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Referencias Bibliográfícas
- 58 -
TESIS EN OPCION AL TITULO ACADEMICO DE
MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL
EEMMBBRRIIOOGGÉÉNNEESSIISS SSOOMMÁÁTTIICCAA DDEE SSwwiieetteenniiaa mmaaccrroopphhyyllllaa KKiinngg
EENN MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO SSEEMMIISSÓÓLLIIDDOOSS
ASPIRANTE: Ing. Raúl Collado López.
TUTOR : DrC. Raúl Barbón Rodríguez.
Santa Clara, CUBA
2006
IINNSSTTIITTUUTTOO DDEE BBIIOOTTEECCNNOOLLOOGGIIAA DDEE LLAASS LLAANNTTAASS
Referencias Bibliográfícas
- 59 -
Agradecimientos
Referencias Bibliográfícas
- 60 -
A mi tutor DrC Raúl Barbón Rodríguez mi agradecimiento especial por todos los conocimientos transferidos durante estos dos años de trabajo conjunto. A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Propagación Masiva Felipe Jiménez, Raúl Barbón, Martha Pérez, Odalys Gutiérrez y Daniel Agramante por haber contribuido a mi formación y brindado una ayuda incondicional para el desarrollo de la investigación. A la compañera Lourdes García por la rigurosa revisión del documento de tesis elaborado. A la institución por aportar todos los recursos necesarios y condiciones de trabajo para el desarrollo de la investigación. A los compañeros Nydia del Rivero, Enrrique Salas y Apolonio Valdez por su apoyo brindado en la toma de fotos para el desarrollo de la investigación. A todos los que de una forma o de otra hallan brindado su apoyo para el desarrollo de este trabajo de tesis.
Referencias Bibliográfícas
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SÍNTESIS En la caoba especie agroforestal de gran importancia, la propagación por vías tradicionales
no resuelven la necesidad de material vegetal para fomentar plantaciones ya sea con el
objetivo de reforestar o para la producción comercial de madera. Se ha demostrado que
esta especie es difícil de propagar mediante el cultivo de tejidos y no se cuenta con un
sistema vía organogénesis repetible, debido básicamente a problemas de contaminación
microbiana, oxidación fenólica y muerte de los tejidos en la fase de establecimiento de los
explantes in vitro. Se hace necesario la búsqueda de un nuevo método de propagación
para dar solución a los problemas antes mencionados. La presente investigación se realizó
con el objetivo de establecer la embriogénesis somática directa e indirecta en Swietenia
macrophylla King en medios de cultivo semisólidos para lo cual se emplearon como
material inicial embriones cigóticos y secciones cotiledonales. Los resultados demostraron
que en un medio de cultivo compuesto por las sales MS con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0
mg.L-1 de kinetina se logra el desarrollo de la embriogénesis somática directa a partir de
embriones cigóticos inmaduros. En el desarrollo de los embriones somáticos en etapa
globular, con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP se obtienen porcentajes de embriones somáticos en
etapas de torpedo y cotiledonal (7.4 y 91.7 %) superiores al resto de los tratamientos. Los
mayores porcentajes de formación de callo a partir de secciones cotiledonales se
obtuvieron con concentraciones de 4.0 y 6.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de
kinetina (96.98 y 97.02%). La formación y diferenciación de embriones somáticos a partir
de callos, se favoreció con la adición de 6-BAP al medio de cultivo. Con 1.0 mg.L-1 de 6-
BAP se obtienen los mayores porcentajes de ESAF y ESBF (53.01 y 33.92 %), así como el
mayor número de embriones somáticos por callo (43.35 ES/callo) y embriones somáticos
que alcanzaron la etapa cotiledonal. La maduración de los embriones somáticos se afectó
con el proceso de deshidratación, en los tres tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0
horas de deshidratación) los porcentajes de germinación obtenidos fueron inferiores a los
logrados con el control. Mientras que, con 6 % de sacarosa no se afectó la supervivencia
de los embriones somáticos, se obtiene el mayor porcentaje de germinación completa de
los embriones somáticos (76.17%) y bajos niveles de embriogénesis somática secundaria.
Los mayores porcentajes de germinación parcial y completa de los embriones somáticos
(13.35 y 77.62 %) se obtuvieron en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento; sin
embargo, con el 6-BAP disminuyó la germinación y se incrementó la embriogénesis
somática secundaria. La adición de AG3 al medio de cultivo provocó solo germinación
parcial de los embriones somáticos.
Referencias Bibliográfícas
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Índice
Referencias Bibliográfícas
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ÍNDICE 1. Introducción 1 2. Revisión bibliográfica 4 2.1. La caoba. Sistemática, botánica, origen y características de la especie Swietenia macrophylla King
4
2.2. Importancia del cultivo 6 2.3. Propagación 7 2.3.1. Propagación in vitro 8 2.4. Mejoramiento genético 9 2.5. Embriogénesis somática 10 2.5.1. Factores que afectan la embriogénesis somática 12 2.5.1.1. Genotipo 12 2.5.1.2. Explante 13 2.5.1.3 Medio de cultivo 13 2.5.1.4. Reguladores de crecimiento 15 2.5.1.5 Condiciones de cultivo 16 2.6. Embriogénesis secundaria o repetitiva 17 2.6.1. Aplicación de la embriogénesis somática repetitiva 18 2.7. Fases de la embriogénesis somática 19 2.7.1. Inducción de los embriones somáticos 19 2.7.2. Desarrollo de los embriones somáticos 20 2.7.3. Proliferación de los embriones somáticos 21 2.7.4 Maduración de los embriones somáticos 21 2.7.5. Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas 22 3. Materiales y métodos 24 3.0 Técnicas y procedimientos generales 24 3.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla King
26
3.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa 26 3.1.2. Histodiferenciación de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia macrophylla King
27
3.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King
28
3.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta 28 3.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
28
3.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King 29 3.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
29
3.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
30
3.4. Germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
31
3.4.1. Efecto del 6-BAP y el ácido giberélico sobre la germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
31
Referencias Bibliográfícas
- 64 -
4. Resultado y discusión 33 4.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla King
33
4.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa 33 4.1.2. Histodiferenciación de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia macrophylla King
36
4.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King
38
4.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta 38 4.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos a partir de callos de Swietenia macrophylla king.
40
4.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King 44 4.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
44
4.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
46
4.4. Germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
52
4.4.1 Efecto del 6-BAP y el AG3 sobre la germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
52
5. Conclusiones 56 6. Recomendaciones 57 7. Revisión bibliográfica 58
Referencias Bibliográfícas
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Introducción
Referencias Bibliográfícas
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1. INTRODUCCIÓN La caoba (Swietenia macrophylla King), especie agroforestal de gran importancia
está muy amenazada por la extracción intensiva e ilegal que se realiza en las áreas
tropicales, en parte por la gran demanda de su valiosa madera. Esta considerada
como la especie arbórea más comercial del Neotrópico. La creciente demanda de
madera de caoba sobrepasa la oferta disponible y aumenta la presión sobre esta
especie, ocasionando una disminución de las poblaciones naturales y provocando
su extinción comercial a lo largo de su área de distribución (Reynel et al., 2003).
El uso de la biotecnología como un apoyo a los programas de reforestación es una
posibilidad actual que aliviaría la presión de deforestación que tienen las
poblaciones naturales y de esta manera evitaría su extinción (Verdeil et al., 1999).
En la caoba, la propagación por vías tradicionales no resuelven los problemas de
déficit de material vegetal para fomentar plantaciones ya sea con el objetivo de
reforestar o para la producción comercial de madera. El mejoramiento genético
resulta difícil de desarrollar utilizando los métodos tradicionales de propagación
debido al extenso ciclo del cultivo.
Esta especie ha demostrado ser difícil de propagar mediante el cultivo de tejidos.
No se cuenta con un sistema de regeneración de plantas vía organogénesis
repetible, debido básicamente a problemas de contaminación microbiana y por
oxidación fenólica y muerte de los tejidos en la fase de establecimiento de los
explantes in vitro. Se hace necesario entonces la búsqueda de un nuevo método de
Referencias Bibliográfícas
- 67 -
propagación para dar solución a los problemas antes mencionados (Rodríguez et
al., 2003).
La embriogénesis somática es un método de micropropagación utilizado en la
industria forestal principalmente para regenerar especies de crecimiento rápido tales
como Eucalyptus nitens, E. globulus, Picea abies, Pinus taeda y Pinus radiata. El
proceso de embriogénesis somática tiene la ventaja de ser sensible a la
automatización y mecanización, generando una alta producción de plantas iniciales
para el establecimiento de plantaciones. Además, dado el interés que existe en el
país de un programa de mejoramiento genético con el empleo de la ingeniería
genética como una herramienta de apoyo, es necesario contar con un sistema de
regeneración eficiente para la obtención de plantas de calidad (Peña y Lezcano,
2001).
El desarrollo de tecnologías de gran eficiencia desde el punto de vista biológico,
cuantitativo y económico, que faciliten un mayor grado de automatización en los
procesos de almacenamiento y multiplicación de germoplasma valioso, permitirán a
su vez disminuir los costos en la producción de plantas in vitro, lo que resulta
altamente beneficioso para especies de interés agroforestal como la caoba (Medina
y Sotolongo, 2004).
Basados en la necesidad de desarrollar protocolos de propagación in vitro para esta
especie se planteó como hipótesis de trabajo que “es posible establecer la
embriogénesis somática por vía directa e indirecta en caoba hondureña
(Swietenia macrophylla King) en medios de cultivo semisólidos ”.
Referencias Bibliográfícas
- 68 -
A partir de esta hipótesis se definieron los siguientes objetivos:
• Determinar la influencia de diferentes concentraciones de reguladores del
crecimiento en la embriogénesis somática directa a partir de embriones
cigóticos como explante inicial.
• Evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento en la
embriogénesis somática indirecta a partir de secciones cotiledónales como
explante inicial.
• Lograr la maduración y germinación de los embriones somáticos.
Referencias Bibliográfícas
- 69 -
Referencias Bibliográfícas
- 70 -
Revisión Bibliográfica
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. La caoba. Sistemática, botánica, origen y características de la especie
Swietenia macrophylla King
La Caoba hondureña pertenece al género Swietenia el cual se encuentra ubicado
dentro de la familia Meliaceae. Según Snook y Negreros-Castillo (2004) la posición
filogenética de la especie es:
Reino : Plantae
Clase : Magnoliopsida
Orden : Sapindales
Familia : Meliaceae
Género : Swietenia
Especie : Swietenia macrophylla King.
Nombres comunes:
Caoba, mara, mogno, caoba de hojas grandes, caoba brasileña, caoba hondureña
(Grogan et al., 2003).
La caoba es un árbol grande con una altura de 20 a 35 m. El diámetro del fuste
alcanza los dos metros, es cilíndrico y tiene usualmente raíces tablares de hasta un
Referencias Bibliográfícas
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metro y cincuenta cm de alto. La copa es abierta y redondeada. La especie es
marcadamente caducifolia, lo cual significa que bota o se desprende de su follaje
durante la estación seca, y el árbol se mantiene así completamente desnudo
durante tres ó cuatro meses. El nuevo follaje aparece masiva y repentinamente no
al inicio de la estación lluviosa como sería lógico suponer, sino más bien unas
semanas antes justo en la época más seca y más caliente de la estación estival. La
corteza es de color gris muy oscuro, a veces casi negra, de textura muy áspera y en
los árboles más viejos se desprende en flecos grandes (Negreros-Castillo et al.,
2003).
Las hojas son de apariencia muy agradable: alternas, compuestas paripinadas (a
veces imparipinadas) con tres a seis pares de folíolos grandes con relación al
tamaño total de la hoja. En las plántulas la hoja puede llegar a medir hasta 40 cm de
longitud, pero en los árboles adultos el tamaño de la hoja se reduce a menos de la
mitad (Grogan et al., 2003).
Las flores son muy pequeñas y sencillas, y se desarrollan en unas estructuras o
inflorescencias alargadas y en forma de cono llamadas panículas o panojas.
Aparecen exactamente al mismo tiempo que las hojas nuevas, justo cuando la
estación veraniega se encuentra en su momento de mayor sequía y más altas
temperaturas (febrero y marzo).
Cada flor es "imperfecta" o unisexual o sea, que sólo posee pistilo (órganos
femeninos) o estambres (órganos masculinos). Cada panícula posee flores hembra
o pistiladas y flores macho o estaminadas en mucho mayor cantidad estas últimas
(Snook y Negreros-Castillo, 2004).
Referencias Bibliográfícas
- 72 -
Los frutos son probablemente la característica más notable de esta especie de
árbol. Una vez polinizadas las flores, los frutos tardan entre ocho y nueve meses en
desarrollarse y madurar (de febrero - marzo hasta octubre - noviembre). Son secos
del tipo cápsulas, que cuando maduran son grandes, de hasta 15 cm de largo, en
forma de pera, y de color café muy claro, formados por un tejido leñoso. Cuando
están con frutos los árboles de caoba hondureña son muy fáciles de reconocer
desde grandes distancias pues prácticamente en la punta de cada rama hay un
fruto siempre apuntando hacia arriba (Grogan et al., 2003).
