Bull. SOC. Chim. Belg. vol. 85/11 "5/1976

ESTERIFICATION DES STEROIDES PAR L'ANHYDRIDE HEPTAFLUOROBUTANOIQUE

L. DEHENNIN ' Fondation de Recherche en Hormonologie 67, Bd Pasteur F 94260 Fresnes (France)

et J. LEVISALLES

Equipe de Recherche Associee au C.N.R.S. Universite Pierre et Marie Curie F 75230 Paris Cedex 05 (France)

Received 9/3/76 - Accepted 31/5/76.

ABSTRACT : The forniation of heptafluorobutanoic esters of some steroidal al- cohols, phenol and conjugated ketone W F S described. The kinetic study of the- se reactions in presence of acid showed a hyperbolic relationship between kexp and the acid concentration for the alcoholic and phenolic functional

groups. Under the same conditions, a bell-shaped curve was obtained for the conjugated ketone.

Les estersheptafluorobutansIques (abreviation dans la suite du texte : HFB ) sont des derives utiles pour l'analyse quantitative de certaines hor- mones sterordes par chromatographie en phase vapeur (CPV) avec detection par capture electronique (1) ou par spectrometrie de masse (2). Les esters HFB derives des phenols et des diBnes-3,5-ols-3 sterordes sont les plus interes- sants a cet Bgard, puisqu'ils ont une affinite marquee pour les electrons thermiques (3), et qu'ils donnent naissance a des ions moleculaires abondants.

Afin de determiner les conditions optimales de formation de ces esters, on a Btudie dans ce prbsent memoire la cinetique de l'esterification par l'a- nhydride HFB de trois substrats representatifs : une enone, l'androstsne-4 One-3 h, un phenol, l'estradiene-1,3,5 (10) 01-3, 22, et un alcool le (5u) androstanol-38 22. L'esterification des (5a) androstanols-3a et -178, 22, a ete Bgalement etudiee de fapon moins approfondie.

* Ce travail constitue une partie de la These de Doctorat 5s Sciences de L. DEHENNIN, (Universite Pierre et Marie Curie, 1975 ; numero d'enregistre- ment au C.N.R.S. : A0 10912).

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& a R.H b R=COC,F, c R=CMe=CHCOC,F,

STRUCTURES DES PRODUITS.

Dans le cas des composes 2s a 2~ les esters HFB /$ 3 ?$ sont isol4s sans difficult4 et leurs structures decoulent normalement de leurs proprie- tes spectroscopiques indiquees dans la partie experimentale. L'enone con- duit a un melange d'esters de dieno1 5 et z, ou 3 l'un d'entre eux seulement, selon les conditions reactionnelles (cf : partie experimentale et ref.4). La demonstration spectroscopique de leurs structures ne presente pas de difficul- te.

I1 convient cependant d'indiquer que la formation de zg est accompa- gnee,en milieu acetonique, par la formation d'un sous produit dont la propor- tion croIt avec l'acidite du milieu. La structure 5s. qui lui est attribuee, est basee sur ses proprietes spectroscopiques : maximum a 280nm ( E = 16400) dans le spectre W, bandes a 1685 et 1565 cm-l dans le spectre IR (-0-C=C-C=O) signaux a 2,35 (CH3-C=) et 5,72 ppm (=HC-C=O) dans le spectre de RMN. Le spec- tre de masse confirme ces donnees : pic moleculaire a 512 um ; pic 3 343 um (M-169) correspondant a la perte de C3F, (ce qui n'est jamais observe dans

-334-

2 les esters HFB), pic metastable a 229 um (= 343 /512) et pic a 259 um (M-253) correspondant a la perte de la charne laterale.

On a verifi.5 que la formation de cette charne heptafluorooxo-hepteny- lique est generale dans le cas de l'esterification des alcools dans l'acetone en presence d'acide.

formation de ces sous-produits est d'autant plus importante que l'alcool est plus encombre.

C'est ainsi que zg et donnent de la meme fagon 22 et is, mais la

Substrat

kexp(l.rnole-!mn-')

ETUDE CINETIQUE SANS ACIDE AJOUTE.

