Ti'irk NorOfiriirji Dergisi 11: 32 - 36, 2001 Banttquog/u: Tiip Gelifimillde Etalloliill Etkisi

Tavuk EmbriyonalEtanoliin Etkisi

Erken DonemTiip Geli§iminde

The Effects of Ethanol on

Early StageNeural Tube DevelopmentChick Embryos

In

MUSTAFA BARUTC:::UOGLU, MEHMET SELC:::UKi,

SEDA VATANSEVER, AHMET $DKRD UMUR, SEVINC::: iNAN

Celal Bayar Universitesi TIp Fakultesi, Noro;;irurji Anabilim Dah (MB, MS, A$U),

Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dah (SV, si) Manisa

Geli;; Tarihi: 27.10.2000 <:=:> Kabul Tarihi: 10.12.2000

Ozet: Bu ara;;tumada beyaz Leghorin tipi tavukembriyolannda, noral tlip kapanma defekti geli;;imi lizerineetanollin etkisi 1;;lkmikroskopu altmda histopatolojik olarakara;;tmldl. C;:ah;;mamlzda 40 adet (n: 40), spesifik patojeni<;ermeyen (SPF), fertil, beyaz Leghorin tipi tavuk yumurtasliki e;;it gruba aynldl (n: 20). Her iki grup 37, 8°C ± O,2°C'da30 saat inkube edilerek embriyonel geli;;imlerinin 8.basamagl11a ula;;tmldllar. Birinci grup kontrol grubunuolu;;turdu. ikinci grup <;ah;;ma grubu olup, in-ovo 42 mg/dl tek doz etanol verildi. Her iki gruptaki yumurtalar 48.ve 72. saatler sonunda a<;llarak 1;;lk mikroskopu altmdahistopatolojik olarak degerlendirildi. 48. ve 72. saatlerdea<;llan yumurtalarda, kontrol grubunun tamammda normalembriyolojik geli;;imin devam ettigi, plasentaldamarlanmanm olu;;tugu, kalp aktivitesinin ba;;ladlgl venoral tlipun kapandlgl gozlendi. Ancak <;ah;;ma grubundakiembriyolann kontrol grubundakilere gore belirgin geli;;megeriligi gosterdikleri, mikrosefalik olduklan ve noral tlipkapanma defekti ~Iu;;tugu gozlendi.

Abstract: In this study, the effects of ethanol on the formationof the neural tube closure defects in White Leghorn chickembryos were investigated under the light microscope.Fertile specific pathogen free (SPF), White Leghorn eggs (n:40) were divided into two groups (n: 20). Both of them wereincubated at 37.8QC ± 0.2QC and 65-75 % relative humidityduring 30 hours and the eighth stage of the embryonicdevelopment was reached (Hamburger and Hamilton). Thefirst group was control group (n: 20). The second was the

study group and it was given in-ovo a single dose, 42 mgr /100 cc of ethanol. The eggs in both groups were openedand investigated under the light microscope at the end -ofthe 48'" and 72nd hours. The embryos in the control groupwere developed normally according to Hamburger andHamilton classification. The normal placental vesseldevelopment, cardiac activity and closure of the neural tu bewere seen. However in the study group, microcephaly,neural tube closure defect and significant developmentalretardation were noticed as compared to the control group.

Anahtar Kelimeler: Erken donem tavuk embriyosu, etano!,noral hip defekti

Key words: Early stage chick embryo, ethanol, neural tubedefect,

GiRi$

Hamjleligin ilk aymda, embriyonal geli;;iminkritik doneminde, alkol kullammmm fetal alkol

sendromuna (FAS) ve noral hip kapanmadefektlerine neden oldugu bilinmektedir (12). Nora]hip kapanma defektleri, kranio;;izis totalis,anensefali, myelomeningosel ve ansefaloseli i<;eren

Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001

bir grup konjenital malformasyonlardu (7). Fetalalkol sendromu, geli~me geriligi, kraniyofasiyalmalformasyonlar, kalp anomalileri ve noral hipdefektleri ile karakterize olup ve tiim fetal alkol<;ah~ma modellerinde en slk elde edilen defektembriyonel geli~me geriligidir (12, 13). Tavukembriyolannda etanolUn neden oldugu serebralhipoplazinin elde edildigi <;ah~malarda, inkiibasyonba~langlcmda (0.giin) verilen tek doz etanoliin, erkendonemde belirgin geli~me geriligine neden oldugunugosterilmi~tir.(1, 13, 14). Ancak etanoliin molekiilerdiizeydeki bu teratojenik etkisi tarn olaraktammlanabilmi~ degildir. Kraniyal noral krest hiicregeli~iminde, kontrollii hiicre olUmii normal vebeklenen bir siire<;tir. Yapllan <;ah~malar kraniyalnoral krest hiicrelerinin, etanolUn indiikledigiapoptozis nedeniyle kontrol dl~l elimine edildiginidii~iindiirmektedir (12). Diger yandan, literatiirdeerken donem embriyolarda radyoaktif timid in velosin kullamlarak, DNA ve protein sentezinin etanoltarafmdan inhibe edildigi gosteren <;ah~malar davardlr (13).Bu sonu<;, geli~im halindeki dokulardakiyogun protein ve niikleik asit ihtiyaClmnkar~llanamamasl sonucu ortaya <;lkan hipoplaziyia<;lklamaktadu. Yapllan <;ah~malar, geli~megeriliginin kan etanol seviyesi ile yakmdan ili~kilioldugunu ve beyin dokusunda cAMP veprostoglandin E2 (PGE2) seviyelerinin yiikseldiginigas termi~tir.

Bu <;ah~mamlzda erken donem tavukembriyolarma in-ovo verdigimiz tek doz etanol ile,48 ve 72 saat sonunda elde ettigimiz histopatolojiksonu<;larliteratiir sonu<;lanyla uyumludur. Gebelikteerken donemde kullamlan alkoliin fetiis iizerinegeli~imsel gerilik ve noral tiip kapanma defektiolu~turma risksi oldugu deneysel olarak tavukembriyolannda gosterilmi~tir.

GERE<; VE YONTEM

Manisa Tavuk Hastahklan Ara~tlrma ve A~lUygulama Enstitiisii' nden, fertil, spesifik patojeni<;ermeyen (SPF), slfmncl giin beyaz Leghorin tipiyumurtalar almdl (n: 180 tUrn <;ah~ma i<;in). Buyumurtalarm aguhklan ol<;iiliip verilecek olan 42mg/ dl alkol dozu mg/kg <;evirilip,yumurta ba~madii~ecek miktan hesaplandl (» 0,5 g/kg/ yumurta)(2,12, 13, 14). Daha soma bu yumurtalar 37,8 QC±0,2 QC' ta % 65-75 bagll nemlilikte 30 saat enkiibeedilerek, Hamburger ve Hamilton slmflamasma goreembriyonel geli~imin sekizinci basamagma ula~tmldl(6). Bu a~amada yumurtalar iki e~it gruba aymldl.Kontrol grubundaki yumurtalar tekrar iki e~it klsma

Barutquoglu: Tup Geli~imil1de Etanoliin Elkisi

aynhp (grup a,b) grup a'ya herhangi bir maddeverilmeden inkiibasyona devam edildi. Grup b'dekiyumurtalara, iizerlerinde kii<;iikbir delik a<;llarak,G27 igne ile embriyo diskinin altma, <;ah~magrubunaverilen etanol ile e~it hacimde steril serum fizyolojikverildi. C::ah~magrubu olan ikinci gruba yine G27igne kullamlarak embriyo diski altma 42 mg/ dlkonsantrasyondaki etanolden 0.05 cc verildi.

Her iki gruptaki yumurtalar 48. ve 72. saatlersonunda a<;lldlve % 10 formolin ile 24 saat siireyletespit edildi. Daha soma l~lk mikroskopu aItmda,embriyolar biitiin olarak degerlendirildi. Se<;ilenembriyolann, hemotoksilen ile boyamp alkol iletespit edildikten sonra, biitiinsel preparatlanhazulandl. Diger embriyolardan parafin bloklarhazlrlandl. Bu bloklardan 7 mikron kalmhgmdakesitler ahmp hematoksilen-eosin ile boyandl. Dahasoma l~lk mikroskopu altmda <;ah~ma grubu ilekontrol grubu kar~lla~tmlarak incelendi.

