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Priv.-Doz. Dr. reed. Jor~A~N~S S C m J ~ T Prof. Dr. med. t tE~VT M ~ N II. Medizinisehe Klinik und Poliklinik der Johann-Wolfgang- Goethe-Universitgt 6 Frankfurt a.M. 70, Ludwig-Retm-StrM~e 14

Enzymatische Galaktosebestimmung im Blut und oraler Galaktose-Toleranztest* * *

K. R o ~ E L , E. BE~NT, F. SC~MITZ und K. GI~I~CIMEL

Sektion fiir Klinische Laboratoriumsdiagnostik nnd Abteflung fiir Innere Medizin, Psychosomatik und Psychotherapie (Prof. Dr. Tm voh" U~XK/Yn~)

des Zentrums fiir Innere Medizin der Universit~t Ulm (Medizinisch-Naturwissenschaftliche ttochschule) und Forschungszentrum Biochemiea, C. F. Boehringer & SShne GmbH h~nnheim, Werk Tutzing

Bis heute sind fiber 200 verschiedene Leberfunk- t ionsproben bekanntgeworden. Dieses umfangreiche Leber tes t -Spekt rum l~Bt abet erkennen, dug die ideale Leberfunktionsprobe, die eine ausreichende Spezifit/~t mit genfigender Empfindl ichkei t bei allen LeberscM- den verbindet, n icht existiert. Bei der VMseit igkeit des Leberstoffwechsels und bei der groBen Funkt ions- reserve der Leber ist dies wohl aueh nicht zu erwarten, so dal3 man immer auf mehrere Lebertests angewiesen sein ~ r d , u m die Leberfunkt ion ausreichend beurteflen zu kSnnen. Alle Leberfunkt ionsproben haben gemein- sam, dab sic einmal eingesetzt werden als Suehreakt ion nach la tenten t lepa topath ien , zum zweiten ats Ver- laufskontrolle und zum dr i t ten zur Differentialdiagnose des Ikterus . Dabei ist die Galaktosebelastung geeignet ffir die Verlaufskontrolle bei akuter und chronischer Hepat i t is und Lebercirrhose, als empfindliche Such- reakt ionen bei la tenten LeberscMden und allgemein zur Bes t immung des Schweregrades eines Leberschadens.

Die Galaktosebelastung wurde yon BAII~I~ (1906) als Leberfunkt ionsprobe beschrieben. Nach Verabfol- gung yon 40 g Galaktose per os ber ing die ausgeschie- dene Menge Galaktose im Urin beim Gesunden nicht mehr als I g nach 4 Std, Pa t ien ten mi t Lebercirrhose schieden fiber 4 g aus. Diese klflfischen Beobachtungen wurden yon R~Iss und J ~ I ~ (1912) t ierexperimen- tell (Unterbindung des Ductus eholedoehus beim I Iund) best/itigt. R o v s I ~ S C ~ X (1912) erzeugte im glei- chert J a h r erstmals t ierexperimentell eine alimenti~re Galaktosurie dureh Vergiftung yon Kaninchen mit Phosphor . W o ~ l ~ I ~ (1913) zeigte durch intraportale

* Mit Unterstiitzung der Deutsehen Forschungsgemein- schaft.

** tIerrn Prof. Tm vo~ U~XXOLL zum 60. Geburtstag ge- widmet.

Galaktoseinjektion vor und naeh der experimentellcn Phosphorvergif tung, dab diese Galaktosurie nicht du tch cine ver/inderte I~esorption, sondern dureh die Sch/~digung des Lcberparenehyms bedingt ist. Zahl. reiehe Modifikationen der Galaktosebelastung, vor allem dutch Berfieksichtigung der Konzent ra t ion der Galaktose ira Urin und dureh einen zus/~tzliehen Was- serstog POLLAKs (I932), wurden im Laufe der Jahre ver- sueht. L w ) w m (1942) faBte alle diese Verbesserungs- vorsehl/ige zu seiner ,,~{odifizierten GMaktoseprobe" zusammen, bei der weniger die ausgeschiedene Galak- tosemenge Ms die Galaktosekonzentrat ion im Urin und die Ausseheidungsdauer bes t immt wurden.

