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2017
Estudio de la regulación por pH de la expresión de genes inducidos por la carencia de zinc en Aspergillus fumigatus DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA. INSTITUTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL Y GENÓMICA. HECTOR TOLEDO PORTEROS
Dr. José Antonio Calera Abad, Profesor Titular del Departamento de Microbiología y Genética
de la Universidad de Salamanca,
CERTIFICA:
Que la tesis titulada “Estudio de la regulación por pH de genes inducidos por la carencia de zinc
en Aspergillus fumigatus”, presentada por D. Héctor Toledo Porteros para optar al grado de
Doctor en Biología, ha sido realizada bajo mi dirección en el Instituto de Biología Funcional y
Genómica (IBFG), dentro del Programa de Doctorado de Microbiología y Genética Moleculares
del Departamento de Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca. El autor del
trabajo ha disfrutado de una beca pre doctoral de la Universidad de Salamanca para la
realización del mismo.
Y para autorizar su presentación y evaluación por el tribunal correspondiente, extiendo el
presente certificado en Salamanca, 30 de mayo de 2017
Fdo: José Antonio Calera Abad
Dr. Pedro F. Mateos, Director del Programa de Doctorado en Microbiología y Genética
Moleculares de la Universidad de Salamanca
CERTIFICA:
Que la tesis titulada “Estudio de la regulación por pH de genes inducidos por la carencia de zinc
en Aspergillus fumigatus”, presentada por D. Héctor Toledo Porteros para optar al grado de
Doctor en Biología, ha sido realizada bajo la dirección del Dr. D. José Antonio Calera Abad en el
Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), dentro del Programa de Doctorado de
Microbiología y Genética Moleculares del Departamento de Microbiología y Genética de la
Universidad de Salamanca.
Y para que así conste, expido este certificado en Salamanca, a 30 de mayo de 2017
Fdo.: Pedro F. Mateos.
Por mí se va a la ciudad del llanto; por mí se va al eterno dolor;
por mí se va hacia la raza condenada […]
¡Oh, vosotros, los que entráis, abandonad toda esperanza!
Infierno, Canto III, Dante Alighieri.
Si las palabras que acabo de citar estuvieran escritas en las puertas de los laboratorios, al menos
los doctorandos no podríamos decir que nos sabíamos a lo que veníamos.
Hacer una tesis -investigar, en general- es duro, exigente, cansado, frustrante, exasperante. Y
uno sólo se mete en semejante viaje porque sabe que al final merecerá la pena, porque sabe
que, al igual que Dante tiene que cruzar infierno y purgatorio para llegar al paraíso, uno tiene
que soportar todas las frustraciones cotidianas del día a día del científico experimental para
alcanzar la meta. El periplo de Dante es una revisión del motivo literario de la Odisea: el viaje
del héroe. Sólo cambia el modelo de héroe: para los antiguos griegos era un guerrero astuto
capaz de desafiar a los dioses; para los humanistas cristianos del siglo XIV, un hombre virtuoso
y sabio que cumple los preceptos religiosos. Cada época tiene sus héroes. La nuestra, más
prosaica, opta por los héroes cotidianos y resume el motivo épico del viaje en una frase que
podría decir cualquier abuela: “Arrancar un ajo, cuesta trabajo” Porque quien algo quiere, algo
le cuesta, y las lentejas, si quieres las comes y si no, las dejas. Y ahí vamos todos en nuestro día
a día: salvando dificultades en pos de algún objetivo.
Pero no todo es horror y penurias y el pobre héroe sólo contra el mundo. Uno siempre encuentra
aliados por el camino. Odiseo tenía a Palas-Atenea, Dante tenía a Virgilio… En este periplo que
me ha tenido entretenido un puñado de años yo también he encontrado valiosos aliados sin
cuya ayuda no habría podido ni avanzar un par de pasos. Y no voy a seguir el ejemplo de los
héroes clásicos, quienes, la verdad, olvidaban con bastante facilidad a quienes les habían
permitido llegar a donde estaban; sino que aplicaré el principio contemporáneo que, como todo
lo contemporáneo, se puede resumir con otra frase de abuela: “es de bien nacido ser
agradecido”. Vayan pues, mis agradecimientos.
En primer lugar, por supuesto, debo agradecer el apoyo incondicional de mis padres, mis
familiares, amigos, compañeros teatreros y toda la gente cercana a mí en estos años. Ellos saben
quiénes son y lo bien que les quiero, y yo sé que es gente sensata que no se va a leer jamás esta
tesis, así que no me extenderé más sobre ello.
En segundo lugar, agradezco a toda la encantadora gente que ha trabajado y trabaja en el IBFG
(anteriormente conocido como IMB) el fantástico ambiente de trabajo que día a día construyen
y la abierta disposición de todo el mundo a echar un cable y ayudar siempre que puede.
También debo agradecer al Dr. Fernando Leal que allá por el lejano 2008 me impulsara a
disfrutar de mi beca de iniciación a la investigación en el laboratorio de Aspergillus, y a los
doctores Vicentefranqueira, Moreno y Amich, porque sólo sobre su magnífico trabajo ha sido
posible que yo levantara el mío.
Por supuesto, a mis compañeras de laboratorio: en primer lugar, a Rocío, que desde el principio
de los tiempos ha estado siempre ahí detrás, apoyando, ayudando y empujando todo lo que ha
podido para tratar de hacerme la vida más fácil. También a Clara y a Laura, cuyo apoyo
profesional y personal han hecho que los dos últimos años hayan transcurrido mucho más rápida
y fácilmente de lo imaginado entre risas, grandes conversaciones y admirables sarcasmos.
Y para finalizar, los agradecimientos más importantes para quien ha sido el gran responsable del
éxito de este viaje: mi director, José Antonio, quien me ha conducido con paso firme entre las
espesas nieblas de la biología molecular cargado de paciencia, excelentes ideas y buen hacer.
Escribo estas líneas a las puertas del final del viaje sin haberlo completado aún del todo. Ulises
volvió a casa, Dante alcanzó el paraíso… Yo ignoro cuál es mi premio final. ¿El título de doctor?
¿El conocimiento? ¿El haber despejado un trocito de camino para que otros lo recorran? El
problema de las heroicidades cotidianas es que su premio acostumbra a ser menos heroico que
cotidiano. Quizá el premio haya sido el viaje en sí, y con eso baste. Misterios del porvenir.
Gracias a todos por todo. Espero haber estado a la altura de lo que se esperaba de mí. Y si en
algo fracasé, lo siento y me aplico en mi descargo otra frase de abuela: Otro vendrá, que bueno
me hará.
Índice
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 5
1. Ciclo de vida de Aspergillus fumigatus .................................................................................. 7
2. Aspergillus fumigatus, patógeno oportunista. ...................................................................... 8
3. Funciones biológicas del zinc. ............................................................................................. 11
3.1. Mecanismos generales de la homeostasis del zinc en eucariotas. .............................. 12
3.2. Homeostasis del zinc en células humanas. .................................................................. 13
3.3. Homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae .................................................... 14
3.4. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus ........................................................... 17
4. Relación entre homeostasis del zinc y virulencia en A. fumigatus. .................................... 20
5. Regulación de la expresión génica por pH ambiental en hongos. ...................................... 22
5.1. Regulación de la expresión génica por pH ambiental mediante la vía rim/pal en
Aspergillus y levaduras. ....................................................................................................... 22
5.2. Otros reguladores implicados en el control de la expresión génica por pH en
Aspergillus ........................................................................................................................... 25
6. Regulación por pH de genes implicados en la homeostasis del zinc .................................. 26
7. Hipótesis de trabajo y objetivos .......................................................................................... 28
Materiales y Métodos ............................................................................................................ 84
1. Microorganismos y medios de cultivo empleados .............................................................. 87
2. Medios de cultivo empleados ............................................................................................. 88
2.1. Medio usado para el cultivo rutinario de Escherichia coli ........................................... 89
2.2. Medios usados para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ...................................... 89
2.3. Medios usados para el cultivo de Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans ......... 89
3. Cultivo de Aspergillus .......................................................................................................... 91
4. Plásmidos usados para generar cepas mutantes de A. fumigatus ...................................... 91
5. Obtención de cepas mutantes de Aspergillus fumigatus .................................................... 92
5.1. Obtención de protoplastos de Aspergillus fumigatus .................................................. 92
5.2. Transformación de Aspergillus fumigatus .................................................................... 93
5.3. Selección de mutantes de Aspergillus fumigatus ......................................................... 93
5.4. Obtención de cepas PyrG– a partir de cepas mutantes PyrG+ ...................................... 94
6. Obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos ................................................ 94
6.1. Obtención de ADN genómico de Aspergillus y análisis por Southern-blot .................. 95
6.2. Obtención de ARN total de Aspergillus y análisis por Northern-blot ........................... 95
6.3. Obtención de ADN plasmídico de Escherichia coli y análisis de restricción ................ 96
7. Extracción y análisis por Western-blot de proteínas totales de Aspergillus ....................... 97
8.- RT-q-PCR ............................................................................................................................. 98
9.- Técnicas de ingeniería genética utilizadas rutinariamente ................................................ 99
9.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................................................ 99
9.2. Mutagénesis dirigida .................................................................................................. 101
9.3. Clonación de fragmentos de PCR ............................................................................... 101
9.4. Transformación de células competentes de Escherichia coli..................................... 101
10. Plásmidos utilizados para generar cepas mutantes de S. cerevisiae .............................. 102
11. Construcción de cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae .................................... 102
12. Ensayo de BiFC in vivo en Saccharomyces cerevisiae ..................................................... 103
Bibliografía. ............................................................................................................................... 87
INTRODUCCIÓN
7
1. Ciclo de vida de Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus es un hongo filamentoso, habitante común del suelo, donde crece
alimentándose a partir de materia orgánica en descomposición. Es, por tanto, un saprofito que
se caracteriza por tener una amplia distribución ambiental, en gran medida gracias a su
considerable versatilidad metabólica y termotolerancia.
Aspergillus fumigatus se reproduce mediante un ciclo asexual que implica la producción de
conidios uninucleados (Fig. 1). Cuando éstos alcanzan un medio adecuado, germinan y crecen
produciendo hifas septadas constituidas por células multinucleadas haploides que crecen por
extensión apical y se ramifican formando una densa masa o micelio. Conforme éste se va
extendiendo, algunas células de las hifas se diferencian para generar células pie a partir de las
cuales se erigen los conidióforos, una suerte de prolongaciones aéreas ensanchadas en sus
extremos apicales sobre las que se diferencian a su vez las fiálides o células conidiogénicas, que
producen conidios blásticos de manera basípeta. Los conidios son relativamente pequeños (unas
2-3 micras de diámetro) y diseminan con facilidad por el viento.
