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Celebrado anualmente, el workshopMRAMA, de un contenido aplicado y defuturo, amplía y difunde los conoci-mientos teóricos y prácticos sobre mé-todos innovadores para detectar, con-tar, aislar y caracterizar rápidamentelos microorganismos y sus metabolitos,habituales en los alimentos y el agua. El workshop cuenta cada año con elprofesor Dr. Daniel Y. C. Fung, de laKansas State University (KSU;Manhattan, Kansas, EUA) como po-nente principal, que aborda cuestio-nes básicas relacionadas com los mé-todos rápidos y miniaturizados y laautomatización en microbiología ali-mentaria. Además, se ofrecieron lassiguientes ponencias: • Evolución de la seguridad y los mé-todos microbiológicos alimentarios:breves consideraciones y comenta-rios. Dra. Cécile Lahellec, AgenceFrançaise de Sécurité Sanitaire desAliments, Alfort, Francia.• La polymerase chain reaction (PCR).Dr. Armand Sánchez Bonastre, UAB.• Resultados del proyecto de investi-gación FoBos. Dr. Fabrizio Ceciliani,Università degli Studi di Milano, Milán,Italia. • Evitar los patógenos en el entornohumano. La UE decide cómo. Dr.Stephen Wessels, DHI (DanishHydraulic Institute), Hørsholm,Dinamarca.• Requisitos y aspectos prácticos pa-ra validar y aplicar métodos alternati-vos en el laboratorio de microbiología.David Tomás Fornés, Ainia CentroTecnológico, Paterna.• Transgénicos, nutrigenética y nutri-genómica en alimentación. Dr. DanielRamón Vidal, Biópolis SL, Paterna.• Campylobacter spp., Salmonellaspp. y Listeria monocytogenes: as-pectos epidemiológicos y microbioló-gicos. Sarah Lafuente van der Sluisy Dra. Mercè de Simón Serra,Agencia de Salud Pública deBarcelona.Durante tres días, se realizaron unassesiones prácticas en el laboratorio,en las que se trabajó con algunos

equipos y los productos más innova-dores del campo de los métodos rá-pidos y la automatización. Y se orga-nizaron tres talleres: • Uso de los recursos para microbio-logía predictiva disponibles en inter-net. Montse Vila Brugalla, Agencia deSalud Pública de Barcelona. • Inmunosensores electroquímicospara detectar bacterias patógenas.Dra. María Isabel Pividori Gurgo ySusana Liébana Girona y TamaraLaube Chávez, UAB. • Cuantificación de micotoxinas y alér-genos por inmunodifusión lateral.Generon Srl, Santa Maria diMugnano, Italia.Se celebró también una mesa redon-da, que reunió a ponentes y profesio-nales de empresas de microbiologíay laboratorios de análisis, moderada

por el Dr. José Juan Rodríguez Jerez,investigador principal del grupo de in-vestigación BIORISC de la UAB yprofesor del Departamento deCiencia y Tecnología de losAlimentos. Con la mesa redonda, so-bre la instrumentación en microbio-logía de los alimentos, las tendenciasdel mercado mundial y otros temasde actualidad del sector, y las ponen-cias del workshop, se constató la im-portancia de la automatización en ellaboratorio; la creciente aplicación delanálisis por PCR; la diversidad de ne-cesidades en cuanto a métodos mi-crobiológicos, según el sector (p. ej.,productos frescos, comidas prepara-das, etc.); así como los progresos enel desarrollo de soluciones que apor-tan rapidez, precisión, sensibilidad yespecificidad.

X Workshop “Métodos rápidos yautomatización en

microbiología alimentaria”

Del 22 al 25 de noviembre de 2011, tuvo

lugar el X aniversario del Workshop sobre

Métodos rápidos y automatización en

microbiología alimentaria (MRAMA), en el

salón de actos de la Facultad de Veterinaria

de la Universitat Autònoma de Barcelona,

dirigido por los Drs. Marta Capellas Puig y

Josep Yuste Puigvert, profesores de Ciencia y

Tecnología de los Alimentos, y organizado por

el Centre Especial de Recerca Planta de

Tecnologia dels Aliments (CERPTA) y el

Departamento de Ciencia animal y de los

alimentos de la UAB.

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Las exposiciones a cargo de las em-presas de microbiología fueron otrasde las actividades del workshop. Enellas se explicaron y mostraron diver-sos productos, presentando su fun-cionamiento, ventajas y limitaciones,y las técnicas en que se basan.Estas empresas, que patrocinaron elX workshop MRAMA, fueron: 3MEspaña, AES CHEMUNEX España,Becton Dickinson (parte de BDDiagnostic Systems), bioMérieuxEspaña, Bio-Rad Laboratories,Bioser, BIOTECON Diagnostics(Alemania), CEERAM (Francia),Generon, IDEXX Laboratorios, IUL,IZASA (parte de Werfen Group), LifeTechnologies, MicroPlanetLaboratorios (distribuidor deBioControl Systems y LIOFILCHEM),Millipore Ibérica (parte de Merck),

Nirco (distribuidor de NeogenEurope), Oxoid(parte de ThermoFisher Scientific), y Sigma-AldrichQuímica. También han colaborado con elworkshop MRAMA: DiverseyEspaña, ACONSA (Asesoría yConsultoría Sanitaria), la AssociacióCatalana de Ciències del’Alimentació (ACCA), EyPASA –Revista Alimentaria (publicación ofi-cial del workshop), la SociedadEspañola de Microbiología (SEM) –Comisión de Normalización yValidación, y la Sociedad Españolade Químicos Cosméticos (SEQC).Como es habitual, el workshop con-tó con una gran variedad de partici-pantes (188) de diversos colectivosnacionales e internacionales: ade-más de profesores y estudiantes de

diversas universidades, y personalde otros centros de investigación y laadministración; asistieron participan-tes procedentes de laboratorios; ase-sorías y consultorías; e industrias delos ámbitos agroalimentario (entreotros, los sectores cárnico y avíco-la, lácteo, cacao, bebidas analcohó-licas –aguas, zumos de frutas, bebi-das refrescantes– y alcohólicas –vi-tivinícola–, alimentación infantil, in-gredientes y aditivos), microbiológi-co, cosmético, productos para limpie-za y desinfección, electrónico, etc.El XI workshop MRAMA se celebra-rá del 20 al 23 de noviembre de2012.A continuación, incluimos tres de lasponencias (dos en español y una eninglés) que mayor interesés suscita-ron en el transcurso del MRAMA.

IntroducciónEl empleo de métodos alternativos su-pone considerables ventajas frente alos métodos convencionales o de re-ferencia, como son la rapidez, auto-matización, interpretación de resulta-dos, etc. No obstante, pueden darsesituaciones que limiten su uso en de-terminadas condiciones o presentenlimitaciones que deban ser evaluadasen cada caso particular, debiendo de-mostrarse que estos métodos permi-tan obtener resultados equivalentes almétodo de referencia y que presentaventajas frente al mismo.Estos métodos alternativos para elanálisis microbiológico de alimentosya es en la actualidad una realidad,siendo ampliamente empleados tan-to por laboratorios de autocontrol co-mo en laboratorios de control oficialde alimentos. No obstante, no solo es de interéspara las empresas y laboratorios decontrol el empleo de métodos alter-nativos en el ámbito del cumplimien-to de criterios de seguridad alimen-taria y de higiene de los procesos,sino que en muchas ocasiones es

necesario también garantizar crite-rios relacionados con la conserva-ción y estabilidad de los alimentos,de forma que se pueda disponer deforma rápida de información acercade la potencial presencia de micro-organismos alterantes que puedenprovocar importantes pérdidas eco-nómicas, en cuyo caso también elempleo de métodos rápidos y auto-matizados es de gran interés y lacomprobación de que este métodoes válido para el uso previsto y esmás importante si cabe, puesto queen este caso es frecuente que exis-ta una gran diversidad de microorga-

nismos alterantes y de matrices enlas que detectarlos.

Aspectos previos relativos ala validez de los métodos al-ternativosLa norma UNE-EN ISO/IEC 17025en su apartado 5.4.2 establece que“El laboratorio debe utilizar métodosde ensayo que satisfagan las nece-sidades del cliente y sean apropia-dos para el uso previsto”.Por tanto, debe tenerse en cuenta elámbito de aplicación, tanto por el la-boratorio en cuanto a la selección delos procedimientos de ensayo y su

Requisitos y aspectos prácticospara validar y aplicar métodos

alternativos en el laboratorio demicrobiología

David Tomás Fornés Ainia Centro Tecnológicodtomas@ainia.es

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validación, como por el organismode acreditación en las evaluacionesque realice.Además, la norma establece que“cuando el cliente no especifique elmétodo a utilizar, el laboratorio debeseleccionar los métodos apropiadosque hayan sido publicados en nor-mas internacionales, regionales onacionales, por organizaciones téc-nicas reconocidas o en libros o re-vistas científicas especializados oespecificados por el fabricante deequipos”.(ENAC. NT-32 rev. 2 julio2010http://www.enac.es/web/enac/documentos-descarga)Así pues, y en primer lugar, y antesde empezar con las experienciasprácticas de implantación del méto-do alternativo, es necesario verificarla adecuación al uso del mismo, pa-ra lo que debemos recopilar toda lainformación disponible, tanto relati-va a los datos disponibles sobre lacaracterización del método, comoaquellos incluidos en la ficha técni-ca que nos proporcione el fabrican-te del método (en el caso de kits ométodos comerciales) o en el artícu-lo o método normalizado que vaya-mos a emplear.Aspectos importantes que nunca de-bemos obviar para garantizar la ade-cuación del método son:• Plazo de obtención de resultados

(con y sin confirmaciones). • Matrices objeto de análisis (limi-

taciones, preparación especial dedeterminadas muestras…).

• Inversión en equipamiento.• Cualificación del personal (inter-

pretación de resultados, manipula-ción…).

• Infraestructuras de laboratorio.• Validación o reconocimiento por

organismos nacionales o interna-cionales.

• Y por supuesto… el coste por en-sayo (reactivos, personal…).

Una vez identificados todos estosaspectos, podemos pasar a revisarcon más detalle los datos relativos ala validación del mismo, así como la

información técnica disponible en li-teratura científica. Este último as-pecto es importante tanto en el ca-so de los kits (puesto que nos pue-de dar una visión independiente delfuncionamiento del mismo) como enrelación con su aplicación e implan-tación en determinados laboratoriosde referencia.Desde un punto de vista práctico, enrelación con los métodos alternati-vos, el laboratorio se enfrenta bási-camente con dos posibilidades:• Métodos comerciales o “kits”.• Métodos públicos, como por ejem-

plo los disponibles en literaturacientífica o los desarrollados porLaboratorios de Referencia.

Según se recoge en la Norma ISO17025:2005 que establece los requi-sitos generales para la competen-cia de los laboratorios de ensayo ycalibración, (punto 5.4.5.2): “se de-ben validar los métodos no normali-zados, los métodos diseña-dos/desarrollados internamente, losmétodos normalizados utilizadosfuera de su campo de aplicación pre-visto y las ampliaciones y modifica-ciones de los métodos normalizadoscon el fin de comprobar que sonapropiados para el uso previsto”.Por tanto y en ambos casos, a efec-tos del reconocimiento de la valideztécnica del método de ensayo porparte de terceros (p. ej., organismosde acreditación) es necesario dispo-ner de datos de validación acorde aun esquema internacionalmente re-conocido, bien siguiendo el esque-ma de la Norma ISO 16140 –Protocolo para validación de méto-dos alternativos, bien en el docu-mento “Guidelines for validation ofMicrobiological Methods of analysis”publicado por AOAC.

