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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Maestría en Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agropecuarias
2020
Establecimiento y caracterización de una línea celular derivada de Establecimiento y caracterización de una línea celular derivada de
tejidos embrionarios de la mosca Calliphora vicina Diptera: tejidos embrionarios de la mosca Calliphora vicina Diptera:
Calliphoridae Calliphoridae
Ingred Pinillos Medina Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Pinillos Medina, I. (2020). Establecimiento y caracterización de una línea celular derivada de tejidos embrionarios de la mosca Calliphora vicina Diptera: Calliphoridae. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/maest_ciencias_veterinarias/84
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ESTABLECIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR DERIVADA
DE TEJIDOS EMBRIONARIOS DE LA MOSCA Calliphora vicina (DIPTERA:
CALLIPHORIDAE)
Ingred Pinillos Medina
PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA
Maestría en Ciencias Veterinarias
Bogotá D.C., julio de 2020
ii
ESTABLECIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR DERIVADA
DE TEJIDOS EMBRIONARIOS DE LA MOSCA Calliphora vicina (DIPTERA:
CALLIPHORIDAE)
Ingred Pinillos Medina, Código 76182201
Director:
Felio Jesús Bello García
Msc., PhD
Co-director:
Orlando Torres García
Msc., PhD
PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA
Maestría en Ciencias Veterinarias
Bogotá D.C., julio de 2020
iii
Dedicatoria
A Dios por darme la oportunidad de cumplir este logro en mi vida.
A mi mamá que desde el cielo, me sigue llenando de bendiciones.
A mi esposo Cesar, por su amor, paciencia y apoyo incondicional para ver realizado este sueño.
A mi hijo Juan Antonio por ser lo mejor de mi vida, mi mayor impulso y motivación.
A mis hermanas, Erika y Luisa Fernanda por apoyarme siempre para culminar este trabajo.
A mis sobrinos Jorge Alejandro y Juan Camilo por su apoyo incondicional y por darme la mano
siempre que lo necesite.
A mi ángel de la guarda, mi amiga incondicional, “mi Cindy”, gracias a Dios por traerla a mi
vida.
iv
Agradecimientos
Mi más sincero agradecimiento al doctor Felio Bello por darme la oportunidad de participar en
este proyecto, por su dirección, y acompañamiento para lograr los resultados de la presente
investigación.
Al doctor Orlando Torres por su colaboración, sus valiosos aportes a esta investigación, apoyo
permanente y amistad de toda una vida.
A la Bióloga Cindy Yormary Pérez, amiga y compañera del grupo de investigación, por su apoyo
y entrega incondicional para la obtención de los resultados finales de esta investigación.
A la Bacterióloga Yuly Bernal, por su apoyo permanente en los procesos desarrollados en los
laboratorios de Microbiología y Biología Molecular de la Universidad Antonio Nariño.
A la Universidad Antonio Nariño por facilitar los espacios, equipos e insumos necesarios para el
desarrollo del presente trabajo.
A la Universidad de La Salle por permitirme regresar a sus aulas para continuar con mi
formación profesional y darme las herramientas necesarias para seguir construyendo un camino
de desarrollo para el país.
v
Tabla de contenido
Introducción ........................................................................................................................................................1
Planteamiento del problema .........................................................................................................................5
Objetivos ...............................................................................................................................................................8 Objetivo general .......................................................................................................................................................................... 8 Objetivos específicos ................................................................................................................................................................. 8
Marco teórico y/o estado del arte......................................................................................................................9
Tipo y diseño de la investigación. .................................................................................................................. 18
Metodología ....................................................................................................................................................... 18 Uso de los insectos ...................................................................................................................................................................18 Situación geográfica: ..............................................................................................................................................................18 Desinfección de los huevos embrionados. ......................................................................................................................19 Explantes ......................................................................................................................................................................................19 Evaluación de los medios de cultivo .................................................................................................................................20 Morfología celular ...................................................................................................................................................................20 Control de calidad....................................................................................................................................................................20 Cariotipo ......................................................................................................................................................................................21 Extracción del ADN .................................................................................................................................................................22
Cultivos celulares de C. vicina ...................................................................................................................................... 22 Adultos de C. vicina .......................................................................................................................................................... 22
Técnica RAPD – PCR .............................................................................................................................................................24 Reconstitución de los cebadores ................................................................................................................................... 24 Amplificación del DNA................................................................................................................................................... 24
Electroforesis en gel de agarosa ........................................................................................................................................25 Análisis estadístico ...................................................................................................................................................................27
Resultados y Discusión .................................................................................................................................... 28 Establecimiento y mantenimiento de la colonia de C. vicina ..................................................................................28 Evaluación de medios de cultivo frente al crecimiento celular de los cultivos de C. vicina .......................28 Cultivo celular primario ........................................................................................................................................................30
Crecimiento celular ........................................................................................................................................................... 30 Curva de crecimiento celular ......................................................................................................................................... 34 Morfología celular ............................................................................................................................................................. 34 Cariotipo ................................................................................................................................................................................ 40 Caracterización molecular .............................................................................................................................................. 45 Criopreservación de los cultivos celulares ............................................................................................................... 50
Conclusiones ...................................................................................................................................................... 51
Recomendaciones .............................................................................................................................................. 52
vi
Referencias bibliográficas ............................................................................................................................... 53
Lista de Tablas
Tabla 1. Preparación de la solución de Grinding ............................................................................................ 23
Tabla 2. Componentes de la solución master mix .......................................................................................... 25
Tabla 3. Evaluación de medios de cultivo con relación a la adaptación celular ................................. 29
Tabla 4. Efecto de los medios de cultivo L15 y Grace/L15 en el crecimiento de los tejidos
embrionarios de C. vicina ......................................................................................................................................... 31
Tabla 5. Datos promedios de los cromosomas autosómicos y sexuales de C. vicina ..................... 44
Tabla 6. Comparación de los RAPD evaluados entre cultivos celulares y el estadio adulto de la
mosca C. vicina y la línea celular LULO ........................................................................................................... 46
Tabla 7. Comparación del índice de similaridad entre cultivo celular de C. vicina, mosca adulta
de C. vicina y la línea celular LULO.................................................................................................................... 49
vii
Lista de Figuras
Figura 1. Pruebas de control microbiológicas de los medios de cultivo celular A. Aislamiento en
agar sangre, B. Aislamiento en agar Mycocel, C+: Control positivo ........................................... 30
Figura 2. Evaluación del crecimiento celular en los medios de cultivo Grace y DMEM. ......... 32
Figura 3. Curva de crecimiento de la línea celular en Grace/L15 .............................................. 34
Figura 4. Crecimiento celular del tejido embrionario de C. vicina en medio L15 .................... 35
Figura 5. Crecimiento celular de los subcultivos de C. vicina en medio L15 ............................ 35
Figura 6. Crecimiento de los cultivos celulares de tejidos embrionarios de C. vicina en medio
Grace/L15 ..................................................................................................................................... 36
Figura 7. Crecimiento celular de los subcultivos de C. vicina en medio Grace/L15.................. 37
Figura 8. Formación de vesículas en cultivo primario de C. vicina en medio Grace/L15 ........ 39
Figura 9. Cariotipo en prometafase a partir de cultivo celular de C. vicina ............................... 41
Figura 10. Cariotipo de C. vicina a partir de cultivos celulares derivados de la especie.......... 43
Figura 11. Cariotipo de C. vicina a partir de cultivos celulares derivados de la especie.......... 43
Figura 12. Idiograma que muestra la clasificación de la variación en la posición centromérica de
los cromosomas derivados de los cultivos celulares de C. vicina. ................................................ 44
Figura 13. Perfil de DNA (RAPD_PCR), usando el iniciador A2 ............................................. 47
Figura 14. Perfil de DNA (RAPD-PCR), utilizando el iniciador A10 ....................................... 47
Figura 15. Perfil de DNA (RAPD-PCR), utilizando el iniciador A20 ....................................... 48
viii
Lista de Anexos
Anexo 1. Presentación oral en el Congreso Nacional de Entomología - SOCOLEN .................. 61
Anexo 2. Ponencia de Investigación en la Universidad de La Salle ............................................ 62
Anexo 3. Nominación al Premio Nacional de Entomología “Hernán Alcaráz Viecco” (HAV) .. 63
Anexo 4. Permiso marco de recolección de especímenes ........................................................... 65
ix
Resumen
La importancia de los cultivos celulares derivados de insectos radica en las aplicaciones que
tienen a nivel de medicina humana y veterinaria, agricultura y biotecnología. Especialmente,
estos cultivos celulares se han venido usando como sustratos para aislamiento e identificación de
virus, para la producción de proteínas recombinantes, pesticidas virales, vacunas e insecticidas,
como también en investigaciones básicas sobre genética, biología molecular, bioquímica,
parasitología y endocrinología. A pesar de que en la actualidad existe un número significativo de
líneas celulares que han sido establecidas de diversas especies de insectos, su aplicabilidad no
alcanza a cubrir toda la demanda que exigen los diversos problemas de investigación y/o los
procesos biotecnológicos relacionados con los campos de estudio donde estas células se podrían
requerir. En la actualidad no existe una línea celular derivada de esta especie, razón por la cual se
obtuvieron cultivos primarios, subcultivos y una línea celular derivada de Calliphora vicina
(Diptera: Calliphoridae), esta mosca es de importancia sanitaria, ya que se alimenta de materia
orgánica en descomposición, ocasionalmente genera miasis y puede ser un vector mecánico de
virus, bacterias y parásitos; también, desde el punto de vista forense, su importancia radica en
ser una de las primeras especies en colonizar cadáveres y, por lo tanto, las formas inmaduras son
utilizadas como herramienta en la determinación del intervalo postmortem. También, puede ser
utilizada en terapia larval. El objetivo general de este trabajo fue establecer una línea celular
x
derivada de tejidos embrionarios de C. vicina. Estos cultivos celulares fueron caracterizados
morfológica, citogenética y molecularmente. La fuente de tejidos embrionarios para efectuar los
explantes fueron huevos embrionados de C. vicina. Los tejidos embrionarios se sembraron en
cuatro medios de cultivo diferentes L15, Grace, Grace/L15 y DMEM, con pH entre 6.8 y 7.2 y
fueron incubados a 28ºC, sin atmósfera de CO2. Sólo el medio Grace/L15 proporcionó las
mejores condiciones para la adaptación, adhesión y proliferación celular. La monocapa
confluente se obtuvo a los 8 días después de realizados los explantes. Inicialmente, la morfología
predominante de las células fue heterogénea, luego en los subcultivos las formas celulares
fueron fibroblastoides similares a nerviosas y en menor proporción epitelioides. El cariotipo de
los cultivos celulares presentó una configuración diploide (2n=12), siendo el cromosoma X el de
mayor longitud. Los pares de cromosomas autosómicos 1, 2, 4 y 5 fueron metacéntricos, el par 3
fue submetacéntrico y el par sexual metacéntrico. Se obtuvieron los patrones característicos de
ADN con la técnica de PCR-RAPD a partir de la línea celular de C. vicina. Los resultados de los
marcadores A2, A10 y A20 fueron utilizados para analizar el índice de similaridad entre los
cultivos celulares y la fase de adulto de C. vicina, la cual estuvo en el rango de 0,88 a 0,96. Así
mismo, la línea celular de C. vicina comparada con la línea celular LULO registró un rango
entre 0,37 a 0,66. Los cultivos celulares de tejido embrionario de C. vicina podrían,
potencialmente, ser a mediano plazo una alternativa para el aislamiento de péptidos
antimicrobianos y moléculas involucradas en la regeneración y recuperación de tejidos,
utilizados para el tratamiento de heridas de la piel o úlceras crónicas asociadas con
leishmaniosis; así mismo, en úlceras de pie diabético. De igual manera,, podrán ser utilizados en
las múltiples aplicaciones que, en general, presentan las líneas celulares derivadas de insectos.
xi
Palabras clave: Calliphora vicina, cultivos celulares, morfología celular, cariotipos, RAPD-
PCR.
