HARTUNG ET AL. / !CAUL ET AL. ~r:"\________________________ ~H~--c'~e

Summary: Development of a pyrogen test based on rabbitbloodThe testing of drugs for pyrogen contamination e.g. theexclusion offever inducing impurities, was standardised in theForties in theform of animal pyrogen assay. We recentlypruposed an alternative method using human whole bloodfrom healthy donors. The substances to be tested are incubatedin the presence of blood and the generation of endogenouspyrogens (Interleukin 1, IL-l) are measured reflecting theprimary fever reaction in man. With this method it is possibleto detect the reaction of the relevant species. However,pronounced differences were reported for the potency ofseveral bacterial pyrogens in different species (e.g. up to factor10.000 for an individual endotoxin in different mammals). As apart of the validation of the new method discrepancies betweenthe whole blood system and the rabbit test might occur. Inthese cases it is not possible to distinguish between an in-vitro-artefact and species differences.Therefore, the goal of this project is the development of an in-vitro-test based on rabbit blood. For this purpose rabbit IL-1was expressed. At present chickens and mice are immunizedand possibly crossreacting anti-human-IL-1-antibodies aretested. In this way, an ELISA for the rabbit cytokin will beestablished. Using a temporarily commercially availablerabbit TNF-ELISA, the feasibility of the test-system could

already be shown: Pyrogens induced the generation ofTNF inrabbit blood. In the human model, tIll' endpoints IL-J and TNFwere very similar. The sensitivity of human blood and rabbitblood appeared to be very similar. However, individualpyrogens (only different endotoxins were tested up to now)showed considerable deviations. However, these results requirethe verification in the final test.The rabbit test in preparation will be implemented immediatelyinto the ongoing evaluations by the Paul-Ehrlich-Institute(BMBF) and at the University of Heidelberg (EuropeanPharmakopoea). Furthermore, such a test also represents aninteresting alternative in the veterinarian medical field usingthe correct target species for pyrogenicity testing.This project war supported by the Foundation Research 3R,CH-Muensingen.

Keywords: pyrogen test, rabbit whole blood, interleukin-I,target species

KorrespondenzadresseDr. Dr. Thomas HartungUniversitat KonstanzBiochemische PharmakologiePostfach 5560D-78434 Konstanz

Entwicklung YOnmolekularbiologischenAlternativmethoden fiir die Prfifung yonPoliomyelitis- ImpfstoffenArtur Kaul, Micha Nubling, Martina Kempfer, Ivo Schmidt und Johannes LowerPaul-Ehrlich-Institut, D-Langen

ZusammenfassungIn jeder neu produzierten Charge des Poliovirus-Lebendimpf-stoffes befinden sich neben attenuierten auch geringe Mengenan Wildtypviren. Impfstoffchargen, deren Wildtypvirusanteileinen bestimmten Grenzwert ubersteigt, sind mit dem Risikobehaftet, bisweilen bei Empfangern eine impfassoziiertePoliomyelitis auszulosen. Um uber moglichst sichere Poliole-bendimpfstoffe zu verfugen, wird jede neu produrierte Impf-stoffcharge im Tierversucli an Affen im Neurovirulenztestuberpruft. Aus friiheren Untersuchungen ist bekannt, dafJ forden attenuierten Charakter eines virusisolates hauptsiichliclieine bestimmte Punktmutation auf dem Poliogenom verant-wortlicb ist.Wir entwickelten eine quantitative PCR-(Polimerase ChainReaction) Methode, mit deren Hilfe der Wildtypanteil derPosition 472 des Polioserotyp 3 Genoms bestimmt werden kann.Damit stellt diese Methode bei der Priifung von monovalentenLebendimpfstoffen eine mogliche Alternative gegeniiber demNeurovirulenztest an Affen dar.

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Summary.Development of an alternative method to the monkeyneurovirulence test for oral poliovirus vaccinesEach oral poliovirus vaccine lot contains attenuated and smallamounts of wild type viruses. Vaccines containing more than acertain limit of wild type viruses may cause a vaccine associa-ted poliomyelitis. To provide safe vaccines for humans, eachnewly manufactured vaccine lot is tested in the monkeyneurovirulence test. A certain point mutation on the poliovirusgenome has been shown to be responsible for the attenuatedphenotype of the vaccine virus.We developed a quantitative PCR method to determine thewildtype proportion at position 472 of poliovirus type 3 genome.This method possibly can be used as an alternative for themonkey neurovirulence test.

Keywords: quantitative polymerase chain reaction, oralpoliovirus vaccine, monkey neurovirulence test, vaccineassociated poliomyelitis, point mutations

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1 Einleitung

Die Infektion mit dem humanpathogenenPoliovirus verlauft in den tiberwiegendenHillen inapparent. Selten kommt es jedochzu paralytischen Erscheinungen verschie-dener Schweregrade bis hin zur Poliomye-litis (Kinderlahmung).

