Upload
others
View
10
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Copyright 2018 Carolina González Camacho
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus EN LA
DESLIGNIFICACIÓN DE CASCARILLA DE ARROZ EN CULTIVO
SEMISÓLIDO
Proyecto de grado
Por
CAROLINA GONZÁLEZ CAMACHO
Presentado a la facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogotá D.C
Junio 2018
Copyright 2018 Carolina González Camacho
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus EN LA
DESLIGNIFICACIÓN DE CASCARILLA DE ARROZ EN CULTIVO
SEMISÓLIDO
Proyecto de grado
Por
CAROLINA GONZÁLEZ CAMACHO
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramírez, PhD. Co-asesores, Luis Jorge Cruz Reina, BSc Juan Sebastián Chiriví Salomón, MSc Jurado, Luis Humberto Reyes, PhD. Director del departamento: Andrés González Barrios, PhD.
Departamento de Ingeniería Química
Junio 2018
iii
Copyright 2018 Carolina González Camacho
ABSTRACT
Study of the Enzymatic Activity of Pleurotus ostreatus in the delignification of risk husk
in semi-solid culture.
Carolina González Camacho, BSc.
Universidad de los Andes, Colombia
Adviser: Rocío Sierra Ramírez, PhD.
Co-Advisers: Luis Jorge Cruz Reina, BSc,. and Juan Sebastián Chiriví Salomón, MSc.
The production of ethanol from agro-industrial waste has been widely studied in recent years as a
source of renewable energy. The rice husk is an agro-industrial waste with a large amount of
fermentable sugars for the production of biofuels, however, it is necessary to release those sugars
with a pretreatment due to the content of lignin in the rice husk. In this study, the activity of the
lignocellulolytic enzymes (laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, exoglucanase, and
endoglucanase) were quantified from the liquid fraction of the semi-solid culture of Pleurotus
ostreatus, which is used as a biological pretreatment for the delignification of rice husks. After the
pre-treatment, the delignification and the loss of dry weight and carbohydrates of the rice husk were
evaluated. Finally, the comparison of three methods of quantification of sugars from enzymatic
hydrolysis: High Performance Liquid Chromatography, Miller's method and the Trinder’s method,
was carried out.
As a result of the pretreatment, 11.85% of delignification was obtained. In addition, a cellulose and
hemicellulose losses of 28.35% and 32.78% were achieved, respectively. A weight loss of 16.65%
was also obtained. The achieved delignification is attributed mainly to the action of the laccase
which reached an enzymatic activity of 14170.65 U/L, being more than 15 times greater than the
maximum activity of manganese peroxidase registered (868.11 U/L). No activity of lignin
peroxidase was found, whereby the absence of this enzyme was confirmed. The loss of cellulose
was mainly due to the activity of the exoglucanase which remained constant during the pretreatment
and reached a maximum value of 1305.47 U/L. In addition, the endoglucanase was not quantified
in the semi-solid culture but a qualitative screening was performed in a different culture, using
carboxymethylcellulose as the sole carbon source.
From the comparison of the three methods of quantification of sugars studied, we concluded that
the methods that best describe the profile of production of sugars with greater precision are HPLC
iv
Copyright 2018 Carolina González Camacho
and the Miller’s method. On the other hand, we do not recommend the Trinder’s method for the
quantification of glucose in this type of culture.
Key words: Biological pretreatment, lignocellulose, quantification methods, sugars.
v
Copyright 2018 Carolina González Camacho
RESUMEN
Estudio de la actividad enzimática de Pleurotus ostreatus en la deslignificación de
cascarilla de arroz en cultivo semisólido.
Carolina González Camacho, BSc.
Universidad de los Andes, Colombia
Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD.
Co-Asesores: Luis Jorge Cruz Reina, BSc,. and Juan Sebastián Chiriví Salomón, M.Sc
La producción de etanol a partir de residuos agroindustriales ha sido altamente estudiada en los
últimos años como una fuente de energía renovable. La cascarilla de arroz es un residuo
agroindustrial con una gran cantidad de azúcares fermentables para la producción de
biocombustibles, sin embargo, su contenido de lignina hace necesario un pretratamiento para la
liberación de dichos azúcares. En el presente estudio se realizó la cuantificación de la actividad de
las enzimas lignocelulolíticas: lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, exoglucanasa y
endoglucanasa, en la fracción líquida del cultivo semisólido de Pleurotus ostreatus como
pretratamiento biológico para la deslignificación de cascarilla de arroz. Posterior al pretratamiento
realizado, se evaluó la deslignificación y la pérdida de peso seco y de carbohidratos de la cascarilla
de arroz. Adicionalmente, se realizó la comparación de tres métodos de cuantificación de azúcares
provenientes de hidrólisis enzimática: cromatografía líquida de alta resolución, método de Miller y
método de Trinder.
Gracias al pretratamiento realizado, se obtuvo una deslignificación de 11,18% además de una
pérdida de celulosa y hemicelulosa del 28,35% y 32,78%, respectivamente, y una pérdida de peso
seco de 16,65%. La deslignificación obtenida se atribuye principalmente a la acción de la lacasa,
la cual alcanza una actividad enzimática de 14170,65 U/L, superando más de 15 veces la actividad
máxima de manganeso peroxidasa registrada la cual fue de 868,11 U/L, y en contraparte, no se
encontró actividad de lignina peroxidasa, por lo cual se confirmó la ausencia de esta enzima. La
pérdida de celulosa se debió principalmente a la acción de la exoglucanasa, la cual registró una
actividad constante durante el tratamiento y alcanzó un valor máximo de 1305,47 U/L. Además, no
se logró cuantificar la endoglucanasa en el cultivo semisólido, pero se realizó un rastreo cualitativo
de la misma en un cultivo diferente, usando carboximetilcelulosa como única fuente de carbono.
vi
Copyright 2018 Carolina González Camacho
A partir de la comparación de los tres métodos de cuantificación de azúcares estudiados, se
concluyó que los métodos que mejor describen el perfil de producción de azúcares con una mayor
precisión son el HPLC y el método de Miller. Por su parte, el método de Trinder no se recomienda
para la cuantificación de glucosa en este tipo de cultivo.
Palabras clave: Pretratamiento biológico, lignocelulosa, métodos de cuantificación, azúcares.
vii
Copyright 2018 Carolina González Camacho
AGRADECIMIENTOS
A mi hermana y mis padres por su paciencia, apoyo y amor incondicional. A mis amigos
por acompañarme y ser mi segunda familia. Agradezco a mi asesora y co-asesores por sus
consejos, especialmente a Luis Cruz quien fue mi mano derecha, me motivó, me apoyó y
me dejó múltiples enseñanzas para la vida.
viii
Copyright 2018 Carolina González Camacho
NOMENCLATURA
HPLC High performance liquid chromatography
DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico
CMC Carboximetilcelulosa
ABTS Ácido 2-,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
PO Pleurotus ostreatus
pH Potencial de Hidrógeno
U/L Unidades de actividad enzimática por litro
LiP Lignina peroxidasa
VA Alcohol veratrílico
MnP Manganeso proxidasa
VP Versátil peroxidasa
ix
Copyright 2018 Carolina González Camacho
TABLA DE CONTENIDO ABSTRACT…………………………………………………………………… iii RESUMEN……………………………………………………………………. v AGRADECIMIENTOS……………………………………………………….. vii NOMENCLATURA………………………………………………………….. viii TABLA DE CONTENIDO…………………………………………………… ix LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………. xi LISTA DE TABLAS………………………………………………………….. xiii OBJETIVOS………………………………………………………………….. xiv CAPÍTULOS I INTRODUCCIÓN…………………………………………….…………1 1.1. Material lignocelulósico……………………………………………2 1.1.1. Celulosa…………………………………………………...3 1.1.2. Hemicelulosa……………………………………………...5 1.1.3. Lignina…………………………………………………….5 1.2 Degradación microbiológica………………………………………..7 1.3 Pleurotus ostreatus………………………………………………….8 1.4. Complejo enzimático lignocelulolítico…………………………….9 1.4.1. Enzimas celulolíticas……………………………………..9 1.4.2. Enzimas ligninolíticas……………………………………10 1.4.2.1. Lacasa (EC.1.10.3.2)…………………………...11 1.4.2.2. Manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13)………...13 1.4.2.3 Lignina peroxidasa (EC.1.11.1.14)……………..15 1.5. Deslignificación biológica…………………………………………17 II METODOLOGÍA……………………………………………................20 2.1. Preinóculo y cultivo………………………………………………..20 2.2 Métodos de cuantificación de azúcares…………………………….21 2.2.1. HPLC……………………………………………………...21 2.2.2. Método de Miller o DNS…………………………………21 2.2.3. Glucosa libre por método de Trinder…………………….22 2.3. Evaluación de la actividad enzimática…………………………….23 2.3.1. Actividad de la lacasa…………………………………….23 2.3.2. Actividad de la manganeso peroxidasa…………………..24 2.3.3. Actividad de la lignina peroxidasa……………………….24 2.3.4. Actividad de la exoglucanasa…………………………….25 2.3.5. Rastreo de actividad de la endoglucanasa……………….25 2.4 Medición de lignina y carbohidratos……………………………….26 III RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………….............28
3.1 Comparación de técnicas de cuantificación de azúcares……………..28
x
Copyright 2018 Carolina González Camacho
3.2 Medición de actividad enzimática……………………………………..34 3.2.1 Lignina peroxidasa…………………………………………..34 3.2.2 Lacasa………………………………………………………..36 3.2.3 Manganeso Peroxidasa………………………………………37 3.2.4 Exo-1,4-B-D-glucanasa……………………………………...40 3.2.5 Endo-1,4-B-D-glucanasa…………………………………….42 3.3 Medición de lignina y carbohidratos…………………………………..45
IV CONCLUSIONES …………………….……………………..………….47 V TRABAJO FUTURO …………………….…………………….. ………49 REFERENCIAS…………………………………………………………………50 ANEXOS………………………………………………………………………...54
xi
Copyright 2018 Carolina González Camacho
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de los materiales lignocelulósicos…………………………………3
Figura 2. Estructura de la celulosa amorfa y cristalina………………………………….4
Figura 3. Estructura molecular de la celulosa…………………………………………...4
Figura 4. Estructura molecular de la lignina…………………………………………….6
Figura 5. Representación esquemática del complejo celulolítico………………………10
Figura 6. Ciclo catalítico de la lacasa……………………………………………...……12
Figura 7. Esquema de la acción del sistema lignocelulolítico…………………………..18
Figura 8. Cultivo de P. ostreatus en medio semisólido…………………………………20
Figura 9. Comparación de resultados de técnicas de cuantificación de azúares. a. HPLC,
DNS y método de Trinder. b. HPLC y método de Trinder. c. DNS y HPLC……………30
Figura 10. Gráfica de efectos principales para la desviación estandar, tienendo en cuenta
los métodos HPLC y Trinder…………………………………………………………….31
Figura 11. Gráficas de intervalos obtenidas en Minitab, se resaltan los datos
significativamente diferentes tras pruebas de Tukey. a. DNS. b. HPLC. c. Kit de glucosa
(método de Trinder)……………………………………………………………………...34
Figura 12. Absorbancia obtenida en el ensayo para cuantificación enzimática de la
lignina peroxidasa………………………………………………………………………..35
Figura 13. Actividad enzimática de la lacasa……………………………………………37
Figura 14. Actividad enzimática de la manganeso peroxidasa………………………….38
Figura 15. Curva de pH del extracto enzimático………………………………………..40
Figura 16. Actividad enzimática de la exoglucanasa……………………………………42
Figura 17. Resultado de la decoloración del rojo congo por el extracto enzimático
del día 27…………………………………………………………………………………43
xii
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 18. Resultados de la prueba de decoloración del rojo congo. a. Prueba con P.
ostreatus. b. Control negativo con P. ostreatus. c. Prueba con Ganoderma lucidum d.
Control negativo con Ganoderma lucidum……………………………………………....44
xiii
Copyright 2018 Carolina González Camacho
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Porcentajes perdidos después del pretratamiento………………………………45
Tabla 2. Relaciones de selectividad……………………………………………………..46
xiv
Copyright 2018 Carolina González Camacho
OBJETIVOS
Objetivo General
Evaluar la actividad de las enzimas ligninolíticas manganeso peroxidasa, lignina
peroxidasa y lacasa, y de las enzimas celulolíticas del cultivo semisólido en la
deslignificación de cascarilla de arroz usando Pleurotus ostreatus.
Objetivos específicos
• Comparar tres metodologías de cuantificación de azúcares para la evaluación de
actividad celulolítica en el cultivo semisólido.
• Cuantificar la actividad de las enzimas ligninolíticas manganeso peroxidasa, lignina
peroxidasa y lacasa, y las enzimas celulolíticas endo-b-D-1,4-glucanasa y exo-b-
D-1,4-glucanasa, producidas por Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido.
