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Binke, R. und F. Schwägele (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr.
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Entwicklung einer leistungsfähigen Methode zur Bestimmung der
Menge einerTier- und Pflanzenart in Erzeugnissen mittels PCR
Development of an efficient method for the quantification of
animal and plant species in meatproducts by means of PCR
R. BINKE und F. SCHWÄGELE
Zusammenfassung
Neben der ELISA-Technik gewinnt die Artenbestimmung unter
Anwendung der PCR zuneh-mend an Bedeutung. Für viele Tierarten sind
Testsysteme unterschiedlicher Hersteller er-hältlich. Diese
qualitativen Kits besitzen eine hohe Spezifität und können selbst
geringsteZusätze verschiedener Tierarten in komplex
zusammengesetzten Lebensmitteln identifizie-ren. Derzeit werden
große Anstrengungen unternommen, quantitative Systeme zur
Bestim-mung von Tier- und Pflanzenzusätzen zu entwickeln. Hierbei
müssen zwei zentraleProbleme gelöst werden. Einerseits werden
Methoden benötigt, die beginnend mit der Ex-traktion, über die
Vervielfältigung des Analyten bis hin zu seiner Detektion richtige
und re-produzierbare Ergebnisse liefern. Andererseits müssen diese
Ergebnisse auf festgelegteReferenzen bezogen werden, da
Desoxyribonukleinsäure (DNA) einer bestimmten Tierartüber
verschiedene Zutaten wie beispielweise als Muskelfleisch, Fett,
Eiweisshydrolysat, Blutoder Gelatine mit unterschiedlichen
DNA-Gehalten und Qualitäten (unverändert oder inBruchstücken) ins
Lebensmittel gelangt. Eine quantitative Angabe ist demnach nur
dannsinnvoll, wenn man die Zuverlässigkeit und Aussagekraft der
angewandten Methode kenntund darüber hinaus relevante Angaben über
die Art der zur Verarbeitung verwendeten Zutathat.In der
nachfolgenden Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die geeignet
ist, Kontaminationenvon wertbestimmenden Fleischanteilen in
Fleischerzeugnissen mit Hilfe der PCR zu unter-scheiden.
Summary
PCR- and ELISA-techniques are of increasing importance for the
identification of animalspecies. A number of commercially available
kits are existing for various animal species.These detection
systems are suitable for qualitative identification of very low
amounts ofadded meat in food. At present quantitative PCR systems
for the determination of animal andplant species are to be
developed. For quantification two problems have to be solved. At
firstall analytical steps like nucleic acid extraction,
amplification and detection must be validated.Secondly the obtained
results must be correlated to specified standards because the
amountof isolated DNA depends on the prevailing matrices like
muscle meat, fat, isolated protein,blood or gelatine. A
quantitative determination is practicable if there is sufficient
knowledgeabout accuracy of the methods and the existing matrices in
processed products.In this report a PCR based method suitable for
distinguishing varying amounts of meat andcontaminations in meat
products is presented.
Schlüsselwörter DNA-Extraktionssystem – Quantifizierung –
Tierartenbestimmung –Fleischerzeugnisse
Key Words DNA extraction system – quantification –
identification of animal species –meat products
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Einleitung
Zur Überprüfung von Deklarationen beiFleisch und
Fleischerzeugnissen ist einemöglichst präzise und richtige
Analysen-methode für die Bestimmung verwendetertierischer und
pflanzlicher Zutaten inFleischerzeugnissen von großer Bedeu-tung.
Nach § 8 Lebensmittel-Kennzeich-nungsVO in Verbindung mit der
QUID(engl. Quantitative Ingredient Declaration) -Regelung ist die
Menge der Zutat imZutatenverzeichnis anzugeben, wenndiese in der
Verkehrsbezeichnung aufge-führt ist. Darüber hinaus zeigt die
Diskus-sion über den Zusatz von gentechnischveränderten Organismen
(GVO) im Sinneder EG Verordnung (VO) Nr. 1139/98 zu-letzt geändert
durch EG VO Nr. 49/2000vom 10. Januar 2000, dass die Kenntnisüber
Art und Anteil des gentechnisch ver-änderten Materials von
zentraler Bedeu-tung sein kann. Zur Überprüfung vonGrenzwerten bzw.
von quantitativen An-gaben müssen deshalb geeignete Metho-den
bereitgestellt werden.