En 2009 se describió la existencia de un ciclo sexual en A. fumigatus tras la observación de
cleistotecios al cruzar diversos aislados ambientales, confirmando de este modo el carácter
heterotálico de este hongo (1). Sin embargo, este ciclo sexual sólo pudo ser inducido en
condiciones de laboratorio tras 6 meses de incubación en unas condiciones muy precisas, por lo
que las posibilidades de darle uso como herramienta en investigación son poco halagüeñas.
Además, se desconoce su relevancia en la biología del hongo.
Figura 1. Ciclo de vida asexual de Aspergillus fumigatus. (A) Imágenes de microscopía electrónica de barrido que
muestras detalles de las distintas estructuras. (B) Evolución del crecimiento de una colonia de una cepa silvestre en
medio SDA a las 24, 48 y 72 horas respectivamente.
8
2. Aspergillus fumigatus, patógeno oportunista.
Debido a su pequeño tamaño, los conidios de A. fumigatus pueden ser transportados por el
viento a largas distancias y permanecer mucho tiempo suspendidos en el aire, siendo fácilmente
inhalados por las personas. En circunstancias normales, la inmensa mayoría de los conidios son
retenidos por los cilios de la mucosa epitelial de las vías respiratorias, mientras que los que
alcanzan los alvéolos son fagocitados y eliminados eficientemente por los macrófagos alveolares
mediante un procedimiento oxidativo basado en el uso de especies reactivas de oxígeno (ROS,
reactive oxygen species) (2–4). Cuando los conidios escapan a la acción oxidativa de los
macrófagos y finalmente germinan y forman hifas, estas son combatidas por medios no
oxidativos por acción de los neutrófilos mediante una estrategia que implica la formación de
NETs (5, 6). Las NETs (Neutrophil Extracellular Traps) son una estrategia de defensa inespecífica
en la cual los neutrófilos expulsan su material genético al exterior celular. Este ADN forma una
masa “pegajosa” capaz de contener la infección evitando la diseminación del patógeno (7). En
cualquier caso, los mecanismos de defensa innata de un individuo sano son tremendamente
eficaces para evitar el crecimiento invasor de A. fumigatus en los pulmones de un hospedador,
de manera que sólo los individuos con un alto grado de inmunosupresión son susceptibles de
ser invadidos por A. fumigatus (8).
Si bien para que la infección con A. fumigatus resulte en la invasión y colonización efectiva del
tejido pulmonar es imprescindible un alto grado de inmunosupresión en el hospedador, no es
menos imprescindible que el microorganismo responsable de la infección presente una serie de
características biológicas que le habiliten para crecer y reproducirse en el interior de un
hospedador susceptible. Así, el fenómeno de “virulencia”, aunque referido a un patógeno, en
realidad resulta de una combinación de factores dependientes tanto del hospedador como del
potencial patógeno. En el caso de Aspergillus fumigatus, entre las características que facilitan su
virulencia son destacables la producción de conidios suficientemente pequeños como para
alcanzar los alveolos pulmonares, su capacidad para obtener nutrientes del medio al pH
fisiológico (pH 7,3-7,6) y su capacidad de crecer mejor a 37ºC que a 28ºC, lo que le habilita para
extenderse de forma rápida a la temperatura corporal de mamíferos (9). Por tanto, la virulencia
de A. fumigatus parece ser una propiedad multifactorial puesto que hasta la fecha no se ha
encontrado un factor de virulencia en sentido estricto, es decir, un componente que sea esencial
para el desarrollo del hongo como patógeno, pero no para su desarrollo en cualquier otra
condición ambiental (10).
Sea como sea, A. fumigatus es capaz de comportarse como un patógeno y provocar daños en
hospedadores susceptibles. En general, la manifestación de los daños o enfermedad causada
por el crecimiento de A. fumigatus dentro de los tejidos de un hospedador susceptible se
denomina aspergilosis. Sin embargo, las manifestaciones clínicas e histopatológicas de la
aspergilosis pueden ser muy diversas. Así, las aspergilosis se pueden clasificar en 3 tipos:
alérgicas, saprofíticas o crónicas, e invasoras (11, 12).
Las manifestaciones alérgicas son habituales en pacientes con asma y fibrosis quística y se suelen
producir como consecuencia de una hipersensibilidad del sistema inmune a antígenos presentes
en las paredes de las esporas. De entre los distintos cuadros clínicos que pueden producirse,
9
destaca la aspergilosis broncopulmonar alérgica o ABPA, cuyos síntomas son asma, eosinofilia y
aparición de infiltrados pulmonares (12, 13) (Fig. 2A).
Cuando el hongo crece aprovechando el tejido muerto de cavidades preformadas en el pulmón,
provocadas por enfermedades previas como sarcoidosis o tuberculosis, se habla de
enfermedades saprofíticas o crónicas. En estos casos el crecimiento saprofito de A. fumigatus
puede formar un aspergiloma pulmonar o bola fúngica (Fig. 2B). Con frecuencia el aspergiloma
es asintomático y sólo se producen síntomas cuando el crecimiento del hongo es capaz de
provocar la rotura de vasos sanguíneos adyacentes (13). La cronificación de estas bolas fúngicas
puede causar eventualmente la destrucción del tejido pulmonar, una condición conocida como
aspergilosis pulmonar necrótica crónica, caracterizada por pérdida de peso, hemoptisis, tos
productiva y esputos crónicos (12).
Pero sin lugar a dudas, las manifestaciones más peligrosas de la patogenicidad de A. fumigatus
las encontramos dentro del grupo de enfermedades invasoras, que sólo se producen en
pacientes inmunosuprimidos. Cuando las esporas del hongo germinan y crecen en los alvéolos
pulmonares de un individuo inmunosuprimido, pueden terminar invadiendo el tejido
circundante (Fig. 2C). Se habla entonces de aspergilosis pulmonar invasora (API), la forma más
frecuente y fatal de las enfermedades invasivas causadas por A. fumigatus, con una tasa de
mortalidad que oscila entre el 50-90% según las fuentes consultadas (14, 15). Además, una
consecuencia de la API es la rotura de capilares y vasos sanguíneos del pulmón que facilitan la
dispersión hematógena de Aspergillus fumigatus (Fig. 2D). De este modo, cualquier órgano
puede resultar afectado dando origen a un cuadro agravado conocido como aspergilosis
diseminada que resulta mortal en caso de que resulten afectados órganos vitales como el
corazón o el cerebro (14) (Fig. 2E). La alta tasa de mortalidad se debe principalmente a la
dificultad para lograr diagnósticos tempranos y a la relativamente baja eficacia de los agentes
quimioterapéuticos utilizados (principalmente anfotericina B y voriconazol) (12, 15, 16). Una
dificultad añadida a todo ello es la creciente aparición de cepas resistentes a azoles (17). Por
esta razón, la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas es de capital interés desde el punto de
vista biomédico. Para ello, resulta fundamental comprender la biología del hongo en las
condiciones ambientales en las que crece dentro de un hospedador susceptible.
Para que A. fumigatus sea capaz de crecer eficazmente en los tejidos del hospedador deberá ser
capaz de obtener todos los nutrientes necesarios a partir de dichos tejidos. Sin embargo, esto
no resulta sencillo para el hongo, especialmente en lo que se refiere a la obtención de cationes
metálicos esenciales, por dos razones fundamentales:
1. El sistema inmune de los mamíferos ha desarrollado una estrategia antimicrobiana
inespecífica para limitar la biodisponibilidad de cationes metálicos en los tejidos vivos que, en
general, se conoce como “inmunidad nutricional” (18). Por ejemplo, en mamíferos se han
descrito dos estrategias para secuestrar cationes de Zn2+: La primera pasa por la secreción de
calprotectina, proteína capaz de quelar zinc que es producida por los neutrófilos en abscesos
(19); la segunda opera en macrófagos activados por su infección con patógenos intracelulares,
e incluye el secuestro de zinc mediante metalotioneínas (MTs) (20, 21). Sin embargo, un exceso
de zinc es también nocivo para cualquier patógeno, ya que reacciona con los grupos -SH de las
proteínas. Por esta razón, los mamíferos también han desarrollado estrategias consistentes en
10
intoxicar a los microorganismos con zinc tras ser fagocitados por macrófagos y encerrados en
endosomas (22). Estas estrategias de defensa demuestran que la adquisición y detoxificación de
zinc es fundamental para la virulencia de bacterias y hongos. Mecanismos similares han sido
hallados al estudiar las relaciones entre la adquisición de hierro y la virulencia de distintos
patógenos (23). La lactoferrina, por ejemplo, es una proteína muy similar a la transferrina
presente en abscesos y en neutrófilos, capaz de unir hierro sin liberarlo a pH ácido (24). La acción
de la lactoferrina reduce la biodisponibilidad de hierro extracelular, como también lo hace la
hepcidina, un pequeño péptido capaz de unirse a la ferroportina, proteína que transporta hierro
hacia el exterior de la célula, induciendo su internalización y degradación y contribuyendo a
mantener los niveles de hierro extracelular muy bajos (25). Otro mecanismo pasa por bloquear
la capacidad de captar hierro del patógeno bloqueando los sideróforos que éste secreta, como
se ha comprobado que hace la siderocalina con los sideróforos de E. coli (26). Por último, la
proteína de membrana Nramp1 y el receptor de transferrina TfR1 constituyen eficaces
mecanismos de defensa contra patógenos intracelulares contribuyendo a la reducción de la
cantidad de hierro disponible en los macrófagos infectados (27, 28).
2. Los cationes metálicos son tóxicos cuando se encuentran en estado libre en las células
(29, 30), razón por la cual, se suelen encontrar asociados a diversas clases de proteínas. Por
ejemplo, se ha estimado que la concentración de hierro libre (en forma de Fe2+/3+) es de ~10–12
M (31) mientras que la de zinc libre (Zn2+) es de ~10–4M (32). Por tanto, las concentraciones
de éstos metales son muy inferiores a las mínimas requeridas para el crecimiento óptimo de una
cepa silvestre de A. fumigatus en un medio definido con pH igual al fisiológico, cuyos valores
hemos fijado en nuestro laboratorio en 6 M para el Fe2+/3+ y 1 M para el Zn2+. Esto sugiere que
A. fumigatus ha debido desarrollar estrategias para obtener a partir del hospedador todo el
hierro y el zinc que necesita para crecer e invadir sus tejidos y órganos.
Figura 2. Pruebas diagnósticas de distintas enfermedades causadas por Aspergillus fumigatus. (A) TC que muestra las estructuras típicas en sortija (flecha corta y gruesa) y en rosario (flecha larga y delgada) indicativas de bronquiectasia en un paciente con ABPA. Imagen tomada de Oxilia, H.G. et al. (2008). (B) Tomografía Computerizada (TC) de tórax con cavitación en forma de media luna y masa fúngica diagnosticada como aspergiloma. Imagen tomada de Shah, A. & Panjabi, C. (2016) (C) TC que muestra un nódulo excavado con necrosis en una paciente con API. Imagen tomada de Marchiori, E. et al. (2003). (D) Preparación histológica en la que se aprecia cómo las hifas de Aspergillus fumigatus invaden un capilar sanguíneo. (E) Resonancia Magnética que muestra las lesiones cerebrales provocadas por el crecimiento de Aspergillus en el cerebro de una paciente seropositiva. Imagen tomada de Reus-Bañuls, S., et al (2012).