SONU<;LAR

Kontrol grubundaki embriyolann normalgeli~imlerine devam ettikleri, Hamburger veHamilton slmflamasma gore olmalan gerekenembriyonel basamakta olduklan gozlendi. Buembriyolarda plasental damarlanma, kalp kesesiolu~umu, kalp aktivitesi ve kapanml~ noral tiipgozlendi. Geli~imsel gerilige ya da rnalformasyonarastlanmadl (Resim la, Ib).

48 saatlik, alkol verilen tavuk embriyolanndamakroskopik olarak geli~imsel gerilik, mikrosefali venoral tiipe uyan bolgede doku organizasyonbozuklugu goriildii (Resim 2a, 2b).

Seri olarak alman parafin kesitler, sistematikrastgele ornekleme yontemi kullamlarak se<;ildiveHematoksilen-Eozin ile boyandl. I~lkmikroskobunda, Cavalieri yontemi kullamlarakyapllan, geli~en beyin vezikiillerinin hacim ol<;iimlerisonucunda alkol uygulanml~ olgularda hacmin(0.070 mm3) normal gruba (0.165 mm3) gore yanyanya azalml~ oldugu ve sonu<;lann istatiksel olarakanlamh oldugu gozlendi (p< 0.05). Bu bulgulannmakroskobik olarak goriilen mikrosefaliyi,mikroskobik olarak destekledigi goriildii.

Seri alman kesitlerin histolojik incelenmelerisonucunda, noral tiibiin ba~ bolgesinden itibarenkapanmaya ba~ladlgl fakat makroskobik olarak dokuorganizasyon bozuklugunun goriildiigii bolgedenoral tiip kapanma defekti oldugu saptandl. Nbral

Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001

$ekil 1a: 30 saa tlik normal geli§im gosteren, noraltubu a<;lk embriyonun hematoksilen ileboyanml§, butUn olarak gorunumu. x 40,B: ba§, K: kuyruk, N: noral tUp, b: ba§klsmmdan, c: govde kIsmmdan, d: kuyrukklsmmdan ge<;enkesitler.

$ekil 1b: 48 saatlik, normal geli§im gosteren, somit saYIsIartml§, noral tUbu kapah, plasentaldamarlanmasl olu§mu§, kardiyak aktivitesiba§laml§ embriyonun diseksiyon mikroskopualtmda gorunumu. x 10, B: ba§, K: kuyruk, N:noral tiip, (*) geli§en kalp.

Barutquoglu: Tiip Geli~imillde Etal1oliil1 Etkisi

$ekil 2a :30. saatte etanol verilip, 48. saatte a<;llan,geli§megeriligi ve noral tup doku organizasyonbozuklugu gosteren embriyonun hematoksilenile boyah, butun olarak gorunumu. x40, ('tc):noral tup uzerinde dezorganize klslm. a: ba§kIsmmdan, b: govde klsmmdan, c,e,g : noral tiipuzerindeki dezorganize kIslmdan, h: kuyrukklsmmdan ge<;enkesitler.

Resim 2b :30. saatte etanol verilip, 48. saatte a<;llan,geli§megeriligi ve noral tUp doku organizasyonbozuklugu gosteren embriyonun, dezorganizeklsmmdan ge<;enkesitin, hematoksilen ile boyahgorunumu. x200, N: noral tup, (.): bazallamina.

hipu olu~turan ektodermal hucrelerin ilk kesitlerdenormal goruldugu ve bazallaminanm da korundugugozlenirken, bunu takip eden kesitlerde verilenetanoli.i.netkisi ile normal geli~imin etkilendigi, noralektoderm hucrelerinin butunli.i.gunun bozuldugu,bazallamianm yer yer kayboldugu ve noral hipunbelirgin olarak a<;lkoldugu goruldu (Resim 3a, 3b).

