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培 養 基 のpHと 細 菌 発 育 に つ い て

第3編

細 菌 発 育pH,反 応pHと 酵 素 活性 との関係

岡山大学医学部微生物学教室(指 導:村 上 栄 教授)

田 中 種 徳

〔昭和34年9月23日 受稿〕

目 次

I　 緒 言

Ⅱ　実験材料及び実験方法

Ⅲ 実験成績

IV　総括及び考按

V　 結 論

VI　文 献

1　 緒 言

細菌発育に対する理学的環境の内培地中の水素イオ

ン濃度が重要な関係を有する事は既に述べた所である

が1),こ れらpHは 細菌自体の有する酵素の活性と密

接 な関連が存する事は言を俊たない.又 一方細菌の生

長増殖する培地のpHは 菌の酵素産生に著しい影響を

及ぼすものであり,これ等に関してはGale & Epps2)

の詳細な実験に接ずる事が出来,酵 素の型と機能とに

よつて培地のpHの 効果は異ることを述べている.

著者は第1編,第2編1)に 於て,培 地の緩衝能及び

発育 とpHと の関係を追求したが,そ の結果得た緩衝

能の高い培養基を用いて可及的一定pHの 元にSal.

57Sを 培養し,そ れ等の菌の酵素活性を各種反応pH

に於いて,又 反応中にpH変 換の実験を行つて検討 し

些かの知見を得たので報告 し御批判を乞 う次 第 で あ

る.

Ⅱ 実験材料 及び 実験 方法

a) 供試細菌:当 教室保存の標準株Sa1.57Sを 常

法により継代し純化を計つた後に供試した.

b) 使用培地及び培養法:ペ プ トン水培地に終濃度

M/50に なる如 く Phosphate bufferを 添加して緩

衝能の上昇を計 り, pH 5.4 pH 7.2 pH 8.3の 三種

を調整した.何 れの培地にもSal. 57Sを500 ccに

約40mg培 養し37℃ に12時 間incubateし た.

c) 生菌浮游液:ペ プ トン水培地に発育せる菌を遠

心沈澱により集菌 し,生 理的食塩水にて2回 洗源後生

理 的 食 塩 水 に 均 等 再 浮 游 せ しめ 光 電 比 色 計 に よ り菌 量

決 定 を行 つ た.

d) 基 質: Glucose. Succinateを 選 び,何 れ も市

販 品 を使 用 した.

e) 酸 素 消 量 測 定 法: Warburg検 圧 計 を用 い 常 法

に従 つ た が3),反 応 液pHを 三種 選 び 一 定 時 間 後反 応

pHを 変 化 さ す為 容 器 中 に添 加 す る試 料 は 次 の 如 く し

た.

主 室

菌 液: 1cc(Sal. 57Sを4mg含 む)

M/50燐 酸 緩 衝 液: 1.5cc(終 濃 度M/100に な る

如 くす る)

但 し初 期 反 応pHは5.4, 7.2, 8.3,と した.

側 室

基 質: 0.3cc(終 濃 度M/100な る如 く した)

NaOH又 はHC1液: 0.2cc(0.1N～0.2Nの も

の を適 宜 使 用 した)

副 室

20%KOH: 0.25cc

上 述 の 如 く初 期 反 応pHを5.4, 7.2, 8.3と 選 び

45分 後 に側 室 のNaOH又 はHC1液 を 入 念 に 洗 い 込

む様 に して添 加 し, pHの 交 換 を行 つ た.

Ⅲ 実 験 成 績

供試菌の作製に当つてはM/50phosphate buffer

8294　 田 中 種 徳

加 ペ プ トン水 にSal.57Sを 培 養 し12時 間inbubate

を行 つ た.初 期pHはpH 5.4, pH 7,2, pH 8.3に 正

確 に 調 整 して お きincubate後 の 培 養pH変 動 は表 の

如 くで あ る.