11
3. Funciones biológicas del zinc.
El zinc es, tras el hierro, el segundo metal más abundante en las células eucariotas y, tras el
magnesio aquel que con más frecuencia aparece asociado a proteínas, incluyendo más de 300
enzimas de las 6 principales clases funcionales (33, 34) El zinc puede unirse a las proteínas por
distintos tipos de enlaces y tener función estructural, catalítica o co-catalítica (35) (Fig. 3).
Cuando su función es estructural se coordina preferentemente con los grupos –SH de cuatro Cys
o distintas combinaciones de Cys/His para estabilizar la estructura de la proteína. Cuando su
función es catalítica, forma complejos con una molécula de agua y tres aminoácidos donadores
de oxígeno, nitrógeno y azufre (His, Glu, Asp o Cys), siendo la His el preferido. En este caso la
función del Zn es activar el agua de la manera adecuada en función del tipo de reacción en la
que esté implicado (ionización, polarización o desplazamiento), lo cual está determinado por los
residuos con los se encuentra coordinado. Cuando su función es co-catalítica, dos iones de Zn2+
interaccionan con un mismo aminoácido, generalmente Asp y, a veces, con una molécula de
agua. Además, cada átomo de Zn también se coordina con 2 aminoácidos más, generalmente
Asp, His o Glu (la Cys nunca se encuentra en un sitio co-catalítico), aunque también pueden ser
otros ligandos inusuales como grupos amida (aportados por Asn, Gln), hidroxilo (Ser, Thr o Tyr)
o amino (Lys o N-terminal) (36). Por consiguiente, el zinc no sólo es esencial para la actividad de
Figura 3. Función del zinc en los sitios activos de las enzimas. Representación esquemática de tres ejemplos de
sitios activos en los que el zinc está cumpliendo respectivamente una función catalítica, estructural o co-
catalítica.
12
numerosas enzimas, sino que también es fundamental para el correcto plegamiento y
configuración de la gran diversidad de motivos zinc-finger presentes en proteínas implicadas en
procesos muy diversos, tales como replicación y reparación del ADN, transcripción, traducción,
metabolismo y señalización. Por lo tanto, la deficiencia de zinc, de la misma manera que su
exceso, afectará gravemente la capacidad de crecimiento y diferenciación y, en última instancia,
a la supervivencia de cualquier organismo vivo (37). Por esta razón, todos los seres vivos tienen
un sistema de control de la homeostasis del zinc.
3.1. Mecanismos generales de la homeostasis del zinc en eucariotas.
Todas las células disponen de mecanismos orientados a mantener la homeostasis de zinc en su
interior, pues un déficit puede detener el crecimiento mientras que un exceso puede resultar
tóxico. La cantidad mínima de átomos zinc necesaria para el crecimiento y desarrollo óptimo de
un microorganismo recibe el nombre de cuota de zinc (38). Por ejemplo, se estima que la
cantidad de átomos de Zn que contiene Escherichia coli creciendo en medio mínimo es de 2
105 átomos/célula. En el caso de Saccharomyces cerevisiae la cuota de zinc se estima que es de
1,5 107 átomos/célula (39). A pesar de que hay dos órdenes de magnitud de diferencia,
teniendo en cuenta los volúmenes celulares, resulta que la concentración intracelular de zinc en
E. coli y S. cerevisiae es 0,2 y 0,5 mM respectivamente (~100-1000 veces mayor que la
concentración de Zn en el medio).
En general, el sistema homeostático del zinc en células eucariotas depende de transportadores
específicos de zinc, proteínas de unión y reguladores transcripcionales (40):
A) Transportadores de zinc de la familia ZIP (Zrt- Irt- like proteins) (40, 41). Se encuentran
principalmente en la membrana plasmática y en la membrana de algunos orgánulos y su
misión principal es transportar zinc hacia el citoplasma. Suelen funcionar como
homodímeros. Normalmente tienen 8 regiones hidrofóbicas transmembrana con el
extremo N y C terminal orientado hacia el medio extracelular o al lumen de los orgánulos,
con una región rica en His entre los dominios transmembrana 3 y 4 orientada hacia el
citoplasma. Los dominios transmembrana 4 y 5 son muy anfipáticos, con residuos de
histidina muy conservados, y parecen ser los que forman el canal por el que pasan los
iones. El mecanismo de transporte no está nada claro. La especificidad de sustrato parece
estar definida por la secuencia de lazo que conecta los dominios transmembrana 2 y 3 o
por un residuo de histidina muy conservado en el VI dominio transmembrana (Fig. 4A).
B) Transportadores de zinc de la familia CDF (Cation diffusion facilitator) (40). Transportan zinc
desde el citoplasma hacia el interior de orgánulos o hacia el exterior celular y participan
en su detoxificación o almacenamiento. Típicamente constan de 6 regiones
transmembrana con el extremo N y C terminal orientado hacia el citoplasma. Un lazo con
un motivo rico en histidina, entre los pasos 4 y 5, es el que potencialmente capta los iones
metálicos. Existe otro dominio de unión a metales en el C-terminal. Los dominios 1, 2 y 5
forman el canal de transporte, cuyo mecanismo no se ha definido, aunque se ha sugerido
la posibilidad de un antiporte Zn2+/H+ (42, 43) (Fig. 4B).
13
C) Proteínas quelantes de zinc (MTs) (40, 41). Entre éstas se encuentran las metalotioneínas,
proteínas de bajo peso molecular (66-68 aminoácidos) caracterizadas por tener un alto
contenido en cisteína (entre 20 y 22 residuos). Aunque presentan una gran
heterogeneidad de secuencias, todas tienen elementos estructurales que les permiten
unir fuertemente iones metálicos como Zn2+, Cu2+ y Cd2+. Las metalotioneínas regulan la
concentración citosólica de zinc, ya que pueden unir hasta 7 átomos de este elemento a
través de los grupos -SH de las cisteínas. Se ha descrito su función en la protección contra
la toxicidad por zinc (44).
D) Factores de transcripción. Todos los elementos señalados deben estar sujetos a regulación
directa por uno o más factores de transcripción que activan o reprimen la expresión
génica en función de la concentración ambiental de zinc (40, 45). No obstante, algunos de
estos genes pueden estar regulados por factores de transcripción que responden a otros
estímulos ambientales tales como el pH del medio o la disponibilidad de otros metales (ej.
Fe), según se ha demostrado en Aspergillus fumigatus (46, 47).
Figura 4. Esquema de la estructura y topología de los transportadores de zinc. (A) Transportadores de la familia
ZIP. (B) Transportadores de la familia CDF. Imagen tomada de la tesis doctoral de Jorge Amich (2010).
3.2. Homeostasis del zinc en células humanas.
Hasta la fecha, se han identificado en las células humanas un factor regulador (MTF1), alrededor
de 12 metalotioneínas, 9 ZnTs (familia CDF) y 14 transportadores de la familia ZIP (41).
14
El regulador MTF1 se expresa en todos los tipos celulares. Tiene un dominio de unión a ADN en
el extremo amino que consta de 6 dedos de zinc que reconocen una secuencia denominada MRE
(Metal Response Element) cuyo consenso es 5’TGCRCnCGCCC3’ (48). MTF1 es capaz de unir zinc
cuando la concentración de este metal es elevada en la célula e inducir la transcripción de los
genes de las metalotioneínas I y II y de ZnT1 y ZnT2, así como reprimir Zip10 (49). Hasta muy
recientemente se pensaba que MTF1 era el único regulador de zinc en mamíferos, pero hace
poco se ha descrito un segundo factor de transcripción, ZNF658, que no sólo parece regular la
expresión de transportadores de zinc como ZnT5 y Zip10, sino que además parece conectar la
homeostasis de zinc con la producción de proteínas ribosomales (50). Además, más
recientemente se ha descrito en Caenorhabditis elegans un factor nuclear (HIZR-1) que media la
respuesta a altas concentraciones de zinc (51), aunque su ortólogo en humanos no ha sido aún
estudiado.
Las metalotioneínas I y II tienen como función principal controlar y mantener en niveles bajos el
Zn2+ citosólico controlando el exceso de zinc. Dada su baja afinidad por el zinc, sólo lo captan
cuando los niveles son altos y son capaces de liberarlo con cierta facilidad, sirviendo como buffer
de zinc y para donárselo a otras enzimas cuando estas lo necesitan (49).
Respecto a los transportadores, tanto los ZnTs como los de la familia ZIP se caracterizan por
tener distintas distribuciones en la célula o incluso por ser específicos de distintos tejidos, como
es el caso del ZnT8 que se expresa únicamente en las células del páncreas (52) o ZnT3 que se
expresa mayoritariamente en el hipocampo y la corteza cerebral (53). Aunque aún hay grandes
lagunas que cubrir, en los últimos años el estudio de la homeostasis del zinc en células humanas
ha avanzado considerablemente. Actualmente todos los transportadores han sido estudiados
en mayor o menor detalle y sus funciones concretas pueden consultarse en cualquier revisión
sobre el tema (41).
3.3. Homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae
La homeostasis del zinc en la levadura S. cerevisiae ha sido ampliamente estudiada y revisada
(45, 54). Nos encontramos con un sistema que consta de transportadores ZIP (Zrt1, Zrt2, Zrt3 y
Ke4), transportadores CDF (Zrc1, Cot1, Zrg17 y Msc2), al menos una metalotioneína (Csr5) y un
factor de transcripción capaz de regular todo el sistema (Zap1). (Fig. 5).
Zap1 fue el primer factor de transcripción de respuesta a zinc descrito en hongos (55). Tiene 880
aminoácidos, con un dominio de unión a ADN (DBD, DNA binding domain) en el C-terminal,
compuesto de 5 dedos de zinc del tipo C2H2, y dos dominios de activación (AD, activating
domains) susceptibles de inhibirse por la unión de iones Zn2+. El dominio AD1 está formado por
una región rica en histidinas y cisteínas (56). El dominio AD2 incluye dos dedos de zinc atípicos
del tipo tCWCH2 (tándem CWCH2) (57, 58). Tanto los dominios AD como el DBD están regulados
por la unión de iones Zn2+, alcanzando su máxima actividad en condiciones de limitación extrema
(59). Conforme va incrementándose la concentración intracelular de zinc, los dominios AD van
uniendo iones Zn2+ y Zap1 va perdiendo actividad. (Fig. 6).
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Figura 5. Esquema general de la homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae. (A) S. cerevisiae creciendo
en condiciones limitantes en Zn2+ y, (B) de exceso de Zn2+. Las proteínas de la familia ZIP se muestran en verde,
las de la familia CDF en amarillo y Zap1 en azul. Los átomos de zinc están representados como puntos negros.
