Upload
phamtruc
View
245
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
RODZICIELSKIE PIĘTNOWANIE GENOMOWE. EPIGENETYKA W CHOROBACH NEUROLOGICZNYCH.
Monika Gos
Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
Kurs: „Neurogenetyka i genetycznie uwarunkowane choroby narządów zmysłów”
21 – 25.11.12.2016
MECHANIZMY REGULACJI EPIGENETYCZNEJ
metylacja: (wyspy CpG, zahamowanie
ekspresji)
modyfikacje białek histonowych:
acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja (efekt zależny od miejsca i
charakteru modyfikacji)
struktura chromatyny:
gęstość upakowania chromatyny (eu- i
heterochromathna – nieaktywna transkrypcyjnie)
struktury przestrzenne tworzone przez chromatynę
(pętle) oddziaływanie z kompleksami
białkowymi
niekodujące cząsteczki RNA: małe (<200pz, mikroRNA, snRNA i snoRNA)
i duże (>200pz, lncRNA)
Aktywacja ekspresji genu otwarta struktura chromatyny niemetylowane cytozyny acetylowane histony (HAT)
Zahamowanie ekspresji genu „zamknięta” struktura chromatyny metylowane cytozyny (DNMT) deacetylacja histonów (HDAC)
Modyfikacje a ekspresja genów
Regulacja epigenetyczna
mechanizm nie jest związany ze zmianą sekwencji DNA wzór piętna genomowego musi być utrzymany w tracie podziałów komórkowych i
różnicowania się komórek wzór piętna musi zostać rozpoznany przez aparat transkrypcyjny, tak aby doszło do
ekspresji genu z odpowiedniego allelu jest potencjalnie odwracalne (odwracalność jest warunkiem koniecznym do
ustalenia wzoru piętna genomowego specyficznego dla płci) może mieć charakter losowy (inaktywacja chromosomu X), jak również zależeć od
pochodzenia rodzicielskiego
Zaburzenia lub zmiana regulacji epigenetycznej efekt fenotypowy
Niekodujące RNA (non-coding RNA, ncRNA)
ncRNA
małe ncRNA (<200nt)
microRNA
snRNA
tRNA
snoRNA
piRNA
długie ncRNA (>200nt)
rRNA
inne ncRNA
Niekodujące cząsteczki RNA (ncRNA)
ekspresja 60% genów
kodujących białka
jest regulowana przy
udziale miRNA
www.sigmaaldrich.com
70% miRNA
ekspresja w mózgu
(specyficzna dla neuronów)
Przykłady: ↓ miR-206 – ALS
↓ miR-9 – SMA
↓ miR-19, miR-101, miR-130 – SCA typ I
Funkcje ncRNA
Hipoteza 1: odgrywają rolę regulatorową względem kompleksów białkowych odpowiedzialnych za modyfikację struktury chromatyny (brak zdolności do wiązania się z DNA)
1. Imprinting i regulacja dawki ekspresji genu – lokalizacja w piętnowanych loci
2. Pluripotencja komórek macierzystych – RoR lncRNA reg. przez Oct4, Sox2 i Nanog
3. Rozwój embrionalny (segmentacja ciała) – regulacja ekspresji genów Hox
4. Hematopoeza 5. Inaktywacja chromosomu X (Xist) 6. Różnicowanie komórek układu nerwowego
– TUG1 – lncRNA – siatkówka; brak fotoreceptorów
wpływ na ekspresję genów (cis i trans)
Epigenetyka – mechanizm adaptacyjny?