En general y en ambos casos, losparámetros que se deben obtenerpara considerar una validación com-pleta (ver punto 3) son:En ambos casos, una validacióncompleta requiere la organizaciónde estudios interlaboratorios. Esteaspecto podría obviarse en determi-nados casos en los que el métodosolo va a ser empleado por un úni-co laboratorio o las técnicas emple-adas no son de uso común por par-te de un número significativo de la-boratorios.Cualquier aspecto de la validacióndel método que no haya sido con-templado en la validación inicial delmétodo tendrá que ser complemen-tado debidamente por el laboratorioque vaya a emplear el mismo. No sepuede modificar el método.Por otra parte, tomando al pié de laletra el contenido del Reglamento envigor relativo a los criterios microbio-lógicos aplicables a los productosalimenticios (Reglamento (CE) nº2073/2005 de 15 de noviembre de2005, DOCE L 338 22/12/05) se re-coge en su considerando 24 que “losresultados de las pruebas dependende los métodos analíticos utilizadosy, por lo tanto, cada criterio microbio-lógico debe asociarse a un métodode referencia determinado” pero in-dica claramente que “los explotado-res de las empresas alimentariaspueden usar métodos analíticos di-ferentes a los métodos de referen-cia, en particular métodos más rápi-dos, siempre que estos métodos al-ternativos produzcan resultadosequivalentes”.Así pues desde un punto de vista le-gal se reconoce el empleo de este ti-po de métodos en el ámbito de la le-gislación actual, si bien posterior-

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• Eficacia relativa • Linealidad y exactitud relativa• Sensibilidad relativa • Límites de detección y cuantificación• Especificidad relativa • Sensibilidad relativa• Nivel de detección relativa • Especificidad y selectividad• Inclusividad y exclusividad • Reproducibilidad y repetibilidad

MÉTODOS CUALITATIVOS MÉTODOS CUANTITATIVOS

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mente incluye en el artículo 5 punto5 que “Se autorizará el uso de mé-todos alternativos cuando los méto-dos estén validados con respecto almétodo de referencia establecido enel Anexo I y, si se utiliza un métodoregistrado, certificado por tercerosconforme al protocolo de la normaEN/ISO 16140 u otros protocolos si-milares internacionalmente acepta-dos”. En la práctica, la legislación in-dica la exigencia de validar el mé-todo en cualquier caso, pero solo esnecesario que esté certificado en elcaso de los “métodos comerciales”o kits y no en el caso de los méto-dos públicos. Por último, indicar que también serefleja que “si el explotador de la em-presa alimentaria desea utilizar mé-todos analíticos distintos a los vali-dados y certificados tal y como se hadescrito en el párrafo anterior, losmétodos deben validarse conformea protocolos internacionalmenteaceptados y su uso deberá ser auto-rizado por la autoridad competente”.Es decir, de nuevo tenemos la nece-sidad de validar estos métodos, aun-que cabe la posibilidad de emplearmétodos no certificados, si la auto-ridad competente lo autoriza y, portanto, su uso queda restringido alámbito de actuación que tenga fija-do las autoridades sanitarias.En cualquiera de los casos anterio-res, y suponiendo que el método al-ternativo está validado de forma co-rrecta (esté o no certificado) el la-boratorio siempre debe “confirmarque puede aplicar correctamente losmétodos antes de utilizarlos para losensayos”.

Validación de un método al-ternativo (norma UNE-EN ISO16140:2003)La validación inicial o completa, re-quiere de una importante puesta apunto previa del método de ensayo(ver fig 1) y supone un protocolo ex-tenso que utiliza un diseño de expe-riencias y unos criterios de evalua-

ción de resultados preestablecidos yreconocidos internacionalmente (co-mo por ejemplo los recogidos en laNorma UNE-EN ISO 16140:2003).Fruto de esta validación se puedenobtener valores que posteriormentepueden ser empleados para la com-probación o verificación (punto 4)del método.Así pues, el protocolo de validaciónconsiste en dos etapas:• Estudio comparativo entre el mé-

todo alternativo y el método de re-ferencia realizado por un laborato-rio experto.

• Estudio interlaboratorio en el que seemplean y comparan los resultadosobtenidos por los dos métodos.

Matrices objeto de estudio La norma ISO 16140 contempla el ti-po de matrices que deben evaluarsepara la validación de un método mi-crobiológico:En el caso de alimentos, se debenestudiar 5 categorías de alimentos.Este número puede reducirse si elmétodo se aplica a un ámbito restrin-gido. (Puede consultarse en AnexoB de la Norma UNE-EN ISO16140:2003):

Validación de métodos cualitati-vosEn primer lugar se realiza un estudiocomparativo por parte del laborato-rio experto que consiste en la carac-

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Carnes y producto cárnicos Pescados y mariscosAves de corral Frutas y verdurasProductos lácteos Chocolate/productos panaderíaOtros productos (especias, Alimentación animalsalsas, huevos, pastas, cereales, bebidas)

Figura 1.- Diagrama de puesta a punto, validación y control de calidad de métodos alter-nativos.

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terización del método con el siguien-te procedimiento:Se deben analizar al menos 60muestras por cada método y catego-ría de alimentos, las cuales, ideal-mente, deben estar contaminadasen una proporción del 50%.A partir de los resultados obtenidoscon ambos métodos se construye lasiguiente tabla:• Eficacia relativa (AC): Grado deconcordancia entre la respuesta ob-tenida por el método a validar y elvalor verdadero obtenido en mues-tras idénticas.

• Desviación positiva (PD): Se pro-duce cuando el método a validar daun resultado positivo y el valor de re-ferencia es negativo. Una desviaciónpositiva se convierte en un falso po-sitivo cuando se puede demostrarque el resultado verdadero es ne-gativo.• Desviación negativa (ND): Se pro-duce cuando el método a validar daun resultado negativo y el valor dereferencia es positivo. Una desvia-ción positiva se convierte en una fal-so negativo cuando se puede de-mostrar que el resultado verdaderoes positivo.• Sensibilidad relativa (SE):Capacidad del método a validar dedetectar el microorganismo cuandoestá presente en la muestra a anali-zar o no diferir de manera significa-tiva del valor de referencia (<30%).

• Especificidad relativa (SP):Capacidad del método a validar pa-ra no detectar el analito cuando noes detectado por el método de refe-rencia.

• Nivel de detección relativa (LOD):Menor número de microorganismos

que puede detectarse en una mues-tra.Se seleccionan diferentes matricesque deben contener tres niveles decontaminación (blanco, próximo al lí-mite de detección y por encima delmismo (p. ej., 3xLOD) Para su eva-luación es necesario obtener una re-cuperación parcial en al menos unode los niveles. Es por ello que ge-neralmente se habla de LOD 50 deforma que se compara un métodofrente a otro. Inclusividad: Capacidad para detec-tar el analito entre un amplio grupo(50) de cepas diana.Exclusividad: Ausencia de interfe-rencia en el método de un grupo (30)de cepas no diana.Posteriormente (o de forma parale-la) se realiza un estudio intercompa-rativo, en el que se debe contar con10 laboratorios participantes y 3 ni-veles mínimos de contaminación y8 replicados por cada nivel de con-taminación, lo que supone un totalde 480 resultados (240 por cada mé-todo).

Validación de métodos cuantitati-vosIgual que anteriormente se desarro-lla en primer lugar un estudio de ca-

racterización por parte del laborato-rio experto:Se trabaja con 5 concentracionesdel analito en cada tipo de alimentopara establecer una curva de cali-bración, de forma que se cubra el in-tervalo completo, realizando al me-nos 10 mediciones (idealmente 25-50) con muestras contaminadas na-turalmente por el método alternativo.De nuevo se estudian 5 categoríasde alimentos y de cada muestra sereplica entre 2 y 10 veces para lo-grar de 10 a 50 resultados por méto-do y categoría de alimentos.Estos datos se representan de formagráfica (ver Fig. 2) empleando el ejeY para el método alternativo y el ejex para el de referencia, evaluando laexistencia de datos anormales. A partir de los mismos se hace unestudio de regresión (Y=a+bx) en elque no solo debemos evaluar el co-eficiente de correlación (r.) sino quese debe verificar que las hipótesisa=0 y b=1 se cumplen (p. ej., los va-lores de la recta están dentro de unintervalo de confianza del 95%) eva-luando de este modo la linealidad odefecto de ajuste (aptitud del méto-do para dar resultados que están enproporción con la cantidad de micro-organismos presentes en la mues-

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Figura 2.- Representación gráfica para el estudio de linealidad y exactitud relativa.

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tra), así como la precisión de los mé-todos (límites en los que la exactitudespecificada se encuentra con unaprobabilidad del 95%).Posteriormente se estiman los lími-tes de detección y cuantificación através del nivel crítico (menor canti-dad que puede ser detectada (no nu-la) pero no cuantificada como un va-lor exacto. Para ello se seleccionantres niveles de microorganismos(mínimo, medio y alto) y se replicacada uno de los niveles al menos 6veces, a partir de cuyos datos se es-tablece el nivel crítico, el LOD yLOQ. Como dato importante, laAOAC define el LOQ como aquella

cuyo coeficiente de variación (S/X)debe ser inferior al 10%.Del mismo modo debe determinarsela sensibilidad para los diferentes in-tervalos de medida, la especificidady selectividad de modo similar a lorealizado en los métodos cualitati-vos.Por último, también es necesario re-alizar un estudio interlaboratorios enel que participen 8 laboratorios enlos que se debe estimar la exactitudy precisión del método sobre 3 nive-les de microorganismos, lo que im-plica un mínimo de 96 resultadosválidos de la matriz alimenticia es-cogida, donde se obtienen respec-

tivamente la repetibilidad, precisióny sesgo del método alternativo.

Nuevas estrategias en el desarro-llo de normas de validaciónEn relación con los nuevos métodosde validación, en 2011 se publicóuna corrección de la ISO16140:2003 que afectaba, básica-mente, a los aspectos relacionadoscon la realización de ejercicios inter-comparativos para validar métodoscuantitativos.Por otra parte, se están desarrollan-do diversas normas (se espera dis-poner de un borrador público o DISen julio de 2012) que contemplarán:• Norma 16140-1: Recoge todo lo

relacionado con definiciones y ter-minología.

• Norma 16140-2: Validación de mé-todos comerciales o kits, que man-tiene la estructura de la actual ISO16140, explicada anteriormente,pero se introduce algunos cambios,sobre todo en lo referente a méto-dos cuantitativos donde se contem-pla un diseño de experimentos dife-rente, como se refleja en la figura 3.

Asimismo, los métodos cuantiativosse estudian mediante un nuevo es-tudio estadístico, de modo que elenfoque es mucho más ajustado alrendimiento esperado del métodocon respeto al método de referencia.El gráfico que permite evaluar estemétodo puede resumirse en la figu-ra 4.También se está desarrollando unnuevo método (ISO 17468), dondese describe la metodología necesa-ria para validar métodos de referen-cia (documento que solo será em-pleado para organismos de norma-lización).Por último y como novedad importan-te, también se va a desarrollar unanorma que sirva de guía para la co-rrecta verificación o comprobación demétodos por parte de los laboratoriosusuarios, si bien en este momentoestá en fase de definición y no se handesarrollado contenidos técnicos.

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Figura 3.- Diagrama del diseño experimental para una categoría de alimentos asumien-do 3 niveles de contaminación.

Figura 4.- Presentación general del perfil de exactitud y precisión para la validación deun método alternativo (el límite de aceptabilidad se ha seleccionado arbitrariamente).