16
Hay más de 80 genes regulados por Zap1, bien por activación, bien por represión, lo que indica
que existe más de un mecanismo de acción. Como norma general, Zap1 actúa activando
promotores al unirse a secuencias de reconocimiento específicas denominadas ZREs (Zinc
Response Elements) cuya secuencia consenso es 5’-ACCYYNAAGG-3’ (60). Estas secuencias
pueden tener mayor o menor afinidad por la unión de Zap1, lo cual es clave en la regulación del
sistema.
La presencia de ZREs de baja afinidad en el propio promotor de Zap1 permite sugerir que, en
ausencia de zinc, estimula su propia transcripción mediante un mecanismo de retroalimentación
positiva que se activa cuando la limitación en zinc es muy elevada (54), del mismo modo que
sucede en otros organismos como A. fumigatus (61) (datos no publicados), y como posiblemente
también ocurre en Cryptococcus gattii (62), o Candida sp. (63). Al ser capaz de autorregular su
propia producción y gracias a la existencia de ZREs con distinta afinidad, cuando la limitación de
zinc es moderada, Zap1 se produce en cantidades moderadas y sólo se une a los sitios ZRE de
alta afinidad del genoma. Sin embargo, cuando la limitación de zinc es severa, Zap1 se produce
en grandes cantidades y es capaz de unirse también a los ZREs de baja afinidad.
Cuando la limitación en zinc es moderada, Zap1 es capaz de unirse a los sitos ZRE de alta afinidad
del promotor de ZRT2 y activar su transcripción. Zrt2 es un transportador ZIP de baja afinidad
Figura 6. Modelo de funcionamiento de Zap1 en S. cerevisiae. Según va aumentando la cantidad de Zn2+ en la célula, éste se va uniendo a los dominios AD reduciendo progresivamente la actividad del factor de transcripción. Imagen tomada de Wilson, S. & Bird, A.J. (2016)
17
que introduce zinc en la célula procedente del medio. Su transcripción depende de la activación
de 2 sitios ZRE situados upstream de la caja TATA de su promotor. Sin embargo, en el promotor
de ZRT2 hay una secuencia ZRE adicional, de baja afinidad, situada por debajo de la caja TATA y
solapando con sitio de inicio de la transcripción. Cuando la concentración en zinc es muy baja,
Zap1 se une a esta secuencia y bloquea la transcripción de ZRT2 (64). En condiciones de
limitación moderada de zinc, Zap1 también activa la expresión de Fet4, un transportador de baja
afinidad de Fe2+, Cu2+ y Zn2+ (65).
En cambio, cuando la limitación de zinc es extrema, Zap1 es capaz de unirse a los sitios de baja
afinidad del promotor del gen ZRT1, que codifica un transportador de membrana de alta afinidad
por Zn2+. Zrt1 es el principal encargado de captar e introducir zinc en la célula en condiciones de
limitación severa (66).
El transporte de zinc hacia la vacuola depende de Zrc1 y Cot1, mientras que en sentido opuesto
(de la vacuola al citoplasma), depende de Zrt3, que se expresa sólo en déficit de zinc inducido
por Zap1 (67). Paradójicamente, Zrc1 se activa por Zap1 cuando hay una limitación severa en
zinc para contrarrestar el zinc-shock causado por el aumento súbito de la concentración de este
metal en el citoplasma tras la entrada en acción del transportador de alta afinidad Zrt1 (68). En
la detoxificación de Zn2+ también está involucrada la metalotioneína Csr5, que es capaz de
secuestrar zinc (69).
En condiciones en las que no existe limitación en zinc, Zrc1 y Cot1 almacenan zinc en la vacuola
para que sirva de reservorio ante una posible limitación. Sin embargo, la vacuola no es el único
orgánulo capaz de almacenar zinc. Zrg17, Msc2 y Ke4 son transportadores encargados de
introducir zinc en el retículo endoplásmico con el fin de proporcionar la cantidad necesaria de
este metal para la correcta síntesis y plegamiento de proteínas reticulares. Zrg17 está controlado
por Zap1, pero no los otros dos (70, 71). Adicionalmente, podemos encontrar zinc almacenado
en vesículas denominadas zincosomas, que han sido descritas tanto en mamíferos como en
levaduras, pero cuya función aún no está clara (39).
Por último, Pho84 es un transportador de alta afinidad de fosfatos capaz de co-transportar zinc
hacia el interior celular. Sin embargo, éste transportador sólo se sintetiza en condiciones
limitantes en fosfatos y no está regulado por la biodisponibilidad de zinc (72) por lo que su
función en la homeostasis de este metal parece poco relevante.
3.4. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus
La homeostasis del zinc en A. fumigatus está regulada por un sistema que consta básicamente
de los mismos componentes esenciales que en el resto de seres vivos. Sin embargo, debido a su
capacidad infecciosa, su estudio reviste un interés especial por la relevancia que este sistema
tiene para la patogénesis del hongo, como se explicará más adelante. A. fumigatus tiene 8
transportadores de zinc de la familia ZIP (ZrfA-ZrfH), 8 de tipo CDF (MscA, ZgrA, ZrcA, ZrcB, ZrcC,
MntA, MtpA y MtpB) y un factor regulador (ZafA) (73) (Fig. 7). Hasta el momento, no se han
descrito metalotioneínas.
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Figura 7. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus. Esquema en el que se sitúa cada proteína en su
localización subcelular más probable en función de lo conocido en otros organismos. En el panel superior se
observa la situación en un medio sin limitación en zinc; en el central, en un medio ácido limitante en zinc; y en el
inferior, en un medio alcalino limitante en zinc. El nombre de los distintos elementos representados puede
consultarse en la leyenda que contiene la propia figura. Imagen tomada de Amich, J. and Calera, J.A. (2014)
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ZafA (61) es un factor de transcripción ortólogo a factor Zap1 de S. cerevisiae que se expresa en
condiciones de limitación en zinc. Tiene 570 aminoácidos con 2 dedos de zinc atípicos del tipo
tCWCH2 y 4 dedos de zinc típicos del tipo C2H2 en su región C terminal. Consta de dos dominios
de activación, llamados AD1 y AD2 cuya regulación se desconoce y 4 probables motivos de unión
a zinc, así como una secuencia de localización nuclear solapando con el 6º dedo de zinc.
Autorregula su propia expresión por un sistema de retroalimentación positiva mediante su
unión directa a una secuencia ZR (zinc response) cuya secuencia consenso es 5’-
RYYNYCAAGGTNYYY-3’ (datos no publicados). Amén de estar presente en su propio promotor,
encontramos varias repeticiones de estas secuencias en los promotores de los genes que
codifican los transportadores ZrfA, ZrfB, ZrfC y ZrfF cuya expresión está inducida por ZafA en
condiciones de carencia de zinc, mientras que la expresión de los demás genes ZIP no parecen
estar regulados por ZafA. Además, los genes zrfA, zrfB y zrfC presentan niveles diferentes de
expresión en función del pH del medio (Fig. 8).
Por su parte, los transportadores ZrcA, ZrcB y ZrcC, de la familia CDF, están implicados en el
transporte de zinc hacia la vacuola, siendo ZrcC el más parecido a Zrc1/Cot1 de S. cerevisiae;
Figura 8. Análisis mediante northern blot de la
expresión de los genes de los transportadores de la
familia ZIP en Aspergillus fumigatus. Se ha medido
la expresión combinando dos variables: condiciones
de ausencia o exceso de Zn2+ y pH ácido o alcalino. Se
usaron los medios SDA y SDN (sin Zn2+ y con Zn2+
respectivamente). Como se puede ver, sólo zrfA,
zrfB, zrfC y zrfF están regulados por la
biodisponibilidad de zinc en el medio de cultivo.
Además, los tres primeros responden también al pH
ambiental.
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MtpA y MtpB son similares a la proteína YiiP de E. coli y a otras implicadas en tolerancia a
metales en hongos y plantas (73).
La proteína ZrfA es el ortólogo de Zrt1 de S. cerevisiae. En la región promotora de zrfA hay tres
secuencias reguladoras de respuesta a ZafA (ZR1-3) y una secuencia de unión al factor regulador
de la expresión por pH, PacC, que solapa con los motivos ZR1 y ZR2 (46). Su expresión es muy
sensible a la concentración de zinc en el medio y se inhibe cuando ésta es mayor de 2 M.
Además, zrfA se expresa a su máximo nivel en medios ácidos limitantes en zinc mientras que su
nivel de expresión se reduce ligeramente en los medios alcalinos (74).
Algo similar ocurre con ZrfB, ortólogo de Zrt2 de S. cerevisiae. En la región promotora del gen
zrfB se encuentran 5 motivos ZR y 4 motivos de unión del factor PacC, estando ubicado uno de
ellos justamente downstream de la caja TATA. Todo ello hace que zrfB se exprese a mayor nivel
en medios ácidos limitantes en zinc mientras que su nivel de expresión se reduce notablemente
en medios alcalinos (74). Además, la expresión de zrfB es menos sensible a la concentración de
zinc que la de zrfA y sólo se inhibe completamente con concentraciones de zinc en el medio
mayores de 10 M (46).
Por su parte, ZrfC no tiene ortólogos conocidos en S. cerevisiae, aunque sí se encuentra un
ortólogo de ZrfC en C. albicans (donde se ha denominado Zrt1) (75). Como todas las proteínas
ZIP tiene 8 dominios transmembrana con los extremos N y C terminales hacia el exterior, pero
también tiene un extremo amino inusualmente largo que presenta 4 posibles motivos de unión
de zinc. El gen zrfC comparte promotor con aspf2, que codifica un antígeno inmunodominante
de función desconocida cuya expresión responde al mismo patrón que la de zrfC (76). El
promotor bidireccional zrfC-aspf2 tiene 3 motivos ZR y 6 sitios de unión a PacC. Es muy sensible
a la biodisponibilidad de zinc y al pH y únicamente se expresa en medios alcalinos muy limitantes
en zinc.
4. Relación entre homeostasis del zinc y virulencia en A. fumigatus.
Como ya se anticipó en el epígrafe 3, la concentración de zinc disponible en los tejidos del
hospedador es considerablemente inferior a la que necesitaría A. fumigatus para poder crecer
de forma óptima in vitro en un medio mínimo definido. De entre todos los componentes del
sistema de mantenimiento de la homeostasis del zinc en A. fumigatus, aquellos que por orden
de prelación deberían ser los más importantes para su virulencia serían los implicados
directamente en la captación de zinc a partir de los tejidos del hospedador. Teniendo en cuenta
que el pulmón es un medio ligeramente alcalino limitante en zinc, el transportador ZrfC sería el
más crítico para el crecimiento inicial del hongo en este medio. El crecimiento de A. fumigatus
en el tejido pulmonar, como el de otros patógenos, resulta en una respuesta inflamatoria que
conlleva la restricción del zinc libre y un ligero descenso del pH en los abscesos fúngicos, por lo
que es posible que además de ZrfC, los transportadores ZrfA y ZrfB también sean importantes
en virulencia. Por otra parte, considerando que la expresión de estos genes está inducida por
ZafA, es lógico pensar que éste gen también sea esencial en virulencia.
