UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS­GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

GUSTAVO ALMEIDA FORTUNATO

ENFISEMA PULMONAR, DA BANCADA PARA A CLÍNICA: A UTILIZAÇÃO DA ENGENHARIA TECIDUAL E PERSPECTIVAS

FUTURAS COM UM ESTUDO CLÍNICO OBSERVACIONAL

Savador, Ba 2012

2

GUSTAVO ALMEIDA FORTUNATO

ENFISEMA PULMONAR, DA BANCADA PARA A CLÍNICA: A UTILIZAÇÃO DA ENGENHARIA TECIDUAL E PERSPECTIVAS

FUTURAS COM UM ESTUDO CLÍNICO OBSERVACIONAL

Tese apresentada ao Programa de Pós­graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.

Orientadora: Prof. Dr. Simone Garcia Macambira

Salvador, Ba 2012

ii

3

Dedico este trabalho a minha família que sempre

me apoiou e acompanhou nas minhas jornadas

de estudo e pesquisa. Sem o esforço desprendido

por cada um deles, não teria alcançado o fim de

mais esta etapa.

iii

4

AGRADECIMENTOS

§ Daniel Torres Andion

§ Leonardo Cortizo

§ Milena Botelho Pereira Soares

§ Ricardo Ribeiro dos Santos

§ Murilo Fagundes de Castro

§ Juliana Vasconcelos

§ Alberto de Siqueira Santos Barbosa Neto

§ Carine Machado Azevedo

§ André Angrisani

§ Wilfried Klein

iv

5

RESUMO

A DPOC é uma das doenças mais prevalentes no mundo e que mais tem aumentado em

incidência. Apesar dos avanços médicos, pouco ganho tem se alcançado na mudança do curso

natural da doença. Exceto a oxigenoterapia e a cessação do tabagismo, nenhuma outra

recomendação médica tem alterado a sobrevida da doença. Visando perspectivas futuras,

terapias através da engenharia tecidual tem se mostrado promissoras, em especial a utilização

de estimuladores celulares. O G­CSF é um estimulador de colônia granulocítica que tem

apresentado efeitos benéficos na regeneração pulmonar de estudos experimentais em diversas

patologias. Espera­se que em curto espaço de tempo, estudos clínicos possam ser iniciados,

dado ao acúmulo de evidências da terapia com G­CSF. Métodos: O estudo foi divido em duas

sessões experimentais e uma outra clínica. Na primeira sessão experimental, 36 camundongos

fêmeas da linhagem C57Bl/6 foram utilizados para validação do modelo de enfisema induzido

com elastase porcina intratraqueal 2U/100g . Uma vez validado, na segunda sessão do estudo,

30 animais foram induzidos ao enfisema e após 28 dias, foram randomicamente divididos

para receber tratamento com G­CSF intraperitoneal (200 μg/kg/dia em 100 µl) ou o mesmo

volume de salina. Os camundongos foram avaliados funcionalmente por ergometria em três

momentos do estudo e morfologicamente através da medida da média linear intersepto (Lm).

A sessão clínica avaliou retrospectivamente, no período de jan­2000 a dez­2009, pacientes do

Toronto General Hospital com DPOC avançado que foram submetidos a cirurgia redutora do volume pulmonar (CRVP) ou transplante pulmonar. Resultados: A primeira sessão

confirmou que o modelo produziu alterações enfisematosas após 28 dias de indução. Os

animais induzidos percorreram uma distância 30% menor na ergometria, apresentaram maior

dificuldade na recuperação da VO2 pós exercício e apresentaram Lm quase 3x maior que o

controle. Na segunda sessão, o grupo tratado com G­CSF apresentou reversão parcial das

alterações morfo­funcionais. Após o tratamento, os animais deste grupo melhoram o

desempenho na ergometria, identificado por um aumento na distância percorrida e por

tendência a maior recuperação do VO2 pós­exercício. Este grupo ainda apresentou restauração

das alterações morfológicas identificado pela redução da Lm. Na terceira sessão, 220 cirurgias

consecutivas para DPOC em estágio final de doença, realizadas no Toronto General Hospital,

v

6

foram avaliadas. Cento e cinquenta e dois pacientes submeteram­se a transplante e 68 a

CRVP. A avaliação espirométrica pré­operatória revelou VEF1 de 20% e 24%

respectivamente. A mortalidade intrahospitalar foi de 2,9% para a CRVP e 6% em 90 dias

para o transplante. A CRVP foi capaz de retardar a indicação do transplante em 4 anos.

Portadores de deficiência da alfa­1 antitripsina apresentam deterioração da função pulmonar

mais precoce no período pós­operatório. Conclusão: O modelo de indução de enfisema com

elastase intratraqueal (2U/Kg) foi capaz de promover alterações funcionais e morfológicas em

modelos de camundogos fêmeas C57Bl/6. A administração de G­CSF intraperitoneal foi

capaz de reverter parcialmente as alterações morfo­funcionais do modelo de enfisema em

camundongos. A CRVP e o transplante pulmonar são procedimentos que tem suas indicações

precisas para a população de DPOC em estágio avançado. O maior conhecimento desta

população pode servir a futuros ensaios clínicos com a utilização da engenharia tecidual.

Palavras­chaves: Enfisema, Elastase pancreática, Fator estimulador de colônia de

granulócitos, Ergometria, Pneumectomia e Transplante de pulmão.

vi

7

ABSTRACT

COPD is one of the most prevalent medical problems worldwide and this issue has been

growing progressively. Despite medical advances lately, nothing has been able to change the

natural course of the disease. No others rather than oxygenotherapy and tobacco cessation has

been shown to improve survival for COPD. Aiming new therapies, tissue engineering has

been shown to be an opition, in especial the utilization of stimulanting factors. G­CSF is an

granulocyte colony­stimulanting factor with positive effect on pulmonary regeneration in

different patologies. Due to the numbers of evidences accumulated in regarding to G­CSF and

emphysema, we expect that clinical trials can be started shortly. Methods: The study was

divided into three sections. Two experimental studies, and one clinical. In the first one, 36

female mice C57Bl/6 were induced to emphysema with elastase intratracheally (2U/Kg).

Once validated the model, 30 mice received elastase and after 28 days they were randomically

divided to recieve either G­CSF (200 μg/Kg/day) or saline intraperitoneally. On both sections

the animals were evaluated functionally with ergometry and morphometrically with intersepct

linear mean (Lm). In the clinical secction, we evaluated retrospectively, throughout 10 years

(Jan­2000 to Dec­2009) patients suffering from end­stage of COPD at Toronto General

Hospital who underwent either LVRS or lung transplantation. Results: The first section

confirmed the changes produced by elastase at 28 th day after induction. Mice reduced the

running distance in 30% in the ergometry, showed more difficult to recover VO2 after test and

showed Lm almost 3x higher than control. In the second section, G­CSF group reverted

partially the morphofunctional changes. After treatment, the animals improved their

performance on treadmil, identified by an increase on running distance and by a tendency to

faster VO2 recovery after test. This group also demonstrated improvement morphologically,

reducing Lm. In the third section, we evaluated 220 consecutive surgeries for COPD

performed at Toronto General Hospital. A hundred fifty two patiets underwent lung

transplantation and 68 LVRS. Functional assessment showed FEV1 of 20% and 24%

respectively. Intrahospital mortality was 2,9% to LVRS and 6% to lung transplantation (90­

day mortality). LVRS was able to delay lung transplantation by 4 years. Patients with alpha­1

anti­trypisin difficiency showed earlier functional deterioration post­operatively. Conclusion:

The elastase­induced model used was able to promote functional and morphological

vii

8

emphysema changes in female C57Bl/6 mice. G­CSF administration intraperitoneally was

able to revert partially the changes on this emphysema model. LVRS and lung transplantation

are surgical procedures that have specific indications for end­stage COPD patients. Better

knowledgement of this population can help future clinical trials with tissue engineering.

Key words: Emphysema, Pancreatic Elastase, Granulocyte colony­stimulanting factor,

Ergometry, Lung volume reduction an Lung transplantation.

viii

9

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12

2 REVISÃO DA LITERATURA 14

2.1 DOENÇA PULMONAR OBSTRUTIVA CRÔNICA 14

2.1.1 EPIDEMIOLOGIA E IMPACTO SÓCIO­ECONÔMICO 14

2.1.2 HISTOPATOLOGIA 15

2.1.3 PATOGÊNESE 16

2.1.3.1 DESEQUILÍBRIO PROTEASE­ANTIPROTEASE 16

2.1.3.2 IMUNOPATOGÊNESE 18

2.1.4 FISIOPATOLOGIA CARDIO­RESPIRATÓRIA 19

2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE ENFISEMA 22

2.3 ENGENHARIA TECIDUAL 24

2.3.1 CÉLULAS­TRONCO 24

2.3.2 ESTIMULADORES CELULARES 25

2.3.2.1 FATOR DE CRESCIMENTO DE COLÔNIA DE GRANULÓCITOS 26

2.4 ESTUDOS CLÍNICOS EM DPOC 29

2.4.1 CIRURGIA REDUTORA DE VOLUME PULMONAR 30

2.4.2 TRANSPLANTE PULMONAR 33

ix

10

3 OBJETIVOS 36

3.1 OBJETIVOS GERAIS 36

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36

4 MÉTODOS 37

4.1 EXPERIMAENTAL 37

4.1.1 ANIMAIS 37

4.1.2 INDUÇÃO DO ENFISEMA 37

4.1.3 TESTE ERGOMÉTRICO 37

4.1.4 ADMINISTRAÇÃO DE G­CSF 38

4.1.5 AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA 38

4.1.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 39

4.1.7 DESENHO DE ESTUDO 39

4.1.7.1 PARTE 1 39

4.1.7.2 PARTE 2 40

4.2 CLÍNICO OBSERVACIONAL 41

4.2.1 PACIENTES 41

4.2.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA 41

5 RESULTADOS 41

5.1 EXPERIMENTAL 41

5.1.1 PARTE 1 – VALIDAÇÃO DO MODELO DE ENFISEMA 41

x

11

5.1.1.1 SEGURANÇA DO MODELO 41

5.1.1.2 ANÁLISE FUNCIONAL – ERGOMETRIA 42

5.1.1.3 ANÁLISE MORFOMÉTRICA – MEDIDA DA LM 44

5.1.2 TRATAMENTO COM G­CSF 49

5.2 CLÍNICO OBSERVACIONAL 49

5.2.1 CIRURGIA REDUTORA DE VOLUME PULMONAR 49

5.2.2 TRANSPLANTE PULMONAR 57

6 DISCUSSÃO 59

7 CONCLUSÃO 71

REFERÊNCIAS 72

xi

12

1 INTRODUÇÃO

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma enfermidade de característica

progressiva que apresenta grande impacto nas atividades da vida cotidiana do paciente

acometido. Promove, em estágios mais avançados, insuficiência respiratória e incapacitação

funcional do mesmo. A progressão da DPOC é constante e estima­se que em 2020 será a

terceira causa de morte mais freqüente no mundo e a quinta maior causa de incapacitação [1].

Atualmente a DPOC afeta 5,5 milhões de brasileiros ­ um aumento de 340% em relação a 20

anos atrás [2]. Segundo dados do DATASUS de 2008 [3], a cada ano são hospitalizados 250

mil brasileiros com a DPOC, sendo gastos cerca de 100 milhões de reais com internações

destes pacientes.

A denominação DPOC engloba basicamente duas apresentações clínicas distintas, o enfisema

e a bronquite, que podem apresentar­se como forma mista, ou com o predomínio de uma

delas. A obstrução do fluxo aéreo não completamente reversível é comum a ambas as formas,

porém no enfisema pulmonar (EP), além da alteração no fluxo, predomina a destruição

alveolar levando a hiperinsuflação pulmonar. No padrão bronquítico predomina a

hipersecreção brônquica e a inflamação. A DPOC acomete predominantemente indivíduos

entre 50 e 75 anos, existindo uma importante relação com o tabagismo, que estima­se ser

responsável por 75% a 95% de todos os casos. É a patologia que apresenta maior custo

econômico diretamente relacionado ao tabagismo quando levado em conta custos indiretos de

morbidade, perda salarial e aposentadoria precoce [4].

A DPOC está associado a uma resposta celular pró­inflamatória desencadeada pelo sistema

imune no pulmão em resposta a agentes tóxicos, especialmente a partículas gasosas presentes

na fumaça do cigarro. A patologia, é caracterizada pelo alargamento anormal e irreversível

dos espaços aéreos distais ao bronquíolo terminal acompanhado de destruição de suas paredes

sem a presença de fibrose óbvia. Trata­se de uma doença sem cura definida, cuja a destruição

progressiva e irreversível do parênquima pulmonar pode vir a acarretar sobrecarga pressórica

das câmaras cardíacas direitas e cor pulmonale. Fisiopatologicamente, estas alterações

relacionadas à destruição septal, mais associadas com o padrão de EP, são atribuídas a um

13

desequilíbrio entre moléculas proteolíticas e anti­proteolíticas [5]. Outros mecanismos

também têm sido descritos como contribuintes, entre eles o estresse oxidativo e a liberação de

agentes oxidantes pelas células inflamatórias [1]. A diminuição anormal da superfície alveolar

implica em perda progressiva da capacidade de troca gasosa resultando em insuficiência

respiratória nos estágios mais avançados da doença. Atualmente as opções terapêuticas para o

tratamento do enfisema em fase terminal recaem sobre o tratamento clínico de suporte com o

uso de oxigênio, corticoesteroides e broncodilatadores. A cirurgia redutora de volume

pulmonar e o transplante pulmonar também apresentam alguma validade num grupo seleto de

pacientes [6].

Neste contexto, uma perspectiva de tratamento para a DPOC, em especial o EP, é a

engenharia tecidual baseada na regeneração celular. Citocinas e fatores de crescimento têm

sido destacados por diversos estudos pré­clínicos e clínicos pelo potencial regenerador no

tratamento de diversas doenças degenerativas. Estudos são conduzidos em busca de se

estabelecer uma terapia restauradora da função e da estrutura dos diferentes órgãos através da

administração de moléculas, ou células propriamente ditas, que apresentem algum potencial

biológico na regeneração tecidual. O fator de crescimento de colônia de granulócitos

(Granulocyte colony­stimulating factor ­ G­CSF) tem gerado resultados promissores no reparo cardíaco, pulmonar e até mesmo neurológico [7­10]. O G­CSF é um quimiotático

produzido por diversas células do corpo, cujo efeito é a quimiotaxia de granulócitos

circulantes [11]. Quando administrado de forma sistêmica, induz a mobilização de células­

tronco da medula óssea para a periferia [12]. Além dos efeitos benéficos em estudos pré­

clínicos, o G­CSF tem seus efeitos terapêuticos comprovados no tratamento de leucopenia em

certas situações clínicas, como na restauração celular pós­quimioterapia, com poucos efeitos

colaterais.