1922 bzw. 1925 versuchtcn erstmals KA~Lv~I~ u. MACl~OL~ (1922) sowie KXHLER (1925) die Blutzueker- kurve naeh oraler Galaktosebelastung zur Diagnostik heranzuziehcn. Von v. U~XK~LL (1939) wurde gezeigt, dab die Blutzuckerkurve tats/~ehlieh zuverl/issiger ist als die GMaktosebest immung im t Ia rn .

Die hierbei gebr/iuehlichen Methoden zur Bestim- mung yon GMaktose waren rein ehemischer Natur . So konnte Galaktose nach der yon Bt~CKlgEI~ (1941, 1942) vorgeschlagenen Orcin-Methode bzw. verschiedenen Modifikationen, davon FISgg~, HANSEX und NOETO~ (1955), S~nTI~ und T ~ o ~ s (1962), bestimm~ werden. Die meisten Mcthoden beruhten jedoch auf einer Be- s t immung der reduzierenden Substanzen nach voran- gegangener ZerstSrung der Glucose entweder durch Verg/~rung mi t normaler B//ckerhefe BAKx (1946), CO~L:S¥ (1927), HAm)n~o und G~ANT (1932/33), RAY- ~O~D und BLANCO (1928), RobINSOn- und RAT~IBV~" (1957), STs, NSTAM (1946) oder du tch Oxyda t ion mi t Glucoseoxydase [SoNDE%GAAI~D (1958), T~GSTRUP, }VINKLEPo, LU:ND und E~O]~LL (1954), ~VATsON (1963), RAY~CIOND und BLA~¢CO (1928)].

~16. Jg., Heft 17, 1968 K. t~O~EL et aI.: Enzymatische Glaktosebes~immung im Blur und oraler GMaktose-Toleranztest 937

Galaktose wnrde hierbei n ieh t angegriffen u n d konnte nach der Methode von HAGEDO~N-JENSEN oder NELSON-So~oG¥I yon RoBr~so~ u n d I~AT~BV~N (1957), TYGSTaUP et al. (195~) bes t immt werden. Ferner bes tand die M6gliehkeit der Anwendung der Anthron- (S~NI)EI~GAAI~D, 1958) bzw. o-Toluidin-Methode (W~T- so~, 1963) zur Erfassung der zurf iekbleibenden Galak- rose.

Si~mtlichen bisher beschriebenen IVieghoden, GMak- rose in K6rperflfissigkeiten zu bes~immen, haf te t je- doeh mangelnde Spezifitgt, Ungenauigke i t u n d mei- stens zu geringe Empfindl iehkei t sowie grol3er Arbeits- aufwand an.

Nachdem DOUDO~OFF, CONTOPOU5OU u n d B u ~ s s (1957) sowie WALL~NFEnS und Kul~Z (1961) u n d Wa~- LE~FELS u n d MALHOTtCA (1961) Angaben fiber Isotie- rung u n d Spezifitgt des E n z y m s Galaktose-Dehydro- genase sowie praktische Durehf i ihrung der Bestim- m u n g ffir verschiedene analyt isehe Probleme maehten , sollte die Brauehbarkeig der Meghode ffir die klinisehe Chemie iiberprfift u n d ein neuer oraler Galaktosetole- ranztesg engwiekelt werden.

Analytische Untersuchungen Prinzip der Reaktion. Galaktose ~4rd in der (lurch das

Enzym Galaktose-Dehydrogenase katMysierten Reaktion dureh NAD i zu Galaktono-Lacton oxydiert.

Ga.lal~tose + NAD + -----> Galaktono-Laeton + NADH + H +. (1)

Aus NAB entsteht eine der Galaktose-Konzentration ~quiva- lente NADH-Menge, die bei 366, 340 oder 334 nm Meht be- stimmt werden kann. Die Reaktion verlguft stSchiometrisch, das Gleichgewieht liegt vollst/indig auf der Seite yon Galaktono- Laeton und NADH.