-- -- 2a l e de la ==

0,94 104 27 ,o

Les reactions ont ete suivies dans tous les cas par dosage en CPV des esters HFB (cf : partie experimentale i lors de l'esterification de l'enone

l a , -- on a dose l'ensemble des esters de dienol 5 et 2). On s'attend en prin- cipe a observer une reaction d'ordre 2 representee par l'equation (1) dans laquelle LSIt est la concentration tctale instantanee du substrat et CAn] la concentration instantanee de l'anhydride.

Cette expression se reduit a l'equation ( 2 ) en raison des conditions operatoires necessaires pour un dosage hormonal Dz CPV, qui exigent l'emploi d'un grand e x c h d'anhydride HFB, (25 a 50 fois la quantite de substrat). C'est ce qui a ete effectivement observe avec une precision satisfaisante.

= k [Ad avec ktexp exp (2) V = kIexp [S],

INFLUENCE DE LA STRUCTURE DU SUBSTRAT.

Comme le montre le tableau 1 les constantes k sont plus elevees exp

pour les alcools que pour le phenol ; on notera en outre l'influence mar- quee de l'encombrement,qui ralentit l'esterification de l'alcool le plus en- combre &, qui permet de distinguer l'alcool $3 axial, de l'alcool rial, et qui justifie la formation plus importante du sous-produit 2s.

equato-

TABLEAU 1 :

Variations de k (dam l'acetone) avec la structure du substrat. exP

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ETUDE CINETIQUE DE LA REACTION EN PRESENCE D'ACIDE.

Si l'on ajoute des quantites croissantes d'acide HFB, la concentra- tion de vitesse k subit une variation qui depend de la nature du substrat. Lorsque le substrat contient un group hydroxyle (phenolique dans 22, alco- olique dans &) , on observe une decroissance hyperbolique de la constante k centration totale en acide HFB ajoute :

l+blAH]

exp

(figure 1) qui correspond a l'equation ( 3 ) , oil &It represente la con- exp

a 1 l+b[AI& (3) kexp = ou - =

kexp a

FIGURE 1 : Variations, avec' la concentration totale [?HIt de l'acide HFB, des valeurs de l/k mesurees (.) et recalculees par la methode des moindres car- res (x) pour la reaction de 22 avec l'anhydride

exP

HFB dans l'acetone. 1WM

-336-

En ra l son de l a t res f a l b l e baslcltCdu so lvant u t i l l s e dans cet ts par- t i e de l ' e t u d e (ace tone) , on peut cons iderer que l a s e u l e espece s u s c e p t i b l e de ceder un proton du s u b s t r a t est l ' a c l d e HFB, e t que l e r61e de l ' a c l d e con- jugue du so lvant est negl igeable . La v a r i a t i o n de kexD es t a l o r s i n t e r p r e t a - b le par l e schema reac t lonnel (4) :

K

k ( i a ) SH+ + A- s + AH

( i b ) S + An -3 p r c d u l t s (&ape determinantel

SI [s] e t is] representen t effect ivement l a concent ra t ion t o t a l e lns tan tanee en substrat . e t l a concentrat ion lns tan tanee en s u b s t r a t l i b r e (non pro tone) , on peut ecrlre les equat ions (5-1 (6) e t (1).

(2) V = k2 _'S], [An]

(5) [s] = is J1 + p+] (1) K = isll i4,

I;H+] [A-J

oa [.HIl r epresente l a concentrat ion en ac ide HFB non d i s s o c i e . La comblnal- son des equat ions (i) , (5) , (6) e t (7) donne l ' l q u a t l o n (g) , q u i es t b len lden- t i f l a b l e a l ' e q u a t l o n (2).

k2K (a) kexp - K+ r A H i l

En t o u t e r igueur l a concentrat ion [AH]lrqul l n t e r v l e n t dans ces Bqua- t ions , n ' e s t pas l a concentrat ion t o t a l e d ' a c i d e a j o u t e iAHJt. Toutefo ls , le so lvant e t le substrat &ant l ' u n e t l ' a u t r e t res peu baslques, l a concentra- tion[A-] d 'anion es t certalnement t r h p e t i t e v l s - ~ - v l s de cel le [ .HIl de l ' a c l d e l l b r e , e t l ' o n peut confondre avec une approximation s a t i s f a i s a n t e [AH], e t FJ1- r&s de l a courbe condui t a l ' e q u a t l o n ( 9 ) .