• Evaluar la relación entre la deslignificación obtenida en el cultivo semisólido y la
actividad enzimática observada.
Copyright 2018 Carolina González Camacho
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
El agotamiento de los combustibles fósiles y las desventajas que estos conllevan como la
emisión de gases de efecto invernadero, conduce a la búsqueda de fuentes de energía
alternativas que sean renovables como la biomasa lignocelulósica (Sindhu, Binod, &
Pandey, 2016), la cual constituye la base para la producción de los llamados
biocombustibles de segunda generación, que se caracterizan por ser subproductos de la
industria alimentaria sin valor económico. La conversión de material lignocelulósico a
bioetanol es una alternativa que contribuye a frenar la concentración de gases de efecto
invernadero en la atmósfera, además de proveer una alternativa barata, renovable y
accesible al obtenerse a partir de residuos agroindustriales tales como el bagazo, la
cascarilla de arroz, la cascarilla de trigo, entre otros, los cuales de no ser utilizados terminan
quemándose en grandes cantidades (Ghorbani, Karimi, Biria, Kariminia, & Jeihanipour,
2015). Esta biomasa está conformada por: celulosa (un polímero de D-glucosa),
hemicelulosa (un azúcar heteropolimérico) y lignina (una unidad polimérica no
fermentable). Estos compuestos se encuentran unidos en una matriz con minerales, aceites,
azúcares solubles y otros componentes en menor proporción (Mohanram, Rajan, & Carrier,
2015).
Según Agrocadenas, el arroz es el tercer producto agrícola en extensión en Colombia
después del café y el maíz, y por cada tonelada de arroz producida se generan tres toneladas
de residuos (Muñoz, 2012). Por lo tanto, la cascarilla de arroz es un abundante residuo
agroindustrial generado en Colombia, y en la actualidad, el alto potencial de utilización de
los carbohidratos poliméricos de la cascarilla de arroz aún permanece sin explotar debido
2
Copyright 2018 Carolina González Camacho
a su naturaleza recalcitrante, lo que conlleva una difícil degradación para el
aprovechamiento de sus azúcares. (Mohanram, Rajan, & Carrier, 2015). La composición
de la cascarilla de arroz reportada por la bibliografía es: celulosa entre 28,7% y y 35,6%,
hemicelulosa entre 12,0 y 29,3% y lignina entre 15,4 y 20% (Furkan & Remzi).
Para liberar los carbohidratos de la pared celular, que posteriormente pueden ser
convertidos en etanol por medio de fermentación alcohólica, primero se debe realizar un
pretratamiento para romper los complejos componentes de la lignina. Varios tipos de
pretratamiento han sido investigados, y pueden ser categorizados en: físicos, químicos,
fisicoquímicos y biológicos (R, Shukla, Tiwari, & Srivastava, 2014). El objetivo común
de estos pretratamientos es reducir el tamaño de la biomasa y abrir su estructura física.
El pretratamiento biológico se realiza empleando hongos de podredumbre parda y blanca,
que tienen gran preferencia por la biomasa lignocelulósica y son capaces de degradar la
lignina a un bajo costo, menor impacto ambiental y menor producción de sustancias tóxicas
que el resto de pretratamientos. Sin embargo, aún es necesario mejorar este proceso, para
hacerlo más eficiente y a mayor escala (Montoya, 2012). Este proyecto de grado se enfocó
en un pretratamiento biológico para la deslignificación de la cascarilla de arroz usando un
hongo de podredumbre blanca.
1.1. Material lignocelulósico
La biomasa lignocelulósica se encuentra compuesta principalmente por tres polímeros:
celulosa, hemicelulosa y lignina; junto con pequeñas cantidades de otros componentes
como grupos acetilo, minerales y grupos fenólicos. Dependiendo del tipo de biomasa
3
Copyright 2018 Carolina González Camacho
lignocelulósica, estos polímeros se organizan en estructuras tridimensionales, no uniformes
y complejas de diferentes grados variando la composición relativa.
En la Figura 1 se aprecia la conformación de los materiales lignocelulósicos en los cuales
la lignina se envuelve a la hemicelulosa y la celulosa para protegerlas.
Figura 1. Estructura de los materiales lignocelulósicos. (Martinez, 2014)
1.1.1. Celulosa
Es el material orgánico más abundante del planeta y las plantas la sintetizan como material
estructural para sostener su peso. Es un biopolímero compuesto de unidades de D-glucosa,
las cuales están unidas por enlaces glucosídicos b(1,4) que le confieren estabilidad.
Las estructuras longitudinales de celulosa son llamadas microfibrillas y están conformadas
por zonas cristalinas en las cuales se encuentran ordenadas debido a una gran red de puentes
de hidrógeno intramoleculares e intermoleculares que unen las unidades de glucosa
(Furkan & Remzi) y por zonas amorfas en donde se encuentran desorganizadas porque la
mayoría de grupos hidroxilo en la glucosa se encuentran amorfos (Chen, 2014). En la
Figura 2 se aprecia la estructura amorfa y cristalina de la celulosa.
4
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 2. Estructura de la celulosa amorfa y cristalina. (Martinez, 2014)
La celulosa se ha convertido en una materia prima muy importante en la industrial del
papel, textiles e industria química. Además de la relevancia de la energía limpia que se
puede generar a partir de materiales lignocelulósicos, lo cual será la energía del futuro.
(Chen, 2014)
En la Figura 3, se muestra la estructura molecular de la celulosa, la unidad de glucosa y el
dímero de glucosa llamado celobiosa.
Figura 3. Estructura molecular de la celulosa (Chen, 2014)
5
Copyright 2018 Carolina González Camacho
1.1.2. Hemicelulosa
Las hemicelulosas son polisacáridos con grupos heterogéneos constituidos de diferentes
unidades de azúcares, siendo el segundo polisacáridos más abundante en la pared celular
de las plantas. Las clasifican según los principales azúcares de su cadena principal en
xilanos, xiloglucanos, mananos y glucomananos. Las ramificaciones de hemicelulosas
consisten en oligosacáridos, una cadena pequeña típicamente entre 1 y 4 unidades de D-
galactosa, D-manosa, L-arabinosa, D-xilosa, L-fucosa, L-ramnosa y/o D-ácido
glucurónico. Sin embargo, las unidades constituyentes, la estructura y el contenido de
hemicelulosa varía dependiendo de cada especie. Su función principal es unirse a las
microfibrillas de celulosa para proporcional rigidez a la planta (Prinsen, 2010).
1.1.3. Lignina
Es un biopolímero aromático no polisacárido que se encuentra principalmente en la pared
celular de las plantas, formando parte de una pared ordenada junto con las microfibrillas
de la celulosa y le da una gran resistencia a ataques microbianos, además de evitar la
degradación de la celulosa.
La lignina está compuesta por tres monómeros los cuales son: alcohol p-cumarílico, alcohol
coniferífilo y alcohol sinapílico, a partir de los cuales resultan las tres unidades de lignina:
p-hidroxifenil, guaiacil y siringil (Chen, 2014).
En la Figura 4, se puede observar una conformación aproximada de la molécula de lignina.
6
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 4. Estructura molecular de la lignina. (Chen, 2014)
A través del estudio de diferentes tipos de modelos estructurales de la lignina, se ha
establecido que es un polímero amorfo complejo con una red tridimensional que se
compone básicamente de unidades de fenilpropano unidas entre sí por enlaces C-C y C-O.
Estos modelos estructurales solo describen una estructura hipotética que se infiere de los
resultados obtenidos en los estudios. Además, diferentes plantas o incluso la lignina aislada
7
Copyright 2018 Carolina González Camacho
de la misma planta podría tener diferentes tipos de enlaces y diferente composición de
grupos funcionales, resultando en una estructura muy compleja (Chen, 2014).
1.2 Degradación microbiológica
En la naturaleza, diferentes microorganismos desarrollaron durante su evolución,
mecanismos fisiológicos para enfrentar diversos factores ambientales. La adquisición de
nutrientes representa un desafío especialmente importante para los microorganismos. El
saprofitismo, uno de los estilo de vida más comunes de los microorganismos, involucra
vivir en materia orgánica muerta. En este contexto, los microorganismos desarrollaron
mecanismos para obtener energía a partir de la biomasa de las plantas, y uno de estos
mecanismos involucra la producción y secreción de enzimas que trabajan sinérgicamente
para degradar la pared celular de las plantas. (de Souza, 2013)
Respecto a la degradación de lignina, muchos basidiomicetos de pudrición blanca y
algunos actinomicetos son capaces de producir enzimas degradadoras de lignina,
especialmente peroxidasas y lacasas que solubilizan la lignina trabajando sinérgicamente.
La degradación microbiológica de lignina es usualmente complicada, ya que se tienen tres
grandes retos respecto a la estructura de la lignina: (1) la lignina es un polímero muy
grande, por lo tanto, el sistema enzimático debe ser esencialmente extracelular, (2) el
mecanismo de degradación enzimática debe ser oxidativo en lugar de hidrolítico ya que la
estructura de la lignina tiene enlaces C-C y éter, y (3) la estereoquímica de la lignina es
irregular, requiriendo enzimas con menor especificidad que las enzimas hidrolíticas
requeridas para la degradación de la celulosa y hemicelulosa. Las enzimas mejor
caracterizadas hasta ahora, capaces de degradar el polímero de lignina son lignina
8
Copyright 2018 Carolina González Camacho
peroxidasa (EC.1.11.1.14) lacasa (EC.1.10.3.2), manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13) y
versátil peroxidasa (EC.1.11.1.16) (de Souza, 2013).
1.3 Pleurotus ostreatus
Pleurotus ostreatus es un hongo basidiomiceto de podredumbre blanca, el cual tiene alto
valor nutricional, además de propiedades terapéuticas y aplicaciones biotecnológicas,
especialmente por su alta capacidad de biodegradación. (Córdoba & Cultid, 2015)
El crecimiento de los hongos de pudrición blanca requiere de sustratos que les
proporcionen características físicas y composición química adecuada para su desarrollo y
los materiales lignocelulósicos cumplen a cabalidad con estas condiciones. (Montoya,
2012). Las hifas invaden rápidamente las células de la madera y secretan enzimas y
metabolitos que provocan la despolimerización de la hemicelulosa, celulosa y la
fragmentación de la lignina. (Gaitan & Perez, 2007)
Existen ciertos factores que afectan el crecimiento de Pleurotus ostreatus tales como la
temperatura, pH, aireación, humedad y luz. El rango de temperatura óptima se encuentra
entre 25ºC y 33ºC para crecimiento micelial. El crecimiento máximo del micelio de la
mayoría de especies de Pleurotus ocurre a una humedad relativa entre 60-95%. El pH
adecuado de oscila entre 6,0-7,0. Estas especies requieren oscuridad para el crecimiento
miceliar e iluminación para la fructificación. La concentración de dióxido de carbono es
muy importante para el desarrollo de Pleurotus, además se debe tener una buena
ventilación (Córdoba & Cultid, 2015).
9
Copyright 2018 Carolina González Camacho
1.4. Complejo enzimático lignocelulolítico
El complejo de enzimas lignocelulíticas, producidas por los hongos de pudrición blanca,
se conforma por las enzimas celulolíticas, que degradan la celulosa; las ligninolíticas, que
degradan la lignina y las xilanolíticas que degradan xilanos (hemicelulosa).
1.4.1. Enzimas celulolíticas
El complejo de celulasas se conforma por tres enzimas las cuales son: endo-1,4-b-D-
glucanasa (E.C.3.2.1.4), exo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91) y b-glucosidasa
(EC.3.2.1.21); las cuales trabajan sinérgicamente para degradar la celulosa (Montoya,
2012).
La endo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4) actúa en primer lugar produciendo una
disminución en el grado de polimerización de la celulosa al realizar cortes al azar en la
parte amorfa de la molécula (Montoya, 2012) y en regiones no terminales, produciendo
glucosa, celobiosa y celotriosa (Gupta & Lee, 2008). Gracias a la acción de la endo-1,4-b-
D-glucanasa (E.C.3.2.1.4), se generan sitios para que la exo-1,4-b-D-glucanasa
(E.C.3.2.1.91) actúe en los extremos no reductores, generando cortes secuenciales en la
parte cristalina de la celulosa y de esta forma libera unidades de glucosa y celobiosa y otros
oligosacáridos de cadena corta (Gupta & Lee, 2008). Debido a lo anterior, se puede
destacar que la endo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4) actua en sustratos con baja
cristalinidad tales como celulosa amorfa y carboximetilcelulosa (Montoya, 2012) y la exo-
1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91) actúa en sustratos cristalinos como Avicel y papel de
filtro (Montoya, 2012). Finalmente la b-glucosidasa (E.C.3.2.1.21) emplea como sustrato
10
Copyright 2018 Carolina González Camacho
las celobiosas y oligosacáridos de bajo grado de polimerización resultantes de la acción de
las endo y exo glucanasas, hidrolizando sus enlaces para liberar glucosa, el cual es el
producto final de la acción de las celulasas que sirve como fuente de energía para el hongo
(Gupta & Lee, 2008).