Diante deste cenário, a DPOC, particularmente o EP, se estabelece como um assunto de

grande interesse para investigação científica aprofundada através de pesquisas básicas,

clínicas e, principalmente, pré­clínicas. Pelo exposto, este projeto, que se divide em duas

etapas, pré­clínica e clínica, investe na tentativa de se estabelecer métodos terapêuticos

experimentais que visem a regeneração tecidual, assim como busca identificar populações de

14

pacientes, através de um estudo clínico observacional, que possam representar futuros

candidatos a novas terapias.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DOENÇA PULMONAR OBSTRUTIVA CRÔNICA

2.1.1 Epidemiologia e Impacto Sócio­econômico

A DPOC é responsável por razoável porcentagem de óbitos no mundo atual [13, 14] e tem

apresentado crescimento mundial de 30% no últimos 10 anos [15]. Apesar dos avanços

médicos, nem mesmo o tratamento clínico mais otimizado tem conseguido modificar o curso

desfavorável de tal patologia. Estima­se que, efetivamente, 6% da população mundial seja

afetada pela DPOC e que a mortalidade ajustada para a idade continua em crescimento, ao

contrário de outras patologias que lideram o ranking de mortalidade, como patologias cardiovasculares e neoplásicas [16].

A prevalência da DPOC tem aumentado em todo o mundo devido à permanente exposição

aos fatores de risco já conhecidos: tabagismo, exposição ocupacional ao cádmio, sílica e aos

índices maiores de poluição aérea nas grandes cidades. Esses fatores, associados à maior

expectativa de vida da população, fizeram com que a Organização Mundial de Saúde

considerasse a DPOC uma epidemia, prevendo a sua eclosão no ano de 2020, quando poderá

então se tornar a terceira maior causa de morte e a quinta doença em prevalência [1].

Nessa perspectiva negativa, esforços têm sido feitos para se conseguir modificar essa

catástrofe médica e econômica, já que nos dias atuais o gasto com o tratamento é

extremamente elevado. Exemplo disto é o custo anual de 24 bilhões de dólares para o

diagnóstico e tratamento de 16 milhões de doentes nos Estados Unidos da América (EUA),

levando­se em consideração os gastos com o diagnóstico, tratamento e afastamento de mão de

obra ativa [17]. Ainda nos EUA, a DPOC é causa de morte em 110.000 pessoas anualmente

[18]. No Brasil, dados do DATASUS 2008 [3] indicam que a DPOC varia entre a quinta e a

sexta causa de morte, além de ter sido responsável por 250 mil internações entre 2006 e 2007,

15

gerando custos ao sistema público de saúde que chegaram a 100 milhões de reais neste

período.

2.1.2 Histopatologia

A DPOC é caracterizado pela resposta inflamatória crônica anormal do pulmão exposto a

agentes tóxicos. Essa resposta inflamatória persiste mesmo após a suspensão da exposição,

passando a ter um caráter auto­imune com o decorrer da doença [19, 20].

Histopatologicamente, duas alterações principais têm sido descritas para o termo DPOC: o

enfisema e a bronquite. Devido ao processo de regeneração tecidual proposto neste projeto

estar mais relacionado com um protótipo de doença degenerativa, ao invés de inflamatória,

guiaremos o foco de nossas revisões e discussões para as alterações enfisematosas. No EP

ocorre uma diminuição anormal e permanente das vias aéreas distais aos bronquíolos

terminais, acompanhado pela destruição de suas paredes e ausência de fibrose óbvia. As

alterações à microscopia incluem fusão de alvéolos adjacentes, produzindo espaços aéreos

alargados e até mesmo bolhas, que por sua vez, hiperinsuflam, comprimindo bronquíolos

respiratórios e vasos pulmonares [21].

Ainda dentro da área da histopatologia, Thurlbeck [22] desenvolveu uma técnica de

quantificação da destruição que consta da determinação da medida da média linear intersepto

de linhas horizontais e verticais sobrepostas a imagens do parênquima pulmonar. Tal método

vem sendo, a décadas, utilizado para a determinação quantitativa da destruição alveolar com

aceitável reprodutibilidade.

16

2.1.3 Patogênese

2.1.3.1 Desequilíbrio Proteases­Antiproteases

As teorias para a patogênese da DPOC dividem­se basicamente em duas: efeito direto

citotóxico contra o epitélio pulmonar mediado pelo desequilíbrio entre proteases e

antiproteases e imunopatogênese mediando tanto a apoptose quanto a liberação de citocinas

[1].

A idéia de que o enfisema resulta da lesão proteolítica dos septos alveolares tem se mantida

como a teoria que mais se adapta aos conhecimentos adquiridos ao longo dos anos.

Fisiologicamente, ocorre um equilíbrio entre a produção de proteases pelas células

inflamatórias pulmonares e a produção, principalmente hepática, de antiproteases que através

da circulação sistêmica alcançam o parênquima pulmonar. Pela hipótese de desequilíbrio

entre proteases e antiproteases, ocorre uma liberação anormal e aumentada de enzimas

proteolíticas no tecido pulmonar associado a uma produção regular e constante de

antiproteases conduzindo à proteinólise do interstício composto predominantemente de

elastina. Como o reparo pulmonar é feito de forma insuficiente e deficiente, logo, mudanças

estruturais são verificadas. Provas claras têm relevado a relação causal entre a fumaça do

cigarro e um aumento da produção de elastase pelos neutrófilos pulmonares [23].

Fisiopatologicamente, este é o início do processo inflamatório celular e do estresse oxidativo

que ocorre na população de fumantes. Indivíduos predispostos geneticamente apresentam uma

disfunção de certas linhagens inflamatórias, como os linfócitos T CD8 + e macrófagos, que se

mantém ativados no tecido pulmonar a despeito da cessação do tabagismo. A perpetuação do

processo inflamatório mediado por estas células garante o desenvolvimento e progressão da

DPOC [1].

Em relação às proteases, a elastase neutrofílica corresponde a um grupo de enzimas com

funções biológicas distintas, incluindo enzimas digestivas de glândulas exócrinas, fatores de

coagulação e proteinases associadas a grânulos de leucócitos que apresentam marcada

atividade contra as proteínas da matriz extracelular, em especial, a elastina. Vários trabalhos

17

demonstram o seu aumento nos lavados broncoalveolares e escarros de tabagistas, o que

garante forte associação com o desenvolvimento da DPOC [24­26].

Dentre os inibidores de proteases, a α1­antitripsina é a principal enzima reguladora deste

mecanismo. A α1­antitripsina é uma glicoproteína de 52kDa sintetizada primariamente pelo

fígado. Consiste em uma cadeia de polipeptídeo de 394 aminoácidos e possui atividade de

inibição proteolítica da elastase neutrofílica além de outras proteinases. Em 1963, alguns

autores [27] propuseram uma associação entre a deficiência sérica de α1­antitripsina e

enfisema, originando uma teoria de desbalanço entre proteinase e antiproteinase para a gênese

da DPOC. Outras proteínas envolvidas no processo estão discriminadas no quadro abaixo.

(Quadro 1).

Quadro 1: Principais proteases e antiproteases que participam da geração da doença pulmonar obstrutiva crônica. FONTE: RUFINO; J Bras Pneumol.2006;32(3):241­8 [17]

Antiproteases Proteases

α1­Antitripsina Elastase Neutrofílica

a2­Macroglobulina Proteinase Neutrofílica

Inibidor de Leucoprotease Proteinase 3 Neutrofílica

TIMP 1 Catepsina G Neutrofílica

TIMP 2 Metaloproteinase Neutrofílica

Metaloproteinase do Macrófago

Catepsia 5

Cisteína Proteinase

TIMP: Tissue inhibitors of metalloproteinases

18

2.1.3.2 Imunopatogênese

Nos últimos anos, a exploração de novos horizontes fisiopatogênicos permitiu a mudança do

enfoque fisiopatológico, até então quase que exclusivamente relacionado à bioquímica da

doença. Tais conceitos foram finalmente introduzidos na definição da DPOC pela Global

Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) [28]. Na DPOC ocorrem alterações dos componentes celulares do pulmão, como aumento do número de macrófagos, neutrófilos,

linfócito T CD8 + , excesso de produtos oxidativos e a facilitação de colonização por

microorganismos. Tais fatores interagem de modo a recrutar mais células pró­inflamatórias.

Nas áreas de maior ventilação pulmonar ocorre a destruição periférica dos ligantes alveolares

facilitando a sua fusão e hiperinsuflação, ou seja, o enfisema [17].

Os neutrófilos são células centrais no mecanismo fisiopatogênico da DPOC, onde existe

claramente acúmulo e ativação deste tipo celular. Neutrófilos ativados por partículas

provenientes do tabaco acarretam na liberação de enzimas proteolíticas e agentes oxidantes

que levam a uma degradação tecidual e por conseguinte a um deflagramento de resposta

imune via liberação de citocinas [20]. Os neutrófilos são abundantes no sangue, mas

praticamente ausentes no tecido pulmonar de pessoas saudáveis. Em tabagistas, os neutrófilos

estão aumentados no escarro e no lavado broncoalveolar. Porém, nas amostras de tecido

pulmonar não se consegue confirmar esse aumento. Acredita­se que isto ocorra pela rápida

migração dos neutrófilos para o alvéolo e pela heterogeneidade do processo inflamatório [29]

[30]. Apesar da importância descrita dos neutrófilos na gênese da DPOC, sua predominância

é inversamente proporcional à severidade, ou seja, quanto mais avançada está a doença menos

neutrófilos são encontrados no lavado broncoalveolar. O que leva a crer que não esteja

diretamente relacionado com o caráter evolutivo e manutenção da resposta inflamatória [20].

Dados de Fletcher [31] revelaram que apenas uma minoria da população de fumantes

desenvolve um rápido declínio da função pulmonar, apesar de que, em qualquer fumante pode

se encontrar algum grau de inflamação pulmonar. O mecanismo desta amplificação é

fracamente compreendido, mas provavelmente envolve mecanismos genéticos e epigenéticos

de resposta imunológica.

19

O processo inflamatório crônico é responsável pelo reparo e pelo processo de remodelamento

parenquimatoso, porém de forma ainda não muito esclarecida, essa população de pacientes

que desenvolve DPOC apresenta uma resposta deficiente e inefetiva. Um possível

componente autoimune da etiopatogenia do DPOC tem sido sugerido após observação de

oligoclonalidade de céulas T CD4 + isoladas de tecido pulmonar enfisematoso de humanos

[32]. Observações adicionais de Taraseviciene­Stewart et al. em modelos experimentais revelaram que ratos adultos imunizados com células endoteliais de veia ou artéria pulmonar

desenvolvem enfisema. Porém, um ponto chave a ser descoberto é se os anticorpos

produzidos em pacientes portadores de enfisema foram causa ou efeito do dano tecidual [32].

A apoptose tem também sido implicada como importante mecanismo patogênico em

avaliações clínicas e experimentais em modelos de doença pulmonar [33]. Apoptose anormal

tem sido descrita em células epiteliais pulmonares enfisematosas, neutrófilos, linfócitos e

monócitos. Muitos fatores associados à DPOC, como a exposição ao tabaco, estão

relacionados ao decréssimo da expressão do fator de crescimento do endotélio vascular

(VEGF), sabidamente um fator chave na sobrevivência e desencadeamento da apoptose em

células epiteliais [34]. O decréscimo da expressão de VEGF e seu receptor podem levar à

apoptose de células dos septos alveolares. Fumantes que desenvolvem DPOC apresentam

uma ativação da imunidade adaptativa com a infiltração de células T, principalmente CD8 + ,

células integrantes do processo da apoptose [34]. Alguns estudos evidenciaram o aumento da

concentração de CD8+ nos pulmões de pacientes fumantes com DPOC em relação a não

fumantes [35, 36], enquanto outros encontraram maior população de células CD8 + no sangue

periférico desses pacientes com DPOC [37].

2.1.4 Fisiopatologia cardio­respiratória

No enfisema, a fisiopatologia está relacionada à destruição da elastina. A elastina participa na

manutenção da estrutura das paredes alveolares e, quando esta proteína está ausente, a menor

parte das vias aéreas, os bronquíolos, sofre colapso, tornando difícil a entrada e saída de ar

dos alvéolos. O consequente estreitamento das vias aéreas, combinado à maior obstrução

20

devido ao acúmulo de muco, faz aumentar a força necessária na respiração aumentando assim

o trabalho expiratório.

Com o objetivo fisiológico de compensação expiratória, devido à obstrução, a respiração

passa a ser controlada de forma a produzir um tempo expiratório prolongado, reduzindo a

freqüência respiratória com um volume corrente aumentado. Essa compensação explica o

grau de hiperinsuflação pulmonar observado nos portadores de DPOC.

Além das mudanças nas vias aéreas, a estrutura alveolar também é destruída, deixando as

unidades responsáveis pela permuta gasosa extremamente complacentes, com diminuída área

de troca de O2 e CO2. Essa destruição alveolar leva a um aumento da área ventilada, mas não

perfundida, assim denominada de espaço morto funcional.

O aumento do trabalho elástico que a hiperinsuflação e o aumento da complacência causam,

associados ao elevado trabalho de resistência ao fluxo aéreo, se traduzem clinicamente na

dificuldade respiratória do portador de DPOC. O aumento do espaço morto e a

hiperinsuflação pulmonar são refletidos na espirometria com a redução dos volumes

inspiratórios e expiratórios, redução da capacidade vital forçada (CVF), aumento da

capacidade residual forçada (CRF) e aumento do volume residual (VR) [38].

Em nível experimental, existem duas formas de avaliação de parâmetros funcionais

respiratórios: através de métodos invasivos e não­invasivos. Nos métodos invasivos, os

animais são avaliados com a realização de intubação orotraqueal ou traqueostomia seguida da

conexão do animal ou do bloco cardiopulmonar a um ventilador específico. Esses métodos

permitem avaliação de importantes parâmetros ventilatórios como pressão transpulmonar,

fluxos inspiratórios e expiratórios, complacência e resistência. Porém, existe uma série de

desvantagens ao método. Eles necessitam de procedimento cirúrgico/anestésico, que

apresenta mortalidade agregada; avaliam através de meios antifisiológicos (intubação e

ventilação mecânica com pressão positiva) e não podem ser utilizados em estudos que exijam

medidas seriadas da função. Os métodos não invasivos, no entanto, apresentam o outro

extremo das vantagens e desvantagens do método invasivo. O método não invasivo é também

21

conhecido como pletismografia e pode ser realizado com equipamento de uma ou duas

câmaras. Ele utiliza a variação das pressões na câmara hermética, que envolve a caixa

torácica ou todo o corpo do animal, para avaliar a complacência pulmonar e outros

parâmetros que representam indiretamente alguns volumes pulmonares. O método tem a

vantagem de ser aplicado com o animal consciente, sem necessidade de anestesia, podendo

ser repetido quantas vezes for necessário ao estudo e ser mais fisiológico.