Eine umfangreiche Auswahl an amtlichenMethoden nach § 35 LMGB
steht denAnalytikern derzeit für die Tierartidentifizie-rung
(qualitativer Nachweis) zur Verfü-gung. Hierbei handelt es sich um
Verfah-ren auf Protein- und Fettsäure-Basis,deren jeweilige Vor-
und Nachteile vonSCHWÄGELE (1999) und HONIKEL (2002)umfassend
beschrieben wurden. Darausstellt sich die Frage nach der
Not-wendigkeit weiterer Nachweisverfahren,welche in der Lage sind
die Nachteile derbestehenden Methoden zu kompensieren.Eine
Möglichkeit Tierarten in Lebensmit-teln nachzuweisen besteht darin,
artspezi-fische Fettsäure- oder Proteinmuster mitStandards der zu
untersuchenden Tierartzu vergleichen. Diese Methoden versagenin der
Regel, je mehr Tierarten im Le-bensmittel verarbeitet wurden,
insbeson-dere wenn die prozentualen Anteile starkvariieren. Eine
Zuordnung von Mustern istdann nur noch bedingt oder gar nicht
mehrmöglich. Die Proteinanalytik bietet darüberhinaus die
Möglichkeit, einzelne artspezifi-sche Proteine nachzuweisen und
damitdie verarbeitete Tierart im Produkt zuidentifizieren. Diese
Methoden setzen je-
doch die definierte dreidimensionaleStruktur der Proteine
voraus, welche beider Herstellung von Lebensmitteln bei-spielsweise
durch Temperatur, pH-Wertoder durch den Verarbeitungsgrad so
be-einflusst werden können, dass qualitativeNachweise zunehmend
erschwert werden.Eine semi-quantitative Aussage ist derzeitnur in
Kombination unterschiedlicher Ver-fahren und unter Kenntnis der
verschiede-nen Einflussfaktoren bei relativ großer Un-sicherheit
möglich.
Prinzip der PCR Analyse
Wünschenswert ist demnach eine Zielsub-stanz, die für jede
Tierart spezifisch undrelativ konstant im Organismus vorhandenist
sowie darüber hinaus eine strukturelleSpezifität auch in
hochprozessierten Le-bensmitteln beibehält. Eine geeigneteSubstanz,
welche diese geforderten Ei-genschaften hinreichend erfüllt, ist
Des-oxyribonucleinsäure (DNA). In tierischenZellen ist DNA im
Zellkern und in denMitochondrien lokalisiert. Ihr Anteil
wurdebeispielsweise für Rindermuskulatur mitetwa 0,04 - 0,06 %
(YOUNG et al., 1987,HERBEL und MONTAG, 1987 undSAVAIANO et al.,
1983) bestimmt. Für denNachweis werden DNA-Bereiche ausge-wählt,
die aufgrund ihrer unterschiedlichenAbfolge (Sequenz) der
Nucleobasenspezifisch für eine Tierart sind. Mit Hilfeder
Polymerase Kettenreaktion (PCR) wirddieser Sequenzbereich
(Template) ver-vielfältigt und kann anschließend mit ge-eigneten
Verfahren wie der Gelelektropho-rese in Verbindung mit
spezifischenFärbemethoden sichtbar gemacht undbewertet werden. Das
Prinzip der PCR istin Abbildung1 dargestellt.
Dabei werden alle für die PCR benötigtenKomponenten in
geeigneten Konzentratio-nen in einem sogenannten Mastermix
zu-sammen pipettiert und für die nachfol-gende PCR in einen
Thermocyclergestellt. Dieses Gerät steuert durch präzi-sen
Temperaturverlauf die Vervielfältigungdes DNA-Abschnitts.