Abstract
The importance of cell cultures derived from insects lies in the applications they have at the
level of human and veterinary medicine, as well as in agriculture and biotechnology. Especially,
these cell cultures have been used as substrates for virus isolation and identification, for the
production of recombinant proteins, viral pesticides, vaccines and insecticides, as well as in basic
research on genetics, molecular biology, biochemistry, parasitology and endocrinology. Despite
the fact that currently there is a significant amount of cell lines that have been established for
various species of insects, their applicability does not cover the demanded amount by the various
research problems and / or biotechnological processes related to the fields where these cells
might be required. Currently, there is no cell line derived from this species, which is why
primary cultures, subcultures and a cell line derived from Calliphora vicina (Diptera:
Calliphoridae) were obtained, this fly is of sanitary importance, since it feeds on material
decomposing organic, occasionally generates myiasis and can be a mechanical vector of viruses,
bacteria and parasites; Also, from the forensic point of view, its importance lies in being one of
the first species to colonize carcasses and, therefore, immature forms are used as a tool in
determining the postmortem interval. Also, it can be used in larval therapy. The general objective
of this work was to establish a cell line derived from C. vicina embryonic tissues. These cell
xii
cultures were characterized morphologically, cytogenetically, and molecularly. The source of
embryonic tissues to carry out the explants were C. vicina embryonated eggs. The embryonic
tissues were seeded in four different culture media L15, Grace, Grace / L15 and DMEM, with a
pH between 6.8 and 7.2 and were incubated at 28ºC, without CO2 atmosphere. Only Grace / L15
medium provided the best conditions for cell adaptation, adhesion, and proliferation. The
confluent monolayer was obtained 8 days after the explants were performed. Initially, the
predominant cell morphology was heterogeneous, then in the subcultures the cell forms were
nerve-like fibroblastoids and to a lesser extent epithelioid. The karyotype of the cell cultures
presented a diploid configuration (2n = 12), with the X chromosome being the longest.
Autosomal chromosome pairs 1, 2, 4, and 5 were metacentric, pair 3 was submetacentric, and the
sexual pair metacentric. The characteristic DNA patterns were obtained with the PCR-RAPD
technique from the C. vicina cell line. The results of markers A2, A10 and A20 were used to
analyze the similarity index between cell cultures and the adult phase of C. vicina, which was in
the range of 0.88 to 0.96. Likewise, the C. vicina cell line compared to the LULO cell line
registered a range between 0.37 to 0.66. Embryonic tissue cell cultures of C. vicina could
potentially be a medium-term alternative for the isolation of antimicrobial peptides and
molecules involved in tissue regeneration and recovery, used for the treatment of skin wounds or
associated chronic ulcers. with leishmaniasis; likewise, in diabetic foot ulcers. Similarly, they
can be used in multiple applications that, in general, present the cell lines derived from insects.
Key words: Calliphora vicina, cell cultures, cell morphology, karyotypes, RAPD-PCR.
Introducción
Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy, 1830) pertenece a la familia Calliphoridae y es una
mosca necrófaga y hemisinantrópica (Figueroa-Roa & Linhares, 2002; Pinilla, Patarroyo, &
Bello, 2013). Esta especie tiene importancia a nivel ecológico, médico y sanitario, debido a sus
hábitos de alimentación y a las etapas en su desarrollo biológico, razón por la cual, pueden ser
vectores mecánicos de patógenos, tales como virus, bacterias, hongos, protozoos y helmintos y
también sus larvas pueden llegar a causar miasis en algunos vertebrados, incluido el hombre
(Montoya, Sánchez, & Wolff, 2009). Así mismo, C. vicina es importante en investigaciones
médico- legales, debido a que puede ser utilizada en la determinación del intervalo postmortem,
al participar como primer colonizador de cuerpos en descomposición (Martinez, Duque, &
Wolff, 2007; Segura, Usaquén, Sánchez, Chuaire, & Bello, 2009).En Bogotá, específicamente en
una zona semirural, fue registrada como especie colonizadora de cuerpos de cerdo en
descomposición, el cual, a su vez, se considera biomodelo animal usado para experimentación en
Entomología Forense (Segura et al., 2009). La mosca tiene una relación estrecha con el hombre;
por lo tanto, es considerada una especie altamente sinantrópica (Pérez, Segura, Patarroyo, &
Bello, 2016). De acuerdo con su distribución, C. vicina se encuentra en la región Holártica y en
el Neotrópico, se ha reportado en países como Argentina, Uruguay, Brasil, Chile, Cuba, Panamá
(Kosmann, Mello, Harterreiten-Souza, & Pujol-Luz, 2013; Whitworth & Rognes, 2012). En
Colombia se registra en los departamentos de Casanare, Tolima, Santander, Caldas, Valle del
Cauca, Meta y Cundinamarca, particularmente en la Sabana de Bogotá, en zonas ubicadas a 2500
metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.) (Amat, Vélez, & Wolff, 2008; Camacho C., 2005;
Florez & Wolff, 2009).
2
Desde comienzos del siglo XX, algunos investigadores trataron de obtener células de insecto
in vitro (Lynn, 2002), pero no fue sino hasta 1962 cuando Grace, a partir de ovarios de un
lepidóptero, la polilla Emperador Australiana (Antheraea eucalypti Scott, 1864), estableció la
primera línea celular (Grace, 1962). Desde entonces hasta nuestros días, se han establecido más
de 500 líneas celulares de insectos, correspondientes a, aproximadamente, 120 especies, la
mayoría, de las cuales, pertenecen a los órdenes Diptera y Lepidóptera (Lynn, 2002, 2016).
Los cultivos celulares de insectos han contribuido al desarrollo de estudios fisiológicos de las
especies, de las cuales se derivan (Khurad et al., 2009; Zhang et al., 2012). También, son
herramientas importantes en campos como la inmunología, biología y en investigaciones sobre
biopesticidas ( Harrison & Lynn, 2008; Sudeep, Mourya, & Mishra, 2005). Por otro lado, estos
sustratos celulares son considerados un recurso potencial importante en biología molecular,
debido a su uso en un amplio rango de investigaciones aplicadas; así mismo, han resultado de
gran utilidad en el estudio de las interrelaciones parásito-hospedero, en la propagación de
patógenos específicos, en biofarmacéutica y en la expresión de proteínas recombinantes (Cruz &
Bello, 2012) Cervarix®, vacuna contra el virus del papiloma humano, fue el primer producto
comercial producido por el sistema baculovirus-vector (Mena & Kamen, 2011). La aparición del
sistema vector de expresión baculovirus a comienzos de 1980, para la producción de proteínas
heterólogas, adicional a los avances en ingeniería metabólica, ha permitido convertir el cultivo
de células de insecto en una nueva tecnología de gran utilidad en estudios biomédicos
(Ikonomou, Bastin, Schneider, & Agathos, 2001), aumentando así el interés en el desarrollo de
nuevas líneas celulares (Sudeep et al., 2005).
3
Además de las aplicaciones de los cultivos celulares derivados de insectos, señaladas
anteriormente, existe una demanda creciente de ellos en biología celular y, particularmente, en
estudios genómicos funcionales de insectos, sin descartar el hecho que estas líneas celulares,
originadas de una gran variedad de especies, difieran en su capacidad para replicar virus y
expresar proteínas recombinantes (Goodman et al., 2012), razón por la cual, se hace necesario
establecer nuevas líneas celulares de insectos (Goodman, Ringbauer, Li, Lincoln, & Stanley,
2017; Zheng, Li, & Li, 2014), precisamente, para apoyar y para avanzar en todos los procesos
indicados.
A pesar de que existen dos estudios relacionados con el ciclo de vida y parámetros
reproductivos y poblacionales (Pérez et al., 2016) y que a la fecha existe un reporte de cultivos
primarios a partir de cuerpos grasos y hemocitos de C. vicina (Yakovlev et al., 2017); no hay
reportes en la literatura científica de cultivos celulares derivados de tejido embrionario de esta
especie siendo un campo inexplorado y que posibilitará hacia el futuro próximo estudios a nivel
celular y molecular; también, para disponer de un nuevo sustrato celular que pueda ser usado en
otras áreas como biomedicina humana y veterinaria, endocrinología, virología, parasitología,
bioquímica, inmunología, entre otras ramas de aplicación (Goodman et al., 2017).
El establecer y caracterizar un cultivo celular de C. vicina, facilitará a futuro estudiar los genes
encargados de la producción de las sustancias antimicrobianas (péptidos antimicrobianos) y de las
sustancias involucradas en la regeneración y/o recuperación del tejido afectado. Para la familia
Calliphoridae solamente existen dos registros de cultivos celulares primarios, que corresponde a
4
las especies Lucilia sericata (Echeverry, Zapata, Segura, & Bello, 2009) y Sarconesiopsis
magellanica (Cruz & Bello, 2012)
El objetivo principal del presente trabajo fue establecer y caracterizar un cultivo celular derivado
de tejidos embrionarios de la mosca C. vicina.