Esses métodos apesar de revelarem informações importantes a respeito da função pulmonar

nos modelos utilizados, não avaliam a capacidade de tolerância ao exercício. A resposta de

pacientes portadores de DPOC ao exercício está associado a um aumento do volume­minuto

(volume corrente x freqüência respiratória), uma redução na pressão arterial de O2 (PaO2) e

um aumento na pressão arterial de CO2 (PaCO2). A hiperinsuflação pulmonar limita a

eficácia mecânica dos músculos inspiratórios e essa limitação ocorre porque o diafragma fica

constantemente em posição encurtada, aumentado assim a demanda energética de outros

músculos respiratórios. O aumento do trabalho respiratório acarreta um aumento do volume­

minuto através do aumento da freqüência respiratória, sem necessariamente aumentar a

ventilação alveolar, mas sim aumentando o espaço­morto. Além da desvantagem mecânica

dos músculos respiratórios, existe um efeito independente sobre a musculatura não­

respiratória que pode estar associado a desnutrição [38]. Luthje et al. foram um dos pioneiros a demonstrar intolerância ao exercício em esteira de camundongos induzidos a enfisema com

elastase.

A destruição do parênquima alveolar leva ainda a um distúrbio na ventilação alveolar (VA) e

perfusão (Q). O que fisiologicamente funciona reduzindo a perfusão de áreas não ventiladas

em detrimento a manter áreas bem perfundidas enquanto aeradas, é perdido em situações

patológicas como a DPOC. Todas essas alterações associadas à diminuição de área de troca

alveolar acarreta um prejuízo à troca alveolar e portanto, uma limitação ao exercício.

Ergoespirometria é uma metodologia acurada de avaliar a gravidade da DPOC e a limitação

funcional ao exercício. Em humanos, com a evolução patológica da DPOC, há redução da

extração de oxigênio devido a distúrbios da difusão, redução da área trocadora de gás e

22

alteração da ventilação­perfusão [39]. O exercício aumenta o distúrbio ventilação­perfusão,

com isso prejudicando a troca e a extração de O2. O fato do CO2 ser 24 vezes mais

hidrosolúvel que o O2 faz com que as alterações de troca de CO2 sejam percebidas mais

tardiamente na evolução da doença em relação ao O2 [40]. Ganju et al. [41] identificaram significante correlação entre o volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) e o

consumo de oxigênio (VO2) no curso da doença.

Em modelos animais a tolerância ao exercício é medida basicamente por equipamentos de

esteira elétrica que podem estar acoplados a analisadores de gases fornecendo informações do

consumo de oxigênio e da produção de CO2.

2.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE ENFISEMA

O primeiro modelo animal de enfisema foi desenvolvido há mais de 40 anos através da

instilação intratraqueal de papaína [42]. Desde então, os modelos têm evoluido

consideravelmente chegando ao ponto de se tornar uma ferramenta indispensável para

diversos grupos de cientistas. Os modelos experimentais permitem a investigação dos

mecanismos patogênicos de diversas doenças e do potencial terapêutico de novas drogas ou

procedimentos. Agem como uma ponte entre os ensaios clínicos e os estudos in vitro. Neste contexto, camundongo é uma opção de grande valia entre os demais modelos, visto que: (i) o

genoma dos camundongos é conhecido e apresenta similaridades com o genoma humano, (ii)

há disponibilidade comercial de uma gama de sondas e anticorpos monoclonais, (iii)

apresenta um ciclo de vida curto, permitindo que os estudos sejam concluídos em meses, além

de custos para criação e manutenção viáveis [28]. Atualmente existem diversos modelos

experimentais que simulam de maneira eficiente as patologias humanas, exemplo disso é o

modelo de cardiopatia chagásica crônica [43] e o modelo de cirrose hepática [44], que servem

como ferramentas na elaboração de novas terapias e no entendimento das diferentes fases de

cada doença.

Apesar das vantagens do uso de comundongos em estudos experimentais, algumas diferenças

do sistema respiratório em relação à espécie humana merecem consideração. Camundongos

23

não apresentam células ciliadas no revestimento respiratório na mesma densidade que

humanos, além de apresentarem poucas glândulas submucosas na traquéia. Os camundogos

não expectoram, apresentam maior simplicidade da ramificação brônquica, não apresentam

bronquíolos, bem como a circulação brônquica é ausente [45]. Molecularmente, os

camundongos ainda, não apresentam colagenase MMP­1 no seu interstício, não apresentam

receptores de citocinas pró­inflamatórias importantes em humanos como IL­8 e não possuem

muitos dos genes do citocromo P450 que apresenta papel importante no estudo da toxicologia

humana [32].

Particularmente, os modelos experimentais para indução do enfisema pulmonar podem ser

divididos em sete modelos [46]: mutação natural, geneticamente manipulados (knockout, knockin e transgênicos), induzidos por proteases, induzidos por LPS, induzidos por apoptose, induzidos por privação de alimento e ambientais (exposto a agentes oxidantes presentes na

fumaça). Para cada grupo, há vantagens e desvantagens que norteiam a escolha do modelo

mais adequado para cada desenho de estudo. Modelos geneticamente modificados têm a

desvantagem de apresentar alterações sistêmicas relacionadas à alteração genômica e

apresentar um custo mais elevado, com a vantagem de encurtar o estudo visto que não há

necessidade de indução. Dentre os grupos induzidos com proteases, há principalmente os

modelos de enfisema induzidos com papaína (protease vegetal) e elastase (protease animal).

Tais modelos apresentam a desvatagem de difícil reprodutibilidade além de serem implicados

em promover uma alteração tecidual pulmonar que não reflete a real patologia pulmonar.

Enquanto em humanos há um equilíbrio entre o padrão bronquítico e o enfisematoso, no

referido modelo o padrão é predominante enfisematoso [47]. Tais modelos, no entanto, têm a

vantagem de custo reduzido e não produzirem alterações sistêmicas. Os modelos que utilizam

fumaça e outros agentes oxidantes em suspensão no ar para indução do enfisema apresentam

a desvantagem de necessitarem prolongado tempo de exposição, muitas vezes incompatíveis

com o ciclo curto do animal de pequeno porte, e importante perda ponderal no curso da

indução, entretanto apresenta a vantagem de promover a alteração pulmonar mais próxima da

realidade fisiopatológica [46].

24

2.3 ENGENHARIA TECIDUAL

2.3.1 Células­Tronco

A medicina regenerativa, através da ativação das células­tronco originárias no próprio tecido

ou do transplante das mesmas, tem apresentado muitos avanços no entendimento do reparo

tecidual em diferentes doenças em humanos e modelos experimentais [48, 49]. Nos modelos

de enfisema, os animais têm auxiliado na investigação dos mecanismos de interação destas

células, bem como na avaliação de possíveis tratamentos [50]. No entanto, um dos grandes

desafios é de se induzir o reparo funcional pulmonar, e não somente regenerar a estrutura

alveolar.

Durante o processo de injúria e reparo tecidual, que ocorre naturalmente no tecido pulmonar,

células genitoras próprias do tecido mantém a homeostase através de ativação de células

designadas inicialmente como células­tronco do tecido pulmonar. Estas células, após um dano

tecidual, que pode ser um trauma ou processo apoptótico, são ativadas localmente através de

interação quimiotática, migram e se diferenciam nos diversos fenótipos celulares do pulmão.

Muitos estudos têm focado na identificação e isolamento destas células, porém dois fatores

maiores interferem na identificação da célula­tronco pulmonar. O primeiro é que ao contrário

do tecido cutâneo e gastro­intestinal, que apresentam acelerada renovação epitelial, o tecido

pulmonar apresenta baixa taxa de renovação. Segundo, o fenótipo celular da célula madura

difere a depender da região ou "nicho" que esta célula esteja localizada na árvore brônquica

[51, 52]. Este conceito de "nicho" foi desenvolvido para explicar que para cada diferente

"nicho" há uma diferente célula progenitora. A exemplo disso, na porção mais proximal da

via aérea, como traquéia e brônquios, as células basais (citoqueratina 5/14) são as

progenitoras predominantes. Na região bronquiolar, as células claras (Scgb1a1) predominam,

enquanto que na região alveolar, predominam os pneumócitos tipo II.

Este conceito predominou nos últimos anos e norteou os estudos que avaliaram células­tronco

do próprio pulmão. No entanto, este conceito apresentava a deficiência de não apresentar uma

25

única célula com todas as características necessárias para a determinação de uma célula­

tronco, que são: auto­renovação, multipotencialidade e clonogenicidade. Mais recentemente,

Kajstura et al. [53], num importante avanço na área, identificaram um grupo celular positivo para o marcador c­kit que apresentou todas estas características. Nesse estudo foi possível

demonstrar a regeneração dos diversos tecidos que compõe o parênquima pulmonar.

Outra abordagem de significante interesse clínico é o transplante de células­tronco exógenas.

No entanto, um desafio à essa técnica é a retenção de células transplantadas no tecido

pulmonar. Várias técnicas tem sido descritas para o procedimento, inclusive com a utilização

de matrizes acelulares servindo de molde. Porém, até o presente momento, a literatura não

revelou trabalho que apresentasse resposta biológica de maior impacto. Krause et al. [54], utilizando transplante de células­tronco da medula óssea após irradiação, encontraram

diferenciação de 20% destas células depositadas em pneumócitos tipo II e apenas 4% delas

foram encontradas no epitélio brônquico. Algumas variáveis influenciam o modo pelo qual

essas células­tronco são recrutadas pelo órgão e transformadas em células pulmonares

funcionais. Estas incluem a via de administração, a fonte das células­tronco, o correto

fenótipo transplantado e a correta sinalização.

Baseado nesses dados, um interessante enfoque seria a investigação de estratégias que

aumentassem e estimulassem a população de células­tronco residentes do pulmão ou

estratégias que promovessem a migração de células­tronco da medula óssea para o

perênquima lesado.

2.3.2 Estimuladores celulares

Algumas moléculas foram estudadas com a finalidade de recrutamento e/ou estimulação de

células­tronco no contexto de EP, são elas: fator­2 de crescimento fibroblástico (FGF­2),

adrenomedulina e ácido transretinóico (ATRA). O FGF­2 é um fator angiogênico essencial

para o desenvolvimento pulmonar. Em modelos de cães enfisematosos, o FGF­2 tem sido

considerado como responsável pelo aumento de fluxo sanguíneo do tecido pulmonar lesado

[55]. No entanto, esse mesmo estudo falhou em mostrar regeneração de parênquima ou

26

induzir septação alveolar. A adrenomedulina é um potente peptídeo vasodilatador que tem

sido implicado no aumento do volume pulmonar, complacência estática e diminuição da

média linear intersepto em modelo de camundongos com EP [56]. A adrenomedulina foi

também associada com o aumento do número de células mononucleares no sangue periférico,

assim como no aumento de células circulantes derivadas da medula óssea. O ATRA é um

análogo da vitamina A e apresenta um papel regulatório importante na diferenciação,

desenvolvimento e homeostase do tecido pulmonar. Porém dados a respeito do ATRA são

contraditórios até esse momento. Enquanto alguns autores mostraram aumento das lesões

enfisematosas em ratos [57], outros têm demonstrado benefício morfológico quando

associado com G­CSF [58]. Um pequeno estudo clínico duplo­cego com 20 pacientes não

apresentou benfícios no uso de suplementação de ATRA em pacientes com DPOC [59]. O

estudo clínico multicêntrico FORTE (Feasibility of Retinoids for the Treatment of Emphysema) avaliou a eficácia do ATRA. Embora outros autores tenham descrito melhoras

da capacidade de difusão com dose e tempo­dependentes, o estudo falhou em mostrar

benefícios em escores de densidade pulmonar tomograficamente e em escores de qualidade de

vida [60].

2.3.2.1 Fator de crescimento de colônia de granulócitos

O GCSF (do inglês "granulocyte colony stimulanting factor") também conhecido como

Filgastrina (Figura 1), é um hormônio de ação parácrina predominante implicado no

recrutamento celular. A mobilização de células­tronco progenitoras da medula óssea para a

circulação com G­CSF é de utilização clinicamente mais difundida [61]. Apesar do

mecanismo não ser completamente elucidado, o G­CSF tem sido implicado na produção e

regulação da função neutrofílica [62]. Além dos efeitos benéficos em estudos pré­clínicos, na

clínica seu efeito terapêutico é comprovado e seu uso é bem estabelecido com poucos efeitos

colaterais.

O G­CSF é uma citocina produzida por uma variedade de células, incluindo macrófagos,

fibroblastos, células endoteliais e células do epitélio broncoalveolar [63]. Em condições

27

fisiológicas pequenas quantidades são liberadas para o epitélio alveolar, estimulando a

proliferção, diferenciação e manutenção dos neutrófilos. O G­CSF a nível celular age através

Figura 1: Estrutura molecular do G­CSF [64]

da via Janus kinase (JAK)/sinal transdutor e ativador da transcrição (STAT), proteína kinase do mitogenio ativado (MAPK) e fosfatidilinositol 3­kinase (PI3K)/proteina kinase B (Akt)

[65] (Figura 2). O receptor de G­CSF está presente nos precursores celulares da medula óssea

que em resposta à estimulação por G­CSF inicia proliferação e diferenciação em granulócitos

maduros. O G­CSF é também um potente mobilizador de células­tronco da medula para a

periferia [66].

Figura 2: Mecanismo de ação do G­CSF. O G­CSF é um importante quimiotático envolvido na mobilização, recrutamento e diferenciação de células inflamatórias. A nível intra celular, age através

28

da via Janus kinase (JAK)/sinal transdutor e ativador da transcrição (STAT), proteína kinase do mitogenio ativado (MAPK) e fosfatidilinositol 3­kinase (PI3K)/proteina kinase B (Akt) [65].

Em nível neuronal, o G­CSF pode atuar como fator neurotrófico. Seu receptor é expresso por

neurônios cerebrais e da medula espinhal e a ativação do mesmo induz neurogênese e regula a

apoptose [9, 10]. Essas propriedades têm sido avaliadas em estudos clínicos de fase II no

tratamento de doenças neurológica como isquemia cerebral [67, 68] e esclerose lateral

amiotrófica [69, 70].

Estudos promissores também têm gerado resultados positivos no reparo cardíaco [7, 8]. Foi

demonstrado o potencial terapêutico do G­CSF no restabelecimetno da estrutura e da função

cardíaca em camundongos chagásicos crônicos através da reversão total das arritmias

cardíacas, recuperação parcial da estrutura do miocárdio e restabelecimento da capacidade de

realizar atividade física [71].

Em modelo de enfisema, diversas são as publicações sobre os efeito benéfico do G­CSF sobre

a patologia. Yoshimatsu et al. relataram um efeito morfológico benéfico com o uso de G­CSF em ratos com ou sem associação com ácido transretinóico [72]. Janelle et al. também

publicaram dados de redução de alterações enfisematosas em modelo de camundongos

tratados com G­CSF [73].

Dados contraditórios, no entanto, estão disponíveis quanto ao uso de G­CSF em outros

modelos experimentais das doenças pulmonares. Da mesma forma que autores defendem a

teoria de que G­CSF recruta células­tronco da medula óssea ou do próprio tecido pulmonar

para a região lesada, outros defendem a teoria de que o G­CSF recruta células inflamatórias e

ampliam o dano tecidual. Hierholzer et al. [63] identificaram hipóxia e edema pulmonar em

associação com o recrutamento de células polimorfonucleares com o uso intratraqueal de G­

CSF. Adachi et al. descreveram os efeitos do G­CSF em modelo animal de injúria mediada por bleomicina, identificando aumento do dano alveolar e subsequente fibrose pulmonar com

severidade variável [74].