21
En concordancia, se demostró que un mutante zafA es incapaz de crecer en medios limitantes
en zinc y, por consiguiente, de infectar ratones inmunosuprimidos (61). La acción supresora de
la virulencia en este mutante depende en primera instancia de su incapacidad para inducir la
expresión de los transportadores transmembrana (ZrfA-C). De hecho, un mutante
zrfAzrfBzrfC es igualmente avirulento (77). Ahora bien, ¿En qué medida contribuye cada uno
de los transportadores a la virulencia de A. fumigatus? Ya que ZrfC es el principal encargado de
captar zinc en las condiciones que más se asemejan a las de un entorno pulmonar, debe ser el
principal responsable de la virulencia. Efectivamente, se ha demostrado que un mutante zrfC
ve reducida su virulencia permitiendo la supervivencia del 50% de los ratones infectados.
Además, se ha demostrado que dicha virulencia depende de la capacidad de captación de zinc
Figura 9. Función de los genes zafA, zrfA, zrfB y zrfC en la virulencia de Aspergillus fumigatus. (A) Curva de
supervivencia de ratones inoculados con 2 x 106 conidios de las cepas AF171 (zafA), AF56 (zafA [zafA]) y AF14 (WT). Gráfica tomada de Moreno, M.A. et al (2007). (B) Curva de supervivencia de ratones inoculados
con 105 conidios de las cepas AF14 (WT), AF54 (zrfC), AF721 (zafAzrfBzrfC) y AF731
(zafAzrfBzrfCzrfC]). En todos los casos, cada curva es la media de la supervivencia de dos cohortes de 10 ratones inmunosuprimidos con cortisona. Imagen tomada de Amich, J. et al. (2014).
22
de ZrfC mediante su extremo N-terminal, el cual está ausente en ZrfA y ZrfB (77). No obstante,
aunque ZrfC es el principal responsable de la captación de zinc cuando A. fumigatus crece como
patógeno pulmonar, el bajo nivel de expresión de zrfA y zrfB también contribuye a la obtención
de zinc, como lo prueba que la cepa zrfC no sea totalmente avirulenta. Sin embargo, ZrfA y ZrfB
no son esenciales en presencia de ZrfC (73, 77) (Fig. 9).
Adicionalmente se ha podido comprobar que ZrfC es esencial para contrarrestar la acción
antimicrobiana de la calprotectina (77, 78) proteína secretada por los neutrófilos en abscesos
que es capaz de inhibir el crecimiento microbiano mediante el secuestro de zinc y manganeso
(19, 79, 80), incluyendo el de hongos patógenos como C. albicans (81), y A. fumigatus (77).
Por todas estas razones se ha propuesto que el sistema de la homeostasis de zinc en A.
fumigatus es esencial para la virulencia de este hongo y que, concretamente, ZafA y ZrfC pueden
ser dos posibles dianas terapéuticas a tener muy en cuenta a la hora de desarrollar nuevos
fármacos contra la aspergilosis (73, 78). No es la primera vez que se señala a los transportadores
de membrana y sistemas de adquisición de nutrientes como posibles dianas terapéuticas. Son,
de hecho, una línea que está siendo cada vez más explorada en los últimos tiempos (82, 83).
5. Regulación de la expresión génica por pH ambiental en hongos.
La regulación de la expresión génica por pH ambiental es un proceso esencial, muy complejo,
que obliga a los hongos desplegar la respuesta homeostática y adaptativa más adecuada para
poder sobrevivir, nutrirse y crecer. Paradójicamente, la adaptación del programa de expresión
génica a cambios en el pH ambiental no depende exclusivamente del pH, sino que también está
influida por la disponibilidad de otros nutrientes y, en particular, de iones metálicos. Así, esta
adaptación es el resultado final de la integración de las señales detectadas y transmitidas a
través de varias vías de señalización.
Aunque los primeros estudios sobre regulación de la respuesta a pH se realizaron en el hongo
A. nidulans, actualmente se ha alcanzado un mayor grado de conocimiento para el caso de la
levadura S. cerevisiae. Se sabe que, en esta levadura, además de la ATPasa de membrana Pma1
(que bombea H+ desde el citoplasma al medio externo) y la ATPasa vacuolar de H+, ambas
implicadas en el mantenimiento del pH citosólico, la respuesta a pH ambiental es dependiente
de al menos 5 vías distintas interconectadas: La ruta de la Mid1/Ca2+-calcineurina/Crz1, la ruta
Rim, la vía Gpr/Ras-cAMP-PKA, la ruta glucosa-Snf1 y, por último, la vía de señalización de la
integridad de la pared celular o vía Wsc1-PKC-Slt2 (84) (Fig. 10).
5.1. Regulación de la expresión génica por pH ambiental mediante la vía rim/pal en
Aspergillus y levaduras.
Aspergillus fumigatus destaca por su capacidad para crecer en un amplio rango de valores de
pH ambiental (pH 2-9). Además, ésta capacidad adaptativa resulta esencial para el crecimiento
23
del hongo en el tejido pulmonar y, por tanto, para su virulencia (85). Esto se debe
fundamentalmente a que el sistema de regulación de la expresión génica en función del pH
ambiental regula y condiciona muchos otros sistemas (86), entre los que se cuenta el sistema
regulador de la homeostasis del zinc.
La regulación por pH en Aspergillus ha sido ampliamente estudiada en Aspergillus nidulans (87–
89), si bien hay datos que permiten suponer un alto grado de conservación del sistema en todo
el género (86). La regulación del sistema a nivel transcripcional depende de PacC. Éste factor de
transcripción está formado por 678 aminoácidos (90) consta de 2 dedos de zinc del tipo tCWCH2
y un dedo de zinc del tipo C2H2 en la región N-terminal (concretamente entre el residuo 76 y el
165). Solapando con el tercer dedo de zinc tiene una secuencia de localización nuclear. Además,
consta de 3 regiones denominadas A, B y C (desde el N-terminal al C-terminal) que interaccionan
entre sí manteniendo a la proteína relativamente estable en una conformación “cerrada”
(PacC72) (90–93).
PacC72 se encuentra libre en el citoplasma. Cuando la célula pasa de un medio ácido a uno neutro
o alcalino, se inicia entonces una cascada de transcripción mediada por la ruta pal. PalH se
encuentra en la membrana plasmática y es capaz de detectar el pH alcalino del medio,
reclutando entonces a la arrestina PalF y a la proteína de membrana PalI, encargada de
estabilizar la unión entre PalH y PalF. Como consecuencia de esta interacción, PalF resulta
ubiquitinada (94–97). La ubiquitinación de PalF permite el reclutamiento y unión de PalC a través
de su dominio Bro1 (98) y de Vps23, proteína perteneciente al complejo ESCRT-I (endosomal
sorting complex required for transport I) (99). Estas dos nuevas proteínas permiten a su vez el
Figura 10. Esquema de la regulación en función del pH en S. cerevisiae. Representación esquemática en la que
se muestran las principales rutas y factores implicados en la respuesta a pH alcalino extracelular. Las líneas
discontinuas indican rutas o mecanismos aún pendientes de elucidar. Tomada de Serra-Cardona, A., et al (2015)
24
reclutamiento de otros componentes del ESCRT-I y ESCRT-II, como Vps20, capaz de inducir la
polimerización de Snf7 (89). Esto permite la suma de nuevos elementos de la ruta pal entre los
que se encuentran PalA y PalB. PalA es reclutada por Vps32/Vps20, el cual facilita la interacción
con PalC. La proteasa PalB es reclutada y activada por Vps24 (98, 100, 101). PacC tiene dos
motivos (YPXL/I) flanqueando la “Signaling Protease Box”, la secuencia de reconocimiento de
PalB que orientan correctamente a PacC para que pueda ser procesada por PalB, ya que ésta no
tiene especificidad de secuencia (101).
Así pues, PacC72 es digerida por PalB por un mecanismo dependiente del pH ambiental, para
generar una forma intermediaria llamada PacC53 en la que se ha eliminado el extremo C-terminal
que contiene la región C (102, 103). Esto impide el mantenimiento de la conformación cerrada
y se pasa a una conformación abierta que es fácilmente reconocida y procesada por el
proteasoma. Éste, mediante un mecanismo independiente de pH, elimina completamente la
región B y parte de la A para generar la forma activa de la proteína (PacC27) que corresponde
aproximadamente a los 245 residuos del extremo N-terminal (104) (Fig. 11). Las formas PacC27
y PacC53 entran en el núcleo, donde pueden unirse a la secuencia consenso 5’ GCCARG-3’
presente en los promotores de los genes que regula [en adelante al motivo consenso 5’ GCCARG-
3’ de unión de PacC lo denominamos PR (pH response)].
Este modelo asume que el factor de transcripción, PacC, sólo es funcional cuando el pH es
alcalino y se mantiene en su forma procesada PacC27, manteniendo al margen a las formas
PacC53 y PacC72, aunque recientemente se ha comprobado que PacC72 funciona como represor
de la expresión de su propio gen en medios ácidos (105). La forma PacC27 se uniría entonces a
Figura 11. Representación esquemática de la activación de la ruta pal para el procesamiento de PacC. Cuando
el pH del medio es alcalino, PalH inicia una cascada de transducción que desemboca en el reclutamiento de una
compleja maquinaria que activa el procesamiento proteolítico de PacC.
25
los sitios PR de los genes que regula bloqueando o atenuando la expresión de genes de expresión
a pH ácido e induciendo la de los genes que se expresan a pH alcalino (87, 88). En medios ácidos
PacC72 reprime pacC en colaboración con el factor PacX de manera que el incremento en la
expresión de pacC observada en medios alcalinos no se debe a inducción mediada por PacC sino
a su desrrepresión en ausencia de PacC72 (105). Este sistema permite además mantener un bajo
nivel basal de PacC27 en medios ácidos gracias a que, en ausencia de señal alcalina, una pequeña
proporción de la forma PacC72 podría adquirir espontáneamente una conformación abierta
haciéndola accesible directamente al proteasoma y permitiendo un procesamiento basal
independiente de pH (93, 106).
Algo similar ocurre con Rim101, ortólogo de PacC en S. cerevisiae, si bien éste se procesa en un
único paso de activación proteolítica para dar una forma análoga a PacC53 (107, 108).
Contrariamente al efecto dual de PacC, Rim101 sólo actúa como represor, bien directamente,
desactivando genes de expresión ácida, o bien indirectamente, bloqueando la acción de otro
represor, como por ejemplo Nrg1 o Smp1 (108). En cualquier caso, Rim101 ejerce su acción
uniéndose a la secuencia consenso 5’-TGCCAAG-3’.