In den spaten 50er Jahren dieses Jahr-hunderts gelang es Sabin, fiir die drei exi-stierenden Poliovirusserotypen aus Wild-typisolaten durch deren Passage in Affenbzw. auf Affenzellinien abgeschwachte(attenuierte) Impfstamme zu erhalten (Sa-bin and Boulger, 1973). Die so hergestell-ten Virusstamme dienen auch heute nochals Saatvirus bei der Produktion yon Le-bendimpfstoffen.

Da bei der Herstellung yon monovalen-ten Tmpfstoffen neben den abgeschwach-ten Viren auch Wildtypen entstehen, de-fen Menge oft nicht beeinfluBbar ist, wirdderzeit jede neu produzierte Impfstoffchar-ge im sogenannten Neurovirulenztest imTierversuch an Affen (z.B. Makakken)uberpruft. Dabei verursachen Wildtypvi-ren bei Affen schon in geringen MengenLahmungen durch Zerstorung yon Ner-venzellen. Attenuierte Stamme rufen hin-gegen keine histologischen Veranderun-gen hervor.

Die Uberprufung neu produzierter Impf-stoffchargen wird fiir die Polioserotypen1 und 2 an mindestens 22 und fur den Typ3 an mindestens 38 Tieren getestet (WorldHealth Organization, 1990). Zwei bis dreiWochen nach der intraspinalen Impfstoff-verabreichung werden die Tiere euthana-siertundRtickenmark- bzw. Gehimschnit-te aus unterschiedlichen Regionen auf dasAusmaB yon Neuronenzerstorung unter-sucht (World Health Organization, 1990).Im Parallelansatz werden Affen einer Ver-gleichsgruppe mit unbedenklichem Impf-stoff behandelt. Die in den Impfstoffenenthaltenen attenuierten Virusstamme un-terscheiden sich gegenliber den Wildtypi-solaten durch eine Anzahl yon Punktmu-tationen, die tiber das gesamte Virus genomverstreut sind (Abb. 1). Eine entscheiden-de Rolle fur den attenuierten Charakteraller drei Sabinserotypen kommt einerPunktmutation in der Domane V der5'NTR (5' Nicht Translatierte Region) zu.Beim Serotyp Sabin 3 befindet sich diesePunktmutation an der Position 472 desGenoms und fi.ihrt zum Nukleotidaus-tausch Zytosin zu Uracil (Svitkin et al.,

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WILDTYPSER LYS THRI I I

II ! I n 1ATIENUIERTESVIRUS

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Abbildung 1: Unterschiede in der Nukleinsiiurensequenz zwischen Wildtyp (oberer Teilder Abbildung) und dem attenuierten Virus (unterer Teil der Abbildung) des Poliosero-typs 3.An drei Stellen unterscheiden sich die beiden VirussUimme zusatzllch in ihrer Amino-sauren-sequenz, Die unteschiedlichen Arnlnosauren sind fiber den entsprechendenNukleotiden dargestellt.

1990; Westrop et al., 1989). AnalogePunktmutationen sind bei den Serotypen1 am Nukleotid 480 und beim Serotyp 2an Position 481 zu finden (Christodoulouet aI., 1990; Kawamura et al., 1989; Mooset al., 1989).

Es besteht beim Serotyp 3 eine signifi-kante Korrelation zwischen dem Virusan-teil mit dem Wildtypnukleotid Zytosin anPosition 472 und den Ergebnissen desNeurovirulenztests. So bestehen Impf-stoffchargen mit einem Wildtypanteil uber1% den Neurovirulenztest nicht (Chuma-kov et al., 1991).

Das Ziel unserer Untersuchungen ist dieEtablierung der Taq Man PCR zum quan-titativen Nachweis yon "Uracil zu Zyto-sin"-Revertanten an der Nukleotidpositi-on 472 des Polioserotyp 3-Genoms. DieMethode kann dabei zum .Vorscreenen"yon monovalenten Impfstoffpraparationendes Serotyps 3 verwendet werden, so daBzumindest Praparationen mit einem zuhohen Wildtypanteil nicht mehr im tier-belastenden Neurovirulenztest eingesetztwerden.

2 Material und Methoden

2.1 Allgemeines Prinzip der Taq ManpeRDas Grundprinzip der Taq Man PCR istzunachst das gleiche wie bei der her-kommlichen PCR; zusatzlich zu den Pri-mem wird hier jedoch eine fluorogene Oli-gonukleotid-Sonde eingesetzt, die inner-halb des Amplifikates bindet. Die Sondeist am 5'-Ende mit dem Reporter-Farb-stoff 6-Carboxy-Fluorescein (FAM) undam 3'-Ende mit dem Quencher-Farbstoff

6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAM-RA) markiert.

