Enzimoloģija/Metabolisms

Lekcijas saturs:Ksenobiotiķu metabolismsLiteratūra: 1. Pharmagenomics handbook. Ed.L.M.Cavallari et al.,, Lexicomp, 2005 2. Fundamental toxicology. Ed. J.H.Duffus, RSC Publishing,2006

Molekulāras bioloģijas (bioķīmijas)katedra 2009/2010. akad.gads

Ksenobiotiķi ir ķīmiskas vielas , ko atrod organismā, bet kuras tur neveidojas

Tie var būt arī substances, kuras organismā ir daudz augstākā koncentrācijā, nekā parasti.

Piemēram: medikamenti tādi kā antibiotikas ir cilvēkam ksenobiotiķi, jo tos cilvēka organisms nesintezē un tiem nevajadzētu būt normālā dietā.

Ksenobiotiķi var būt normāli metabolīti vienam organismam, bet sveši citam (piemēram hormoni).

Ksenobiotiķiem var pieskaitīt arī transplantētu orgānu dažādu sugu robežās.

Ksenobiotiķi ir vides piesārņotāji – tādi kā dioksīni, polihlordifenīli, smagie metāli.

2,3,7,8 –tetrachlor dibenzo-p- dioksīns

tiomersāls

Ksenobiotiķu (farmakokinētikā) liktenī organismā izšķir četras stadijas:

1. Absorbcija

2. Izplatīšanās un izvietošanās organismā

3. Metabolisms

4. Ekskrēcija

1. Absorbcijas veidi

Caurlaidība atkarīga no savienojuma polaritātes , pH diferences

a) Parastā difūzija – Fika (1855) likums: A (virsmas platība, caur kuru notiek transports) x (c1-c2) difūzijas ātrums= D (membrānas biezums) Parasti difundē nejonizētas, lipīdos šķīstošas vielasb) FiltrācijaNelielas hidrofīlas molekulas – urea, ūdensc) Pinocitoze , receptora atkarīgā endocitozeLielas molekulasd) Aktīvais transports

Pinocitoze Receptora atkarīgā endocitoze

Primārais aktīvais transports Sekundārais aktīvais transports izmantoprasa ATF jonu gradientu

2. Izplatīšanās un izvietošanās organismā

Audu barjeras: āda un gremošanas trakta gļotādas elpošanas ceļi hematoencefaliskā placentas

Bioloģiskās membrānas sedz visas šūnas un šūnu iekšpusē norobežo subšūnu struktūras

Membrānu lipīdu sastāvs ievērojami atšķiras

Membrānu kopīgās īpašības1.Membrānas ir planāras struktūras, tikai dažu molekulu biezas, tās veido slēgtu robežu starp dažādiem starpšūnu un iekššūnu kompartmentiem. Lielākā daļa membrānu ir 60-100 Å biezas.2. Membrānas pārsvarā sastāv no lipīdiem un proteīniem. Proteīnu/lipīdu svara attiecības vairumā bioloģisko membrānu ir robežās no 1:1 līdz 1:4. Membrānas satur arī ogļhidrātus , kas saistīti ar lipīdiem un proteīniem.3. Membrānu lipīdi ir samērā mazas molekulas, kurām izšķir hidrofobo un hidrofīlo daļu. Ūdens šķīdumā lipīdi spontāni veido noslēgtas bimolekulāras struktūras. Lipīdu dubultslānis ir barjera polāru savienojumu molekulu plūsmai.4. Specifiski proteīni nodrošina dažādu membrānu atšķirīgās funkcijas. Membrānu proteīni kalpo kā sūknis , kanāls, receptori, enerģijas pārnesēji un enzīmi. Membrānu proteīni ir integrēti lipīdu dubultslānī , kurš nodrošina attiecīgo mikrovidi proteīna funkcijām.5. Membrānas ir nekovalenti agregāti. Membrānu pastāvīgie proteīni un lipīdu molekulas tiek kopā saturētas ar kooperatīvām nekovalentām mijiedarbībām.6. Membrānas ir asimetriskas. Membrānu abas puses ir atšķirīgas.7. Membrānas ir kustīgas struktūras. Lipīdu molekulas , kā arī proteīni ātri difundē membrānas plāksnē. Turpretī šīs molekulas nevar rotēt šķērsām cauri membrānai. Membrānas tādejādi ir orientēts divdimensionāls proteīnu un lipīdu šķidrums.