El sistema también está descrito en el patógeno oportunista Candida albicans. La regulación por
pH en Candida depende de Rim101, que también se activa por procesamiento proteolítico:
cuando las condiciones son alcalinas, se origina una forma activa de 74 kDa. CaRim101 tiene la
particularidad de que también experimenta procesamiento proteolítico cuando las condiciones
son ácidas para dar una proteína de 65 kDa que parece estar implicada en la regulación de genes
independientes de pH (109). Al contrario que en S. cerevisiae, CaRim101 parece actuar tanto
como activador como como represor de forma directa mediante su un unión a la secuencia
consenso 5’-(G)CCAAGAA-3’ (110, 111).
También se ha encontrado el ortólogo de PacC/Rim101 en Cryptococcus neoformans, otro
hongo patógeno oportunista. Rim101 es esencial en Cryptococcus para la producción de la
cápsula, que es, a su vez, esencial para la virulencia. En este caso también se procesa en dos
pasos de proteólisis pero, al contrario de lo que ocurre en Aspergillus, Candida y Saccharomyces,
su activación no depende sólo de una señal de pH, sino que también de la ruta AMPc/PKA (112).
5.2. Otros reguladores implicados en el control de la expresión génica por pH en
Aspergillus
PacC no es el único factor de transcripción que afecta al crecimiento del hongo en función del
pH ambiental. Ya hemos mencionado anteriormente que la respuesta a cambios en el pH es
compleja e incluye una señal integrada a la que se suman hasta 5 rutas de señalización.
Recientemente, se han descubierto dos factores que son esenciales para el crecimiento de A.
nidulans cuando el pH es alcalino y que parecen responder a estímulos de rutas alternativas a
Pal/Rim: CrzA y SltA (113).
CrzA es un factor de transcripción con dedos de zinc homólogo de Crz1p en S. cerevisiae
implicado en la regulación de la homeostasis del calcio y en la respuesta a estrés alcalino (114).
26
Cuando el pH del medio es alcalino, se activan canales de transporte de calcio de la membrana
(Cch1/Mid1 en S. cerevisiae) (84) induciendo la activación de Calmodulina, que a su vez activa a
la fosfatasa calcineurina. Ésta defosforila CrzA, que se localiza en el citosol. Su defosforilación
permite que sea transportada hacia el núcleo donde reconoce la secuencia consenso 5’-
GNGGC(G/T)CA-3’ gracias a un dominio de unión a ADN situado entre los residuos 469-603 (113).
El pH alcalino también induce la activación de CrzA por mecanismos que aún no han sido
identificados pero que, en todo caso, parecen independientes de la ruta pal (113, 115). Se sabe
que Crz1p regula genes que aparecen en otras rutas de señalización, transporte vesicular y
mantenimiento de la pared celular (116), y que su homólogo en C. albicans participa en la
inducción de filamentación a pH neutro o alcalino (117). Por su parte, un mutante crzA en A.
fumigatus, presenta defectos en tolerancia a pH, temperatura y estrés iónico, así como defectos
en crecimiento polarizado y conidiación y pérdida de virulencia (118).
La distribución del factor SltA parece limitada al subphylum Pezizomycotina y no tiene homólogo
en S. cerevisiae (119). Es un factor de transcripción con tres dedos de zinc tipo C2H2, que
reconoce la secuencia 5′-AGGCA-3’ (113). Está implicado en detoxificación de cationes metálicos
(Na+, K+, Li+, Cs+ y Mg2+) y es esencial para el desarrollo de los esterigmatocistos (120, 121). SltA
se activa por proteólisis gracias a la intervención de SltB, una serín-proteasa similar a
quimiotripsina que se activa a su vez por autoproteolisis. SltA parece inducir la síntesis de SltB y
de sí misma mediante un sistema de retroalimentación positiva. La activación proteolítica de
ambas proteínas no es dependiente de pH y no se conocen los mecanismos que provocan que
los mutantes sltA y sltB no crezcan cuando el pH es alcalino (122).
6. Regulación por pH de genes implicados en la homeostasis del zinc
Hemos visto anteriormente cómo los genes zrfA, zrfB y zrfC, que codifican transportadores de
zinc ubicados en la membrana plasmática de A. fumigatus, poseen en sus promotores sitios de
unión para el factor ZafA, lo que les permite responder a una regulación en función de la
biodisponibilidad de zinc, y sitios de unión para el factor PacC, para responder a una regulación
en función del pH ambiental. Parece claro que, en el caso que nos ocupa, el factor clave para la
inducción de la expresión génica en medios limitantes en zinc es ZafA, ya que ninguno de éstos
genes regulados por ZafA es capaz de expresarse en presencia de zinc, con independencia del
pH ambiental (61, 74, 76). No obstante, en este caso PacC tendría una función moduladora de
la expresión que podría ejercer mediante distintos mecanismos.
Así, si observamos el promotor de zrfB (Fig. 12A y C), encontramos en él 4 supuestos sitios de
respuesta a pH medida por PacC: PR1, PR2, PR3 y PR4 (16, 716, 1044 y 1422 pb upstream del
sitio de inicio de la transcripción). Los tres últimos se encuentran bastante alejados tanto del
codón de inicio como de los sitios ZR (de respuesta a zinc), pero el primero, PR1, se encuentra
en situado entre el sitio de inicio de la transcripción y la probable caja TATA del promotor. Este
particular posicionamiento nos llevó a postular que en condiciones ácidas, el sitio PR1
permanecería desocupado, pero cuando las condiciones son alcalinas, PacC27 se uniría a este
sitio e interferiría de forma directa con la maquinaria de inicio de la transcripción, atenuando
27
notablemente la expresión del gen (74). Uno de los objetivos del presente trabajo será adquirir
datos que sustenten dicha hipótesis y profundizar en el mecanismo de regulación de dicho
promotor.
En lo que respecta al promotor de aspf2-zrfC (Fig. 12B y C), su arquitectura es más compleja. Es
un promotor bidireccional genuino puesto que regula la transcripción de los genes divergentes
aspf2 y zrfC de manera idéntica. El promotor de aspf2-zrfC tiene 3 sitios ZR: ZR1, ZR2, ZR3 (150,
268 y 593 pb upstream del sitio de inicio de la transcripción de zrfC) y 6 sitios PR: PR1, PR2, PR3,
PR4, PR5, y PR6 (168, 188, 293, 305, 313 y 605 pb upstream del sitio de inicio de la transcripción
de zrfC). Estos sitios están dispuestos de tal manera que cada uno de los sitios ZR tiene muy
cerca al menos 1 sitio PR. Esto nos permitió especular sobre la posibilidad de que exista una
regulación cruzada por interacción física entre ambos factores de transcripción (ZafA y PacC) a
nivel del promotor de ZrfC (76).
Adicionalmente se había demostrado previamente que la eliminación por mutagénesis dirigida
de todos los sitios PR del promotor de zrfC permitía la expresión de aspf2 y zrfC a pH ácido en
condiciones limitantes de zinc (76) (Fig. 13). Este hallazgo sugirió una alternativa al modelo
tradicionalmente establecido para el funcionamiento de PacC, proponiendo una posible función
reguladora de la forma completa PacC72 cuando el pH es ácido. Estos datos animan otro de los
Figura 12. Representación esquemática de los promotores de los genes zrfA, zrfB y zrfC, y efecto del pH ambiental sobre su expresión. (A) Patrón de expresión de zrfA y zrfB en condiciones ácidas y alcalinas con y sin limitación en zinc. (B) Patrón de expresión de zrfC y aspf2 en condiciones ácidas y alcalinas con y sin limitación en zinc. (C) Promotores de los genes zrfA, zrfB y zrfC. Los sitios PR se muestran en cajas naranjas y los sitios ZR como cajas negras. La caja TATA más probable de cada gen se representa en amarillo.
28
objetivos del presente trabajo: desentrañar el mecanismo de regulación por pH del promotor
de zrfC.
7. Hipótesis de trabajo y objetivos
Los resultados mostrados en la figura 13 sugieren una posible función represora de PacC sobre
la expresión de zrfC en medios ácidos. Esto no sólo nos brindó la posibilidad de investigar de qué
manera PacC era capaz de ejercer distintas funciones (activadoras y represoras) sobre un mismo
promotor en función de su estado de procesamiento y de posibles interacciones con el principal
regulador del sistema (en este caso ZafA), sino también poder utilizar los conocimientos
adquiridos para revertir la regulación de zrfC con fines prácticos. Dada la importancia que tiene
el sistema de captación de zinc para la virulencia del hongo, resultaría del máximo interés
conocer en profundidad el mecanismo de regulación que gobierna la expresión de los
transportadores de membrana. En particular, teniendo en cuenta la importancia de la expresión
de zrfA, zrfB y zrfC para la virulencia de A. fumigatus, una estrategia para reducir la capacidad
de crecimiento del hongo en los tejidos sería interfiriendo negativamente la regulación de estos
genes. Sin embargo, para ello será esencial conocer con detalle el mecanismo de regulación del
sistema de homeostasis del zinc en A. fumigatus.
Por todo ello, se emprendió este trabajo con el objetivo general de determinar la función de
PacC y, en particular, de las formas PacC72 y PacC27 en la regulación de la expresión de los genes
zrfB y zrfC como prototipos de genes expresados en medios ácidos o alcalinos limitantes en zinc
respectivamente.
Para ello, los objetivos específicos del trabajo fueron:
1. Determinar el patrón de procesamiento de PacC en Aspergillus fumigatus.
Figura 13. Análisis de la función de los sitios PR sobre la expresión de aspf2 y zrfC. (A) Todos los sitios del promotor del aspf2-zrfC se inactivaron mediante mutagénesis dirigida. Los sitios PR se muestran en cajas naranjas y los sitios ZR como cajas negras. La caja TATA más probable se representa en amarillo. (B) Análisis por northern blot de la expresión de zrfC en una cepa con los sitios PR del promotor del gen mutados, lo que permite la expresión de este gen en medios ácidos limitantes en zinc. Imagen tomada de Amich, J. et al. (2010)
29
2. Analizar las variaciones en la regulación de la expresión de los genes de los transportadores
de zinc zrfC y zrfB en respuesta a alteraciones en el patrón de procesamiento de PacC.
3. Determinar si PacC está cumpliendo una función represora sobre zrfC a pH ácido y
caracterizar el promotor bidireccional PzrfC-aspf2.
4. Determinar la función de PacC sobre la regulación de la expresión de zrfB y caracterizar el
promotor de este gen.
5. Determinar si la expresión de zafA o la función del factor regulador ZafA de homeostasis del
zinc en A. fumigatus que codifica, se encuentran influidas por el pH ambiental y si ello
depende de PacC.