La semilla es aplastada, de aproximadamente 2 cm de largo, con la forma de un
frijol, y de color blanco con un largo hilum de color negro (Negreros-Castillo et al.,
2003).
Estudios realizados acerca del rendimiento en madera de la caoba señalan que se
obtienen volúmenes promedio de 7 a 11 m³/ha/año (Alvarez, 2000).
2.2. Importancia del cultivo
La Caoba es muy utilizada para la reforestación, se planta de manera extensa tanto
como un árbol ornamental como de sombra. Tiene las ventajas de un rápido
crecimiento, alta tolerancia a la sequía y a los suelos pobres (Medina y Sotolongo,
2004).
La madera de esta especie debido a su belleza, alta durabilidad natural, fácil
aserrado y alta estabilidad dimensional corresponde al grupo de maderas
denominadas de utilidad general y se emplea en: construcciones livianas y
molduras, embarcaciones (cobertura, pisos); parquet doméstico, acabados y
Referencias Bibliográfícas
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divisiones interiores, muebles de lujo, gabinetes de primera clase, chapa plana
decorativa, contrachapados, artículos torneados, cajas para joyas, instrumentos
musicales (o parte de estos), instrumentos científicos, fósforos, palillos y lápices
(Alvarez y Ponce, 1995).
Es utilizada también en la medicina tradicional. La corteza tiene propiedades
astringentes, tónicas y febrífugas. El té de sus semillas es recomendado para el
dolor de pecho (Alvarez y Ponce, 1995).
2.3. Propagación
La caoba es la especie maderable más importante comercialmente en el neotrópico,
es propagada comúnmente por semilla sexual, pero no regenera a menudo con
éxito debido a la baja eficacia de los métodos de propagación convencionales. Se
han realizado estudios donde se han evaluado diferentes profundidades de siembra
y diversas formas de preparación del área y los porcentajes de arbolillos
establecidos son inferiores al 20 % después de los diez meses (Negreros-Castillo et
al., 2003).
La necesidad de multiplicar íntegramente individuos de caoba seleccionados a
despertado interés por los métodos de propagación vegetativa (Grogan et al., 2003).
Patiño (1997) planteó que la propagación asexual con la aplicación de técnicas
convencionales (injertos, estacas y margullos) es posible; pero las plantas
resultantes pierden rápidamente su valor comercial debido a múltiples
ramificaciones causadas por efectos topofíticos. Aparentemente la vía más
Referencias Bibliográfícas
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apropiada para la reproducción artificial de esta especie en cantidades comerciales
es la micropropagación (Rodríguez et al., 2003).
La propagación "in vitro", es una tecnología bien conocida y manejada con
experiencia por más de tres décadas en muchos países del mundo. Se conoce que
esta técnica ha sido aplicada con diversos objetivos: producción masiva,
mejoramiento genético y en la obtención de plantas libres de patógenos (Ashmore y
Engelman, 1997).
La propagación vegetativa representa una vía más directa para mantener
características genéticas de un árbol elite. Dentro de este tipo de propagación, el
cultivo de tejidos ofrece un gran potencial de apoyo a los métodos tradicionales, al
incrementar la producción de variedades genéticamente superiores, proveniente de
la selección de poblaciones, del mejoramiento convencional o de un número
limitado de semillas de polinización controlada (Altman y Loberant, 1998).
La mayoría de los estudios sobre micropropagación se han realizado en más de
50.000 variedades de más de 1.000 especies de plantas ornamentales, agrícolas,
forestales y en especies de interés industrial. Sin embargo, el empleo de esta
tecnología en especies nativas de diversos ecosistemas, ha resultado un proceso
complejo en muchas especies que han sido estudiadas (Pérez, 1998).
2.3.1. Propagación in vitro
La propagación in vitro de caoba tiene pocos antecedentes, debido posiblemente a
lo recalcitrante de la especie. Lee y Rao (1988) obtuvieron vástagos adventicios a
partir de callos originados de segmentos nodales de plantas de diferentes edades,
Referencias Bibliográfícas
- 75 -
cultivados en un medio de cultivo modificado de Murashige y Skoog (1962) (MS),
suplementado con benciladenina (BA) a concentraciones de 2.0 mg.l-1 y 5.0 mg.l-1.
Sarasan et al. (2002) encontró que los explantes de mayor potencial para lograr
brotes eran también los segmentos nodales de 0.5 cm, obtenidos de plantas
germinadas in vitro y cultivados en un medio de cultivo MS modificado con
diferentes relaciones de la auxina ácido indol-3-acético (AIA) y la citoquinina (BA).
Tacoronte et al. (2004) lograron la propagación in vitro de la caoba, para lo cual
utilizaron como explante inicial segmentos nodales de plantas germinadas in vitro a
partir de semillas con cuatro semanas de edad. Para el desarrollo y alargamiento de
las yemas axilares, fue necesaria una relación de ANA/BA en el rango de 0 a 1.94
mg.l-1 de cada regulador de crecimiento. La formación de raíces se presentó en
medio de cultivo MS/2, suplementado con tiamina 9.9 mg.l-1, ácido indolbutírico
(AIB) 0.5 mg.l-1, ANA 0.3 mg.l-1, sacarosa 40 g.l-1, gelrite 2.0 g.l-1 y pH de 5.7.
Existen pocos trabajos publicados sobre la regeneración de plantas mediante el
cultivo in vitro en especies del género Swietenia y los resultados presentados se
han obtenido a partir de plantas asépticas (Sotolongo et al., 2002).
La micropropagación vía organogénesis de la caoba ha tenido poco o ningún
desarrollo, debido a los grandes problemas de contaminación y a los bajos índices
de regeneración de plantas in vitro (Medina y Sotolongo, 2004).
2.4. Mejoramiento genético
La aplicación de Biotecnología en el área de mejoramiento vegetal, de forma
paralela a la aplicación de programas de mejoramiento convencional, contribuyen
Referencias Bibliográfícas
- 76 -
de forma efectiva a incrementar la producción agrícola e industrial, ya que permite
obtener plantas con características más compatibles a su medio ambiente. Los
métodos biotecnológicos permiten explorar más ampliamente la gran variabilidad
genética existente en las plantas, ya que aunque se han obtenido variedades
mejoradas mediante hibridación y selección continua, existen restricciones que
limitan el proceso de mejoramiento (Tang y Tian, 2003).
Aplicando técnicas biotecnológicas podemos micropropagar en forma rápida un
individuo elite con características deseables conocidas, y clonar los genes
responsables de dichas características, y posteriormente introducir dichos genes en
plantas de diferentes especies, lo cual es imposible de realizar por métodos
convencionales. Debido a todas las ventajas señaladas anteriormente, la
biotecnología vegetal permite el desarrollo de una nueva agricultura sustentada en
el uso reducido de fertilizantes químicos, en el biocontrol de plagas y en el cultivo de
plantas que expresan características de tolerancia o resistencia, ya sea a factores
de estrés biótico (microorganismos e insectos), o factores abióticos (altas o bajas
temperaturas, concentraciones salinas y suelos áridos) (Salvi et al., 2001).
2.5. Embriogénesis somática
Parrott (2002) describió al embrión somático como un individuo que es originado
por una o varias células somáticas y que no tiene conexiones vasculares con el
tejido materno. Este autor define que el proceso de formación de un embrión
somático se conoce como embriogénesis somática.
Referencias Bibliográfícas
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En los últimos 40 años se han desarrollado tecnologías para obtener embriones
somáticos de un número cada vez más grande de especies. La embriogénesis
somática ha sido utilizada en los programas de mejoramiento genético y en la
propagación a gran escala de genotipos superiores, especialmente cultivos
perennes de alto valor (Viana y Mantell, 1999).
La aplicación de la embriogénesis somática para la propagación se incrementará
con la existencia de protocolos más avanzados y capaces de lograr la producción
de embriones somáticos morfológicamente normales, sin variación somaclonal y
con habilidad de germinar y convertirse rápida y eficazmente en plantas
(Mascarenhas y Muralidharan, 1995).
Haines y Martin (1997), informaron que el proceso de embriogénesis somática tiene
lugar a partir de dos tipos de células: Células Embriogénicas predeterminadas
(CEPDs) y Células Embriogénicas Determinadas Inducidas (CEDIs), estas se
encuentran en tejidos somáticos.
Existen dos vías de desarrollo de la embriogénesis somática: directa e indirecta. De
acuerdo a esto en la embriogénesis somática directa las células pre-existentes
(CEPDs) se dividen directamente para formar un embrión somático. En el caso de la
embriogénesis somática indirecta las células pre-existentes (CEDIs) se dividen para
formar un callo y el callo a su vez adquiere embriogenicidad (Agustine, 1999).
En cultivos como Coffea arabica L y Cedrela odorata se ha demostrado que existen
dos tipos de embriogénesis indirecta: una conocida como embriogénesis somática
de baja frecuencia y otra denominada embriogénesis somática de alta frecuencia
Referencias Bibliográfícas
- 78 -
(Barbón, 2001; Muños, 2003). En la primera se forman pocos embriones somáticos
por callo, de forma asincrónica, pasando por las diferentes etapas de desarrollo. En
la segunda un callo compuesto de proembriones y embriones globulares que
mantienen un desarrollo sincrónico. Estos tipos de embriogénesis indirecta son
típicas también en algunas especies del género Swietenia.
El tejido embriogénico se caracteriza por estar formado por células pequeñas, ricas
en citoplasma, y asimétricas (Parrott, 2002). Viana y Mantell (1999) señalaron que
las células dentro de los tejidos embriogénicos pueden dividirse y mantener su
estado embriogénico mientras estén expuestas a suficiente auxina.
La embriogénesis somática ofrece la posibilidad de regenerar una mayor cantidad
de material vegetal uniforme y permite la obtención de poblaciones puras (Peña y
Lezcano, 2001).
Teniendo en cuenta las ventajas de la embriogénesis somática y su aplicación en la
propagación masiva de plantas, esta vía brinda la posibilidad de micropropagar
clonalmente la Swietenia macrophylla (Medina y Sotolongo 2004).
2.5.1. Factores que afectan la embriogénesis somática
2.5.1.1. Genotipo
Se ha observado que genotipos provenientes de una misma especie, pueden diferir
en cuanto a su capacidad para formar embriones somáticos, lo cual esta dado por
las diferentes habilidades para activar las rutas embriogénicas (Parrott, 2002). Esto
es especialmente evidente en cultivos de árboles tropicales donde se manifiesta un
Referencias Bibliográfícas
- 79 -
fuerte efecto del genotipo en el patrón de mantenimiento de los cultivos
embriogénicos. Existe un tipo de genotipo que en presencia de una auxina fuerte
forman embriones somáticos que alcanzan la etapa cotiledonal; mientras que, otro
tipo conducen a una proliferación de masas proembriogénicas (Vilchez, 2001).
2.5.1.2. Explante
La respuesta embriogénica depende del explante, del estado fisiológico y la edad de
la planta donadora (Barbón, 2001).
Todos los tejidos tienen la capacidad de formar callos in vitro, pero no todos son
embriogénicos (Barbón, 2001). Por lo general se han utilizado diversos explantes y
se han obtenido con éxito callos embriogénicos en varias familias de plantas, como
cotiledones de embriones cigóticos (Canhoto et al., 1999), cotiledones de semillas
de frutos inmaduros (Da Costa et al., 2002), hipocótilos y embriones cigóticos (Parra
y Amo-Marco, 1998), ápices caulinares, segmentos de tallos y hojas (Cramer y
Briggen, 1997), inflorescencias maduras, óvulos (Cabasson et al., 1997),
microsporas (Nitta et al., 1997) y protoplastos (Bang et al., 1999). Aunque se
plantea que los tejidos embrionarios y tejidos muy jóvenes son los que poseen una
respuesta embriogénica activa (Bandyopadhvay y Hamill, 2000).
Varios autores informan la formación de callos en la especie Swietenia macrophylla
King a partir de diferentes explantes, plantas germinadas in vitro (Maruyama e Ishii,
1999), meristemos apicales (Peña y Lezcano, 2001), hojas (Sotolongo y Medina,
2002), sin lograr inducir embriogénesis somática. Collado et al. (2005) señalaron
Referencias Bibliográfícas
- 80 -
que con el empleo de cotiledones de semillas de frutos inmaduros como explante se
logra la formación y diferenciación de embriones somáticos en esta especie.
2.5.1.3 Medio de cultivo
Para el desarrollo de la embriogénesis somática generalmente se ha empleado el
medio de cultivo MS con algunas modificaciones del mismo.
En trabajos publicados sobre la embriogénesis somática en Meliaceas como
Cedrela fissilis Vellozo y Cedrela odorata utilizan las sales MS en los medios de
cultivo para la inducción y formación de embriones somáticos (Da Costa et al.,
2002; Muños, 2003).
La adición de nitrógeno en el medio de cultivo ha tenido un marcado efecto sobre la
embriogénesis somática en varias especies. En particular la relación nitrato –
amonio y la adición de nitrógeno reducido en forma de aminoácidos influyen en la
aparición de la embriogénesis somática (Nuutila et al., 2002).