Im ersten Schritt wird eine Temperatur von95 °C eingestellt, bei
der die DNA in ihreEinzelstränge aufgeschmolzen (denatu-
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riert) wird. Kurze DNA-Abschnitte (Primeroder Startersequenzen)
lagern sich beiTemperaturen zwischen 50 - 60 °C spezi-fisch an die
getrennten DNA-Matrizen(Templates) an, indem sie die zu
verviel-fältigende Sequenz einschließen. DieDNA-Polymerase
verlängert im letztenSchritt der PCR bei einer für sie
optimalenTemperatur (beispielsweise 72 °C) diePrimer, so dass am
Ende eines Zyklus dieZielsequenz verdoppelt wurde. Die
expo-nentielle Vermehrung (2n, n = Anzahl derZyklen) wird im Laufe
der PCR durch diesich ändernde Zusammensetzung der
Mastermix-Komponenten und die abneh-mende Aktivität der
DNA-Polymerase zu-nehmend langsamer und kommt nachetwa 20 - 40
Runden zum Stillstand. Beioptimaler Einstellung der PCR sollte
derKurvenverlauf, insbesondere der Teil desexponentiellen Anstiegs,
nur abhängig vonder eingesetzten DNA-Menge sein. AlleFaktoren, die
eine gleichbleibende PCRbeeinflussen, wie beispielsweise
unter-schiedliche Reaktionsansätze, Reakti-onsgefäße, Thermocycler
und insbeson-dere die Qualität des DNA-Isolats müssenvorher
standardisiert werden.
Abb. 1: Schematischer Ablauf der PCR
Die hier dargestellten Untersuchungenverfolgen das Ziel,
quantitative PCR-Me-thoden insbesondere für die Bestimmungvon
Fleisch in Fleischerzeugnissen bereit-zustellen. Sie sollen dazu
beitragen, denVerbraucher vor Täuschung und gesund-heitlichen
Gefahren wie beispielsweise vorallergieauslösenden Bestandteilen
zuschützen.
Mit Blick auf den 1 (0,9) % Grenzwert fürGVO-Zusätze und die
Überprüfbarkeit vonMengenangaben soll gezeigt werden,
wiereproduzierbar derzeit Nucleinsäure ausFleisch und Fleischwaren
isoliert werdenkann und welchen Einfluss der Verarbei-
tungsgrad wie beispielsweise die Hitze-behandung auf die
Ergebnissicherheit derverwendeten PCR-Methode hat.
Material und Methoden
Für die Isolierung von Nucleinsäuren ausFleisch und
Fleischerzeugnissen wurdeein geeignetes Extraktionssystem
opti-miert und validiert (BINKE et al., 2003)welches nachfolgend
kurz beschriebenwird.
Zur Lyse werden 25 mg bis 100 mgFleisch bzw. 50 mg
Fleischerzeugnis ein-
5´3´
3´5´
5´3´5´3´
3´5´3´5´
DNA - Matrize (Template)
5´ 3´5´ 3´
3´ 5´3´ 5´
Schmelzen (Denaturieren)
Primer - Anlagerung (Annealing)
extrahierte DNA
����������
3´
5´
5´
��������������������
3´
5´
5´3´
5´
5´
DNA - Synthese (Elongation)
5´ 3´3´ 5´5´ 3´3´ 5´
Verdoppelung der Zielsequenz
PCRZyklusPCR
Zyklus
5´3´
3´5´
5´3´
3´5´
����������
5´5´3´
��������������������
5´5´3´5´3´
����������5´ 3´5´
��������������������5´ 3´5´
���������5´ 3´5´
���������5´ 3´5´
MastermixPrimer
MgCl2dNTP
Polymerase
��������������������������������
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gewogen, mit Lysepuffer, einer salzhalti-gen wässrigen Lösung,
und demproteinabbauenden Enzym Proteinase Kversetzt. Der Ansatz
wird über Nacht ly-siert. Hierbei werden die
proteinhaltigenZellstrukturen zerstört, so dass die DNAnach
erfolgter Lyse gelöst in der Suspen-sion vorliegt. Nach Zugabe
einer chloro-formhaltigen Extraktionslösung werdenalle nucleophilen
Bestandteile in die orga-nische Phase überführt, wohingegen
nichtlysierte Proteine an der Interphase aus-gefällt werden. Die
Nucleinsäuren verblei-ben in der wässrigen Lösung und werdendurch
Zentrifugation von den restlichenProbenbestandteilen abgetrennt.