Figura 5. Representación esquemática del complejo celulolítico (de Souza, 2013)
1.4.2. Enzimas ligninolíticas
Como su nombre lo indica, este grupo de enzimas producidas por los hongos de pudrición
blanca se encarga de la biodegradación de la lignina generando tanto la despolimerización
de la molécula como la transformación de las sustancias derivadas para incorporarlas en
las rutas generales del metabolismo. El sistema ligninolítico es poco específico y está
compuesto por peroxidasas y oxidasas; las principales enzimas de este complejo son:
lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa. Sin embargo, no todos los hongos de
11
Copyright 2018 Carolina González Camacho
pudrición blanca contienen el total de enzimas ligninolíticas (Córdoba & Cultid, 2015).
Además de estas enzimas, se ha reportado otro tipo de enzima ligninolítica llamada versátil
peroxidasa, la cual se encuentra dentro del complejo ligninolítico de P. ostreatus. La
versátil peroxidasa es específica para Mn+2 al igual que la manganeso peroxidasa y además
oxida sustratos fenólicos y no fenólicos que son típicos de la lignina peroxidasa (Wong,
2009).
1.4.2.1. Lacasa (E.C.1.10.3.2)
La lacasa es una oxidoreductasa que actúa en difenoles y sustancias afines como donantes
y utiliza oxígeno como aceptor. Esta enzima requiere cobre y oxígeno para realizar la
oxidación de los sustratos mediante la transferencia de un electrón resultando en la
formación de radicales libres. (Córdoba & Cultid, 2015).
La ecuación general del ciclo catalíco de la lacasa es la siguiente:
4𝑅𝐻 + 𝑂& → 4𝑅 + 𝐻&𝑂(1)
RH: Sustrato, donador de electrones
El sitio activo de cada molécula de lacasa tiene cuatro iones cobre, uno tipo 1 (T1), uno
tipo 2 (T2) y dos tipo 3 (T3). Los sitios T2 y T3 están organizados en un único grupo.
(Córdoba & Cultid, 2015)
La siguiente figura esquematiza el ciclo catalítico de la lacasa, el cual consta de cuatro
pasos.
12
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 6. Ciclo catalítico de la lacasa. (Wong, 2009)
Como lo establece (Wong, 2009), el ciclo catalítico de la lacasa se lleva a cabo en los
siguientes pasos:
1. En el primer paso ocurre la reducción del sustrato por el cobre en el sitio T1. Los
electrones tomados del sustrato son transferidos a los sitios T2/T3 resultando en la forma
totalmente reducida de la enzima. Para esto se requiere la oxidación de 4𝑒 tomados de
cuatro moléculas diferentes de sustrato.
2. Ocurre la reducción de O2, en la cual se genera la formación de enlaces con los sitios T2
y T3, generando un intermediario peróxido y la transferencia de electrones desde T3.
13
Copyright 2018 Carolina González Camacho
3. Se produce el rompimiento del enlace O-O por reducción de 2𝑒 que genera una molécula
de agua. Se obtiene un radical oxi intermediario.
4. Finalmente, se oxidan los cuatro iones de cobre y se libera O-2 en forma de una segunda
molécula de agua.
La acción de la lacasa por si sola se restringe a los compuestos fenólicos de la lignina,
debido a que las unidades no fenólicas tienen un potencial redox mayor. Por lo tanto, la
lacasa solo es capaz de romper los enlaces de los compuestos no fenólicos de la lignina con
la acción de un mediador; el cual es una molécula que actúa como un transportador de un
electrón entre la lacasa y el sustrato a ser oxidado. (Munk, Sitarz, Kalyani, Mikkelsen, &
Meyer, 2015)
El mediador más estudiado es el ABTS (ácido 2,2'-azino-bis-(3-etillbenzotiazolin-6-
sulfonico), el cual es capaz de ser oxidado por la lacasa además de oxidar las estructuras
de la lignina. Además, su tamaño reducido le permite ingresar a la pared celular para actuar
en grupos fenólicos y no fenólicos presentes en su interior. El mecanismo de acción del
sistema lacasa-mediador sugiere que inicialmente el oxígeno oxida la enzima, la cual
posteriormente oxida al mediador generando un radical libre y, finalmente, el mediador
oxidado se difunde dentro de la molécula de lignina y la oxida (Córdoba & Cultid, 2015).
1.4.2.2. Manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13)
La manganeso peroxidasa (E.C.1.11.13) es una oxidoreductasa que actua con peróxido de
hidrógeno como primer aceptor de electrones. Es una hemoproteína con fuerte preferencia
por el Mn+2 como sustrato, oxidándolo a Mn+3. El Mn+3 se libera del sitio activo en
presencia de un quelante que lo estabiliza. El ion acomplejado de Mn+3 se difunde en la
14
Copyright 2018 Carolina González Camacho
pared de lignina en donde oxida compuestos fenólicos de la lignina y otros sustratos
orgánicos.
La principal reacción catalizada por la MnP es la oxidació del Mn2+ a Mn3+ por el H2O2
como se muestra a continuación:
2𝑀𝑛&0 + 2𝐻0 + 𝐻&𝑂& → 2𝑀𝑛10 + 2𝐻&𝑂(2)
El ciclo catalítico, según (Wong, 2009) se explica a continuación:
Inicia con la generación del compuesto MnP-I por la acción del peróxido de hidrógeno
𝑀𝑛𝑃 + 𝐻&𝑂& → 𝑀𝑛𝑃3 + 𝐻&𝑂(3)
Posteriormente, se genera la oxidación de Mn2+ por el compuesto MnP-I
𝑀𝑛𝑃3 + 𝑀𝑛&0 → 𝑀𝑛𝑃33 + 𝑀𝑛10(4)
El ciclo termina con una segunda oxidación de Mn2+, lo cual vuelve a generar la enzima
nativa
𝑀𝑛𝑃33 + 𝑀𝑛&0 → 𝑀𝑛𝑃 +𝑀𝑛10 + 𝐻&𝑂(5)
El Mn3+ formado media la oxidación de sustratos orgánicos con el siguiente mecanismo
𝑀𝑛10 + 𝑅𝐻 → 𝑀𝑛&0 + 𝐻0(6)
Sin embargo, el ion Mn3+ es un oxidante con una vida media corta en medios acuosos
(Córdoba & Cultid, 2015), por lo cual es necesario la acción de un quelante para formar un
complejo estable. Oxalato y malonato son óptimos quelantes secretados en grandes
cantidades por los hongos. Otras funciones fisiológicas se han atribuido a estos quelantes
15
Copyright 2018 Carolina González Camacho
incluyendo el mejoramiento de la actividad enzimática por su habilidad de facilitar la
disociación del ion Mn3+ de la enzima. Por otro lado, el complejo Mn3+-quelante, actúa
como un oxidante de sustratos fenólicos, ya que tiene la capacidad de difundirse fácilmente
para producir intermediarios radicales que llevan a ruptura de enlaces y reordenamientos
en la molécula de lignina. Sin embargo, para la oxidación de sustratos no fenólicos, es
necesaria la formación de radicales en presencia de un segundo mediador. En estos casos,
el ion Mn3+ en presencia de tioles, media la oxidación de estructuras como benzil alcoholes
a sus respectivos aldehídos generando radicales tiilo los cuales pueden substraer un
hidrógeno del sustrato y mediante reacciones no enzimáticas generar los productos finales.
(Wong, 2009)
1.4.2.3. Lignina peroxidasa (EC.1.11.1.14)
La lignina peroxidasa (LiP) (E.C.1.11.1.14), al igual que la MnP es una oxidoreductasa que
actúa con peróxido de hidrógeno como primer aceptor de electrones. La reacción catalítica
se da inicialmente con una oxidación del grupo hemo formando un radical catión de Fe en
el sitio activo que posteriormente se reduce. La LiP no puede difundirse en la lignina para
actuar directamente sobre esta debido a su gran tamaño molecular, pero puede usar alcohol
veratrílico como sustrato, oxidándolo para generar un radical libre que puede difundirse en
la lignina para oxidarla (Córdoba & Cultid, 2015). La LiP puede actuar tanto en sustratos
fenólicos como en sustratos no fenólicos los cuales incluyen Azure B y alcohol veratrílico
(Montoya, 2012).
La reacción catalítica global es la siguiente:
16
Copyright 2018 Carolina González Camacho
1,2𝑏𝑖𝑠 3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑓𝑒𝑛𝑖𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑝𝑎𝑛𝑜– 1,3– 𝑑𝑖𝑜𝑙 + 𝐻&𝑂&
3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑏𝑒𝑛𝑧𝑎𝑙𝑑𝑒ℎí𝑑𝑜
+ 1– 3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜– 1,2– 𝑑𝑖𝑜𝑙 + 𝐻&𝑂(7)
Según (Wong, 2009), el ciclo catalítico de la LiP conlleva los pasos explicados a
continuación: Primero, se da la oxidación de 2𝑒 de LiP gracias a la acción de H2O2, lo cual
genera el compuesto LiP-I
𝐿𝑖𝑃 + 𝐻&𝑂& → 𝐿𝑖�3 + 𝐻&𝑂(8)
Seguido, se lleva a cabo una reducción por un sustrato reductor, como el alcohol veratrílico
(VA) lo cual genera el compuesto LiP-II y un radical catiónico.
𝐿𝑖𝑃3 + 𝑉𝐴 → 𝐿𝑖𝑃33 + 𝑉𝐴.0(9)
Finalmente, el ciclo acaba con una segunda reducción mediante la cual la enzima vuelve a
su forma nativa y se genera un segundo radical catiónico.
𝐿𝑖𝑃33 + 𝑉𝐴 → 𝐿𝑖𝑃 + 𝑉𝐴.0(10)
La lignina peroxidasa se asocia en gran medida con el rompimiento de la lignina porque es
capaz de oxidar compuestos aromáticos asociados a la lignina tales como guaiacol, ácido
vainíllico, ácido siríngico, entre otros. Estos compuestos tienen enlaces b-O-4, el cual es el
más abundante en la lignina, representando el 50% de los enlaces en gimnospermas y el
60% en angiospermas. (Wong, 2009)
La LiP, puede oxidar tanto sustratos fenólicos como no fenólicos. La oxidación de sustratos
fenólicos ocurre por la reducción de LiP-I a LiP-II en la cual se crean radicales fenoxi a
17
Copyright 2018 Carolina González Camacho
partir del sustrato, que en presencia de oxígeno pueden reaccionar para generar productos
por el rompimiento de sus enlaces. A diferencia del alcohol veratrílico, los radicales fenoxi
no pueden generar la enzima nativa de la forma en la que se muestra en la ecuación 10, lo
cual puede generar un rápido decaimiento en la actividad enzimática. Sin embargo, se le
ha atribuido al alcohol veratrílico la tarea de cerrar este ciclo catalítico para generar enzima
nativa ya que es un metabolito que se genera en la hifa del hongo al mismo tiempo que la
LiP. Por otro lado, para la oxidación de sustratos no fenólicos, se requiere la formación de
un catión radical por medio de la oxidación de 1𝑒, seguido por el rompimiento de enlaces
y otras reacciones no enzimáticas para generar los productos finales. (Wong, 2009)
La macromolécula de lignina se compone de 10 a 20% de compuestos fenólicos y de 80 a
90% por compuestos no fenólicos, por esta razón los hongos de podredumbre blanca deben
contar con mecanismos con alto potencial de oxidoreducción mediante el cual las unidades
de lignina puedan ser convertidas a compuestos fenólicos para fomentar la oxidación por
la acción de lacasa y MnP. (Montoya, 2012)
1.5 Deslignificación biológica
La deslignificación biológica modera las condiciones de reacción, genera mayor
rendimiento, menos reacciones secundarias y menor demanda energética que la
deslignificación química, sin embargo requiere mucho más tiempo. (Sanchez, Sierra, &
Alméciga, 2011)
La deslignificación tiene un efecto directo en la disponibilidad de los azúcares
fermentables, lo cual aumenta significativamente el rendimiento de la producción de
18
Copyright 2018 Carolina González Camacho
bioetanol. Se ha demostrado que una deslignificación de apenas 8% puede incrementar la
disponibilidad de azúcares en hasta un 20%. (Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011)
La Figura 7 esquematiza la acción del sistema ligninolítico de los hongos, encargado de la
deslignificación biológica. Sobre la lignina actuan las lacasas, lignina peroxidasa y
manganeso peroxidasa, entre otras, generando radicales producto de la despolimerización
de la lignina. Las enzimas MnP y LiP requieren peróxido de hidrógeno para poder realizar
su ciclo catalitico, esta sustancia la encuentran como producto de otras reacciones
catalíticas del complejo enzimático lignocelulítico tales como la oxidación de la glucosa
por la enzima glucosal oxidasa (GOX) y la oxidación de un metabolito llamado glioxal por
la enzima glioxal oxidasa (Glox) (Montoya, 2012). Lo anterior demuestra como las
enzimas celulolíticas y ligninolíticas se complementan para trabajar sinérgicamente en la
degradación de los polímeros de la pared celular de las plantas.