En estudios realizados sobre el efecto de fuentes nitrogenadas orgánicas en la
embriogénesis somática en especies como Eucalyptus globulus y Gossypium
hirsutum, se ha demostrado que la adición de extracto de malta al medio de cultivo
incrementa la formación de embriones somáticos (Pinto et al., 2002; Kumria et al.,
2003).
Otras fuentes de nitrógeno utilizadas para el desarrollo de la embriogénesis
somática la constituyen los aminoácidos, entre estos tiene un papel importante el
aminoácido L-Glutamina que ha sido empleado para incrementar la formación de
estructuras embriogénicas en varias especies leñosas como Quercus suber
Referencias Bibliográfícas
- 81 -
(Hernández et al., 2003), Eucalyptus globulus (Pinto et al., 2002) y Pinus taeda
(Pullman et al., 2005).
En algunas especies se ha determinado la influencia de la concentración de
sacarosa sobre la formación de callo con estructuras embriogénicas y embriones
somáticos, ya que altas concentraciones de sacarosa (> 40 g.l-1) actúan como un
factor estresante que induce el proceso de la embriogénesis somática (Nuutila et al.,
2002; Zheng et al., 2002; Choi y Jeong, 2003).
2.5.1.4. Reguladores de crecimiento
La combinación de reguladores de crecimiento necesaria para obtener embriones
somáticos depende del tipo de células que formen el explante, ya sean CEPDs o
CEDIs. En el caso de las CEPDs, la adición de una citoquinina al medio de cultivo
es suficiente, porque las células ya son embriogénicas y simplemente necesitan
dividirse; pero al utilizar tejidos con CEDIs, es necesario el empleo de auxinas para
inducir el estado embriogénico (Parrott, 2002).
Las auxinas desempeñan un importante papel en el proceso de embriogénesis
somática. La acción auxínica produce severos cambios, lo cual reprograma a la
célula para un estado embriogénico. Uno de los eventos iniciales es la terminación
del patrón genético general, que puede variar y permitir la expresión de un
programa embriogénico. Un posible mecanismo para la baja regulación de la
expresión génica es la metilación del ácido desoxirribonucleico (ADN), lo cual esta
correlacionado con la cantidad de auxina exógena (Barbón, 2001; Kintzios et al.,
2002).
Referencias Bibliográfícas
- 82 -
En los escasos informes de embriogénesis somática en Meliaceas han utilizado el
ácido 2,4-diclorofenoxiácetico, como regulador de crecimiento para inducir la
embriogénesis somática, en concentraciones que se encuentran en el rango de 1.0
a 5.0 mg.l-1 (Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y
Quoirin, 2004; Medina y Sotolongo 2004).
El papel de las citoquininas en el medio de cultivo primario o inductor no ha sido
bien definido, aunque normalmente este medio de cultivo incluye en su composición
alguna de ellas como es el 6-bencilaminopurina (6-BAP) o la Kinetina. Las
citoquininas pueden ser esenciales para la maduración y germinación de embriones
somáticos. La incorporación de estas durante la fase de histodiferenciación
compensa el efecto negativo inducido por la auxina sobre el desarrollo del
meristemo (Barbón, 2001).
Parrott (2002), informó que la histodiferenciación, maduración, germinación y
conversión de los embriones somáticos de angiospermas ocurre sin la presencia de
reguladores de crecimiento exógenos. Este mismo autor señaló que aún así,
muchos de los protocolos para la embriogénesis somática omiten una o más
etapas, usan reguladores de crecimiento innecesarios, o condiciones subóptimas de
cultivo. Lo que provoca que los embriones somáticos requieran el empleo de
reguladores de crecimiento (generalmente citoquinina o giberelina) antes de
germinar y convertirse en plantas.
2.5.1.5 Condiciones de cultivo
Referencias Bibliográfícas
- 83 -
Se ha demostrado que para algunas especies leñosas es fundamental la inducción
de la embriogénesis somática en presencia de luz. Shaji et al. (1997), señalaron que
callos de Naregamia alata mostraron más actividad embriogénica a la luz que en
condiciones de oscuridad. D´Onorio et al. (1998), mencionan que la competencia
embriogénica de hojas de Cydonia oblonga mostró una correlación con el
fotoequilibrio, de manera que callos cultivados bajo luz azul presentaron un bajo
fotoequilibrio, que influyó negativamente en la embriogénesis somática. Mientras
que en algunas Meliaceas como Azadirachta excelsa, Azadirachta indica, Cedrela
fissilis y Cedrela odorata, es necesaria la oscuridad para desarrollar el proceso de
embriogénesis somática (Lorenzi, 1996; Salvi et al., 2001; Da Costa et al., 2002;
Muños, 2003)
En términos de la atmósfera gaseosa, la adición de inhibidores de etileno, tales
como cobalto, níquel y ácido salicílico incrementaron la embriogénesis en zanahoria
(Roustan et al., 1990). Grapin et al. (1994) informan la importancia de la atmósfera
gaseosa en el proceso de regeneración de embriones somáticos, donde la calidad
de la atmósfera influyó en el proceso de diferenciación y se observó una reducción
del número de embriones somáticos por explante en atmósferas con bajas
concentraciones de oxígeno.
En estudios realizados con respecto al efecto del dióxido de carbono (CO2) en las
especies Coffea arabica L. y Clematis tangutica K., Barbón (2001) demostró que el
gaseado con CO2 a concentraciones de 2.5 y 5.0 % estimuló la formación de
embriones somáticos en comparación con los controles de intercambio pasivo, este
efecto positivo del dióxido de carbono y el oxígeno no solo estuvo relacionado con
Referencias Bibliográfícas
- 84 -
la mayor producción de embriones somáticos sino con una mejor proporción de
embriones somáticos en etapa de torpedo.
2.6. Embriogénesis secundaria o repetitiva
En ausencia de auxinas exógenas, la histodiferenciación procede normalmente. Si
hay auxinas dentro del umbral que permite la histodiferenciación, ésta procederá,
pero anormalmente. Al aumentar el nivel de auxinas exógenas, se llega a un punto
en que la histodiferenciación no pasa más halla de la etapa globular. En este caso,
nuevos embriones somáticos se forman del embrión original, y se desarrollaron
hasta la etapa globular, donde se multiplican. Este proceso se repite mientras el
nivel de auxinas exógenas sea suficientemente alto. Este fenómeno se conoce
como embriogénesis somática recurrente, repetitiva, o secundaria (Parrott, 2002).
Cuando el nivel de auxinas externas esta por de bajo del punto necesario para
mantener la embriogénesis somática repetitiva, el ciclo de esta se rompe, y los
embriones somáticos terminan su histodiferenciación para desarrollarse en
embriones somáticos maduros. En algunas especies, los embriones somáticos
alcanzan las etapas de corazón, torpedo, o cotiledonal, o incluso pueden germinar,
antes de empezar el proceso repetitivo (Merkle et al., 1991).
En otras especies, la embriogénesis repetitiva puede ocurrir en ausencia de toda
auxina externa, en cuyo caso puede ser difícil o imposible de romper el ciclo de la
embriogénesis somática repetitiva. Este proceso recibe el nombre de autoembrionia
(Thorpe, 1995).
2.6.1. Aplicación de la embriogénesis somática repetitiva
Referencias Bibliográfícas
- 85 -
La habilidad que tienen los tejidos embriogénicos y los embriones somáticos
facilitan su utilización para la multiplicación a gran escala. Ya que la embriogénesis
somática puede producir un número ilimitado de propágulos con la capacidad de
germinar y producir plantas completas sin necesidad de etapas adicionales para el
enraizamiento, esta tecnología puede ser especialmente útil para la propagación
masiva de plantas (Hernández et al., 2003).
La embriogénesis somática es una de las vías de propagación más utilizada para el
mejoramiento genético, ya que aporta un mecanismo para la transformación
genética de aquellas especies que no son regenerables por organogénesis. Las
células embriogénicas se han empleado como material vegetal en varios métodos
de transformación; pero son particularmente útiles para la transformación por medio
de biobalística debido a que carecen de vacuolas grandes (Silveira et al., 2004).
2.7. Fases de la embriogénesis somática
El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración de plantas vía
embriogénesis somática incluye los siguientes pasos:
• Inducción de los embriones somáticos.
• Desarrollo de los embriones somáticos.
• Proliferación de los embriones somáticos.
• Maduración de los embriones somáticos.
• Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas.
2.7.1. Inducción de los embriones somáticos
Referencias Bibliográfícas
- 86 -
La Inducción del proceso consiste en la terminación del patrón de expresión de los
genes presentes en el tejido del explante; siendo reemplazado por un programa de
expresión del gen o genes de la embriogénesis en aquellas células del tejido del
explante, los cuales pudieran dar lugar a embriones somáticos (Gómez, 1998).
Según, Parrot (2002), la inducción del estado embriogénico incluye la inducción de
los mismos mecanismos genéticos que conllevan a la embriogénesis cigótica.
Contrariamente a los embriones cigóticos los embriones somáticos no contienen un
nuevo grupo de genes sino que poseen la misma combinación genética de la planta
fuente del explante.
El empleo de la auxina es la mejor manera de inducir la formación de células
embriogénicas a partir de células somáticas. La inducción de la división celular
como una respuesta a esta auxina puede resultar en un callo con crecimiento
desorganizado o bien en un crecimiento polarizado coordinado para la formación de
un embrión somático (Gómez, 1998).
La combinación de reguladores de crecimiento (2,4-D, AIB y kinetina) en el medio
de cultivo, utilizada para la inducción de la embriogénesis somática en el híbrido de
caoba (Swietenia macrophylla King X Swietenia mahogani Jacq), permitió la
formación de callos que por sus características macromorfológicas y citológicas
fueron los más promisorios para una posible embriogénesis somática (Medina y
Sotolongo, 2004).
2.7.2. Desarrollo de los embriones somáticos
Referencias Bibliográfícas
- 87 -
La etapa temprana o pre-globular de los embriones somáticos son fácilmente
reconocidos generalmente por el contenido de citoplasma denso y la ausencia
general de vacuolas (Krikorian, 1995). Durante esta fase las auxinas son inhibitorias
para el desarrollo de los agregados celulares embriogénicos a embriones somáticos
(Halperin, 1995).
2.7.3. Proliferación de los embriones somáticos
Uno de los aspectos más importantes de la embriogénesis somática que permite su
aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes es la habilidad de
los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o
multiplicarse indefinidamente (Merkle et al., 1995).
El factor más fuerte asociado con la proliferación continua de las células
embriogénicas es la auxina. Sin embargo, parece que el efecto de este regulador de
crecimiento no puede ser considerado independiente a la reducción de la
concentración de nitrógeno, ya que existen evidencias de la interacción entre ambos
(Gómez, 1998). Además el nivel de auxina necesario para mantener la
embriogénesis somática repetitiva varia de acuerdo a la especie (Merkle et al.,
1995).
2.7.4 Maduración de los embriones somáticos
La maduración es el período en el cual el embrión somático sufre expansión de sus
células, y la acumulación de sustancias de reserva (Gómez, 1998). En esta etapa
juega un papel fundamental la presencia de nitrógeno en el medio de cultivo, siendo
necesario el suplemento con nitratos, amonio, aminoácidos y caseína hidrolizada.
Referencias Bibliográfícas
- 88 -
Los carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de 3 - 6 % son
esenciales, junto a bajas concentraciones de oxígeno en la atmósfera gaseosa en el
frasco de cultivo, lo cual permite una maduración total y evita la germinación precoz
(Merkle et al., 1995).
Al respecto Gómez (1998), menciona que un tratamiento de deshidratación parcial o
total del embrión somático aumenta su posterior germinación y crecimiento, además
de facilitar el crecimiento simultáneo de la raíz y el brote.
En el caso de Eucaliptus dunii, con la adición de agua de coco 10.0 % (v/v) o 1.0 g.l-
1 de caseína hidrolizada a un medio libre de reguladores de crecimiento se logró la
maduración de los embriones somáticos (Termignoni et al., 1996).
2.7.5. Germinación y conversión de los embriones somáticos en plantas
Al proceso mediante el cual los embriones somáticos emiten brote y raíz se le
denomina germinación y al desarrollo de plantas completas en condiciones ex vitro
a partir de embriones somáticos germinados se le denomina conversión (Barbón,
2001).
Dentro del proceso de la embriogénesis somática los pasos finales lo constituyen la
germinación y la conversión en plantas. Las primeras señales de la germinación de
los embriones somáticos lo constituyen la elongación del hipocótilo, desarrollo del
color verde de los cotiledones y la elongación de la radícula (Alemano et al., 1997;
Canhoto et al., 1999).
Aunque en la mayoría de los trabajos de embriogénesis somática de especies
leñosas no se da mucha información sobre estos procesos, se sabe que la baja tasa
Referencias Bibliográfícas
- 89 -
de regeneración de plantas es causada por problemas en la germinación y
conversión de los embriones somáticos (Vilchez, 2001).
Muchos trabajos realizados para mejorar la fase de germinación en especies
leñosas señalan la necesidad de cambiar los embriones somáticos a medio de
cultivo fresco durante el este proceso (Danso y Ford-Lloyd, 2002; Zheng et al.,
2002; Montoro et al., 2003).
Se ha informado que los embriones somáticos de especies Meliáceas germinan
bien en medios de cultivo simples, por lo general a la mitad de las sales MS y sin
reguladores de crecimiento (Da Costa et al., 2002; Muños, 2003).