Der klareÜberstand, in dem sich die DNA befindet,wird abpipettiert.
Die Nucleinsäure wirdanschließend mit Isopropanol
ausgefällt(Präzipitation). Die DNA kann nun entwe-der durch
Zentrifugation an die Wand desReaktionsgefäßes (Abb. 2, System 1)
oderan entsprechendes Säulenmaterial(Abb. 2, System 2) adsorbiert
werden.Nach erfolgter Reinigung der DNA mit ei-ner ethanolischen
Waschlösung wird dieDNA mit Hilfe eines wässrigen Puffers vonder
Säule eluiert bzw. in Puffer gelöst.
Der Nucleinsäuregehalt in den Extrakti-onslösungen wird nach dem
Verfahrenvon WARBURG und CHRISTIAN (1942)bestimmt. Hierbei werden
die Absorptio-nen der Lösungen bei Wellenlängen von260 nm und 280
nm mit Hilfe eines Spek-tralphotometers gemessen und der
Nuc-leinsäuregehalt in µg/ml berechnet.
Die Amplifikation der Zielsequenz erfolgtmit einem Thermocycler
der Firma PerkinElmer (PE 9600) oder dem Real TimePCR System von
Corbett Research (RotorGene 2000). Die tierartspezifischen
Primerwerden von der Firma Cibus BiotechGmbH bezogen. Die
Primersequenzen(GM03/GM04) für den Nachweis von Sojaund die
PCR-Bedingungen sind der § 35Methode L 00.00-31 entnommen.
DieCharakterisierung der PCR-Produkte er-folgt bei Verwendung des
ThermocyclersPE 9600 nach gelelektrophoretischerTrennung
(Probenvolumen 5 µl; 10 % Po-lyacrylamidgel; 85 V; < 200 mA; ca.
1,5 h;Molekulargewichtsmarker 322 / Hae III,Qbiogen) durch Anfärben
der Banden mit
dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid.Die Interpretation der
Messdaten bei derReal Time PCR wird mittels Vergleich derCt-Werte
(engl. Ct-value, Ct = thresholdcycle) durchgeführt. Dieser Wert ist
defi-niert als der Punkt, an dem der Schwel-lenwert (Threshold) die
Amplifikations-Kurve der Probe schneidet (Abb. 3). DerCt-Wert ist
bei gleicher Reaktions-Effizienzvon Proben und Standards nur
abhängigvon der Ausgangsmenge der intakten Ziel-DNA im
Reaktionsansatz. Die Reaktions-Effizienz einer 1:10 Verdünnung ist
inBezug auf den unverdünnten Standard derTheorie nach maximal, wenn
dieser einenum 3,3 erhöhten Ct-Wert besitzt. HöhereCt-Werte
signalisieren eine nicht voll-ständige Verdopplung der
Ziel-Sequenzpro PCR-Zyklus.
Zur Bestimmung der Nachweisgrenzewurden Brühwursterzeugnisse
bestehendaus 50 % Magerfleisch, 25 % Öl, 23 % Eisund 2 % Salz,
Gewürzen undZusatzstoffen, mit unterschiedlichenAnteilen an
Pferdefleisch und Sojaproteinhergestellt und unterschiedlich
starkerhitzt.
Ergebnisse und Diskussion
Extraktion der DNA. Die bereits durchge-führten Arbeiten zeigen,
dass ein brauch-bares DNA-Extraktionssystem für Fleischund
Fleischerzeugnisse bei hoher Repro-duzierbarkeit und Reinheit
entwickeltwurde. Für tierisches Gewebe wurde einrelativer
Verfahrensvariationskoeffizientbzw. eine relative
Verfahrensstandard-abweichung (CVxo, engl. coeffizient ofvariation)
von < 10 % für 7 untersuchteTierarten ermittelt (BINKE et al.,
2003).