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Verificación o comprobacióndel funcionamiento de un mé-todo alternativoLa validación interna o verificaciónpor parte del laboratorio de controlque va a utilizar el método alternati-vo, que consiste básicamente encomprobar que el laboratorio es ca-paz de cumplir con los requisitos defuncionamiento del método previa-mente establecidos en las condicio-nes habituales de trabajo.Lo primero que debemos conocer an-tes de incorporar un método alterna-tivo, como se ha indicado en el pun-to 2, es si el mismo ha sido validadode forma completa con un esquemainternacionalmente reconocido (porejemplo con la sistemática estableci-da anteriormente) o si por el contra-rio esta validación no es completa, encuyo caso el laboratorio es responsa-ble de obtener (en literatura científicao realizado las experiencias pertinen-tes) evidencias suficientes para com-plementar las carencias que puedapresentar dicha validación.Del mismo modo, es importante queel laboratorio utilice el método alter-nativo tal y como ha sido diseñadopor el fabricante, puesto que en ca-so contrario no se puede garantizarla validez del mismo, y el laboratoriodeberá realizar una validación com-pleta (ver punto 3).La comprobación es más importan-te si cabe en los métodos alternati-vos, puesto que en muchos casos sereconoce que el rendimiento de es-tos métodos puede verse afectadopor diferentes microorganismos, co-mo viene reflejado en algunos proto-colos de métodos alternativos “Elparámetro xxxxx ha sido evaluadosobre numerosos productos. Sin em-bargo, teniendo en cuenta la diversi-dad de productos y procesos de fa-bricación, se recomienda verificarque la composición de las matricesanalizadas no afecta a la fiabilidadde los resultados”.Existen muchas alternativas para re-alizar la verificación de métodos al-

ternativos y como se ha indicado an-teriormente, desde el punto de vistanormativo no existe todavía un do-cumento de referencia en el que ba-sarse.No obstante, los enfoques más ha-bituales consisten en la realizaciónde muestras por duplicado (analiza-das en paralelo por el método de re-ferencia y por el método alternativo)o el empleo de materiales de refe-rencia con un valor conocido.Aunque desde un punto de vista or-todoxo no se deben emitir resultadosanalíticos antes de realizar una com-probación, es comúnmente acepta-do, sobre todo en el caso de méto-dos ampliamente reconocidos y quedisponen de una validación el reali-zar este tipo de verificaciones me-diante el control de calidad internodel laboratorio (empleando para elloun esquema similar al descrito eneste punto), así como resultadosprocedentes de ejercicios intercom-parativos (aunque en este último ca-so el tipo de matrices a analizar nosuele ser representativo de mues-tras reales).

Matrices a emplearNunca debemos olvidar que estacomprobación tiene como objetivodemostrarnos a nosotros mismosque, en condiciones reales de ejecu-ción de los ensayos, los resultadosque voy a emitir son correctos y, portanto, no tiene ningún sentido em-plear microorganismos o matricesque no reflejen la realidad del mé-todo de ensayo. En este sentido, laesterilización de matrices está clara-mente desaconsejada puesto que sealeja enormemente de la realidad enlos análisis de rutina (como excep-ción podemos citar los laboratoriosque analicen exclusivamente con-servas o platos preparados tratadostérmicamente).Para una verificación de un métodoque se emplee en alimentos en ge-neral, deben verificarse alimentos dediferentes categorías (ver punto 3.1)

y tipos, así como de diversas pro-cedencias. El número de categorías a verificarideal es de 5. No obstante, es razona-ble realizar una primera evaluación enun número limitado de categorías re-presentativas de las que habitualmen-te se analicen en el laboratorio y pos-teriormente, mediante las pruebas decontrol de calidad interno, ir incorpo-rando nuevas matrices para verificarsu influencia en el resultado y las po-sibles limitaciones del método.Una vez identificadas el tipo y núme-ro de matrices a emplear procedere-mos de forma diferente en funcióndel tipo de método que queramosverificar.Así pues el diseño de la verificacióndel método debe establecerse de talmodo que se garantice de la formamás fiel posible las condiciones deuso habituales del método. Para ellolo ideal es trabajar con matrices na-turalmente contaminadas que con-tengan el microorganismo objeto deanálisis. Solo en caso de no dispo-ner de las mismas es posible emple-ar la inoculación artificial.

Inoculación de microorganismosdiana/interfirientesEn el caso de que se requiera deuna contaminación artificial, (dada laausencia de materiales de referen-cia microbiológicos que incorporenel efecto matriz) se pueden emplearcepas procedentes de Coleccionesde Cultivos Tipo (www.cect.org) apartir de las que prepararemos, lasuspensión de inóculo, o tambiénpueden utilizarse material de refe-rencia certificado con una concen-tración y pureza conocida comercia-lizado en diversos formatos por dife-rentes organismos y empresas(Health Protection Agency“http://www.hpa.org.uk/”, LABAQUAhttp://www.labaqua.com/ oMicroBiologics “http://www.microbio-logics.com/)El empleo de cepas salvajes o demuestras procedentes de intercom-

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parativos como material de referen-cia es también posible, siempre queestos microorganismos estén per-fectamente caracterizados y se pue-da asegurar que cumplen con los re-quisitos de estabilidad, pureza, via-bilidad y comportamiento adecuadoal fin buscado.

Métodos cualitativosEl objetivo de la verificación es com-probar que podemos detectar un ni-vel suficientemente bajo de microor-ganismos en las diferentes matricesobjeto de análisis.No es razonable que el laboratoriode análisis deba estimar el límite dedetección que previamente ha sidoestimado en la validación, sino másbien evaluar la influencia de las con-diciones reales (matrices, analistas,medios de cultivo…) en la capacidadde detección de microorganismosdiana a bajos niveles. En las validaciones completas se es-tima el nivel de detección relativomediante la inoculación de diferen-tes niveles, siendo el limite de detec-ción en aquel nivel donde se obtie-ne un número parcial de resultadospositivos del total de muestras ino-culadas. Posteriormente, se emple-an test estadísticos como el TestFisher para métodos cualitativos oLey de Poisson para métodos cuan-titativos (Tabla P.1 UNE EN ISO16140), lo cual no suele ser posibleen los laboratorios de rutina.Por otra parte, la estimación del lími-te de detección requiere del empleode suspensiones de inóculo con ni-veles de concentración bajos quedeben ser preparadas por el labora-torio, puesto que en la actualidad noexiste un material de referencia dis-ponible a estos niveles. El propio intervalo de confianza aestos bajos niveles (ver tabla 1) ha-ce que, desde un punto de vista es-tadístico, no se pueda conocer deforma exacta si un determinado in-óculo contiene o no el microorganis-mo a detectar, por lo que un labora-

torio de control generalmente no dis-pone de la suficiente experiencia yrecursos para abordar la tarea deconseguir un inóculo con una con-centración lo suficientemente bajacomo para estimar el límite de detec-ción. En su lugar es más adecuado el em-pleo de material de referencia conbajas concentraciones (p. ej., en tor-no a 10 ufc/muestra y siempre infe-riores a 25 ufc/muestra) o la prepa-ración de inóculos con una concen-tración tal (por ejemplo, no más de10 veces el limite de detección) queel laboratorio pueda garantizar suvalor y evaluar diferencias entre lasdistintas matrices, analistas, etc., deforma que, en lugar de estimar el lí-mite de detección, se verifica la ca-pacidad del laboratorio de obtenerresultados reproducibles y eficacescon bajos niveles de microorganis-mos diana.Así pues, y dado que no deseamoscalcular el límite de detección (as-pecto que ya ha debido ser evalua-do anteriormente en la validacióncompleta del método), la verificaciónen los métodos cualitativos puede

hacerse con niveles en los que el mi-croorganismo diana se encuentre envalores de entre 4 y 16 ufc/muestra,de forma que se garantiza que en elinóculo disponemos de entre 1 y 25ufc/muestra (con un límite de con-fianza al 95% para recuentos conbajos números de colonias) garanti-zando que la muestra ha sido efec-tivamente inoculada con al menos 1microorganismo y no más de 25.Con estos niveles de inóculo debeninocularse al menos 6 muestras di-ferentes (idealmente 10) por catego-ría de alimentos en condiciones dereproducibilidad, obteniendo en to-dos los casos valores positivos. Deeste modo, se puede considerar ve-rificado un método de uso generalen alimentos, si obtenemos resulta-dos positivos en el análisis de al me-nos 30 muestras de 5 categorias dealimentos. Las muestras empleadaspueden ser de las que habitualmen-te reciba el laboratorio, de modo quemediante su análisis habitual sepueda verificar la ausencia del mi-croorganismo diana en las mismas.En caso contrario deberán realizar-se análisis complementarios para

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1 <1 22 <1 43 <1 54 1 65 2 96 2 107 2 12

Número de colonias Intervalo de confianza (95%)

Inferior Superior

8 3 139 4 14

10 4 1611 5 1812 6 1913 7 2014 7 21

Número de colonias Intervalo de confianza (95%)

Inferior Superior

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verificar la ausencia del mismo. Enalgunos casos y siempre que estédebidamente justificado, puedenemplearse niveles más altos de in-óculos para verificar un método, pe-ro en estos casos se recomienda re-visar si la capacidad del método esla adecuada (p. ej., LOD de los cer-tificados de validación) y en caso deno disponerlos, realizar los análisisde las muestras inoculadas median-te dos métodos diferentes (métodode referencia y alternativo), de mo-do que podamos evidenciar si el pro-blema es del método que emplea-mos, o bien de una determinada ce-pa o por el contrario del laboratorio.

Métodos cuantitativosEn este tipo de métodos debemosestimar:• Recuperación puede ser estimadamediante la exactitud (grado de con-cordancia entre un resultado de unanálisis y el valor de referenciaaceptado) o el sesgo (diferencia en-tre el resultado esperado y el valorde referencia aceptado.• La exactitud, cuando se aplica a unconjunto de análisis, incorpora com-binación de resultados aleatorios yel error sistemático común, que es elque estimamos a través del sesgo.El término exactitud es complemen-

tario al de eficacia o veracidad.Dado que en microbiología no es po-sible en la práctica obtener un valorde referencia, deberemos emplearen su caso el término relativo, pues-to que el valor de referencia se ob-tiene mediante el propio análisis dela muestra con un método de refe-rencia aceptado.• Reproducibilidad, o precisión inter-media, considerando este término enrealidad como el de reproducibilidadinterlaboratorios, es decir, el gradode concordancia entre resultados deanálisis individuales, empleando elmismo método obtenido en las con-diciones más diversas que se pue-dan dar en el laboratorio (operadoresdiferentes, lotes de reactivos diferen-tes, equipos diferentes…).Desde un punto de vista práctico, esaconsejable realizar la verificaciónde la recuperación y la reproducibi-lidad simultáneamente mediante elanálisis por duplicado de muestrascon una concentración conocida. Eneste caso, es aconsejable que lasmuestras contemplen diferentes ni-veles de contaminación y que estospermitan realizar un recuento dentrodel rango habitual de lectura (p. ej.,en el caso de placas petri de 90 mmrecuentos de entre 15 y 150 o 30 y300 colonias), no siendo incluidos en

el cálculo los casos en los que losrecuentos son inferiores a 10 colo-nias (como recuento total en todaslas placas).El diseño de experiencias podría serel que aparece en la Fig. 5. Generalmente, se realizan entre 5y 10 muestras (ver ISO 19036) dediferentes categorías (entre 3 y 5)representativas del alcance, debien-do contemplarse para un alcance dealimento en general entre 25 y 30muestras por duplicado.Para la estimación de la tasa de re-cuperación se puede evaluar cadarecuento individualmente como:

Siendo:Xi = Recuento del método a compro-bar en ufc/g.Yi = Valor de referencia en ufc/g.Estos valores se expresa en valor lo-garítmico y posteriormente el valorde recuperación se pueden compa-rar con los valores de referencia in-dicados en la norma ISO 11133-2Anexo B. Los valores que habitual-mente se estiman adecuados sonRec ≥ 0,5 en métodos que incluyenel empleo de medios selectivos yRec ≥ 0,7 para aquellos en los quese emplean medios no selectivos.También podemos realizar otras apro-ximaciones para evaluar la exactitudal objeto de estimar diferencias entreel valor de referencia de diferentespoblaciones (muestras) mediante em-pleo de criterios estadísticos como al“t student” o la realización de ANOVAsi los datos así lo permiten.No obstante este enfoque está sien-do cuestionado, dado que puedenproducirse casos en los que se apre-cien diferencias estadísticamentesignificativas que indiquen que laexactitud de un método no es la ade-cuada y, sin embargo, desde el pun-to de vista microbiológico, dicho mé-todo es válido e incluso mejor queotros, como se puede observar en lafigura 6.

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Figura 5.- Esquema de realización de duplicados para estimar la incertidumbre del méto-do.(ISO/TS 19036:2006).