Referencias Bibliográfícas
- 90 -
Materiales y Métodos
Referencias Bibliográfícas
- 91 -
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se realizó en el laboratorio de Propagación Masiva del
Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), adscrito a la Universidad Central
“Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), Santa Clara, (Cuba), durante el período
comprendido entre enero de 2004 y noviembre de 2005.
3.0. Técnicas y procedimientos generales
Material vegetal
Como material vegetal inicial se emplearon embriones cigóticos y secciones de
cotiledones de semillas de frutos inmaduros recolectados de plantas adultas de
Swietenia macrophylla King seleccionadas por sus características agromorfológicas
en el Jardín Botánico de la UCLV.
Procedimientos generales
Se utilizaron tubos de vidrio de 150 mm de longitud por 25 mm de diámetro y
frascos de vidrio de 250 ml de capacidad. El pH de los diferentes medios de cultivo
fue ajustado a 5.8 con NaOH 0.1N y HCl 0.1N antes de la esterilización en
autoclave a una temperatura de 121oC y 1.2 Kg.cm-2 de presión durante 20 min.
Como agente gelificante de los diferentes medios de cultivo empleados para los
experimentos se utilizó 3.0 g.L-1de Gelrite® (SIGMA). Se añadieron 10 ml de medio
de cultivo en los tubos y 30 ml en los frascos.
Referencias Bibliográfícas
- 92 -
La manipulación de los explantes se realizó en condiciones de asepsia en una
cámara de flujo laminar horizontal. El instrumental (pinzas y bisturíes) fueron
desinfectados con una solución de NaClO al 1.0 % (v/v) durante 15 minutos.
En las fases de inducción y diferenciación de embriones somáticos los
experimentos se desarrollaron en condiciones de oscuridad constante y a una
temperatura de 27.0 ± 2.0○C. Para la fase de germinación de los embriones
somáticos se utilizó una cámara de crecimiento de luz solar con una densidad de
flujo de fotones fotosintéticos de 48.0-62.5 µmolm-2s-1 con una duración del período
luminoso máximo y mínimo de 13 h, 34 min y 10 h, 41 min y una temperatura de
25.0 ± 2.0○C.
Preparación del material vegetal
Frutos inmaduros de caoba (Swietenia macrophylla King.) desarrollados a los cinco
meses después de la antésis, con un largo de 7.0 – 10.0 cm y un diámetro de 5.0 –
7.0 cm, fueron lavados con agua y detergente. Los frutos se desinfectaron con una
solución de NaClO al 3 % y 2 gotas de Tween-80 por cada 1000 ml de solución,
durante 30 minutos en agitación. Posteriormente, en condiciones asépticas, los
frutos se enjuagaron dos veces con agua desionizada estéril y se seccionaron en
cuatro partes de las cuales se separó la masa de semillas del endocarpo. A las
semillas se les eliminó la testa, se separaron los cotiledones y se extrajo el embrión
cigótico (Figura 1A).
Los embriones cigóticos se emplearon como explante para la obtención de la
embriogénesis somática directa. Los cotiledones fueron seccionados a la mitad y
Referencias Bibliográfícas
- 93 -
cortados por los bordes. De cada cotiledón se obtuvieron dos secciones de
aproximadamente 0.25 cm2 de área, las cuales se utilizaron como material vegetal
de partida para el desarrollo de la embriogénesis somática indirecta (Figura 1B).
Figura 1. Explantes de Swietenia macrophylla King procedentes de una semilla de un fruto inmaduro de cinco meses posterior a la antésis. A.) Embrión cigótico B.) Secciones cotiledonales.
Procesamiento estadístico
Los datos experimentales se procesaron estadísticamente mediante un análisis de
varianza de clasificación simple y la diferencia entre los tratamientos se determinó
con la aplicación de la prueba de rangos múltiples de Duncan. El paquete
estadístico empleado fue Statgraphics Plus versión 5.0 para Windows.
3.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla
King
3.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa
En este experimento se estudió la combinación de diferentes concentraciones de
2,4-D y una concentración de kinetina con el objetivo de lograr la formación de
embriones somáticos a partir de embriones cigóticos inmaduros.
A B
Referencias Bibliográfícas
- 94 -
El medio de cultivo utilizado estuvo compuesto por las sales de Murashige y Skoog
(1962) (MS), suplementado con 200.0 mg.L-1 de L-glutamina, 1.0 mg.L-1 de tiamina,
1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0 mg.L-1 de extracto de
malta y 4 % de sacarosa. Se estudiaron tres concentraciones de 2,4–D (2.0, 4.0 y
6.0 mg.L-1) combinado con 1.0 mg.L-1 de kinetina.
Se colocó un embrión cigótico por tubo de cultivo y se realizaron 80 repeticiones. El
experimento se realizó tres veces en el tiempo. Se realizaron observaciones cada
siete días para describir los cambios morfológicos presentados por los explantes y
el momento de aparición de la embriogénesis somática directa, así como su
caracterización. Se determinó al final del experimento (a las seis semanas de
cultivo), el número de explantes con embriogénesis somática de alta frecuencia
(ESAF) y embriogénesis somática de baja frecuencia (ESBF).
3.1.2. Desarrollo de embriones somáticos en etapa globular de Swietenia
macrophylla King
Este experimento se realizó con el objetivo de lograr el desarrollo de los embriones
somáticos en etapa globular a las etapas finales de torpedo y cotiledonal, para ello
se tomaron los embriones somáticos obtenidos en la mejor variante de inducción de
la embriogénesis somática directa. Los embriones somáticos se colocaron en tres
tratamientos con 6-BAP (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1) y un control sin reguladores de
crecimiento.
El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por las sales MS suplementado
con 250.0 mg.L-1 de L-glutamina, 10 ml.L-1 de las vitaminas MS y 3% de sacarosa.
Referencias Bibliográfícas
- 95 -
Se colocaron diez embriones somáticos en etapa globular por frasco de cultivo y se
realizaron 20 repeticiones por tratamiento. El experimento se realizó dos veces en el
tiempo. Se efectuaron observaciones periódicas de los cambios morfológicos en los
explantes cada 10 días y se evaluaron las siguientes variables a los 30 días de
cultivo, número de embriones somáticos que alcanzaron la etapa de torpedo y
cotiledonal.
3.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia
macrophylla King
3.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta
Con el objetivo de evaluar el efecto de la combinación auxina - citoquinina en la
inducción de la embriogénesis somática indirecta. Se emplearon como explante
inicial secciones de cotiledones, las cuales se colocaron en un medio de cultivo
compuesto por las sales MS, al que se le adicionaron 200.0 mg.L-1 de L-glutamina,
1.0 mg.L-1 de tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0
mg.L-1 de extracto de malta y 4 % de sacarosa. Se estudiaron tres concentraciones
de 2,4–D (2.0, 4.0 y 6.0 mg.L-1) combinadas con 1.0 mg.L-1 de kinetina.
Se colocaron cuatro secciones de cotiledones por frasco de cultivo y se realizaron
80 repeticiones por tratamiento. Se efectuaron observaciones para describir las
características y color de los callos formados cada siete días y a las seis semanas
de cultivo se evaluó el número de explantes que formaron callo. El experimento se
realizó tres veces en el tiempo.
3.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos
Referencias Bibliográfícas
- 96 -
Para lograr la formación y diferenciación de los embriones somáticos, los callos
obtenidos con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0 mg.L-1 de kinetina se cultivaron en un medio
de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS suplementado con 10.0 mg.L-1 de
tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de pirídoxina, 250.0 mg.L-1 de
L-glutamina, 50.0 mg.L-1 de L-cisteína y 3 % de sacarosa. Se estudiaron tres
concentraciones de 6-BAP (0.5, 1.0 y 2.0 mg.L-1) y un control sin reguladores del
crecimiento.
Se colocaron seis callos por frasco de cultivo y se realizaron 10 repeticiones para un
total de 60 callos por tratamiento. Se efectuaron observaciones cada 10 días para
detectar el momento de aparición de la embriogénesis somática indirecta y su
caracterización morfológica. A los 60 días de cultivo se evaluaron las variables
número de callos con ESAF y callos con ESBF. Transcurrido 80 días de cultivo se
evaluó el número de embriones somáticos por callo y el número de embriones
somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal.
3.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
3.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones
somáticos
Embriones somáticos en etapa cotiledonal obtenidos en la mejor variante del
acápite 3.2.2 fueron sometidos a un proceso de deshidratación con el objetivo de
lograr una correcta maduración. Para lo cual se empleó el método propuesto por
Choi y Jeong (2002), que consistió en colocar 20 embriones somáticos sobre la
Referencias Bibliográfícas
- 97 -
superficie de un papel de filtro estéril dentro de un frasco de cultivo en condiciones
de oscuridad constante y a una temperatura de 27.0 ± 2.0○C.
Se conformaron tres tratamientos:
1. Embriones somáticos expuestos a 24 horas de deshidratación.
2. Embriones somáticos expuestos a 72 horas de deshidratación.
3. Embriones somáticos expuestos a 96 horas de deshidratación.
Posteriormente los embriones somáticos deshidratados fueron colocados en un
medio de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS, suplementado con las
vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa. Como control se emplearon embriones
somáticos en etapa cotiledonal sin aplicación del proceso de deshidratación. Se
colocaron 20 embriones somáticos por frasco de cultivo y se realizaron 10
repeticiones para un total de 200 explantes por tratamiento.
A los 60 días de cultivo se evaluaron las variables: supervivencia, germinación
completa y embriogénesis somática secundaria.
3.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de
los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
Con el objetivo de lograr la maduración, embriones somáticos en etapa cotiledonal,
fueron cultivados durante un período de 30 días con diferentes concentraciones de
sacarosa (4.0, 6.0 y 8.0 %). El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por
las sales MS y las vitaminas MS. Se colocaron 10 embriones somáticos por frasco
de cultivo y se realizaron 10 repeticiones, para un total de 100 explantes por
Referencias Bibliográfícas
- 98 -
tratamiento, los cuales fueron situados en condiciones de oscuridad constante y a
una temperatura de 27.0 ± 2.0○C.
Los explantes cultivados en las tres concentraciones de sacarosa, a los 30 días
fueron transferidos a un medio de cultivo compuesto por la mitad de las sales MS,
suplementado con las vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa. como control se utilizaron
embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes
concentraciones de sacarosa. Se ubicaron siete embriones somáticos por frasco de
cultivo y se realizaron 10 repeticiones para un total de 70 explantes por tratamiento.
El experimento se realizó tres veces en el tiempo.
Se realizaron observaciones a intervalos de 10 días para apreciar algunos cambios
morfológicos ( incremento de tamaño, cambio de coloración y pronunciación del
polo radicular) en los embriones somáticos. A los 60 días de cultivo se evaluaron las
siguientes variables: supervivencia, germinación completa y embriones somáticos
deformados.
3.4. Germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
3.4.1. Efecto del 6-BAP y el ácido giberélico sobre la germinación de
embriones somáticos
Para lograr la germinación se emplearon como explante embriones somáticos en
etapa cotiledonal cultivados durante 30 días en el medio de cultivo para la
maduración (MS) con 6.0 % de sacarosa. Estos fueron colocados en un medio de
cultivo compuesto por la mitad de las sales MS, al cual se le añadieron las
vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa.
Referencias Bibliográfícas
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Se estudiaron tres concentraciones de 6-BAP (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1), dos
concentraciones de giberelina A3 (AG3) (1.0 y 2.0 mg.L-1) y un medio de cultivo
control sin reguladores de crecimiento. Se colocaron siete embriones somáticos por
frasco de cultivo y se realizaron 20 repeticiones para un total de 140 explantes por
tratamiento. El experimento se realizó dos veces en el tiempo.
A los 60 días de cultivo se determinó la altura de los embriones somáticos
germinados, a los cuales se le cuantificó el número de hojas verdaderas y fueron
evaluadas las siguientes variables:
• Número de embriones somáticos con germinación completa.
• Número de embriones somáticos con germinación parcial (el embrión
desarrolla la parte radicular o apical).
• Número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria asociada.
Referencias Bibliográfícas
- 100 -
Referencias Bibliográfícas
- 101 -
Resultados y Discusión
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Desarrollo de la embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla
King
4.1.1. Inducción de la embriogénesis somática directa
Durante las dos primeras semanas de cultivo se observaron cambios de coloración
y morfológicos en los embriones cigóticos, estos se tornaron de un color pardo y
comenzaron a tener un ligero engrosamiento.
A las seis semanas de colocados los explantes en el medio de cultivo para la
inducción de la embriogénesis somática se observó la presencia de embriogénesis
somática directa de alta frecuencia y de baja frecuencia en todos los tratamientos
(Figura 2).
Figura 2. Embriogénesis somática directa desarrolladas a partir de embriones cigóticos de Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo (A- Embriogénesis somática de alta frecuencia y B- Embriogénesis somática de baja frecuencia).
A B
Referencias Bibliográfícas
- 102 -
La embriogénesis somática directa de alta frecuencia se caracterizó por la
presencia de grupos con un gran número de proembriones y embriones somáticos
en etapa globular de color blanco amarillento. Sin embargo, la embriogénesis
somática de baja frecuencia estuvo formada por embriones somáticos aislados y en
diferentes etapas de desarrollo. Estos se caracterizaban también por poseer una
coloración blanca.