Reagentien. NAB (etwa 68-% fl-NAD), Galaktose-De- hydrogenase (ca. 5 U/mg) sowie Tt~IS stammen yon C. F. Boehringer & SShne GmbH ~armheim, alle anderen Reagen- tien in p.&- oder reinster Qua]itgt yon der Firma E. Merck, Darmstadt.

Methode. Enteiweigung yon Vollblut. 0,20 ml Vollblut, friseh aus der Fingerbeere oder dem Ohfl~ppehen entnommen, werden mit 1,00 ml 0,33 3I Perehlorsiiure gemiseht. Die 3/[i- sehung wird ca. 10 min bei 2000 g zentrifugiert oder durch ein kleines Faltenfilter filtriert und vom Uberstand bzw. Filtrat 0,20 ml zum Test eingesetzt.

Infolge der groBen Pufferkapazit/~t des beim Test verwen- deten Tt~IS-Puffers entf~llt eine NeutrMisa.tion des Blutex- traktes.

Bestimmungsansa~z. Wellenlinge: 366, 340 oder 334ima; Glaskiivette: 1 em Sehichtdicke; Temperatur: 20 bis 25 ° C; 3/[essung gegen Luft.

und yon der mit Probe gemessenen Extinktionsdifferenz abzu- ziehen.

Bereehnung. Die Galaktose-Konzentration erreelmet sich naeh der allgemein anwendbaren Formet:

AE. V .MG e" d ~ tig Galaktose im Testansatz. (2)

Es ist V ~ Testvolumen, MG == 3~olekulargewicht yon Gala~tose, e = mikromolarer Extinkgionskoeffizient yon NADH, d = Schichtdicke der Kiivette.

Bei Durehffihrung des oben beschriebenen Bestimmungsan- satzes ist fiir die 3gessung bei 366 nm: A E . 181 = ~xg Galakt~se im Testansatz.

Falls die Messnng bei 340 bzw. 334 nm erfolgte, muB die gemessene Extinktionsdffferenz mit 96 bzw. 99,5 multipliziert werden, um ~xg Oalaktose im Testansatz zu erhalten.

Zur Berechnung der Galaktose-Konzenbration im Blur ist es notwendig, die bei der Enteiweit3ung des Blutes eingetretene Verdfinnung sowie den INiissigkeitsgehalt des Blutes zu be- rfieksiehtigen. Blut enth5lt ca. 80% seines Gewiehtes an Fliis- sigkeit, 1 ml Blur wiegt etwa 1,06 g. Bei Einsatz yon 0,20 ml Blut (=0,122g) ergibt die EnteiweiBung 0,212.0,8-t-1,0= 1,17 ml Extrakt. Von diesem werden 0,20 ml zum Test einge- setzt. Die Gesamtverdiirmung betrigt:

1,17 • 1 = 29,2.

0,2 • 0,2

Die Berectmung der Galaktose-Konzentration/ml Blut erfolgt also mit dem Faktor 29,2.

Es ist daher fiir die lViessung bei 366 nm:

A E . 181 • 29,2 = ~g Galaktose/ml Blur oder

A E . 528 = mg- % Galaktose im Blur.

Ffir die Messung bei 340 bzw. 334 nm miissen die Faktoren 280 bzw. 290 eingesetzt werden, um rag-% Gataktose im Blut zn erhalten.

b~berpri~]ung der Methode Proportional#St. Die Proportionalit/it wurde geprfift, in-

dem steigende Volumina GalaktoselSsung (aus ehromatogra- phisch miner, wasserfreier Galaktose) in den Test eingesetzt wurden (Tabelle 1).

Tabelle 1

~ oI ~zMol % alaktose Galaktose

eingesetzt gefunden

0,100 0, IOI I01,0 0,200 0, I98 99,0 0,300 0,295 98,3 0,400 0,404 101,0 0,500 0,493 98,6 Mittel 99,5

In eine Kiivette pil0ettieren:

0,1 IVI TRIS-Puffer, pit-= 8,6 NAD-LSsung (10 mg/ml) Probe

~[isehen und Extinktion E i messen

3,00 ml 0,10 ml 0,20 ml

Galaktose-Dehydrogenase (5 mg/ml) 0,02 ml

mischen und Stillstand der l~eaktion abwarten (ca. 30 rain). Extinktion E~ messen. Ep--E iist die dutch GMaktose hervor- gerufene ExtinktionsEnderung AE.