1944 – klęska głodu
Holandia
kobiety
I trymestr ciąży
kobiety
III trymestr ciąży
prawidłowa masa urodzeniowa;
otyłość i choroby układu krążenia
obniżona masa urodzeniowa;
nadciśnienie i insulinooporność
ekspresja genów odpowiedzialnych za
metabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych
adaptacja do warunków środowiska
warunki stresowe wzrost ryzyka rozwoju depresji i nerwicy
ZMIANY EPIGENETYCZNE SĄ SZYBSZE NIŻ MUTACJE DNA
Defekty epigenetyczne w ciągu życia a choroby cywilizacyjne
Wraz z wiekiem poza kumulacją mutacji punktowych w organizmie zachodzą także zmiany epigenetyczne
NOWOTWORY
INNE CHOROBY CYWILIZACYJNE
Genetyczno-epigenetyczny model powstawania chorób kompleksowych
1. rozwój choroby zależy od podłoża genetycznego oraz działania czynników epigenetycznych
2. czynnik epigenetyczny (DNA, chromatyna) może być modyfikowany przez czynniki środowiskowe
3. również warianty sekwencji genów odpowiedzialnych za regulację ekpresji genów mogą wpływać na powyższe zmiany
4. Starzenie się proces utraty plastyczności fenotypowej w czasie
cukrzyca, choroby serca, nabyta NI
Uszkodzenia epigenotypu
CHOROBY EPIGENETYCZNE
nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne
Zespół łamliwego chromosomu X (FXS)
Częstość występowania: 1/4000 mężczyzn, 1/8000 kobiet
Częstość nosicielstwa: 1/800 mężczyzn, 1/250 kobiet
Cechy kliniczne (chłopcy z pełną mutacją):
1. opóźniony rozwój mowy i psychoruchowy
2. NI (IQ 30-50)
3. specyficzne cechy dysmorfii
4. zaburzenia psychologiczne (autyzm, ADHD, nadreaktywność)
5. makroorchidyzm
http://medgen.genetics.utah.edu/photographs/pages/fragile_x.htm
FMRP (FMR1) – RNA interacting protein transport mRNA do dendrytów i regulator syntezy białek w synapsach istotne dla
procesów uczenia się i pamięci
regulacja internalizacji receptora AMPA po pobudzeniu mGluR brak FMRP nadmiar internalizacji AMPAR
Status CGG Liczba powtórzeń
CGG Metylacja FMR1
Objawy kliniczne
mężczyzna kobieta
Premutacja ~55-200 niemetylowany FXTAS FX-POI i FXTAS
Mutacja >200 całkowita metylacja 100% ID ~50% - ID,
~50% - prawidłowy
Mozaika w liczbie powtórzeń
p+m; n+p+m zmienna, w zależności od liczby powtórzeń
Do 100% ID
fenotyp zmienny; od prawidłowego do ID
Mozaika metylacyjna >200 zmienna
Niemetylowana pełna mutacja
>200 niemetylowany prawie wszyscy ID (nawet w dolnym zakresie normy)
XLMR a inaktywacja chromosomu X
Inaktywacja chromosomu X – stadium ok. 200 komórkowe (mozaicyzm)
Regulacja przy udziale ncRNA – XIST – akumulacja wzdłuż chr. X
wymazanie zmian epigenetycznych aktywnej chromatyny (H3K4me3, H3ac) naniesienie zmian chromatyny nieaktywnej (ubH2A, H3K27me3)
przyłączenie białek z rodziny
Polycomb, trithorax (Ash2L), białka SAF-A, histonu macroH2A
XLID - 150 jednostek chorobowych, głównie chłopcy zmiany dziedziczone od matek, u których obserwuje się
nielosową inaktywację chromosomu X (zaburzenia proliferacji lub przeżycia komórek z mutacją)
NI lekka – 55-69, umiark. 35-54, znaczna – 20-34, głęboka - <20
Inaktywacja chromosomu X - analiza
DNA
amplifikacja AR
HhaI
elektroforeza
M - NT
M - HhaI
P - NT
P - HhaI
m
_ m/-
Piętnowanie genomowe (GI)
Piętnowanie genomowe, rodzicielskie piętno genomowe
monoalleliczna ekspresja genu zależna od jego rodzicielskiego pochodzenia
46,XX 46,XY
R! ORGANIZM DIPLOIDALNY
każdy gen w dwóch kopiach (zazwyczaj eksprymowany z obu)
HAPLOINSUFICJENCJA (monosomie, 45,X, zespół Marfana)
Geny piętnowane (ok. 150) są odpowiedzialne za:
-rozwój mowy - kształtowanie kontaktów
międzyludzkich - inne fenotypy związane z
zachowaniem
1. organizacja klastrowa 2. eskpresja z allela mat. lub ojc. 3. w obrębie klastra – również geny
dla ncRNA 4. centra regulatorowe 5. piętno może być nałożone na
chromosomie mat. lub ojc.