Con las combinaciones de diferentes concentraciones de 2,4-D con kinetina se
indujo el proceso de la embriogénesis somática en Swietenia macrophylla King. En
dependencia de estas concentraciones variaron significativamente los porcentajes
de explantes con embriogénesis somática de alta frecuencia y embriogénesis
somática de baja frecuencia.
Los mayores valores de número de embriones cigóticos que desarrollaron
embriogénesis somática de alta frecuencia y embriogénesis somática de baja
frecuencia, se obtuvieron en el medio de cultivo suplementado con 4.0 mg.L-1 de
2,4–D y 1.0 mg.L-1 de kinetina (Tabla 1). Este tratamiento mostró diferencias
estadísticas con el resto de las combinaciones de los reguladores de crecimiento
estudiados.
Tabla 1. Efecto de diferentes combinaciones de 2,4-D y kinetina en la inducción de la embriogénesis somática directa a partir de embriones cigóticos en Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo
Tratamientos
No. de explantes con
ESAF
Porcentaje de explantes con
ESAF (%)
No. de explantes con
ESBF
Porcentaje de explantes con
ESBF (%) 1 24.20 c 30.25 12.30 c 15.38 2 32.82 a 41.02 16.41 a 20.51 3 27.42 b 34.28 14.17 b 17.71
E. E. ± 0.45 ± 0.38 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente según la prueba de rangos múltiple de Duncan (p< 0.05).
Referencias Bibliográfícas
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Tratamientos. 1) 2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 2) 4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 3) 6.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina.
Los resultados presentados en este experimento demostraron el efecto positivo del
2,4-D combinado con la kinetina en la inducción de la embriogénesis somática
directa en la especie Swietenia macrophylla King a partir de embriones cigóticos
como explante inicial.
En los escasos estudios sobre la inducción de la embriogénesis somática en el
género Swietenia, se ha investigado el efecto del 2,4-D (1.0 – 5.0 mg.L-1)
combinado con la kinetina (0.5 – 2.0 mg.L-1), en diferentes tipos de explantes como
discos de hoja, ápices y segmentos nodales de plantas germinadas in vitro. Sin
embargo no se obtuvieron resultados alentadores en cuanto a la respuesta
embriogénica (Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y
Quoirin, 2004; Medina y Sotolongo, 2004).
Con los resultados obtenidos se describe por vez primera la embriogénesis
somática directa a partir de embriones cigóticos en Swietenia macrophylla King. El
efecto de la combinación del 2,4-D con la kinetina sobre la inducción de la
embriogénesis somática, difiere con los resultados señalados por Shaji et al. (1997)
en la meliácea Naregamia alata, en la cual no lograron una respuesta embriogénica.
Sin embargo, Zhang (2000), planteó que con el empleo de 2,4–D en combinación
con Kinetina (0.5–1.0 mg.L-1) en la inducción de embriogénesis somática en
Gossypium hirsutum, se logró la embriogénesis somática directa y los mayores
valores de embriogénesis somática de alta frecuencia se manifestaron en los
Referencias Bibliográfícas
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tratamientos donde el medio de cultivo fue suplementado con concentraciones de
3.0 – 5.0 mg.L-1 de dicha auxina.
En especies Meliáceas como Azadirachta excelsa y Azadirachta indica, Giagnacovo
et al. (2001) y Salvi et al. (2001) señalaron que el empleo de embriones cigóticos
inmaduros como explante inicial, en un medio de cultivo MS al que le adicionaron
como reguladores de crecimiento el 2,4-D (2.0 – 8.0 mg.L-1) combinado con kinetina
(1.0 mg.L-1), lograron la embriogénesis somática directa.
Los porcentajes de embriogénesis somática de alta frecuencia (30.25, 34.28, 41.02
%) y embriogénesis somática de baja frecuencia (15.38, 17.71, 20.51%), obtenidos
en el presente trabajo con todas las combinaciones de 2,4-D y kinetina estudiadas
fueron superiores a los logrados por Giagnacovo et al. (2001), 8.0 y 10.3 %, en la
especie Azadirachta excelsa.
En el presente experimento se evidenció que con el empleo de un medio de cultivo
compuesto por las sales MS suplementado con 200.0 mg.L-1 de L-glutamina, 1.0
mg.L-1 de tiamina, 1.0 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1.0 mg.L-1 de piridoxina, 200.0
mg.L-1 de extracto de malta y 4 % de sacarosa, con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado
con 1.0 mg.L-1 de kinetina se logró el desarrollo de la embriogénesis somática
directa en Swietenia macrophylla King a partir de embriones cigóticos inmaduros.
4.1.2. Desarrollo de embriones somáticos en etapa globular
En el medio de cultivo para la diferenciación de embriones somáticos con 0.4 mg.L-1
de 6-BAP, se observaron desde los diez días de cultivo embriones somáticos en
etapas de torpedo y cotiledonal. Sin embargo, a los 30 días en todos los
Referencias Bibliográfícas
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tratamientos estudiados un alto porcentaje de embriones somáticos alcanzaron
estas etapas de desarrollo, los cuales presentaron una coloración blanca, con
cotiledones definidos y presencia de embriogénesis somática secundaria asociada
(Figura 3).
Figura 3. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King que alcanzaron las etapas de torpedo y cotiledonal en el medio de cultivo para la diferenciación con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP a los 30 días de cultivo. Al comparar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo
de los embriones somáticos (Tabla 2), se observó que en todos los tratamientos
estudiados los embriones somáticos alcanzaron las etapas torpedo y cotiledonal.
Los valores más altos de embriones somáticos en estas etapas de desarrollo, se
presentaron cuando se añadió al medio de cultivo 0.4 mg.L-1 de 6-BAP con
diferencias con respecto a los demás tratamientos.
Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 30 días de cultivo
Embriones somáticos en etapa torpedo
Embriones somáticos en etapa cotiledonal
Concentraciones de 6-BAP (mg.L-1).
No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%) 0.0 0.56 c 5.60 7.52 d 75.20 0.2 0.67 b 6.70 7.98 c 79.80 0.4 0.74 a 7.40 9.17 a 91.70 0.6 0.71 ab 7.10 8.63 b 86.30
E. E. ± 0.02 ± 0.11 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Referencias Bibliográfícas
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La adición de bajas concentraciones de citoquinina al medio de cultivo favorece el
desarrollo de los embriones somáticos, ya que estos durante el proceso de
histodiferenciación se desarrollan debido a la división celular (Parrott , 2002).
Los resultados obtenidos demuestran el efecto del 6-BAP en el desarrollo de los
embriones somáticos en Swietenia macrophylla King. En los tratamientos donde se
adicionaron concentraciones de este regulador de crecimiento al medio de cultivo,
se obtuvieron resultados superiores con respecto al control. Resultados similares
relacionado con el empleo de bajas concentraciones de 6-BAP (0.2-0.5 mg.L-1) en
la histodiferenciación de los embriones somáticos fueron obtenidos en otras
especies de meliaceas como Cedrela fissilis y Cedrela odorata (Da costa et al.,
2002; Muños et al., 2003). Esta citoquinina también fue utilizada para el desarrollo
de embriones somáticos en Pinus taeda (Pullman et al., 2005).
El proceso de desarrollo de los embriones somáticos fue estimulado con las
diferentes concentraciones de 6-BAP empleadas (0.2, 0.4 y 0.6 mg.L-1) y fue en el
tratamiento con 0.4 mg.L-1 de 6-BAP donde obtienen los mayores porcentajes de
embriones somáticos en etapas de torpedo y cotiledonal.
4.2. Desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia
macrophylla King
4.2.1. Inducción de la embriogénesis somática indirecta
A partir de la tercera semana los cotiledones colocados en el medio de cultivo para
la inducción de la embriogénesis somática indirecta comenzaron a mostrar cambios
morfológicos. Se observó inicialmente un engrosamiento del borde de los
explantes. En la octava semana de cultivo, un alto porcentaje de los explantes
Referencias Bibliográfícas
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presentaron formación de callo en las tres combinaciones de 2,4–D con kinetina
estudiadas con diferencias entre estos tratamientos.
Los callos formados cubrieron la totalidad del explante, presentaron color pardo
oscuro y características nodulares, en todos los tratamientos evaluados (Figura 4).
Figura 4. Callo formado a partir de una sección cotiledonal de semilla de fruto inmaduro de Swietenia macrophylla King a las ocho semanas de cultivo. Los resultados presentados demostraron el efecto positivo del 2,4-D combinado con
la kinetina en la formación de callo en la especie Swietenia macrophylla King. Los
mayores valores del número de explantes con callo se presentaron en los
tratamientos dos (4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) y tres (6.0 mg.L-1 de
2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) con diferencias significativas con el tratamiento uno
(2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina) (Tabla 3).
Tabla 3. Efecto de diferentes combinaciones de 2,4-D y kinetina en la formación de callo a partir de secciones cotiledonales en Swietenia macrophylla King a las seis semanas de cultivo
Tratamientos No. de explantes con callo/frasco Porcentaje (%) 1 3.75 b 93.70 2 3.87 a 96.98 3 3.88 a 97.02
E. E. ± 0.03 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Tratamientos.
Referencias Bibliográfícas
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1) 2.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 2) 4.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina. 3) 6.0 mg.L-1 de 2,4-D + 1.0 mg.L-1 de kinetina.
Resultados similares fueron obtenidos en el híbrido (Swietenia macrophylla King X
Swietenia mahogani Jacq) por Medina y Sotolongo (2004), quienes señalaron que
cuando se combinaron en el medio de cultivo los reguladores de crecimiento 2,4-D
(4.0 – 6.0 mg.L-1) y kinetina (1.0 mg.L-1 ), se logró el mayor número de explantes
con callo.
En los estudios realizados sobre la inducción de la embriogénesis somática
indirecta en el género Swietenia, han sido utilizado con éxito para la formación de
callos el 2,4-D (1.0 – 5.0 mg.L-1) combinado con la kinetina (0.5 – 2.0 mg.L-1)
(Maruyama e Ishii, 1999; Peña y Lezcano, 2001; Cruz de Rocha y Quoirin, 2004).
Se puede concluir con estos resultados que con concentraciones de 4.0 y 6.0 mg.L-1
de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de kinetina se obtienen los mayores porcentajes
de formación de callo en Swietenia macrophylla King.
4.2.2. Formación y diferenciación de embriones somáticos a partir de callos
En los explantes colocados en el medio de cultivo para la formación y
diferenciación de los embriones somáticos, a partir de los 40 días de cultivo se
observaron pequeñas estructuras de coloración amarillo intenso sobre los callos
cultivados con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP y a los 50 días de cultivo en un gran número de
callos se observó la presencia de ESAF y ESBF (Figura 5).
Referencias Bibliográfícas
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Figura 5. Embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King obtenida con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP a los 50 días de cultivo (A. Callo con ESAF y B. Callo con ESBF).
La embriogénesis somática de alta frecuencia se caracterizó por la presencia de
grupos de un gran número de proembriones y también de embriones somáticos en
etapa globular de color blanco amarillento; sin embargo, en la embriogénesis
somática de baja frecuencia se observaron embriones somáticos aislados en
diferentes etapas de desarrollo.
A los 60 días se observó que algunos de los embriones somáticos formados a partir
de los callos, en el medio de cultivo para la formación y diferenciación con 1.0 mg.L-
1 de 6-BAP, se encontraban en la etapa de torpedo (Figura 6 A). En todos los
tratamientos se observó a los 80 días de cultivo un alto porcentaje de embriones
somáticos en etapa cotiledonal (Figura 6 B).
Figura 6. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla king formados a partir de callos con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP (A. Embriones somáticos a los 60 días de cultivo y B. Embriones somáticos en etapa cotiledonal a los 80 días de cultivo).
A
B
A B
A B
Referencias Bibliográfícas
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Al comparar el efecto del 6-BAP sobre la embriogénesis somática indirecta (Tabla
4),
se encontró que en los tratamientos donde se adicionaron las concentraciones de
esta citoquinina al medio de cultivo los porcentajes de ESAF y ESBF fueron
superiores a los obtenidos en el control.
Los valores más altos del número de callo con ESAF y ESBF se presentaron en los
callos que fueron cultivados en el medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP, este
tratamiento manifestó diferencias significativas con el resto de los tratamientos.
Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo
Callo con Embriogénesis somática de alta frecuencia
Callo con Embriogénesis somática de baja frecuencia
Concentraciones de 6-BAP (mg.L-1)
No. callo/frasco Porcentaje No. callo/frasco Porcentaje 0.0 1.43 c 23.81 % 0.67 d 11.13 % 0.5 2.77 b 46.15 % 1.71 c 28.56 % 1.0 3.18 a 53.01 % 2.04 a 33.92 % 2.0 2.82 b 47.00 % 1.83 b 30.61 %
E. E. ± 0.04 ± 0.02 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Los resultados demuestran que la adición de 6-BAP al medio de cultivo incrementa
significativamente la formación de embriones somáticos en los callos originados a
partir de secciones de cotiledones. Nos muestran también que este proceso se
logra sin la presencia de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo.