表Incubateに よ る培 地pHの 変 動

図1 pH 5.4培 養 菌 のglucose

基 質 に 於 け る酸 素 消 費 量

a) 初期 反応pH 5.4

b) 初期 反 応pH 7.2

c) 初 期 反 応pH 5.3

培 地 初 期pH 5.4 pH 8.3の 場 合 は やや 変 動 す るが,

全 体 と し て 大な る変 動 で な い為,初 期pHを 以 つ て培

養pHと し た,

a) Glucose基 質 に 於 る 酵 素 活 性 に 就 い て

pH 5.4培 養 菌 に 於 る 酸 素 消 費 曲線 は 図1に 示 す如

くで あ る.初 期 反 応pH 5.4でpH変 換 を行 う 場 合

は, pH 5.4の ま まで は か な りの 活 性 を維 持 す るが 変

換 後pH 7.2, 8.3の 場 合 は 一 時 的 に 活性 低 下 を来 し,

そ の 後次 第 に適 応 的 に 呼 吸 量 の上 昇 を認 め る.図 には

示 さな か つ た が120分 値 で はpH 8.3 pH 7.2の 場 合

の方 がpH 5.4を しの ぐ酸 素 消 費 量 を示 した.(図1

a) 次 に初 期反 応pH 7.2で.変 換後 のpH 5.4の

時 は 著 明 な 活 性低 下 を示 し適応 的 な 傾 向 は見 られ ない

が, pH 8.3に 変 換 した場 合 は 直後 に 於 て やや 低下 す

るが そ の 後 急 上 昇 してpH 7.2持 続 の 場 合 の酸 素消 費

量 よ り大 とな る.(図11))次 に 初 期反 応pH 8.3の

場 合 は 変 換 後 もpH 8.3持 続 が 最 高 呼 吸 量 を 示 し他 は

変 換 後 や や 活 性 低 下 を来 す(図1c)

次 にpH 7.2培 養 菌 に お け る成 績 は 図2に 示す.初

期 反 応pH 5.4で は変 換 後pH 7.2. pH 8.3は や や 活

性 低 下 をす るがpH 7.2で は 特 異 的 で30分 後 よ り適 応

的 に急 上 昇 し, pH 5.4持 続 の場 合 よ り著明 に 大 な る

酸 素消 費 量 を 示 す.(図2a) 初 期 反 反 応pH 7.2の

場 合 はpH 7.2持 続 が 最 大 の呼 吸 量 を示 し,他 は やや

抑 制 さ れ てpH 8.3, pH 5.4の 順 で あ つ た.(図2b)次

に 初期 反 応 の場 合 もpH 8.3変 換 後pH 5.4が 最 大 で あ

つ た.(図2c)

pH 8.3培 養 菌 に お け る成 績 は 図3に 示 す.初 期 反

応pH 7.2の 場 合 はpH変 換 を行 うとpH 7.2. pH

8.3で 直 後 は 強 い 抑 制 を受 け るが 短 時 間 後 に 高 い活性

を示 し 始 め90分 値 以後 で はpH 5.4よ り大 とな る.

(図3a)初 期 反 応pH 7.2で もpH変 換 後8.3の

時 は 適 応 的 に上 昇 し,逆 にpH 5.4の 場 合 は強 い活

性 低 下 を認 め る.(図3b) 次 に 初 期反 応pH 8.3

で は変 換 後 の活 性 度 はpH 8.3, pH 7.2, pH 5.4の順

, pH 5.4の み に特 に低 下 が 大 で あ つ た.