In Anbetracht der sehr geringen Galaktose-Konzentration im Normalblut und der damit verbundenen sehr kleinen Ex- tinktionsdifferenz ist es zweekmgBig, einmul bei jedem Galak- tose-Dehydrogenase-Priparat den dutch Zugabe des Enzyms hervorgerufenen geringen Extinktionssprung zu bestimmen

i Abkiirzungen: NAD = Nicotinamid-adenin-dinue]eotid, NADtI = reduz. Nieotinamid-adenin-dinueleotid, TRIS ~ Tris (Hydroxymethyl) -aminomethan.

Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, dab die Reaktion bis minde- stens 0,5 ~ o l Galaktose/Testansatz linear vertEuft, die ein- gesetzte Galaktose wird zu 99,5 % wiedergefunden.

Emp[indtichkeit. Setzt man voraus, dab bei Beracksiehti- gung eines Leerwertes eine Extinktionsdifferenz der Probe yon 0,010 noeh mit geniigender Genauigkeit abtesbar ist, so kSnnen unter den oben beschriebenen Testbedingungen bei der Mes- sung bei 340 nm noch 2,8 rag-% Galaktose im Vollblnt erfaBt werden. Falls die Messung bei 366 nm effolgt, verringert sich die Empfindlichkeit entsprechend dem bei diesel" Wellenlinge niedrigeren Extinktionskoeffizienten yon NADH um den Fak- tot 1,89, so dab bier noch 5,3 mg-% Galaktose im Vollblut be- stimmt werden kSnnen. Diese Empfindliehkeit reieht far die meisten Fragestellungen a.us.

Dureh eine konzentriertere Enteiweigung, z. ]3. dureh Mi- schung yon 0,20 ml Blut mit 0,50 ml 0,6 N PerehIorsiure ist es jedoch mSglieh, die Bestimmung bei sonst gleiehem Test- ansatz um den Faktor 1,74 empfindlicher za maehen.

Prgzision der Be~timmung. Zur Ermitt]ung der Standard- abweichung (s) und des Variationskoeifizienten (VK) wurden yon einer Blutprobe (nach Galaetosebelastung) 10 Bestimmun- gen durehgefiihrt (Tabelle 2).

938 K. RO~N~L et al. : Enzymatische Galaktosebestimmung im Blur und oraler Galaktose-Toleranztest Klin. Wschr.

Wieder]indungsversuch. Zu einer Blu~probe mit bekanntem Galaktosegehalt wurden bekannte Mengen GMaktose zuge- setzt, die Probe nach oben beschriebener Vorsehrift enteiweiBt und getestet.

Ira Mittel warden 99 % der zugese~zten Galaktose wieder- gefunden (Tabelle 3).

Tabelle 2

~Tr. mg- %

1 56,5 2 56,0 3 58,0 4 56,0 5 59,0 6 57,0 7 56,5 8 57,5 9 58,5

10 58,5 2 57,3 s 1,11 VK 1,94%

Tabelle 3

rag-% Galaktose AE~¢¢ rag-% Galaktose % zugese~zt gefunden

Ohne Zusatz 0,091 48,0 ~- 15 0,119 61,7 98 ~- 30 0,151 79,5 102 ~- 60 0,211 111,5 97 -~ 120 0,325 171,5 99

Mittelwert 99,0 %

Stabilit5t der Galaktose a) Im Vollblut. Nach Galaktosebelastung wurde Blur ab-

genommen und dieses bei +4°C und 25°C gelagert. Die Galaktose-Konzentration sank innerhalb 48 Std bei + 4 ° C um 15% und bei 25 ° Cum 45% ab (Tabel]e 4).