Figura 7. Esquema de la acción del sistema lignocelulolítico. (Montoya, 2012)
19
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Es importante la selección de un microorganismo con baja actividad celulolítica ya que la
hidrólisis de la celulosa se considera como una reacción secundaria indeseable cuando se
realiza un pretratamiento con el objetivo de disponibilizar azúcares para producir bioetanol.
(Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011). La deslignificación biológica se ha combinado con
tratamientos químicos, obteniendo hasta un 80% de deslignificación, lo cual sugiere que la
combinación de ambos métodos es una gran alternativa para aumentar la disponibilización
de azúcares, promoviendo la producción de combustibles amigables con el medio ambiente
(Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011).
20
Copyright 2018 Carolina González Camacho
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
2.1. Preinóculo y cultivo
El preinóculo se preparó colocando 5 mL de medio Sabouraud con dextrosa y extracto de
levadura (SDY) en tubos de ensayo y añadiéndole 15 plugs de P. ostreatus. Posteriormente,
se incubó a 25ºC en la oscuridad durante 5 días.
En un frasco de mermelada previamente esterilizado en autoclave con capacidad de 500
mL se agregaron 26,5g de cascarilla de arroz molida, el contenido del preinóculo y 85 mL
de medio basal. Se cubrió con aluminio y se dejó en la incubadora a 25ºC. Al quinto día de
incubación se añadió una solución 1M de CuSOR.
Se tomaron 2 muestras de extracto enzimático cada semana durante 4 semanas por
triplicado, para un total de 24 cultivos.
Figura 8. Cultivo de P. ostreatus en medio semisólido.
21
Copyright 2018 Carolina González Camacho
2.2. Métodos de cuantificación de azúcares
Se emplearon tres técnicas diferentes para cuantificar azúcares, las cuales son el uso de
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), el método de Trinder empleando un kit de
glucosa y el método de Miller que usa ácido 3,5-dinitrosalicílico, mejor conocido como
DNS.
2.2.1. HPLC
El HPLC cuantifica la concentración de glucosa en los viales que se le introduzcan usando
un detector de Índice de Refracción y una columna HPX-87P. De esta manera se puede
tener la curva de glucosa libre en el medio, lo cual permite estudiar el comportamiento de
Pleurotus ostreatus en los días de cultivo.
2.2.2. Método de Miller o DNS
El método del DNS se basa en la oxidación del ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3,5-
amino-nitrosalicílico en la presencia de un azúcar reductor. Cuando se da esta reacción se
produce una coloración naranja-marrón por lo que se pueden cuantificar los azúcares
reducidos por espectrofotometría (Miller, 1959) ; para esto, se agregan 3mL de DNS a la
solución que se quiere medir y se coloca por 5 minutos en agua en ebullición y
posteriormente se detiene la reacción con un baño de hielo por otros 5 minutos y se mide
la absorbancia a una longitud de onda de 540nm. Para conocer la concentración de azúcares
teniendo la absorbancia se debe hacer una curva de calibración empleando glucosa (Adney
& Baker, 2008).
22
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Á𝑐𝑖𝑑𝑜3,5– 𝑑𝑖𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + 𝐷–𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
→ Á𝑐𝑖𝑑𝑜3,5– 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜– 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜(11)
La ecuación 11 muestra la reacción entre el DNS y una molécula de D-glucosa
2.2.3 Glucosa libre por método de Trinder
El kit de glucosa que emplea el método de Trinder contiene una enzima llamada glucosa
oxidasa (GOD) la cual cataliza la reacción de oxidación de glucosa, que genera peróxido
de hidrógeno. Este peróxido de hidrógeno se detecta mediante un aceptor cromogénico de
oxígeno en presencia de peroxidasa (POD). De esta manera se cuantifica la concentración
de glucosa presente en un medio con la absorbancia a una longitud de onda de 505nm; para
esto se adicionó 1mL de reactivo RT (que viene en el kit) y 10µL de extracto enzimático,
posteriormente se agitó con un vortex y se incubó a 37ºC por 10 minutos y finalmente se
midió la absorbancia. El kit contiene una solución patrón para convertir la absorbancia a
concentración en g/L. (spinreact, s.f.)
Las ecuaciones 12 y 13 muestran las reacciones del método
𝐻&𝑂 + 𝑂& + 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎Z[\
𝐻&𝑂& + Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜(12)
𝐻&𝑂& + 𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙 + 𝐴𝑚𝑝𝑖𝑟𝑜𝑛𝑎^[\
𝑄𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 + 𝐻&𝑂(13)
23
Copyright 2018 Carolina González Camacho
2.3. Evaluación de la actividad enzimática de complejo lignocelulolítico de P.
ostreatus
2.3.1 Actividad de la lacasa (E.C.1.10.3.2)
Se preparó una solución de ABTS 1mM en buffer acetato de sodio con pH 4,5 y se
adicionaron 50 µL de extracto enzimático en 950 µL de solución y se registró el incremento
de la absorbancia por espectrofotometría por 10 minutos tomando la absorbancia cada
minuto a una longitud de onda de 436 nm. La actividad se cuantificó siguiendo la ley de
Beer-Lambert:
𝑈𝐿 =
𝐴𝑉b𝐹c𝑡𝜀𝑉e𝑙
14
Donde,
𝐴𝑡
= Pendienteobtenidaallinealizarlosresultadosdeabsorbanciadurantelos10minutosdereacción
Vw = Volumendelacelda(1mL)
Fz = Factordedilución
ε = Coeficientedeextinciónmolara436nm. 29.3mM��cm��
V� = Volumendelamuestra. 50µL
l = longituddelacelda. 1cm
Se usaron 950 µL de solución con 50 µL de agua destilada como blanco.
24
Copyright 2018 Carolina González Camacho
La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima requerida para
oxidar 1µmol de ABTS en un minuto. (Kyung & Park, 2008)
2.3.2 Actividad de la manganeso peroxidasa (MnP) (E.C.1.11.1.13)
Se utilizó una solución 0,01% de rojo fenol en buffer succinato de sodio 0,2M con pH 4,5
y sulfato de manganeso (0,22 g/L) como sustrato. A una celda de cuarzo para
espectrofotómetro se agregaron 500µL de sustrato con 500µL de extracto enzimático y
10µL de peróxido de hidrógeno como iniciador de la reacción y se incubó por 10 minutos
a 30ºC. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 430nm (Gomaa, 2005). Se hizo
una prueba control en la cual no se agregó sulfato de manganeso al buffer (Vares, Kalsi, &
Hatakka, 1995). El blanco de las pruebas fue 500µL de agua destilada y 500µL de buffer.
Usando la diferencia de absorbancias entre la prueba control y la prueba con MnSO4 se
calculó la actividad con la ley de Beer-Lambert. La unidad de actividad enzimática se
define como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1µmol de rojo fenol en un minuto.
2.3.3 Actividad de la lignina peroxidasa (LiP)(E.C.1.11.1.14)
Se midió la actividad siguiendo la oxidación del alcohol veratrílico. En una celda de cuarzo
se agregaron 200µL de buffer tratrato de sodio 0,25M con pH 3, 40µL de alcohol
veratrílico, 750µL de extracto enzimático y 10µL de peróxido de hidrógeno para un
volumen de reacción de 1mL. El blanco constó de la misma preparación reemplazando el
peróxido de hidrógeno por agua destilada (Córdoba & Cultid, 2015). Se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 310nm durante 4 minutos y se calculó la actividad
25
Copyright 2018 Carolina González Camacho
con la ley de Beer-Lambert. La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad
de enzima requerida para oxidar 1µmol de alcohol veratrílico en un minuto.
2.3.4 Actividad de la exoglucanasa (E.C.3.2.1.91)
Se usaron 500µL de celulosa cristalina Avicel al 1% en buffer citrato de sodio 50 mM con
pH=5,0 en reacción con 500µL de extracto enzimático a 50ºC por 60 minutos. La reacción
se detuvo con la adición de DNS y se empleó esta técnica para determinar la concentración
de azúcares reductores. Una unidad de actividad enzimática (UE) está definida como la
producción de 1µmol de azúcares reductores en un minuto. (Montoya S. , 2008)
Se usó como blanco 3mL de DNS con 1mL de agua destilada. Además, se realizó un control
negativo reemplazando extracto enzimático con agua y con control positivo con enzimas
celulasas de laboratorio.
2.3.5. Rastreo de actividad de la endoglucanasa (E.C.3.2.1.4)
La carboximetilcelulosa (CMC), es el sustrato para la endoglucanasa y por lo tanto puede
ser utilizada para determinar su actividad. Para la determinación cuantitativa de la
endoglucanasa se realizó el mismo protocolo empleado para la evaluación de la
exoglucanasa reemplazando Avicel por CMC. Para el rastreo cualitativo, se cultivó el
hongo en un medio con CMC y posteriormente se agregó una solución con rojo congo el
cual forma un complejo con la CMC, diferenciando las zonas en las cuales esta se encuentra
intacta y degradada. Para esto, se preparó un medio de cultivo con CMC 0,1% P/V, y en
condiciones asépticas se transfirió a cajas de petri y se inoculó, posteriormente se incubó a
25ºC en la oscuridad hasta que el diámetro de la colonia fue de aproximadamente 30mm.
26
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Seguido, se inundaron las cajas de petri con una solución de rojo congo 0,15% P/V y se
dejaron reposar por 15 minutos. Pasados los 15 minutos, se vaciaron las cajas de petri y se
lavaron con agua destilada y luego, se inundaron con la solución desmanchante que consta
de NaCl 1M, por otros 15 minutos. Finalmente, pasados los 15 minutos, se vació el
contenido de las cajas y se observó el halo de decoloración. (Pointing, 1999)
Se realizaron 7 cajas de petri para Pleurotus ostreatus de las cuales 2 pertenecían a
controles negativos para los cuales se omitió la CMC del agar. Además se realizaron
controles positivos utilizando el hongo Ganoderma lucidum..
Con el fin de rastrear la actividad del cultivo semisólido cualitativamente, se realizó un
agar con CMC pero en lugar de inocular con el hongo, se agregaron 50µL de extracto
enzimático en un agujero creado en la mitad de la caja de petri con un pitillo y se dejó
incubar por 24 horas. Posteriormente se realizó el procedimiento de manchado y
desmanchado como se explicó anteriormente. En este procedimiento se evaluaron extractos
enzimáticos tomados en 5 días de cultivo diferentes y por duplicado.
2.4 Medición de lignina y carbohidratos
Se cuantificó la cantidad de lignina y carbohidratos presentes en la cascarilla de arroz antes
y después del pretratamiento, utilizando el protocolo NREL/TP-510-42-618
“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass” (Sluiter, y otros,
2011). Siguiendo este protocolo, se realizó una separación de la lignina, la hemicelulosa y
la celulosa por medio de una hidrólisis ácida. La cuantificación de lignina fue gravimétrica,
y la cuantificación de hemicelulosa y celulosa se realizó en fase acuosa con HPLC.
27
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Para saber la selectividad del hongo para degradar lignina o carbohidratos, se empleó la
siguiente ecuación:
𝑅𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎
%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜(15)
Además se conoció la selectividad del hongo entre carbohidratos con la siguiente ecuación:
𝑅𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝐶 =%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐻𝑒𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 (16)
28
Copyright 2018 Carolina González Camacho
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Comparación de técnicas de cuantificación de azúcares
La Figura 9.a muestra el perfil obtenido para la concentración de azúcares durante 27 días
de cultivo por medio de las tres técnicas estudiadas. Se puede observar que las tres técnicas
difieren en la concentración de azúcar reportada, siendo el método del DNS el que reporta
mayor cantidad de azúcares, seguido de HPLC y finalmente el método de Trinder.
La técnica del DNS tiene varios defectos comprobados, siendo el mayor de estos la pérdida
de una parte de los azúcares reductores que se están analizando; esta complicación puede
ser asociada a reacciones de descomposición del azúcar en la solución alcalina. Si esta
hipótesis es correcta, la reacción del grupo aldehído del azúcar con el reactivo DNS puede
verse como una reacción secundaria en competencia. Además, diferentes azúcares pueden
generar diferente intensidad de color y diferentes concentraciones de los constituyentes del
reactivo DNS también pueden generar diferentes cantidades de coloración, así como
pueden destruir la glucosa presente en el medio (Miller, 1959).