5
Planteamiento del problema
¿Por qué establecer y caracterizar una línea celular derivada de tejidos embrionarios de la
mosca C. vicina? Aún no hay reportes en la literatura científica de cultivos celulares de origen
embrionario de C. vicina siendo un campo inexplorado y que posibilitará a corto plazo estudios
avanzados a nivel celular y molecular; también, se podrá disponer de un nuevo sustrato celular
que pueda ser usado en otras áreas como biomedicina humana y veterinaria, endocrinología,
virología, parasitología, bioquímica, inmunología, entre otras aplicaciones. También, el
establecer y caracterizar cultivos celulares a partir de C. vicina, facilitará estudiar los genes
encargados de la producción de sustancias antimicrobianas (péptidos antimicrobianos) y de otras
moléculas involucradas en la regeneración y/o recuperación de tejidos afectados. La
identificación y producción de estas proteínas, a mediano plazo, con efecto antibiótico
posiblemente tendrán usos a nivel clínico y farmacéutico para combatir enfermedades que
afectan a seres humanos y/o animales cuando haya presencia de heridas crónicas con infecciones
bacterianas y que tradicionalmente son manejados con medicamentos alopáticos que pueden
llegar a ser muy costosos y no estar al alcance de algunos grupos de personas con ingresos
económicos bajos; además, del problema creciente de la resistencia que presentan los
microorganismos a estos antibióticos convencionales. Adicionalmente, ante los requerimientos
de nuevas fuentes de proteína para los alimentos, para las industrias dedicadas a esta actividad,
los insectos han adquirido gran interés ya que sus proteínas (40 – 75g/ 100g de peso seco) son de
alta calidad y digestibilidad (77 – 98%), siendo también fuente de minerales y de aminoácidos,
11esenciales y 7 no esenciales además de vitaminas y energía; estos hallazgos convierten a las
líneas celulares de insectos en una nueva y promisoria fuente de alimentación con calidad para el
6
mundo al aumentar el contenido proteínico de las comidas (Verkerk, Tramper, van Trijp, &
Martens, 2007).
El establecimiento de una línea celular de insectos es la creación de un sistema que ha
demostrado tener ventajas sobre una línea celular de mamíferos, ya que requiere menor tiempo
de duplicación, una temperatura de crecimiento óptimo más baja, y en general, es menos
sensibles a cambios de pH, temperaturas o choques osmóticos y, además, en la actualidad existen
medios de cultivo que no requieren ser suplementados con suero fetal bovino (Ikonomou,
Schneider, & Agathos, 2003). Siendo, los cultivos celulares, considerados como sistemas
biotecnológicamente promisorios que permiten realizar diversos estudios en la evaluación de
procesos ecológicos celulares, las interacciones célula -célula, el seguimiento de actividades
intracelulares como procesos de transcripción, síntesis de proteínas, flujo intracelular de
metabolitos y producción de bioinsecticidas (Lynn, 1999; Sudeep et al., 2005).
En los últimos años, se han venido desarrollado diversos trabajos como el estudio de la
secuencia de eventos que ocurren para la señalización de los ecdisteroides en células epidermales
de artrópodos (Smagghe, Goodman, & Stanley, 2009), el estudio de la respuesta inmune de los
mosquitos Aedes albopictus y A. aegypti (Schmid-Hempel, 2005), infección de cultivos celulares
de insectos con iridiovirus (Smagghe et al., 2009), estudios de control de plagas agrícolas,
inicialmente desarrollado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, sin
considerar un gran número de publicaciones que reportan la importancia que ha ido adquiriendo
la utilización de cultivos celulares de vertebrados y de invertebrados en los avances de la ciencia
y, particularmente, de la medicina (Akiyama, Iwabuchi, Furukawa, & Morishima, 2008;
7
Ikonomou et al., 2003; Sudeep et al., 2005). Los cultivos celulares son una herramienta científica
que permite economizar reactivos al trabajar directamente sobre el material de interés,
prescindiendo de la utilización de animales vivos, en los cuales las respuestas podrían estar
sujetas a otros procesos fisiológicos como reacciones del sistema inmune y la relación misma
entre el hospedero y el parásito, aspectos sobre los cuales aún no se puede tener control (Baust et
al., 2017).
8
Objetivos
Objetivo general
Establecer y caracterizar una línea celular derivada de tejidos embrionarios de la mosca C.
vicina.
Objetivos específicos
Evaluar diversos medios de cultivo que posibiliten la adaptación y el crecimiento de las
células derivadas de huevos embrionados de C. vicina.
Identificar las características morfológicas de los cultivos celulares, tanto a nivel de cultivos
primarios como de subcultivos, obtenidos a partir de tejidos embrionarios de la especie
seleccionada.
Determinar el cariotipo de los cultivos celulares y establecer los análisis morfométricos
correspondientes.
Tipificar el patrón molecular de los cultivos celulares de C. vicina, con base en marcadores
RAPD (Polimorfismo diferencial de regiones amplificadas al azar, vía de la Reacción en Cadena
de la Polimerasa-PCR)
9
Marco teórico y/o estado del arte
Se han reportado aproximadamente 1000 especies correspondientes a la familia Calliphoridae,
las cuales se distribuyen en casi todas las zonas zoográficas; se caracterizan por ser moscas
caliptradas de color verde o azul metálico y de tamaño medio entre 4 a 16 mm (Tomberlin et al.,
2017; Wolff & Kosmann, 2016). Las larvas tienen hábitos alimenticios de tipo saprófago y
necrófago y los adultos usan la materia orgánica en descomposición, como una fuente proteica
indispensable para la maduración de los huevos, la oviposición y la reproducción (Yakovlev,
Kruglikova, & Chernysh, 2019). La liberación de compuestos volátiles, producto de la
contaminación por bacterias es esencial para la atracción de moscas grávidas y para la
estimulación de la oviposición (Tomberlin et al., 2017). Las moscas son los primeros organismos
que colonizan no sólo cadáveres, sino también descomponen materia orgánica y heces de las que
se alimentan, crían y ponen huevos; debido a estos recursos que utilizan tienen importancia
forense, médica y veterinaria (Junqueira et al., 2017; Tomberlin et al., 2017; Yakovlev et al.,
2019); es decir, la presencia de estos especímenes es vital, no solo para la estimación del
intervalo post-mortem (IPM), sino también porque pueden ser agentes causantes de miasis y
además vectores mecánicos de patógenos, como bacterias, virus, hongos y parásitos producto de
la descomposición; siendo las bacterias de tipo Proteobacterias el vector principal (Förster et al.,
2007; Junqueira et al., 2017). Actualmente su importancia en el área de biomedicina está
relacionada con el uso de las larvas de moscas, que se han implementado para el tratamiento de
algunas enfermedades, como úlceras por presión, infección de heridas con microorganismos
resistentes, úlceras de pie diabético, quemaduras, osteomielitis, mastoiditis y tratamiento post-
10
quirúrgico de algunos tipos de cánceres; este procedimiento es conocido como Biocirugía o
terapia larval ( Sherman & Cooper, 2018).
C. vicina (Robineau-Desvoidy, 1830), es una mosca que tiene hábitos alimenticios de tipo
saprófago y necrófago, es decir, se alimenta de material orgánico en descomposición y utiliza
este sustrato para el desarrollo larval (Pérez et al., 2016). Presenta un comportamiento
eusinantrópico, es decir que se encuentra asociada a asentamientos humanos y también se ha
considerado una especie hemisinantrópica, habitando áreas rurales o suburbanas (Camacho,
2005).
Esta especie se encuentra distribuida en la región holártica (Aak, Birkemoe, & Leinaas, 2011)
y en el neotrópico ha sido reportada en México, Panamá, Argentina, Brasil, Uruguay, Chile
(Bermúdez C, 2007; Kosmann et al., 2013) y Colombia (Amat et al., 2008) en los departamentos
de Casanare, Tolima, Santander, Caldas, Valle del Cauca, Meta y Cundinamarca, en la Sabana de
Bogotá sobre los 2500 metros sobre el nivel del mar (Amat et al., 2008; Camacho, 2005; Florez
& Wolff, 2009).
Los insectos de la familia Calliphoridae a la que pertenece C. vicina, se encuentra en primer
lugar asociados a cadáveres animales y humanos, por lo cual son utilizados en entomología
forense al relacionarlos con el intervalo post-mortem (Clark, Evans, & Wall, 2006; Saigusa,
Matsumasa, Yashima, Takamiya, & Aoki, 2009), ocasionalmente se han reportado como
causantes de miasis y como vectores pasivos de Mycobacterium avium avium, M. a.
paratuberculosis y M. a. hominissuis (Fischer et al., 2004) y son aplicados en biocirugía larval,
11
razón por la cual son ampliamente utilizados en países como Inglaterra, Israel, Estados Unidos,
Argentina, Venezuela, entre otros ( Sherman, Hall, & Thomas, 2002), para curar heridas que no
responden a tratamientos convencionales utilizando antibióticos de alta generación, además se
prefieren por constituirse de un tratamiento no invasivo.
Los cultivos de tejidos se iniciaron a comienzo del siglo (Harrison, Greenman, Mall, &
Jackson, 1907) como un método para estudiar el comportamiento de las células animales libres
de variaciones sistémicas que pudieran surgir en el animal durante el proceso normal de
homeóstasis y bajo la presión de un experimento. La técnica fue elaborada primero con
fragmentos disgregados del tejido y el crecimiento fue restringido a la migración de células con
ocasionales mitosis en el crecimiento. A partir de los años 50, del siglo pasado, se empleó la
técnica de cultivos de células que sustituyó a los tejidos, la cual se refiere a los cultivos de
células dispersas que son tomadas de un tejido original, de un cultivo primario, de una línea
celular o de una cepa celular, mediante la disgregación enzimática, mecánica o química (Baust et
al., 2017).
La primera línea celular de insectos fue establecida a partir de tejidos de pupas de la polilla
Antherea eucalypti, en Australia por Grace en 1962. El modificó el medio de cultivo de Wyatt,
1956, con la adición de 10 vitaminas y formuló un nuevo medio conocido como medio de cultivo
Grace para insectos, el cual apoyó el crecimiento y mantenimiento de la línea celular. Este medio
de cultivo vino a ser popular debido a su utilidad en el establecimiento y mantenimiento de
muchas líneas celulares de insectos. Hoy esta formulación se encuentra disponible
comercialmente y muchos investigadores han modificado este medio para adaptarlo a sus
12
requerimientos con otras especies (Hurton, Berkson, & Smith, 2005). El estudio de los cultivos
celulares de insectos ha progresado en los siguientes años y más de 500 líneas celulares de
diferentes especies de insectos, principalmente de los órdenes díptera, lepidóptera, hemíptera,
homóptera y ortóptera, han sido descritas a la fecha (Lynn, 2002). Los sistemas celulares in vitro
derivados de insectos han encontrado amplia aplicación en los estudios sobre morfogénesis,
virología, patología, bioquímica, parasitología, genética y otros campos de la biología y la
medicina (Sudeep et al., 2005). En Colombia, (Ardila, Escovar, & Bello, 2005; Bello et al., 2005,
1995, 2001; Cruz & Bello, 2012; Rey, Ferro, & Bello, 2000; Segura, Santamaría, Cabrera, &
Bello, 2012; Zapata Lesmes, Cárdenas Castro, & Bello, 2005) obtuvieron cultivos celulares
primarios y líneas celulares de crecimiento continuo de diferentes especies de mosquitos y de
flebótomos, las cuales caracterizaron morfológica, citogenética, bioquímica y/o molecularmente
y, también en estos trabajos, evaluaron la susceptibilidad a la infección con arbovirus y parásitos,
siendo los pioneros en este campo de investigación en Latinoamérica.