Tabelle 4

0 ° C 25 ° C

Anfangswert 87,5 rag- % 87,5 mg- % Nach 5 Std 81,5 nag- % 76,5 rag- % Nach 24 Std 78,5 mg-% 60,5 mg-% Naeh 48 Std 74,5 rag-% 47,7 mg-%

b) Ira sauren Blutextrak~. Nach Ga.laktosebetastung wurde Blut abgenommen, mit Perchlorsgure engeiweiflt und zentri- fugiert. In dem yore denaturierten Protein dek~ntierten Uber- stand trat innerMlb 3 Tagen selbst bei 25 ° keine VerSmderung der Galaktosekonzentration ein.

Ein]lufi yon Anticoagulantien. Wir priiften Heparin (bis I mg/ml Blur), Citrat, OxMat, Athylendiamintetraaeetat (bis je 5 mg/ml Blur) and Fluorid (his 10 mg/ml Blur) als Zusatz und kormten in keinem Fall einen die Bestimmung stSrenden Eir~luB feststellen.

Dehydrogenase ffir die Galaktose-Bestimmung zur Vefffigung steht, wurde der Toleranztest neu bearbeitet.

Die Untersuchungen wurden an 36 lebergesunden und 10 teberkranken Personen durchgef/ihrt. Als,,leber- gesund" galten Versuchspersonen im Alter zwischen 20 und 50 Jahren, die anamnestiseh keine Lebererkran- kung durehgemacht hatten mad kliniseh keinen An- haltspunkt fiir einen Lebersehaden boten. Bromtha- leintest, GOT, GPT, alkalisehe Phosphatase, Gamma- Globuline and 90 min-Wert der Galaktose naeh Be- Iastung [bestimmt naeh der Methode yon SOSD~- GAA~D (1958 ) ] lagen ira Normalbereieh [Normalbereich ffir GOT und GPT naeh SCHmDT and SC~mDT (1963)].

Bei den ,,leberkranken" Patienten lagen histolo- giseh entweder eine ehroniseh floride Hepatitis oder eine Lebercirrhose vor. S/tmtliehe der oben angeffihr- ten Tests ergaben pathologische Werte.

Methode. Die Galaktose-Belastungen wurden unter Grundumsatzbedingungen morgens zwischen 8 und 9 Uhr durehgefiihrt. Naeh Bestimmung der Galaktose- Konzentration im N/iehternblut wurde eine LSsung yon 40 g Galaktose in 250 ml Wasser innerhalb 2 min getrunken. Die Gataktose-Konzentration wurde dann fiber 90 rain in 15miniitigem Abstand bestimmt. Die letzte Bestimmung wurde 120 rain naeh Galaktose- Gabe durchgefiihl~. Die Blutentnahme erfolgte aus der Fingerbeere.

Ergebnisse. Die Galaktose-Konzentration im Nfich- ternblut sehwankte zwisehen 0 rag-% und 4,3 rag-% um einen Mittelwert yon 1,4 rag- % (n = 70).

Tabetle 5. Mittelwerte und deren Signi/ikanzerb der Galaktose- Konzentration im Blur in rag- % bei Lebergesunden (n = 36) ]iir

die verschiedenen Abnahmezeiten

Zeit. in rain

O. 15 30 45 60 75 90 120

1,46 20,44 41,70 48,26 39,43 23,17 10,9 4,87 S 1,04 13,6 25,9 26,9 24,2 15,2 7,1 2,7 S 2 1,09 185,1 672,7 726,9 586,9 232,9 50,9 7,4 SEM a 0,17 2,2 4,3 4,4 4,0 2,5 1,2 0,45 95% Ver- 2 ,10 27,5 52,3 54,4 48,9 30,7 14,3 5,45

tr~uens- bereieh

a Standard error of the mean,

Wie man aus den Tabellen 5 und 6 sowie der Abb. 1 ersieht, unterscheiden sich die 75-, 90- und 120 min- Werte der Leberkranken yon den Lebergesunden signi- fikant. In den ersten 60 rain nach der Belastung (,,Resorptionsphase") differieren beiden Gruppen nieht eindeutig, in den n/~chsten 60 rain der zweiten Phase