Wird nun der Reporter-Farbstoff mit derLichtwellenlange yon 488 nm angeregt,so wird seine Fluoreszenz aufgrund derraumlichen Nahe zum Quencher (dieErnissionswellenlange des Quencher liegtbei 582 nm) durch einen Fluoreszenz-En-ergietransfer unterdriickt (Forster, 1948).Hybridisiert die Sonde dagegen wahrenddes Primer-Sonden-Annealings der PCRmit dem DNA-Template-Strang, so wirdsie bei der DNA-Synthese aufgrund derY-3 '-Exonuklease-Aktivitat derTaq DNAPolymerase zunachst yon der DNA-Ma-trize entfemt und anschlieBend gespalten.Dadurch wird die raumliche Nahe zwi-schen Reporter und Quencher aufgehobenund damit auch der Fluoreszenz-Energie-transfer. Durch den Wegfall des Fluores-zenz- Energietransfers bildet der Reportereine Eigenemission bei 518 nm aus. Ent-sprechend der Syntheserate des PCR-Pro-dukts steigt die Fluoreszenz des Repor-ters mitjedemPCR-Zyklus, die vomABIPRISM ™ 7700 (Applied Biosystems) er-fasst wird. Damit kann die Amplifikat-menge im Verlauf der PCR exakt be-stimmt werden.

2.2 Primer- und Sondenwahl fiir denquantitativen WildtypnachweisBeim quantitativen Nachweis yon Wildtyp-anteilen in Polio-Lebendimpfstoffen desSerotyps 3 mit Hilfe der Taq Man PCRwurden die Sonde und der sense Primer sogewahlt, daB diese sowohl zu attenuiertenals auch zu Wildtypvirus-Sequenzen einelOO%-ige Komplimentaritat zeigen. Wei-terhin wurde ein antisense Primer synthe-

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tisiert, dessen direktes 3' -Ende mit der Po-sition 472 des Polio-Genorns abschloB. Die- .ser antisense Primer hatte zum Wildtypge-nom eine 100%-ige Komplimentaritat undbildete mit Sequenzen des attenuierten Vi-rus eine Fehlpaarung (Mismatch) mit der3'-Base. Ein weiterer antisense Primer kannnicht zwischen den Virussequenzen diskri-minieren und wird zur Bestimmung derPolio-RNA Menge verwendet.

2.3 StandardsZwei Serotyp 3 Vollangenklone mit derWildtyp- bzw. der attenuierten Sequenzdienten zur Herstellung yon Standardpro-ben. Die verwendeten Standards enthiel-ten 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 und 1,4%Genomanteile mit der Wildtypsequenz.

2.4 Versuchsdurchfiihrung undAuswertungSowohl die Standardproben als auch diezu testenden Impfstoffproben wurden ingetrennten Ansatzen mit Hilfe beiderantisense Primer amplifiziert. Anschlie-Bend wurde fur jede Probe der DCt-Wert gebildet. Der DCt- Wert ist dieDifferenz aus den Threshold Cycels (Ct)yon Amplifikationen einer Probe mitdem einen oder dem anderen antisensePrimer. Der Ct- Wert ist jener PCR-Zy-klus, bei dem die Reporter-Fluoreszenzeinen bestimmten Schwellenwert er-reicht. Uber die graphische Darstellungder DCt- Werre gegeniiber den Wildtyp-anteilen der Standards konnte fiir dieseProben ein Regressionsverlauf erstelltwerden, Der Wildtypanteil unbekannterProben konnte aus der Formel der Re-gressionskurve ermittelt werden,

2.5 Verwendete Materialien undProben0,45 ml der Proben wurden in Anwesen-heit yon 0,05 ml 10% SDS mit 0,5 mlPhenol extrahiert und uber Nacht bei -200

C mit dem doppelten Volumen Isopro-panol gefallt, davon wurden 0,3 ml mit70% Ethanol gewaschen. Das Virus-RNA-Pellet wurde mittels MuLV-RT und Ran-dompriming revers transkribiert (AppliedBiosystems).

Die cDNAs aus der reversen Transkrip-tion und die Standardproben wurden mitdem Taq Man PCR Core Reagent Kits ™(Applied Biosystems) im Taq Man PCRAssay nach Angaben des Herstellers ein-gesetzt.

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3 Ergebnisse

Anhand von Standardproben, die verschie-dene Mischungsverhaltnisse zwischenWildtyp- und attenuierten Virussequenzendarstellten, konnten wir den Wildtypanteildiverser Proben mit der Taq Man PCRbestimmen, Der Wildtypanteil eines Teilsder Proben wurde bereits fruher imMAPREC-Ringversuch auf 1,12; 0,67 und0,4% bestimmt. Die Wildtypanteile die-ser in einer unabhangigen Methode bereitscharakterisierten Proben konnten mit derTaq Man PCR Methode bestatigt werden.