Diferencias entre los resultados de HPLC y el método de Trinder
En la Figura 9.b se pueden observar las discrepancias entre HPLC y el método de Trinder.
En primer lugar, es posible notar que el comportamiento de ambas gráficas es diferente ya
que la gráfica obtenida con el método de Trinder muestra inicialmente una disminución de
la concentración de glucosa en el extracto enzimático, seguido de un aumento leve y
posteriormente otra disminución hasta llegar a una concentración final de glucosa menor
29
Copyright 2018 Carolina González Camacho
que la inicial. Por otro lado, el HPLC muestra un aumento de glucosa hasta el día 15 y
posteriormente un decrecimiento.
Es importante notar que la desviación estándar es muy diferente entre los resultados de los
dos métodos de cuantificación graficados en la Figura 9.b, ya que la desviación obtenida
con el método de Trinder es muy alta, lo cual podría explicar la diferencia en la
cuantificación de glucosa entre los resultados de ambos métodos. Para comprobar
estadísticamente la precisión de los métodos, se realizó un Análisis de Varianza one-way
(ANOVA) usando los métodos de cuantificación como factor y los resultados obtenidos
por estos como respuesta, y se obtuvo un p-value < 0,05, lo cual ratifica que la
concentración es significativamente diferente dependiendo del método empleado. Además,
se compararon las desviaciones estándar de ambos métodos, obteniendo que estas sean
significativamente diferentes. Este resultado se ve reflejado en la gráfica de efectos
principales en la Figura 10.
Para entender el origen de estas diferencias, es necesario estudiar el método de Trinder,
este método propuesto por Trinder en 1969 como un forma para medir glucosa en sangre
usando glucosa oxidasa y un aceptor de oxígeno alternativo a los que se usaban en la época
(Trinder, 1969). Es decir, es un método originalmente creado para un propósito diferente
al que está siendo empleado ya que se estudiaron las posibles interferencias que pudiera
tener con elementos que se encuentran en la sangre tales como hemoglobina, drogas,
anticoagulantes, entre otros. Sin embargo, no se conocen los efectos que pueda tener todos
los metabolitos y demás sustancias presentes en el extracto enzimático trabajado.
30
Copyright 2018 Carolina González Camacho
a. H
PLC
, DN
S y
Mét
odo
de
Tri
nder
b. H
PLC
y M
étod
o de
Tri
nder
c. D
NS
y H
PLC
Figura 9. Comparación de resultados de técnicas de cuantificación de azúares. a. HPLC,
DNS y método de Trinder. b. HPLC y método de Trinder. c. DNS y HPLC.
02468
10121416
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Con
cent
raci
ón (g
/L)
Días
DNS HPLC Trinder
1,86
3,373,91
4,845,68
4,83
2,692,262,26
1,491,91
3,59 3,322,63 2,28
0,94
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Con
cent
raci
ón (g
/L)
Días
HPLC Trinder
2,35
6,468,45 8,51
13,44
8,68
4,473,28
1,863,37 3,91
4,84 5,68 4,832,69 2,26
02468
10121416
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Con
cent
raci
ón (g
/L)
Días
DNS HPLC
31
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 10. Gráfica de efectos principales para la desviación estandar, tienendo en cuenta
los métodos HPLC y Trinder.
El método de Trinder no es recomendable para medir glucosa en un extracto
enzimático
En el estudio llamado “Evaluation of Trinder’s Glucose Oxidase Method for Measuring
Glucose in Serum and Urine”, se evaluaron diferentes posibles fuentes de interferencias
con el método y se encuentra que sustancias tales como ácido ascórbido, ácido gentísico,
glutatión, levadopa y maltosa, generan errores en la concentración de glucosa medida. Sin
embargo, se estudiaron también las posibles interferencias con otros azúcares tales como
xilosa, fructosa y galactosa y no se encontraron interferencias, confirmando la gran
especificidad del método por la glucosa (Lott & Turner, 1975). En el estudio “Evaluation
and Comparison of 10 Glucose Method and the Reference Method Recommended in the
Proposed Product Class Standard”, se evaluaron diez métodos de cuantificación de glucosa
32
Copyright 2018 Carolina González Camacho
incluyendo el método de Trinder y se concluye que este método muestra un error
sistemático inaceptable (Passey, Gillum, Fuller, Urry, & Giles, 1977). Gracias a lo anterior
es posible concluir que se requieren técnicas más precisas si lo que se desea hacer es una
cuantificación enzimática a partir de un extracto enzimático.
Las discrepancias entre los resultados de HPLC y el método del DNS
En la Figura 9.c, se observa que a pesar de que ambos muestran la misma tendencia, la
curva obtenida con DNS muestra una concentración mucho más grande de azúcares, la
discrepancia entre los resultados obtenidos por los métodos HPLC y DNS se encuentran
en un rango que va desde 21% hasta 58% en el día 15 . Generalmente, cuando se
cuantifican hidrolizados por acción enzimática, la suma de las concentraciones de los
azúcares analizados con HPLC es menor a la cantidad de azúcares resultantes de los
ensayos con DNS. Este fenómeno ha sido altamente reportado y se ha demostrado que
depende mucho del sustrato empleado, ya que cuando el sustrato es una fuente purificada
como Sigmacell® la diferencia es poco significativa, pero cuando se emplean sustratos
impuros como bagazo o en este caso, cascarilla de arroz, la diferencia entre ambos métodos
puede superar el 20%. Debido a lo anterior, David Fox, Peter Gray, Noel Dunn y Warwick
Marsden, realizaron un estudio para conocer si la diferencia entre los resultados obtenidos
con HPLC y DNS se debía a la presencia de oligómeros o a efectos del reactivo DNS, como
reacciones secundarias. Realizaron pruebas en sustratos puros y naturales y la diferencia
fue importante ya que en los sustratos naturales se encontraban las diferencias más
marcadas. Posteriormente, realizaron una hidrólisis ácida para volver a cuantificar los
azúcares con HPLC y encontraron que después de la hidrólisis ácida los azúcares
cuantificados con HPLC y con DNS eran practicamente iguales lo cual les llevó a concluir
33
Copyright 2018 Carolina González Camacho
que la diferencia entre ambos métodos se debe a la presencia de oligosacáridos que no son
cuantificables en HPLC (Fox, Gray, Dunn, & Marsden, 1984). Por lo tanto, se podrían
atribuir las diferencias encontradas en la Figura 9.c a la presencia de azúcares de cadena
mediana que no son cuantificables por HPLC pero si con el método de Miller. Gracias a
esto, el método de DNS se considera una buena opción para cuantificar azúcares
provenientes de la hidrolización enzimática y el HPLC también puede ser empleado para
este fin pero es necesario una hidrólisis química previa a la cuantificación final.
Análisis estadístico
En general, es posible observar que las curvas de la Figura 9 comienzan en una baja
concentración de azúcares y con el tiempo esta concentración tiende a aumentar hasta
alcanzar un pico y posteriormente vuelve a disminuir hacia los últimos días de cultivo. En
la Figura 11.a, se observa la curva de DNS obtenida en Minitab; tras realizar un ANOVA
y una prueba de Tukey con una confianza del 95%, fue posible concluir que la
concentración de azúcares en los puntos señalados en amarillo es significativamente
diferente a la concentración del día 15 y a las demás concentraciones de los primeros y
últimos días de cultivo. Igualmente, se aplicaron las mismas pruebas estadísticas a los
resultados reportados por HPLC y se obtuvo la Figura 11.b, en la cual se resaltan en rojo
los puntos significativamente diferentes. Gracias a lo anterior, se puede observar que
inicialmente el hongo está liberando glucosa en grandes cantidades hasta el día 15
aproximadamente. La Figura 11.c, es la curva obtenida en Minitab para el método de
Trinder; debido a la alta desviación estandar agrupada que se tiene en este método se
concluye que ningún día es significativamente diferente de otro durante todo el tiempo de
cultivo.
34
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 11. Gráficas de intervalos obtenidas en Minitab, se resaltan los datos
significativamente diferentes tras pruebas de Tukey. a. DNS. b. HPLC. c. Kit de glucosa
(método de Trinder).
3.2 Medición de actividad enzimática
3.2.1 Lignina Peroxidasa
35
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 12. Absorbancia obtenida en el ensayo para cuantificación enzimática de la
lignina peroxidasa
Se cuantificó la actividad de la enzima LiP en el extracto enzimático proveniente del cultivo
semisólido siguiendo la oxidación de alcohol veratrílico que se observa mediante un
incremento en la absorbancia en el tiempo. En la Figura 12 se presenta el resultado obtenido
para la absorbancia en el tiempo durante los ensayos realizados en ocho muestras de
extracto enzimático diferentes. Debido a que no se encontró cambios en la absorbancia, se
concluye que no hay actividad.
Existen estudios como los realizados por (Fernández & Henao, 2007) y (Moreno & Ospina,
2008) en los cuales se encontró una pequeña actividad de LiP. Sin embargo, también hay
estudios en donde intentaron cuantificar la actividad de la LiP de Pleurotus ostreatus sin
éxito, concluyendo que Pleurotus ostreatus no es un hongo productor de esta enzima. En
el estudio titulado “Evaluación de actividades endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y
lignina peroxidasa en diez hongos de pudrición blanca” (Montoya, Sanchez, & Levin,
Evaluacion de actividades endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 1 2 3 4 5
Abs
orba
ncia
Tiempo (min)
1,1
1,2
1,3
5,1
5,2
5,3
8,1
8,2
36
Copyright 2018 Carolina González Camacho
diez hongos de pudrición blanca, 2012), Pleurotus ostreatus no decoloró el sustrato Azure
B comprobando cualitativamente la ausencia de actividad de LiP. También en el estudio
titulado “Estudio comparativo de la lacasa, LiP y MnP de Pleurotus ostreatus” (Córdoba
& Cultid, 2015), se realizó la prueba del alcohol veratrílico para LiP sin encontrar cambios
en la absorbancia del volumen de reacción. Los resultados obtenidos comprueban los
trabajos mencionados anteriormente, además del estudio realizado por (Fernandez-Fueyo,
y otros, 2016), en el cual se analizó el secretoma de Pleurotus ostreatus identificando
lacasas, MnP y Versatil peroxidasa pero no lignina peroxidasa.
3.2.2 Lacasa
En la Figura 13, se observa la curva de actividad de la lacasa, en la cual se evidencia un
periodo inicial de baja actividad enzimática que llega hasta el día 12, seguido de un rápido
incremento de la actividad a partir del día 15 que parece estabilizarse hasta el último día de
cultivo. El día de actividad máxima se encontró el día 23 con una actividad de 14170,65
U/L.
Se realizó un ANOVA y una prueba de Tukey con la cual se concluye con una confianza
del 95% que la actividad enzimática registrada a partir del día 15 es significativamente
diferente de la actividad registrada en los primeros días de cultivo. Sin embargo, en otros
trabajos, como el realizado por Cordoba y Cultid, se ha encontrado que la actividad de la
lacasa va en aumento hasta encontrar un pico en el día 14 y posteriormente disminuye
significativamente (Córdoba & Cultid, 2015).
37
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 13. Actividad enzimática de la lacasa
3.2.3 Manganeso Peroxidasa
La actividad de la manganeso peroxidasa solo pudo ser cuantificada en cinco días
diferentes. En la Figura 14 se tiene la curva de actividad enzimática encontrada para esta
enzima. El máximo valor encontrado fue de 868,11 U/L en el día 15 de cultivo. Debido a
que se tienen muy pocos puntos analizados, es difícil concluir sobre el comportamiento de
esta enzima. En la medición de actividad enzimática realizada por Córdoba y Cultid usando
como sustrato dimetoxifenol (DMP), tampoco se logró establecer un patrón para la
actividad de esta enzima, sin embargo, la mayor actividad encontrada fue de 80 U/L
(Córdoba & Cultid, 2015), lo cual representa una actividad 10 veces menor a la encontrada
en el presente estudio. Estadísticamente, la actividad enzimática obtenida entre los días 12
y 15 es significativamente diferente del resto de días, con una confianza del 95%.
363,14 440,961391,35
2705,35
13351,54
12443,69
14170,65
12843,00
02000400060008000
100001200014000160001800020000
2 5 8 12 15 19 23 27
Act
ivid
ad U
/L
Días
38
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 14. Actividad enzimática de la manganeso peroxidasa.
Es evidente que la mayor actividad ligninolítica se debe a las lacasas. Esto puede deberse
a que los iones de Mn y Cu inducen la actividad de MnP y lacasa (Janusz, Kucharzyk,
Pawlik, Staszczak, & Paszczynski, 2012) y en el medio basal se agrega cobre para
incentivar la actividad de la lacasa, pero no se agregan iones Mn para incentivar la MnP.