Klinische Untersuchungen

Wie in fffiheren Untersuchungen (Ro~ i~n und G~IMMEL, 1966; R o ~ I ~ L und Gm~IMEL, 1967) ge- zeigt wurde, bew/ihrt sieh der orale Galaktose-Toleranztest in der Ktinik bei der Diagnose und Verlaufs- kontrolle yon Lebersch/~den sowie bei der Differentialdiagnose z~G schen hepatocellul/~rem und mecha- nisehem Ikterus. Nachdem nunmehr das spezifische Enzym Galaktose-

Tabelle 6. Mittelwerte und deren Signi]ikanzen der Galaktose-Konzentration im Blut in mg-% beg Leberkran]cen ]i~r die verschiedene~ Abnahmezeiten (3 =10)

Zeit in rain

0 15 30 45 60 75 90 120

2,64 28,85 60,0 86,5 100,75 105,4 90,05 58,3 S 1,64 16,9 28,5 37,9 38,3 38,0 34,5 39,6 S ~ 2,5 288 ,4 816 ,5 1446,5 1476,4 1450,3 1194,0 1573,9 SEM ~ 0,5 5,3 9,0 !1,9 12,1 12,0 10,9 ]2,5 95% Ver- 3,36 37,7 63,5 84,5 85,5 84,7 77,0 88,3

trauens- bereich

a Standard error of the mean.

46. Jg., Heft 17, 1968 K. ROMNEL et M. : Enzymatische GMaktosebestimmung im Blur und oraler Galaktose-Toler~nztest 939

(,,Metabolisierungsphase") ist der Unterschied zwi- sehen beiden Kollektiven jedoch signifikant. F/Jr den 75-, 90- und 120 min-Wert ist/9-- < 0,001. Der hSchste 90 min-Wert wurde bei Lebergesunden unter Berfiek- sichtigung des 3 s-Bereiehes mit 30,3 mg-% Galaktose gefnnden.

Wie schonfrfiher beriehtet (Ro~J~L and G~_~EL, 1966 ; RO~EL und GRz~r~n, 1967 ; yon U~X~Z~LL und WAG~rm 1963), zeigte sieh der 90 min-Wert als der einzig aussagesichere Bezugswert zwisehen dem Kollektiv lebergesunder und teberkranker Patienten. 70 % der leberkranken Patienten hatten einen 90 min- Wert fiber 40 rag-%, 5% der Personen ohne Leber- schaden lagen fiber 40 rag-%, fibersehritten jedoeh nicht 45 rag-%. Nach dem jetzt beschriebenen Tole-

weist. Eine Fettleber l/~Bt sich erkennen, wenn bei nor- mMem Ausfall des Gataktose-Toleranztests der Brom- thalein-Test pathologisehe Werte zeigt.

4. Eine Dosierung, bezogen auf K6rperoberfl&ehe und K6rpergewieht, ist unn6tig. Naeh frfiheren Unter- suehnngen (I~oM~ELund G a ~ E ~ , 1966;RO~MEL und Ga~-~N]~, 1967) genfigt eine Betastung mit 40 g Galak- tose klinischen Bedfirfnissen vollauf.

5. Die enzymatisehe Galaktosebestimmung ist aueh yon aussehlaggebender Bedeutung bei Verdaeht auf eine eehte Galaktos/~mie und bei der Diagnostik yon latenten Galaktos&mien. So sollte der P&diater im S£uglingsalter bei dem Vorliegen einer I-Iepathospleno- megahe, einem Ikterus und einem allgemeinen Kr&fte- verfall, ferner beim Auftreten yon Katarakten im

1501 mg °I°I- T T

1 2 o [ T - - i I - - T .~ ~ 1 1 0 - - l , ~ I

N I _ I l ~ o 80 --T, - - - / ' - , I

70 I ± I ' o _± _~ 60

, - - 4 - 30 ' 2O 10

0 15 45 60 75 90 min 120 Zeit der Betostung

T

- - } . - -

i X + s der Leberkrcmken A

- - 1 ~ s der Lebergesunden

Abb. 1. Mi t t e lwe~ t skurven der Ga lak toseb lu t sp iege l n a c h oraler G a l a k t o s e b e l a s t u n g