6. Proponer un modelo que explique la acción conjunta de PacC y ZafA sobre la regulación de
la expresión de zrfB y zrfC por pH y disponibilidad de zinc.
Materiales y Métodos
87
1. Microorganismos y medios de cultivo empleados
Las cepas de microorganismos utilizadas en este trabajo y sus correspondientes genotipos se
encuentran listados en la Tabla 1.
Tabla 1. Relación de cepas utilizadas
Microorganismo Cepa1 Genotipo2,3 Referencia
E. coli DH5 F– gyrA96 (Nalr) recA1 relA1 endA1 thi-1
hsdR17 (rk-mk
+) supE44 deoR U169 (lacZYA-
argF) [Φ80 lacZM15]
(186)
A. fumigatus CEA17* pyrG1 (pyrGC756G) (187)
AF2511* pyrG1 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI (76)
AF801 zrfC::lacI [PzrfCPR123456 zrfC] (76)
AF14 Wt (46)
AF58 pyrG1 pacC∆15982215::pyrG (76)
AF60 pyrG1 pacC∆15981855::pyrG (76)
AF721 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI (77)
AF731 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfCwt zrfC]
(76)
AF761 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBwt zrfB]
(76)
AF763 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBPR1 zrfB]
Este trabajo
AF765 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBTATA
zrfB]
Este trabajo
AF841 pyrG1 pacC::hisG-pyrG-hisG Este trabajo
AF851* pyrG1 pacC::hisG Este trabajo
AF97 pyrG1 myc3::pacC∆13862215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF992* pyrG1 myc3::pacC∆13862215::Tgst Este trabajo
AF9911 pyrG1 myc3-pacCwt:: Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF9913 pyrG1 myc3-pacC∆15982215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF9915 pyrG1 myc3-pacC∆15981855::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF100 pyrG1 myc3x-pacCwt_Anid::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF9921 pyrG1 V5-pacCwt::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo
AF9925 pyrG1 V5-pacC∆15981855::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo AF9900* pyrG1 myc3-pacCwt::Tgst Este trabajo
AF9923* pyrG1 V5-pacCwt::Tgst Este trabajo
AF110 pyrG1 myc3-pacCwt::Tgst palH::lacI-pyrG-lacI
Este trabajo
AF9926 pyrG1 V5-pacC∆15982215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo AFPR0 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCwt GFP] Este trabajo
AFPR1 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR1 GFP] Este trabajo
AFPR2 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR2 GFP] Este trabajo
AFPR3 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR3 GFP] Este trabajo
AFPR45 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR45 GFP] Este trabajo
AFPR6 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR6 GFP] Este trabajo
AFPR12 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR12 GFP] Este trabajo
AFPR13 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR13 GFP] Este trabajo
AFPR16 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR16 GFP] Este trabajo
AFPR126 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR126 GFP] Este trabajo
AFPR136 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR136 GFP] Este trabajo
AFPR245 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR245 GFP] Este trabajo
88
AFPR2345 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR2345 GFP] Este trabajo
AFPR2456 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR2456 GFP] Este trabajo
AFPR3456 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR3456 GFP] Este trabajo
AFPR123456 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR123456 GFP] Este trabajo
AF8530 pacC::hisG [LUC PzrfCwt GFP] Este trabajo
AF8531 pacC::hisG [LUC PzrfCPR123456 GFP] Este trabajo
AF99230 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBwt GFP] Este trabajo
AF99231 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBPR1 GFP] Este trabajo
AF99232 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBTATA GFP] Este trabajo
AF99233 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBPR1234 GFP] Este trabajo
AF8540 pacC::hisG [LUC PzrfBwt GFP] Este trabajo
AF8541 pacC::hisG [LUC PzrfBPR1 GFP] Este trabajo
AF8542 pacC::hisG [LUC PzrfBTATA GFP] Este trabajo
AF8543 pacC::hisG [LUC PzrfBPR1234 GFP] Este trabajo
A. nidulans MAD2009 WA2 pyroA4 pantoB100 pacC900 (104)
S. cerevisiae ZHY6 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
(55)
HTP1 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
rim101::KanMX6
Este trabajo
HTP12 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
rim101::KanMX6 [URA3, VN-ZafA, PacC72-VC]
Este trabajo
HTP13 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
rim101::KanMX6 [URA3, yEVenus-ZafA]
Este trabajo
HTP14 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
rim101::KanMX6 [URA3, VN-ZafA, PacC72-
VC] [LEU2, PzrfCwt NanoLuc]
Este trabajo
HTP15 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112
trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1
rim101::KanMX6 [VN-ZafA, PacC72-VC]
[LEU2, PzrfCPR123456 NanoLuc]
Este trabajo
1Las cepas de A. fumigatus marcadas con un asterisco son PyrG–, es decir, requieren uracilo y uridina para crecer.
2Los genes situados entre corchetes en las cepas de A. fumigatus se introdujeron entre los genes AFUA_2G08360 (pyrG) y AFUA_2G08350 del genoma de A. fumigatus a la vez que se produce la reparación de la mutación pyrG1, restaurando así su plena capacidad de crecimiento en ausencia de uracilo.
3Los genes situados entre corchetes en las cepas de S. cerevisiae son portados por plásmidos episómicos.
2. Medios de cultivo empleados
Se utilizaron medios de cultivos específicos, sólidos y líquidos, para el crecimiento de los
distintos microorganismos utilizados a lo largo de este estudio: Escherichia coli, Saccharomyces
cerevisiae y Aspergillus.
89
2.1. Medio usado para el cultivo rutinario de Escherichia coli
• Luria Bertani (LB). Su composición es: 10 g/L bacto-triptona (Difco), 5 g/L extracto de levadura,
10 g/L NaCl (pH 7,0). El medio LB selectivo (LB amp) se preparó suplementando el medio LB con
ampicilina (0,1 mg/mL) a partir de un stock de ampicilina (100 mg/mL) conservado a −20ºC. Para
preparar LB sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.
2.2. Medios usados para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae
• Yeast Potato Dextrose (YEPD). Su composición es: 10 g/L extracto de levadura; 20 g/L peptona;
20 g/L glucosa. Para preparar YEPD sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.
• Yeast Potato Raffinose (YEPR). Su composición es: 10 g/L extracto de levadura; 20 g/L
peptona; 20 g/L rafinosa. Para preparar YEPD sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.
Se usó para inducir la producción de proteínas bajo el control del promotor GAL1.
• Synthetic Dextrose Ammonium plus CSM (SDA+CSM). Su composición es: 1,7 g/L YNB without
amino acids, ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa,
5 g/L (NH4)2SO4. El medio se suplementó con la mezcla CSM adecuada según las auxotrofías de
la cepa utilizada: 0,77 g/L CSM-Ura (BIO 101, Inc. #4511-212) o 0,65 g/L CSM-His-Leu-Ura (BIO
101, Inc. #4531-212).
• Synthetic Raffinose Ammonium plus CSM (SRA+CSM). Su composición es: 1,7 g/L YNB
without amino acids, ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L
rafinosa, 5 g/L (NH4)2 SO4. El medio se suplementó con la mezcla CSM adecuada según las
auxotrofías de la cepa utilizada: 0,77 g/L CSM-Ura o 0,65 g/L CSM-His-Leu-Ura.
2.3. Medios usados para el cultivo de Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans
• Aspergillus Minimal Medium (AMM). Su composición es: 10 g/L glucosa, 3 g/L NaNO3, 0,52
g/L MgSO4-7H2O, 0,52 g/L KCl, 1,52 g/L KH2PO4; 1 mL/L solución de elementos traza de Cove
1000. La solución de Cove se preparó con ZnSO4-7H2O o sin él según las necesidades
experimentales. Nuestra solución de Cove contó con las siguientes modificaciones respecto a la
original(188): Sustitución del MnSO4-2H2O (0,8 g/L) por MnSO4-1H2O (0,72 g/L) y del FePO4-2H2O
(0,8 g/L) por FeSO4-7H2O (1,2 g/L).
• Aspergillus Minimal Medium + KCl (AMM+KCl). Se utilizó para el rescate de transformantes
de Aspergillus fumigatus. Se preparó igual que el AMM, pero añadiendo 44,72 g/L de KCl (para
dejarlo a 0,6 M) en lugar de la cantidad estándar.
• Aspergillus Minimal Medium + Uracilo (AMMU). Se utilizó para aislar cepas de A. fumigatus
auxótrofas para uracilo. Se preparó igual que el AMM, pero añadiendo 0,5 g/L de uracilo y 1,2
g/L de uridina.
90
• Aspergillus Minimal Medium + Uracilo + KCl (AMMU+KCl). Se utilizó para cultivar los
protoplastos de A. fumigatus auxótrofos para uracilo en los controles de regeneración de
protoplastos. Se preparó igual que el AMMU, pero añadiendo 44,72 g/L de KCl (para dejarlo a
0,6 M).
• Synthetic Dextrose Ammonium (SDA). Su composición es: 1,7 g/L YNB without amino acids,
ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa, 5 g/L
(NH4)2SO4, 6 M FeSO4-7H2O, 2 M CuSO4-5H2O, 2 M Na2MoO4-2H2O y 0,1 mM ZnSO4-7H2O
(pH ~4,2).
• Synthetic Dextrose Ammonium limitante en Zn (SDA–Zn). Idéntico al anterior, pero omitiendo
el ZnSO4-7H2O.
• Synthetic Dextrose Ammonium EDTA (SDAE): Medio utilizado para incrementar la limitación
en Zinc. Se preparó añadiendo 0,25 mM Na2EDTA al medio SDA–Zn.
• Synthetic Dextrose Nitrate (SDN): 1,7 g/L YNB without amino acids, ammonium sulfate &
without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa, 3 g/L NaNO3, 6 M FeSO4-7H2O,
2 M CuSO4-5H2O, 2 M Na2MoO4-2H2O y 0,1 mM ZnSO4-7H2O. Se ajustó el pH a 7,5 con NaOH
5 M.
• Synthetic Dextrose Nitrate limitante en Zn (SDN–Zn). Idéntico al anterior, pero omitiendo el
ZnSO4-7H2O.
• Synthetic Dextrose Nitrate EDTA (SDNE–Zn): Medio utilizado para incrementar la limitación
en zinc. Se preparó añadiendo 0,25 mM Na2EDTA al medio SDN–Zn.
• Placas de potato Dextrose Agar (PDA): 20 g/L Potato Dextrose Agar (Difco), 20 g/L sacarosa,
2,5 g/L MgSO4-7H2O, 1 mL/L solución 1000× de elementos traza de Cove modificada y 10 g/L de
agar bacteriológico estándar. El pH se ajustó a 6,5 con NaOH 5 M.
• Yeast Peptone Dextrose (YEPD): 10 g/L extracto de levadura, 20 g/L peptona, 20 g/L glucosa.
Para preparar medio sólido en placas Petri, se añadieron 20 g/L de agar bacteriológico estándar.