Piętno genomowe (GI)
46,XX
46,XY
R!
R!
DEFEKTY PIĘTNA GENOMOWEGO – bardzo rzadkie, niemożliwe do naprawienia po zapłodnieniu
(epimutacja pierwotna lub epimutacja wtórna – cis, trans)
R!
46,XX
problemy z usunięciem piętna
R!
46,XX
problemy z nałożeniem piętna
gen eksprymowany z allela pochodzenia matczynego
gen eksprymowany z allela pochodzenia ojcowskiego
46,XX - matka
46,XY - ojciec
CHOROBA EPIGENETYCZNA
CHOROBA EPIGENETYCZNA
brak efektu fenotypowego mężczyzna może przekazać
defekt potomstwu
brak efektu fenotypowego kobieta może przekazać
defekt potomstwu
EFEKT: aktywacja allelu, który powinien być wyciszony wyciszenie allelu, który powinien być aktywny
NIEPRAWIDŁOWA DAWKA EKSPRESJI GENU
ekspresja obu kopii albo brak ekspresji zaburzenia wzrostu i rozwoju organizmu
Defekty GI – mechanizmy powstawania
R! R!
Rodzicielskie piętno genomowe
PWS/AS UPD14
SRS BWS/SRS
GNAS
TNDM
Choroba Częstość
występowania ID (%)
Region
chromosomowy
Zespół Pradera-Williego 1/10000 - 1/25000 ≈1 15q11-q13
Zespół Angelmana 1/12000 - 1/20000 ≈4 15q11-q13
Zespół Beckwitha-Wiedemanna 1/15000 ≈60 11p15.5
Zespół Russell-Silver 1/3000 - 1/100000 ≈50 11p15.5,
7p11.2-p13
Przemijająca cukrzyca
noworodkowa typu I 1/400000 ≈30 6q24
Pseudohypoparatyroidyzm Ib ? >90 20q13.11
UPD(14)mat
(zespół Temple) ? ? 14q32
UPD(14)pat
(zespół Kagami-Ogata) ? ? 14q32
Typowe choroby epigenetyczne
Zespół Pradera-Williego
objawy kliniczne: - hipotonia - trudności w karmieniu - nadmierne łaknienie - otyłość - zaburzenia funkcji poznawczych (NI) - specyficzny fenotyp behawioralny - hypogonadyzm - niskorosłość, małe dłonie i stopy - subtelna dysmorfia twarzoczaszki - zez - skolioza
Zespół Angelmana
Kryteria główne (4/4) - znaczne opóźnienie rozwoju - zaburzenia chodu / równowagi - opóźnienie rozwoju mowy - specyficzny fenotyp behawioralny Kryteria dodatkowe (3/6) - małogłowie pourodzeniowe - napady padaczkowe - nieprawidłowy wzór EEG - zaburzenia snu - zainteresowanie wodą / błyskaniem - ślinotok
Choroby epigenetyczne
„La Monstrua „ Juan Carreño de Miranda (1616-1685); Milan, Prada Museum
Eugenia Martinez Vallejo from Carol 2nd royal court
A boy with a puppet Giovanni Francesco Caroto
AS PWS
delecja mat 15q11-q13 delecja pat 15q11-q13
patUPD matUPD
epimutacja IC (brak piętna) epimutacja IC (piętno ++)
mutacja UBE3A delecja SNORD116
Disomia jednorodzicielska chr.14
matUPD14 – zespół Temple
przed- i pourodzeniowe zahamowanie wzrostu
wrodzona hypotonia
wiotkość stawów
opóźnienie rozwoju ruchowego
NI w stopniu umiarkowanym
patUPD14 – zespół Kagami-Ogata
(KOS, zespół Wang)
wielowodzie
wady w obrębie brzucha i klatki piersiowej
podwyższona waga urodzeniowa
(hypertrofia mięśniowa)
NI w stopniu głębokim
MLMD (multilocus DNA methylation defects)
Hypometylacja w obrębie kilku piętnowanych loci (ICR2+GNAS+IGF2R+PEG1 lub TNDM+ICR2+GRB10+PEG1)
białka odpowiedzialne za nałożenie wzoru piętna genomowego???