El suero animal es un aditivo común para el medio de cultivo celular y con frecuencia se
requiere de 5 a 10% ( v / v ) para la unión y el crecimiento de cultivos primarios y continuos
dependientes del anclaje (monocapa) (Nims & Harbell, 2017)
Los cultivos primarios se obtienen por crecimiento de células que migran de un fragmento de
tejido o que son liberadas de un tejido. Las células que son capaces de migrar o de sobrevivir a la
técnica de disgregación cuando se adhieran al sustrato o que sobreviven en suspensión pueden
llegar a constituir un cultivo primario. Posteriormente, las células capaces de proliferar pueden
incrementarse, algunos tipos de células pueden sobrevivir pero no incrementarse y otras células
13
pueden no ser capaces de sobrevivir bajo las condiciones del cultivo. De esta forma, la
distribución de los tipos celulares puede continuar hasta que, en el caso de cultivos en monocapa
ocupen todo el sustrato del cultivo disponible (Baust et al., 2017).
La mayoría de los cultivos celulares pueden propagarse por un número limitado de
generaciones, después de las cuales pueden morir o dar origen a una línea celular continua. La
habilidad de una línea celular para crecer continuamente reflejará, probablemente, su capacidad
de variación genética permitiendo la selección subsiguiente, esto puede ocurrir espontáneamente
o inducirse por químicos o virus (Nims & Harbell, 2017). Las líneas celulares continuas son
generalmente aneuploides y casi siempre tienen un número de cromosomas entre diploides y
tetraploides (Wahrman & Zhu, 1993)
El término transformación ha sido aplicado al proceso de formación de una línea celular
continua parcialmente, porque el cultivo sufre alteraciones morfológicas y cinéticas pero también
porque la formación de la línea celular continua está casi siempre acompañada por un incremento
de la tumorigenecidad. Algunas propiedades de la línea celular continua han sido asociadas con
la transformación maligna como: reducción de los requerimientos de suero, limitación en la
densidad del crecimiento, adaptación a medios semisólidos y aneuploidías (Wahrman & Zhu,
1993).
La caracterización morfológica, citogenética y molecular de los cultivos celulares de insectos,
es necesaria para correlacionarla con el tejido de origen, monitorear su inestabilidad o variación
14
y descartar contaminación cruzada por la demostración de caracteres únicos (Oelofsen, Gericke,
Smith, & De K. Van Der Linde, 1990).
La técnica más sencilla para identificar los tipos celulares consiste en caracterizar los cultivos
celulares, mediante observaciones al microscopio. Dentro de las características más distintivas de
los cultivos celulares de insectos se encuentra la formación de vesículas huecas que aparecen
durante los primeros días de cultivo; este crecimiento puede persistir por semanas o meses y
permanecer durante los primeros subcultivos (Goodman et al., 2017). Las vesículas se pueden
separar del sustrato, quedando suspendidas en el medio donde siguen creciendo hasta romperse
liberando nuevas células al fondo del medio de cultivo; estas células inician nuevos procesos de
división y establecen una monocapa de células adheridas al sustrato que poseen una forma
específica. La morfología final se ha definido como epitelioides, fibroblastoides o pleomórficas
(Oelofsen et al., 1990).
Desde el punto de vista cromosómico se puede inferir sobre número básico de cromosomas,
poliploidías, aneuploidías, modificaciones estructurales de los cromosomas como deleciones,
translocaciones, etc. La información disponible también permite hacer análisis taxonómicos y de
similitudes morfológicas entre especies (Kreutzer, Modi, Tesh, & Young, 1987).
Otra ventaja que ofrecen los cultivos celulares es la obtención de mejores resultados al
realizar estudios morfométricos de cariotipos. Específicamente en insectos, Bello et al., (1995),
evaluaron varias técnicas citogenéticas para el estudio de las características del cariotipo del
mosquito Ochlerotatus taeniorhynchus; comparando las técnicas de squash y secado al aire con
15
la utilización de cultivos celulares, concluyeron que en los cultivos celulares se obtienen mejores
resultados en la resolución de la estructura de los cromosomas, la separación de homólogos y en
la medición de las longitudes cromosómicas.
La técnica de amplificación polimórfica al azar del ácido desoxirribonucleico (RAPD),
implica la amplificación de segmentos al azar del genoma del ADN, y ha sido usado en especies
o en la identificación de líneas celulares de insectos (Ardila et al., 2005; Behura, 2006). La
técnica o el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el estudio de filogenias y
variabilidad genética en líneas celulares de insectos, ha sido utilizada con importantes logros
(Benecke, 1998; Chaeychomsri, Chaeychomsri, Ikeda, & Kobayashi, 2017).
El objetivo básico de la PCR es amplificar el ADN para disponer de cantidad suficiente y
utilizarlo, con diversos fines, o para detectar en muestras con pequeñas cantidades del ADN
diana. Cada ciclo de una PCR consta, de tres etapas: desnaturalización, que consiste en el
calentamiento para la separación de las dos hebras del ADN, a una temperatura entre 68 y 97 oC.
Templado o hibridación, enfriamiento rápido, de forma que se permita la hibridación de las
hebras sencillas del ADN, se usan temperaturas de 37 a 65 oC. Elongación o replicación, que es
la etapa de amplificación propiamente dicha (72-75 oC), en la que la ADN polimerasa
termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales (Griffiths,
Whiteley, O’Donnell, & Bailey, 2000).
La técnica de PCR-RAPD usa solo un primer que consta de 10 pb y es una secuencia
arbitraria con un porcentaje mínimo del 60% de GC que amplifica simultáneamente muchas
16
regiones genómicas. Durante la hibridación del primer al ADN molde se usa una temperatura
baja (35 oC). Este primer detecta polimorfismos que funcionan con marcadores genéticos y
pueden ser usados para construir mapas genéticos (Williams, Kubelik, Livak, Rafalski, &
Tingey, 1990). La amplificación de regiones polimórficas con la técnica de PCR-RAPD
típicamente se manifiesta como la ausencia o presencia de bandas únicas para los individuos.
Muchos estudios muestran que más del 90% de las bandas amplificadas con RAPD son
inherentes a lo que muestra la teoría de Mendel con respecto a los alelos dominantes. Esto
significa que los individuos muestran una serie de bandas, que indican si son homocigotos
dominantes o heterocigotos dominantes, si muestras dos copias o una respectivamente, del alelo
amplificado del locus (Black, 1993).
El conjunto de fragmentos amplificados de ADN, llamados ADN polimórfico amplificado al
azar (RAPD), permite un nuevo tipo de huellas de ADN que puede emplearse para caracterizar
los cultivos celulares, hacer análisis genéticos rutinarios o para estudio de poblaciones. Estas
huellas son detectadas a través de la electroforesis en gel de agarosa al 1,2 %, que es un método
donde las moléculas cargadas con una solución de ácidos nucleicos, migran en respuesta a un
campo eléctrico. El porcentaje de migración o movilidad a través del campo eléctrico depende
de la fuerza de dicho campo, de la carga neta, del tamaño y forma de las moléculas, y también de
la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las moléculas son movidas. La
localización del ADN dentro del gel puede ser determinada directamente con una tinción en las
que se usan bajas concentraciones de un intercalador fluorescente denominado bromuro de
etidio. Con este procedimiento, bandas que contengan cantidades tan pequeñas como 10-20 ng
17
de ADN pueden ser detectadas por visualización directa en un transiluminador que emite luz
ultravioleta (Griffiths et al., 2000).
Las ventajas de usar RAPD como marcadores es la rápida detección de 50 – 60 polimorfismos
del ADN, no hay necesidad de conocer previamente la secuencia y no hay que hacer la detección
de los productos radioactivamente. Sin embargo, han sido muy criticados debido a la baja
reproducibilidad entre un laboratorio y otro, lo cual ha sido atribuido a la diferencia de Taq
polimerasa usada, la concentración de MgCl2, el tipo de termociclador y los tiempos usados y la
cantidad y calidad del ADN molde (Black, 1993). No obstante, es una técnica eficaz y de amplia
aceptación para determinar los patrones moleculares de los cultivos celulares.
18
Tipo y diseño de la investigación.
Corresponde a una investigación exploratoria descriptiva en la cual se establecieron cultivos
celulares a partir de tejidos embrionarios de especímenes de C. vicina, capturados en la ciudad de
Bogotá; se evaluaron experimentalmente las mejores condiciones de cultivo y se estableció la
caracterización de éstos. En este proceso se obtuvieron datos sobre morfometría celular,
cromosómica y molecular, este último con base en un marcador de polimorfismo genético (PCR-
RAPD); los cuales fueron analizados bajo parámetros estadísticos.
Metodología
Uso de los insectos
La colonia de C. vicina se mantuvo durante el transcurso del proyecto de investigación y se
estableció en el laboratorio de Entomología Médica de la Facultad de Medicina de la
Universidad Antonio Nariño.
Situación geográfica:
La colecta de los especímenes adultos se realizó en la ciudad de Bogotá, Colombia en la
estación XXVI de Carabineros Coronel José A. Ramos del parque Nacional Enrique Olaya
Herrera, localizado en las coordenadas 4º37′16″N, 74º03′35″W, empleando como cebo hígado de
res; la captura se efectuó en horas de la mañana, entre las 9:00 am y 1:00 pm. La identificación
taxonómica se realizó con las claves de Amat et al., (2008); los individuos que fueron
identificados como C. vicina se mantuvieron en jaulas Gerberg de 45X45X45 cm a una
19
temperatura de 21 a 25°C, una humedad relativa de 45 a 50% y un periodo de fotoperiocidad de
12 horas (Pérez et al., 2016)
Desinfección de los huevos embrionados.
Previo establecimiento in vitro de la colonia de C. vicina, se obtuvieron huevos embrionados
colectados del sustrato alimenticio (hígado de res), que fueron desinfectados con hipoclorito de
sodio al 0,5% durante 10 minutos, etanol al 70% durante 10 minutos y finalmente, 3 lavados con
agua destilada estéril con adición de Penicilina/Estreptomicina al 1%, cada lavado por 5 minutos.