4 Diskussion

Aus den ersten Untersuchungsergebnissenmit der Taq Man PCR zeichnet sich ab,daB Proben mit einem Wiltypanteil zwi-schen 0,2 und 1,4% (untersuchter Bereich)gut quantifiziert werden konnen,

In noch ausstehenden Versuchen soil dieReproduzierbarkeit dieser Methode an ei-ner groberen Zahl yon Impfstoffchargendes Serotyps 3 iiberpruft werden. DerWildtypanteil dieser Proben ist bereitsbzw. wird noch mit der yon Chumakov etal., 1991 beschriebenen MAPREC Metho-de bestimmt.

Zudem sollen in weiteren Versuchen dieInter- und Intra-Assayvariabilitat der TaqMan PCR Methode bestimmt werden.

N ach der Etablierung der Taq Man PCRfur die monovalenten Impfstoffchargendes Serotyps 3 kann diese Methode prin-zipiell auch auf die Typen 1 und 2 uber-tragen werden. Dabei sollen beim Sero-typ 1 neben den Revertanten an der Posi-tion 480 auch die des Nukleotids 525 mitberiicksichtigt werden, da sie am neuro-virulenten Verhalten eines Virusisolatsmitbeteiligt sind (Christodoulou et al.,1990; Li et al., 1996).Die Taq Man PCR Methode ist zum

Voruntersuchen yon neu produziertenmonovalenten Impfstoffchargen gut geeig-net. Bei der Durchfuhrung dieses mole-kularbiologischen Ansatzes konnen Impf-stoffchargen mit einem deutlich erhohtenWildtypanteil (uber 1%) yon vornhereindem Neurovirulenztest entzogen werden.Impfstoffchargen, die in der quantitativenTaq Man PCR unauffallig sind, musstenjedoch weiterhin den Tierversuch durch-laufen, urn das mogliche Restrisiko einerimpfassoziierten Poliomyelitis beim Men-schen weiter zu minimieren.

Literatur

Christodoulou, C, Colbere-Garapin, F.,Maca-dam, A., Taffs, L F,Marsden, S., Minor, P.and Horaud, F (1990). Mapping of mutati-ons associated with neurovirulence in mon-keys infected with Sabin Ipoliovirus rever-tants selected at high temperature. 1. Viral.64,4922-4929.

Chumakov, K. M., Powers, L B.,Noonan, K.E., Roninson, 1. B. and Levenbook, 1. S.(1991). Correlation between amount of vi-rus with altered nucleotide sequence and themonkey test for acceptability of oral polio-virus vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 199-203.

Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Ener-giewanderung und Fluoreszenz, Annalen derPhysik 2,55-75.

Li, J., Zhang, L. B., Yoneyama, T., Yoshida,R., Shimizu, H.,Yoshii, K., Rara, M., Nomu-ra, T., Yoshikura, R., Miyamura, T. and Ha-giwara, A. (1996). Genetic basis of the neu-rovirulence of type I polioviruses isolatedfrom vaccine-associated paralytic patients.Arch. Virol. 141, 1047-1054.

Kawamura, N., Kohara, M., Abe, S., Komatsu,T., Tago, K., Arita, M. and Nomoto, A.(1989). Determinants in the 5' noncodingregion of poliovirus Sabin 1RNA that influ-ence the attenuation phenotype. 1. Yirol. 63,1302-1309.

Moos, E. G., O'Neill, R E. and Racaniello, V.R. (1989). Mapping of attenuating sequencesof an avirulent poliovirus type 2 strain. 1.ViraL 63, 1884-1890.

Sabin, A. B. and Boulger, L. R (1973). Histo-ry of Sabin attenuated poliovirus oral livevaccine strains. 1. BioL Stand. I, 115-118.

Svitkin, Y V., Cammack, N., Minor, P. D. andAlmond, J. W. (1990). Translation deficien-cy of the Sabin type 3 poliovirus genome:Association with an attenuating mutationC472 U. Virology 175,103-109.

Westrop, G. D., Wareham, K. A., Evans, D. M.A., Dunn, G., Minor, P. D., Magrath, D. 1.,Taffs, E, Marsden, S., Skinner, M. A., Schild,G. C. and Almond, J. W. (1989). Geneticbasis of attenuation of the Sabin type 3 oralpoliovirus vaccine. 1. Viral. 63, 1338-1344.

World Health Organization. (1990). Require-ments for poliomyelitis vaccine (oral). WHOTech. Rep. Ser. 800, 30-65.

KorrespondenzadresseDipl.-Biol. Artur KaulPaul- Ehrlich- Institut,Abteilung VirologiePaul-Ehrlich-Str.51-59D-63225 LangenTel.: +49-6103-773300Fax: +49-6103-77123E-mail: Kaul@em.uni-frankfurt.de

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