Dans l e cas du phenol 12, l e c a l c u l par l a methode des molndres car-

(9) - 1+20,7[A$ k o,a7

exP 1 ce qui donne k2 = 0,87 e t K =- = 0,0483

20,7

Dans le cas de l ' a l c o o l &, l e c a l c u l de l a courbe condui t a l ' equa-

1 1+52 [ A j t

t l o n (10).

(10) - kexp 100

1 e t K = '52 = 0,0192 ce q u l donne k2 = 100

-337-

On constate c o m e on peut s'y attendre, que la constante k de la exp

vitesse d'esterification de l'acool & est superieure a celle du phenol zp.

Lorsque le substrat est l'enone 8 , on observe que k croft d'abord exP

avec la concentration en acide pour decroftre ensuite, quand la concentration en acide devient tres elevee (figure 2). Une telle courbe en cloche est l'in- dice d'un mecanisme a plusieurs etapes ( 5 1 , qui, dans sa forme la plus simple, peut &re represent€ par les equations (11) oil G represente l'ester gemin6 8 .

(Gal SH+ + A- +& s + AH ( g b ) S + A n & G

k-1

FIGURE 2 : Variationsl avec' la concentration l'acide HFBldes valeurs de kexp pour la reaction de -- avec l'anhydride HFB dans l'acetone et l'aceto- nitrile.

bH3t de

* mn-'

-338-

L'allure caracteristique de la courbe qui represente les variations de kexp avec la concentration globale PIt de l'acide HFB est compatible avec le fait que l'une ou l'autre dee deux etapes ( G b ) ou ( g c ) sont catalysees par les acides ; si c'est l'etape (gb),la variation k l'equation (12).

est representee par exp

klk2 [AH]b-] K

kexp = (k-l [Aq +k2) (K[AJ+ [Aq) (2)

si c'est l'dtape (Gc), la variation de tion (13).

k est representee par 1'Bqua- exP

INTERVENTION DE L'ESTER GEMINE p.

L'analyse cinetique ci-dessus confirme l'analyse chimique faite par LIBMAN et & (6) a propos de l'action de l'anhydride trichloracetique sur les cetones steroides. Les auteurs mettaient en evidence, dans le cas des cetones saturees, des esters gemines analogues a 8, quise decomposaient sous l'influence des acides en esters d'enol et en acide trichloracetique. Pour etre en accord avec les rdsultats de LIBMAN et (6), l'analyse cinetique ci-dessus doit Stre inflechie vers la catalyse acide de 1'8tape (sc), c'est a dire vers l'expression (2) de la constante kexp.

0 @R RLCOO.' COO&

9 -

-339-

L'lntervention intermedialre de l'ester g€mlne g n'est pas facile a demontrer dans le cas du substrat &e a cause &, qui se decompose sur la colonne de CPV. En revanche a partir du substrat 9 - on a pu mettre en evidence par couplage CPV-spectrometrie de masse, l'in- terventlon des esters gemids A& et de dlenols analogues a 5 (volr partle experimentale).

j g est demontree par l'effet lsotoplque kH/kD = 4 observe lors de la

de la labllite thermique de

- dans la transformation de 2 en esters

L'~llmlnat1on preferentielle de 1'hydrogSne 68 dans la transformation

formation de g a partlr de

nees de la lltterature (71 , est effectivement compatible avec le mecanisme propose, oil 1'Btape lente et catalysee par les acides est la decomposition ( G c ) de l'ester gemin6 g.

en l'absence d'acj.de. Une telle valeur de l'effet isotoplque, qui est en accord avec les don-

En effet, en l'absence d'acide, l'equatlon (12) se (9) a (13').