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En cuanto a la reproducibilidad (asícomo la estimación de la incertidum-bre) a partir de los resultados obte-nidos de las muestras analizadaspor duplicado obtenidas en variasmatrices (fig 6), se realizarán los si-guientes cálculos. a) Transformar los valores ufc/g envalor logarítmico.b) Calcular la media de los duplica-dos de cada muestra según la fór-mula:

c) Calcula la varianza de la repro-ducibilidad (SRi2) para cada mues-tra, según:

d) Calcular la desviación estándarde la reproducibilidad (sR) según:

e) Calcular la incertidumbre ULa modificación de la norma ISO19036:2006, Amd. 1:2009, conside-ra el cálculo de la incertidumbre ex-pandida (U), asumiendo que el nú-mero de colonias en placa sigue unadistribución de Poisson y permite ob-tener la incertidumbre en casos don-de se obtiene recuentos bajos (aun-que la suma de colonias en todas lasplacas debe ser al menos >10). Laincertidumbre expandida se calculacon la siguiente fórmula:

Donde es la suma de coloniasque se cuentan en todas las placasque se han utilizado para el análisis. Cuando esta formula se aplica en loscasos que se hayan obtenido ensa-yos con un número de colonias to-tal elevado, el segundo término pue-de considerarse despreciable y cal-cular la incertidumbre como: U=2SR.A partir de la integración de todos losresultados de recuento expresadosen ufc/g, se estimará la DesviaciónEstandar de Reproducibilidad (SR) yeste dato permite calcular laReproducibilidad intermedia (R) se-gún la fórmula:

El valor de SR y R (o Sr y r) obteni-do debe ser inferior al valor de refe-rencia disponible en la norma o, encaso de ausencia, aquellos publica-dos en artículos científicos o guíasde carácter horizontal (p. ej., 19036).Algunos de los datos disponibles pa-ra comparar la obtenida en nuestrolaboratorio figuran en la tabla 1.También podemos comparar estosvalores con los proporcionados porlos certificados de validación del mé-todo alternativo. No obstante, en es-tos casos, el valor de reproducibili-

dad se estima a partir de un ejerci-cio colaborativo, por lo que en su es-timación se han considerado los da-tos de múltiples laboratorios con di-ferentes analistas, equipos, mayornúmero de muestras lo que en gene-ral implica una mayor hetereogenei-dad y la suma de contribuciones queno van a darse en un único labora-torio.Es por ello que el valor de reprodu-cibilidad obtenido pueda ser muyelevado en relación con el valor ob-tenido en la verificación. En este ca-so se recomienda tomar como crite-rio en lugar del R (reproducibilidadinterlaboratorios) el valor de referen-cia identificado como r (repetibilidadintralaboratorio), que es más seme-jante a las condiciones experimenta-les que se dan en este tipo de veri-ficaciones.

Control de calidad internoLa Norma UNE-EN ISO 17025:2005(punto 5.9) indica que el laboratoriodebe tener procedimientos de con-trol de calidad para realizar el segui-miento de la validez de los ensayos(…).El control de calidad debe realizarsede tal forma que permita detectar

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Figura 6.- El método A (izquierda) es más exacto y preciso que el B, sin embargo el méto-do A presenta diferencias estadísticas, frente al valor de referencia mientras que el méto-do B no presenta diferencias estadísticas mediante un estudio t student o ANOVA.

Aerobios mesófilos r=0,25 R=0,45 ISO 4833Coliformes totales Sr = 0.20 SR=0.5 ISO 4832E. coli Sr = 0.11 SR=0.47 ISO 19036Mohos y levaduras Sr = 0.29 SR=0.75 ISO 19036Enterobacteriaceae Sr = 0.04 SR=0.52 ISO 19036S. aureus r=0.28 R=0.43 ISO 6888-1

B. cereus r=0.29 R=0.42 ISO 7932-2

Ensayo Repetibilidad Reproducibilidad Referencia

Tabla 1.-

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tendencias y aplicar técnicas esta-dísticas para la revisión de los resul-tados. Además, el control de calidadinterno puede permitir obtener infor-mación que indique si los métodosson apropiados para el tipo y volu-men de trabajo que se realiza de for-ma cotidiana en el laboratorio. Los datos debe ser analizados y sino satisfacen los criterios predefini-dos, se deben tomar acciones pla-nificadas para corregir el problema yevitar los resultados incorrectos. Estos criterios, si bien pueden obte-nerse a partir de los datos propiosde la validación del método, es máscoherente emplear los valores rea-les obtenidos a partir de las pruebasde verificación o comprobación delmétodo para asegurar la correctaevaluación de los mismos.

Métodos alternativos certifi-cadosComo se ha indicado anteriormente,en algunos casos (empleo de méto-dos comerciales o “kits”) la legisla-ción recoge la necesidad de que elmétodo alternativo haya sido certifi-cado por terceros.En la actualidad, y a nivel mundialsolo existen 3 organismos que cer-tifican la validez de métodos alterna-tivos:• AFNOR VALIDATION

(http://www.afnor-validation.org/)

• MICROVAL(http://www.microval.org/)

• AOAC RI(http://www.aoac.org/) Las dos primeras organizacionesemplean como norma para validar laISO 16140:2003, mientras queAOAC, emplea criterios propios pe-ro armonizados con la ISO 16140(http://www.aoac.org/Official_Methods/Food_Micro_Validation_Guidelines.pdf), aunque en su organizaciónhay diferentes niveles de exigenciapara los métodos alternativos.La certificación de un método permi-te, además de garantizar la validezdel método, asegurar que el fabri-cante del método alternativo dispon-ga de un sistema de calidad para laproducción del kit (p. ej., ISO 9001),así como la certificadora debe reali-zar una verificación regular de losmétodos y evaluar cualquier modifi-cación del producto o del proceso deproducción para ver si estas modifi-caciones afectan a la validación delkit.Además, la certificadora suele eva-luar un gran número de aspectoscomplementarios a la norma de va-lidación, como las ventajas del mé-todo, su aplicabilidad, facilidad deuso, etc.Puede verse un resumen de el nú-mero y tipología de métodos alterna-tivos disponibles bajo un esquemacertificado, en la tabla 2.

En cuanto a las diferentes tecnologí-as empleadas para la validación demétodos, y tomando como ejemplolos métodos alternativos empleadospara la detección de Salmonellaspp., las diferentes técnicas emple-adas pueden agruparse en la tabla3.

ConclusionesEl empleo de métodos alternativoses una posibilidad técnicamente vá-lida y reconocida tanto por los orga-nismos de acreditación como por lalegislación vigente.El laboratorio debe utilizar métodosde ensayo que satisfagan las nece-sidades del cliente y sean apropia-dos para el uso previsto.Una vez seleccionado el método al-ternativo que cubra nuestras nece-sidades y se adecúe al uso previsto,el laboratorio comprobará que el mé-todo se ha validado y si procede elcertificado en el caso de kits comer-ciales (punto 3), así como confirmaro verificar que lo ha implantado ade-cuadamente y es capaz de obtenerresultados válidos en las condicionesreales de ensayo (punto 4).El empleo de métodos validados y cer-tificados aporta además la garantíapor parte de terceros de otros aspec-tos complementarios, como los rela-cionados con la producción y revisiónperiódica de los métodos de ensayo.

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Salmonella 28 4 29Listeria spp 15 - 18Listeria monocytogenes 25 1 10E. coli O157 9 - 23Cronobacter 1 2 -Campylobacter 2 2 3

Microorganismo AFNOR MicroVAL AOAC

Certificadora

Inmunoenzimática 10 14Genética 16 9cultivo 3 5

Tecnología AOAC AFNOR

Tabla 2.-

Tabla 3.-

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Aspectos epidemiológicosSalmonellaEpidemologíaSalmonella (S) Typhi y Paratyphi.Este tipo de bacterias tiene como úni-co reservorio el ser humano y, portanto, solo puede adquirirse a travésde una persona enferma o portado-ra, o a través de agua o alimentoscontaminados con restos fecales. Latransmisión directa persona personaes poco frecuente. Esta enfermedad sigue siendo un pro-blema en los países en vías de des-arrollo, con un impacto aproximado de16 millones de casos y 600.000 muer-tes anuales. En estos países, con in-cidencias cercanas a 900 por 100.000habitantes la introducción de cepasmultiresisitentes es altamente proble-mática. En los países desarrollados la inci-dencia de esta enfermedad ha dismi-nuido muchísimo, siendo ahora cer-cana a 0,2 por 100.000 habitantes enEUA. Esta espectacular mejoría esdebida sobre todo al cambio radicalde las condiciones de saneamientode las aguas y a la manipulación máscorrecta de los alimentos. La mayorparte de los brotes que hoy en día seven de esta enfermedad están rela-cionados con la contaminación a par-tir de un manipulador infectado. Losviajes a países en vías de desarrollotambién son una vía importante deadquisición de esta enfermedad.Salmonella no tifoidea.S. Thypimurium y S. Enteritidis sonlos serotipos más comunes de infec-ción por S. no tifoidea. En el año 2000,en EE.UU., representaron el 42% detodas las salmonelosis confirmadasmicrobiológicamente. El mayor núme-ro de casos de salmonelosis se repor-tan durante los meses más cálidos delaño, coincidiendo con el aumento detoxiinfecciones alimentarias.En humanos, este tipo de infeccionesse asocia con brotes causados poralimentos [TIA], y el agente etiológi-co más comúnmente identificado enlos brotes, en general, es la salmo-

nella no tifoidea. Muchos alimentosestán contaminados con este tipo debacterias, carne roja, pollo y huevosentre muchos otros. La ingesta direc-ta de estos productos insuficiente-mente cocinados, o bien de otros pro-ductos que han sido contaminados apartir de estos, con la llamada conta-minación cruzada son los responsa-bles de esta infección en humanos.Los productos que mayoritariamentese han visto asociados a este tipo debrotes son el pollo y los huevos, peroexisten muchísimas fuentes más deinfección descritas.No es raro que huevos y aves esténinfectados por esta bacteria. Muchosbrotes han sido descritos después decomer ovo productos contaminadosy aunque calentar el huevo hasta quela clara esté totalmente solidificadaelimina la capacidad de transmisión,

la medida preventiva más eficaz reco-mendada es utilizar el huevo pasteu-rizado en la cocinas que preparan ali-mentos para un importante número depersonas.También las aves y otras carnes sonuna fuente potencial de esta infec-ción. La prevalencia de infección enaves no es nada despreciable. Lacontaminación cruzada a partir decarne cruda contaminada en las co-cinas también se asocia con brotes deesta enfermedad.Cada vez más, se asocia esta infec-ción al consumo de productos frescoscontaminados: las heces de animalesinfectados podrían contaminar frutas yverduras frescas y, debido a una lim-pieza inadecuada, transmitir la infec-ción. El melón, tomate, zumo de na-ranja, cilantro y brotes crudos son pro-ductos relacionados con estos brotes.

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Campylobacter spp., Salmonellaspp. y Listeria monocytogenes:

aspectos epidemiológicos ymicrobiológicos

Sarah Lafuente van der Sluis1

Mercedes de Simón Serra2

1(slafuent@aspb.cat)Servicio de Epidemiología, Agència deSalut Pública de Barcelona2(mdsimon@aspb.cat)Servicio de Microbiología, Agència deSalut Pública de Barcelona

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Los productos manufacturados distri-buidos también pueden suponer unimportante riesgo en cuanto a latransmisión de esta enfermedad.Helados, leche, leche en polvo y le-che maternizada son también produc-tos asociados a brotes.La transmisión nosocomial de salmo-nella no es demasiado frecuente, pe-ro sí la transmisión de pacientes alpersonal, que queda controlada si sesiguen los protocolos de prevenciónfrente a las infecciones nosocomiales.Sin embargo, los neonatos hospitali-zados sí que son susceptibles de ad-quirir infecciones a raíz de familiaresinfectados, debido a la baja concen-tración ácida del estómago. Los pa-cientes de edad avanzada tambiénestán expuestos a mayor riesgo debacteriemia y formas extraintestinalesde esta enfermedad debido a su de-bilidad, patologías de base y menoreficiencia inmunitaria.