29

O GM­CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), que apesar de tratar­se de uma molécula diferente, apresenta mecanismo de ação similar, sendo um quimiotático de

poder mais amplificado que o G­CSF, mas apresentou efeito deletério no tratamento de

enfisema em estudo experimental realizado [8]. Porém outros autores têm relatado resultados

positivos com o GM­CSF por regular a apoptose em modelos de enfisema [33].

2.4 ESTUDOS CLÍNICOS EM DPOC

Até a presente data não existem dados disponíveis na literatura de estudos clínicos com a

utilização de G­CSF em DPOC. Existem, no entanto, algumas publicações com a utilização

de células­tronco em diversas patologias pulmonares inclusive DPOC (referencia). O

transplante de células­tronco, pode ser de origem autóloga, vindas do mesmo indivíduo, ou,

alogênica, vindas de um doador. Em teoria a utilização clínica de células­tronco autóloga é

mais segura que à alogênica devido aos riscos inerentes do transplante alogênico. No entanto,

até o momento o tratamento alogênico e o transplante autólogo de células­tronco para doenças

pulmonares com manipulação celular é ilegal nos Estados Unidos e na maioria dos outros

países. Por isso, os tratamentos atuais, quando realizados, utilizam uma limitada quantidade

de células, tendo portanto uma menor chance de sucesso clinicamente relevante. Segundo

informações do FDA (Food and Drug Administration), a manipulação transforma a terapia em remédios, o que requer um maior controle e maior rigor para sua liberação. Estudos em

animais revelaram que as células­tronco podem sim contribuir para a regeneração do tecido

pulmonar em diversas condições patológicas, mas o que ocorre de fato é que, apesar de

avanços na ciência básica sobre o assunto, os resultados são incipientes e portanto incapazes

de alterar, até então, guidelines clínicos de tratamento do DPOC.

Com todos os avanços nas últimas décadas sobre a doença, nenhum tratamento, exceto a

oxigenoterapia, tem alterado inequivocamente a sobrevida dos pacientes com DPOC.

Pacientes seguem por um curso progressivo de doença que culminam em insuficiência

respiratória e óbito deflagrado geralmente por um evento infeccioso. Alguns poucos pacientes

30

têm, no entanto, seu curso de doença interrompido pela realização do transplante pulmonar ou

da cirurgia redutora de volume pulmonar (CRVP). Tanto o transplante como a CRVP têm

sido também grande foco de estudo, tanto na área básica como na clínica. Os estudos clínicos

observacionais nesta população de pacientes que se submetem ao tratamento cirúrgico, têm,

além de outros enfoques, buscado categorizar pacientes nos diferentes estágios de doença e

procurado selecionar subpopulações de pacientes não respondedores aos tratamentos

disponíveis. Com isso é possível definir possíveis candidatos a futuros testes terapêuticos,

como a utilização da engenharia tecidual.

2.4.1 Cirurgia Redutora de Volume Pulmonar

Como a terapia médica tem sido relativamente ineficaz na redução da progressão do

enfisema, algumas tentativas cirúrgicas surgiram no passado afim de reduzir os efeitos da

doença. Manobras iniciais incluiram costocondrectomia e esternotomia transversa para

melhorar a mobilidade torácica. Outros autores tentaram limitar a expansão do pulmão com

toracoplastia e secção frênica. Estas tentativas não obtiveram êxito clínico, porém abriram os

caminhos para que estudos de Brantigan e Mueller, em 1957 [75], propusessem a excisão

pulmonar periférica em cunha dos pacientes enfisematosos, diminuindo assim o volume

pulmonar. Esta idéia foi baseada no conceito de que um pulmão menor poderia restaurar a

eficiência do fole respiratório. O procedimento de Brantigan produziu alguma melhoria na

função pulmonar, mas a taxa de mortalidade foi elevada (18%) e o procedimento foi então

abandonado.

Trinta anos depois, Cooper et al. [76] revisitaram a teoria e descreveram a cirurgia que hoje é conhecida como cirurgia redutora de volume ou CRVP. Esta operação envolve a ressecção de

20% a 30% do parênquima pulmonar hiperinsuflado que não contribue à ventilação eficaz.

Desta forma se reestabelece o fole torácico, há uma melhora na complacência, na performance dos músculos intercostais, do diafragma e por fim, nas trocas gasosas. A mesma teoria, porém utilizada em um momento histórico mais favorável, onde a assistência médica

peri­operatória era melhor, trouxe a melhora fisiológica esperada com uma mortalidade

aceitável. Seu primeiro relatório não mostrou mortalidade precoce ou tardia relacionada ao

31

procedimento.

Após a descrição inicial de Cooper et al. [76], a técnica foi rapidamente difundida pelo mundo, a despeito de resultados variáveis em estudos clínicos com número limitado de

pacientes. Esses dados iniciais levaram a uma euforia da classe médica que passou a

encaminhar os milhões de pacientes portadores de DPOC avançado para tratamento cirúrgico.

Essa corrida dos pacientes em busca do tratamento levou o National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), uma agência do U.S. Department of Health and Human Services (HHS) a desautorizar a realização do procedimento pelas agências de saúde dos Estados Unidos até

que se estabelecesse maior evidência científica. Em 1996, a mesma NHLBI iniciou um dos

maiores estudos clínicos já realizado na área cirúrgica, o NETT (National Emphysema Treatment Trial).

Pesquisadores do NETT de 17 centros avaliaram sobrevida, capacidade de exercício, função

pulmonar, qualidade de vida, escore de dispnéia e taxa de internação de 1.218 pacientes com

enfisema grave. O estudo teve um acompanhamento médio de 29 meses. No início do estudo,

todos os participantes receberam 6 a 10 semanas de reabilitação pulmonar, em seguida, foram

divididos aleatoriamente em dois grupos: 608 pacientes foram selecionados para receber a

cirurgia em adição à terapêutica clínica, e 610 continuaram com o tratamento clínico

exclusivo.

Em 2003, o NETT publicou os resultados da CRVP versus terapia clínica. Os dados

reveleram benefício de sobrevida e dos dados funcionais no subgrupo de pacientes

submetidos a CRVP que apresentaram doença heterogênea com predomínio apical e baixa

tolerância ao exercício [77]. O subgrupo de pacientes com doença heterogênea, porém sem

baixa tolerância ao exercício também apresentou algum benefício, apesar de que menor.

Baseado nestes dados, em novembro de 2003, o Center for Medicare & Medicaid Services (CMS) publicou os critérios para cobertura da CRVP pelas agências de saúde norte­

americanas, permitindo a indicação do procedimento para esses dois subgrupos. O estudo

também relatou os fatores de mal prognóstico e alto risco cirúrgico. O subgrupo com VEF1 <20% e DLCO (Difusão pulmonar de monóxido de carbono) <20% submetido a CRVP

32

apresentou mortalidade de 90 dias de 7,9%, superior ao grupo de terapia clínica (p <0,001).

Estes dados foram atualizados em 2006, com um seguimento médio de 4,3 anos, confirmando

os benefícios anteriormente descritos [78].

Apesar de ter sido um dos maiores estudos clínicos duplo­cego, multicêntrico e randomizado

de todos os tempos na área da cirurgia torácica, o NETT ainda deixou algumas questões sem

resposta sobre subpopulações de pacientes. Embora DLCO e VEF1 menores que 20%

conjuntamente apresentassem maiores riscos, sendo portanto, contra­indicações para CRVP, o

NETT não esclareceu qual o desfecho quando apenas um desses critérios é menor que 20%.

Para ascender mais ainda esta discussão, Meyers et al. relataram dados opostos [79]. Eles publicaram resultados a partir de um grupo de 20 pacientes com um VEF1 e DLCO de 20%

ou menos que foram submetidos a CRVP bilateral e mostraram uma mortalidade em 90 dias

de 5%. O VEF1 aumentou de 0,46 (17%) para 0,78 (32%), uma variação de 73%; e o DLCO

apresentou aumento de 16% para 27%, uma melhoria de 70%. O Kaplan­Meier de 5 anos não

apresentou diferença entre os pacientes de alto risco e sem alto risco. Eles concluiram que os

pacientes deste grupo selecionado pode experimentar melhorias na função pulmonar,

tolerância ao exercício e na qualidade de vida com morbidade e mortalidade aceitáveis após a

CRVP.

Outro ponto também discutível sobre a indicação da CRVP é a realização do procedimento

em pacientes portadores de deficiência de alfa1­antitripsina (A1AT). Estima­se que cerca de

2% da população de portadores de DPOC apresente esta condição como patologia de base

[80]. Estes pacientes passam a apresentar sintomatologia mais precocemente em comparação

aos não portadores e, em geral, têm um predomínio basal do enfisema. Os estudos que

focaram na avaliação específica deste subgrupo são controversos [81­83]. Porém, a American Thoracic Society e a European Respiratory Society (ATS­ERS) publicaram recomendações

sobre o diagnóstico e tratamento de indivíduos com deficiência de A1AT e, devido ao fato da

CRVP oferecer benefícios apenas em curto prazo, a recomendação foi de não oferecer esta

modalidade de tratamento para esta população até que estudos adicionais estejam disponíveis

[84]. Apesar da recomendação, 2/3 dos centros realizadores de CRVP incluem pacientes com

deficiência de A1AT, segundo Hamacher et al. em pesquisa de 45 centros europeus [85].

33

A idade e o momento da indicação também apresentam­se como tópicos não esclarecidos pela

literatura. Em algum momento da evolução, o paciente pode apresentar critérios de

elegibilidade tanto para o transplante quanto para a CRVP. Não está claro que estes pacientes

devam ter a indicação preferencial do transplante apenas pelo fato da idade ser mais

avançada. Como a CRVP serve como ponte para um transplante futuro, alguns autores

sugerem que pacientes com idade superior a 60 anos devam preferencialmente se submeter ao

transplante a fim de evitar transplante após 65 anos [86].

2.4.2 Transplante pulmonar

O transplante pulmonar consiste na substituição de um ou dos dois pulmões quando a doença

alcança o estágio final. Inicialmente, o enfisema foi considerado uma contraindicação para a

realização do transplante pulmonar. Na época em que o transplante bilateral não era uma

rotina, as dificuldades fisiológicas de manter um pulmão nativo hiperinsuflado e um pulmão

recém­transplantado foi considerada um obstáculo muito grande à manutenção da técnica.

Naquele momento, os transplantes eram realizados quase que exclusivamente em pacientes

com fibrose pulmonar onde a resistência vascular pulmonar aumentada no pulmão nativo

levava a um aumento fisiológico da ventilação e perfusão do pulmão transplantado. Somente

após o sucesso inicial com o transplante unilateral para enfisema [87], e após o

desenvolvimento de técnicas que permitiram o transplante pulmonar bilateral [88, 89] é que a

aplicação do transplante pulmonar para enfisema se difundiu.

Dados do International society for heart and lung transplantation (ISHLT) revelam que a terapia com a substituição de órgãos tem se tornado mais corriqueira na área torácia,

alcançando números superiores a 3000 transplantes pulmonares por ano (dados de 2011 do

ISHLT) [90]. Muito se tem evoluido no cuidado destes pacientes transplantados e a

mortalidade peri­operatória tem sido reduzida significantemente, porém a mortalidade tardia

não tem se modificado muito ao longo do tempo. Continua um desafio a busca da descoberta

das causas dessas elevadas taxas de mortalidade tardia e de seus possíveis tratamentos.

A teoria do tratamento com transplante pulmonar é óbvia: substituição completa do pulmão

34

não funcionante, por um pulmão novo, de um doador saudável. A curto e longo prazo, a

função dos pacientes submetidos a transplante uni ou bilateral revela uma dramática melhora

nos volumes pulmonares e na tolerância ao exercício, com a eliminação da necessidade de

oxigênio suplementar. As desvantagens do transplante, no entanto, são bem conhecidas. Não

há doadores disponíveis para a demanda, criando­se assim uma lista de espera que pode

apresentar tempo variável e mortalidade associada. A mortalidade cirúrgica é maior que à

apresentada pelos relatos da CRVP, chegando a cifras de 5­15% para os primeiros 30 dias e

um pouco mais até o final do primeiro ano [91]. Para os sobreviventes a presença do

aloenxerto cria a necessidade de imunossupressão ao longo da vida, que traz consigo maiores

riscos de neoplasia e infecção em comparação com os não imunossupressos. Por último, o

risco de desenvolver disfunção crônica do aloenxerto, ou síndrome de bronquiolite

obliterante, atinge 50­60% dos receptores em 5 anos. O conjunto desse dados demonstram

claramente a solução ainda imperfeita que o transplante oferece para pacientes com enfisema.

Na atualidade, a escolha do transplante bilateral ou unilateral para pacientes com enfisema é

controversa. Em geral, para pacientes mais jovens, particularmente aqueles com deficiência

de A1AT, é preferível o transplante bilateral seqüencial [91]. Por outro lado, os receptores

com comorbidades importantes associadas e idade mais avançada, podem receber o

transplante unilateral. Os primeiros relatos comparativos sobre a eficácia do transplante de

pulmão para enfisema em relação aos riscos do transplante bilateral versus unilateral, demonstraram um maior risco perioperatório para a opção bilateral sem um benefício

funcional justificável para o receptores [92, 93]. Porém, recentemente outros autores têm

relatado resultados opostos em pacientes com DPOC [94]. Um estudo incluiu 306 pacientes,

86 dos quais receberam transplante unilateral e 220 receberam transplante bilateral. A

morbidade e a mortalidade foram comparáveis para os dois grupos, com uma mortalidade

hospitalar global de 6,2%. Não havendo diferença no tempo de internação, tempo em UTI ou

duração da ventilação mecânica. Houve, no entanto, uma diferença na sobrevida a longo

prazo (5 anos), 66,7% para os receptores de transplante bilaterais e 44,9% para os receptores

de um único pulmão [94].

As causas de morte pós transplante pulmonar variam conforme seja a fase em que ocorre o

35

óbito. Óbitos mais precoces são relacionados com as causas cirúrgicas, como sangrameno,

disfunção primária do enxerto, insuficiência renal aguda e infecção. No período que vai de 30

dias a 1 ano predominam as causas infecciosas, visto que, é o período que a imunossupressão

está mais elevada, e após esse período predominam a síndrome de broquiolite obliterante, que

nada mais é que a forma de rejeição crônica, e as causas infecciosas, sobresaindo­se as

infecções fúngicas.

Em verdade, essa população de pacientes que atingem a indicação de transplante é uma outra

população que apesar de estar sendo tratada da forma mais adequada sob a luz da literatura na

atualidade, ainda apresenta elevadas taxas de morbi­mortalidade. Muitas questões ainda não

encontraram suas respostas e os guidelines e tratamentos propostos sustentam­se muitas vezes em informações que carecem de evidência científica maior. A avaliação e reavaliação dessa

população se faz necessária afim de um melhor conhecimento dos fatores contribuintes para

este desfecho.