La adición de Mn2+ es estrictamente requerida para la estimulación de la producción de
MnP en Pleurotus ostreatus. Además, el ion Mn2+ juega un papel importante como un
factor post-transcripcional esencial para la producción y secreción de MnP activa en el
líquido extracelular (Janusz, Kucharzyk, Pawlik, Staszczak, & Paszczynski, 2012).
Adicionalmente, es necesario controlar la cantidad de peróxido de hidrógeno en el medio,
ya que todas las hemoproteínas incluyendo MnP pueden inactivarse en presencia de una
concentración catalítica de peróxido de hidrógeno, este fenómeno se conoce como
inactivación suicida (Valderrama, Ayala, & Vazquez-Duhalt, 2002).
Factores ambientales y pH son piezas clave para la actividad enzimática
430,27
841,62868,11
407,03
102,70
0
200
400
600
800
1000
1200
2 12 15 23 27
Act
ivid
ad (U
/L)
Días
39
Copyright 2018 Carolina González Camacho
La regulación de los genes que codifican para la producción de lacasas y peroxidasas
involucra factores ambientales, tales como la concentración de carbono y nitrógeno,
presencia de iones metálicos, temperatura y pH. Se ha determinado que la composición del
medio y las condiciones de cultivo afectan fuertemente los patrones de expresión de
isoenzimas en hongos de podredumbre blanca (Janusz, Kucharzyk, Pawlik, Staszczak, &
Paszczynski, 2012). El pH es un factor sumamente importante para una enzima por dos
factores principalmente: i) El estado de protonación de los grupos funcionales de los
aminoácidos y cofactores envueltos en la reacción catalítica y ii) La estructura
tridimensional nativa de las enzimas (Bisswanger, 2014). En el artículo llamado
“Ligninolytic peroxidase gene expression by Pleurotus ostreatus: Differential regulation
in lignocellulose medium and effect of temperatura and pH” (Fernandez-Fueyo, y otros,
2014) se estudia el efecto del pH y la temperatura en la expresión de genes en Pleurotus
ostreatus, encontrando que los cambios de pH generan modificaciones más extremas que
los cambios de temperatura. Además, se encuentra que la expresión de las diferentes
isoenzimas de MnP y VP fue afectada por diferentes temperaturas y pH en los cultivos,
siendo VP la enzima más afectada. En la tesis titulada “Evaluación de enzimas
degradadoras de lignina producidas por aislamientos fúngicos de cultivos de arroz”
(Muñoz, 2012), se evaluó la estabilidad de las enzimas ligninolíticas de Pleurotus ostreatus
lacasa y MnP en diferentes pH. La lacasa resulta estable en un pH de 5 y se mantiene estable
en pH alcalino, pero cuando es sometida a pH ácido su actividad se ve reducida
drásticamente. Por otro lado, la MnP es estable a una temperatura de 30ºC y un pH de 6
pero cuando se tiene un pH menor a 5 la actividad enzimática decrece rápidamente.
40
Copyright 2018 Carolina González Camacho
En la Figura 15 se presenta la curva de pH del extracto enzimático en el tiempo de cultivo.
Inicialmente el pH es de 4,5 y rápidamente va aumentando con el paso de los días hasta
llegar a 6,14 en el último día de cultivo. Es importante notar el gran salto en el pH entre el
día 0 y el día 2, es probable que el mismo hongo esté ajustando el pH del medio ya que el
rango de pH adecuado para el crecimiento micelial de Pleurotus ostreatus está entre 6,0 y
7,0 (Córdoba & Cultid, 2015) y como se mencionó anteriormente, los cambios en el pH
son factores sumamente importantes en la actividad enzimática y podría explicar el
comportamiento reportado en el presente estudio.
Figura 15. Curva de pH del extracto enzimático.
3.2.4. Exo-1,4-b-D-glucanasa
En la Figura 16, se muestra la curva de actividad enzimática de la exoglucanasa. Se puede
observar que desde el segundo día de cultivo se presenta una gran actividad de
exoglucanasa de 1251,20 U/L, la cual baja y sube sin un patrón definido, siendo la mínima
4,5
5,15
5,675,78
5,97 5,946,07 6,02
6,14
4,50
4,70
4,90
5,10
5,30
5,50
5,70
5,90
6,10
6,30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
pH
Días
41
Copyright 2018 Carolina González Camacho
actividad reportada la encontrada en el día 19 con 767,15 U/L y la máxima reportada la
encontrada en el día 23 con 1305,47 U/L. El día 23 también resultó ser el día de mayor
actividad de la lacasa.
No hay diferencias significativas entre los días de cultivo
Se realizó un ANOVA con significancia del 5%, con el fin de conocer si existen diferencias
entre las mediciones realizadas para la actividad enzimática en los diferentes días de cultivo
y se encontró que para esta prueba no hay diferencias.
Los resultados obtenidos en este ensayo fueron diferentes a los obtenidos en otros estudios
realizados, en los cuales la actividad enzimática va aumentando progresivamente hasta
alcanzar un máximo en la segunda semana de cultivo y finalmente decrece dramáticamente.
En el estudio titulado “Production of cellulase by Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-
caju in solid state fermentation of lignocellulosic biomass” (Khalil, Hoque, Basunia, Alam,
& Khan, 2010) se cuantificó la actividad enzimática de enzimas celulolíticas producidas
sobre diferentes sustratos lignocelulósicos en un periodo de 14 días y el comportamiento
encontrado para todas las pruebas fue el mismo: crecimiento progresivo hasta el día 10,
seguido de un rápido decrecimiento en la actividad enzimática que alcanza valores cercanos
a 0 en el día 14. Sin embargo, es importante mencionar que el cultivo realizado es diferente.
Por otro lado, en la cuantificación de exoglucanasa realizada por Montoya, en el trabajo
llamado “ Selección de la mejor combinación hongo-formulación para la degradación de
sustratos lignocelulósicos mediante fermentación en estado sólido con Pleurotus ostreatus,
Coriolus versicolor y Lentinus edodes” (Montoya, Sanchez, & Levin, 2012) se encuentra
42
Copyright 2018 Carolina González Camacho
que, al igual que en el presente trabajo, la actividad se mantiene constante durante los días
de cultivo.
Figura 16. Actividad enzimática de la exoglucanasa.
3.2.5 Endo-1,4-b-D-glucanasa
No se encontró actividad en la prueba cuantitativa realizada sobre el extracto enzimático.
Por lo tanto, se rastreo actividad cuantitavamente con el método del rojo congo y
unicamente se encontró actividad (decoloración) en una de las diez muestras analizadas, la
cual pertenece al día 27. Este resultado se muestra en la Figura 17. Debido a lo anterior, se
puede concluir que probablemente la actividad de endoglucanasa en el cultivo es muy baja
y por lo tanto no pudo ser cuantificada ni rastreada en todos los días de cultivo.
1251,201138,25
857,36
1185,92
1054,64
767,15
1305,47
1194,73
0200400600800
10001200140016001800
2 5 8 12 15 19 23 27
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a (U
/L)
Días
43
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura 17. Resultado de la decoloración del rojo congo por el extracto enzimático del día
27.
Finalmente, se realizó un rastreo cualitativo de endoglucanasa en un cultivo diferente; esta
prueba de rojo congo se realizó al quinto día de cultivo y sus resultados se encuentran en
la Figura 18. La Figura 18.a muestra el resultado obtenido para Pleurotus ostreatus, se
observa un halo de decoloración que indica la presencia de carboximetilcelulosa degradada
por la presencia de endoglucanasa. En la Figura 18.c, se observa el control positivo
realizado con Ganoderma lucidum, en la cual también se observa un halo amarillo intenso
aunque cubre una menor área que el halo de la Figura 18.a. Finalmente en las Figuras 18.b
y 18.d se observa que no hubo ningún tipo de decoloración en los controles, lo cual
confirma la veracidad del método empleado. En el estudio “Evaluación de Actividades
Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en Diez Hongos de Pudrición
Blanca” (Montoya, Sanchez, & Levin, 2012), se realizó esta misma prueba en Pleurotus
ostreatus en donde también se observó la decoloración del rojo congo con un diámetro de
31mm.
44
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Prueba Control negativo Pl
euro
tus o
stre
atus
a.
b.
Gan
oder
ma
luci
dum
(con
trol
pos
itivo
)
c.
d.
Figura 18. Resultados de la prueba de decoloración del rojo congo. a. Prueba con P.
ostreatus. b. Control negativo con P. ostreatus. c. Prueba con Ganoderma lucidum d.
Control negativo con Ganoderma lucidum.
45
Copyright 2018 Carolina González Camacho
3.3 Medición de lignina y carbohidratos
En la Tabla 1 se encuentran los resultados para la deslignificación, la pérdida de
carbohidratos y la pérdida de masa de cascarilla de arroz, debido al pretratamiento
realizado. La deslignificación obtenida se encuentra dentro del rango esperado según
trabajos anteriores como el de (Becerra, 2017) en el cual se obtuvo una deslignificación de
14,89%. Además, en el estudio titulado “Delignification of wheat straw by Pleurotus spp.
under mushroom-growing conditions” se evaluó la deslignificación de paja de trigo usando
Pleurotus sajor-caju, Pleurotus sapidus, Pleurotus cornucopiae y Pleurotus ostreatus,
obteniendo una pérdida de peso seco total de 18% y una deslignificación promedio de 11%,
siendo P. ostreatus el hongo con mayor tasa de deslignificación con 13% y una pérdida de
celulosa y hemicelulosa promedio de 20% y 50% respectivamente (Tsang, Reid, &
Coxworth, 1987). Gracias a lo anterior se concluye que el pretratamiento realizado se
encuentra dentro del rango normal reportado en la bibliografía y por lo tanto fue un
pretratamiento exitoso ya que, como lo reportan (Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011), una
reducción de 8% en la lignina puede liberar hasta el 20% de los azúcares.
Tabla 1. Porcentajes perdidos después del pretratamiento
Porcentaje
perdido
Lignina 11,18%
Celulosa 28,35%
Hemicelulosa 32,78%
Masa total 16,65%
46
Copyright 2018 Carolina González Camacho
La deslignificación obtenida se atribuye principalmente a la lacasa que presentó una gran
actividad y oxidó compuestos fenólicos de la lignina, asimismo, la pérdida de celulosa se
atribuye a la acción de celulasas como la exoglucanasa que se mantuvo constante durante
todo el tiempo de cultivo y además se ve reflejada en el perfíl de azúcares reductores
previamente mostrado en la Figura 9.
Por otro lado, es importante analizar la selectividad de P. ostreatus en la degradación de
lignina y carbohidratos. Estas relaciones se encuentran en la Tabla 2, y muestran que la
cantidad de lignina degradada representa solo un 39% de la cantidad de celulosa degradada
y un 34% de la hemicelulosa degradada. Además, Pleurotus ostreatus degrada la
hemicelulosa 1,16 veces más que la celulosa, por lo cual se concluye este hongo presenta
una selectividad que prioriza la hemicelulosa como fuente de energía sobre la celulosa.
Estos resultados son importantes ya que cuando se realiza un pretratamiento de
deslignificación con el objetivo de utilizar los azúcares para la producción de etanol, perder
azúcares se considera una reacción secundaria que afecta directamente el rendmiento del
proceso de producción de etanol.
Tabla 2. Relaciones de selectividad
Relación
Lignina/celulosa 0,39
Lignina/hemicelulosa 0,34
Hemicelulosa/celulosa 1,16
47
Copyright 2018 Carolina González Camacho
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES
En primer lugar, se concluye que se puede observar un perfil adecuado de azúcares
provenientes de hidrólisis enzimática por medio del uso de HPLC y de la técnica de DNS.
Además, el método de Trinder es útil para comprobar cualitativamente la presencia de
glucosa y se tiene amplio conocimiento de su desempeño para la cuantificación de glucosa
en sangre, sin embargo, no se recomienda el uso en la cuantificación de azúcares en extracto
enzimático porque se desconocen las posibles interacciones con los metabolitos presentes
además de arrojar una desviación estándar muy alta que hace poco viable el análisis del
perfil obtenido por este método.
La discrepancia de los resultados obtenidos por HPLC y DNS fue de más de 20% y según
la bibliografía encontrada puede ser explicada por la cantidad de oligosacáridos presentes
en el extracto enzimático que no son cuantificables por HPLC. Adicionalmente, se
concluye que el método del DNS es útil para la cuantificación de azúcares provenientes de
hidrólisis y se recomienda por su rapidez y su precisión aceptable, además de no requerir
equipos muy avanzados para ejecutarlo.
Se obtuvo el perfil de actividad enzimática de la lacasa con una actividad máxima de
14170,65 U/L, la cual es más de 15 veces la actividad máxima de MnP encontrada, que fue
de 868.11 U/L. Por lo tanto, la deslignificación encontrada puede ser atribuida
principalmente a la acción de lacasas. Asimismo, se comprobó la ausencia de actividad de
LiP en Pleurotus ostreatus, lo cual tiene explicación en la ausencia de genes que codifican
para su producción.