Manifestaciones clínicasGastroenteritis.Es la manifestación más típica de lasalmonella no tifoidea. Tras de 6 a 48horas de la ingesta del alimento con-taminado aparecen náuseas, vómitosy diarreas. En la mayoría de los ca-sos, la diarrea no es sanguinolenta. Elcuadro se puede acompañar de fiebredolor abdominal y escalofríos. A vecestambién aparecen síntomas sistémi-cos como dolor de cabeza y mialgia.En algunos pacientes es necesaria lahospitalización para rehidratarlos, pe-ro la mayoría de los casos se resuel-ven espontáneamente. Los pacientesque suelen tener complicaciones o undesenlace fatal son las personas ma-yores y los immunodeprimidos.Fiebre entérica.Es un cuadro clínico severo caracte-rizado por fiebre y dolor abdominal, seda mayoritariamente, en niños y jóve-nes de 4 a 25 años. En los niños me-nores de 1 año, los immunodeprimi-dos y otras personas con enfermeda-des de base las complicaciones sonmucho más frecuentes. Actualmente,

con tratamiento antibiótico óptimo latasa de mortalidad es del 0,4%.Normalmente el agente causante esla Salmonella Typhi , S Paratyphi A, By C, que suele dar una sintomatologíasimilar pero menos grave. El periodode incubación suele ser de 5 a 21 dí-as. La enfermedad empieza con sín-tomas no específicos como debilidad,anorexia, dolor muscular, dolor degarganta y a veces hasta síntomasneuropsiquiátricos. La fiebre es ini-cialmente baja y sube durante la se-gunda semana de la enfermedad,también es frecuente un rash cutáneocaracterístico. La perforación intesti-nal es una complicación bastante fre-cuente de los casos no tratados.Otras manifestaciones clínicas muchomenos frecuentes de S. son: la bac-teriemia e infección vascular y las in-fecciones localizadas. En pacientesinfectados por el virus VIH se dan otrotipo de complicaciones mas especifi-cas.

TratamientoLa fiebre tifoidea se trata mayorita-riamente con fluorquinolonas (cipro-floxacino durante 1 semana) o conazitromicina en casos de resistencia. La gastroenteritis por S no tifoideanormalmente se suele limitar espon-táneamente y el tratamiento suele irdirigido a la reposición de líquidos yelectrolitos. De rutina, no se debenadministrar antibióticos. Sin embargo,en neonatos, immunodeprimidos opersonas mayores sí que se benefi-cian de ellos. Las fluorquinolonas sontambién en este cuadro el antibióticode elección. Los portadores crónicosde S tifoidea y no tifoidea deben sertratados con antibiótico para que ce-se dicho estado.

Prevención y controlLa prevención y control de esta enfer-medad se basan en un buen conoci-miento de su ciclo vital y en la vigi-lancia continuada para conocer suevolución y detectar los cambios. Enlos países en vías de desarrollo me-

jorar las condiciones de saneamientode las aguas es el primer paso parareducir el importante impacto que tie-ne la fiebre tifoidea. En los países desarrollados son lastoxiinfecciones alimentarias las quedeben ser controladas mediante regu-laciones que dificulten el paso de laSalmonella “de la granja a la mesa”para disminuir las infecciones por Sno tifoidea. Si los médicos que diag-nostican los casos cuando detectanbrotes los notifican rápidamente a lasautoridades éstos se pueden contro-lar de manera rápida y eficaz. Otrasestrategias, como limitar el uso de an-tibióticos en ganado, vacunar anima-les y mejorar las prácticas de manipu-lación de alimentos, son básicas pa-ra reducir esta infección.Entre las estrategias comerciales im-portantes para evitar toxiinfeccionescon muchos afectados podemos des-tacar: no servir ningún alimento pre-parado con huevo insuficientementecocinado, utilizar siempre que sea po-sible huevo pasteurizado y vigilar mu-cho el riesgo de contaminación cruza-da durante la manipulación de variosalimentos. También en residencias yhospitales se recomienda utilizar pre-parados de huevos pasteurizados.En cuanto a los manipuladores de ali-mentos es importante insistir en la hi-giene personal y en el cuidado demantener siempre los tiempos y tem-peraturas necesarias para controlaresta infección. No queda claro si esmejor hacer pruebas rutinarias a ma-nipuladores que han estado infecta-dos antes de reincorporarse al traba-jo o que vuelvan a trabajar cuando sehaya resuelto el cuadro. De todas ma-neras es bueno asegurar la negativi-zación con como mínimo dos copro-cultivos seguidos en manipuladoresque han sido infectados y que estánen contacto con alimentos o prepara-dos que no vayan a ser cocinadosposteriormente. La infección nosocomial se puedeprevenir siguiendo los protocolos deprecauciones estándares, los trabaja-

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dores infectados, pueden volver a tra-bajar cuando se haya resuelto la en-fermedad, ya que el riesgo de infec-ción del trabajador al paciente es muybajo, siempre y cuando cumplan contales precauciones.

CampylobacterEpidemiologiaLa principal vía de transmisión de es-ta infección para los humanos es elconsumo de carne contaminada.Muchos animales son portadores deesta bacteria durante toda su vida.Aunque la infección también causamorbimortalidad en animales, las car-nes que provienen de animales infec-tados que se contaminan cuando sonprocesados. Un buen ejemplo son lospollos de criaderos, muchos de estosanimales están colonizados, duranteel proceso de descuartizar se conta-mina la carne que se vende infecta-da en los supermercados. Leche cru-da no pasteurizada también es un ve-hículo muy común de esta infección.Y la transmisión a través de aguascontaminadas no tratada también es-tá ampliamente documentada.También han sido descrito brotes apartir de la cocción insuficiente decarne contaminada, tanto de vacunocomo de carne de cordero, quesos,leche de cabra e incluso almejas. Sinembargo, las aves (los pollos), no su-ficientemente cocinadas son respon-sables de la mayor parte de casos decampylobacteriosis esporádicas (50-70%). Con el consumo creciente decarne aumenta el impacto de esta en-fermedad.El contacto directo con animales in-fectados también puede transmitir laenfermedad. Animales de compañíatipo gatos y perros jóvenes con dia-rreas también han sido responsablesde infecciones en humanos. Tampocoes improbable que animales sanosexcreten la bacteria y provoquen in-fección. Personas con empleos rela-cionados con animales de campo, asícomo de laboratorio, presentan mayorriesgo de sufrir esta enfermedad.

Transmisión fecal-oral persona perso-na es también posible, por ejemplo,gente con contacto con niños que aúnson incontinentes. La transmisión per-sona persona en niños de edad es-colar es infrecuente, tampoco la trans-misión a partir de manipuladores dealimentos infectados pero asintomáti-cos es demasiado común. Los homo-sexuales tienen un riesgo aumenta-do de sufrir infecciones por subtiposmenos comunes de esta bacteria (ci-naedi, fennelliae), así como pacientescon infección por el virus VIH.Esta bacteria provoca un pico de in-fección durante el verano y principiosde otoño, sin embargo durante todo elaño su incidencia y transmisión sonimportantes.Se trata de la infección bacteriana in-testinal más común. En el año 2008,fue la primera causa de gastroenteri-tis humana esporádica en laComunidad Europea. Los grupos deniños menores de un año y jóvenesentre 15 y 29 años son los grupos deedad más afectados. La prevalenciade esta infección en personas sanases mucho más baja que la que encon-tramos personas con alguna enferme-dad de base. En los países en vías de desarrolloesta infección sigue un patrón epide-miológico marcadamente distinto,afecta principalmente a niños sanosdurante sus cinco primeros años devida, las infecciones que sufren losadultos son mayoritariamente asinto-máticas. Parece que, en estos casos,

la fuente de transmisión más comúnes entre personas. También es una in-fección comúnmente vista en viajerosque acuden a estos países.Tanto estudios realizados reinyectan-do la bacteria en voluntarios sanosasí como la evidencia de que en paí-ses en vías de desarrollo la infeccióndisminuye su prevalencia con la edadapunta hacia una inmunidad adquiri-da para esta infección y esto deja lapuerta abierta a que sea posible ob-tener algún dia una vacuna frente a lamisma.

Manifestaciones clínicasC. jejuni es el subtipo que causa elcuadro clínico más típico. C. coli sue-le provocar un cuadro similar peromás leve. La manifestación más co-mún es la enteritis, a la que suelepreceder el dolor de cabeza, la mial-gia y el malestar general, y seguida-mente aparece la diarrea, con dolorabdominal y fiebre. La diarrea puedeser de intensidad variable (desde de-posiciones semilíquidas a diarreaacuosa o sanguinolenta). El dolor ab-dominal suele ser intenso y cedercon las deposiciones. Normalmenteeste cuadro es autolimitado y benig-no, sin embargo en algunos pacien-tes se puede prolongar más de 7 dí-as. Otras manifestaciones más gra-ves y mucho menos frecuentes sonla colitis, principalmente manifesta-da con diarrea sanguinolenta de másde una semana de evolución o la bac-teriemia.

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TratamientoEl tratamiento adecuado para esta en-fermedad es la reposición de líquidosy electrolitos vía oral, para los casosleves, y para aquellos que cursen condeshidratación severa, vía endoveno-sa. Los antibióticos son necesarios encasos en los que la evolución es lar-ga y la diarrea tiene sangre o la fie-bre es elevada. En estos casos, reci-bir antibióticos de forma precoz dismi-nuye la severidad del cuadro. Muchosantibióticos son efectivos, sin embar-go, el preferido, por causar pocosefectos secundarios y ser de fácil ad-ministración, es la eritromicina. El pronóstico es bueno en la mayoríade casos, aunque pueden surgir algu-nas complicaciones reumáticas o elsíndrome de Guillan Barré, infrecuen-tes pero que son posibles tras una in-fección de este tipo.

Prevención y controlA diferencia de la Salmonella, estaenfermedad no causa demasiadosbrotes y, por tanto, tiene impacto encuanto a que produce muchas infec-ciones espontáneas que no suelen te-ner un origen común. Sin embargo,una buena estrategia para disminuirla prevalencia de esta infección es re-ducir la cantidad de carne contamina-da que se produce, mejorando loscontroles de calidad de los matade-ros. Además, reducir al máximo elriesgo de contaminación cruzada du-rante la manipulación y cocinar duran-te suficiente tiempo a temperaturasadecuadas son clave para limitar latransmisión de esta enfermedad.

ListeriaListeria monocytogenes es una bac-teria Gram positiva de forma baci-lar. Por lo general se manifiesta enlos recién nacidos y adultos comomeningoencefalitis, septicemia oambas, y en las mujeres embaraza-das por corioamnionitis que puedeproducir el aborto. Se transmite ha-bitualmente por ingestión de alimen-tos contaminados. En las infeccio-

nes neonatales se puede transmitirde la madre al feto en el útero o du-rante el paso por el conducto delparto infectado. El período de incu-bación va de 3 a 70 días. También,aunque no es frecuente, en la lite-ratura se han descrito brotes de in-fección nosocomial por contamina-ción cruzada. En el año 2008 enEuropa el 20% de los casos reporta-dos (134/653) tuvieron un desenla-ce fatal. Según la legislaciónEuropea existen criterios de seguri-dad alimentaria para comidas que sevenden preparadas y a punto paracomer. Las categorías de comidasen las que se encuentra un mayor in-cumplimiento de la normativa sonpescados ahumados, quesos y pla-tos precocinados con carne.

Aspectos microbiológicosCampylobacter, Salmonella yListeria monocytogenes, patóge-nos humanos transmitidos por losalimentosCampylobacter, Salmonella y Listeriamonocytogenes son los principalesagentes bacterianos causantes de zo-onosis transmitidas por los alimentosen los países desarrollados. Según el informe de la AutoridadEuropea de Seguridad Alimentaria(EFSA) del año 2011 sobre agenteszoonoticos y brotes de origen alimen-tario en el año 2009, Campylobactersigue siendo la causa de gastroente-ritis bacteriana de origen zoonóticomás común en los países de la comu-nidad europea (UE) con 198.252 ca-sos humanos confirmados, y con unaumento del 4% respecto al 2008.Salmonella es el segundo agente en-teropatógeno, con 108.614 casos. EnEspaña, la incidencia de Salmonellaen los casos de gastroenteritis es aúnligeramente superior a la deCampylobacter.Debido a las medidas de control apli-cadas por los estados miembros de laUE y la Comisión Europea, especial-mente en la producción aviar, la sal-monelosis ha experimentado un des-

censo por quinto año consecutivo,con un 17% menos de casos en el2009 respecto al 2008. Las infecciones humanas de origenalimentario debidas a Listeria mo-nocytogenes, han aumentado un 19%en 2009 respecto al año 2008 con1.645 casos confirmados. Aún sien-do su incidencia menor que la deCampylobacter y Salmonella, ha sidoresponsable de 270 muertes huma-nas durante el año 2009, mientrasque solo 60 han sido causadas porSalmonella y 40 por Campylobacter.