36

3 OBJETIVOS

3.1 GERAIS

Desenvolver um modelo de enfisema pulmonar em camundongos

Avaliar as alterações morfo­funcionais da terapêutica do G­CSF no modelo de

enfisema pulmonar validado

Analisar pacientes com estágio final de DPOC submetidos a terapia cirúrgica em

centro de referência.

3.2 ESPECÍFICOS

Validar um modelo de enfisema em camundongos C57Bl/6 com a utilização de

elastase porcina avaliando a eficácia e a segurança (mortalidade).

Avaliar as alterações morfológicas induzidas pela administração da elastase porcina

através da medida da média linear intersepto, e funcionais, através da ergometria.

Avaliar o potencial terapêutico do G­CSF sobre o enfisema pulmonar experimental

por análises morfo­funcionais.

Avaliar o perfil epidemiológico pré e pós­operatório de pacientes com DPOC

submetidos a tratameto cirúrgico para a DPOC no Toronto General Hospital.

37

4 MÉTODOS

4.1 EXPERIMENTAL

O estudo experimental foi realizado no período de 2007 a 2012 no laboratório de

Biotecnologia da FIOCRUZ­Ba (CPpGM). Essa parte do estudo foi dividida em duas sessões.

A primeira avaliou a eficácia e segurança do modelo, e a segunda avaliou a eficácia do

tratamento com G­CSF no modelo validado.

4.1.1 Animais

Foram utilizados sessenta e seis camundongos fêmeas da linhagem C57Bl/6 com 4­6 semanas

de idade, pesando em torno de 20g, provenientes do Biotério do CPqGM/FIOCRUZ, onde

foram criados sob temperatura controlada, água e comida ad libitum. O sacrifício foi realizado em câmara de CO2 seguindo o protocolo ético do National Institute of Health para uso de animais de laboratório. Este projeto faz parte do projeto “Terapia de células tronco em

doenças crônico degenerativas” que possui aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais

– CEUA, sob licença no 015/2010.

4.1.2 Indução do Enfisema

Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (0,5 a 2%). Uma mini­incisão cervical

foi realizada até visualização da porção cervical da traquéia. Através de punção traqueal, os

animais receberam 2U/100g de elastase pancreática porcina (Sigma, Aldrich, Taufkirchen,

Germany) dissolvidos em 100μl de phosphate­buffered saline (PBS). Após a instilação traqueal, 200μl de ar foi utilizado para distribuir distalmente a solução instilada. A incisão foi

suturada e os animais mantidos em plataforma aquecida (30 o C) até o despertar.

4.1.3 Teste Ergométrico

38

Uma esteira elétrica recoberta com uma câmara de acrílico hermética (LE 8700 treadmill

control, Panlab, Barcelona, Espanha) acoplada a um analisador de gases (OXYLET 00,

Panlab) foi utilizada para o exercício dos animais. A velocidade da esteira e a intensidade dos

choques aplicados a uma grade localizada na porção traseira da esteira foram controlados por

um potenciômetro (LE 8700 treadmill control, Panlab). Ar ambiente foi bombeado para a

câmara a um fluxo contínuo de 700ml/min por um fluxometro (OXYLET LE 400, Panlab). A

temperatura foi mantida constante a 21±1 o C. A amostra dos gases foi levada por um circuito

fechado ao analisador de gases (OXYLET 00, Panlab) e os dados foram enviados ao

computador através de um amplificador (ML 820, PowerLAb) contendo uma placa analógico­

digital conectado ao computador (notebook DELL, Round Rock, USA). Os dados foram

armazenados em computador para análise no programa Chart 5 para Windows – Metabolism for PowerLab System. Cada animal foi mantido na câmara por 40 minutos antes de iniciar o exercício para adptação e equilíbrio de gases. A velocidade inicial foi de 7.2 m/min com

incremento de 7.2 m/min a cada 10 minutos com inclinação de 10º na esteira ergométrica. O

teste foi realizado até o animal entrar em exaustão, interpretado pela permanência do mesmo

por mais de 10 segundos na área de choque. Parâmetros como consumo de oxigênio,

produção de dióxido de carbono, distância e velocidade de exercício foram registrados.

4.1.4 Administração de G­CSF

Foi administrado G­CSF (Granulokine 30; Hoffman la Roche, Switzerland) por via

intraperitoneal (200 μg/kg/dia) durante 5 dias consecutivos com 3 ciclos de administração e

intervalo de 7 dias entre cada ciclo. Os animais do grupo controle receberam o mesmo

volume de solução salina por via intraperitoneal seguindo o mesmo protocolo.

4.1.5 Avaliação Morfométrica

Após eutanásia dos animais em câmaras de CO2, uma incisão toracoabdominal foi realizada

para exposição de ambos os pulmões. A traquéia foi então canulada com gelco 18 e por duas

horas os animais foram perfundidos com solução de formalina a 4% a uma pressão

hidrostática constante de 20 cmH2O. Após este período, o bloco cardiopulmonar foi retirado

39

com ligadura traqueal a fim de manter constante a pressão alveolar de 20 cmH2O de água. Em

seguida, o bloco foi colocado em solução de formalina 4% para posterior confecção das

lâminas. O corte das lâminas foi feito com 5 micrômetros de espessura e as lâminas coradas

por Hematoxilina­Eosina para análise por microscopia de campo claro. As imagens foram

analisadas usando o programa Image Pro. As regiões de onde foram tiradas as fotos foram

previamente selecionadas de forma que todas as regiões pulmonares fossem contempladas. A

extensão das lesões enfisematosas foi estimada através da medida da média linear intersepto

ou método de Thurlbeck modificado [22, 58]. De cada animal foram colhidas 5 fotografias

com aumento de 40 vezes utilizando o sistema Aperio ScanScope (Aperio Technologies,

Vista, CA.). Uma grade de 10 linhas horizontais e 10 linhas verticais separadas

uniformemente foi sobreposta a cada figura e a distância entre os septos por onde estas linhas

se cruzaram foram computadas. A média da distância de todas estas medidas gerou a média

linear intersepto (Lm).

4.1.6 Análise Estatística

Valores numéricos foram expressos em média e desvio padrão quando não indicado diferente.

Análise ergométrica foi realizada utilizando teste t para comparar grupos antes e após o

tratamento. Dados morfométricos foram comparados com one­way ANOVA seguido do teste de Tukey. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

4.1.7 Desenho do Estudo

4.1.7.1 Parte 1

Nesta primeira avaliação foram utilizados 36 animais divididos randomicamente em 3 grupos:

grupo A1 (controle) não foi manipulado (n=12); grupo B1 recebeu 100 μl de elastase

intratraqueal (n=12) e grupo C1 recebeu 100 μl de PBS intratraqueal (n=12). Nesta parte do

estudo os animais foram avaliados com ergometria antes e após a indução e com análise

morfométrica (Lm) (Figura 3).

40

4.1.7.2 Parte 2

Nesta segunda sessão, 30 animais foram induzidos com 100 μl de elastase traqueal e então

radomicamente divididos em 3 grupos: grupo controle (A2), grupo tratado com salina

intraperitoneal (B2) e grupo tratado com G­CSF intraperitoneal (C2). Nesta etapa, os animais

foram avaliados com ergometria antes da indução, após a indução e após o tratamento, como

mostra a Figura 4.

Figura 4: Esquematização da parte 2 do estudo experimental. Os animais foram submetidos a ergometria em três momentos e o protocolo de tratamento com G­CSF ou salina intraperitoneal (controle) foi de aplicações diárias consecultivas por 5 dias em 3 ciclos a intervalos de 7 dias entre os ciclos.

Figura 3: Esquematização da parte 1 do estudo experimental. Os animais foram submetidos a ergometria antes da indução e após 28 dias da mesma.

41

4.2 CLÍNICO OBSERVACIONAL

4.2.1 Pacientes

Foram revisados prontuários de todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para o

DPOC (CRVP e transplante pulmonar) no Toronto General Hospital num período de 10 anos, de janeiro de 2000 a dezembro de 2009. Dados de história, tipo de cirurgia, função pulmonar

e complicações pós­operatórias foram coletados. Dados de acompanhamento como

reinternamentos e função pulmonar pós­operatória foram registrados até o período do quinto

ano pós­operatório. O estudo teve aprovação do comité de ética e pesquisa da Universidade

de Toronto e do Toronto General Hospital (Protocolo REB 10­0928­BE).

4.2.2 Análise Estatística

Os dados foram analisados com média e desvio padrão exceto quando indicado diferente.

Testes comparativos foram realizados através de teste t de student quando a distribuição foi identificada como normal e ANOVA para análises repetidas. Kaplan­Meier foi utilizada para

análise da curva de sobrevida. Significância estatística foi definida com p<0,05.

5 RESULTADOS

5.1 EXPERIMENTAL

5.1.1 Parte 1 ­ Validação do Modelo de Enfisema

5.1.1.1 Segurança do Modelo

Quatro de 36 camundongos (11,1%) morreram durante o experimento. Os grupos

manipulados com punção traqueal revelaram mortalidade similar (duas mortes por grupo)

independente do tipo de solução administrada (Tabela 1).

42

Tabela 1. Percentagem de mortalidade relacionada à metodologia de indução do enfisema pulmonar. Controle,

animais não manipulados (A1); Administração de 100 μl de elastase intratraqueal (B1); Administração de 100 μl

de PBS intratraqueal (C1).

Grupo n Mortalidade %

A1 12 0 0

B1 12 2 16,7

C1 12 2 16,7

Total 36 4 11,1

5.1.1.2 Análise Funcional ­ Ergometria

Velocidade máxima e distância percorrida alcançada por cada grupo antes e após a

administração de PBS ou elastase estão resumidos na Tabela 2.

Antes da manipulação, todos os camundongos foram capazes de exercitar­se igualmente na

esteira. Após a manipulação, o grupo B1 (administração de elastase intratraqueal) mostrou

uma redução significativa da velocidade máxima de exercício, sustentando velocidades

somente até 16,2 m/min (Tabela 2). Essa diferença resultou em uma redução significante na

distância percorrida pelo grupo dos camundongos tratados com elastase traqueal, reduzindo a

distância percorrida em 30,5% quando comparados com os camundongos tratados com PBS

(Tabela 2).

43

Tabela 2. Avaliação ergométrica dos grupos: (A1) Controle. Animais não manipulados; (B1) Administração de

100 μl de elastase intratraqueal; (C1) Administração de 100 μl de PBS intratraqueal. Medida da velocidade

média durante o teste e distância percorrida. * p < 0,05

Grupo Velocidade (m/min) Distância (m)

Pre Pos Pre Pos

A1 19,8±3,0 19,2±3,2 900±124 810±173

B1 19,2±2,7 16,2±3,1* 810±161 570±45*

C1 18,0±3,0 18,0±3,6 710±157 720±201

No que diz respeito ao consumo de oxigênio e produção de dióxido de carbono, todos os

camundongos tratados com elastase aumentaram o consumo de oxigênio após a indução

quando comparados com a mesma velocidade antes e após a administração de elastase (Figura

4A). Em relação à produção de dióxido de carbono, não foram observadas diferenças

significantes com a mesma velocidade antes e após a administração de elastase (Figura 4B).

44

Figura 4: Análise de gases no teste ergométrico antes e após a indução com elastase no gupo B1. (A) Consumo

de oxigênio (VO2) e (B) produção de dióxido de carbono (VCO2) em diferentes velocidades da esteira no teste

ergométrico, no período de exaustão e nos períodos de repouso pré e pós teste (recupração). Os dados estão

apresentados em média e desvio padrão. n=10 por grupo. Nota­se que nenhum animal do grupo B1 alcançou a

velocidade de 36m/min após indução. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

5.1.1.3 Análise Morfométrica ­ Medida da Lm

A administração de 100 μl de elastase por via traqueal aumentou significativamente o Lm

(99,6 ± 2,9 µm) quando comparado com o grupo tratado com PBS intratraqueal (33,3 ± 0,6

µm) e o grupo não manipulado (25,6 ± 0,1 µm). Um pequeno, mas significativo, aumento de

Lm foi encontrado no grupo tratado com PBS quando comparado com o grupo não

manipulado (Figura 5).

A

45

Figura 5: Análise morfométrica com medida da média linear intersepto (µm) nos grupos controle (A1),

induzidos com elastase (B1) e induzidos com PBS (C1). Nota­se um aumento maior que 3x da média linear

intersepto no grupo induzido (B1) em relação aos demais grupos. * p < 0,05

5.1.2 Tratamento com G­CSF

Na avaliação ergométrica, confirmou­se significativa redução da capacidade ao exercício após

indução com elastase. Camundongos com enfisema tratados com G­CSF recuperaram a

capacidade de exercício, exercitando­se significativamente mais quando comparado ao

desempenho registrado 28 dias após a indução do enfisema (Figura 6). Em contraste,

camundongos enfisematosos tratados com salina mantiveram esta redução até 8 semanas após

o tratamento. Camundongos normais não apresentaram diferença na capacidade de realizar

exercícios físicos ao longo do estudo.

Figura 6: Avaliação da distância percorrida no teste ergométrico nos três grupos do estudo em três momentos

1 1 1

46

distintos, antes da indução, após a indução e após o tratamento. Observa­se redução da distância percorrida após

a indução com elastase nos gruos B2 e C2 e observa­se a recuperação funcional do grupo tratado com G­CSF

(C2) no teste realizado após o tratamento.* p <0,05; ** p < 0,01.

Quando se avaliou a análise dos gases na ergometria no grupo C2, pôde­se observar que no

momento do primeiro teste, antes da indução com elastase, os animais apresentaram padrão

ascendente de VO2 com o aumento do esforço físico. Esse é o padrão fisiológico esperado em

resposta ao exercício. O segundo teste, após indução, revelou um VO2 inicial mais elevado,

porém com o decorrer do teste houve uma curva menos ascendente que no primeiro teste.

Observou­se diferença estatística significante do VO2 somente até a velocidade de 21,6 m/min

em comparação com o primeiro teste. No terceiro teste, após tratamento com G­CSF, houve

uma tendência à redução desse efeito compensatório de aumento da VO2, porém não houve

diferença estatística em relação ao segundo teste (Figura 7A). No período de recuperação,

houve tendência à recuperação mais rápida do VO2 no terceiro teste em comparação com o

segundo.

Na avaliação da produção do dióxido de carbono (VCO2) observa­se um padrão uniforme nos

três testes realizados no grupo C2, houve apenas significância na velocidade de 14,4 m/min

quando comparado com os animais pós­indução, e no período de recuperação em comparação

com os animais pré­indução (Figura 7B).