Die Verfahrensstandardabweichung ist einMaß für die Streuung der
Analysenergeb-nisse bezogen auf den Mittelwert der Ka-libriergerade
(Abb. 4). Sie kann aus derReststandardabweichung und der Stei-gung
entsprechend der folgenden Glei-chung berechnet werden und ist ein
Indi-kator für die Präzision und Robustheiteiner Methode.
100[%]0
0 ⋅⋅=
xbs
CVx y
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Lösen bzw. Elution der Nucleinsäuren
Probeneinwaage
Lyse der Probe
Extraktion
1.
2.
3.
Präzipitation der Nucleinsäuren
Isolierung
Waschen
System 1 System 2
4.
5.
6.
7. Lösen bzw. Elution der Nucleinsäuren
Probeneinwaage
Lyse der Probe
Extraktion
1.
2.
3.
Präzipitation der Nucleinsäuren
Isolierung
Waschen
System 1 System 2
4.
5.
6.
7.
Abb. 2: Schematischer Ablauf der DNA Extraktion
Abb. 3: Amplifikationsverlauf ausgewählter Standards am Beispiel
von Pferdefleisch
Abb. 4: Parameter zur Bestimmung der relativen
Verfahrensstandardabweichung als Maßfür die Robustheit und
Präzision einer Methode
Verfahrens- standardabweichung (CVx 0)
Reststandardabweichung (s y) ist die Streuung der Messwerte um
die Regressionsgerade.
y
x
Regressionsgrade y = bx + a mit : b = Steigung a = Schnittpunkt
der y - Achse
x0
Mitte des Konzentrationsbereiches
x0 + CVx0 x0 - CVx0
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Die Eignung dieses Extraktionssystemswurde anschließend auf
Fleischerzeug-nisse ausgeweitet. Hierfür wurden insge-samt 44
kommerziell erhältliche Fleisch-erzeugnisse, davon 14 Rohwürste,
24Brühwürste und 6 Kochwürste jeweilszweimal aufgearbeitet und der
Nucleinsäu-regehalt bestimmt. Die mittlere Abwei-chung der
einzelnen Doppelbestimmun-gen lag bei 11,3 %. Es konnte
gezeigtwerden, dass auch Nucleinsäure ausFleischwaren
reproduzierbar isoliert wer-den kann.
Nachweisgrenzen (NWG). Als weitererParameter für die Validierung
des Extrak-tionssystems wurden die Nachweisgren-zen (NWG) für eine
Tierart (Pferd) undeine Pflanzenart (Sojaprotein) in verar-
beiten Brühwürsten mittels PCR ermittelt.Nach DIN 32645 stellt
die NWG eine Ent-scheidungsgrenze für das Vorhandenseineines
Analyten da. Für die PCR-Analytikkommt diesem Parameter eine
besondereBedeutung zu, da im Gegensatz zu denmeisten
Bestimmungsmethoden hier derAnalyt (DNA-Abschnitt) vor seiner
Detek-tion millionenfach vermehrt (amplifiziert)wird und damit die
Nachweisgrenze in derPraxis relativ frei wählbar ist. Für die
Be-stimmung der NWG kann aufgrund derAmplifikation der Zielsequenz
nicht derNachweis des Analyten entscheidendsein, sondern der
Anteil, der sich signifi-kant von möglichen Kontaminationen
un-terscheidet. Die Ergebnisse dieser Unter-suchung sind in Tabelle
1 dargestellt.