Salmonella sppSalmonella es el principal agente etio-lógico bacteriano de brotes de toxi-in-fección de origen alimentario enEspaña y en los países tanto desarro-llados como emergentes. En la UE esla causa del 31% del total de brotesde origen alimentario.El reservorio de las salmonellas gas-troenteríticas está constituido por losanimales enfermos o portadores desangre caliente y fría, especialmentelos mamíferos y las aves, dentro delprimer grupo los animales de abasto.Las aves de corral tienen la inciden-cia más elevada de infección porSalmonella, particularmente pollos,gallinas y patos. El cerdo y el ganadobovino presentan también una altacontaminación. El reservorio de infec-ción entre los animales domésticos(tortugas, perros, gatos, ratones,hámsters, etc.) es también de funda-mental importancia en la epidemiolo-gía de la salmonelosis. Las salmone-llas se eliminan por las heces y se di-seminan en el medio ambiente don-de pueden sobrevivir durante un tiem-po según las condiciones de tempe-ratura, pH y humedad.Ciertos serovars de Salmonella en elcurso de la evolución se han adaptadode modo estricto a determinados hués-pedes. Este es el caso de Samonellatyphi y Salmonella paratyphi A en elhombre en el que pueden causar en-fermedad grave, no siendo patógenaspara otras especies animales.

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Otros serovares están adaptados auna especie animal, como SalmonellaGallinarum, Salmonella Abortusequi,Salmonella Choleraesuis, etc., en lospollos, équidos y ganado porcino, res-pectivamente. La transmisión no pue-de realizarse más que en el interior dela especie animal sin huésped inter-mediario.Al lado de estos serovares deSalmonella adaptados a un huéspedestán los muy numerosos tipos ubi-quitarios, con un amplio rango dehuéspedes potencialmente patóge-nos para el hombre y los animales.Son responsables de las gastroente-ritis en el hombre, que constituyen laexpresión clínica más frecuente de lainfección por Salmonella. Mientrasque en los países industrializados seproducen sobre todo por el consumode alimentos contaminados, en lospaíses en vías de desarrollo, dondelos abastecimientos de agua, frecuen-temente, no están sometidos a proce-sos de higienización, las salmonelo-sis de origen hídrico son, probable-mente, las más comunes. La trans-misión también puede ser directa –víaorofecal–, especialmente en niños yenfermos hospitalizados, dando lugaren guarderías, salas de pediatría, deenfermos crónicos, etc., a brotes difí-ciles de controlar y que pueden pro-ducir una mortalidad elevada.El pH óptimo para la supervivencia yla multiplicación de Salmonella se si-túa entre 6.5 y 7.5, aunque entre va-lores de 4.5 a 9 también pueden mul-tiplicarse. La mayoría de serovares deSalmonella se inactivan a temperatu-ras superiores a los 60ºC durante 20minutos y resisten hasta tres meses atemperaturas de congelación.La Salmonella tiene múltiples factoresde virulencia, especialmente los quese sitúan en diversas islas de patoge-nicidad que están formadas por se-cuencias de DNA que codifican deter-minantes de virulencia responsablesde interacciones con el huésped.Determinados serotipos deSalmonella (Typhimurium, Dublin,

Gallinarum-Pullorum, Enteritidis,Choleraesuis i Abortusovis) presentanplásmidos de virulencia que permitenuna multiplicación rápida de las cepasdentro de las células del huésped, yresistir a sus mecanismos de defen-sa. También confieren la posibilidadde inducir la lisis de los macrófagos,una respuesta inflamatoria anómala yuna enteritis. Estos plásmidos tam-bién son portadores de un operón quecodifica una adhesina involucrada enla colonización del intestino delgado.Otros factores de virulencia son unaenterotoxina diarreagénica y una pro-teína citotóxica termolábil localizadaen la membrana externa de la bacte-ria. Estudios en voluntarios indicanque la dosis infectiva de Salmonellaes elevada (100.000 células), pero enalimentos implicados en brotes de in-toxicación alimentaria se ha compro-bado que las concentraciones inferio-res a 50 células provocan la enferme-dad. La carne y los productos derivadosconstituyen uno de los principales ve-hículos de transmisión de Salmonellaal hombre. A partir de la carne, pue-de entrar en la cadena alimentaria encualquier punto, durante la elabora-ción de alimentos, así como en la fa-se de comercialización y preparaciónde los alimentos en catering y en elámbito doméstico.

Campylobacter spp.Dentro del género Campylobacter seincluyen 18 especies. Las especiestermofílicas son las causantes de lainfección en el hombre: C. jejuni, C.coli, C. fetus, C. upsaliensis. C. Jejunies el responsable del 90% de los ca-sos y es muy frecuente en pollos. C.coli se aísla principalmente en el cer-do y tiene una incidencia mucho me-nor en las enfermedades intestinalesen humanos.El reservorio de Campylobacter es eltubo digestivo de un gran número deanimales de sangre caliente, dondese encuentra como comensal y tam-bién como patógeno entérico ocasio-

nal. Los más frecuentes son las avesde corral (pollos), conejos, roedores,bóvidos, porcinos, ovinos, pájaros yanimales de compañía incluidos ga-tos y perros. Los vegetales los crus-táceos y las moscas pueden ser vehí-culos de la infección. Sobrevive enaguas superficiales y aguas tratadasincorrectamente, lo que es importan-te para el ciclo vital deCampylobacter.Campylobacter jejuni se multiplica en-tre 30ºC y 45ºC y no a 4º C, por lo tan-to no lo hace en alimentos manteni-dos a temperatura ambiente o en con-diciones de refrigeración. Crece en at-mósferas de baja concentración deoxígeno (5% de O2) y según recien-tes estudios sobrevive en la superfi-cie de las carnes gracias a la interac-ción con Pseudomonas. Es un micro-organismo frágil, vulnerable a diferen-tes factores físicos y químicos. Lacongelación reduce la población deCampylobacter en los alimentos (has-ta dos unidades logarítmicas). El mecanismo enteropatogénico deCampylobacter jejuni no esta estable-cido del todo pero se sabe que pue-de colonizar e invadir el epitelio in-testinal produciendo una enteritis di-fusa, inflamatoria, hemorrágica y ede-matosa. El único flagelo deCampylobacter jejuni se considera unfactor de virulencia ya que facilita lacolonización. Las fimbrias son tam-bién importantes en la virulencia, asícomo la actividad endotóxica del li-popolisacárido de la membrana exter-na de este microorganismo. Son ne-cesarios más estudios para estable-cer si la producción de citotoxinas pa-recidas a la enterotoxina cholera-liketiene también un papel en la capaci-dad patogénica del microorganismo.La dosis infectiva es baja, en general500 células son suficientes para pro-ducir la enfermedad.Los alimentos mas frecuentementecontaminados con Campylobacterson las carnes, especialmente lasaves y la leche cruda y sus derivados.Según datos de la EFSA en los paí-

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ses miembros de la UE en el 2008,el porcentaje medio de pollos conta-minados era del 71% y el pollo en lafase de comercialización variaba en-tre 8-74% según el país. Aunque Campylobacter puede ser lacausa de brotes de origen alimenta-rio, la mayoría de infecciones huma-nas son esporádicas y el principal ve-hículo de la transmisión es la carne depollo por el cual Campylobacter se in-troduce en el ámbito doméstico y pue-de dar lugar a una contaminación cru-zada de los alimentos en la cocina.

Listeria monocytogenesListeria monocytogenes es un patóge-no oportunista que causa infecciónsistémica (septicemia, meningitis). Lalisteriosis invasiva, afecta particular-mente a las personas inmunodeprimi-das, así como a las mujeres embara-zadas, los recién nacidos y a los an-cianos. A pesar de tener una baja in-cidencia, la enfermedad tiene una al-ta mortalidad. En el año 1997 se des-cribieron cepas de L. monocytogenesen brotes de toxiinfección alimenta-ria con síntomas similares a los cua-dros de gastroenteritis con un iniciorápido, a diferencia de lo que sucedeen la infección invasiva por Listeria,que tiene un periodo de incubaciónque puede llegar hasta las 6 sema-nas. En la infección que cursa comogastroenteritis la mayoría de perso-nas afectadas no presentan enferme-dades de base.Este microorganismo se encuentraampliamente distribuido en la natura-leza. Se puede aislar del tubo diges-tivo de numerosas especies de mamí-feros y pájaros, de algunos peces ydel marisco. Se encuentra también enla tierra, las plantas, el agua y am-bientes de producción y procesamien-to de alimentos. En el hombre entreun 1% y un 10% son portadores intes-tinales asintomáticos de este microor-ganismo.Aunque es un organismo no esporu-lado, es resistente a las condicionesambientales adversas. Puede crecer

entre 0ºC y 45ºC, característica quele permite la multiplicación en alimen-tos en refrigeración. La temperaturaóptima de crecimiento es entre 30ºCy 37ºC. Es moderadamente resisten-te al calor y sobrevive a temperatu-ras de congelación. Crece a pH4.4–9.5 por debajo de 4.3 las célulasbacterianas sobreviven pero no cre-cen. La dosis infectiva de L. monocytoge-nes varía según la cepa bacteriana yla susceptibilidad del huésped. En pa-cientes inmunodeprimidos se consi-dera que pueden ser suficientes 1.000microorganismos para producir la en-fermedad, mientras que en personassanas la dosis infectiva es más eleva-da (1,9x105 a 1x109 ufc).Más del 95% de las cepas aisladas enhumanos son serovar 4b, 1/2 y 1/2b.No hay diferencias geográficas en ladistribución de cepas y tampoco exis-te relación entre el origen, caracte-rísticas fenotípicas y moleculares delas cepas y su virulencia. Las cepasresponsables de brotes correspondena un pequeño número de clones.

La infección humana tanto de las ce-pas invasivas como gastroenteríticasse produce principalmente por el con-sumo de alimentos contaminados co-mo la leche y quesos blandos duran-te la maduración, los patés, los ve-getales crudos y todo tipo de carnes,en especial el pollo, pescado crudo oahumado y marisco.Los principales factores que puedenmotivar el aumento de la listeriosisson la creciente población sensible, lamayor conservación en frío para pro-longar las vida de los alimentos y laemergencia de la listeriosis gastro-enterítica.

Prevalencia de Campylobacter,Salmonella y Listeria monocytoge-nes en los alimentosPara asegurar la inocuidad de los ali-mentos para el consumo humano, lasdiferentes autoridades competentescontrolan los aspectos relacionadoscon la producción y comercializaciónde los alimentos. Una parte esencialde este control es la recopilación,análisis e interpretación sobre la pre-

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Tabla 1.- Prevalencia de Campylobacter spp. en productos cárnicos en Barcelona (2005-2010).

Pollo y derivados 233 18,0Otras aves 55 18,1Ovino 62 8,0Porcino 93 1,0Bovino 76 1,3Conejo 15 6,6Total 534 11,0

Tipo muestra nº muestras % muestras positivas

Tabla 2.- Prevalencia de Salmonella spp en alimentos en Barcelona (2005-2010).

Carnes y derivados cárnicos de ave 179 17,8Otros productos cárnicos 666 8,1Productos charcutería 120 1,6Productos de la pesca 552 1,4Moluscos bivalvos 451 5,9Ovoproductos 170 1,2Comidas preparadas 929 3,1Otros alimentos * 1500 0,7Total 6067 2,7

Tipo muestra nº muestras % muestras positivas

* Productos lácticos, pastelería, hortalizas, especies y condimentos, salsas...