Posteriormente se adicionó 2,0 mL del medio de cultivo a evaluar para el desarrollo de los
cultivos primarios (Cruz & Bello, 2012)
Explantes
Los huevos embrionados desinfectados a los que se les adicionó 2 mL de medio de cultivo,
fueron transferidos a un homogenizador donde se maceraron para disgregar los tejidos. El
producto del proceso anterior se adicionó a una caja de cultivo de 25 cm2 que contenía 8 mL del
mismo medio. Se llevaron a incubación a 27 ºC y se realizaron observaciones diarias a través de
microscopio invertido, siguiendo el desarrollo de los cultivos primarios durante varias semanas.
El cambio o adición de medio, se realizó teniendo en cuenta el estado de crecimiento y
proliferación de los cultivos primarios.
20
Evaluación de los medios de cultivo
Se evaluaron los medios de cultivo L-15, Grace, mezcla de Grace/L-15 y DMEM, con el fin
de determinar el medio óptimo para la obtención de cultivos primarios y subcultivos de C.
vicina. Estos medios de cultivos se suplementaron con 20% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Nims
& Harbell, 2017) y una solución de antibiótico al 1% de Penicilina - Estreptomicina.
Morfología celular
Los cultivos por ser de tipo adherente se examinaron con un microscopio invertido (Zeiss),
con óptica de contraste de fases y un anillo de fase, para comprobar el estado general y la
confluencia del cultivo con los objetivos 10X, 20X y 40X, registrando el patrón de crecimiento
de las formas celulares más predominantes de los cultivos celulares. Se realizó la caracterización
morfológica con registros fotográficos en diferentes estadios del proceso de crecimiento celular.
Control de calidad
De acuerdo con lo establecido por la FAO sobre aseguramiento de la calidad de medios de
cultivo y reactivos, norma ISO 17025, se observaron diariamente los cultivos para determinar el
color del medio; un color amarillo indica una concentración alta de CO2 o un sobre crecimiento
de las células; la turbidez del medio es indicativo de contaminación.
21
Cariotipo
En cada experimento, se tomaron dos frascos de cultivos celulares de C. vicina con
aproximadamente el 80% de confluencia y se les adicionó 1 mL de colchicina al 0,1% durante 30
minutos a 27ºC para detener las células en metafase y lograr el cariotipo. Las células de los
cultivos fueron obtenidas a partir de dos métodos: desprendimiento mecánico, usando un Scraper
para cultivo adherente y desprendimiento químico, mediante la adición de Tripsina al 0,25%. El
resultado de lo anterior, fue llevado a un tubo Falcon de 15mL y se centrifugó a 1000 g por 10
minutos. El precipitado se resuspendió en 3 mL de una solución hipotónica de NaCl 0.075M y
agua, en proporción 1:4 y se dejó actuar por un periodo de 30 minutos a 27ºC, se centrifugó y
retiró el sobrenadante. Posteriormente se fijó con 2 mL de solución de Carnoy compuesto por
Metanol: Ácido Acético Glacial 3:1, que se dejó actuar durante 30 min, este proceso se repitió 2
veces. El precipitado obtenido de células fijadas se resuspendió en 1 mL de Carnoy y se realizó
un goteo con una pipeta Pasteur sobre láminas portaobjetos limpias y desengrasadas a una altura
de 1 metro, se dejaron secar y se tiñeron con Giemsa al 10% por 30 minutos. Los cromosomas se
observaron en un microscopio de luz (Zeiss) en objetivo de 100X, se tomaron fotografías de las
mejores 20 metafases con las cuales se determinó las medidas con el software Image Pro Plus
5.0 para cada par de cromosomas, de brazo corto (p), brazo largo (q), se halló la relación de
brazos (q/p y p/q), la longitud total del cromosoma (LT), la longitud relativa (LR), el índice
centromérico (IC) y el valor absoluto promedio de longitud (VAPL), de acuerdo con lo reportado
por otros autores (Levan, Fredga, & Sandberg, 1964; Zapata Lesmes et al., 2005).
22
Extracción del ADN
Para la extracción del ADN de los cultivos celulares y de la mosca adulta de C. vicina, así
como de la línea celular Lulo, se utilizó el Kit de purificación de ADN genómico GeneJETTM , el
cual consiste en una serie de 10 pasos, que permiten la purificación rápida, eficiente y de alta
calidad del ADN genómico y, de acuerdo con el protocolo establecido por la casa matriz.
Cultivos celulares de C. vicina
Para cada prueba, se tomaron dos cajas de cultivo celulares con aproximadamente el 80% de
confluencia, la monocapa fue removida mecánicamente y posteriormente se centrifugó a 2000 g
por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó 3 veces con 4 mL de PBS
estéril. Luego el precipitado fue transferido a un tubo ependorf que contenía 3mL de solución
buffer de lisis y 3μL de Proteinasa K y se dejaron incubar durante 1 hora a 56 ºC.
Adultos de C. vicina
Para cada experimento, se colectó una mosca adulta y se dejó a -20ºC hasta que muriera,
después se realizaron 3 lavados consecutivos con 5mL de PBS estéril y se adicionaron 25 μl de
solución amortiguadora de Grinding (Tabla 1), se maceró el adulto y nuevamente se colocaron
25 μL de esta solución y se centrifugó a 2000 g por 3 minutos. Posteriormente, se incubó a 65ºC
por 30 minutos en baño serológico y pasado este tiempo se adicionó 7 μL de acetato de potasio
8M (7,8 g disueltos en 10 mL de agua desionizada) y se llevó en baño de hielo durante 30
minutos y se centrifugó nuevamente a 2000 g por 15 minutos. El sobrenadante fue transferido a
un tubo nuevo y se adicionaron 100 μL de etanol frío al 100%, se mezcló y se mantuvo a
23
temperatura ambiente por 5 minutos y de nuevo se centrifugó a 2000 g; el etanol fue descartado
y se adicionaron 100 μL de etanol frío al 70% para disolver el precipitado y se retiró con
cuidado. Se adicionaron 3mL de solución buffer de lisis y 3μL de Proteinasa K y se dejaron
incubar durante 1 hora a 56 ºC.
Tabla 1. Preparación de la solución de Grinding
Reactivo Cantidad
Cloruro de Sodio 2,92 g
Sacarosa 34,25 g
TRIS 6,25 g
EDTA 0,5 M 50 mL
SDS al 10 % 25 mL
Después del tiempo de incubación tanto a los tubos que contenía el material genético del
cultivo y del adulto se les adicionó 1mL de Cloruro de sodio (NaCl) 6M y se agitaron
vigorosamente durante 15 segundos aproximadamente y luego se llevaron a centrifugar a 2000 g
por 10 minutos. El sobrenadante se pasó por inversión a otro tubo y se adicionó dos veces el
volumen de etanol frío al 96%, se incubó 2 horas a -20ºC y se centrifugó nuevamente a 2000 g
por 10 minutos y se descartó el sobrenadante. El precipitado se disolvió, se pasó a un tubo nuevo
y se centrifugó a 13000 g durante 3 minutos, se descartó otra vez el sobrenadante y se adicionó
500 μL de etano frío al 70% y se centrifugó bajo las condiciones indicadas anteriormente. El
tubo se dejó abierto para que se secara el sobrenadante a 56ºC por 1 hora, se le adicionó agua
para PCR y se dejó a 37ºC durante 15 minutos y luego se mezcló. Finalmente, se dejaron
atemperar los tubos que contenían el ADN aislado de cultivo celular y de moscas adultas a 37ºC
por 10 minutos y se guardó a 4ºC para su posterior uso.
24
Técnica RAPD – PCR
Reconstitución de los cebadores
Los tubos con los iniciadores se centrifugaron por 15 segundos a 14000 rpm para concentrar
el ADN liofilizado en el fondo. Se les adicionaron 200 μL de solución amortiguadora TE, que se
dejó actuar por 2 minutos para una buena rehidratación. Luego los tubos fueron llevados a un
agitador vortex por 15 segundos y finalmente se conservaron a 20ºC, hasta su uso (solución
madre). Para las soluciones de trabajo con un volumen de 100 μL por cada iniciador, se tuvo en
cuenta la concentración de cada solución madre de los iniciadores 100μM y la concentración del
stock de 4 μM.
Amplificación del DNA
Para la estandarización de la técnica de PCR se tuvo en cuenta la concentración de los reactivos
de la mezcla de reacción (master mix) que pueden incidir directamente en el proceso de
amplificación. La mezcla de reacción, estuvo compuesta por Buffer (10X), mezcla de dNTPs (10
mM), MgCl2 (50 mM), el cebador (100 µM), la Taq ADN polimerasa (2 U/µL), ANA de los
cultivos primarios de C vicina (37,3 ng/µL), de los adultos de la mosca (14 ng/µL) y de la línea
celular LULO (22 ng/µL) y agua ultra pura, para un volumen final por muestra de 15 µL (Tabla
2).
25
Tabla 2. Componentes de la solución master mix
Reactivos Concentración inicial Concentración Final Volumen para 15 µL
Buffer 10X 1 X 1, 5 µL
MgCl2 50 mM 2 mM 0,6 µL
dNTPs 10 mM 0,25 mM 0, 375 µL
Cebador 100 µM 4 µM 0,6 µL
Taq Polimerasa 2 U/µL 2 U/µL 0,1 µL
Agua ultra pura - - 8,825 µL
ADN - - 3 µL
Se seleccionaron 3 cebadores sintetizados por InvitrogenTM la secuencia de base para cada
uno de ellos fue la siguiente: A2=(5’-TGCCGAGCTG-3’), A10=(5’-ACGGCGTATG-3’) y
A20=(5’- GTTGCGATCC- 3’) (Cruz & Bello, 2012).
La mezcla de reacción se realizó en un termociclador (Applied Biosystem) con el siguiente
programa de corrida: Desnaturalización 5 minutos a 95ºC, seguido por una amplificación de 45
ciclos (1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 36ºC, 2 minutos a 72ºC) y una extensión final de 5 minutos
a 72ºC.
Electroforesis en gel de agarosa
Los productos amplificados, a partir de muestras de ADN de células de C. vicina, adultos de
la misma especie y las células control LULO (Rey et al., 2000), se corrieron en un sistema
electroforético sobre agarosa al 1,5% con previa adición de 3 µL de HydraGreenTM Safe DNA
Dye, como revelador de bandas. En los pozos fueron sembrados 2 μL del marcador de peso
26
molecular de 100pb DNA LadderTM, Invitrogen, se tomó 2 µL de ADN de cultivo celular de C.
vicina, individuos adultos de C. vicina y de la línea celular LULO, y se mezclaron con 4 µL de
Orange DNA Loading DyeTM . El tiempo de corrida de la electroforesis fue de 90 minutos a
150V, después de finalizar la corrida los geles se visualizaron y fotografiaron bajo luz
ultravioleta.