初期 反 応 に お け る活 性 度 を検 討 す る為 に,初 期反 応

45分 測 定 値 を各pH培 養 菌 如 に 図 示 す ると図4の 如

くな る.即 ちpH 5.4. pH 8.3培 養 菌 では 反 応pH

8.3の 場 合 が最 高 の 酸 素 消 費 量 を示 しpH 7.2に 於い

て 最 低 で あ つ た.し か しpH 7.2培 養 菌 では 酸 素消 費

培養基のpHと 細菌発育について　 8295

図2 PH 7.2培 養 菌 のglucose

基 質 に 於 け る酸 素 消 費 量

a) 初 期 反 応pH 5.4

b) 初 期 反 応pH 7.2

c) 初 期反 応pH 8.3

図3 pH 8.3培 養 菌 のglucose

基 質 に 於 け る酸 素 消 費 量

a) 初 期 反 応pH 5.4

b) 初 期 反 応pH 7.2

c) 初 期反 応pH 8.3

図4 各pH発 育菌のglucose

基質に於ける活性

a) 発育pHと 反応pHと の関係

b) 有 効 活 性

8296　 田 中 種 徳

量は反応PH 7.2が 最高であ り,反 応PH 5.4, PH 8.3

では著しく低値を示した.(図4a)

又発育したpHに 於ける酵素活性即ち有 効 活性は

pHに よつて著差はないがpH 5.4,に おいて最 大で

あつた.(図4b)

b) Suceinate基 質に 於 る酵素 活性 に就い て

pH 5.4培 養菌に於ける成績は図5に 示す如くであ

る.初 期反応pH 5.4で はpH 5.4持 続 の場合が活

性度は最高でpH 7.2, pH 8.3に 変 換 した場合は僅

かに低下する結果を得 た.(図5a) 初期反応pH

7.2に 於てもpH変 換後の活性度はpH 5て4が 最も

大である成綴を得たがこの場合pH 7.2よ りpH 5.4

に変換後一時活性が低下する様な現象は見られず活性

曲線は直線的に上昇してい る.(図5b)初 期 反 応

pH 8.3に 於てもpH変 換後5.4が 最高で同じく直線

的に上昇する.

pH 7.2培 養菌に於る成績は 図6に 示 す 如 くであ

る.初 期反応pH 5.4に 於てはpH 5.4持 続 の 場合

がそのまま活性を維持し最高の 呼 吸 量 を示し,他 の

pH変 換を行つたものは強い 抑 制 を受ける.し かし

pH 7.2に 変換した場合は約30分 後より僅かに適応的

に上昇する(図6a)初 期反応pH 7.2に 於てはpH

5.4に 変換を行つた場合が直後より直線的に活性最高

を示した.逆 にpH 8.3に 変換した場合は僅か活性低

下 を示した(図6b) 次に初期反応pH 8.3で はや

や傾向を異にした.即 ちpH 5.4にpH変 換を行 う

と変換後約30分 経た後より適応的に上昇し,他 のpH

の場合は殆 ど酸素消費量を認めない.(図6c)

次にpH 8.3培 養菌に於る成績は図7に 示す如 くで

ある.初 期反応pH 5.4の 場合はpH 5.4持 続 の時

が酸素消費量は最大ではあるがpH 7.2, 8.3に 変換し

た場合も一時酸素消費は抑制されるがその後かな りの

上昇を認めた.(図7a)

初期反応pH 7.2で はpH 5.4に 変換した場合は変換

後30分 頃より適応的に呼吸量の上昇を認める様にな り

150分 の酸素消費量はこの場合が最大である.(図7b)

初期反応pH 8.3に 於ても同 様 変換後pH 5.4の

場合一定時間後より活性上昇を示し最高値を示すに到

る.(図7C)

Succinate基 質に於る場合も初期反応測 定 値を各

pH培 養菌毎に総括図示すると図8の 如 くであ る.即

ちSuccinate基 質の場合には何れ のpH培 養菌 も

反応pHが 低い程酸素消費量は大である.し かも培

養菌相互間ではpH 5.4培 養菌が最大の酸素消費量を

示し,次 がpH 8.3培 養菌 であつた.(図8a) 又

図5 pH 5.4培 養 菌 のSuccinate

基 質 に於 け る酸 素 消 費 量

a) 初期 反応pH 5.4

b) 初 期反 応pH 7.2

c) 初 期 反 応pH 8.3

図6 PH 7.2培 養 菌 のSuccinate

基 質 に 於 け る酸 素 消 費 量

a) 初 期 反 応pH 5.4

培養基のpHと 細菌発育について　 8297

有効活性の点でpH 5.4は における活性が著しく大き

い成績を得た.(図8b)