A

47

Figura 7: Análise de gases (VO2 e VCO2) do grupo tratado com G­CSF (C2) em três momentos do estudo; antes

da indução, após a indução e após o tratamento. (A) Observa­se uma curva ascendente de VO2 no decorrer do

primeiro teste, antes da indução, e curvas mais aplainadas após a indução com elastase (segundo e terceiro

testes). Os animais induzidos com elastase apresentaram VO2 maior no início em comparação com o primeiro

teste, mas não apresentaram o aumento esperado até a exaustão. O terceiro teste, após tratamento com G­CSF,

revelou tendência à redução do aumento compensatório da VO2, vista no segundo exame, porém sem diferença

estatística. (B) As curvas de VCO2 apresentaram padrão quase que uniforme nos três testes. Diferença estatística

ocorreu no período de recuperação entre o primeiro e terceiro teste.

Comparando­se os cortes histológicos pulmonares obtidos dos camundongos enfisematosos

tratados com G­CSF (Figura 8C) com os tratados com salina (Figura 8B), observa­se que o

grupo tratado com G­CSF foi capaz de restaurar o parênquima pulmonar, comprovado pela

reestruturação do septo alveolar, semelhante aos camundongos normais (Figura 8A). A Lm de

camundongos enfisematosos tratados com G­CSF foi semelhante aos observados com os

camundongos não manipulados (Figura 9). Em contraste, a degeneração no enfisema induzida

pela administração de elastase não foi revertida nos camundongos enfisematosos tratados com

salina, que tinha Lm significativamente maior quando comparados aos camundongos normais

ou tratados com G­CSF (Figura 9).

B

48

Figura 8: Corte histológico do parênquima pulmonar (40x) corados com HE dos três grupos: (A) controle; (B)

grupo tratado com salina e (C) grupo tratado com G­CSF. Observa­se o aumento da distância intersepto no

grupo induzido com elastase tratado com salina (B) e recuperação da septação alveolar no grupo induzido com

elastase e tratado com G­CSF (C).

Figura 9: Média linear intersepto dos grupos avaliados (µm). Nota­se a redução significativa da Lm e

recuperação morfológica no grupo tratado com G­CSF em comparação com o grupo tratado com salina. *** p <

0,001.

B C

49

5.2 CLÍNICO OBSERVACIONAL

Ao longo de 10 anos (Jan/2000­Dez/2009), 220 pacientes submeteram­se a tratamento

cirúrgico para a DPOC no Toronto General Hospital. Foram realizados 152 transplantes pulmonares e 67 pacientes submeteram­se a 68 cirurgias redutoras de volume pulmonar

(CRVP).

5.2.1 Cirurgia Redutora de Volume Pulmonar

Dados demográficos e funcionais dos pacientes submetidos a CRVP na avaliação

imediatamente anterior à cirurgia podem ser avaliados na Tabela 3.

Tabela 3: Dados demográficos dos pacientes submetidos a CRVP no Toronto General Hospital de Jan­2000 a Dez­2009. Dados descritos em média (Valor) e desvio padrão (DP).

Parâmetros Valor DP n Idade (anos) 60 9,2 68 Sexo (M/F) 37/31 ­ 68 VEF1 (L) 0,68 0,2 65 VEF1 (%) 24,2 6,7 60 CVF (L) 3,05 7,0 55 CVF(%) 56,7 17,9 54 RV (%) 268,5 63,5 56 CPT (%) 139,7 21,6 55 DLCO (%) 38,1 12,3 57 PO2 (mmHg) 69,3 12,4 48 PCO2 (mmHg) 40,6 9,8 49 6MWT (m) 307,3 101,2 29 IMC (Kg/m 2 ) 23,7 3,8 51 PSVD (mmHg) 34,2 9,7 25

VEF1: Volume expiratório forçado no primeiro segundo; CVF: Cpacidade vital forçada; RV: Volume

residual; CPT: Capacidade pulmonar total; DLCO: Difusão pulmonar de monóxido de carbono; PO2:

Pressão arterial de oxigênio; PCO2: Pressão parcial de dióxido de carbono; 6MWT: Teste de

caminhada de 6 minutos; IMC: Indice de massa corpórea; PSVD: Pressão sistólica de ventriculo

direito.

50

Dentre os pacientes submetidos à CRVP, cinquenta e nove pacientes (86,7%) tinham história

de tabagismo documentado. A média de maços/ano na história foi 36,9 (± 16,9). Vinte e dois

pacientes (32,4%) vieram encaminhados do serviço de transplante pulmonar, sendo

inicialmente encaminhados para aquele programa. Dez pacientes (14,7%) tinham história

prévia de deficiência de alfa­1 antitripsina (A1AT). Um paciente foi submetido a CRVP

unilateral duas vezes durante o período.

Sessenta e uma cirurgias (90%) foram concluídas por vídeo (VATS), quatro pacientes (5,9%)

foram iniciados com VATS e então convertidos, seja para esternotomia ou toracotomia

lateral. As áreas­alvo de ressecção e dados cintilográficos de perfusão estão descritos na

Tabela 4.

Tabela 4: Quantificação cintilográfica da perfusão pulmonar segmentados por áreas alvo.

n 1/3 Super ior (% ) 1/3 Médio (% ) 1/3 Basal (% ) Áreas Alvo D E D E D E

Superior 43 (63,2%) 6,6 7,9 23,3 23,2 18,6 20,4 Inferior 23 (33,8%) 22,6 21,1 22,7 21,1 9,6 7,2

Não específica 2 (3%) 8,4 14,7 16,8 27,9 15,1 17,1

Quinze pacientes (22%) foram submetidos a CRVP unilateral. A mediana de permanência

hospitalar foi de 10 dias. Seis pacientes (8,8%) necessitaram de internamento em unidade de

terapia intensiva (UTI) em algum momento durante o curso pós­operatório. Um paciente

necessitou de ventilação mecânica prolongada e teve uma longa permanência na UTI, 131

dias. Este paciente, em especial, foi transferido para um hospital de reabilitação sob

ventilação mecânica. Os outros 5 tiveram uma média de permanência na UTI de 5,2 dias.

Dois pacientes (2,9%) necessitaram de traqueostomia por ventilação mecânica prolongada.

51

Em termos de resultados pós­operatório imediato, 58% (36/62) dos pacientes permaneceram

com dreno torácico por 10 dias ou mais, com uma média de 13,6 dias (± 13,8). Vinte e oito

por cento (18/64) tiveram alta com dreno torácico (conectados à válvula de Heimlich). Outros dados de morbidade estão descritos a seguir (Tabela 5).

Tabela 5: Quantitativo da morbidade pós­operatória de CRVP. Valores descritos com números absolutos

(porcentagem)

Pneumonia 13 (19,1%) Reoperação por Escape Aéreo 5 (7,4%) Empiema 2 (2,9%) Ventilação prolongada/Traqueostomia 2 (2,9%) Recolocação de Dreno Torácico 2 (2,9%) Rouquidão 2 (2,9%) Reoperação por Hemotórax 1 (1,5%) Trombose Venosa Profunda 1 (1,5%) Tromboembolismo Pulmonar 1 (1,5%) Arritmia req. Cardioversão 1 (1,5%)

Dois pacientes (2,9%) morreram durante o curso hospitalar. Um desenvolveu pneumotórax

hipertensivo seguido de parada cardíaca, e o outro, pneumonia bilateral após reoperação por

escape aéreo.

Avaliação funcional foi registrada nos períodos pós­operatórios: 3° mês, 6° mês, 1°, 2°, 3°, 4°

e 5° ano, quando os pacientes finalmente receberam alta clínica do ambulatório. Avaliação

funcional pós­operatória está descrita na Tabela 6.

De 68 pacientes, 18 (26,5%) foram encaminhados para o programa de transplante de pulmão

quando a função regrediu aos níveis críticos. Neste ponto, eles deixaram o acompanhamento

na clínica de CRVP para acompanhamento naquele programa. Dentre esses 18 pacientes, 12

(17,6%), de fato, se submeteram ao transplante pulmonar após CRVP. O tempo médio de

espera para o transplante foi de 284 dias.

52

Entre o grupo de pacientes que recebeu alta hospitalar após a cirurgia e não foi elegível para o

transplante, 8 (11,8%) evoluíram a óbito durante o período de estudo. Entre aqueles que se

submeteram ao transplante, apenas um morreu após o transplante. O tempo de ponte entre a

CRVP e o transplante foi 4,0 anos (± 1,9).

Tabela 6: Avaliação funcional com espirometria e teste de caminhada (6 WMT) no período pós­operatório dos

pacientes submetidos a CRVP.

3 meses 6 meses 1 ano 2 anos 3 anos 4 anos 5 anos

VEF1 (L) 1,1

(n=35) 1,0

(n=24) 1,0

(n=39) 0,9

(n=27) 0,8

(n=22) 0,8

(n=12) 0,9 (n=8)

VEF1 (%) 39,9 (n=34)

36,4 (n=22)

33,8 (n=35)

29,8 (n=26)

31,6 (n=19)

32,2 (n=11)

31,3 (n=7)

CVF (L) 2,9 (n=31)

2,5 (n=19)

2,6 (n=32)

2,5 (n=22)

2,4 (n=17)

2,2 (n=9)

2,4 (n=6)

CVF (%) 80,5 (n=31)

71,9 (n=19)

74,7 (n=33)

69,1 (n=22)

70,3 (n=16)

69,7 (n=10)

80,5 (n=6)

CPT (%) 115,0 (n=32)

122,5 (n=19)

111,9 (n=33)

120,5 (n=22)

109,9 (n=13)

113,6 (n=8)

131,4 (n=5)

VR (%) 177,1 (n=33)

211,4 (n=18)

185 (n=33)

197,6 (n=22)

172,6 (n=12)

197,3 (n=9)

223,7 (n=6)

DLCO (%) 43,3 (n=34)

43,9 (n=22)

47,3 (n=32)

41,7 (n=23)

40,0 (n=16)

41,3 (n=9)

42,6 (n=7)

6 WMT 365,2 (n=20)

403,3 (n=10)

359,7 (n=21)

356,9 (n=9)

334,3 (n=10)

190,0 (n=2)

398,0 (n=1)

VEF1: Volume expiratório forçado no primeiro segundo; CVF: Cpacidade vital forçada; RV: Volume

residual; CPT: Capacidade pulmonar total; DLCO: Difusão pulmonar de monóxido de carbono; PO2:

Pressão arterial de oxigênio; PCO2: Pressão parcial de dióxido de carbono; 6MWT: Teste de

caminhada de 6 minutos.

Como os pacientes tiveram diferentes medidas da função pulmonar (VEF1) como ponto de

partida, foi realizada uma análise levando­se em consideração a quantidade de pontos

percentuais (pp) acima da medida pré­operatória para cada momento da avaliação, portanto

pp representa a subtração do VEF1(%) pós­operatório pelo VEF1(%) pré­operatório. O

percentual estratificado é mostrado na Figura 10.

53

Figura 10: Estratificação da porcentagem de pacientes com diferentes pp no curso de avaliações pós­

operatórias. Nota­se que progrressivamente o grupo de pacientes que apresentam pp menor ou igual a zero (azul)

aumenta ao longo do acompanhamento pós­operatório e consequante os grupos com pp de 1­10% (vermelho) e

11­20% (verde) apresentam redução de pacientes, que provavelmente migram para o grupo azul. O grupo de

pacientes com pp > 20% (lilás) mantém­se relativamente estável ao longo dos 5 anos de evolução.

Curva de Kaplan­Meier foi utilizada para resumir o número de pacientes que haviam estado

com a função acima da linha de base (Figura 11). Os pacientes foram sensorados quando

morreram ou referendados para o transplante. Para os demais pacientes, a data da última visita

clínica foi considerada a data final. A sobrevida mediana foi de 4,6 anos.

54

Figura 11: Kaplan­Meier de pacientes com função pulmonar acima da linha de base. Pacientes foram

sensorados quando evoluiram a óbito ou quando foram encaminhados ao serviço de transplante. Para os demais,

a data da última visita foi considerada a data final.

Quando avaliamos o subgrupo de pacientes com deficiência de A1AT (n = 10), vemos que

todos eles tiveram doença predominante basal. No pré­operatório, a função não diferiu entre

os grupos com e sem deficiência de A1AT (20,3% versus 24,9%, p = 0,06). Quatro pacientes do grupo com deficiência de A1AT (40%) foram encaminhados para o programa de

transplante, enquanto apenas 14 (24%) pacientes do grupo sem deficiência declinaram função

ao ponto de serem encaminhados. Todos do grupo de deficiência de A1AT acabaram se

submetendo ao transplante, enquanto que apenas oito do grupo sem deficiência (13,8%)

receberam de fato o transplante. Os tempos de permanência hospitalar e de drenagem não

apresentaram diferença estatística. Nenhum dos 10 pacientes morreu durante a internação

cirúrgica. Mesmo sem haver significância (p = 0,06), pacientes sem deficiência de AAT

tenderam a ter melhor e mais sustentável função após a cirurgia (Tabela 7).

55

Tabela 7: Avaliação funcional (VEF1) dos grupos com e sem deficiência de A1AT no curso pós­operatório.

3meses 6meses 1ano 2anos 3anos 4anos 5anos

Def A1AT 13,2 3,5 6,3 1,3 4,0 3,0 2,0

DP 6,6 2,1 6,9 3,2 3,5 ­ ­

n 5 2 6 4 3 1 1

Sem Def A1AT 16,1 15,2 10,2 7,8 5,5 6,8 ­0,6

DP 11,3 17,1 10,6 11,9 12,9 15,1 18,6

VEF1 (pp acima linha de base)

n 27 20 29 21 16 10 5

VEF1: Volume expiratório forçado no primeiro segundo; A1AT; Alfa­1 anti­tripsina.

Quando avaliamos o subgrupo de pacientes que tinham função pulmonar pior (VEF1 <= 25%)

(n=40) e comparamos com aqueles que tinham melhor VEF1 (> 25%) (n=20), vemos

tendência a diferentes evoluções do ponto de vista funcional (Figura 11). Os pacientes que

apresentavam a VEF1 inicial acima de 25% apresentaram uma melhor resposta funcional,

observando­se um ganho do VEF1 mais elevado que o grupo que apresentava VEF1 inicial <=

25%, porém com valor de p sem significância. Uma tendência de maior incidência de complicações pós­operatórias no grupo com VEF1 <= 25% também foi observada, no entanto,

a significância estatística não foi confirmada (Tabela 8).

56

Figura 11: Evolução funcional (PP de VEF1 acima da linha de base) dos grupos com VEF1 inicial >25% e VEF1 inicial <=25%. p = ns. PP: Pontos Percentuais.

Tabela 8: Complicações pós­operatórias dos grupos que apresentavam VEF1 inicial >25% e VEF1 inicial

<=25%.

VEF1 >25% VEF1<=25% Pneumonia 15% 25% Recolocação de Dreno 5% 2,5% Re­operação 0% 15% Empiema 0% 5% Rouquidão 0% 5% Embolia Pulmonar 0% 2,5 Arritmia 5% 0%

57

5.2.2 Transplante Pulmonar

Cento e cinquenta e dois transplantes foram realizados em pacientes com DPOC no Toronto General Hospital no período do estudo, 69,1% do total das cirurgias realizadas para a patologia. As características demográficas dos pacientes estão descritas na Tabela 9.