Ksenobiotiķu metabolismā izšķir 3 stadijas: 1. Funkcionalizēšanas reakcijas. Šai stadijā uz ksenobiotiķa virsmas izveido funkcionālas grupas, savienojumu sagatavojot tālākām pārveidošanām, lai nodrošinātu ekskrēciju. Parasti šai stadijā zūd farmakoloģiskā aktivitāte. Tomēr var būt arī otrādi, kad no pro-medikamenta veidojas tā darbīgā forma. Mehānisms pārveidošanai ir oksidācija, reducēšana, hidrolīze.

2. Konjugācijas reakcijas, kuru galvenā jēga ir paaugstināt savienojuma šķīdību, lai to vieglāk ar urīnu vai žulti izdalītu. Šķīdību paaugstina, konjugējot savienojumu ar izteikti polāriem savienojumiem – glikuronskābi, glutationu, sulfātu, koenzīmu A, acetātu. Mehānisms pārveidošanai ir konjugācija

Tātad, ksenobiotiķu biotransformācijā novēro četras reakciju grupas. Tās visas ir enzimātiskas.

3.Tālākā modifikācija un ekskrēcija

3. Metabolisms

Ksenobiotiķu metabolismā nodala divas (trīs) fāzes

G.R.Wilkinson, NEJM,352,2211,2005

First-Pass Metabolism after Oral Administration of a Drug, as Exemplified by Felodipine and Its Interaction with Grapefruit Juice.CYP3A enzymes (e.g., CYP3A4) present in enterocytes of the intestinal epithelium extensively metabolize felodipine during its absorption,and on average only 30 percent of the administered dose enters the portal vein (solid line). Subsequently, CYP3A enzymes in the liver furthermetabolize the drug so that only 15 percent of the dose is bioavailable and finally reaches the systemic circulation and is able to exert its effects.Grapefruit juice selectively inhibits CYP3A in the enterocyte, with the net result being an increase in the oral bioavailability of felodipine by a factor of three, denoted by the asterisks and the dashed lines.

Metabolismuvar ietekmētdažādi faktorit.sk. uzturs – vai medikamentsvispār tieklīdz farmakoloģiskās darbības veikšanai

Felodipīns ir kalcijakanālu blokators un to lieto pie sirdsslimībām

Medikamentu biopieejamība svārstās plašās robežās

Uztura ietekmē ievērojami var mainīties medikamenta farmakodinamiskie rādītāji

Mechanism of Induction of CYP3A4-Mediated Metabolism of Drug Substrates (Panel A) and the Resulting Reduced Plasma Drug Concentration.In Panel A, an inducing agent (DrugI) interacts with the nuclear receptor PXR (pregnane X receptor), which forms a heterodimer with the retinoid X receptor (RXR), which in turn binds to cognate recognition sites in the 5‘ regulatory region of the CYP3A4 gene. As a result, transcription of DNA is up-regulated, leading to increased synthesis of CYP3A4 enzyme and enhanced oxidative metabolism of its substrates (Drug S).

Medikamenta metabolisma izmaiņas tiek regulētas transkripcijas līmenī

This causes a reduction in the plasma drug concentration as exemplified by felodipine (Panel B) and, subsequently, decreased drug effects. The same molecular mechanism is also responsible for the induction of other metabolizing enzymes and membrane transporters important in drug disposition. Comparison of the plasma felodipine concentration– time profiles in Panel B with those in Figure2A indicates the wide range of CYP3A activity that is possible.