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sencia en los alimentos de microorga-nismos que puedan ser origen de en-fermedad en el hombre. En el Servicio de Microbiología delLaboratorio de la Agencia de SaludPública de Barcelona (ASPB) se rea-liza el análisis microbiológico de ali-mentos producidos y/o comercializa-dos en Barcelona. Una gran parte delos alimentos analizados correspon-den a programas de control y vigilan-cia sanitaria de los alimentos en elpunto de venta de acuerdo con la nor-mativa comunitaria, pero también pro-ceden de la investigación de brotesde toxiinfecciones alimentarias en lasque el laboratorio actúa como sopor-te analítico. Otros alimentos procedende mercados centrales de la ciudadde Barcelona así como del comerciointernacional y de empresas alimen-tarias. En el laboratorio se utilizan métodosde análisis de referencia y métodosalternativos rápidos acreditados porENAC. Para la detección deSalmonella spp. actualmente se utili-za el método convencional de refe-rencia ISO 6579:2002 y el método rá-pido de ensayo inmunofluorescenteenzimático Salmonella Vidas. La de-tección de Campylobacter spp. se lle-va a cabo mediante el método ISO10272-1:2006 y la detección deListeria monocytogenes mediante elmétodo ISO 11290-1:1996/Ammendment 1:2004 y tam-bién mediante el método inmunofluo-rescente enzimático Listeria Vidas.En las tablas 1, 2 y 3 se recogen losresultados obtenidos sobre la presen-cia de Campylobacter spp,Salmonella spp. y Listeria monocyto-genes en los alimentos estudiadosdurante el periodo 2005-2009. Los ali-mentos que corresponden a progra-mas de control fueron recogidos porlos servicios de inspección de laAgencia de Salud Pública deBarcelona y de la Agencia de SaludPública de Catalunya. Las cepas de Salmonella aisladas enlos alimentos pertenecen a 33 sero-

vares de Salmonella diferentes. Losserovars prevalentes fueron S.Typhimurium (35 aislamientos ) y S.Enteritidis (34 aislamientos) que sonlos serovares que con mayor frecuen-

cia infectan al hombre y que se inclu-yen en los programas de control ali-mentario de la UE. La distribución deestos serovares en los diferentes ali-mentos se indica en las figuras 1 y 2.

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Figura 1.- Porcentaje de aislamientos de S. Typhimurium en los alimentos.

Figura 2.- Porcentaje de aislamientos de S. Enteritidis en los alimentos.

Tabla 3.- Prevalencia de Listeria monocytogenes en alimentos en Barcelona (2005-2011).

Carnes y derivados cárnicos 417 22,5Pescados ahumados 64 14,0Comidas preparadas 701 5,1Quesos 167 0,5Otros alimentos * 312 1,2Total 1661 9,0

Tipo muestra nº muestras % muestras positivas

* Productos lácticos (leche, natas y mantequillas), pastelería, hortalizas, especies y con-dimentos, salsas...

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The title of this presentation is“Evolution of Food safety and micro-biological methods: a few considera-tions and comments”. The reason ofthat choice is as follows: I think thatwe are always at one period of history,whichever the field we consider andit is always uneasy to be consciousof the fact that the period we live is theresult of many discoveries, many ef-forts and events which occurred pre-viously. That is particularly true in thefield of Food safety. The problems of Food safety are notnew; they have occurred from a verylong time and, at each period of ourhistory, men tried to face problems;but, of course, the way of thinking hasbeen submitted to a lot of changesand evolutions. That is the reason whyI shall comment some crisis describedin the early Food safety history befo-re the time when the role of some par-ticular agents in Food safety problemswas pointed out. The discovery of microorganisms andof their incidence in food has been animportant step in the origin of differentdiseases obviously related with food;however, Food microbiology found itsown identity after the 2nd world’s waronly. That will be the second part.The microbiological methods said“pastorian” were used all around theworld and are still used as “reference”methods; but the face of Food micro-biology as completely changed withthe development of rapid methodsand automation in microbiology and,especially, with molecular biology ap-proaches.Due to the necessity to be acceptedofficially in international trade, thosemethods had, of course, to face diffe-rent difficulties; I shall mention thoserelated to their acceptance by stan-dardization bodies. Then, after a few considerations andcomments on changes observed wi-thin the types of foods and ways of ea-ting during the past decades I’ll des-cribe shortly, in the last part, the newscientific context of Food safety and

the role of Food safety agencies; weshall examine till which extent the im-provement of microbiological methodsmay help our understanding of somehealth problems related with food.Finally, I’ll draw a short conclusion.

Food Safety: what was it a fewcenturies ago?The concept of Food safety is not anew one. From the beginning of hu-manity, food had some sacred mea-ning and, for that reason, it has beenconsidered that eating must not leadto any health problem.We all know that, even nowadays, so-me types of foods, like pork, are stillsubmitted to religious prohibitions (forJews and Muslins especially), even ifthey are no more in relation with anyconcrete health problem, they haveanyway to be considered as prescrip-tions written in the Bible or the Coran. In fact, from a long time, food has be-en incriminated in problems of illnessbut the origin of contaminations was notknown. One of those crisis, related tobread was described firstly by Ademarde Chabannes in 997. The illness wasvery severe and a lot of people diedfrom in the center of France; however,people were very poor and they had tomake a cruel choice: eat the contami-nated bread or not to eat at all and die.Most often, Food security problems hadto be taken under consideration beforethose of Food safety.The agent of the disease, Clavicepspurpurea, was identified, at the begin-ning of the 19th century only by a bo-tanist called Candolle.

When we have the opportunity to le-arn a little about the history of fears re-sulting from the ingestion of food (avery interesting book written byMadeleine Ferrières and published in2002), we are conscious that, duringmany centuries, even if the situationwas very different from now as theexistence of microbes was not known,different approaches concerning therisks related to food were undertaken.From different examples, we can fo-resee what is called now “RiskEvaluation”; different groups of peo-ple: scientists, experts, profane, maybe consulted to give their advice andtry to find a consensus; then, the de-cision may be taken by a magistrateand, sometimes, somewhat differentfrom that of the experts.The discovery of the existence of mi-croorganisms has opened a decisivestep in the comprehension of the ori-gin of food diseases. However, we ha-ve to keep in mind that, by intuition,empirically, men were conscious ofthe presence of microorganisms in fo-od. As an example, we know that the-re was a brewery in Babylona, mostprobably 5 to 7 thousand years BeforeChrist (B.C.) We know also that saltfrom the Dead Sea was used to pre-serve Food, that Babylonians andChinese even prepared fermentedsausages 1500 years B.C. They knewwhat they could do but they did notknow why they were so successful. Many centuries passed along: accor-ding to James M. Jay, 1978, in“Modern Food Microbiology”, “the firstscientist who suggested the role of mi-

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Evolution of food safety andmicrobiological methods: a few

considerations and comments

Cécile Lahellec Honorary Research Director, French FoodSafety Agency(cecile.lahellec@sfr.fr)

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croorganisms in food was probably A.Kircher who, as early as 1658, obser-ved decaying bodies, meat, milk andother substances and saw what he re-ferred to as “worms” invisible for thenaked eye. It is then, possible to takeunder consideration the works of L.Spallanzani (1765), who observedthat beef broth submitted to boiling forone hour and sealed remained sterilebut he did not succeed in convincinghis colleagues because the treatmentto which the broth had been submit-ted excluded oxygen. A lot of resear-ches were carried out consequently.We can remember here especially,the beginnings of canning; in 1795,the French government offered a pri-ze of 12000 fr for the discovery of apractical method of food preservation.In 1809, a Parisian confectioner,François (Nicolas) Appert could pre-serve meats in glass bottles that hadbeen kept in boiling water for varyingperiods of time. This discovery wasmade public in 1810 when Appert wasissued a pattern for his process. Notbeing a scientist, Appert was probablyunaware of the long-range significan-ce of his discovery or why it worked.This is, of course, the beginning ofcanning as it is known and used to-day. This event occurred some 50 ye-ars before Louis Pasteur demonstra-ted the role of microorganisms inFrench wines, a development whichgave rise to the rediscovery of bacte-ria (they were seen under a microsco-pe and described by A. Leeuwenhoekin 1883 but it is unlikely that Appertwas aware of this development sincehe was not a scientist andLeeuwenhoek’s report was not availa-ble in French.The first man to appreciate and un-derstand the presence and role of mi-croorganisms in food was LouisPasteur who, in 1837, showed that thesouring of milk was caused by micro-organisms; he employed for the firsttime the use of heat to destroy unde-sirable microorganisms in wine andbeer (pasteurization).

The evolution of microbiologi-cal methodsThe first real developments in Foodmicrobiology can be observed afterthe Second World War only: as nowa-days, the evaluation of Food safetyalways began by a visual inspectionand microbiology was used as a helpto the decision.The microbiological techniques used,which, in France, were taught from theearly fifties by R. Buttiaux (who wasa physician), in the Pasteur Institute inLille (France) derived from the disco-veries of Louis Pasteur. I was lucky tofollow the courses in 1967 and 1968.If I remember well, in May, each year,it was possible to learn through theo-retical and practical work all bases ofFood microbiology; four courses wereorganized: one on water, one on me-at and derived products, one on milkand dairy products, and the last oneconcerned all other types of food pro-ducts (fish or poultry, for example). Istill have those courses in mind as R.Buttiaux had never any paper to helphim during his presentations. Fromthat time, he taught us about the eco-logical development of microorga-nisms; concerning the practical work,he was very keen of the way we we-re conducting the manipulations and,to help us, we could follow on a scre-en all developments; we had also toknow by heart the characteristics ofmicroorganisms; we were consciousto learn the real basis of Food mi-crobiology. Those techniques are theconventional ones used at referencemethods even if, of course, a lot ofimprovements have been afforded,new media have appeared of the mar-ket, a lot of specifications have beengiven in the purpose of accreditation,as we’ll see later, new technologiesmay be introduced in some cases (Ithas to be mentioned that, In France,the first regulation giving microbiolo-gical criteria, published 21stDecember 1979, gave criteria and therelated microbiological conventionalmethods ). Quite at the same period,

due to the necessity of examining asufficient number of samples, repre-senting as closer as possible the po-pulation, many scientists began tothink to alternative methods whichmay be used in laboratories in orderto control and maintain Food safetyin most countries. The first scientist topropose practical solutions is some-body who, providentially, is among ustoday, and I’d like to tell you a story Irepeat every year: I was participatingin a symposium in Kiel(D) in 1974. Ican’t forget it. I did not present any-thing on that day; I was just learningand listening at the different paperswhen, suddenly, we had a very inte-resting and unusual presentation: thespeaker, a young American Chinesewas quite “dancing”, showing beauti-ful slides: the miniaturized methodsused to detect or enumerate microor-ganisms from poultry was the subjectof his presentation: he was using mi-croplates instead of tubes and a mi-cro-inoculator instead of platina lo-ops. He had a very simple principle“THINK SMALL”. As I was working onpoultry meat microbiology and wasvery much interested by rapid andeconomic methods in order to studya large number of strains simultane-ously, I met Dr. Fung at the end of thesession, asking for informations andreprints; I must say it was the begin-ning of a long story, first because hesent me reprints and even his thesisand, from that time we became verygood friends but I must say, too, thatit opened me new horizons, new con-tacts and a willingness to communica-te about the possibilities which wereoffered to food microbiologists: theycould use rapid method which were,till that period, used in the medicalfield only. For me, it was the begin-ning of a long story in science andfriendship. Dr. Fung visited ourInstitute in 1976 and, from that time,miniaturized methods were introducedin our laboratory and used to identifya lot of strains to trace Salmonella,then different types of pathogenic mi-

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croorganisms “from farm to fork”; wewere so enthusiastic with those me-thods that we presented the techniqueas well as the results during differentmeetings in different laboratories: wewanted those methods be adopted bythe scientific community and were so-mewhat successful. In fact, Dr. Fungis really the “father” of all the commer-cial methods of identification whichappeared on the market from the se-venties, and I must say I have beenvery lucky to stay in his laboratory du-ring 2 months in 1980. Simultaneously, different scientistsaround the world began to think tonew techniques derived from differentbranches of Science; in fact, the mi-crobiological controls taking place inindustrial laboratories, they had to finda way in order to:• Get a rapid answer in order to can-

cel any abnormality in processingfood and, by that way, avoid to puton the market some products whichwould not fill regulatory standards orstandards proper to the concernedindustry.

