Upload
ulric
View
117
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása. 3. gyakorlat. Indikátor mikrobák. Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok) Coliformok Escherichia coli Salmonel lák. Enterobaktériumok. Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella
kimutatása
3. gyakorlat
Indikátor mikrobák
Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok)
Coliformok Escherichia coli
Salmonellák
Enterobaktériumok
Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra
Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobokoxidáz negatívakNO3→NO2-vé redukáljákglükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett
Enterobaktériumok kimutatása
Lemezöntés: VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml)kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra
értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek
Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra
értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra
VRBG
OXIDÁZ-próba
1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgáspozitív: kékesPár másodperc - perc, A vas katalizálja! (üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető)
Enterobaktériumok:Enterobaktériumok: negatívnegatív
FERMENTÁCIÓS próba
Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra
pozitív: pozitív: sárgasárga, gázt termelEnterobaktériumok: az eredetileg
piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából)
s
Szőlőcukros magasagar
KATALÁZ próba
1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg
Enterobaktériumok: pozitívpozitív
Coliformok
Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják
EscherichiaEscherichia (E. coli), KlebsiellaKlebsiella (K. oxytoca),
CitrobacterCitrobacter (C. freundii), EnterobacterEnterobacter (E. aerogenes) nemzetség– Gr-, vaskos pálcák, – epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C
hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt,
– Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben)
– Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti
Klebsiella
Coliformok kimutatása
VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe)– gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát– savtermelés → neutrálvörös → piros,
precipitációs udvar, min. 1 mm– 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös)
telepekEndo agar
– gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin– laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-
szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin
kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)
VRB agar
Endo agar
Coliformok kimutatása
BBL leves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús
Laurilszulfát-laktóz-levesgátlóanyag: Na-lauril-szulfátDurham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz
X-leves (szintetikus táptalaj)ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek
Kromogén Coliform agarok
Escherichia coli
Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba)
Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7)
Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól
IMV(E)C próbák
Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben
→ VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat
IMV(E)C próbák
Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció
0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata)
1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű
Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék
IMV(E)C próbák
Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció
1-2 csepp METILVÖRÖS reagens+: az egész leves színe élénkpiros–: az egész leves színe sárgaA kevertsavas, és a butándiolos erjesztést
végző baktériumokat különíti el egymástól (E.coli kevertsavas erjesztést végez)
IMV(E)C próbák
VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat
2 óra múlva+: tenyészet felső része piros A glükózt butándiolosan erjesztő
baktériumok kimutatására szolgál.
IMV(E)C próbák
VP-próbaGlükóz → acetil-metil karbinol
(acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke]
↓ O2, KOH
diacetil
↓ +kreatin piros szín
IMV(E)C próbák
Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on,
majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció→
+: eredeti zöld KÉK-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs
baktérium-növekedés(Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on
kék)
Az IMV(E)C próbák értékelése
Indol-képzés
Metilvörös-próba
Voges-Proskauer-
próba
Citrát-hasznosítá
s
ELBÍRÁLÁS
+ + - - Fekáltípusú E. coli
- + - - Atípusos E. coli
- + - + Citrobacter típusos
+ + - + Citrobacter atípusos
- - + + Klebsiella v. Enterobacter
+ - + + Enterobacter atípusos
β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása
β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-alMUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil → β-D-glükuronidáz → umbelliferon
(fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van
(néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!)
E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG
β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása
Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor
TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml)
Inkubálás 44± 1 oC 18-24 óraPozitív telep: kék
További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!
Salmonella
– Enterobacteriaceae család– Gram -, nem spórás– Önálló mozgásra képes, peritrich csillós
kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi– 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így
írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!)
– Fakultatív anaerob– Laktózt nem bontja, de– Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek
laktóz +, ONPG +– Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között
laktóz -, ONPG +
Általános tulajdonságok
Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°CpH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5
Ellenálló képesség:– Fagyasztástól nem pusztul el– Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5)
sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége– Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli– D idők:
60°C-on 2-6 perc 70°C-on <1 perc (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050
perc)
– 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt
Salmonellák kimutatása
A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól
Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerintMintavétel:
– 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta– 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű
öblítőfolyadék
Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani.Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.
Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.
25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz
↓H O M O G É N E Z É S
↓18±2 óra 37±1°C (elődúsítás)
0,1 ml 1 ml↓ ↓
+10 ml RVS dúsító +10 ml MKTTn dúsító↓ ↓
24±3 óra 41,5±1°C 24±3 óra 37±1°C↓ ↓
Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.
↓ ↓ ↓ ↓XLD Másik táptalaj XLD Másik táptalaj↓ ↓ ↓ ↓
24±3 óra 37±1°C 24±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása
↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C)
Biokémiai próbák Szerológiai próbák
Dúsítók
RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító
Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2
MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin
Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2
Régen használatban volt még:
Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld
Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz
Szilárd táptalajok - XLD
XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agarxilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj)– Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín– H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín– Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor
szín (pH-változás)– Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása,
Gram+-okat gátoljaSalmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével
(vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel
XLD
Egyéb szilárd táptalajok
BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agarlila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna)Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat
BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agarSem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni.
Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik
Rambach agar: propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum
SS agar: Salmonella-Shigella agarlaktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörösSzulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknekLaktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj
BPLS
Az MSRV agar
MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar– A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán
alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez.
– Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.
Biokémiai megerősítés
TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-
tioszulfát, fenolvörös1. Glükóz bontás: (TSI)
savképzéssel +sav és gáz +
2. Laktózbontás: - , (TSI)Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás
3. Szacharóz bontás: - (TSI)4. H2S termelés: +, (TSI)
Biokémiai megerősítés
RÖVID BIOKÉMIAI SOR1. Glükóz bontás: +2. Laktózbontás: általában - 3. Szacharóz bontás: - 4. H2S termelés: +
5. Karbamid bontás: -6. Indolképzés: -7. Lizin-dekarboxilálás: +8. Voges-Proskauer próba: -9. ONPG-reakció: általában -
TSI agar
– TSI alja sárga: glükóz pozitív– TSI teteje piros:
laktóz és szacharóz negatív– Fekete foltok a TSI
agarban:H2S-termelés
Biokémiai próbák
5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) - (karbamid leves, 37°C, 24-48 óra)értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja
Biokémiai próbák
6. Indolképzés: - (triptonvíz, 37°C, 16-24 óra, Kovács-reagens)értékelés: - sárga
Biokémiai próbák
7. Lizin-dekarboxilálás: + (lizin leves, 37°C, 20-24 óra)értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor), (- : sárga lenne)
Biokémiai próbák
Karbamidbontás:
negatív
Lizin-dekarboxiláz:
pozitív
Biokémiai megerősítés
8. Voges-Proskauer próba: -, CH3 CH3
CH-OH 40%-os KOH C=OC=O α-naftol, kreatinin C=OCH3 CH3
acetoin diacetil (piros)
9. ONPG-reakció (o-nitrofenil β-D-
galaktopiranozid) : -
Laktóz bontás
Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása
ONPG reakció
(0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc)értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne)Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+
Szerológiai azonosítás
Önagglutináció kizárása: 1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt, – Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem
lehetséges
Szerológiai azonosítás
O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén)
Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja)
H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar),
Az eredmények értékelése
Biokémiai próbák
Ön-agglutináció
Szerológiai próbák
Eredmény
Jellemző - O-, Vi- vagy H-Ag pozitív
Salmonella
Jellemző - Mindegyik negatív
Feltehetően
Salmonella
Jellemző + Önagglutináció miatt nem alkalmas
vizsgálatra
Nem jellemző -/+ O-, Vi- vagy H-Ag pozitív
Nem jellemző -/+ Mindegyik negatív
Nem Salmonella
Pozitivitás esetén
Döntő szerológiai azonosítás: A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a – Nemzeti Salmonella Központba (Országos
Epidemiológiai Központ) vagy a – Salmonella Referencia Központba (MGSZH)
kell küldeni.
Salmonella bakteriofág
Fág-tipizálás