Tab. 1: Bestimmung der NWG für Pferd und Soja
AnteilPferd
Erhit-zung
Nach-weis
AnteilPferd
Erhit-zung
Nach-weis
AnteilSoja
Erhit-zung
Nach-weis
AnteilSoja
Erhit-zung
Nach-weis
HK schwach HK +DK schwach DK + DK - DK +
0,00 % VK - 0,50 % VK + 0,00 % VK - 0,10 % VK +TK - TK +ÜP - ÜP
+ ÜP - ÜP -HK + HK +DK + DK + DK + DK +
0,05 % VK + 1,00 % VK + 0,01 % VK - 0,20 % VK +TK - TK +ÜP - ÜP
+ ÜP - ÜP -HK + HK +DK + DK + DK + DK +
0,25 % VK + 45,7 % VK + 0,05 % VK + 1,00 % VK +TK + TK +ÜP + ÜP
+ ÜP - ÜP -
HK = Halbkonserve, DK = Dreiviertelkonserve, VK = Vollkonserve,
TK = Tropenkonserve,ÜP = überhitztes Produkt (FC-Wert = 32)
Die durchgeführten Untersuchungen erga-ben, dass sowohl
Pferdefleisch als auchSojaprotein bis zu einer Konzentration
von0,05 % (VK) in Fleischerzeugnissen sicheridentifiziert werden
können. Der Nachweiswurde als positiv gewertet, wenn das fürdie
jeweilige Art spezifische PCR Produktnach gelelektrophoretischer
Trennung undFärbung sichtbar war (Abb. 5 und 6).
Wie die Bahnen 2 und 7 der Abb. 6 zei-gen, wurden mit dieser
Methode nicht nurgeringste Zusätze der entsprechenden
Tierart, sondern auch Kontaminationenidentifiziert (Tab. 1).
Abb. 6 zeigt aber sehrdeutlich, dass diese Banden in ihrer
Inten-sität wesentlich schwächer sind als bei-spielsweise der 0,05
% Zusatz. Derzeitlaufen Untersuchungen, die sich mit
derKontaminationsgefahr bei der Herstellungvon Fleischwaren und
deren Auswirkun-gen auf die PCR-Analytik befassen. Durchgeeignete
Einstellungen der PCR lassensich aber Kontaminationen von
geringstenZusätzen deutlich unterscheiden (Abb. 6,Bahn 2, 3 und
7).
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Abb. 5: Gelelektrophoretische Trennung derPCR-Produkte für den
Nachweis vonSojaeiweiss in
Fleischerzeugnissen(Dreiviertelkonserve).1. Negativkontrolle, 2.
0,05 %, 3. 0,10 %,4. 0,20 %, 5. ohne Soja, 6. 1,00 %,7. 0,01 %, 8.
Soja 100 %, 9. Soja 20 %,10. Molekulargewichtsmarker 7-587 bp
Abb. 6: Gelelektrophoretische Trennung derPCR-Produkte für den
Nachweis vonPferdefleisch in Fleischerzeugnissen(Halbkonserve).1.
Negativkontrolle, 2. ohne Pferd,3. 0,05 %, 4. 0,25 %, 5. 0,50 %, 6.
1,00 %,7. ohne Pferd, 8. 45,7 %, 9. Pferd 1 %,10.
Molekulargewichtsmarker 7-587 bp
Einfluss der DNA-Struktur. Für die Effizienzder PCR ist neben
der Anzahl der extra-hierten Ausgangssequenzen die Qualitätder DNA
entscheidend, welche beiFleischwaren maßgeblich von der
Hitze-behandlung des Produktes abhängt. Umden Temperatureinfluss
sichtbar machenzu können, wurden Untersuchungen mitHilfe der Real
Time PCR durchgeführt, dahier im Vergleich zur normalen PCR
dieBildung der PCR-Produkte online verfolgtwerden kann. Abb. 3
zeigt den typischenVerlauf ausgewählter Pferdefleisch-
standards. Bei optimaler Reaktions-Effizienz, das bedeutet alle
Templateswerden in jedem Zyklus verdoppelt,beträgt die ΔCt zweier
benachbarterStandards mit einem Konzentrationsunter-schied von
einer Zehnerpotenz theoretisch3,3 Zyklen (Abb. 3). Um zu zeigen,
welcheAuswirkungen die Hitzebehandlung derFleischerzeugnisse auf
die PCR hat,wurden Referenzproben in 5 Erhitzungs-stufen mit 1%igem
Pferdefleischzusatzund einem Pferdefleischstandard (roh,1 %)
untersucht (Abb. 7).
