Estrategias de Hibridación in situ Fluorescente para … SAG 2011.pdf• Hibridación in situ •Desarrollada por Pardue & Gall (1969)-Muy pocas secuencias de DNA disponibles-Radioisótopos

Fluorescent in situ Hybridization

• Hibridación in situ•Desarrollada por Pardue & Gall (1969)

-Muy pocas secuencias de DNA disponibles-Radioisótopos

·Alto entrenamiento·Seguridad·Tiempo

• Hibridación in situ Fluorescente•Pinkel & Gray (1984)•Detección de secuencia blanco por fluorescencia•Método rápido•Discriminativo•Inofensivo•Relativamente fácil

HistoriaHistoria

37ºC 95ºC

FundamentosDesnaturalización

•Desnaturalización de la sonda

•Desnaturalización del DNA Cromosómico

•Hibridación Sonda-DNA Cromosómico

MetodologíaMetodología

Hibridación in situ Fluorescente

FISH (Clásico)

•Multicolor Karyotyping•Spectral Karyotyping•Multicolor banding FISH•Fiber FISH•Q-FISH•Flow-FISH•Chromosome combing•Padlock FISH•CGH•Array-CGH•etc.!!

Sondas

Fragmentos de DNA homólogos a la secuencia blanco, marcados con una molécula detectable directamente o mediante una reacción inmunoquímica

Estos fragmentos deben cubrir una región de por lo menos 70 kb para poder ser detectados al microscopio.

DefiniciónSondasSondas

Sondas:

Sondas gen-específicas:

Sondas región específicas:

Sondas de pintado cromosómico total:

Hibridación in situ Fluorescente en diagn óstico oncológico

Citogenética Molecular

Citogenética Clásica Genética Molecular

Genética Clínica

Análisis de Metafases

•Translocaciones

•Cromosomas Marcadores

•Inversiones (pericéntricas)

•Anomalías numéricas

•Microdeleciones

Análisis de Metafases

Citogenética de interfase

�Diversidad de sondas específicas (proyectogenoma)

�Simplificación de protocolos�Disminución del tiempo de análisis�Mejora notable en los métodos de

marcado de sondas�Mejora en los sistemas de tomas de

imágenes y software

Información valiosaen núcleos interfásicos

FISH en interfases

HERRAMIENTA CLHERRAMIENTA CLÍÍNICANICA

Citogenética de interfaseAlgunos usos específicos

�Estudio de mosaicismos �Células tumorales

�Muestras pequeñas�Células inactivas

FISH en interfases

Se obtiene información de una gran variedad de muestras

Permite obtener información específica en muestraspequeñas

Independiente de la presencia de células metabólicamente activas

Sujeto a variaciones técnicas importantes

Debido a:�Calidad de la sonda�Calidad de la fijación�Background�Reactivos de detección�Interpretación de las señales�Especificidad de la sonda�Temperatura de desnaturalización�Variabilidad entre reacciones

Es necesario establecer criterios propios

DiseDiseñño de sondaso de sondas

Cent.

HIRA (Tuple1) TOP3BPPM1F22qter(C+)

Cent.


Cent.


Para aplicación en Oncología


Para aplicación en Oncología


•Sondas Locus específicas

•Sondas Break Apart

•Sondas Doble fusión

•Sondas Tumores sólidos

Sondas OncológicasLocus Específicas

17p13.1 (TP53)

Izq, Normal. Der, P53-

Isocromosoma 17q

150Kb

17p13.1

17q25.3

SHBG

FXR2

SAT2

TP53(20Kb)

WDR79

EFNB3

DYH2


1p36 (TP73)

1p36.32

150Kb

TP73

Control1q44


5q15-q31 (SHGC85191/EGR1)

SHGC85191

Control5q11.2

EGR1

Her 2/neu (erb2) Es un oncogen que se encuentra en la célula normal en dos copias únicamente

Her 2/neu

Enumeración 17 (17p11.2) (C+)

CANCER DE MAMA :

Distintos mecanismos pueden llevar a la amplificación de este gen, desencadenando la enfermedad.

Sondas OncológicasTumores sólidos

MicrotomoMicrotomo

Tacos de Tacos de parafinaparafina Cortes de Cortes de 44--6 6 µµµµµµµµ

SeSeññalal al al microscopiomicroscopio

Procesado:


Celula normal: dos copias de Her 2/neu

dos señales verdes representan dos cromosomas 17dos señales rojas representan dos copias del oncogen

Celulas con amplificaciones

Las señales verdes representan los cromosomas 17, las señales rojas representan del oncogen amplificado


Células normales Células anormales


Translocación BCR-ABL


Cromosoma Philadelphia en Leucemia Mieloide Crónica

•95 % de los pacientes tiene esta fusión

•Su presencia activa una tirosina kinasa requerida para su función transformante

•La evolución es seguida a través del porcentaje de células con cr. Phi en sangre

•El método más apropiado para esto es FISH


¿Porqu é FISH ?

•Los métodos moleculares (PCR) dan la respuesta: SI ó NO

•FISH: respuesta cuantitativa (%)

•Los métodos moleculares (PCR) pueden contaminarsecon falsos positivos

•FISH: no es pasible de contaminación intermuestras

Translocación BCR-ABL


Translocación BCR-ABL(Sonda Fusión Simple)

BCR-ABL +

BCRCrom. 22

140Kb

350Kb

ABLCrom. 9

52Kb

421Kb

BCR-ABL -

Falsos positivos5-13%

BCR-ABL +

Translocación BCR-ABL(Sonda Doble Fusión)

BCRCrom. 22

140Kb

1300Kb

ABLCrom. 9

52Kb

876Kb

BCR-ABL -

Falsos positivos0.5%

Sondas de Doble Fusión

MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia)


MLL (myeloid/lymphoid or mixed leukemia)

(Sonda Break apart)

Crom. 11

MLL

MLL normal

MLL translocado

Sondas Break Apart

•Simple de aplicar

•Resultados obtenidos en corto tiempo

•Fácil de interpretar

•Funciona en casi cualquier célula o tejido

•Herramienta en investigación

•Herramienta diagnóstica

Conclusiones Finales

MUCHAS GRACIAS

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