Tabela 9: Dados demográficos dos pacientes submetidos a transplante pulmonar no Toronto General Hospital de Jan/2000 a Dez/2009. Valores descritos em média e desvio padrão (DP).

Parâmetros Valor DP n Age (anos) 59 8,0 152 Sexo (M/F) 88/66 ­ 152 VEF1 (L) 0,5 0,37 149 VEF1 (%) 20 13,1 143 CVF (L) 2 2,7 147 CVF (%) 56 19 145 CPT (%) 146,5 26,1 152 DLCO (%) 30,8 14,4 121 PO2 (mmHg) 68 16,8 141 PCO2 (mmHg) 46 10,2 143 6MWT (m) 289,6 7,8 145 IMC (Kg/m 2 ) 23 5,4 149 PSVD (mmHg) 36 15,6 113

VEF1: Volume expiratório forçado no primeiro segundo; CVF: Cpacidade vital forçada; RV: Volume

residual; CPT: Capacidade pulmonar total; DLCO: Difusão pulmonar de monóxido de carbono; PO2:

Pressão arterial de oxigênio; PCO2: Pressão parcial de dióxido de carbono; 6MWT: Teste de

caminhada de 6 minutos; IMC: Indice de massa corpórea; PSVD: Pressão sistólica de ventriculo

direito.

A evolução da função pulmonar caracterizada pelo VEF1 pode ser vista na Figura 12. Pode

ser observado, que dos pacientes sobreviventes, houve estabilidade da função pulmonar até o

quinto ano pós operatório. Diferença estatística houve apenas entre o pré operatório e as

avaliações subsequentes.

58

Figura 12: Evolução espirométrica (VEF1) pré e pós­transplante pulmonar até o quinto ano de

acompanhamento.

A análise da curva de sobrevida revela que a sobrevida em 90 dias foi de 94%, 88% no

primeiro ano e 63% no quinto ano (Figura 13).

Figura 13: Curva de sobrevida de pacientes com DPOC submetidos a transplante pulmonar.

Cinquenta e dois pacientes (34%) evoluíram a óbito durante o período do estudo. As causa do

óbito foram na sua grande maioria ou por infecção (38%) ou rejeição crônica (38%) (Figura

14).

59

Figura 14: Análise do percentual das causas de morte nos pacientes submetidos a transplante pulmonar.

DAD: Dano alveolar difuso; PLTD: Doença linfoproliferativa associado a transplante

6 DISCUSSÃO

Este trabalho foi dividido em duas sessões, uma experimental com a validação de um modelo

de enfisema e o teste terapêutico com um fator de crescimento celular (G­CSF) no modelo

utilizado; e uma sessão clínica com um observacional retrospectivo de uma população de

pacientes com DPOC submetidos a tratamento cirúrgico, CRVP ou transplante pulmonar.

Na primeira sessão, induzimos o enfisema por injeção intratraqueal de elastase pancreática

suína, o que resultou em uma medida da média linear intersepto de 99,6 µm. Ishizawa et al. [58] utilizaram a mesma concentração de elastase por instilação intranasal para induzir o

enfisema em camundongos e, depois de três semanas, eles observaram anormalidades

pulmonares com média linear intersepto de 80 µm. O mesmo grupo repetiu o procedimento, a

fim de testar os efeitos do Fator de Crescimento de Hepatócito nos pulmões induzidos a

enfisema por elastase, e a média linear intersepto encontradoa foi menor: 65 µm [95]. Outro

estudo [96], usando camundongos C57Bl/6, camundongos transgênicos SP­C/TNF­a e doses

similares de elastase encontraram uma média linear intersepto variando entre 60 e 85 µm. A

avaliação dos dados morfométricos disponíveis sugere que a administração intratraqueal de

60

elastase parece mais eficiente para induzir enfisema, juntamente com uma mortalidade

relativamente baixa. Ishizawa et al. [58, 95] não mencionaram a taxa de mortalidade observada em seus estudos.

Em outro estudo [97], enfisema foi induzido em uma linhagem de camundongos transgênicos

(NMRI), que possui uma maior atividade endógena anti­protease. Dois grupos experimentais

foram usados para administrar elastase pancreática suína por instilação intratraqueal: 5U/100g

com administração única e 3.3U/100g com administração repetitivas. Em ambos os

tratamentos, a mortalidade absoluta de animais foi elevada (seis e cinco ratos,

respectivamente). No entanto, os autores não mencionaram o número total de animais

utilizados por grupo. Parece claro que a maior concentração de elastase utilizada em seu

estudo resultou em uma maior taxa de mortalidade entre os animais experimentais em

comparação com o presente estudo que utilizou a dose de 2U/100g. Estes resultados indicam

que o protocolo experimental utilizado em nosso estudo é mais aplicável na indução de

enfisema em camundongos.

Comparando­se os parâmetros morfológicos de nosso estudo com os medidos por Luthje et

al. [97], observamos que a Lm foi maior no último estudo (260,7 µm) quando comparado com os nossos dados (99,6 µm). A maior destruição do parênquima pulmonar induzida em

camundongos pela Luthje et al. [97] pode ser atribuída à maior concentração de elastase utilizado, bem como pela linhagem do camundongo utilizada, que é mais suscetível ao

desenvolvimento de anormalidades estruturais pulmonares.

Uma série de outros estudos utilizaram a via nasal para a indução de enfisema [98­100]. Nos

estudos experimentais todos os fatores externos devem ser diminuídos ou excluídos do teste.

Acreditamos que esta via leva à aspiração errática da dose de elastase e portanto uma maior

variação no dano pulmonar atribuído à elastase. De fato, parte do que é administrado por via

nasal é deglutido ao invés de aspirado. Utilizamos em nossos experimentos a via traqueal

através de punção cervical. Com isso garantimos que toda a dose administrada alcançou a via

aérea distal. Apesar de não publicado, utilizamos em nosso estudo piloto a via nasal e

observamos que a mesma dose de elastase não levou a alterações pulmonares enfisematosas

61

quando administrada por via nasal. A via traqueal é mais invasiva, apresenta mortalidade

provavelmente maior que a nasal porém apresenta vantagem indiscutível que é a certeza da

dose administrada.

Outro fator importante no controle dos fatores relacionados com a média linear intersepto é a

perfusão traqueal de formalina durante a fixação dos pulmões. Diferentemente de outros

órgãos, que basta serem imersos na solução de formalina, o pulmão necessita ser fixado a uma

pressão constante e conhecida para que o alvéolo mantenha sua conformação e tamnaho. Em

geral a pressão intra­alveolar é de 15 a 25 cmH2O. Desenvolvemos um dispositivo capaz de

manter a pressão intratrqueal de 20 cmH2O de forma constante a cinco camundongos

simultaneamente. Com isso, evitamos hiperdistensão alveolar e leitura incorreta do Lm.

A atividade física é significativamente prejudicada no paciente com DPOC, alterando

significativamente sua qualidade de vida. A patogênese da incapacidade física é complexa e

envolve a perda de força muscular respiratória, alterações nas trocas gasosas e anormalidades

na mecânica pulmonar, o que reflete na intolerância ao exercício. Técnicas de avaliação de

tolerância ao exercício em modelos animais têm ganhado mais importância após publicações

revelando que estes testes têm correspondência com a avaliação espirométrica [41]. Eles têm

a vantagem de serem não invasivos, de fácil realização, podendo ser repetidos durante o curso

do estudo quantas vezes forem necessários e ainda apresentam a vantagem de avaliar a função

cardiorespiratória relacionada ao exercício de uma forma global.

Luthje et al. demonstraram uma redução na distância percorrida em relação em camundongos enfisematosos avaliados por teste ergormétrico [97]. Nosso estudo avaliou não só a distância

e o tempo de exercício, mas também o consumo de oxigênio e a produção de dióxido de

carbono. Os resultados obtidos demonstraram que a indução do enfisema compromete a

capacidade ao exercício provavelmente devido ao comprometimento das trocas gasosas em

conseqüência da destruição do parênquima pulmonar (Figura 4 e Tabela 2).

Em nosso trabalho, com uma única administração intratraqueal de elastase e um pequeno grau

de inclinação na esteira, observamos uma redução da distância percorrida de 30,5% quando

62

comparado ao pré­tratamento. Outros estudos também revelaram redução da capcidade física

de camundongos em realizar exercício na esteira após a administração intratraqueal de

elastase [101]. O desempenho de camundongos na esteira no estudo de Luthje et al. revelou que não houve diferença na distância percorrida entre o controle e o grupo que recebeu

elastase intratraqueal em única dose, mas houve redução de 29,7% no grupo com

administração repetida de elastase [97]. Embora a destruição do tecido pulmonar tenha sido

mais caracterizada no estudo de Luthje et al., como mostrado pelo maior aumento de Lm, nosso procedimento experimental resultou no mesmo nível de comprometimento funcional

com menos aplicações de elastase. Vale ressaltar que a diferença entre as linhagens utilizadas

e o sexo dos camundongos pode justificar alugumas diferenças entre os estudos

experimentais.

Diferente dos trabalhos anteriormente mencionados, analisamos a dinâmica das trocas gasosas

durante o exercício. O aumento do consumo de oxigênio (Figura 4A) pode refletir o estado

hipermetabólico causado pela doença e a habilidade compensatória do coração em aumentar o

débito cardíaco, atendendo as demandas metabólicas do animal durante o esforço. Um estudo

que avaliaou a inflamação em modelo de enfisema, identificou uma maior quantidade de

leucotrieno B4, marcador de inflamação, entre o 14° e o 28° dia pós indução [100]. A

manutenção da produção de dióxido de carbono (Figura 4B) pode significar que o

comprometimento da troca gasosa não foi suficientemente grave a fim de aumentar a

produção de CO2. O CO2, por ser 24x mais difusível que o O2, mantém o VCO2 inalterado no

curso da patologia até a doença atinja estágio avançado.

Portanto, o modelo testado no nosso estudo fornece algumas vantagens, como o uso de uma

menor concentração de elastase quando comparados a outros estudos, levando a significantes

anormalidades estruturais que podem ser responsáveis por distúrbios funcionais que

caracterizam enfisema pulmonar. Além disso, o enfisema pode ser induzido com uma taxa de

mortalidade relativamente baixa e um alto grau de reprodutibilidade, podendo ser avaliado

funcionalmente através de métodos não­invasivo com teste de tolerância ao exercício.

Quanto ao tratamento de lesões pulmonares enfisematosas com a terapia celular, muitos

63

estudos investigando diferentes terapias restauradoras do tecido e da função têm sido descritas

nos últimos anos. Células­tronco da medula óssea [102], células­tronco mesenquimais [103],

fatores de crescimento como G­CSF [104], GM­CSF [105], VEGF [106], HGF [107] etc têm

sido empregados em modelos experimentais de diversas doenças crônicas, como

miocardiopatia chagásica crônica, encefalomielite auto­imune, cardiomiopatia isquêmica,

doenças neurológicas, doenças renais e doenças pulmonares. Alguns deles inclusive já foram

testados em ensaios clinicos [67­70].

Neste estudo, nós demonstramos, pela primeira vez por análises funcional e morfométrica,

que o tratamento com G­CSF induziu à recuperação da função de troca gasosa pulmonar e

estrutura alveolar. A melhora da função respiratória se refletiu em um melhor desemnpenho

físico durante o exercício em camundongos tratados com G­CSF. Estes efeitos podem ser

devido a muitas ações do G­CSF já descritas, como a mobilização de células­tronco derivadas

da medula óssea, estimulação de células­tronco residentes do próprio tecido, indução de

angiogênese [108], redução da inflamação e fibrose [71, 109] e indução de apoptose de

células inflamatórias [71].

Na literatura, diversos estudos tiveram como objetivo promover a reparação e regeneração do

tecido pulmonar no enfisema por G­CSF. Ishizawa et al. demonstraram que a administração de ATRA conjuntamente com G­CSF resultou na mobilização de células da medula óssea

para o parênquima pulmonar e na regeneração do septo alveolar (redução da Lm) [58]. Os

efeitos benéficos sobre a estrutura pulmonar, no entanto, foi melhor observado quando

utilizado em associação quando comparado com a utilização individual do ATRA ou do G­

CSF. Janelle et al. demonstraram o efeito benéfico da pre­elafina, um inibidor da elastase, administrado em modelo de enfisema em camundongos [73]. Os autores demonstraram que o

efeito benéfico era associado a uma maior concentração de G­CSF e a uma diminuição de

neutrófilos no parênquima pulmonar. Outros autores têm demonstrado que as lesões

pulmonares diretas inflamatórias provocadas no parênquima pulmonar pela elastase são

transitórias e por volta do sétimo dia após a administração são inexistentes [110]. As lesões

enfisematosas começam a aparecer a partir da primeira semana da administração, o que leva a

crer que elas são, pelo menos em parte, desencadeadas por liberação endógena de proteases.

64

Yoshimatuso et al. demonstraram que G­CSF é capaz de reverter lesões enfisematosas desde

que o protocolo de adminstração do G­CSF se inicie quando as lesões enfisematosas entejam

bem estabelecidas [72]. Segundo eles, G­CSF não impediu progressão do enfisema quando

administrado a partir do quarto dia da administração da elastase, outros autores também não

identificaram efeito benéfico quando quando G­CSF foi administrado antes da indução com

elastase [111]. Yoshimatuso et al. testaram as dosagens de 100 e 200 μg/kg/dia com múltiplas aplicações, e apesar de observarem tendência a maior redução da Lm com a dose 200

μg/kg/dia, não houve diferença estatística entre elas. Eles demonstraram redução da Lm em

28% com a dose de 100 μg/kg/dia e 35% com a dose de 200 μg/kg/dia [72]. Enquanto nós

demonstramos redução de 45,7% com a dose de 200 μg/kg/dia. Provavelmente, essa diferença

é devido a um diferente protocolo de administração do G­CSF. Eles aplicaram 100 μg/kg/dia

ao longo de 7 semanas, somando um total de 20 aplicações. Nós realizamos um protocolo

mais curto, porém com maior dosagem, 200 μg/kg/dia em 4 semanas, somando um total de 15

aplicações. Essa diferença e os dados de Yoshimatuso et al. levam a crer que a redução da Lm pode ser dose dependente.

Por outro lado, alguns autores têm demonstrado efeito deletério do G­CSF no parênquima

pulmonar em outros modelos, pricipalmente em modelos de hipóxia e fibrose por bleomicina

[63, 74]. Esses autores acreditam que o G­CSG ative e recrute células pró­inflamatórias

aumentando a fibrose iniciada pela patologia de base. Esses modelos diferem dos modelos de

enfisema por serem iminentemente produtores de fibrose. Outro fator que pode contribuir

para resultados discrepantes é a linhagem utilizada no estudo. Em modelo de enfisema, Fujita

et al. [96] utilizaram duas linhagens diferentes de camundongos para testar o modelo. Os autores identificaram que a regeneração alveolar induzida pelo tratamento (ATRA) foi

dependente da espécie e da linhagem.