• Low cost in order to allow a highnumber of samples to be examined.

All that being realized, keeping inmind the results have to be acceptedby the scientific community. In that context, many efforts have be-en proposed quite early, in order to setup methods based on the followingprinciple: the microbial population isevaluated by detecting a signal rela-ted with the activity of microorga-nisms, most often an enzymatic or theconcentration of a molecule (coenzy-me, metabolite) or a change appea-ring in the medium (pH or Redox po-tential impedance, heat productionvariation) in connection with that ac-tivity. Radiometric methods were pro-posed and studied by P. Mafart inQuimper. A lot of methods based on immuno-logy have been developed but it se-ems that, during the last decade, themost spectacular developments haveconcerned the introduction an use of

methods based on molecular biology,including now DNA chips, which me-ans a fantastic technological evolu-tion, for the characterization ofstrains. During the week, you will belucky to learn a lot about the evolu-tions but one of the difficulties, ofcourse, was to make the commercialtechniques accepted for official con-trols. That is the reason why I wouldlike to share with you an example ofthe difficulties encountered to introdu-ce new technologies in regulations.

The long way for the officialacceptance of alternative mi-crobiological methodsThe problem of acceptance of alterna-tive microbiological methods has be-en thoroughly studied during the pastyears and somewhat solved, due es-pecially to the actions undertaken inISO and CEN meetings. Those two or-ganizations will be described shortlyin order to better understand the con-text. • ISO (International StandardsOrganization) is the InternationalStandards Organisation; this organi-zation was created in October 1946;its seat is located in Geneva (CH); thecreation results from the fusion of twoorganizations: – ISA which was the International

Federation of National Associationsof Standardization, founded in NewYork in 1926.

– UNSC, i.e Committee for coordina-tion of standardization of UnitedNations, created in 1944.

The first national Assembly was heldin 1949 in the great amphitheater inSorbonne (Paris). ISO is composed of247 committees. All standards are ob-tained by consensus; however, theyare not mandatory. The technicalcommittee in charge of Food micro-biology is TC34 / SC9; the actual pre-sident is Bertrand Lombard (F); themeetings are held in a differentcountry each year; for example, in2009, the meeting was held inValencia (Spain); In June 2011, the

meeting was held in Bournemouth(UK); as usual, it was a joinedISO/CEN meeting.• CEN, Comité Européen deNormalisation (“European Committeefor Standardization”) has been crea-ted in 1961 in order to harmonize thestandards elaborated in Europe; thatmeans that the standards are man-datory in all countries of EC ( at thecontrary, the standards which are ela-borated by ISO are facultative, whichmeans a great difference… All mem-bers are members of ISO as well. The seat of CEN is located in Brussels(B). In the beginnings, it was createdby the national organisms for standar-dization from France, Germany andBenelux countries. Nowadays, the fullmembers are the 27 countries of EUand the three contries of AELE(Association Européenne de LibreEchange) which own such an orga-nism (Switzerland, Norway andIceland). CEN elaborates technicalstandards in favor of international tra-de.CEN/TC275/WG6 was created in1993 and I was nominated as the con-venor; nowadays, from July 2005,Alexandre Leclercq from InstitutPasteur in Paris, is in charge of thegroup. From the beginnings, one main prin-ciple has been followed during thework of this group, i.e the ViennaAgreement; this agreement requiresthat, as often as possible, ISO me-thods are taken In order to avoid anyoverlap, there is also an agreementbetween different groups of CEN thatonly one group is in charge of a par-ticular method (the “ Vienna agree-ment”). For example, TC302 in char-ge of milk and dairy products analy-sis may choose one specific techni-que. In this case, it requests TC275/WG6 to refer to this specific tech-nique in the standard method. Thenecessity of taking into account theexperience of other groups around theworld, for example AOAC and IDF(International Dairy Federation), has

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also been emphasized from the begin-ning and, presently, the basis for a go-od cooperation has been set up. In order to maintain a good interna-tional cooperation, one part of the me-eting concerns the liaison with otherorganizations, ie: International DairyFederation (IDF) Codex Committeeon Food Hygiene, AOAC (Associationof Official Analytical Chemists), WHO(World’ Health Organisation), IUMS(International Union of MicrobiologicalSocieties). The necessity of getting aninternational consensus, especiallywith Codex Alimentarius, is alwayskept in mind. Due to the evolution of techniquesproposed, one important problem dis-cussed during many ISO /CEN mee-tings has been the introduction of newtechnologies in Food microbiologicalmethods and, to finalize the project,it took a very long time…Finally, an important resolution wastaken during the joined meeting heldin Parma (It) in April 2004.– Each time a standard method is

being revised, the possibility ofusing new technologies, includingPCR, must be examined by com-paring results with those obtainedwhen using the official conventionalmethod.

– For a given microorganism, in orderto complete the existing method, thedevelopment of standardised me-thods based on new technologiescan be proposed when the purpo-se to be obtained (for example pa-thogenicity level) makes it neces-sary.

– When new technologies, includingPCR, are used as alternative me-thods, they must be validatedagainst the reference method.

Those sentences look probably asquite simple, but I am sure you cannotimagine how many hours of discus-sions which were necessary to obtaina consensus: that is “international co-operation”. But the hours of discus-sions were very fruitful… as, finally,rapid methods were accepted accor-

ding to the EC regulation 2073 15December 2005 concerning microbio-logical criteria:“Test results are dependent on theanalytical method used and, therefo-re, a given reference method shouldbe associated with each microbiologi-cal criterion. However, Food businessoperators have the possibility to useanalytical methods other than the re-ference method, in particular more ra-pid methods, as long as the use ofthese alternative methods provideequivalent results”.So, alternative methods were finally,officially accepted in the EC, which issurely an important step in the newcontext of Food safety as a lot of con-trols and investigations have to be re-alized.

The new context of FoodSafetyThe new context which will be descri-bed shortly thereafter has taken placein the early 1990’s after different foodcrisis which may be explainedthrough different reasons.The types of foods we eat is very dif-ferent of that we ate 50 years ago; anda lot of microbiological changes maybe observed according to the food,the conditions of preparation, of sto-rage. As an example, I still rememberthe time when crude vegetables, asminced carrots, appeared on the mar-ket; a lot of controls began which sho-wed the presence of Yersinia (inclu-ding some Yersinia enterocolitica),and some types of fears suddenly ap-peared; at that time, they concernedmore the scientists than the consu-mers who were not really informed ofany eventual, potential danger. At thattime, even if some familial outbreakswere published, the situation was re-ally very different from now.There are also large changes concer-ning the origin (different types of me-ats or vegetables, etc., come from dif-ferent parts of the world); moreover,different meals are prepared in a cen-tral place, then distributed around…

That explains the contamination of alot of people from a unique prepara-tion.Those changes have led progressi-vely to large outbreaks which havebeen known from the consumers.Nowadays, each incident seems to bepublished immediately in the newspa-pers, and that is very different fromwhat we could observe, even 20 ye-ars ago. I always remember what I he-ard in 1992: I was in Washington DCfor a Codex Alimentarius meeting andI went to a travel agency to change myplane ticket. At the desk, a nice ladyasked me: “which is the reason ofyour stay in US?” I answered I wasparticipating in the Codex Hygieneand she asked me: “are you aware ofthe problems of E. coli?” I was reallysurprised by that question and I re-membered that this year.In fact, from 1992, we have had to fa-ce different problems of Food safety.As an example, we can remember theproblems of Listeria monocytogeneswhen the responsibility in differentoutbreaks have been discovered;then, other foodborne diseases havetaken place in the public debate. The result of those food crisis, whichwere better and better investigateddue to new techniques and new tech-nologies have led, in Europe, to largechanges in the apprehension of FoodSafety: I want to speak of the crea-tion of Food Safety agencies in quiteall European countries and, in 2002,the creation of the European FoodSafety Agency. All problems are nowinvestigated according to a protocol ofRisk analysis. In order to set up a go-od Risk assessment necessitates tohave a lot of good and representativedata –and that is very difficult in micro-biology–; in that context, the impro-vement of methods as well as the in-troduction of predictive microbiologycan help but realistic quantitative riskanalysis are only a few at the momentas microbes are alive and can growand multiply in very different condi-tions; a lot of analytical problems are

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not solved, in spite of many improve-ments; virulence characterization isalways very difficult to appreciate andmay vary even for strains belonging toa same species; we have also to con-sider a lot of factors which may in-fluence the growth or, simply, the sur-vival of microorganisms (pH, tempe-rature, water activity, oxygen, natureof the food and available substra-tes…); then, we must not forget the in-dividual susceptibility… A quantitativeevaluation of microbial risk will alwaysbe very difficult to set up.Whichever the context in which we tryto put the microbes, they will alwaysmake us know their personality! That seems very important at a periodwhen young microbiologists may for-get they are working on microbes andmany teachers in universities thinkthat problem has to be seriously takenunder consideration. Of course, wehave to recognize we are far from thetime we were drawing the shape ofmicrobes when looking in a micros-cope !! Probably, an equilibrium has tobe found in order the improvement oftechniques does not hidden the realworld microbiologists are studying.

What to say as a conclusion?At first, the problems of Food Safetyare not new (M. Ferrières asks “whatis new?”) but, of course, along the cen-turies, the world has changed (thetypes of foods we eat are very differentfrom those of the Middle age, or evenvery different from what we had 50 ye-ars ago, the origin of food is worldwi-de, the way of eating) and the way ofapprehension of the problems too.All changes in our environment, ourway of living and eating, the type ofpublished informations, have led to ra-dical changes. Different crisis:Listeriosis, BSE have led to a newway of apprehension of the problemsand the creation of national Food sa-fety agencies, then of the EFSA(European Food Safety Agency).And, suddenly, I realize, that, perso-nally, I have been living one important

period of the History of Food safetyand I would like to share with you so-me comments as a conclusion:The reason why I have been interes-ted in pathogenic microorganisms asSalmonella in the early 70’s was thedevelopment of further processedpoultry products on the market; at thattime, the Ministry of Agriculture wasafraid of potential Public health pro-blems due to the contamination of tho-se products; we were then requestedto participate in the elaboration of mi-crobiological criteria. That was the be-ginning of the story; we observed theSalmonella contamination of a some-what high percentage of products anddecided to look at the origin. A lot ofepidemiological surveys were then re-alized which made us observe thecontamination “from farm to fork”, butthe communication was very difficultat that time because there was notany obvious problem of public health.Later on, the problem of the verticaltransmission of Salmonella througheggs seemed more important to thepublic authorities, and especially be-cause it was officially worldwide.Some physicians were involved in theproblem, visiting US as well to try tounderstand what did happen; epide-miological surveys were realized andthe results were published in profes-

sional journals; more and more peo-ple began to be aware of the pro-blems. Simultaneously, rapid/alternative me-thods were developed on the marketand catch on (the first API gallerieswere found on the market from 1970),but there was no official acceptance. Then, from 1992, the Food safetyproblems became catched on fromthe media when the evidence of fo-odborne transmission of Listeriosiswas shown. At that time, our labora-tory was involved in methods of detec-tion; simultaneously, I participated inmeetings organized in Paris by the“Conseil supérieur d’hygiène publiquede France”; those were the first appro-aches to the creation a few years la-ter, of the Food Safety Agencies..During the same period too, the stan-dardization bodies (AFNOR inFrance, CEN in Europe, and ISO) we-re more and more involved in the pro-blems of acceptance of alternative mi-crobiological methods.I feel lucky to have been involved inall those developments.But a long way remains and the im-provement of our knowledge in Foodsafety must not make us forget the to-pic is a very difficult one. Microbes arealive and will make them know if weare tempted to forget the reality.

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All changes in our environment, our wayof living and eating, the type of

published informations, have led toradical changes. Different crisis:

Listeriosis, BSE have led to a new way ofapprehension of the problems and the

creation of national Food safetyagencies, then of the EFSA (European

Food Safety Agency)