Posteriormente se compararon los patrones de bandas utilizando el coeficiente de similitud de
Nei y Li (1979), con la siguiente fórmula:
𝑺𝑨𝑩 =𝟐 𝑵𝑨𝑩
(𝑵𝑨 + 𝑵𝑩)
En donde NAB, corresponde al número de bandas compartidas y NA y NB, representan el
número total de bandas mostradas por los individuos A y B respectivamente (Léry, LaRue,
Cossette, & Charpentier, 2003).
Criopreservación de los cultivos celulares
Se rotularon 2 tubos ependorf, uno con medio de cultivo y suero fetal bovino (Tubo 1) y otro
con medio de cultivo Grace/L15 y dimetil sulfoxido (DMSO) (Tubo 2). Las proporciones
finales, para cada uno de los componentes de la mezcla, fueron: 50% de medio de cultivo
Grace/L15, 40% de suero fetal bovino (SFB) y 10% DMSO.
Se tomaron varios frascos de los cultivos celulares de C. vicina con monocapa semiconfluente
y el número de células fue ajustado a 5 x 106 células/mL, se descartó el medio de cultivo y se
adicionó el contenido del tubo 1, las células se desprendieron mecánicamente con un scraper, y
27
el tubo se colocó dentro de un recipiente con hielo, luego lentamente se adicionó el contenido del
tubo 2, mientras se agitaba en forma continua. Se dispensó 1,5 mL de células en crioviales
previamente marcados con el nombre del cultivo celular, número del pase y fecha de
congelación. El enfriamiento y congelación se realizó lentamente, primero 15 minutos a 4°C y
posteriormente, 4 horas a -70°C. Finalmente se llevaron a nitrógeno líquido (Zapata Lesmes et
al., 2005).
Análisis estadístico
Para los análisis de caracterización de los cariotipos, los datos morfométricos de brazo largo,
brazo corto y longitud total de los cromosomas fueron consolidados en una tabla Excel y
posteriormente con el software STATA12 se calcularon los parámetros de estadística descriptiva
como tamaño de la muestra (n), media y desviación estándar (DS), con un intervalo de confianza
del 95%.
28
Resultados y Discusión
Establecimiento y mantenimiento de la colonia de C. vicina
En general, el establecimiento y mantenimiento de una colonia de insectos, además del
conocimiento del ciclo de vida, posibilita la definición de parámetros importantes, no sólo para
obtener el material biológico constante sino también para determinar el tiempo del ciclo de vida
adecuado. En este trabajo, se usó la primera generación de C. vicina, cepa Bogotá; una vez los
adultos ovipositaron se tomaron los huevos y larvas de primer estadio, en la medida que se
necesitó material biológico para realizar los explantes en los medios de cultivo evaluados. Esta
especie se adaptó exitosamente a las condiciones físicas, ambientales y nutricionales del
laboratorio, la duración del ciclo de vida para la especie en estudio fue de 95,5 días, el estadio de
huevo tuvo una duración de 0,8 días y el primer estadio larval de 0,9 días, resultados que
coinciden con los encontrados previamente para C. vicina (Pérez et al., 2016); trabajar a partir de
los estadios de huevo y larva I, es indispensable porque son en estas fases de desarrollo donde
existen cambios en la expresión génica que impactan el fenotipo de los tejidos embrionarios
(Hodar & Cambiazo, 2018), en la regulación de los cambios de forma de las células y en las
interacciones de los tejidos durante la morfogénesis (Panfilio, 2008).
Evaluación de medios de cultivo frente al crecimiento celular de los cultivos de C. vicina
Después de seguir el protocolo de desinfección de los huevos, se realizó el explante del tejido
embrionario, evaluando diferentes medios de cultivo celular. Este proceso, es importante ya que
de acuerdo con la rigurosidad con la que se realice se pueden eliminar microorganismos que son
propios del material biológico, estos microorganismos provenientes de huevos fueron descritos
29
previamente en dos especies de moscas de la familia Calliphoridae, Chrysomya megacephala y
Lucilia cuprina, en donde se evidenció la presencia de diferentes bacterias Gram positivas y Gram
negativas como Proteus mirabilis, Enterococcus sp., Enterococcus faecalis, Micrococcus sp.,
Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophila, Serratia marcescens, Staphylococcus
aureus, Bacillus sp., Pseudomonas putida y levaduras de la especie Candida glabrata
(Limsopatham et al., 2017).
En cada uno de los cultivos evaluados se observó contaminación bacteriana, para lo cual se
utilizó las mezcla Penicilina-Estreptomicina al 1% al comienzo del crecimiento celular; sin
embargo, el uso de antibiótico se suspendió para evitar el efecto citopático en los cultivos. En el
medio Grace/L15 a partir de huevos hubo autocontrol de la contaminación bacteriana
favoreciendo la adhesión celular (Tabla3).
Tabla 3. Evaluación de medios de cultivo con relación a la adaptación celular
Medios de
Cultivo
Fuente Explantes
realizados
Efectividad del
proceso
Evolución del
cultivo
L15 Huevos 35 Contaminación* Desprendimiento
celular*
GRACE Huevos 20 Contaminación** No se desarrolló
GRACE/L15 Huevos 87 Contaminación
controlada
Obtención de
Cultivos primarios
DMEM Huevos 20 Contaminación** No se desarrolló
GRACE/L15 Larvas 20 Contaminación** No se desarrolló
* Después de realizar los subcultivos, ** Contaminación desde el inicio del explante
Se descartó que la contaminación bacteriana proviniera del medio de cultivo, puesto que no se
detectaron cambios inusuales en el pH, no hubo aumento de la turbidez, ni aparición de partículas
suspendidas en el medio de cultivo (Arunkarthick, Asokan, Aravintharaj, Niveditha, & Kumar,
30
2017), estas observaciones fueron respaldadas con pruebas microbiológicas utilizando medios
selectivos para bacterias (Figura 1A) y hongos (Figura 1B).
Figura 1. Pruebas de control microbiológicas de los medios de cultivo celular A. Aislamiento en agar
sangre, B. Aislamiento en agar Mycocel, C+: Control positivo
Cultivo celular primario
Crecimiento celular
Los cultivos primarios se obtienen por crecimiento de células que migran de un fragmento de
tejido o que son liberadas del mismo. Las células que son capaces de migrar o de sobrevivir a la
31
técnica de disgregación pueden llegar a constituir un cultivo primario, siempre que proliferen en
suspensión o adheridas al sustrato. Algunos tipos celulares sobreviven por determinado tiempo
sin dividirse, unos, desaparecen en un tiempo específico y otros no resisten las condiciones del
cultivo.
En el presente estudio, las células se obtuvieron a partir de tejido embrionario de huevos de C.
vicina con los medios L15 y la combinación Grace/L15, en los dos medios, el crecimiento inició
en un periodo corto, se observó que el desarrollo celular en Grace/L15 inició entre el día 1 al 3
posterior a la realización del explante del tejido embrionario. La formación de la monocapa con
un 100% de confluencia fue a los 19 días en L15 y a los 8 días en Grace/L15, siendo éste último
donde mejor se adaptaron las células, resultados que se confirman con el número de cultivos
viables y el número de pases realizados durante la presente investigación (Tabla 4).
Tabla 4. Efecto de los medios de cultivo L15 y Grace/L15 en el crecimiento de los tejidos embrionarios
de C. vicina
Medios de Cultivo L15 GRACE/L15
Fuente
Huevos
embrionados
Huevos
embrionados
Inicio de crecimiento
(Días)
3-8 1-3
Número de cultivos
viables
1 52
Número de subcultivos 1 12
Formación de monocapa
después de los explantes.
(Días)
Si
19
Si
8
32
Estos resultados concuerdan con lo reportado en estudios de cultivos celulares realizados a
partir de tejidos embrionarios de la mosca Sarconesiopsis magellanica (Diptera: Calliphoridae)
en medio Grace /L15 (Cruz & Bello, 2012). Sin embargo, en otro estudio con Lucilia sericata,
mosca perteneciente a la misma familia, se observó que en Grace/L15 las células no se
adhirieron al frasco de cultivo sino que se mantuvieron suspendidas, inhibiendo la replicación
celular y ocasionando apoptosis (Echeverry et al., 2009). En este mismo estudio con L15, la
migración celular ocurrió en las primeras horas después de realizar el explante y la monocapa
semiconfluente se obtuvo a los 45 días; lo cual indica que los cultivos celulares obtuvieron los
nutrientes necesarios a partir del último medio de cultivo, posibilitándoles la adaptación,
proliferación y el crecimiento de las células.
Los medios Grace y DMEM también fueron evaluados y se observó que desde el inicio del
cultivo primario hubo presencia de microorganismos bacterianos por lo cual no fue posible el
desarrollo ni el crecimiento del tejido embrionario de C. vicina (Figura 2).
Figura 2. Evaluación del crecimiento celular en los medios de cultivo Grace y DMEM.
A. Explante realizado con medio Grace, B. Explante realizado con medio DMEM. No hubo crecimiento
del tejido y se evidenció contaminación bacteriana como se indica con las flechas en color negro.
33
Estos resultados concuerdan con lo reportado para cultivos celulares de L. sericata, en medio
Grace, el explante tuvo una duración de 10 días pero las células no se adhirieron ni proliferaron,
y en medio DMEM, se mantuvieron en suspensión pero finalmente hubo muerte celular debido a
que las células no lograron adaptarse a las condiciones de crecimiento (Echeverry et al., 2009).
Las diferencias en la adaptación del tejido a los medios de cultivo se debe a las combinaciones
complejas de nutrientes (Ahamed & Vermette, 2009; Su, Zheng, Wan, & Li, 2016): sales,
vitaminas, aminoácidos como la glutamina, glutamato, aspartato, serina, arginina, asparagina,
metionina y cisteína, que son componentes fundamentales para la producción de energía y
favorecen la división celular; la deficiencia de éstos los podrían afectar significativamente
(Arunkarthick et al., 2017). Los factores de crecimiento, hormonas, lípidos como triacilglicerol y
ácidos grasos, colesterol y vitaminas lipídicas presentes en el suero fetal bovino (SFB) funcionan
como la hemolinfa de los insectos y contribuyen a la producción de proteínas necesarias para la
adherencia de las células al frasco de cultivo y al desarrollo y división celular; igualmente, los
carbohidratos como la glucosa, maltosa, fructosa y ácido pirúvico son fuente importante de
energía y carbono que pueden apoyar el crecimiento del cultivo (Ikonomou et al., 2001, 2003).