ZFP57 – białko jądrowe odpowiedzialne za utrzymanie wzoru piętna
w trakcie rozwoju zarodkowego; TNDM i BWS; AR
NLRP2 i NLRP7 – białka cytoplazmatyczne o nieznanej funkcji
NLRP2 – BWS – mutacja typu frameshift (ex.6)
NLRP7 i C6orf221 – AR – dziedziczna forma zaśniadu groniastego
(brak nałożonego piętna matczynego)
Analiza metylacji DNA
Izolacja DNA
PCR po trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację
MS-MLPA
modyfikacja DNA kwaśnym dwusiarczynem sodowym
sekwencjonowanie MS-PCR pyrosekwencjonowanie
analiza metylacji w
SNRPN
nieprawidłowy wzór metylacji
analiza delecji (FISH, MLPA)
delecja w locus 15q11-13
PWS/AS brak delecji
analiza RFLP, mikrosatelity
dziedziczenie oburodzicielskie
defekt piętna genomowego PWS/AS
patUPD AS
matUPD PWS
prawidłowy wzór metylacji
ponowna weryfikacja
kliniczna
wykluczenie PWS/ AS
potwierdzenie AS
analiza UBE3A
potwierdzenie obecności
mutacji AS
analiza UBE3A u rodziców
brak mutacji
???
Mechanizm genetyczny Ryzyko
Delecja <1%
UPD <1%
Defekt imprintingu i mutacja ≤50%
Defekt imprintingu bez mutacji <1%
Translokacja zrównoważona powstała de novo <1%
Odziedziczona translokacja zrównoważona. 25%
Ryzyko genetyczne
Przykładowe wyniki
Przykładowe wyniki
MAT PAT
Analiza metylacji (MS-PCR lub MS-MLPA)
Analiza delecji (FISH lub MS-MLPA)
Analiza UPD markery mikrosatelitarne dla 15q
Analiza AS-SRO (sekw.) Tylko AS
P1 P3
Uszkodzenia epigenotypu
CHOROBY EPIGENETYCZNE
nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne
Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych
1. choroby dziedziczące się w sposób mendlowski – najczęściej autosomalny (80%) dominujący (wyjątek: 71% chorób związanych z usuwaniem znaczników epigenetycznych – chromosom X); AR – 14% vs. 80% dla IEM
2. białka – składniki kompleksów wielobiałkowych zmiana poziomu/aktywności zaburzenie działania całego kompleksu
3. choroby wieloukładowe, o szerszym spektrum objawów klinicznych niż inne jednostki chorobowe; różna ekspresja fenotypowa trudny do identyfikacji defekt molekularny przed erą sekwencjonowania następnej generacji (NGS)
4. efekt fenotypowy – zmienny, nie dotyczy wszystkich komórek organizmu, a jedynie określonej frakcji komórek, dla których prawidłowego funkcjonowania konieczna jest właściwa aktywność regulatora epigenetycznego konieczność identyfikacji „target genes”
5. efekt fenotypowy – może zależeć także od poza epigenetycznych funkcji białka (np. HDAC8 – zespół Cornelia de Lange – koezynopatia – NIPBL)
Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych
44 jednostki chorobowe objawy kliniczne: 1. niepełnosprawność intelektualna (prawidłowa regulacja epigentyczna niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania układu nerwowego) 2. zaburzenia wzrastania – niskorosłość lub gigantyzm 3. wady kończyn (nieprawidłowa budowa paznokcia ↔ brachydaktylia) 4. zaburzenia immunologiczne
Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych
PRZYCZYNA CHOROBY
zaburzenia równowagi stanów transkrypcyjnych chromatyny (aktywny ↔ nieaktywny)
zaburzenia regulacji genów docelowych
Zespół Kabuki (NGS) 1. niskorosłość 2. małogłowie 3. dysmorfia (uszy, ptoza, brwi) 4. wrodzona wada serca (ASD, VSD, koarktacja aorty) 5. niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju psychoruchowego 6. drgawki padaczkowe / hypotonia 7. problemy z karmieniem 8. skolioza, nieprawidłowości w budowie kręgów, nadruchliwość stawów 9. wnętrostwo / wady budowy nerek 10. opuszki płodowe palców 11. CAL, hirsutyzm
KMT2D (MLL2) H3K4me3 aktywny
KDM6A H3K27me3 nieaktywny
↓ ekspresji genów docelowych (1/3 – homologi genów Polycomb i Trithorax – odpowiedź na działanie
czynników zewnętrznych, rytm dobowy, szlak mTOR)
DNMT1 – demencja, głuchota, neuropatia czuciowa; ataksja móżdżkowa, głuchota, narkolepsja
DNMT3b (de novo) – zespół ICF (OMIM #242860) niedobór odporności, niestabilności centromerów, anomalie twarzy, ID
DNMT3a – nadmierny wzrost + ID, dysmorfia twarzy (Nat Genet. 2014 Apr;46(4):385-8)
MECP2 – zespół Retta; zespół dup. MECP2 MBD1-4 – autyzm
Choroby MECP2-zależne
X-linked, Xq28
MECP2 – białko wiążące się do metylowanych sekwencji CpG
poza domeną wiążącą metylowane DNA (MBD), białko posiada domenę TRD, odpowiedzialną za oddziaływanie z pozostałymi białkami kompleksu hamującego transkrypcję (białka HDAC, metylotransferazy histonowe, inne białka odpowiedzialne za tworzenie heterochromatyny)
mutacje: delecje i m. nonsens w MBD i TRD związane są z objawami neurologicznymi
gen regulowany przez MECP2 – BDNF – czynnik odpowiedzialny za rozwój układu nerwowego (zapobiega apoptozie), różnicowanie komórek progenitorowych oraz procesy pamięci i uczenia się
MECP2
↓ miR-30a/d, miR-381, miR-495 - ↓ BDNF Mecp2 brain knockout – miR-29 i miR-146 (komórki nerwowe i glejowe)
BDNF miR-212, miR-132 ↓ MECP2
Choroby związane z MECP2
Zespół Retta
• głównie dziewczynki (1/10-15 tys.)