TARTI$MA

Embriyonel geli~imin kritik periyodundaembriyonun maruz kaldlgl kimyasallann geli~im

Turk Noro~irurji Dergisi 11: 32 - 36, 2001

$ekil 3a: 72. saatte a<;llan, etanol verilmi~ embriyo.Makroskopik olarak normal gorUlen klslmdange<;en kesitin, hematoksilen ile boyahgorilnilmii. x400, N: noral tilp, (•• ): bazallamina.

kusurlanna neden olduklan bilinmektedir (1, 2, 3,4,

6,8, 9, 10, 11, 12, 15). Bu kritik periyod, hamileliginilk aYl olup gastrulasyon olarak bilinen ve insandaembriyonun blastokist haline ge<;ip implantasyonunger~ekle§mesiyle ba§laYlp (7 - 8. gunler) 2. haftason una dogru birbirini izleyen iki evredir. Bu donem,u~ germ yapragmm organizasyonu ile dokularmorganlan olu§turmak uzere farkhla§tJgl kritikdonemdir.

Erken donem tavuk embriyosu modeli,memelilerde embriyonel geli§imin ilk ayma uyan vekimyasallarm embriyonel geli§im uzerine etkilerininincelendigi ideal bir modeldir. Erken donem tavukembriyolannda, diazepam, verapamil, kafein,papaverin ve lokal anesteziklerin noral tup kapanmadefektine neden olduklan deneysel <;ah§malarlagosterilmi§tir (5, 8, 9, 10, 11). Bu model, etanolunnoral krest hucrelerinin geli§imleri uzerine etkilerininincelenebildigi, dolaYlslyla hamileligin ilk aymdamaternal etanol tuketiminin fetal alkol sendromu

Barut~uoglu: Tfip Geli~imillde Eta 110111 11 Etkisi

$ekil 3b: 72. saatte a<;llan, etanol verilmi~ embriyo.Makroskobik olarak doku organizasyonbozuklugunun goriildiigil klsmmdan ge<;enkesitin, hematoksilen ile boyalt goriinilmii. x400,N: a<;1knoral tilp, (•• ): bazallamina.

(FAS) olarak bilinen, geli§imsel gerilik, noral tiipkapanma defektleri ve kraniyofasiyal defektlereneden olabilecegini gostermektedir.

EtanolUn uygulandlgl embriyonel geli§imbasamagmm onemi vardlr. Noral tupun kapandlgl,ileri eyre embriyolara verilen aym miktar etanolUnembriyo geli§iminde noral tup uzerinde etkisigozlenmemi§tir. Enhart ve ark. doza baglmh olarak,embriyolarda geli§en defekt insidansmm arttlgmlbildirmi§lerdir (3). Pennigton ve ark. ~ah§malanndain-ovo verilen tek doz 1 g/kg etanolun tavukembriyolanmn geli§imlerinin yedinci gununde totalembriyo aglrhgmm ve beyin dokusu aglrhgmm yanyanya azaldlgml bildirmi§lerdir (13). Yapllan~ab§malar tavuk embriyolanmn inkubasyonlannmdokuzuncu gununden once yani embriyonelkaraciger dokusunda klas 1 alkol dehidrogenazenzim uretimi ve aktivitesi ba§lamadan verilen

etanolun metabolize olmadlgml gostermi§tir. in-ovaverilen 42 mg/ dl etano180-100 mg/ dl olan artalama

Tiirk Noro§iriirji Dergisi 11: 32 - 36, 2001

intoksikasyon dozunun <;ok altmdadu. Bu daetanohin, metabolitleri olan asetaldehid ve asetattandaha fazla teratojen oldugunu du~undurmektedir(12). Her ne kadar, geli~memi~ karaciger dokusuyuzunden metabolize olmaml~ ethanolun etkisi, bumethodun insanlar i<;in ge<;erli olamayacagmldu~undurse de, kronik alkolik anne kamnda benzermiktarda serbest alkolun surekli olarak bulunduguhatIrlanmahdu. Bununla beraber, kritik donemdekitek doz etanolun dahi, embriyo uzerine olumsuzetkisi olabilecegi dikkati <;ekmi~tir.

Sonu<; olarak gastrulasyon donemindekiembriyoya etanohin major etkisi noral krest hucrepopulasyonunun geli~imini duraksatmasl ve hucretoplulugunun kaybldlr. Bu etkinin mekanizmasl netolarak a<;lklanabilmi~ degildir. Noral doku geli~imii<;inkritik olan hucreler araSI sinyalin kaybma nedenolabilecegi gibi, etanolun indukledigi kontrolsuzapoptozisin noral tup kapanma defekti geli~imindensorumlu olabilecegi du~unUlmektedir.