Las sales inorgánicas y los fosfatos en concentraciones adecuadas proveen a los medios de
cultivo las condiciones ideales para mantener la presión osmótica similar a la que tienen las
células in vivo, siendo el bicarbonato de sodio el metabolito principal, que tiene como función
ser amortiguador del pH que, además, permite evaluar el metabolismo celular indicando la
evolución del cultivo y el momento de realizar cambios de medio por agotamiento de nutrientes.
(Echeverry et al., 2009).
34
Curva de crecimiento celular
La curva de los cultivos celulares en medio Grace/L15 muestra de una manera exponencial la
adaptación de las células al medio, ya que se observó la propagación de éstas a través de los
diferentes subcultivos que evolucionaron a monocapas confluentes (Figura 3). La habilidad de un
cultivo celular para crecer continuamente se refleja por la capacidad de adaptación a las
condiciones ofrecidas in vitro.
Figura 3. Curva de crecimiento de la línea celular en Grace/L15
Morfología celular
El crecimiento celular del tejido embrionario en medio L15 se evidenció al día 3, una vez se
adhirió el tejido al frasco se observaron prolongaciones filamentosas con morfología similares a
células nerviosas alrededor de los explantes, esta morfología se mantuvo hasta el 100% de
confluencia alcanzando al día 19 (Figura 4), momento en el cual se realizaron dos subcultivos
que se caracterizaron por mantener la misma estructura (Figura 5); sin embargo, el crecimiento
de estos subcultivos fue notoriamente más lento hasta ocasionar, al final, el desprendimiento de
la monocapa y muerte celular.
35
Figura 4. Crecimiento celular del tejido embrionario de C. vicina en medio L15
Figura 5. Crecimiento celular de los subcultivos de C. vicina en medio L15
36
Los cultivos primarios realizados en Grace/L15 presentaron una morfología celular similar a
la observada en medio L15, es decir que las células presentaron una apariencia fibroblastoide
similares a células nerviosas, el crecimiento inició al día 3 y la confluencia del 100% se obtuvo
al día 8 (Figura 6). Posteriormente, se realizaron 12 subcultivos, que se caracterizaron por una
morfología predominantemente fibroblastoide; sin embargo, a partir del subcultivo 4 y hasta el
12, presentaron la diferenciación de algunas células a formas epitelioides (Figura 7).
Figura 6. Crecimiento de los cultivos celulares de tejidos embrionarios de C. vicina en medio Grace/L15
37
Figura 7. Crecimiento celular de los subcultivos de C. vicina en medio Grace/L15
Los círculos en color morado muestran células de tipo epitelioide.
38
Las conexiones de las fibras en los cultivos y subcultivos realizados con L15 y Grace/L15 se
dividieron y unieron con otras fibras cercanas, esto permitió que se extendieran en el frasco de
cultivo, lograran la monocapa confluente y cambiaran su forma a células parecidas a nerviosas.
Esto se ha reportado, igualmente, en diferentes especies de la clase Insecta, como en los cultivos
de L. sericata en medio L15 (Acuña Morera, Cortés Bernal, Vargas, Segura, & García, 2011;
Echeverry et al., 2009) y en líneas celulares de Anasa tristis (Hemiptera: Coridae) (Goodman et
al., 2017), Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) (Reall et al., 2019), Bombix mori
(Lepidoptera: Bombycidae) (Khurad et al., 2009; Pan et al., 2010) y Spodoptera. exigua
(Lepidoptera: Noctuidae) (Su et al., 2016).
En las primeras fases de crecimiento del tejido embrionario de C. vicina evaluados en medios
L15 y Grace/L15 se observaron vesículas, estructuras comunes en cultivos de insectos que en la
periferia contienen células esféricas (Figura 8). Estas vesículas aparecieron durante los primeros
días, persistieron por semanas y permanecieron en los subcultivos iniciales suspendidas en el medio
de cultivo hasta romperse, liberando nuevas células, estas células iniciaron nuevos procesos de
división y establecieron una monocapa adherida al sustrato con morfología de tipo fibroblastoide;
este evento, con las mismas características, fue reportado por Echeverry et al., (2009) y Cruz &
Bello, (2012) en L. sericata y S. magellanica; en lepidópteros como Phthorimaea operculella
Zeller (Sudeep et al., 2005) y Clostera anacoreta (Wen et al., 2009), dípteros como Culex
quinquefasciatus (Segura et al., 2012) y en dos especies de coleópteros, Leptinotarsa
decemlineata (Charpentier, Tian, Cossette, Léry, & Belloncik, 2002) y Tribolium castaneum
(Goodman et al., 2012).
39
Figura 8. Formación de vesículas en cultivo primario de C. vicina en medio Grace/L15
Las flechas en color negro muestran vesículas vacías y la flecha en rojo indica vesícula con células
esféricas.
Además de estas estructuras, se observaron movimientos contráctiles periódicamente en
algunos de los nodos de crecimiento de cultivos primarios pero no en los subcultivos
(https://youtu.be/dp8Oe7dnroA), que coincide con lo reportado en cultivos de L. sericata
(Echeverry et al., 2009), S. magellanica (Cruz & Bello, 2012); Culex quinquefasciatus ( Segura
et al., 2012); Bombix mori (Khurad et al., 2009) y Spodoptera exigua (Su et al., 2016). Es posible
40
que estas contracciones estén relacionadas con proteínas propias de células derivadas de tejido
muscular y podría ser un indicativo de que las células del cultivo se encuentran en una etapa de
alta actividad, lo cual promueve el desarrollo de los cultivos primarios (Cruz & Bello, 2012; Su
et al., 2016).
En los medios L15 y Grace/L15, desde el inicio del explante hubo presencia de bacterias, sin
embargo, se observó que a medida que el cultivo crecía, la actividad y número de bacterias
disminuía. A partir de cultivos celulares de cuerpos grasos y hemocitos de C. vicina (Gordya et
al., 2017) y de cultivo celular proveniente de tejido embrionario de Sarcophaga peregrina
(Matsuyama & Natori, 1988) se han aislado diferentes péptidos antimicrobianos (PAMs) que son
proteínas cortas producidos por el sistema inmune innato (Lombardi, Falanga, Del Genio, &
Galdiero, 2019); la síntesis de PAMs en moscas necrófagas y que habitan en ambientes
altamente contaminados, normalmente se producen en bajas concentraciones y aumenta en
respuesta al ataque de microorganismos, no solo bacterias Gram negativas o Gram positivas sino
también contra hongos (Rahnamaeian et al., 2015; Wang, Zeng, Yang, & Qiao, 2016), por lo
cual, es posible que los cultivos celulares de C. vicina descritos en este estudio, estén
sintetizando estas moléculas como antibióticos naturales que controlan el crecimiento y
desarrollo de los diferentes microorganismos presentes en el medio y en las células de los
cultivos.
Cariotipo
41
Una ventaja que ofrecen los cultivos celulares es la obtención de mejores resultados al
realizar estudios morfométricos de cariotipos. Específicamente en insectos, Bello et al., (1995)
evaluaron varias técnicas citogenéticas para el estudio de las características del cariotipo del
mosquito Ochlerotatus taeniorhynchus; comparando las técnicas de squash y secado al aire con
la utilización de cultivos celulares, concluyendo que en los cultivos celulares se obtienen mejores
resultados en la resolución de la estructura de los cromosomas, la separación de homólogos y en
la medición de las longitudes cromosómicas.
Para la obtención del cariotipo de C. vicina, se realizaron múltiples extendidos de cultivos
celulares en donde se obtuvieron algunas metafases y prometafases, éstas últimas, caracterizadas
por un estado de menor condensación de la cromatina que le confiere una mayor longitud, como
se observa en la Figura 9, en donde se pudo evidenciar 5 pares de cromosomas autosómicos y un
par de cromosomas sexuales, que corresponden al mismo número diploide observado en
metafase.
Figura 9. Cariotipo en prometafase a partir de cultivo celular de C. vicina
42
Las metafases obtenidas a partir de cultivos primarios de C. vicina, mostraron un número de
cromosomas diploide 2n = 12, de éstos, 5 pares corresponden a cromosomas autosómicos y 1 par
sexual (Figura 10, 11). La posición del centrómero para cada uno de los pares de cromosomas se
determinó de acuerdo con la escala de Levan et al., (1964), que permite designar si los
cromosomas son metacéntricos, submetacéntricos, subtelocéntricos o telocéntricos (Figura 12).
El cariotipo de C. vicina se caracterizó porque el cromosoma sexual X fue el que presentó
mayor longitud total (LT=18,739) y el cromosoma sexual Y, fue el de menor longitud en el
complemento diploide (LT=9,268). En cuanto a la longitud de los cromosomas autosómicos,
estos se encuentran organizados en orden descendente siguiendo el procedimiento de Kaul, 1978
(Rani Agrawal, Bajpai, Kurahashi, & Ram Tewari, 2010), los cromosomas del par 1 fueron los
de mayor tamaño y con base en la relación q/p se determinó que 4 pares de autosomas de esta
mosca necrófaga son metacéntricos (1, 2, 4, 5), un par submetacéntrico (3) y los cromosomas
sexuales fueron clasificados como metacéntricos (X, Y) (Tabla 5).
La estadística descriptiva para la longitud total de cada par de cromosomas de C. vicina, se
realizó con un nivel de confianza del 95% y los valores de desviación estándar mostraron que las
mediciones no se encuentran dispersas respecto a la media.
43
Figura 10. Cariotipo de C. vicina a partir de cultivos celulares derivados de la especie.
Complemento cromosómico diploide correspondiente a macho de C. vicina, obtenido a partir del análisis
de 20 metafases (n=20)
Figura 11. Cariotipo de C. vicina a partir de cultivos celulares derivados de la especie.
Complemento cromosómico diploide correspondiente a hembra de C. vicina, obtenido a partir del análisis
de 20 metafases (n=20)
44
Figura 12. Idiograma que muestra la clasificación de la variación en la posición centromérica de los
cromosomas derivados de los cultivos celulares de C. vicina.