ranztest lag der 90 min-Wert bei Lebergesunden im Mittel bei 10,9 mg-% Galaktose mit Extrem-Werten yon 3 mg-% und 34,5 rag-%. Unter Berficksiehtigung des 3 s-Bereiches lag der h6ehste 90 rain-Weft bei 30,3 rag-% Galaktose. Bei der Methode naeh SO~DEg- GAAl~D (1958) fand sieh ein nieht nur dureh GMaktose bedingter ,,I%stzueker" yon 6--12 mg-%. Subtrahiert man diesen ,,gestzueker" yon dem naeh der Sonder- gaard-Methode h6chst zul&ssigen 90 min-Wert fiir Le- bergesunde yon 40 rag-%, so erh&lt man die ,,wahre Galaktose-Konzentration" im Blut. Unter Berfieksich- tigung der jetzt durchgeffihrten spezifisehen Galak- tose-Bestimmung und dem fiir die Bestimmung kriti- sehen 90 min-Wert yon etwa 30,3 rag-% GMaktose er- gibt sich somit eine gate Ubereinstimmung zu unseren frfiheren Befunden.

Fiir die Klinik ergibt sich mit dieser Methode, frfi- here Ergebnisse einbezogen, folgendes:

1. Die Methode ist in jedem klinisch-ehemischen Labor durchffihrbar, das fiber ein Photometer ffir die Wellenlangen 366, 340 bzw. 334L nm verfiigt.

2. Der Arbeitsanfwand ist gering und nieht zeit- raubend.

3. Verglichen mit anderen Leberfunktionsprobenist die Aussagekraft des Tests gro6. So konnten wir zeigen (l%0~iEL und GRIMMEL, 1966 ; RO~MEL und GI~IM~IEL, 1967), dag im Falle der chronisehen Hepatitis und der Lebercirrhose der hier besehriebene Toleranz-Test eine grSl3ere Empfindlichkeit als der Bromthalein-Test auf-

66 c Klin. ~Vschr., 46. 5ahrg.

S&uglhlgs- und Kindesalter, au6erdem bei Beobach- tung yon Sehwachsinn im S/~uglings- und Kindesalter, eine Galaktos&mie dutch Bestimmung des Galaktose- Niichternblutspiegels und Durchffihrung yon Bela- stungstests ausschhe6en.

Allerdings ist es notwendig, ffir das Neugeborenen- und S/~uglingsalter eine spezielle Belastung auszu- arbeiten.

6. Die Kurven bei Galaktos~mie zeigten bei Leber- kranken und Lebergesunden eine gute 1%produzierbar- keit, statistisch konnte keine signifikante Streuung festgestellt werden.

Zusamme~4assung. Es wird fiber eine neue Galak- tose-Bestimmung im Blur mit Hilfe des Enzyms Galak- tose-Dehydrogenase berichtet. Die Bestimmung zeich- net sich dureh Spezifit/~t, groge Empfindliehkeit und kleinen Arbeitsaufwand aus. Der exakte orMe Galak- tose-Toleranztest als Leberfunktionsprobe ist dureh die enzymatisehe Bestimmung der GMaktose erst mSgIieh geworden. Bei Leberkranken liegt die untere Grenze des 90min-Wertes naeh orMer GMaktosegabe bei 30,3 rag-% Galaktose im Blur.

Summary. The publication reports a new method of galaetose determination in blood with the help of the enzyme galactose-dehydrogenase. The determina- tion is characterized by specificity, great sensitivity and a low labour expenditure. The exact oral galactose tolerance test as estimation of the liver function is now

940 K. ¥. WERDER, K. SCHWAEZ und P. C. Sc~rBA: Sernmproteinbildung yon ACTH. I Klin. Wschr.

for the first t ime possible th rough the enzymat ic deter- ru inat ion of gMactose. By pa t ien ts with l iver disease the lowest level, 90 minu tes after oral gMaetose adminis- t r a t ion is 30.3 rag- % galactose in blood. For the detec- t ion of a l iver disease the 90 minu te ga]actose value, after oral admin i s t ra t ion is sufficient.