Resultados similares fueron descrito en otras especies Meliaceas como:
Azadirachta excelsa y Azadirachta indica, donde se señala que los callos cultivados
con 1.0 mg.L-1 de esta citoquinina presentaron una formación de embriones
Referencias Bibliográfícas
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somáticos superior con respecto a los que se cultivaron en el medio de cultivo sin
reguladores de crecimiento (Giagnacovo et al., 2001; Salvi et al., 2001).
En cuanto al número de embriones somáticos por callo, los valores máximos se
obtuvieron en los callos que se cultivaron en un medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de
6-BAP, con diferencias con respecto a los demás tratamientos (Tabla 5). La
presencia de los embriones somáticos en los callos cultivados con esta citoquinina,
demostró el efecto de la misma en la formación de embriones somáticos en
Swietenia macrophylla King.
Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el número de embriones somáticos por callo y el desarrollo de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 80 días de cultivo
Concentraciones de 6-BAP (mg.L -1)
No. de ES por callo
No. de ES por callo en etapa cotiledonal
Porcentaje de ES en etapa cotiledonal
0.0 18.73 d 15.58 d 83.21 % 0.5 31.62 c 27.58 c 87.23 % 1.0 43.35 a 40.37 a 93.12 % 2.0 36.18 b 32.83 b 90.74 %
E. E. ± 0.36 ± 0.34 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
En la embriogénesis somática en Meliaceas como Cedrela fissilis Vellozo y Cedrela
odorata utilizan el 6-BAP en los medios de cultivo para la formación y
diferenciación de embriones somáticos. En estas especies los valores más altos del
número de embriones somáticos por callo fueron obtenidos con 1.0 mg.L-1de 6-BAP
(Da Costa et al., 2002; Muños, 2003).
Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo de
los embriones somáticos formados a partir de callos a los 80 días de cultivo, se
observó que un alto porcentaje de embriones somáticos alcanzaron la etapa
Referencias Bibliográfícas
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cotiledonal en todos los tratamientos. El valor más alto del número de embriones
somáticos por callo en esta etapa de desarrollo, se presentó cuando se añadió al
medio de cultivo 1.0 mg.L-1 de esta citoquinina, con diferencias significativas con
respecto a los otros tratamientos.
Con los resultados obtenidos se demostró el efecto del 6-BAP en el desarrollo de
los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King formados a partir de callos.
En especies leñosas como Eucalyptus globulus Labill y Quercus suber L, la adición
de concentraciones de 6-BAP en el rango de 0.5–1.5 mg.L-1 al medio de cultivo
incrementó los valores de embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal
(Pinto et al., 2002; Hernández et al., 2003).
Resultados similares respecto a la utilización de bajas concentraciones de 6-BAP
(0.5 - 1.0 mg.L-1) para la diferenciación de embriones somáticos fueron obtenidos
en otras especies leñosas como Psidium guajava L. cv. EEA 18-40 y Coffea arabica
L. cv. Caturra rojo (Vilches et al., 2001; Barbón et al., 2002).
Estos resultados demostraron que la formación y diferenciación de embriones
somáticos a partir de callos en Swietenia macrophylla King se favoreció con la
adición de 6-BAP al medio de cultivo. Con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP se obtienen los
mayores porcentajes de ESAF y ESBF, así como el mayor número de embriones
somáticos por callo y embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal.
4.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
4.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones
somáticos
Referencias Bibliográfícas
- 113 -
Al evaluar el efecto de los diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de
los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King a los 60 días de
transferidos al medio de cultivo MS modificado, observamos que en los explantes
que fueron deshidratados durante 72 y 96 horas el porcentaje de supervivencia
disminuyó. Los valores más bajos de esta variable se presentaron en el tratamiento
donde los embriones somáticos fueron expuesto al mayor tiempo de deshidratación
(Tabla 6). Resultados similares fueron obtenidos por Chand y Kumar (2001), los
cuales realizaron estudios sobre la deshidratación de los embriones somáticos en la
fase de maduración en la especie Hardwickia binata Roxb y demostraron que los
explantes expuestos a este proceso durante 72 o más horas posteriormente
presentaron afectaciones en la supervivencia.
Tabla 6. Efecto de diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo
Supervivencia de los
ES
Germinación completa
Embriogénesis somática secundaria
Tiempo de
deshidratación (horas). No.
ES/frasco Porcentaje
(%) No.
ES/frasco Porcentaje
(%) No.
ES/frasco Porcentaje
(%) 0.0 20.00 a 100.00 11.14 a 55.72 8.06 40.31
24.0 20.00 a 100.00 10.24 b 51.18 7.96 39.81 72.0 18.20 b 91.00 7.27 c 36.37 8.12 40.63 96.0 15.17 c 75.86 4.28 d 21.43 8.23 41.19 E. E. ± 0.21 ± 0.22 N.S
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Cuando los embriones somáticos fueron expuestos a diferentes tiempos de
deshidratación los porcentajes de germinación disminuyeron. El mayor valor de esta
variable lo presentó el control y mostró diferencias significativas con el resto de los
tratamientos. Con este resultado se demostró que en la especie Swietenia
macrophylla King, la deshidratación de los embriones somáticos por el método
Referencias Bibliográfícas
- 114 -
empleado y en los tiempos probados, influyó negativamente en la germinación. Este
resultado no coincide con los obtenidos por Choi y Jeong (2003) los cuales plantean
que en la especie Siberian ginseng se incrementaron los porcentajes de
germinación después de haber expuesto los embriones somáticos a 72 horas de
deshidratación. Sin embargo, coincide con Kumria et al. (2003) quienes plantearon
que la deshidratación de los embriones somáticos en Gossypium hirsutum no indujo
respuesta positiva en la germinación.
Algunos autores han encontrado que con la exposición de los embriones somáticos
a tiempos de deshidratación en el rango de 48–96 horas se reduce la
embriogénesis somática secundaria asociada a los mismos en especies como en
Populus spp (Lakshmi, 1999) y Acacia caven (Marinucci et al., 2004). Sin embargo,
estos resultados difieren de los resultados obtenidos ya que con ninguno de los tres
tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se obtuvieron
porcentajes de embriogénesis secundaria significativamente inferiores al control.
Los resultados obtenidos demostraron que la deshidratación afectó la maduración
de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King, ya que con los tres
tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se lograron
porcentajes de germinación inferiores al control.
4.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de
los embriones somáticos
A los 30 días de cultivo los embriones somáticos mostraron una apariencia diferente
en los medios de cultivo con seis y ocho porciento de sacarosa, estos presentaron
un incremento de tamaño, así como una coloración blanca opaca y pronunciación
Referencias Bibliográfícas
- 115 -
del polo radicular. Mientras que, los explantes cultivados en el tratamiento uno (4.0
% de sacarosa) mantuvieron el color blanco traslúcido, aunque también con un
aumento de tamaño (Figura 7).
Figura 7. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King en el medio de cultivo de maduración a los 30 días de cultivo (A. 4.0 % de sacarosa; B. 6.0 % de sacarosa; C. 8.0 % de sacarosa). Se ha demostrado que los agentes osmóticos activos como la sacarosa pueden
inhibir el proceso de germinación precoz y en algunos casos es más efectivo el
establecimiento de alta presión osmótica en el medio de cultivo que el aporte
exógeno de ABA (Perán-Quesada, 2001).
El cambio de coloración de blanco-traslucido a blanco-opaco en los embriones
somáticos de Swietenia macrophylla King debido al incremento de las
concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo para la maduración, puede ser
un indicador del aumento de almacenamiento de sustancias de reserva y de
maduración.
En la especie Persea americana L. Márquez et al. (2003), demostraron que el
cambio de color de blanco-traslucido a blanco-opaco en los embriones somáticos,
era una respuesta al incremento de sustancias de reserva, lo cual mejoró la
A B C
Referencias Bibliográfícas
- 116 -
maduración. Estos autores obtuvieron la mayor cantidad de embriones blancos–
opacos cuando adicionaron al medio de cultivo de 5.0 a 7.0 % de sacarosa.
Cuando evaluamos el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la
supervivencia y la germinación completa de los embriones somáticos de Swietenia
macrophylla King. A los 60 días de transferidos al medio de cultivo compuesto por la
mitad de las sales MS, vitaminas MS y 2.0 % de sacarosa, observamos que la
supervivencia se afectó con el empleo de explantes provenientes del medio de
cultivo con 8.0 % de sacarosa, que fue significativamente inferior al resto de los
tratamientos (Tabla 7). Resultados similares fueron obtenidos por Márquez et al.
(2003), los cuales realizaron estudios sobre la influencia de agentes osmóticos
activos en la fase de maduración de los embriones somáticos en la especie Persea
americana L y demostraron que los explantes cultivados durante períodos de 15 y
30 días con concentraciones de sacarosa superiores a 7.5 % posteriormente
presentaron afectaciones en la supervivencia.
Tabla 7. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa sobre la supervivencia y la germinación completa de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo
Supervivencia de los ES Germinación completa de los ES Tratamientos No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%)
Control 7.00 a 100.00 2.74 d 39.14 1 7.00 a 100.00 4.59 b 65.64 2 7.00 a 100.00 5.33 a 76.17 3 6.51 b 93.00 3.77 c 53.83
E. E. ± 0.08 ± 0.11 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05 según la prueba de Duncan. Tratamientos
1. Embriones somáticos cultivados en 4.0 % de sacarosa. 2. Embriones somáticos cultivados en 6.0 % de sacarosa. 3. Embriones somáticos cultivados en 8.0 % de sacarosa.
Control. Embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones de sacarosa.
Referencias Bibliográfícas
- 117 -
La adición de sacarosa en el rango de 4.0 a 8.0 % al medio de cultivo incrementó
significativamente la maduración de los embriones somáticos. Los explantes
provenientes de los medios de cultivo con las diferentes concentraciones de este
agente osmótico, después de cultivados durante 60 días en el medio de cultivo MS
modificado presentaron un mayor porcentaje de germinación que el control, los
mejores resultados se obtuvieron en el tratamiento dos.
Al analizar los resultados se observó, que con el empleo de embriones somáticos
madurados con la mayor concentración de sacarosa (8.0 %), se presentó una
disminución de la germinación. Resultados similares fueron obtenidos por Abedini et
al. (2000), los cuales señalaron que en la especie Acacia caven la maduración de
los embriones somáticos con concentraciones de sacarosa superiores al 7.5 %
produjo una afectación de la germinación. Estos mismos autores atribuyeron la
causa de la disminución de los valores de esta variable a las altas concentraciones
de este agente osmótico, el cual está correlacionado con la mortalidad celular.
Con respecto a la embriogénesis somática secundaria, se presentaron porcentajes
inferiores al control. Los valores más bajos de esta variable se obtuvieron en los
embriones somáticos madurados con las mayores concentraciones de sacarosa
(6.0 y 8.0 %) con diferencias significativas con el tratamiento uno (4.0 % de
sacarosa) (Tabla 8).
Tabla 8. Número de embriones somáticos con embriogénesis secundaria y malformados bajo el efecto de diferentes concentraciones de sacarosa a los 60 días de cultivo en Swietenia macrophylla King
ES con Embriogénesis secundaria ES malformados Tratamientos No. ES/frasco Porcentaje (%) No. ES/frasco Porcentaje (%)
Control 2.88 a 41.12 0.09 d 1.28 1 1.83 b 26.18 0.30 c 4.32 2 1.69 c 24.12 0.67 b 9.54 3 1.65 c 23.63 1.24 a 17.65
E. E. ± 0.03 ± 0.02 Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Referencias Bibliográfícas
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Tratamientos
1. Embriones somáticos cultivados en 4.0 % de sacarosa. 2. Embriones somáticos cultivados en 6.0 % de sacarosa. 3. Embriones somáticos cultivados en 8.0 % de sacarosa. Control. Embriones somáticos en etapa cotiledonal que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones de sacarosa. ES: Embriones somáticos.
Los porcentajes inferiores de embriogénesis somática secundaria en Swietenia
macrophylla King presentados en los tratamientos en los cuales los explantes
fueron cultivados con las más altas concentraciones de sacarosa estudiadas, nos
demuestra que los embriones somáticos sometidos a un proceso de maduración
con este agente osmótico alcanzaron una etapa de desarrollo más avanzada que
los embriones somáticos que no fueron cultivados en las diferentes concentraciones
de sacarosa. Estos resultados coinciden con Fernández et al. (1995), los mismos
señalaron que en la especie Quercus suber L, los embriones somáticos cultivados
en un medio de cultivo MS con concentraciones de sacarosa en el rango
comprendido entre 6.0 y 9.0 %, presentaron porcentajes de embriogénesis somática
secundaria inferiores con respecto a los embriones somáticos que no recibieron un
tratamiento de maduración.
En otra especie leñosa como Quercus robur L, Cuenca et al. (1999) y Zegzouti et al.
(2001), demostraron que con el aumento del estado de madurez de los embriones
somáticos, disminuyó la embriogénesis somática secundaria. Estos autores
demostraron con el empleo de técnicas de cortes histológicos, en la especie
anteriormente mencionada, que los embriones somáticos cultivados durante 30 días
con altas concentraciones (6.0 – 9.0 %) de sacarosa, presentaron un número de
Referencias Bibliográfícas
- 119 -
células embriogénicas predeterminada muy bajo al ser comparados con embriones
somáticos inmaduros.