b) 初 期反 応pH 7.2

c) 初 期 反 応pH 8.3

図7 pH 8.3培 養 菌 のSuccinate

基 質 に 於 け る酸 素消 費 量

a) 初 期 反 応pH 5.4

b) 初期 反応pH 7.2

c) 初.期反 応pH 8.3

図8 各pH発 育菌のSuccinate

基質に於ける活性

a) 発育pHと 反応pHと の関係

b) 有 効 活 性

Ⅳ. 総括及 び考 按

菌が発育する場合には至適pH域 よりも更に広い発

育可能pH域 を有していてこの範囲では良否の差はあ

るが発育が可能である4).し かしその発育する培地の

pHと 酵素産生 とは密接な関係があ りGale&Epps2)

により広範な研究がなされており,彼 等は二群の酵素

に分ち,第1の ものは生長培地のpHが 酵素の至適活

8298　 田 中 種 徳

性pHか らかたよるに従つて酵素の活性損失を補 う為

に代償的に多 くの酵素が産生されるものと,第2の も

のは代償効果が殆どないか全く存しないもので酵素の

至適pH又 はその近 くで生長する時に最もよく産生さ

れるものに分けている.又 別の観点より機構的に中和

機構,防 禦機構その他の場合にも分類している.即 ち

Gale等6)は これ等発育pH,酵 素反応pH等 の関係を潜

在活性(至 適pHに おける酵素活性),有 効活性(菌 が生

長した培地のpHに おいて示す活性)を 測定する事に

より精細に検討している.し かしこれ等はあくまで発

育状態にある時のpH影 響であるが著者は静菌状態即

ち無発育呼吸状態に於る反応pHが 酵素活性に如何な

る影響を及ぼすかを呼吸量測定の中途でpHの 急変を

行はしめ,そ の後の活性度を検討した次第である.

Glucoseを 基質とした場 合 を酸素消費量の時間曲

線より45分incubate後 にpH変 換を行つた場合の

活性変動を総括すると次の如くてある.

pH変 換後も初期反応pHに 馴化する傾向を示し,

初期反応pHの ままにてpH変 換を行はない場合が

最も活性が大である.し かしこの現象はpH変 換直後

の現象であつて短時間incubateを 行つている内に特

に培養pH(詳 細にはpH 7.2, pH 8.3何 れにも)と 同じ

pHに 帰つた時良好 な適応が見られ活性度が急上昇し

て くる.し か しpH 5.4培 養菌のみに於てはかかる傾

向は見 られず,pH 7.2又 はpH 8.3に 徐々に適応 し

てくる.以 上の事よりglucose分 解に対する酵素系

の活性は短時間の 静菌状態incubateで 反応pHに

馴化する傾向にある.し かしpH変 換後の終局的な活

性度の大小の点よりすれば培養pHの 如何にかかわ ら

ず,反 応pHが アルカ リ性側で最も酸素消費量が大で

ある事が判つた.即 ち反応至適pH域 はアルカ リ性側

にある事が想像される.し かし培養pHに は関係ない

と述べたものの.pH 5.4で 培養 した場合はアルカ リ

性の反応pHに 適応するにはやや長時間を要する差は

認められた.次 に培養pHと 初期反応pHと の間の関

係から見て有効活性はpH 5.4で 大であることが窺は

れたが,こ の事よりglucose分 解 に対する酵素群は

至適pHか らかたよると反つて代償性に多量産生され

るものであると思考する.

次にSuccinateに 対する酵素の活性 についての成

績を総括すると,こ の場合は初期反応pHに 馴化する

現象は見 られず,変 換後は例外なく反応pH 5.4の 場

合に活性度が最大であり,し かもこのpH 5.4で 最大

の活性度を現す場合には僅かの例外を含んでなんら適

応期を認めず直線的に酸素消費量は上昇する.

pH 8.3培 養 菌 でpH 7.2→. pH 5.4, pH 8.3→pH

5.4の 如く,培 養が強アルカ リ性でしかも 初期 反 応

pHが アルカ リ性のものをpH 5.4に 持ち来る時には

僅かの遅滞現象を認め適応的に上昇する.