(2') kexp = kl

klk2

k- 1 (GI) kexp = -

La valeur 4 de l'effet isotopique est incompatible pique secondalre, seul Imaginable dans la formation lente 8, qul correpond a l'equatlon (12'). En revanche elle est

reduit a (l-2'), et

avec un effet lsoto- de l'ester gemin€ par f aitement compa-

tible avec un effet isotoplque prlmalre qul interviendrait lors de l'arrache- ment lent de l'atome d'hydroggne 68 , ce qui correspond a l'equatlon (9').

CONCLUSION :

Les resultats precedents permettent de deflnir les conditions optimales de preparation des esters HFB : le milieu doit 6tre aussipeu aclde que possi- ble afln d'eviter la formation de prodults complexes tels que 22, 4s ou Zg, qui brouillent les dosages ulterieurs, et afin d'operer avec une vltesse aussi €levee que possible (du moins lorsque la molecule referme un groupe hydroxyle) .

PARTIE EXPERIMENTALE . 1) STRUCTURES.

Les points de fusion ont bte prls en tubes caplllaires et ne sont pas corrlges. Les spectres W ont ete enregistres sur appareil CARY 15, les spec- tres IR sur apparell PERKIN-ELMER 237, les spectres de RMN sur appareil JEOL C 60 HL et les spectres de masse sur apparell AEI MS 12 couple a un chromatographe en phase vapeur dans les conditions decrltes dans la reference ( 3 ) .

-340-

Deuterio-6$ androstene-4 one-3 &. Ce compose a ete synthgtise a partir de Lg selon la methode de TOFT (8) On traite une solution d'enone &g (2,5 g) dans le benzene par l'ethy-

leneglycol en presence d'uretrace de TsOH. Le produit brut est chromatographie sur silice ; le melange hexane-Et20 : 98-2 Blue l'Bthylenedioxy-3,3 androste- ne-5 (2 g ; F = 154-5'C), qui est ensuite oxyde par l'acide p.nitro perben- zorque dans le benzene. Neutralisation et extraction livrent un melange (SO- 50) d'epoxydes a et $ , qui sont separes par chromatographie sur silice. On obtient ainsi ltethy18nedioxy-3,3 6poxy-5al 6a androstane (350 mg i F = 132- 3'C), qui est reduit en LiAlD4 dans le THF. L'ethylenedioxy-3,3 deuterio-6B androstanol-5a brut est deshydrate par NaOH 0,l N pendant 16 h a temperatu- re ambiante. Extraction et cristallisation dans le methanol aqueux fournissent -- Lb (150 mg) dont la purete chromatographique est superieure a 98% et dont la purete spectrometrique est donnee par le rapport m/e (272) / (273) = 3%.

F = 105-6'C. UV (dioxanne) : Xmax = 236 run ( E = 15.000).

IR (KBr) RMN (CDC13) : 3H a 0,70 ; 3H a 1,12 i 1H a 5,72 pprn.

Spectre de masse : C H DO = 273 i m/e = 273 (36) i 272 (1) i 231 (38) ; 188 (34) ; 149 (50) ; 125 (100).

: 1670, 1610, 1220, et 855 cm-l.

19 27

Heptafluorobutanoyloxy-3 estradi8ne-lI3,5 (10) 2$.

Une solution acetonique de & est traitee par l'anhydride HFB (5%) pen- dant 1 h a.22"C et ensuite Bvaporee a sec sous azote.

IR (cc14) : 1785, 1482, 1070 et 960 cm-l.

RMN (CDC13) : 3H a 0,75 ppm. Spectre de masse : C22H23F702 = 452 i m/e = 452 (100) ; 437 (9) i 409 (22) ;

356 (26) ; 355 (31) : 239 (27) ; 144 (53).

Heptafluorobutanoyloxy-3% (5u) androstane 1k .

La preparation est identique a celle de zg. IR (CC14) : 1770 et 1290 cm-l.

RMN (CDC13) : 3H a 0,68 ; 3H a 0,78 ; 1H a 4,90 ppm. Spectre de masse : C23H31F7 O2 = 472 ; m/e = 472 (59) ; 457 (40) i 429 (70) ; 259 (20) ; 258 (34) ; 243 (100) ; 215 (25) i 204 (22) i 189 (19).