No presente estudo, mostramos que o reparo estrutural está associado à uma recuperação da

função visto que os camundongos tratados com G­CSF tiveram a reconstituição da parede

alveolar e melhora na resposta ao teste ergométrico em esteira. Isso indica que a troca gasosa

alveolar é restabelecida através da recuperação da superfície de troca, e portanto, da relação

ventilação­perfusão pulmonar. Outro dado que merece análise mais detalhada é a resposta do

65

VO2 no modelo após a indução e após o tratamento com G­CSF. O VO2 que melhor reflete a

capacidade de exercitar­se é o VO2 de pico, aquele aferido na exaustão. Em nosso estudo não

identificamos diferença entre os três testes. No entanto, identificamos uma tendência a retorno

mais rápido do VO2 para níveis basais no grupo tratado quando se avalia o período de

recuperação. Alguns autores têm relatado que este efeito se correlaciona bem com uma

melhor tolerância ao exercício [112].

O outro possível efeito benéfico do G­CSF no parênquima pulmonar, refere­se ao efeito

imunomodulador que o G­CSF desempenha na modulação da apoptose. Durante o

desenvolvimento de enfisema, há um aumento do processo apoptótico em resposta a

componentes tóxicos liberados no parênquima pulmonar. Se o clearance de células mortas falhar, pode­se desencadear um processo auto­imune [113] que causa a auto­destruição da

parede alveolar e algum grau de deposição de fibrose devido a uma inflamação persistente

[114­116]. A administração de G­CSF reduziu a apoptose de miócitos cardíacos e aumentou a

apoptose de células inflamatórias no coração danificado causado pela infecção por T. cruzi

[71]. Da mesma forma, a modulação da apoptose também pode ocorrer nos pulmões

enfisematosos, levando à restauração do parênquima e restabelecimento da troca gasosa.

A administração de G­CSF no enfisema pulmonar experimental teve efeitos benéficos sobre a

estrutura do pulmão que foram compatíveis com uma melhora na capacidade de exercício.

Neste contexto, a administração de G­CSF surge como uma opção terapêutica promissora.

Assim, dada a relevância destes achados, mais estudos são necessários para investigar os

mecanismos pelos quais este fator de crescimento tem efeitos benéficos no enfisema.

Na sessão clínica do nosso estudo, avaliamos retrospectivamente uma população de pacientes

com DPOC que foi submetida a tratamento cirúrgico no Toronto General Hospital. Esse

estudo foi relizado em um dos maiores centros de referência mundial em tratamento cirúrgico

do DPOC e teve como objetivo conhecer melhor o perfil do paciente que declina função

pulmonar de forma mais severa ao ponto de necessitar de tais intervenções. No período de 10

anos, 220 cirurgias foram realizadas, 152 transplantes e 68 CRVP.

66

Em relação aos pacientes submetidos à CRVP, encontramos que eles apresentavam idade

média de 60 anos com VEF1 de 24% (Tabela 3). Outros dados demográficos também

confirmam o perfil funcional de DPOC avançado dos pacientes como, CPT de 140%, DLCO

de 38%, RV de 268% e 6MWT de 307m. Esses dados corroboram com o perfil dos pacientes

tratados com CRVP nos diversos centros. Alguns centros tendem, no entanto, por intervir

mais precocemente, com relação à função (VEF1) [77, 117, 118]. O NETT, por exemplo,

apresentou média de VEF1 de 26,8%. O centro avaliado, em contraste, não contra­indica a

CRVP baseado apenas no valor do VEF1. Cerca de 2/3 dos pacientes avaliados apresentaram

VEF1 crítico, menor ou igual a 25%.

Em relação à capacidade de se exercitar, o 6MWT têm se mostrado uma exelente ferramenta

na avaliação de gravidade destes pacientes [119]. O teste consta na simples medida da

distância percorrida durante 6 minutos de caminhada sem estímulo. Um importante estudo

tem demonstrado a superioridade da avaliação multidimensional, não apenas com VEF1, mas

também com escore de dispnéia, 6MWT e IMC (escore de BODE), na identificação do risco

de morte dos pacientes com DPOC [120]. O estudo pontuou o 6MWT de 0 a 3 e identificou

que, dos 207 pacientes avaliados, os que morreram (n=25) apresentaram média do 6MWT de

175m (± 86). A média da distância percorrida em nosso estudo foi de 307m, o que repreenta

pontuação 1 no escore do estudo de Celli et al [120]. Outro fator associado a risco de óbito no estudo foi o IMC, onde 21 Kg/m 2 foi o ponto de corte, obtendo pontuação 1 os pacientes com

IMC < 21 Kg/m 2 e 0 aqueles com IMC > 21 Kg/m 2 . Os pacietnes avaliados apresentaram

média de IMC de 23 Kg/m 2 . Infelizmente, por se tratar de um estudo retrospectivo, o escore

de BODE não pôde ser completamente analisado pela falta da informação do escore de

dispnéia, parte integrante do escore, registrado no momento pré­operatório.

A análise das áreas alvo da ressecção cirúrgica, revelou que 97% dos pacientes apresentaram

doença heterogênea identificada por teste cintilográfico perfusional. Apesar de parte dos

pacientes terem sido tratados antes mesmo da publicação do NETT, em 2003, a premissa de

que a CRVP era indicada para doença heterogênia já fazia parte da rotina do serviço avaliado.

Os únicos 2 pacientes que não puderam ser caracterizados como heterogêneos, também não

foram caracterizados como homogêneos, apenas tiveram áreas­alvo diferentes na direita e na

67

esquerda. Isso, assim como o fato de que todas as cirurgias terem sido realizadas pelo mesmo

cirurgião, se somam para fornecer mais consistência nos resultados do estudo. O NETT, no

entanto, revelou que mais importante que ser heterogêneo, é ter doença predominantemente

apical. Em nosso estudo, 66% dos pacientes apresentaram predomínio apical. Porém este fato

está intimamente relacionado com o fato do serviço oferecer o tratamento para portadores de

deficiência de A1AT. Cem por cento (n=10) dos portadores de deficiência de A1AT

apresentaram predomínio de doença basal.

Em termos de avaliação pós­operatória imediata, apesar da menor VEF1 média dos pacientes

selecionados para CRVP e da elevada parcela de pacientes portadores de A1AT, o estudo

apresentou mortalidade operatória global de 2,9%, permanência hospitalar de 10 dias e

pneumonia como principal morbidade pós­operatória (19%). Yusen et al. descreveram uma mortalidade hospitalar de 4,5% na era pré NETT [121] e Meyrs et al., 5% em 90 dias na era

pós NETT [122]. No entanto, mortalidades intra­hospitalares tão altas quanto 12% são

também encontradas na literatura [123]. A permanência hospitalar da literatura varia de 7,6

dias [124] a 11,4 dias [125].

Os pacientes permaneceram com dreno torácico por 13,6 dias e 58% deles mantiveram o

dreno por mais de 10 dias. Em um estudo, DeCamp et al [124]. descreveram os fatores que eles encontraram como predisponentes à fuga aérea prolongada no pós­operatório de CRVP.

Segundo os autores, 90% dos pacientes submetidos a CRVP apresentam fuga persistente.

Baixa difusão, baixo VEF1, predomínio de doença apical, presença de aderência pleural e ser

caucasiano foram os fatores relacionados com maior risco de escape prolongado. De fato,

estes pacientes que apresentaram escape prolongado, apresentaram também maior risco de

complicações, 57% versus 30% no estudo de DeCamp et at [124]. Em nosso estudo, o número pequeno de pacientes não permitiu utilizarmos técnicas estatísticas para definirmos se

as complicações foram relacionadas com o escape propriamente dito ou com os fatores de

risco.

A avaliação da função pulmonar pós­operatória revelou que os pacientes sairam de uma FEV1

inicial média de 24,2% para uma VEF1 de 39,9% no terceiro mês pos­operatório (Tabelas 5 e

68

6), permanecendo com a melhora até o quinto ano de acompanhamento (VEF1 31,3%). Esses

dados, no entanto, apresentam um viés que somente os pacientes capazes para realização do

teste foram avaliados. Yusen et al. descreveram os dados de função de 200 CRVP consecutivas [121]. Eles encontraram que 92% dos pacientes apresentavam alguma mehora

da VEF1 ao 6° mês, 72% no 3° ano e 58% no 5° ano. Em nosso estudo encontramos 91%,

69% e 34% respectivamente (Figura 10). Essa marcada diferença entre os nosso resultados no

5° ano com o daquele estudo provavelmente se deve pelo fato daqueles autores não terem

incluído pacientes com deficiência de A1AT. Com o declínio da função, os pacientes foram

então encaminhados para avaliação de transplante. Vinte e seis por cento dos pacientes, foram

encaminhados e 17% receberam o transplante de fato. Para estes pacientes, encontramos um

tempo de ponte para o transplante de 4 anos. Meyers et at. [79] encontraram um tempo de ponte de 3,6 anos.

A análise de subgrupos revelou que pacientes com deficiência de A1AT ou com função

pulmonar pré­operatória ruim (VEF1 <= 25%) apresentaram tendência a pior evolução

funcional, porém não alcançamos diferença estatística. Os pacientes com deficiência de

A1AT declinaram função mais precocemente na evolução da doença (Tabela 7), sendo isto

comprovado pelo maior número de encaminhamentos para avaliação de transplante (40%

versus 24%). Donahue et al. descreveram melhora funcional e de escore de dispnéia nesta população de pacientes portadores de deficiência de A1AT até o followup de 2 anos [80]. A

escassez de doadores e a baixa mortalidade cirúrgica perioperatória continuam sendo os

alicerses da indicação de CRVP nesta população. Quanto à análise dos subgrupos dividos por

função pulmonar inicial, vimos que a tendência à maior resposta do grupo com melhor função

inicial se reduz ao longo dos anos retornando à função inicial e igualando­se com aquele

grupo. Essse dados, no entanto, devem ser avaliados com cautela quando dissociados da

avaliação dos questionários de qualidade de vida. Fica ainda como questão em aberto, o

impacto da qualidade de vida que ocorre nesses diferentes grupos.

No grupo submetido ao transplante pulmonar, encontramos 152 cirurgias realizadas no

período de 10 anos. Enquanto o número de CRVP se manteve constante ao longo do tempo, o

número de transplantes aumentou substancialmente, passando de uma média de 10

69

transplantes/ano, nos 3 primeiros anos do estudo, para 23 transplantes/ano no final. Esse

aumento pode ser justificado por um maior número de pacientes referendados

especificamente a este serviço nos últimos anos, pois mundialmente o transplante para DPOC

tem reduzido proporcionalmente em relação à fibrose pulmonar. DPOC e fibrose pulmonar

sempre foram as patologias que disputaram o ranking das indicações de transplante pulmonar

pelo mundo. Em 2005, o ministério da saúde norte­americana passou a adotar um escore para

alocar os doadores disponíveis, e este escore, o lung allocation score, passou a favorecer os portadores de fibrose pulmonar naquele país. Desta forma, notou­se uma queda nos registros

internacionais de transplante por DPOC. Em nosso estudo avaliamos o perfil epidemiológico

e funcional dos pacientes que se submeteram ao transplante em um único centro e avaliamos a

evolução funcional, assim como a mortalidade.

Quanto aos dados demográficos e funcionais, notamos que os pacientes apresentaram média

de idade de 59 anos, VEF1 de 20% e 6WMT de 289m. Notadamente essa população apresenta

menores valores funcionais em comparação àquela submetida a CRVP. Esses dados em

conjunto auxiliam na determinação da gravidade da doença e na identificação do melhor

momento para a indicação do transplante. Após o estudo de Celli et al., que determinou os

fatores predisponentes de morte nos portadores de DPOC [120], os guidelines da sociedade internacional de transplante de pulmão, o ISHLT, passaram a adotar o escore de 5 a 7 como

ponto de corte na indicação do procedimento [126]. Como ocorrido com a CRVP, também

não foi possível concluir a determinação do escore de BODE devido à falta do escore de

dispnéia no momento da intervenção. No entanto se considerássemos que a média do escore

de dispnéia da população estudada tenha sido de 3, o escore de BODE seria 6, considerando

que tenha sido 4, o escore de BODE suberia para 7.

Com relação ao acompanhamento funcional pós­operatório, notamos que os pacientes

mantiveram função constante ao longo de 5 anos do acompanhamento (Figura 12). Apesar

desses dados também apresentarem o viés que apenas os pacientes vivos e em condições de

realização da espirometria contribuiram para esta avaliação, é possível inferir pelo menos que

os pacientes mantidos em acompanhamento ambulatorial mantém função estável até o quinto

ano de evolução.

70

No que este estudo realmente diferencia­se da literatura em geral são os dados da curva de

sobrevida (Figura 13). A população estudada apresentou uma mortalidade de 6% em 90 dias,

12% em 1 ano, 21% em 2 anos e 37% em 5 anos. Dados do registro internacional de

transplante revelam mortalidade no primeiro ano de 21%, 36% no terceiro e 47% no quinto

[90]. Os dados ficam mais discrepantes ainda quando comparados com as publicações

nacionais [127], 32,3% de mortalidade no primeiro ano em uma avaliação de 130 pacientes

submetidos a transplante por todas as causas, dos quais, 40% foi por DPOC.

Dos 38 óbitos relatados, a grande maioria foi secundária a rejeição crônica e infecção,

somando ambas quase 80% das causas de óbito. Esses dados corroboram com o dados do

registro internacional de transplantes [90].

71

7 CONCLUSÃO

A instilação intratraqueal única de elastase porcina na dose de 2U/100g é segura e

reprodutível na indução de enfisema em camundongos fêmea da linhagem C57/Bl6 . O estudo

comprovou a eficácia do método através de teste funcional ergométrico e morfométrico (Lm).

A indução levou os camundongos a apresentarem redução na capacidade de se exercitar na

esteira e aumento da Lm.

O estudo mostrou ainda o potencial terapêutico do G­CSF no tratamento experimental do

enfisema através de análise funcional e estrutural. O tratamento com G­CSF induzidiu

regeneração alveolar em camundongos enfisematosos, que foi bem correlacionada com a

melhora da capacidade de exercitar­se. Estes resultados sugerem que a administração de G­

CSF pode ser uma terapia promissora para o tratamento de pacientes com enfisema avançado

devido a destruição do parênquima pulmonar e, consequentemente, com função respiratória

comprometida.

CRVP e transplante são opções terapêuticas cirúrgicas para o DPOC avançado, no entanto,

ambas apresentam morbimortalidade associada. CRVP apresenta uma indicação mais restrita,

não impede o curso natural da doença, porém pode postergar a indicação do transplante em

alguns anos. O transplante pulmonar, por sua vez, oferece uma melhora funcioanal

substancial, com baixa mortalidade precoce, no entanto, ainda apresenta mortalidade tardia

elevada. Análises de um número maior de pacientes, incluindo de outras instiuições, são

necessárias para melhor análise dos subgrupos. Estas análises auxiliarão na identicação de

subpopulações ainda não satisfatoriamente tratadas com os recursos terapêuticos disponíveis

na atualidade, que possam se beneficiar de novos tratamentos, como com a engenharia

tecidual.

72

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