M: Metacentrico, Sm: Submetacéntrico, St: Subtelocéntrico, T: Telocéntrico . De acuerdo con la escala de
clasificación tomado de Levan et al., (1964)
Tabla 5. Datos promedios de los cromosomas autosómicos y sexuales de C. vicina
Cromosoma
(μm)
r q/p
r p/q
LT
LR
IC
VAPL
Clasificación p q (μm) DS
1 6,386 9,579 1,500 0,666 15,965 0,788 0,179 0,400 1,722 M
2 5,527 7,335 1,327 0,753 12,855 0,739 0,144 0,429 1,387 M
3 3,356 7,833 2,334 0,428 11,189 0,651 0,126 0,299 1,207 Sm
4 4,749 5,805 1,222 0,818 10,554 0,858 0,118 0,449 1,138 M
5 4,387 5,817 1,325 0,754 10,204 0,858 0,114 0,429 1,100 M
X 8,245 10,494 1,272 0,785 18,739 1,24 0,211 0,439 2,021 M
Y 3,70 5,568 1,504 0,664 9,268 0,745 0,104 0,399 1 M
Total 88,774
p: Brazo corto, q: Brazo largo, LT: Longitud total, LR: Longitud relativa, IC: índice centromérico. VAPL:
Valor absoluto promedio de longitud M: Metacéntrico, Sm: Submetacéntrico. Fueron medidas 20
metafases (n=20)
45
La configuración cromosómica diploide 2n=12, ha sido reportada ampliamente en diferentes
especies de la familia Calliphoridae (Ullerich & Schöttke, 2006), como Lucilia sericata (Acuña
Morera et al., 2011; Chirino, Rossi, Bressa, Luaces, & Merani, 2015; El-Bassiony, 2006),
Chrysomya megacephala y Chrysomya putoria (Parise-Maltempi & Avancini, 2001),
Triceratopyga calliphoroides, Lucilia porphyrina, Chrysomya pinguis, Xenocalliphora hortona
(Rani Agrawal et al., 2010), C. vicina (El-Bassiony, 2006) y Lucilia cluvia (Chirino et al., 2015);
incluso, también reportado en algunas especies de la familia Muscidae y Sarcophagidae, en las
cuales registran el mismo número de cromosomas en sus cariotipos (Parise-Maltempi &
Avancini, 2000, 2007).
Los resultados de la longitud total de los cromosomas de C. vicina, difieren de los reportados
en un estudio previo para esta misma especie, se ha discutido que podrían estar relacionados con
las diferentes ubicaciones geográficas, cambios evolutivos por adaptaciones, donde se colectaron
los especímenes y, posiblemente, por el tejido del cual se está realizando el cariotipo,
manteniendo similitud en la clasificación de los cromosomas X y Y (El-Bassiony, 2006). Estas
variaciones en el tamaño también han sido reportadas en Chrysomya albiceps y Chrysomya
rufifaciens, moscas de la familia Calliphoridae (Parise-Maltempi & Avancini, 2001).
Caracterización molecular
Después de realizar la extracción de ADN, se comprobó de forma cualitativa la presencia del
material genético por electroforesis y al pasar la muestra por NanoDrop se pudo cuantificar el
46
ADN obteniéndose en promedio 37,3 ng/µl de cultivo celular de C. vicina y 14 ng/µl de la mosca
adulta.
En la Tabla 6 se encuentran los resultados obtenidos por RAPD-PCR, en donde se encontró que
el iniciador que generó mayor número de fragmentos correspondió al A20, con 16 fragmentos en
cultivo celular de C. vicina, 18 fragmentos en la mosca adulta de C. vicina y 14 fragmentos en la
línea celular LULO. El rango de pares de bases para los iniciadores A2 (Figura 13), A10 (Figura
14) y A20 (Figura 15) se mantuvo entre 100 a 1500 pb (Tabla 6).
Tabla 6. Comparación de los RAPD evaluados entre cultivos celulares y el estadio adulto de la mosca C.
vicina y la línea celular LULO
Cebadores
Número de Fragmentos Rango de tamaño (pb)
Cultivo
celular
primario C.
vicina
Estadio
Adulto
C.vicina
Línea
celular
LULO
Cultivo
celular
primario C.
vicina
Estadio
Adulto
C.vicina
Línea
celular
LULO
A2 7 8 7 250 - 1200 250 - 1200 300 - 1300
A10 16 13 12 100 - 1100 100 - 1100 310 - 1500
A20 16 18 14 150 - 1200 150 - 1200 200 - 1400
47
Figura 133. Perfil de DNA (RAPD_PCR), usando el iniciador A2
M: Marcador de peso molecular de 100pb; 1, 2, 3: Línea celular LULO; 4, 5, 6: Cultivo celular de C.
vicina; 7, 8, 9: C. vicina mosca en estadio adulto
Figura 144. Perfil de DNA (RAPD-PCR), utilizando el iniciador A10
M: Marcador de peso molecular de 100pb; 1, 2, 3: Línea celular LULO; 4, 5, 6: Cultivo celular de C.
vicina; 7, 8, 9: C. vicina mosca en estadio adulto
48
Figura 155. Perfil de DNA (RAPD-PCR), utilizando el iniciador A20
M: Marcador de peso molecular de 100pb; 1, 2, 3: Línea celular LULO; 4, 5, 6: Cultivo celular de C.
vicina; 7, 8, 9: C. vicina mosca en estadio adulto
Una de las posibles causas en la variación de la intensidad de las bandas en el perfil
electroforético de cada iniciador, podría explicarse por alteraciones en el material genético
causado por el número de copias obtenido en la PCR (Léry et al., 2003; Mahmoud & Kamel,
2019).
Usando la fórmula de Léry et al., (2003) se calculó el coeficiente de similaridad. Cuando se
comparó el cultivo celular de C. vicina y la mosca adulta de la misma especie, se encontraron
valores de similaridad en un rango de 0,88 a 0,96. Así mismo, el cultivo celular de C. vicina
comparado con la línea celular LULO mostró un rango entre 0,37 a 0,66 (Tabla 7).
49
Tabla 7. Comparación del índice de similaridad entre cultivo celular de C. vicina, mosca adulta de C.
vicina y la línea celular LULO
Cebadores Cultivo primario de C. vicina Vs.
Estadio Adulto de C. vicina
Cultivo primario de C. vicina Vs. Línea
celular LULO
A2 0,93 0,37
A10 0,96 0,48
A20 0,88 0,66
Los coeficientes de similaridad calculados en el presente estudio, guardan correlación con los
que han sido reportados en especies de dípteros como L. sericata (Acuña Morera et al., 2011), S.
magellanica (Cruz & Bello, 2012), Culex quinquefasciatus ( Segura et al., 2012), Ae. aegypti
(Ardila et al., 2005), coleópteros como Leptinotarsa decemlimeata (Long, McIntosh, Grasela, &
Goodman, 2002) y Tribolium. castaneum (Mahmoud & Kamel, 2019) y en lepidópteros como
Spodoptera exigua (Chaeychomsri, Chaeychomsri, Ikeda, & Kobayashi, 2016). En cada uno de
los estudios mencionados, el cálculo del coeficiente de similaridad ha permitido confirmar la
identidad que comparten las líneas celulares evaluadas.
Una relación intraespecífica, es aquella interrelación biológica en la que los organismos que
intervienen pertenecen a la misma especie, y una relación interespecífica es aquella en la que los
intervinientes son de diferente especie (Chaeychomsri et al., 2016).
Se reportó que los coeficientes de similaridad interespecíficos, son bajos comparados con el
coeficiente de similaridad intraespecífico, estos resultados concuerdan con lo encontrado en
cultivos celulares y el estado adulto de C. vicina, en donde los valores calculados estuvieron en
un rango cercano a 1, a diferencia de los índices encontrados en la relación interespecífica entre
el cultivo celular de C. vicina y la línea celular LULO aislada de Lutzomyia longipalpis que
50
fueron relativamente más bajos. Estos valores han permitido distinguir la relación que existe
entre los organismos a nivel intra e interespecíficas (Léry et al., 2003; Mahmoud & Kamel, 2019;
Zheng et al., 2014).
Criopreservación de los cultivos celulares
Se congelaron las células de C. vicina en monocapa y transcurridos 20 días se descongelaron
y se llevaron nuevamente a incubar en cajas de 25 cm2 con medio Grace/L-15 suplementado con
SFB y libre de cualquier antimicrobiano. Se realizó el seguimiento diario con el microscopio
invertido y se encontró que el porcentaje de viabilidad fue del 60 al 70% de las células
congeladas.
Se evidenció una disminución de la población celular hasta en un 40% luego de haber
congelado y descongelado varias monocapas de los cultivos celulares de C. vicina, lo cual indica
que debe haber más estabilidad de los cultivos in vitro y, posiblemente, la necesidad de optimizar
las condiciones de criopreservación, en razón a que lo ideal es obtener una viabilidad celular
superior al 85% en subcultivos altos.
51
Conclusiones
Luego de evaluar cuatro medios de cultivo, se obtuvo adhesión, proliferación, formación de
monocapa y subcultivos en los medios L-15 y Grace/L15, cuya composición benefició el
metabolismo celular para el establecimiento in vitro.
Se estableció una línea celular a partir de tejido embrionario derivado de huevos
embrionados de C. vicina.
La morfología predominante de las células en los cultivos primarios y en los subcultivos,
usando los medios L15 y Grace/L15, fue fibroblastoide similares a nerviosas.
Se estableció que la contaminación en los cultivos primarios de C. vicina, fue controlada sin
la adición permanente de antibióticos, lo cual permitió inferir la presencia de péptidos
antimicrobianos producidas por las células cultivadas
Se encontró que el cariotipo de C. vicina es diploide 2n=12, siendo los pares 1, 2, 4, 5, X, Y
metacéntricos y el par 3 submetacéntrico. Así mismo, se evidenció que el cromosoma X siempre
presentó mayor longitud que el resto de los cromosomas. No se registraron poliploidías en los
subcultivos de pases altos.
52
Se obtuvieron los perfiles de ADN de Calliphora vicina que permitieron determinar la
identidad de los cultivos celulares y hacer la diferenciación con el estado adulto de la misma
especie y la línea celular LULO, a partir del coeficiente de similaridad.
Los cultivos celulares de tejido embrionario de C. vicina podrían ser a mediano plazo ser
utilizados para el aislamiento de péptidos antimicrobianos y moléculas involucradas en la
regeneración y recuperación del tejido, que potencialmente tendrían aplicación en el tratamiento
de heridas de la piel o úlceras crónicas asociadas con leishmaniosis, o a enfermedades de base
como diabetes. También, podrían ser utilizados en otros tipo de infecciones en humanos y
animales causadas por virus, bacterias y parásitos.
Recomendaciones
Evaluar in vitro la capacidad antimicrobiana de los péptidos sintetizados a partir de los cultivos
celulares de C. vicina.
Determinar la susceptibilidad de los cultivos celulares obtenidos, en el presente estudio, a la
infección con arbovirus y parásitos de interés en salud pública .
53
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61
Anexo 1. Presentación oral en el Congreso Nacional de Entomología - SOCOLEN
62
Anexo 2. Ponencia de Investigación en la Universidad de La Salle
63
Anexo 3. Nominación al Premio Nacional de Entomología “Hernán Alcaráz Viecco” (HAV)
64
65
Anexo 4. Permiso marco de recolección de especímenes
66
67