-341 -

Heptafluorobutanoyl-1 (5'~) androstanyl-3'6) oxy-2 prophe-1 22.

Ce sou8 produit de la reaction de & avec l'anhydride HFB en milieu acetonlque acldlfie n'a pas ete isole et n'a pu &re Identifie que par cou- plage CPV-spectrometrle de masse.

Spectre de masse : C26H35F702= 512 : m/e = 512 (0,2) : 343 (1) : 259 (100):

258 (23) : 243 (16) : 204 (23) : 163 (35).

Heptafluorobutanoyloxy-3a (5a) androstane &.

La preparation est analogue a celle de z$. (CC14) : 1770, 1295, 1230 et 1075 cm-l.

23 31 7 2

IR

Spectre de masse :C H F 0 = 472 : m/e = 472 (31) ; 457 (30) : 429 (67) ;

259 (31) : 258 (98) : 243 (56) : 204 (56) : 189 t41).

Heptafluorobutanoyl-1 ((5a) androstanyl-3'a) oxy-2 propbe-1

La preparation est analogue a celle de 1s. Spectre de masse : C26H35F702= 512 : m/e = 512 (0,2) ; 343 (1) : 259 (100): 229 (pic metastable = 343 x 343 / 512) : 204 (22) ; 163 (38).

Heutafluorobutanoylox~-176 (5a ) androstane z$. La preparation est analogue a celle de &.

(CC14) : 1775, 1302 et 1150 cm-l. F = 64-5OC. IR

RMN (CDC13) : 3H a 0,76 i 3H a 0 , 8 0 : 1H a 4,70 ppm.

Spectre de masse : C23H31F,02= 472 ; m/e = 472 (42) : 457 (50) : 415 (52);

259 (34) : 258 (97) : 217 (46) : 201 (52) : 149 (63) : 95 (89) : 81 (100).

Heptafluorobutanoyl-1 ((5'a) androstanyl-17'6) oxy-2 propepe-1 Zg.

On dissout le (5a) androstanol-176 zg (500 mg) dans un melange Me co auxquels on ajoute de l'anhydride HFB (5 ml). On

2 (20 ml) -Me3SiC1 (20 ml) , Bvapore apres 3 h de reaction a temperature amblante et on chromatographie par fractions de 100 mg sur colonne de Florisil (30 x 1 cm) en eluant un melange benzene-ether (98-2). On obtient ainsi apres cristalllsation dans le methanol sec, le compose 22 (310 mg).

F = 81-2'C. W (dloxanne) : Amax = 280 nm (16.400).

Analyse : C H F 0 26 35 7 2

-342-

Calculee % : C 60,94 H 6,83 F 25,98 Trouvee : 61,ll 6,93 25,63

IR (Ccl4) : 1685, 1565, 1300, 1225 et 1120 cm-l.

RMN (CDC13)

Spectre de masse : C26H35F702= 512 ; m/e = 512 (1)

203 (10) ; 163 (44) i 149 (53).

: 3H a 0,78 ; 3H a 0,82 i 3H a 2,33 i 1H a 4,05 i 1H a 5,72ppm.

i 343 (2) ; 259 (100) i

Heptafluorobutanoyloxy-3 androstadiene-3,5 6 .

Une solution acetonique de &g est traitee par l'anhydride IIFB (5%) pen- dant lh a 22°C et ensuite evaporee a sec sous azote.

(CC14) : 1780, 1630, 1290, 1230 et 1140 cin-l. IR

RMN (CDC13)

Spectre de masse : C23H27F702= 468 : m/e = 468 (75) i 453 (32) i 318 ( 6 ) :

148 (100) ; 135 (99).

: 3H a 0,72 ; 3H a 0,99 ; 1H a 5,40 ; 1H a 5,72 ppm.

Heptafluorobutanoyloxy-3 androstadisne-2,4 2 Une solution de &g dans un melange benzene-pyridine 85-15 contenant

5% d'anhydri.de HFB est chauffee a 6OoC pendant 1 h et evaporee a sec sous azote.