El incremento o la disminución de la embriogénesis somática secundaria tiene una
alta dependencia de la presencia o no de células embriogénicas predeterminadas
en los tejidos epidérmicos de los embriones somáticos y en la medida que estos son
más diferenciados desciende su carácter embriogénico (Parrott, 2002).
Con el aumento de las concentraciones de sacarosa en el medio de cultivo para la
maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King, se
incrementaron los porcentajes de embriones somáticos malformados estos
explantes aumentaron aproximadamente tres veces su tamaño inicial y adquirieron
una forma redondeada con aspecto hiperhídrico. Los valores más altos de esta
variable se presentaron en el tratamiento donde los explantes fueron cultivados con
la mayor concentración (8.0 %) de este agente osmótico.
Varios autores han señalado que la adición de altas concentraciones (5.0 – 10.0 %)
de sacarosa al medio de cultivo en la fase de maduración es una de las causas que
aumenta la malformación de los embriones somáticos (Fernández et al. 1995;
Cuenca et al., 1999; Svobodova et al., 1999). Comportamientos similares en el
porcentaje de embriones somáticos deformados han sido descrito por Zegzouti et al.
(2001), para la fase de maduración en Quercus robur L.
Sobre la base de estos resultados se puede concluir que con la adición de altas
concentraciones de sacarosa al medio de cultivo se estimula la maduración de los
Referencias Bibliográfícas
- 120 -
embriones somáticos en Swietenia macrophylla King, pues en el tratamiento con 6%
de este agente osmótico no se afectó la supervivencia de los embriones somáticos,
se obtiene el mayor porcentaje de germinación completa de los embriones
somáticos y bajos niveles de embriogénesis somática secundaria.
4.4. Germinación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
4.4.1 Efecto del 6-BAP y el AG3 sobre la germinación de embriones somáticos
Cuando evaluamos el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 en la
germinación de embriones somáticos en Swietenia macrophylla King se puede
observar que el mayor porcentaje de embriones somáticos con germinación
completa se obtuvo en el medio de cultivo control con diferencias significativas con
el resto de los tratamientos (Tabla 9). Los valores de esta variable disminuyeron con
el incremento de las concentraciones de 6-BAP y no se observó respuesta cuando
se le añadió al medio de cultivo AG3 .
Tabla 9. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 en la germinación de embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo
Germinación completa de los ES
Germinación parcial de los ES
Tratamientos
No. ES/frasco Porcentaje No. ES/frasco Porcentaje Control 5.43 a 77.62 % 0.93 a 13.35 % 0.2 mg.l-1 de 6-BAP 2.75 b 39.34 % 0.81 b 11.54 % 0.4 mg.l-1 de 6-BAP 2.53 c 36.19 % 0.44 c 6.26 % 0.6 mg.l-1 de 6-BAP 1.76 d 25.16 % 0.18 d 2.58 % 1.0 mg.l-1 de AG3 0.00 e 0.0 % 0.13 de 1.83 % 2.0 mg.l-1 de AG3 0.00 e 0.0 % 0.08 e 1.12 % E. E. ± 0.06 ± 0.02
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan. Algunos autores han señalado que la adición de 6-BAP al medio de cultivo
incrementa la germinación de los embriones somáticos (Barbón et al., 2002; Vilchez
Referencias Bibliográfícas
- 121 -
et al., 2004). Sin embargo, en la Swietenia macrophylla King, los resultados
obtenidos indicaron que las concentraciones de 6-BAP añadidas al medio de cultivo
influyeron negativamente en la germinación de los embriones somáticos y se
demostró que los mejores resultados en esta etapa se presentaron en el medio de
cultivo sin reguladores de crecimiento.
El porcentaje de embriones somáticos con germinación parcial disminuyó con el
incremento de las concentraciones de 6-BAP. En los tratamientos donde se
adicionó al medio de cultivo AG3 los embriones somáticos solamente emitieron el
brote apical; mientras que, en los otros tratamientos se produjo la formación y
desarrollo del brote apical y radical.
Varios autores han mencionado que con el empleo de bajas concentraciones (1.0 –
2.0 mg.L-1) de AG3 lograron romper el estado de dormancia de los embriones
somáticos e incrementaron la germinación de los mismos en especies como:
Hyophorbe lagenicaulis (Sarasan et al., 2002), Siberian ginseng (Choi y Jeong,
2003) y Gossipyum hirsutum (Kumria et al., 2003). Dicho criterio no coincide con
los resultados obtenidos ya que las dos concentraciones de AG3 probadas (1.0 y 2.0
mg.L-1) solo estimularon el desarrollo de brote apical en los embriones somáticos e
inhibieron la emisión de raíz. Sin embargo, los embriones somáticos germinados a
los 60 días en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento presentaron las
características típicas de planta y alcanzaron una altura de tres a cinco cm,
presencia de raíz definida y de tres a cinco hojas verdaderas (Figura 8). Los
resultados mencionados anteriormente confirma lo planteado por Parrott (2002)
Referencias Bibliográfícas
- 122 -
relacionado con que la germinación de los embriones somáticos puede ocurrir sin
la presencia de reguladores de crecimiento.
Figura 8. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla King germinados después de 60 días en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento.
Fueron observados valores altos para el porcentaje de embriones somáticos con
embriogénesis secundaria en todos los tratamientos, pero el mayor valor de esta
variable se alcanzó cuando se le adicionó al medio de cultivo 0.6 mg.L-1 de 6-BAP
(Tabla 10). Con este resultado se demostró que en la especie Swietenia
macrophylla King la embriogénesis somática repetitiva puede ocurrir en ausencia de
auxinas exógena, de acuerdo a las condiciones de cultivo desarrolladas.
Tabla 10. Número de embriones somáticos que desarrollaron embriogénesis secundaria en Swietenia macrophylla King bajo el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y AG3 a los 60 días de cultivo
Embriones somáticos con embriogénesis secundaria Tratamientos No. de ES por frasco Porcentaje (%)
Control 2.81 d 40.17 0.2 mg.l-1 de 6-BAP 3.19 c 45.53 0.4 mg.l-1 de 6-BAP 3.74 b 53.43 0.6 mg.l-1 de 6-BAP 4.16 a 59.36 1.0 mg.l-1 de AG3 2.68 e 38.33
Referencias Bibliográfícas
- 123 -
2.0 mg.l-1 de AG3 2.60 f 37.15 E. E. 0.02
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Con el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento se obtuvieron los mayores
porcentajes de germinación completa y parcial de los embriones somáticos,
mientras que, con el 6-BAP se produce una disminución de la germinación e
incremento de la embriogénesis somática secundaria y el AG3 provoca inhibición de
la germinación completa con los mas bajos valores de germinación parcial.
Referencias Bibliográfícas
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Conclusiones
Referencias Bibliográfícas
- 125 -
5. CONCLUSIONES
1. Con el empleo de un medio de cultivo MS con 4.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0 mg.L-1 de
kinetina se desarrolló la embriogénesis somática directa a partir de embriones
cigóticos inmaduros.
2. Los mayores porcentajes de embriones somáticos en etapas de torpedo y
cotiledonal se alcanzaron con una concentración de 0.4 mg.L-1 de 6-BAP en el
medio de cultivo.
3. Con una concentración de 4.0 y 6.0 mg.L-1 de 2,4-D combinado con 1.0 mg.L-1 de
kinetina se obtuvieron los mayores porcentajes de formación de callo, 96.98% y
97.02% respectivamente.
4. Se lograron los mayores porcentajes (53.01 % y 33.92 %) de ESAF y ESBF, el
mayor número (43.35) de embriones somáticos por callo y embriones somáticos
en etapa cotiledonal con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP.
5. El proceso de deshidratación afectó la maduración de los embriones somáticos,
con los tratamientos aplicados, los porcentajes de germinación obtenidos fueron
inferiores a los logrados con el control
6. Con un 6.0 % de sacarosa se obtuvo el mayor porcentaje (76.17 %) de
germinación completa de los embriones somáticos y bajos niveles de
embriogénesis somática secundaria.
Referencias Bibliográfícas
- 126 -
7. Los mayores valores (77.62 % y 13.35 %) de germinación completa y parcial de
los embriones somáticos se lograron en un medio de cultivo sin reguladores del
crecimiento.
Recomendaciones
Referencias Bibliográfícas
- 127 -
6. RECOMENDACIONES
- Realizar otros estudios para mejorar la fase de maduración de los embriones
somáticos.
- Estudiar la fase de conversión de los embriones somáticos germinados in vitro.
- Emplear otros tipos de explantes para el proceso de embriogénesis.
- Determinar marcadores bioquímicos que caractericen el proceso de embriogénesis
somática.
Referencias Bibliográfícas
- 128 -
Referencias Bibliográficas
Referencias Bibliográfícas
- 129 -
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFÍCAS
Abedini, W, Boeri P, Marinucci L, Ruscitti M y Scelzo L (2000) Biotécnicas aplicadas
a especies forestales nativas. Investigación Agraria: Sistemas y Recursos
Forestales 9: 31-43
Agustine, W (1999) Somatic embryogenesis of Gentumula, Tree Improvement.
Science Publishers. Editor Sunil Puri. Estados Unidos.
Alemano, L, Berthouly M y Micaux-Ferreiere N (1997) Embryogenese somatique
ducacaoyer a partir de pieces florales. Plantation Recherche Developpment 3:
225-237
Altman, A y Loberant B (1998) Micropropagation. Clonal plant propagation in vitro.
Agricultural Biotechnology 8: 19-42
Alvarez, A (2000) La Genética Forestal en Cuba: Avances del siglo XX y desafíos
del siglo XXI. Recursos Genéticos Forestales 27: 18-28
Alvarez, A y Ponce D (1995) Base de datos sobre los recursos fitogenéticos
forestales arbóreos de Cuba. IIF. La Habana.
Ashmore, S y Egelman E (1997) Status report on the delopment and application of
in vitro techniques for the conservation and use of plant genetics resources.
IPGRI. Roma.
Bandyopadhyay, S y Hamill J (2000) Ultrastructural studies of somatic embryos of
Eucalyptus nitens and Comparisons with zygotic embryos found in mature seeds.
Ann Bot 86:237–244
Referencias Bibliográfícas
130
Bang, J, Dong S, Sunng H y Jang R (1999) Plant regeneration from embryogenic
cells-derived protoplast of Bupleurum falcatum. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 55: 151-154
Barbón, R (2001) Efecto del dióxido de carbono sobre la embriogénesis somática de
Coffea arabaica L. cv. Caturra rojo y Clematis tangutica K. Tesis presentada en
opción al grado científico de doctor. Universidad Central ¨Marta Abreu¨ de Las
Villas. Instituto de Biotecnología de las Plantas.
Barbón, R, Jiménez E, De Feria M, Quiala E, Capote A y Chavez M (2002) Influencia
del genotipo y la densidad de inoculación sobre la diferenciación de embriones
somáticos de Coffea arabica L. cv. Caturra rojo y Coffea canephora cv. Robusta.
Biotecnología Vegetal 3: 145-148.
Cabasson, C, Alvard A, Danbier D, Ollitraul P y Teisson C (1997) Improvement of
Citrus somatic embryos development by temporary immersion. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture 50: 33-37
Canhoto, J, López M y Cruz G (1999) Somatic embryogenesis and plant
regeneration in myrtle (Myrtaceae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 57: 13-
21
Chand, S y Kumar A (2001) Direct somatic embryogenesis from zygotic embryos of a
timber-yielding leguminous tree, Hardwickia binata Roxb. Current Science 80: 7-
10
Choi, Y y Jeong J (2003) Dormancy induction of somatic embryos of Siberian
ginseng by high sucrose concentrations enhances the conservation of hydrated
artificial seeds and dehydration resistance. Plant Cell Reports 20: 1112–1116
Referencias Bibliográfícas
131
Collado, R, Barbón R, Agramonte D, Jiménez F, Pérez M y Gutierrez O (2005)
Diferenciación de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King en medio
de cultivo semisólido. En: Memorias Congreso Internacional Biotecnología
Agrícola (BioVeg 2005). Ciego de Avila. Cuba
Cramer, C y Bridgen (1997) Somatic embryogenesis and shoot proliferation of
Mussaenda cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 50: 135-138
Cruz da Rocha, S y Quoirin M (2004) Calogeneses e Rizogeneses em Explantes de
Mogno (Swietenia macrophylla King) cultivados in vitro. Ciencia Forestal, Santa
Maria 14: 91-101.
Cuenca, B, San-José M, Martinez M, Ballester A y Vieitez A (1999) Somatic
embryogenesis from stem and leaf explants of Quercus robur L. Plant Cell
Reports 18: 538-543
D´Osorio, CD, Morini S y Bellocchi G (1998) Effect of light quality on somatic
embryogenesis of quince leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 33: 91-98
Da Costa, E, Volkmer de Castillo C, Netto F y Viana A (2002) In vitro culture of
Cedrela fissilis Vellozo (Meliaceae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 70: 259
– 268
Danso, K y Ford-Lloyd B (2002) Induction of high-frequency somatic embryos in
cassava for cryopreservation. Plant Cell Reports 21: 226-232
Fernández, B, Celestino C y Toribio M (1995) Influence of external factors on
secondary embryogenesis and germination in somatic embryos from leaves of
Quercus suber. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 41: 99-106
Referencias Bibliográfícas
132
Giagnacovo, G, Pasqua G, Monacelli B, Van S, Maccioni O y Vitali F (2001)
Organogenesis and embryogenesis from callus cultures of Azadirachta excelsa.
