ESTHER VENTIANE 2008

METHODE DE DIAGNOSTIC ET DE SUIVI DE LINFECTION PAR LE VIH

Service de MicrobiologieVIROLOGIECHU saint Louis Paris 10francois.simon@sls.aphp.fr

Diversit du VIHAB*

Quels sont les examens biologiques qui permettent de faire le diagnostic de linfection VIH-1 ELISATest rapide

ELISA

Les tests ELISA sont dits mixtes lorsquils dtectent les anticorps anti-VIH1 et les anticorps anti-VIH2 de faon simultane.

Ils sont dits combins lorsquils dtectent, la fois, les anticorps anti-VIH1 et VIH2 et lantigne P24 du VIH1.

Ils sont dits de 1re gnration lorsque les antignes utiliss taient du lysat viral (abandonn en France hors recherche)Test de 2me gnration : les tests utilisant des antignes de synthse soit par recombinants soit par peptides Test de 3me gnration, il sagit de tests par immuno-capture dtectant la fois les IgG et les IgM, les immunoglobulines tant pris en sandwich entre les antignes de la phase solide et un antigne marqu servant pour rvler la liaison Ag-Ac-Ag

Test de 4me gnration, il sagit des tests mixtes, et combins, haute sensibilit base sur le principe de limmunocapture et dtectant les anticorps antiHIV1, antiHIV2 et lantigne P24 un seuil de dtection de au moins 30- 50 pg/ml de srum

Dtection des anticorps Totaux (IgG + IgM)IgG ou IgM Expression des rsultats Qualitatif (positif ; ngatif ; douteux) diagnostic srologique mixte 4eme GenerationELISA

Microplaque ELISA : Les puits colors correspondent des positivitsTest ELISA indirect (Infection par le VIH)

Les tests par immunochromatographie ou TESTS RAPIDES

Lantigne et le ractif de rvlation sont fixs en mme temps sur une membrane lors de la diffusion du srum, les anticorps vont se fixer sur lantigne et sur le ractif de confirmation et entraner ce dernier vers un tmoin sur le site de contrle et qui donnera une raction obligatoirement positive pour valider le test. Ces tests peuvent tre utiliss avec le srum, le plasma, parfois le sang total voire la salive.

TESTS RAPIDES & GENERATIONS DE TESTSLes tests immuno-chromatographiques peuvent tre considrs comme des tests de 3me gnration dans la mesure o certains dentre eux peuvent dsormais dtecter les isotypes IgG et IgM.Les tests TDR de 4me gnration sont actuellement en valuation.

Western Blot du VIH-1Bandelette 1 : Contrle positifBandelette 2 : Contrle ngatifSrum A: NegatifSrum B: IndeterminSrum C: PositifWestern blot de confirmation (Infection par le VIH)

Quels sont les marqueurs biologiques permettant le suivi clinique et thrapeutique des sujets infects par VIH ?

Charge virale ARN VIH-1 Suivi biologique de linfection VIH-1Quantification ARN VIH-1Plasma EDTA(LCR)

principales tapes :

lyse des virions prcipitation en prsence d'thanol adsorption sur membrane ou billes de silica-gel lavages puis lution de l'extraitExtraction des ARN/ADN viraux

Sang total, plasma LCR, LBA, biopsie...Extracteurs automatiquesExtraction dAcides NucliquesExtracteur dacides nucliques Magna Pure LC (Roche)200 l32 chantillons2 heures

certains virus d'intrt mdical majeur ont un gnome ARN --> VIH, VHC

transformation en ADN complmentaire (ADNc) par une transcriptase inverse (RT) :

plus stable chimiquement obligatoire pour permettre une PCRTranscription inverse

PCR en temps rel - Rsultat

V. Deffrennes _P. Sageat Avril 2005

PCR versus PCR en Temps RelNb de cyclesFluorescenceDtection dela PCR traditionnelle96 rplicats510152025Dtection de la PCR Temps Rel303540Phase plateauPhase exponentielle Phase dinitiation

Plateformes automatisesExtraction dARN/ADN et PCR en temps rel Quantification ARN VIH-1, ADN VHB, ARN VHCRocheAbbott

V. Deffrennes _P. Sageat Avril 2005

ARN viralADN viralBactrienGnomiqueSrumPlasmaUrineSang totalBuffy CoatscouvillonsLCRSaliveMoelleSpermeExpectorationsm2000sp

V. Deffrennes _P. Sageat Avril 2005

m2000rt Rapide, analyse de donnes valide avec le logiciel de m2000rtRsultat dtaill de la srieRsultat dtaill de lchantillonInterface LIS Marquage CE-IVDD Logiciel de diagnostic convivialFonctionnement en mode ouvert pour autres tests Abbott (07/2006)

Technologie avance et fiableTechnologie en temps relCamera CCD, Lecture de 5 filtresJusqu 96 chantillons

Modlisation de la cintique de dcroissance de la charge virale plasmatique chez un patient qui dbute un traitement antirtroviral efficace

RESISTANCE AUX ANTIRETROVIRAUX

Taux derreur de la TI: 1/10.000 nuclotidesProduction virale: 109-1010 particules par jourToutes les mutations pr-existent avant traitementTaux de recombinaison: 5 10 vnements par cycle Evolution constante de la quasiespceDemie-vie dun virus plasmatique = 0.3 joursDemie-vie des cellules infectes = 2.2 joursPourquoi y a til slection de virus rsistants ?

Emergence de virus rsistantsEn labsence dantirtroviralLe virus sauvage est le plus adapt, cest le variant le plus prvalent dans la quasiespce virale rplicative

Sous pression de slection antirtroviraleLes variants rsistants mergent en raison de leur avantage rplicatif dans ces conditionsPression de slection

Pression de slection antirtroviraleSlection de variants rsistantsSuppression incomplte Dfaut de puissance Taux plasmatiques insuffisants Dfaut dobservance Pr-existence de rsistance Charge viraleTempsVariants sensiblesVariants rsistantsDbut du traitement

Mutations de rsistancePrsentes dans les gnes cibles des antirtroviraux : -->TI, protase, gp41, intgrase

Elles confrent un avantage rplicatif aux virus en prsence de drogues : -->slection de variants muts

Certaines ont un effet ngatif sur la fonction de lenzyme

M184V(sauvage) position (mut)

Analyse des mutations des gnes RT, protase, gp 41 VIH-1associes la rsistance aux traitements antirtroviraux Gnotype de rsistance -VIH1Choix du premier traitementGestion des checs virologiques

ExtractionARN viralcDNAPCR nichePurificationproduits PCRSquencePurification Migration sur squeneurC C T CCGGAAGATGGGTTGGGGASquencenuclotidiquePlasma Gnotype de rsistance -VIH1 (ANRS consensus, tous les gnes cibles des antirtroviraux)Squences gnes RT, protase (gp41, intgrase)

INDICATIONS DES TESTS DE RESISTANCE RECOMMANDEPrimo-infectionDs le diagnostic ou avant initiation du traitementTous les checs thrapeutiques (rplication virale sous traitement)GrossesseNouveau-nEnfant (diagnostic et chec)

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