Spectre de masse : CZ3Hz7F7O2= 468 ; m/e = 468 (38) i 318 (26) i 149 (100) i

135 (24).

Bis heptafluorobutanoyloxy-3,3 androstsne-4 g

La formation de 0 peut Etre decelrje par la RMN quand la cinetique de la reaction est suivie dans les conditions suivantes : on ajoute l'anhydride HFB (100 111) a une solutiond'enone & (50 mg) dans (CD3)2C0 (400 ~ 1 ) . Les spectres sont enregistres des que le melange est homogene et ensuite par intervalles de 10 mn jusqu'a 40 mn. Pendant les 20 premisres minutes de la reaction, on observe l'apparition rapide et la disparition graduelle de deux signaux, qui peuvent Stre attribues a l'ester gemin6 g :

1,25 ppm (methyle-19) 6,14 ppm (proton en C-4).

Ces signaux disparaissent au profit des resonances analogues de l'ester de dieno1 9 :

1,06, 5,55 et 5,90 ppm.

-343 -

MBthylSne-6 hydroxy-17% androstsne-4 one-3 p

Preparee selon la reference (9).

Tris trifluorOac~tcocv-3,3,178 et tris penta fluoro propionyloxy-3,3,17B

rn8thylSne-6 androstgne-4 g g &h.

Ces compos6s sont mis en evidence par spectrometric de masse de la fa- con suivante : une partie aliquote du melange reactionnel, comprenant 2 (100 ug) , Me2C0 (100 111) et (CF3CO)20 ou (C2F5C0)20 (10 u1) , est Bvaporee sur la sonde d'introduction directe aprgs 15 mn de reaction et aussitdt in- troduite dans la source. Les spectres de masse montrent respectivement, pour --- 10a un pic moldculaire a 606 u.m. et pour un pic moleculaire a 756 u.m. ---

2 ) MESURES CINETIQUES .

Les solvants (250 ml) ont BtB rendus anhydres par passage sur une 0

colonne (50 x 2 cm) de tamis moleculaire (4 A ) et distillation. Les anhy- drides perfluores ont ete prepares a partir des acides correspondants par mi- ses a reflux repetees sur P205 et distillation fractionnee. Les cinetiques ont BtB effectuees en tubes bouches a 22OC. Les tubes coniques en verre et leurs bouchons rod& ont Bte chauffes 15 h a 15OoC, refroidis au dessicca- teur et aussitdt emplis a 22'C avec un melange reactionnel. Celui-ci se compose de 200 u1 de solvant contenant le steroide (1,8 x et eventuel- lement des concentrations croissantes d'acide HFB, auquels est ajoute l'anhy- dride HFB (0,05 ou 0,lO MI. Le melange est rendu homogene par agitation (instant Zero). Un dchantillon de 1 u1 est preleve une seule fois dans cha- que tube a des intervalles determines et inject6 aussit6t dans la colonne de CPV.

Les esters HFB 22 et 22 ont Bte doses par CPV sur une colonne en ver- ,

re (30 x 0,3 cm), remplie d'OV-7 1% sur Gas Chrom Q 100-120 mesh. La concen- tration de l'ester est lue sur une courbe d'etalonnage. Les constantes k exprim es en mole-' mn-' a 22OC (2 0,3 O ) ont Bte determinees en triple et la precision sur les valeurs varie entre 3 et 5% (coefficient de variation). La constance de k en fonction du temps de reaction (t) a BtB verifiee par la linearit6 de l'equation

exp

exp

jusqu'a une valeur de 1,O (voir aussi ref+ CS] 0

log ~ - [S]o-[E] 2.303

rence 4) oh [El est la concentration d'ester forme et is]. la concentration initiale en substrat.

-344-

REMERCIEMENTS :

Les auteurs remercient le Dr.M. EPHRITIKHINE pour l'enregistrement des spectres RMN, Mr.A. REIFFSTECK pour l'enregistrement des spectres de masse, Mr.J. DUBOIS pour l'aide technique et le Dr.D.K. VALANCE (Glaxo Ltd, Grande- Bretagne) pour un don de composB 5.

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