C::ah~mamlz du~uk doz alkolkonsantrasyonlarmda bile embriyonun geli~imselolarak kontrol grubuna gore belirgin ~ekilde gerikaldlgml ve noral tup kapanma defektiolu~turdugtinu gostermi~tir.

Bu <;ah~ma 2-6 Ekim 2000 tarihleri arasmdaistanbulda yapIlan, 28. InternatIOnal Society forPediatric Neurosurgery Kongresi' nde poster bildirisiolarak sunulmu~tur.

YaZl~ma Adresi: Prof. Dr.Mehmet Selc;uki1403 sokak No: 5 / 835220Alsancak / izmirTel: (232) 422 0302E-mail: mselcuki@yahoo.com

KAYNAKLAR

1. Bupp Becker SR,Shibley lA Jr:Teratogenicity of ethanolin differtent chicken strains. Alcohol Alcholism V0133No 5; 457-464, 1998

2. Cartwright MM, Smith SM: Stage dependent effects ofethanol on cranial neural crest cell development: partialbasis for the phenotypic variations observed in fetal

Barutquoglu: Tiip Geli§iminde Etanoliin Etkisi

alcohol syndrome. Alcholism: Clinical andExperimental Research Vol19 No 6; 1454-62,December1995

3. Ernhart CB, Jokol RI, Martier S, Moron P, Nadler 0,Ager JW, Wolf A: Alcohol teratogenicity in the human;A detailed assessment of specificity, critical period andthreshold. Am J Obstet Gynecol156; 33-39, 1987

4. Gilani S, Persaud TV: Embryonic development in thechick following exposure to ethanol, acetaldehyde andcyanamide. Annals of Anatomy 174 (4); 305-308,1992

5. Giiney 0, Selc;ukiM, Unlii A, Bagdatoglu C: The effectof diazepam on the development of neural tube defectsin the chick embryos. Turkish Neurosurgery 9 (1-2);44-48, 1999

6. Hamburger V, Hamilton HL: A series of normal stagesin the development of the chick embryo. J Morph 88;49 - 92, 1951.

7. Dirks PB and Rutka JT: The Genetic Basis ofNeurosurgical Disorders. Youmans JR NeurologicalSurgery, Fourth Edition CD-ROM In. Volume Il, PartVI, Chapter 31, 1994: Record: 9814-9832

8. Lee H, Bush KT, Nagele RG: Time-lapse photographicstudy of neural tube closure defects caused byxylocaine in the chick. Teratology 37; 203-209, 1988

9. Lee H, Nagele RG: Neural tube closure defects causedby papaverine on explanted early chick embryos.Teratology 20; 321-331, 1979

10. Lee H, Nagele RG: Toxic and teratologic effects ofverapamil on early chick embryos. Evidence for theinvolvement of calcium in neural tube closure.Teratology 33; 203-211, 1986

11. Lee H, Nagele RG, Pietrolungo JF:Toxic and teratologiceffects of caffeine on explanted early chick embryos.Teratology 25; 19-25, 1982

12. Martina M.Cartwright, Susan M. Smith: Increased celldeath and reduced neural crest cell numbers in ethanol­

exposed embryos; partial basis for the fetal alcoholsyndrome phenotype. Alcholism: Clinical andExperimental Research V0119 No 2; 378-386, April 1995

13. Pennigton S, Kalmus G: Brain growth during ethanolinduced hypoplasia. Drug and Alcohol Dependence20; 279-286, 1987

14. Pennington SN: Alcohol metabolism and fetalhypoplasia in chick brain. Alcohol Mar-Apr; 5 (2): 91­94, 1988

15. Susan E. Maier, ]ennifer A. Miller, Jennifer M.Blackwell, James R. West: Fetal alcohol exposure andtemporal vulnerability; regional differences in cell lossas a function of the timing of binge-like alcoholexposure during brain development. Alcholism:Clinical and Experimental Research 1999: Vo123 No 4;726-734