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Dr. K. ROndEL Apotheker E. B~NT (C. F. Boebringer, Tutzing) BSc F. Sc~r~TZ Dr. K. G ~ -Universit~t LTIm Zentrum ffir Innere Medizin 79 Uim, SteinhSvelstr. 9

Serumproteinbindung yon ACTH I. Unte r suehungen mit Dextrangelfi l t rat ion und aIt-ACTIt

K. v. W ~ D ~ , K. SCHWArtz u n d P. C. Sc~I~A* IL Medizinische Klinik der Universit~t Miinchen (Dh'ektor: Prof. Dr. Dr. G. BOD~C~TEI)

Einleitung Unte r suchungen fiber die B indung yon ACTH an

Serumeiwei~kSrper liegen bisher nur spi~rlich vor. So konn t en WoLF u. Mitarb. [1] zeigen, dat3 synthet i - sches, la lJ-markier tes Tetracosapept id in der Radio- papierelektrophorese mi t den Serumprote inen wan- derte, wenn der Papierstreffen vorher mi t n ich t mar- kier tem Corticotropin abges;4ttigt worden war. MELA~I u. Mitarb. [2] fanden hingegen bei Dextrangelchroma- tographie yon la lJ -markier tem Schweine-ACTH n u r eine B indung der rad ioakt iven Degradat ionsprodukte an das Serumprotein, wobei Angaben fiber die biologi- sche AktL4t i i t dieser , ,Degradat ionsprodukte" in dieser Arbei t fehlen [2]. - - Biologische ACTH-Be- st inm~ungen werden in unserem Labor seit einiger Zeit durchgeffihrt [3]. Da uns a l t -ACTH zur Verffigung stand, wnrde mi t I t i lfe der Dextrangelf i l t ra t ion, einer Technik, die ~4r zur Bes t immung der P ro te inb indung yon Schi lddrf isenhormonen u n d Cortisol benfi tzen [4~ 5] die Frage der B indung yon ACTH an Serum- proteine untersucht .

* Mit Unterstiitzung der Deutschan Forschungsgemein- sehaft und der Stfftung Volkswagenwerk (K. v. W.).

PrSparate und Methoden Als markiertes ACTH wurde ein katalytisch mit Tritium

markiertes Tricosapeptid verwendet (all--ill-23 Corticotropin- 23-amid-acetat, Farbwerke Hoechst AG), das in zwei spezffi- schen Aktivitiiten vorlag: 212 ~Ci/mg und 382 ~zCi/mg. Dabei en¢sprachen 1,0rag Trockensubstanz ca. 100 E ACTH [6]. Welter wurde nicht markiertes fi~-2a Cortieotropin-23-amid (Farbwarke Hoechst AG) und natives Sehwaine-ACTIt (Cor- t.rophine®, Organon GmbH) verwendet. Beiden Firmen sind wir zu grol3em Dank fiir ihre Unterstfitzung verpflichtet.

Die Dextranget/iltrati~ mit Sephadex G-25 fine wurde Ms S/~ulenchromatographie mit Standards/~ulen (i.D ..... 0,8 em) durchgefiihrt. Sephadex wurde ca. 90 rain in 0,01 M Na- Phosphatpuffer pH 7,4 gequeli~ und darauf in eine ver~ikal stehende S~ule, deren Ausflul~ mit Glaswolle und einer Glas- parlenschicht verschlossen war, geffillt [4]. Das Gelbett wurde anschliel~end mit 3 mt 5 %iger tIumanalbuminl6sung (Behring- werke, AG) abges~ttigt, da sich in Vorversuchen [7] gezeigt hatte, da~ ohne vorherige Albuminabs~ttigung des Dextrangels das ACTH auch durch 0,1 N HC1 nicht vollst~ndig eluiert werden konnte. Zur Elution dienten dann 0,01 M Na-Phosphat- puffer pH 7,4 und 0,1 N HC1.

:Die Messung der Radioa]~tivitiit erfolgte im Tri-Carb Liquid Szintillation-Spectrometer (Fa. Packard Instrument) mit 13,8 % Ausbeute fiir Tritium in unserem System. Dafiir win'den abhangig yon der zu arwartenden Radioaktivitat jeweils all- quote Teile der gesammelten Fraktionen (3--5 ml) eines Ver- suches bis zur Troekene eingeengt, anschliel]end in 1,0 ml