• regres rozwoju po okresie
prawidłowego rozwoju
• utrata nabytych umiejętności
posługiwania się rękoma
• regres mowy
• zaburzenia chodu
• stereotypie
• pourodzeniowa mikrocefalia
• zaburzenia oddychania
• chłopcy: encefalopatia
niemowlęca
Zespół duplikacji MECP2
• głównie chłopcy
• NI – ciężka - głęboka
• wczesnodziecięca hypotonia
• opóźniony rozwój motoryczny
• narastająca spastyczność
• predyspozycja do infekcji (75%)
• Napady padaczkowe (50%)
• cechy dysmorfii - dyskretne
• kobiety: nielosowa inaktywacja
chromosomu X
(całkowita lub znaczna)
Zespół ATR-X Zespół Rubinstein-
Taybiego Zespół Coffina-Lowry’ego
ATRX (Xq13.3) CREBBP (16p13.3) RSK2 (Xq22.3)
członek rodziny SWI/SNF;
represja transkrypcji; zmiany
w konformacji chromatyny
CREB binding protein, HAT,
acetylacja H3, oddziaływuje z
regulatorami cyklu
komórkowego c-FOS,
c-JUN
aktywacja białek CREB na
drodze fosforylacji;
fosforylacja histonów (H3S10)
NI głęboka, opóźnienie rozwoju
mowy, drgawki, hypotonia,
dysmorfia; zaburzenia rozwoju
kory mózgowej
NI (umiarkowana do głębokiej),
zaburzenia rozwoju mowy i
poznawczego, impulsywność,
zaburzenia koncentracji, otyłość,
dysmorfia twarzy, spowolnienie
wzrostu, niskorosłość, wady
szkieletu
NI (głęboka u chłopców),
opóźnienie rozwoju mowy,
małogłowie, wady serca,
dysmorfia twarzy, zaburzenia
budowy szkieletu
Zespół płciowo-rzepkowy
Zespół Say-Barber-Biesecker-Young-
Simpson
10q22.2 MYST4
(KAT6B)
acetylotransferaza
histonowa
Zespół Rubinstein-Taybi 16p13
22q13
CREBBP
(KAT3A),
EP300
(KAT3B)
acetylotransferaza
histonowa
Zespół brachydaktylia
niepełnosprawność intelektualna
(zespół microdelecyjny)
2q37.3 HDAC4 deacetylaza
histonowa
Zespół podobny do z. Wilsona-Turnera,
sprzężony z chromosomem X
(XLID, hypogonadyzm, ginekomastia,
otyłość, niskorosłość, dysmorfia)
Zespół podobny do z. Cornelia de Lange
(dysmorfia, zaburzenia wzrastania,
niepełnosprawność intelektualna,
zaburzenia budowy kończyn górnych,
zaburzenia neurologiczne i pokarmowe )
Xq13.1 HDAC8 deacetylaza
histonowa
Zespół Kleefstra 9q34 EHMT1
MLL3
metylotransferaza
histonowa
Zespół Weavera
(wysoki wzrost, specyficzny
wygląd twarzy, NI)
7q36.1 EZH2
Zespół Wiedemann-Steiner
(niskorosłość, NI, dysmorfia) 11q23.3 MLL
Zespół Kabuki
(NI, wada serca, wady układu
moczowego, niedosłuch, hypotonia,
pourodzeniowy niedobór wzrostu)
12q13.12 MLL2
Zespół Sotosa
Zespół Weavera 5q35 NSD1
Autyzm 1q21.3 SETDB1
XLID (NI sprzężona z chr. X) Xp11.22 PHF8
demetylaza
histonowa
NI (NGS-trio analysis) 1q32.1 KDM5B
XLID (NI sprzężona z chr. X +
niskorosłość, ataksja, wzmożone
napięcie mięśniowe, hyperrefleksja)
Xp11 KDM5C
(JARID1C)
XLID
(NI sprzężona z chr. X, brak
rozwoju mowy, drgawki,
wady układu moczowo-
płciowego, problemy ze
skórą, niska linia włosów na
karku, szeroko rozstawione
sutki, nadmiar włosów na
tułowiu, dysmorfia)
Xq24 UBE2A
transferaza
ubikwitynowa
XLID
(NI sprzężona z chr. X;
zespół podobny
do zespołu Turnera)
Xp11.22 HUWE1
Zespół Coffina-Lowry’ego
(NI sprzężona z chr. X) Xp22 RPS6KA3
kinaza białek
histonowych i czynników
transkrypcyjnych
Zespół Nicolaidesa-Baraitsera 9p24.3 SMARCA2 podjednostki
kompleksów
remodelujących
chromatynę
Zespół Coffina-Sirisa
11p13.2 SMARCA4
1p36.11 ARID1A
Zespół CHARGE 8q12 CHD7
helikaza DNA autyzm i zaburzenia ASD 14q11.2 CHD8
zespół α-thalasemia-NI (ATR-X) Xq13 ATRX
* niskorosłość * opóźnienie rozwoju
psychoruchowego * NI
* dysmorfia * zaburzenia kostno-szkieletowe
* wrodzona wada serca * brak płytki paznokciowej
piątego palca