Plant-biosystems135:13-18
Gómez, R. 1998. Generalidades sobre la embriogénesis somática. Resúmenes del
curso Internacional de Propagación Masiva in vitro de especies vegetales.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Santa Clara. Cuba.
Grapin, A, Ferriére M, Etienne H y Carron M (1994) Effect of hypoxia on induction
and development of somatic embryos in Hevea brasiliensis. En: In vitro culture of
tropical plants. Ed by Claude Teisson, CIRAD. 23-25 p
Grogan, J, Ashton M y Galvao J (2003) Big-leaf mahogany (Swietenia macrophylla)
seedling survival and growth across a topographic gradient in southeast Pará,
Brazil. Forest Ecology and Management 186: 311-326
Haines, R y Martin B (1997) Biotechnology and the sustainable production of tropical
timber. Forest Genetic Resourses. FAO (25).
Halperin, W (1995) In vitro embriogénesis: some historical issues and unresolved
problems. En: Thorpe TA (Eds.) In vitro Embriogénesis in plants. Kluwer
Academic, Dordrecht, Netherlands.
Hernandez, I, Celestino C y Toribio M (2003) Vegetative propagation of Quercus
suber L. by somatic embryogenesis. Plant Cell Reports 21: 759-764
Kintzios, S, Sereti E, Bluchos P, Drossopoulos J, Kitsaki C y Liopa A (2002) Growth
regulator pretreatment improves somatic embryogenesis from leaves of squash
(Cucurbita pepo L.) and melon (Cucumis melo L.). Plant Cell Reports 21: 1-8
Referencias Bibliográfícas
133
Krikorian, A (1995) Hormones in Tissue. Peter J. (Eds) Cult and Molecular Biology.
pp 774-796. Kluiwer Academic Publisher. Netherlands.
Kumria, R, Sunnichan V, Das D, Gupta S, Reddy V, Bhatnagar R y Leelavathi S
(2003) High-frequency somatic embryo production and maturation into normal
plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stress. Plant Cell
Reports 21:635–639
Lakshmi, G (1999) Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Kluwer Academic
Publishers, Great Britain 5: 95-112
Lee, S y Rao A (1998) Plantlet production of Swietenia macrophyla King. Through
tissue culture (Singapore) 41:11-18
Lorenzi, H (1996) Identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova
Odessa 1: 30-37
Marinucci, L, Ruscitti, M y Abedini, W (2004) Morfogénesis in vitro de leguminosas
forestales nativas de la Republica Argentina. Rev. Fac. Agron. (La Plata) 105: 27-
36
Márquez, B, Sánchez C, Perán R y Barceló A (2003) Factores que afectan a la
obtención de embriones somáticos blanco-opacaos de aguacate. Actas V
Congreso Mundial del Aguacate. Universidad de Málaga. España. pp. 97-102
Maruyama, E y Ishii K (1999) Somatic Embryogenesis in Big-Leaf Mahogany
(Swietenia macrophylla King). Somatic embryogenesis in woody plants 5: 45-63.
Mascarenhas, A y Muralidharan A (1995) Tissue culture of forest tree, Somatic
embryogenesis in woody plants. Plant Science Letters 18: 166-189
Referencias Bibliográfícas
134
Medina, M y Sotolongo R (2004) Avances en el cultivo de tejidos de Swietenia
macrophylla King. X Swietenia mahogani Jaco. Revista Forestal Baracoa (2) 23:
19-26
Merkle, S, Parrott W y Flinn B (1995) Morphogenic aspects of somatic
embriogénesis. En:. Thorpe, TA (Eds.) in Vitro embriogenesis in plants. pp 155-
203. Kluiwer Academic Publisher. Netherlands.
Merkle, S, Parrott W y Williams E (1991) Applications of somatic embryogenesis and
embryo cloning. In avanced methods in plant breeding and biotechnology, pp. 67-
101. Elsevier Science publisher, Amsterdam.
Montoro, P, Rattana W y Pujade V (2003) Production of Hevea brasiliensis
transgenic embryogenic callus lines by Agrobacterium tumefaciens: roles of
calcium. Plant Cell Reports 21: 1095-1102
Muños, S (2003) Embriogénesis somática en Cedro (Cedrela odorata L.) a partir de
Cotiledones. Trabajo de diploma en opción al titulo de licenciado en biología,
Universidad Nacional Agraria La Molina, Perú.
Murashige, T y Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue culture. Plant Physiol 15: 473-497.
Negreros-Castillo, P, Snook L y Mize C (2003) Regenerating mahogany (Swietenia
macrophylla) from seed in Quintana Roo, Mexico: the effects of sowing method
and clearing treatment. Forest Ecology and Management 183: 351-362
Nitta, T, Takahata, Y y Kaizuma A (1997) Scanning electron microscopy of
microspore embryogenesis in Brassica spp. Plant Cell Reports 16: 406-410
Referencias Bibliográfícas
135
Nuutila, A, Villiger C y Oksman K (2002) Embryogenesis and regeneration of green
plantlets from oat (Avena sativa L.) leaf-base segments: influence of nitrogen
balance, sugar and auxin. Plant Cell Reports 20: 1156-1161
Parra, R y Amo-Marco JB (1998) Secundary somatic embryogenesis and plant
regeneration in Myrtle (Myrtus communis L.). Plant Cell Reports 18:325-330
Parrott, W (2002) La embriogénesis somática en los angiospermas. En: Resúmenes:
VI Simposio Internacional de Biotecnología Vegetal, Santa Clara, Cuba. 156p
Patiño, F (1997) Recursos genéticos de Swetenia y Cedrela en los neotrópicos:
Propuesta para acciones coordinadas. FAO.Roma.
Peña, J y Lezcano J (2001) Cultivo in vitro de Swietenia macrophylla King x
Swietenia mahogany Jacq. Trabajo de diploma en opción al titulo de ingeniero
forestal, Universidad de Pinar del Río Hermanos Saíz Montes de Oca, Cuba.
Perán-Quesada, R, Sánchez C, Márquez B, Barceló A y Pliego F (2001) Efecto del
medio de cultivo sobre la maduración y germinación de embriones somáticos de
aguacate. Actas de Horticultura 28: 111-115.
Pérez, JN (1998) Propagación y mejora Genética de plantas por biotecnológía.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Cuba.
Pinto, G, Santos C, Neves L y Araújo C (2002) Somatic embryogenesis and plant
regeneration in Eucalyptus globulus Labill. Plant Cell Reports 21: 208-213
Pliego, F, Barceló A, Simón E, de la Viña G, Sánchez C y Perán R (1999) La
micropropagación en la mejora de patrones de aguacate (Persea americana
Mill.): problemas y limitaciones. Revista Chapingo Serie Horticultura 5: 239-244
Referencias Bibliográfícas
136
Pullman, G, Johnson S, Van Tassel S y Zhang Y (2005) Somatic embryogenesis in
loblolly pine (Pinus taeda) and Duglas fir (Pseudotsuga menziesü): improving
culture initiation and growth with MES pH buffer, biotin, and folic acid. Plant Cell,
Tissue and Organ Culture 80: 91-103.
Reynel, C, Pennington R, Pennington T, Flores C y Daza A (2003) Arboles útiles de
la Amazonía Peruana. Manual con apuntes de identificación, ecología y
propagación de las especies. Perú.
Rodríguez, R, Daquinta M, Capote I, Pina D, Lescano Y y Gonzáles-Olmedo J
(2003) Nuevos aportes a la micropropagación de Swietenia macrophylla x
Swietenia mahagani (Caoba híbrida) y Cedrela odorata (cedro). Cultivos
Tropicales 24: 23-27
Roustan, J, Latché A y Fallot J (1990) Inhibition of ethylene production and
simulation of carrot somatic embryogenesis by salicic acid. Biolgy Plant 32: 273-
278
Salvi, D, Singh H, Tivarekar S y Eapen S (2001) Plant regeneration from different
explants of neem. Plant Cell Tissue and Organ Culture 65: 159-162
Sarasan, V, Ramsay M y Roberts A (2002) In vitro germination and induction of direct
somatic embryogenesis in ‘Bottle Palm’ [Hyophorbe lagenicaulis (L. Bailey) H.E.
Moore], a critically endangered Mauritian palm. Plant Cell Reports 20:
1107–1111
Shaji, J, Soniya E, Valsala K y Nair G (1997) In vitro adventitious shoot formation
from mature leaves and leaf derived calli of Naregamia alata. Indian Journal of
Experimental Biology 35:1249-1251
Referencias Bibliográfícas
137
Silveira, V, Segal, Handro W y Guerra M (2004) Effect of plant growth regulators on
the cellular growth and levels of intracellular protein, starch and polyamines in
embryogenic suspension cultures of Pinus taeda. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 76: 53-60
Snook, L y Negreros-Castillo P (2004) Regenerating mahogany (Swietenia
macrophylla King) on clearings in Mexico’s Maya forest: the effects of clearing
method and cleaning on seedling survival and growth. Forest Ecology and
Management 189: 143-160
Sotolongo, R, Medina M, Garcia M, Garcia E y Noda A (2002) Cultivo in vitro del
híbrido Swietenia macrophylla x Swietenia mahogani. Respuesta de diferentes
tipos de explantes. VI Simposio Internacional de Biotecnología Vegetal. Instituto
de Biotecnología de las Plantas. Villa Clara. Cuba.
Svobodová, H, Albrechtová, J, Kumstyrová, L, Lipavská H, Vágner M y Vondráková Z
(1999) Somatic embryogenesis in Norway spruce: Anatomical study of embryo
development and influence of polyethylene glycol on maturation process. Plant
Physiol Biochem 37: 209-221
Tacoronte, M, Vielma M, Mora A y Valecillos C (2004) Propagacion in vitro de Caoba
(Swietenia macrophylla KING) a partir de yemas axilares. Acta Cientifica
Venezolana 55: 7-12
Tang, W y Tian Y (2003) Transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) plants expressing
a modi®ed d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis with enhanced resistance to
Dendrolimus punctatus Walker and Crypyothelea formosicola Staud. Journal of
Experimental Botany 54: 835-844
Referencias Bibliográfícas
138
Termignoni, R; Po-Jen, W. & Ching-Yeh, H. 1996. Somatic embryo induction in
Eucaliptus dunii. Plant Cell and Organ Culture. Kluwer Academic Publisher.
Netherlands. 45(2): 129-132
Thorpe, T (1995) in vitro embryogenesis in plants. Kluwer Academic Publisher.
Dordrecht.
Trujillo, I y Garcia E (1998) Enraizamiento en plantas de Pino (Pino Caribaea).VII
Congreso Latinoaméricano de Botánica. México
Verdeil, JL, Hornung R, Huet C, Jacobsen H-J, Rillo E, Oropeza C, Bourdeix R,
N´cho Y-P, Hocher V, Hamon S y Sangare A (1999). Recent progress on coconut
micropropagation through a joined effort involving different countries. En:
Oropeza C, Verdeil JL, Ashburner GR, Cárdena R y Santamaría JM (Eds).
Current Advances in Coconut Biotechnology, pp. 391-405. Kluwer Academia
publishers, Dordrecht.
Viana, A y Mantell S (1999) Somatic embryogenesis of Ocotea Catharinesis. En:
Endangered trees of the Mata atlantica, Somatic embryogenesis in woody plants,
pp. 3-31. Academic Publishers, Dordrecht, Holanda.
Vilches, J (2001) Embriogénesis somática y regeneración de plantas en guayabo
(Psidium guajava) Tesis presentada en opción al titulo académico de Master en
Biotecnología Vegetal. Universidad Central ¨Marta Abreu¨ de Las Villas. Instituto
de Biotecnología de las Plantas.
Vilchez, J, Albany N y León de Sierralta S (2004) Micropropagación de guayabo
(Psidium guajava L.). En: Libro de Reportes cortos: VIII Congreso Venezolano de
Fruticultura, Venezuela. 27p.
Referencias Bibliográfícas
139
Vilchez, J, Albany N, Gómez R, García L y Agramonte D (2001) Germinación de
embriones somáticos de Psidium guajava L. cv. Enana Roja Cubana EEA 18-40
en sistemas de inmersión temporal. Biotecnología Vegetal 1(2):67-69.
Zegzouti, R, Arnould M y Favre J (2001) Histological investigation of the
multiplication step in secondary somatic embryogenesis of Quercus robur L. EDP
Sciences 58: 681-690
Zhang, BH (2000). Regulation of plant growth regulators on cotton somatic
embryogenesis and plant regeneration. Biochemistry 39: 1567.
Zheng, M, Weng Y, Liu W y Konzak (2002) The effect of ovary-conditioned medium
on microspore embryogenesis in common wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell
Reports 20: 802-807