Biotranformācijas I fāzesenzīmi ir oksidoreduktāzesun hidrolāzes

Lipofīlām un hidrofīlām vielām metabolisms ir dažāds

Hidrofobās ( lipofīlās)vielas ekskretējas sliktāk,līdz biotransformācijas rezultātāto hidrofilitāte pieaug(R.Weinshilboum, NEJM, 348,529,2003)

Oksidācija:1. Citochroma P450 monooksigenāzes sistēma

2. Flavīnu saturošā monooksigenāzes sistēma

3. Alkohol dehidrogenāzes un aldehīd dehidrogrenāzes

4. Monoamīnoksidāzes

5. Peroksidāzes

Reducēšana:

1. NADPH2 – citochroma P450 reduktāze

2. Reducētā Fe citochroma P 450 reduktāze

Oksidācija

Citohromi P450 un to nozīme

“Klasiskā”homogenizācijasun diferenciālāscentrifugēšanas shēma

KF.1.14.14. Oksidoreduktāžu apakšapakšklase, kuraoksidē substrātu vienu skābekļa atomu reducējot arflavīnu, bet otru ieslēdz oksidēta substrātā

Svarīgākais pārstāvis: KF.1.14.14.1 - nespecifiskā monooksigenāzesinonīmi: mikrosomālā monooksigenāze, mikrosomu P-450, ksenobiotiķu monooksigenāze, ar flavoproteīnu saistītā monooksigenāzeUzbūve: īstenībā grupa hēma-tiolātu proteīnu (P-450) grupa

Citohromi P450 - monooksigenāzes

1. Cilvēka organismā ~150 izoenzīmu formu, kuras dala >14 dzimtās , pie dzimtas pieskaitot proteīnus ar >40% homoloģiju. Dzimtas apzīmē:CYP 1, CYP 2 u.tt.

Dzimtas dala apakšdzimtās ar homoloģiju >53% un apzīmē , piemēram:CYP1A u.tt.

Apakšdzimtās ir noteikti pārstāvji, piemēram;CYP2E1 – šā enzīma biosintēzi inducē etanols CYP2C9 - šā enzīma biosintēzi inducē fenobarbitāls (miega līdzeklis)

2. CYP ir hemoproteīni

3. Dažādās dzīvnieku sugās plaši izplatīti

4. Sintezējas uz endoplazmatiskā tīkla membrānām un aknu mikrosomu frakcijā no visiem proteīniem 20% ir dažādi CYP

5. Daudzi no CYP ir inducējami, vismaz 6 izoformas aknās

6. To darbībā piedalās NADPH2 , iespējams arī citi citohromi , piemēram, cit b5

7. CYP spēj katalizēt apmēram 60 dažādu oksidācijas reakciju tipus

Iespējamā mikrosomalās oksidācijas sistēmas darbība

O2 H2 O Substrāts-CH3 Substrāts CH2– OH

Otrs H2 donors oksidēts donors RCH3

NADPH2 FP Fe2+ CitP450 RCH2OH oksidēts H2O Nehemīna dzelzs

Adrenodoksīns NAD FPH2 Fe3+ Cit P450 reducēts 2e-1 O2

2H+

Citohromi P450 ir dažādi un dažādas ir to atsevišķo pārstāvju funkcijas

Dažādiem Citochromu P450 sistēmas pārstāvjiem ir atšķirīgi substrāti un inhibitori

Eimsa (Ames) tests savienojumu mutagenitātes novērtēšanai. Pievienotais aknu ekstrakts satur mikrosomālo oksidācijas sistēmu, kuras galvenais komponents ir citohroms P450.

Nemikrosomalā oksidēšanās

1. Monoaminooksidāzes, satur FAD (KF 1.4.3.4)

2. Alkohol un aldehīd dehidrogenāzes

Reducēšanās

Reducēšanās potenciālu (NADPH2) nodrošina glikozes-6-fosfāta- dehidrogenāze.Tās ģenētiskas nepietiekamības dēļ dažu ksenobiotiķu lietošana izraisa smagas hemolītiskas anēmijas (pat sulfonamīdi un nitrofurāni). Rēķina, ka pasaulē tādu cilvēku varētu būt ap 400.000.000

Reducētais NADPH2 un glutations nodrošina eritrocītu aizsardzību pret oksidatīvo stresu

Dabīgie organisma antioksidanti

Hidrolīze

Hidrolīze:1. Ēsteru hidrolīze

2. Amīdu hidrolīze

3. Epoksīdu hidrolīze (KF 3.3.2.3)

Biotranformācijas II fāze

Tur svarīgākie enzīmi ir transferāzes

Biotranformācijas II fāzesenzīmi ir transferāzes

Bilirubīns var konjugēties arī ar sulfātu, glikozi,ksilozi

The following is a list of human glutathione S-transferases:

ClassMembers

alpha GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4,

kappa GSTK1

mu GSTM1, , GSTM2, GSTM3, GSTM4,

omega GSTO1, GSTO2

pi GSTP1

theta GSTT1, GSTT2

microsomal MGST1, MGST2, MGST3

Glutations- γ- glutamīl-cisteinīl- glicīns. Ar glutationu konjugē elektrofīlus ksenobiotiķus: piemēram: 1,2,dichlor-4-nitrobenzoluEnzīms: KF 2.5.1.18 glutation-S-transferāze

Paracetamola- N-(4-oksifenīl)etānamīda) metabolisms (nesteroīda pret iekaisuma medikaments NSAID)

50%

30%

20%

Aktīvā sulfāta veidošanās.To izlieto:1.Glikozaminoglikānu sintēzei – heparīns, hondroitīnsulfāts2.Ceramīdsaturošo lipīdu – sulfatīdu sintēzei3.Konjugācijai

S- adenozīlmetionīna veidošanās – aktīvais metionīns

To izlieto pārmetilēšanās procesos, piemēram:1.Kreatīns2.Holīns3.Adrenalīns4.Daudz citu savienojumu, piemēram: Melatonīns,anserīns, ergosterīns, metīlkobalamīns,metīlhistamīns, trigonellīns, metanefrīns (adrenalīna inaktivēšana),trimetīllizīns (karnitīns), DNS un proteīnu metilēšana

N

Pharmacogenetics of Thiopurine S-Methyltransferase (TPMT) (PanelA) and the TPMTGene (Panel B).

Panel A shows the level of TPMT activity in red cells among 298 randomly selected white adult blood donors. Presumed genotypes for the TPMT genetic polymorphism are also shown. TPMT L and TPMT H are alleles that result clinically in low levels and high levels of activity, respectively. These allele designations were used before the molecular basis for the polymorphism was understood.Panel B shows the human TPMTgene.TPMT*1is the most common allele, andTPMT*3A is the most common variant allele among white subjects.TheTPMT*3A allele is primarily responsible for the trimodal frequency distribution shown in Panel A. The two single-nucleotide polymorphisms inTPMT*3A, which are in strong linkage disequilibrium, as well as the resultant changes in encoded amino acids, are indicated.

Tiopurīnu transformē metilējot

Izoniazīds transformējas acetilējoties

Ksenobiotiķus metabolizējošie enzīmi bieži ir inducējami

Ogļūdeņražureceptors

Androstānareceptors

Farnezoīdureceptors

Hepatocītukodolfaktors

Aknureceptors

Peroksisomuproliferatoraaktivētājreceptors

Pregnānareceptors

RetinoīduReceptors

Kalciferolureceptors

Ksenobiotiķu izomērimetabolizējas ardažādu ātrumu

Ksenobiotiķu metabolisma ģenētiskais polimorfisms

Smēķētājiem ar aktīvu CYP2D6sistēmu plaušu vēzi sastop biežāk

Debrizokvins ir tetrahidroizohinolīna atvasinājums,ko lieto hipertensijas ārstēšanai

Ģenētiskie varianti aprakstīti daudzos biotransformācijas enzīmu gēnos

Bez enzīmu polimorfismafarmakoloģisko efektu var modulētmedikamenta receptorapolimorfisms

(W.E.Evans,H.L.McLeod,NEJM,348,538,2003)

Kateholamīnu veidošanās un noārdīšanās ir labs piemērs ksenobiotiķu metabolismam, kurā ir gan oksidācijas , gan konjugācijas reakcijas, gan biotransformētie savienojumi, kuru koncentrācijas var noteikt

Kateholamīni noārdotiesdod vanilīn mandeļskābi,vanilīnskābi, oksi-metoksifenīlglikolu , adrenohromu,oksoadrenohromu

4. Ekskrēcija caur: a) nierēm b) aknām c) siekalām d) izelpojot e) sviedriem

Farmakokinētiskie pētījumi

Vienkāršs metaboliskais būris:1. Gaiss (1/5 skābeklis, 4/5 slāpeklis)

Metabolisma būris pelēm vai žurkām

Kāda ir preparāta farmakokinētika (cik tas ilgi darbojas) un kā tas tiek noārdīts