Abb. 7: Einfluss des Erhitzungs1 % Pferdefleischzusatz,
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
146 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
118 bp
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grades auf die PCR am Beispiel von Referenzbrühwürsten
mitErhitzungsbedingungen siehe Tab. 1
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Die Ergebnisse der PCR zeigen, dass biszu einem F-Wert von 3,4,
dies entsprichtdem Erhitzungsgrad einer Vollkonserve(Probe Nr. 4),
die Ct-Werte mit einem Un-terschied von etwa 2 Zyklen relativ
kon-stant bleiben und eine ähnliche Reaktions-Effizienz wie der
Standard (1:100)besitzen. Hieraus ergibt sich eine
Verfah-rensunsicherheit von bis zu 1 Zehnerpo-tenz bezogen auf den
1 % Standard (d. h.0,1 bis 10 %). Des Weiteren müssen
un-terschiedliche Nucleinsäuregehalte imFleischgewebe, Schwankungen
bei derExtraktion berücksichtigt und vergleich-bare
Reaktions-Effizienzen von Standardund Proben vorausgesetzt werden.
Be-rücksichtigt man für diese Unsicherheitennochmals eine
Zehnerpotenz, ergibt sicheine Gesamtverfahrensunsicherheit vonbis
zu zwei Zehnerpotenzen. Davonausgehend können derzeit
folgendeAnteile an Fleischzusätzen unterschiedenwerden:
1. Kontaminationen (< 0,05 %), die beider Herstellung von
Fleischerzeug-nissen unvermeidbar bzw. die bei
derProbenaufarbeitung entstanden sind(Abb. 6, Bahn 2 und 7)
2. Proben, deren Kontaminationen imBereich von etwa 0,1 - 1 %
(entsprichtdem 100 - 1.000fach verdünntenStandards) liegen
3. Proben, denen ein wertbestimmen-der Anteil (> 10 %)
zugesetzt wurde.
Zur Absicherung der Ergebnisse, insbe-sondere um wertbestimmende
Anteile vonKontaminationen zu unterscheiden, ist essinnvoll,
weitere Methoden wie die ELISA-Technik mit einer NWG um 1 %
einzuset-zen. Bei höheren Anteilen (> 5 %) könnendarüber hinaus
Methoden wie beispiels-weise die isoelektrische Fokussierung(IEF)
bzw. die denaturierende Elektropho-
rese (PAGE) wertvolle Hilfen bei der Iden-tifizierung
tierartspezifischer Proteine sein.
Schlussfolgerung
Eine quantitative Bestimmungsmethode,welche eine Aussage über
den Gehalt ei-ner Zutat im Produkt ermöglicht, ist derzeitbei der
festgestellten Verfahrensunsicher-heit weder für Pflanzenzusätze
noch fürtierische Zusätze in Fleischerzeugnissen,unabhängig von der
angewendeten PCRMethode, verfügbar. Hierfür müssen wei-tere
Faktoren, die eine reproduzierbareQuantifizierung beeinflussen,
ermittelt undbei der Bestimmung hinreichend berück-sichtigt werden.
Die in der Literatur be-schriebenen Systeme können in der
RegelAnteile einer Tierart nur relativ bestimmen,indem sie die
Kopienzahl eines nachge-wiesenen tierartspezifischen Gens in Be-zug
zur Kopienzahl eines geeigneten Re-ferenzgens setzen (WOLF et al.,
2001,PALISCH et al., 2003). Aussagen über denabsoluten Gehalt einer
Zutat (z. B. Rind-fleisch im Produkt) sind mit diesen Metho-den
nicht möglich. Zum jetzigen Zeitpunktmuss jedoch festgestellt
werden, dasseine relative Bestimmung die einzige Mög-lichkeit ist,
mit Hilfe der PCR Anteile vonFleisch- oder Pflanzenzusätzen zu
quanti-fizieren.
Danksagung
Diese Arbeit wurde finanziell unterstütztdurch das EU-Projekt
„MOLSPEC-ID“(Development of quantitative and qualita-tive molecular
biological methods to iden-tify plant and animal species in
foods).Projekt-Nr. QLK1-CT-2001-02373, Inter-netseite:
http://www.molspec.org
Literatur
Die Literatur kann bei den Verfassern angefordert werden.
http://www.molspec.org/