以上よりSuccinateに 対する酵素活性は培養pH

の如何にかかわらず,至 適 活性 のpHは5.4と 云

う酸性側にあ り,又 異るpHに よる短時間の静菌状態

incubateで はglucoseに 対する活性の様に順応す

る事な く至適活性pHに 於かれると直ちに潜在活性を

示す性質を有する.又 図8よ り判る如 くこの酵素は至

適pH或 いはその近 くで生長する時最もよく産生され

ることが判 り,pHが 強 くずれた場合に代償的に多量

の酵素が産生される事は殆んど考えらきない.

V. 結 論

著者はSa1.57Sを 供試 菌としてPH 5.4, PH 7.2,

pH 8.3の 一定pHの 元に培 養 し,そ れ等 の 菌の

Glucose. Succinateに 対する酵素活性が種々の反応

pHで 静菌状態におかれた場合に如何なる影響を受け

るかを,反 応中に更にpHの 急変換を起さしめて検討

し次の結果を得た.

1. Glucoseに 対する活性は 短時間 の静 菌 状 態

incubateに よつて反応pHに 馴化する傾向を示す.

しかしこの傾向はpHを 変換すると徐々に培養pHに

復元適応をする.但 しpH 5.4培 養菌のみは長時間後

にアルカ リ性の反応pHに 適応して くる.

2. Succinateに 対す る活 性 は短時間の静菌状態

incubateで はそのpH.に 馴化する傾 向は見 られな

い. pH変 換を行 うと何れの培養菌も反応pH 5.4で

最大の活性を示す.

稿を終るにあた り,終 始御懇篤なる御指導及び御校

閲を賜つた恩師村上教授に深甚の謝意を表し,合 せて

御援助を頂いた金政講師,森 淳子嬢に感謝致します.

Ⅳ

: 文 献

1) 田 中:岡 山 医 学 会 雑 誌, 71, 4515, 1959.

2) Gale, E. F. & Epps, H. M. R.: Bioch. J., 36, 600, 1942.

3) Umbreit, W. W., et al.: Manometric Tech niques and Tissue Metabolism., 1949.

4) Bergey: Manual of Determinative Bacte riology, 6th Ed, 1948.

5) Topley, W. W. C. & Wilson, T.: The princi

ples of bacteriology and immunity, 1948.6) Gale, EF.: Bact. Rev., 4, 165, 1940.

培養基のpHと 細菌発育について　 8299

The Interrelation Between pH of Media and Bacterial Growth

Part III On the Interrelation between pH of Growth Media

and Reaction Media and Enzyme Activity of Bacteria

By

Tanenori TANAKA

Department of Microbiology, Okayama University Medical School

(Director: Prof. Sakae MURUKAMI)

In order to explain the effect on the enzyme activities of bacteria to glucose and succinate

on the reaction by resting cells under different pH from that of culture media, the author

observed the enzyme activities of Sal. 57 S under a various pH of reaction media by means

of conventional WARBURG's manometer. Sal. 57 S used in this study were cultured at the

pH of 5.4, 7.2 and 8.3 respectively. The effect on the enzyme activity by a sudden change

of pH during the reaction was also studied. The results obtained were as follows.

1) Concerns to the enzyme activity to glucose, the bacterial cells showed an adaptation

to the different pH of reaction media by short time incubation of resting cells in that media

and gave the proper reaction rate to the pH of reaction media. By the change of the pH of

reaction media to the identical pH of culture media during the reaction, this adaptation to

the reaction media was gradually lost and the reaction rate approached to the rate found

at the same pH as growth media. But the bacterial cells cultured at the pH of 5.4 adapted

to the pH of reaction media in alkaline by long time incubation in that and the reaction

rate retained for long in spite of the change of pH to the pH of growth media.

2) In the case of the activity to succinate, the bacterial cells did not show an adapta

tion to the different pH of reaction media by such incubation as above. The enzyme "activity

of either culture was found to be highest at the pH of 5.4.