48
Copyright 2018 Carolina González Camacho
La actividad enzimática de la exoglucanasa se encontró casi constante en el tiempo, con
una actividad máxima registrada de 1305,47 U/L y una actividad mínima de 767,15 U/L.
No fue posible cuantificar la endoglucansa en el cultivo lo cual indica que la cantidad de
enzima producida podría ser muy pequeña, sin embargo se logró hacer el rastreo cualitativo
de esta enzima usando Pleurotus ostreatus en un medio con CMC como fuente de carbono.
Para terminar, el pretratamiento biológico realizado alcanzó una deslignificación de
11,18% y una pérdida de celulosa y hemicelulosa de 28,35% y 32,78%. El pretratamiento
fue exitoso, ya que alcanzó niveles esperados de deslignificación.
49
Copyright 2018 Carolina González Camacho
CAPÍTULO V
TRABAJO FUTURO
En primer lugar, se recomienda cambiar el pH del cultivo ya que el pH adecuado para el
óptimo crecimiento micelial de P. ostreatus se encuentra en el rango entre 6 y 7 y como se
observó en la Figura 15, el medio sufre un reajuste de pH drástico durante los días de
cultivo lo que puede deberse a una acción de defensa del hongo y podría provocar un
consumo de energía innecesario del mismo. Además, un cambio del pH del cultivo podría
mejorar los niveles de actividad enzimática registrados ya que cuidaría a las enzimas
ligninolíticas de su inactivación. Por otro lado, es recomendable adicionar iones Mn+2 al
cultivo así como se adicionan iones de cobre, ya que esto estimularía la producción de MnP
lo cual podría conllevar un mayor grado de deslignificación. Adicionalmente se
recomienda incentivar y cuantificar la versátil peroxidasa, ya que se ha comprobado que
Pleurotus ostreatus tiene los genes que codifican para tres isoenzimas de versátil
peroxidasa (Fernandez-Fueyo, y otros, 2014), la cual es un tipo de enzima importante ya
que es un híbrido entre la MnP y la LiP (ausente en P. ostreatus) y por lo tanto puede oxidar
compuestos fenólicos y no fenólicos de la lignina sin la necesidad de un mediador (Wong,
2009), convirtiéndola en un factor clave para la deslignificación. Asimismo, se recomienda
realizar la cuantificación de la enzima celulolítica b-glucosidasa, ya que esta enzima es la
encargada de hidrolizar la celobiosa para obtener glucosa, por lo tanto, es esencial tener en
cuenta su actividad enzimática como parte fundamental de la hidrólisis enzimática de la
celulosa.
50
Copyright 2018 Carolina González Camacho
REFERENCIAS
Adney, B., & Baker, J. (2008). Measurement of Cellulase Activities. Technical Report NR/TP-510-
42628, National Renewable Energy Laboratory.
Becerra, N. (2017). Influencia de las condiciones de operación y del consorcio bacteriano en el
rendimiento de las fermentaciones anaeróbicas tipo mixalco(R). Universidad de los Andes,
Departamento de Ingeniería Química, Bogotá.
Bisswanger, H. (2014). Enzyme assays. Perspectives in Science, 41-55.
Córdoba, R., & Cultid, G. (2015). ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LACASA (Lac), LIGNINA PEROXIDASA (LiP) Y MANGANESO PEROXIDASA (MnP)
DE “Pleurotus ostreatus” CULTIVADO EN RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DE
RAQUIS DE PALMA DE ACEITE, BAGAZO DE FIQUE Y PULPA DE CAFÉ.
Universidad de Nariño, Facultad de ciencias exactas y naturales.
Chen, H. (2014). Biotechnology of Lignocellulose: Theory and Practice. Chapter 2: Chemical
Composition and Structure of Natural Lignocellulose. Beijing.
de Souza, W. (2013). Microbial Degradation of Lignocellulosic Biomas.
Fernandez-Fueyo, E., Castanera, R., Ruiz-Dueñas, F., López-Lucendo, M., Ramirez, L., Pisabarro,
A., & Martínez, A. (2014). Ligninolytic peroxidase gene expression by Pleurotus ostreatus:
Differential regulation in lignocellulose medium and effect of temperature and pH. Fungal
Genetics and Biology.
Fernandez-Fueyo, E., Ruiz-Dueñas, F., López-Lucendo, M., Pérez-Boada, M., Rencoret, J.,
Gutierrez, A., . . . Martinez, A. (2016). A secretomic view of woody and nonwoody
lignocellulose degradation by Pleurotus ostreatus. Biotechnology for Biofuels.
Fernández, L., & Henao, L. (2007). Evaluación de tres hongos basidiomicetos inmovilizados en
luffa cylindrica y fotocatálisis con TiO2 para la remocion del negro reactivo 5. Pontificia
Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias.
Fox, D., Gray, P., Dunn, N., & Marsden, W. (1984). An Explanation of the Discrepancy between
the Results of h.p.l.c and DNS Assays in the Analysis of Lignocellulosic Hydrolysates. J.
Chem. Tech. Biotechnol., 171-175.
Furkan, I., & Remzi, B. (s.f.). Lignocellulosic Biomass: A sustainable Platform for Production of
Bio-Based Chemical and Polymers. University of London. Bogazici University.
51
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Gaitan, D., & Perez, L. (2007). Aislamiento y evaluación de microorganismos celulolíticos de
residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de crisantemo. Pontificia
Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias.
Ghorbani, F., Karimi, M., Biria, D., Kariminia, H., & Jeihanipour, A. (2015). Enhancement of
fungal delignification of rice straw by Trichoderma viride sp. to improve its
saccharification.
Gomaa, O. (2005). Improving Phenol Red Decolourization Using Laccase-Mediator System.
International Journal of Agriculture & Biology.
Gupta, R., & Lee, Y. (2008). Mechanism of Cellulase Reaction on Pure Cellulosic Substrates.
Biotechnology and Bioengineering, 102(06), 1570-1581.
Janusz, G., Kucharzyk, K., Pawlik, A., Staszczak, M., & Paszczynski, A. (2012). Fungal laccase,
manganese peroxidase and lignin peroxidase: Gene expression and regulation. Enzyme and
Microbial Technology.
Khalil, I., Hoque, M., Basunia, M., Alam, N., & Khan, A. (2010). Production of cellulase by
Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju in solid state fermentation of lignocellulosic
biomass. TUBITAK.
Kyung, M., & Park, S. (2008). Purification and Characterization of laccase from Basidiomicete
Fomitella fraxinea. Journal of Microbiology Biotechnology, 670-675.
Lott, J., & Turner, K. (1975). Evaluation of Trinder's Glucose Oxidase Method for Measuring
Glucose in Serum and Urine. Clin. Chem.
Martinez, Y. (2014). SELECCIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS CON POTENCIAL PARA LA
DEGRADACIÓN DE LIGNOCELULOSA AISLADOS DE DESECHOS
AGROINDUSTRIALES DE CAFÉ E HIGUERILLA. Tesis de pregrado, Universidad de
Manizalez, Facultad de Ciencias, Manizales.
Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicycle Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry.
Mohanram, S., Rajan, K., & Carrier, D. (2015). Insights into biological delignification of rice straw
by Trametes hirsuta and Myrothecium roridum and comparison of saccharificacion yields
with dilute acid pretreatment.
Montoya, S. (2008). Actividad enzimática, degradación de residuos sólidos orgánicos y generación
de biomasa útil de macromiceto grifola frondosa. Universidad Nacional de Colombia. Sede
52
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Manizales.
Montoya, S. (2012). Obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de residuos
lignocelulósicos del departamento de caldas empleando macromicetos de pudrición blanca
por fermentación sumergica y fermentación en estado sólido. Universidad de Caldas,
Facultad de Ciencas Agropecuarias.
Montoya, S., Sanchez, O., & Levin, L. (2012). Evaluacion de actividades endoglucanasa,
exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en diez hongos de pudrición blanca.
Universidad de Caldas; Universidad de Buenos Aires.
Montoya, S., Sanchez, O., & Levin, L. (2012). Selección de la mejor combinación hongo-
formulación para la degradación de sustratos lignocelulósicos mediante fermentación en
estado sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes. Universidad
de Caldas, Universidad de Buenos Aires.
Moreno, N., & Ospina, X. (2008). Evaluación de inductores metálicos y co-sustratos para la
remoción de negro reactivo 5 empleando Pleurotus ostreatus inmovilizado en fique.
Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias.
Munk, L., Sitarz, A., Kalyani, D., Mikkelsen, J., & Meyer, A. (2015). Can laccases catalyze bond
cleavage in lignin? Biotechnology Advances.
Muñoz, L. (2012). Evaluación de enzimas degradadoras de lignina producidas por aislamientos
fúngicos de cultivos de arroz. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de ciencias.
Passey, R., Gillum, R., Fuller, J., Urry, F., & Giles, M. (1977). Evaluation and Comparison of 10
Glucose Methods and the Reference Method Recommended in Proposed Product Class
Standard. Clinical Chemistry, 23(1), 131-139.
Pointing, S. (1999). Qualitative methods for the determination of lignocellulolytic enzyme
production by tropical fungi. Fungal Diversity.
Prinsen, P. (2010). Composición química de diversos materiales lignocelulósicos de interés
industrial y análisis estructural de sus ligninas. Universidad de Sevilla.
R, S., Shukla, A., Tiwari, S., & Srivastava, M. (2014). A review on delignification of lignocellulosic
biomass for enhancement of ethanol production potential. New Delhi.
Sanchez, O., Sierra, R., & Alméciga, C. (2011). Delignification Process of Agro-industrial Wastes
an Alternative to Obtain Fermentable Carbohydrates for Producing Fuel. Alternative Fuel.
53
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Sindhu, R., Binod, P., & Pandey, A. (2016). Biological pretreatment of lignocellulosic biomass-
An overview. Bioresource Technology.
Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., & Crocker, D. (2011).
Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Technical Report
NREL/TP-510-42618, National Renewable Energy Laboratory.
spinreact. (s.f.). Recuperado el mayo de 2018, de spinreact:
http://www.spinreact.com/es/productos/bioquimica_clinica.html
Trinder, P. (1969). Determination of Glucose in Blood using Glucose Oxidase with an alternative
oxygen acceptor. Ann. clin. Biochem.
Tsang, L., Reid, I., & Coxworth, E. (Junio de 1987). Delignification of Wheat Straw by Pleurotus
spp. under Mushroom-Growing Conditions. Applied and Environmental Microbiology,
53(6), 1304-1306.
Valderrama, B., Ayala, M., & Vazquez-Duhalt, R. (2002). Suicide Inactivation of Peroxidases and
the Challenge of Engineering More Robust Enzymes. Chemistry & Biology.
Vares, T., Kalsi, M., & Hatakka, A. (1995). Lignin Peroxidases, Manganese Peroxidases, and Other
Ligninilytic Enzymes Produced by Phlebia radiata during Solid-State Fermentation of
Wheat Straw. Applied and Environmental Microbiology, 3515-3520.
Wong, D. (2009). Structure and Action Mechanism of Ligninolytic Enzymes. Appl Biochem
Biotechnol, 174-209.
54
Copyright 2018 Carolina González Camacho
ANEXOS
Anexo 1: Preparación de medios de cultivo
Tabla A.1.1. Preparación de medio SDY
Reactivo Cantidad Glucosa 20g Peptona 5g Levadura 5g Agua destilada 500 mL
Tabla A.1.2. Preparación de medio basal
Reactivo Cantidad Glucosa 0.5g KH2PO4 2g MgSO4 0.25g (NH4)SO4 0.9g CaCl2 0.1g Kcl 0.5g Agua destilada 1000mL Tiamina 0.5g Ácido cítrico 2.1g Citrato de sodio dihidratado 2.94g Hcl 100mL NaOH 0.08g
55
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 2: Curva de calibración de DNS
Figura A.2 Curva de calibración usando glucosa.
y = 0,6307x - 0,0169R² = 0,99541
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Abs
orba
ncia
Concentración (g/L)
Curva calibración reactivo DNS
56
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 3: Preparación de reactivo DNS
Tabla A.3. Insumos para la preparación del reactivo DNS
Reactivo Cantidad NaOH 6.6g DNS 3.5g Tartrato de sodio y potasio 100g Agua destilada 500 mL
Se deben disolver los reactivos en agua destilada en caliente y con agitación magnética. Se debe guardar en oscuridad en un frasco ambar y en frío.
57
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 4: Instrucciones del kit de glucosa
Figura A.4 Reactivos, preparación y procedimiento del kit de glucosa.
58
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 5: Preparación de soluciones para el método del rojo congo
Preparación del agar
Tabla A.5. Insumos para la preparación del agar
Reactivo Cantidad Agar bacteriológico 3.2g Peptona 1g Extracto de levadura 1g Carboximetilcelulosa 0.2g
Para el control se realiza la misma solución omitiendo la carboximetilcelulosa.
Preparación de la solución de rojo congo
Se pesan 0.45g de rojo congo en polvo y se adicionan a 300 mL de agua destilada. Se agita para diluir bien.
Preparación de la solución desmanchante
Se pesan 17.52g de NaCl y se adicionan a 300 mL de agua destilada. Se agita para diluir bien.
59
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 6: Preparación de soluciones buffer para ensayos de cuantificación enzimática
Buffer citrato de sodio 50mM pH=5
En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido cítrico 0.1M y citrato de sodio 0.1M.
1. Se pesan 9.6g de ácido cítrico y se adiciona a 500mL de agua destilada.
2. Se pesan 12.9g de citrato de sodio y se adiciona a otros 500mL de agua destilada.
3. Se toman 115mL de solución de ácido cítrico y 135mL de solución de citrato de sodio y se mezclan.
4. A la mezcla obtenida en el paso anterior se adicionan 250mL de agua destilada.
5. En este punto se tienen 500mL de buffer citrato de sodio 100mM pH=5, para disminuir la concentración se agregan 500mL de agua destilada para obtener 1L de buffer citrato de sodio 50mM pH=5.
Buffer acetato de sodio 100mM pH=4.5
En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido acético 0.2M y acetato de sodio 0.2M.
1. Se disuelven 11.55mL de ácido acético en agua destilada completando 1L
2. Se disuelven 27.2g de acetato de sodio en agua destilada completando 1L
3. Se toman 305mL de la solución de ácido acético y se mezclan con 195mL de la solución de acetato de sodio.
4. A la solución obtenida en el anterior paso se le agrega 500mL de agua destilada
Buffer succinato de sodio 0.2M pH=4.5
En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido succínico 0.2M y NaOH 0.2M.
1. Se disuelven 2.3g de ácido succínico en 100mL de agua destilada.
2. Se disuelven 0.8g de NaOH en 100mL de agua destilada
3. Se adiciona la solución de NaOH a la solución de ácido succínico lentamente hasta alcanzar un pH de 4.5.
Buffer tartrato de sodio 0.25M pH=3
1. Se disuelven 5.75g de tartrato de sodio en 100mL de agua destilada
2. Se disuelven 3.75g de ácido tartárico en 100mL de agua
3. Se mezclan las soluciones obtenidas en los pasos 1 y 2
60
Copyright 2018 Carolina González Camacho
4. En caso de ser necesario, se ajusta el pH en 3.
61
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Anexo 6: Pruebas estadísticas
A.6.1 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de glucosa libre con HPLC
Resultadospara:HPLCgl.MTW
ANOVAunidireccional:Respvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 43,099 6,1570 20,98 0,000 Error 13 3,816 0,2935 Total 20 46,915 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 0,541792 91,87% 87,49% 80,81% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 1,857 0,551 ( 1,181; 2,533) 2 3 3,375 0,481 ( 2,699; 4,051) 3 3 3,910 0,411 ( 3,234; 4,586) 4 2 5,696 0,376 ( 4,868; 6,523) 5 2 6,293 0,307 ( 5,465; 7,120) 6 3 4,829 0,880 ( 4,153; 5,505) 7 3 2,687 0,556 ( 2,011; 3,362) 8 2 2,2550 0,0636 (1,4274; 3,0826) Desv.Est. agrupada = 0,541792
ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación
62
Copyright 2018 Carolina González Camacho
5 2 6,293 A 4 2 5,696 A 6 3 4,829 A B 3 3 3,910 B C 2 3 3,375 B C D 7 3 2,687 C D 8 2 2,2550 C D 1 3 1,857 D Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Figura A.6.1.1. Gráfica de residuos de la prueba
Figura A.6.1.2. Gráfica de intervalos de la prueba
A.6.2 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de glucosa libre con kit de glucosa
87654321
7
6
5
4
3
2
1
Muestra
Resp
Gráfica de intervalos de Resp vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.
63
Copyright 2018 Carolina González Camacho
ANOVAunidireccional:kitvs.Muestra
1. Método 2. 3. Hipótesis nula Todas las medias son iguales 4. Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente 5. Nivel de significancia α = 0,05 6. 7. Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. 8. 9. 10. Información del factor 11. 12. Factor Niveles Valores 13. Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 14. 15. 16. Análisis de Varianza 17. 18. Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 19. Muestra 7 21,86 3,123 1,26 0,328 20. Error 16 39,58 2,474 21. Total 23 61,45 22. 23. 24. Resumen del modelo 25. 26. R-cuad. R-cuad. 27. S R-cuad. (ajustado) (pred) 28. 1,57290 35,58% 7,40% 0,00% 29. 30. 31. Medias 32. 33. Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 34. 1 3 2,261 1,019 ( 0,336; 4,187) 35. 2 3 3,43 2,11 ( 1,51; 5,36) 36. 3 3 4,20 2,33 ( 2,28; 6,13) 37. 4 3 3,588 1,346 ( 1,662; 5,513) 38. 5 3 3,318 1,716 ( 1,392; 5,243) 39. 6 3 2,627 1,654 ( 0,702; 4,552) 40. 7 3 2,284 0,998 ( 0,359; 4,209) 41. 8 3 0,940 0,634 (-0,985; 2,866) 42. 43. Desv.Est. agrupada = 1,57290
64
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.2.1. Gráfica de residuos de la prueba
Figura A.6.2.2. Gráfica de intervalos de la prueba
A.6.3 Modelo lineal general para comparar las respuestas de HPLC y kit de glucosa
Modelolinealgeneral:Respuestavs.Muestra;Metodo
87654321
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
Muestra
kit
Gráfica de intervalos de kit vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.
65
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Método Codificación de factores (-1; 0; +1) Información del factor Factor Tipo Niveles Valores Muestra Fijo 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Metodo Fijo 2 hplc; kit Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 48,889 6,984 4,23 0,002 Metodo 1 9,850 9,850 5,96 0,020 Error 36 59,474 1,652 Falta de ajuste 7 16,074 2,296 1,53 0,195 Error puro 29 43,400 1,497 Total 44 117,532 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 1,28532 49,40% 38,15% 21,29% Coeficientes EE del Término Coef coef. Valor T Valor p VIF Constante 3,302 0,193 17,12 0,000 Muestra 1 -1,243 0,494 -2,52 0,016 1,62 2 0,101 0,494 0,20 0,839 1,62 3 0,753 0,494 1,53 0,136 1,62 4 1,223 0,534 2,29 0,028 1,73 5 1,299 0,534 2,43 0,020 1,73 6 0,425 0,494 0,86 0,394 1,62 7 -0,817 0,494 -1,65 0,107 1,62 Metodo hplc 0,471 0,193 2,44 0,020 1,01 Ecuación de regresión Respuesta = 3,302 - 1,243 Muestra_1 + 0,101 Muestra_2 + 0,753 Muestra_3 + 1,223 Muestra_4 + 1,299 Muestra_5 + 0,425 Muestra_6 - 0,817 Muestra_7 - 1,742 Muestra_8 + 0,471 Metodo_hplc - 0,471 Metodo_kit Ajustes y diagnósticos para observaciones poco comunes Resid Obs Respuesta Ajuste Resid est. 6 5,813 2,932 2,881 2,49 R 9 6,871 3,585 3,286 2,84 R
66
Copyright 2018 Carolina González Camacho
15 1,416 4,131 -2,715 -2,38 R Residuo grande R
A.6.4 Modelo lineal general para comparar las desviaciones estandar de HPLC y kit de glucosa
Modelolinealgeneral:DESV.EST.1vs.MUES;m2Método Codificación de factores (-1; 0; +1) Información del factor Factor Tipo Niveles Valores MUES Fijo 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 m2 Fijo 2 hplc; kit Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p MUES 7 1,648 0,2354 1,48 0,309 m2 1 4,179 4,1793 26,25 0,001 Error 7 1,114 0,1592 Total 15 6,941
Figura A.6.4.1. Gráfica de residuos de la prueba
67
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.4.2. Gráfica de efectos principales
A.6.5 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de azúcares reductores con DNS
ANOVAunidireccional:Concentracionvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 212,70 30,386 29,79 0,000 Error 10 10,20 1,020 Total 17 222,90 Resumen del modelo
68
Copyright 2018 Carolina González Camacho
R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 1,00998 95,42% 92,22% 84,87% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 2,350 1,024 ( 1,051; 3,650) 2 2 6,459 1,357 ( 4,868; 8,051) 3 2 8,449 0,359 ( 6,858; 10,041) 4 2 8,5210 0,1004 (6,9298; 10,1123) 5 2 13,44 1,73 ( 11,85; 15,04) 6 2 8,679 1,088 ( 7,088; 10,270) 7 2 4,4696 0,1121 (2,8784; 6,0609) 8 3 3,280 0,986 ( 1,981; 4,580) Desv.Est. agrupada = 1,00998
ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 5 2 13,44 A 6 2 8,679 B 4 2 8,5210 B 3 2 8,449 B 2 2 6,459 B C 7 2 4,4696 C D 8 3 3,280 C D 1 3 2,350 D Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Figura A.6.5.1. Gráfica de residuos de la prueba
69
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.5.2. Gráfica de intervalos de la prueba
A.6.6 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de la prueba para lacasa
ANOVAunidireccional:Lacasavs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 843350779 120478683 18,25 0,000 Error 15 99045384 6603026 Total 22 942396163 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad.
87654321
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Muestra
Conc
entra
cion
Gráfica de intervalos de Concentracion vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.
70
Copyright 2018 Carolina González Camacho
S R-cuad. (ajustado) (pred) 2569,64 89,49% 84,59% 75,84% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 363,1 87,1 (-2799,0; 3525,3) 2 3 441 261 ( -2721; 3603) 3 3 1391 337 ( -1771; 4554) 4 3 2705 1810 ( -457; 5868) 5 3 13352 4986 ( 10189; 16514) 6 3 12444 2245 ( 9282; 15606) 7 3 14171 3846 ( 11008; 17333) 8 2 12843 1656 ( 8970; 16716) Desv.Est. agrupada = 2569,64
ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 7 3 14171 A 5 3 13352 A 8 2 12843 A 6 3 12444 A 4 3 2705 B 3 3 1391 B 2 3 441 B 1 3 363,1 B Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Figura A.6.6.1. Gráfica de residuos de la prueba
71
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.6.2. Gráfica de intervalos de la prueba
A.6.7 ANOVA en resultados de la prueba para endoglucanasa
ANOVAunidireccional:ExoGvs.Muestra
Método Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 510547 72935 3,17 0,055 Error 9 206967 22996 Total 16 717513 Resumen del modelo
87654321
20000
15000
10000
5000
0
Muestra
Laca
sa
Gráfica de intervalos de Lacasa vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.
72
Copyright 2018 Carolina González Camacho
R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 151,645 71,16% 48,72% 3,70% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 2 1251 145 ( 1009; 1494) 2 3 1138 198 ( 940; 1336) 3 2 857,4 63,3 (614,8; 1099,9) 4 2 1185,9 111,0 (943,4; 1428,5) 5 2 1055 162 ( 812; 1297) 6 2 767,1 87,1 (524,6; 1009,7) 7 2 1305 239 ( 1063; 1548) 8 2 1194,7 25,9 (952,2; 1437,3) Desv.Est. agrupada = 151,645
Figura A.6.7.1. Gráfica de residuos de la prueba
73
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.7.2. Gráfica de intervalos de la prueba
A.6.8 ANOVA en resultados de la prueba para MnP
ANOVAunidireccional:Actividadvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 5 1; 4; 5; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 4 838153 209538 13,24 0,007 Error 5 79108 15822 Total 9 917261 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad.
87654321
1500
1250
1000
750
500
Muestra
ExoG
Gráfica de intervalos de ExoG vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.
74
Copyright 2018 Carolina González Camacho
S R-cuad. (ajustado) (pred) 125,784 91,38% 84,48% 65,50% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 2 430,3 24,5 ( 201,6; 658,9) 4 2 841,6 138,4 ( 613,0; 1070,3) 5 2 868 232 ( 639; 1097) 7 2 407,0 55,8 ( 178,4; 635,7) 8 2 102,7 47,4 (-125,9; 331,3) Desv.Est. agrupada = 125,784
ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 5 2 868 A 4 2 841,6 A 1 2 430,3 A B 7 2 407,0 A B 8 2 102,7 B Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
Figura A.6.8.1. Gráfica de residuos de la prueba
75
Copyright 2018 Carolina González Camacho
Figura A.6.8.2. Gráfica de intervalos de la prueba
87541
1250
1000
750
500
250
0
Muestra
Activ
idad
Gráfica de intervalos de Actividad vs. Muestra95% IC para la media
Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.