En todos los casos, a excepción de las placas de PDA y YEDP, para preparar medios sólidos en
placas Petri se añadieron 20 g/L de agar purificado (Cat. 1806.00, Pronadisa).
En general, los medios definidos utilizados para el crecimiento de cepas PyrG– se suplementaron
con 0,5 g/L de uracilo y 1,2 g/L de uridina. Todos los medios y soluciones se esterilizaron en
autoclave a 121º C durante 20 minutos. En todos los casos, la glucosa se esterilizó por separado
en autoclave y después se añadió al medio en condiciones de esterilidad. Los medios se
guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización.
Todos los medios utilizados se prepararon con agua Milli-Q y reactivos de la mejor calidad para
reducir posibles contaminaciones con trazas de zinc. Además, para reducir al mínimo las trazas
de iones metálicos adheridos a las paredes de los recipientes, todo el material utilizado para la
preparación de los medios (probetas, vasos de precipitado, botellas y matraces de cultivo), se
lavaron previamente con una solución de EDTA 3 mM (pH 8,0) y posteriormente se enjuagaron
varias veces con agua Milli-Q antes de su esterilización por calor seco.
91
3. Cultivo de Aspergillus
Para la obtención de conidios frescos de Aspergillus se realizaron resiembras en placas de PDA
a razón de 105 esporas por placa, usando conidios mantenidos a 4°C. Las placas se incubaron a
37 °C durante 3-4 días en atmósfera húmeda. Una vez el hongo había esporulado, se añadió a
las placas una solución acuosa estéril de Tween-20 al 0,1% (v/v) y se raspó la superficie de la
placa suavemente con un asa de cultivo estéril. Las suspensiones de conidios se sedimentaron
por centrifugación a 1500 g durante 10 minutos en tubos estériles de fondo cónico y se lavaron
2 veces con la solución de Tween-20 para eliminar restos de hifas y deshacer posibles agregados
de conidios. Finalmente, los conidios se suspendieron en la solución de Tween-20 al 0,1% y se
calculó su concentración con una cámara cuentaglóbulos “Thoma”. Estas suspensiones frescas
se utilizaron para inocular los distintos medios. Los medios líquidos se inocularon de forma
general con 106 conidios/mL y se incubaron a 37ºC en agitación constante a 200 rpm. Los medios
sólidos se incubaron a 37ºC en atmósfera húmeda durante 3-5 días.
4. Plásmidos usados para generar cepas mutantes de A. fumigatus
Los plásmidos utilizados para generar todas las cepas mutantes de A. fumigatus construidas
durante la elaboración de este trabajo se recopilan en la Tabla 2.
Tabla 2. Plásmidos utilizados para construir cepas mutantes de A. fumigatus
Plásmido Descripción
pZRF220 Porta el gen zrfB bajo el control del PzrfBPR1. Se utilizó para construir la cepa AF761.
pZRF221 Porta el gen zrfB bajo el control del PzrfBTATA. Se utilizó para construir la cepa AF765. pPAC81 Porta la región promotora y la terminadora del gen pacC flanqueando el marcador
hisG-pyrG-hisG. Usado para construir la cepa AF841.
pPAC111 Porta el alelo myc3::pacC∆13862215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF97.
pPAC113 Lleva el alelo pacC silvestre marcado con myc (myc3-pacC) seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9911.
pPAC114 Lleva el alelo mimético alcalino extremo myc3-pacC∆15982215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9913.
pPAC110 Lleva el alelo mimético ácido myc3-pacC∆15981855 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9915.
pPAC9002 Porta el gen pacC silvestre de A. nidulans marcado con myc (myc3x-pacCwt_Anid) bajo el control del promotor de pacC de A. fumigatus, seguida del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF100.
pPAC115 Lleva el alelo silvestre pacC marcado con V5 (V5-pacCwt) seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9921.
pPAC117 Lleva el alelo mimético ácido V5-pacC∆15981855 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9925.
pPALH4 Porta la región promotora y la terminadora del gen palH flanqueando el marcador lacI-pyrG-lacI. Usado para construir la cepa AF110
pPAC116 Lleva el alelo mimético alcalino V5-pacC∆15982215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9926.
pPYRGQ3 Plásmido pPYRGQ3 (76) diseñado para introducir fragmentos de DNA en el locus pyrG entre los genes AFUA_2G08360 (pyrG) y AFUA_2G08350 del genoma de A. fumigatus a la vez que se produce la reparación de la mutación pyrG1.
92
pPYRGQ19.PRn (n = nº de sitio PR inactivado)
Serie de plásmidos basados en el pPYRGQ3 que portan diferentes versiones del promotor de zrfC con distintas combinaciones de sitios PR mutados que controlan la expresión de dos genes reporter, GFP (en lugar de zrfC) y luc (en lugar de aspf2):
[LUC PzrfCwt/PRn GFP]. Se utilizaron para crear la serie de cepas AFPRn (n = nº de sitio PR inactivado) con fondo silvestre y las cepas AF8530 (PzrfCwt) y AF8531
(PzrfCPR123456) con fondo pacC. pPYRGQ31 Versión mejorada del plásmido pPYRGQ3 (76) para incrementar la frecuencia de
recombinación homóloga. pPYRGQ192n PzrfBwt (n=0) PzrfBTATA (n=1) PzrfBPR1 (n=2) PzrfBPR1234 (n=3)
Serie de plásmidos basados en el pPYRGQ31 que portan diferentes versiones del promotor de zrfB con distintas combinaciones de mutaciones (en los sitios PR o en la caja TATA) controlando la expresión de dos genes reporter: GFP (en lugar de zrfB)
y luc (en lugar de AFU2G03850): [LUC PzrfBwt/TATA/PRn GFP] (n = nº de sitio PR). Se utilizaron para crear las series de cepas AF9923n (con fondo silvestre) y AF854n
(con fondo pacC).
5. Obtención de cepas mutantes de Aspergillus fumigatus
Se construyeron cepas mutantes en A. fumigatus mediante la sustitución de genes por versiones
mutadas en los correspondientes loci originales o mediante la inserción dirigida de DNA
transformante en el locus pyrG de una cepa que portaba la mutación pyrG1, para permitir que
ocurra la reparación de dicha mutación y la cepa se convierta en PyrG+. El marcador de selección
usado en todos los casos fue pyrG.
5.1. Obtención de protoplastos de Aspergillus fumigatus
Se inocularon 107 conidios la cepa de interés PyrG– en 50 mL del medio adecuado según su
fenotipo (normalmente AMM) suplementado con uracilo (0,5 g/L), uridina (1,2 g/L) y 0,1 mM de
ZnSO4, y se incubaron durante ~16 horas a 37ºC. Se recogió el micelio por filtración a través de
un filtro Cell strainer (BD Falcon. Ref 352340). Se preparó la solución de protoplastos de la
siguiente manera: A 10 mL de tampón PB (0,75 M KCl, 25 mM citrato/fosfato [pH 5,8]
esterilizado por autoclave y almacenado a temperatura ambiente), se añadieron 0,5 g de
VinoTaste (Novozymes, 2860-689) que se disolvieron por agitación vigorosa en vortex. Tras ello,
se esterilizó la solución a través de un filtro de 0,22 m, se suspendió el micelio en la solución
resultante y se incubó en un matraz durante 2 horas a 30ºC y 120 rpm. Después se comprobó al
microscopio la formación de protoplastos, que se observaban como células redondas de tamaño
variable, no refringentes, vacuolizadas y de color oscuro. La solución se filtró a través de un
embudo con doble filtro Miracloth (Calbiochem 475855) y el filtro se lavó con 25 mL de tampón
KC (0,6 M KCl, 50 mM CaCl [pH 5,8] esterilizado por autoclave y almacenado a 4ºC). Se centrifugó
el filtrado durante 10 minutos a 1200 g a 4ºC. Se retiró el sobrenadante y se suspendió por
agitación muy suave en 15 mL de tampón KC. Se repitió el paso de centrifugación, se
suspendieron los protoplastos sedimentados en 0,4 mL de tampón KC y se comprobó al
microscopio la cantidad y calidad de los mismos. Para ello se añadió sobre un portaobjetos 5 L
de SDS 10% y se comprobó la lisis celular. La mitad de los protoplastos se destinaron a
transformación y la otra mitad a controles.
93
5.2. Transformación de Aspergillus fumigatus
Los plásmidos que portan el ADN transformante (~ 5 g) se digirieron con las enzimas de
restricción adecuadas y éste se purificó mediante una extracción 1:1 (v/v) con fenol-cloroformo-
isoamílico y otra, también 1:1 (v/v) con cloroformo-isoamílico. Posteriormente se precipitó con
0,1 volúmenes de AcNa 3 M (pH 7) y 0,7 volúmenes de isopropanol. El precipitado se lavó con
etanol al 70% y se suspendió en 16 L de agua Milli-Q. Se analizó 1 L en un gel de agarosa al
0,8% para comprobar la cantidad y calidad del ADN.
La solución de ADN transformante se mezcló con 15 L de tampón KC y se añadió sobre 0,2 mL
de solución de protoplastos previamente dispensados en un tubo de 15 mL. Al tubo control se
añadieron 30 L de tampón KC. A continuación, se añadieron 0,5 mL de tampón PEG (30% PEG-
6000 w/v, 0,6 M KCl, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl [pH7,5], esterilizado por autoclave y
almacenado a -20ºC) y se mezcló por suave pipeteo. Se incubaron en hielo durante 30 minutos,
se volvieron a mezclar suavemente con micropipeta y se incubaron otros 30 minutos en baño
de agua a ~25ºC. Finalmente, se añadieron 12 mL de tampón KC, se mezcló suavemente, se
sedimentaron los protoplastos por centrifugación a 1200 g durante 10 minutos a 4ºC y se
repitió el lavado con KC. Por último, se suspendieron los protoplastos en 0,5 mL de tampón KC.
Paralelamente, se prepararon 3 alícuotas fundidas de ~4 mL de AMM+KCl con 0,4% agarosa y 1
alícuota de AMMU+KCl con 0,4% agarosa (suplementado con uracilo y uridina). Estos medios se
mantuvieron fundidos a ~48ºC en un tubo hasta su uso. Los protoplastos transformados se
sembraron del siguiente modo:
*Se añadieron 0,25 mL de protoplastos transformados sobre una alícuota de AMM+KCl con 0,4%
agarosa, se mezcló bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMM+KCl con 1,5%
agar (se hicieron por duplicado).
*Se añadieron 0,25 mL del control sobre una alícuota de AMM+KCl con 0,4% agarosa, se
mezclaron bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMM+KCl con 1,5% agar
(control de contaminación).
*Se añadieron 0,25 mL del control sobre una alícuota de AMMU+KCl con 0,4% agarosa, se
mezclaron bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMMU+KCl con 1,5% agar
(control de regeneración de protoplastos).
Todas las placas se incubaron durante 24 h a 28ºC y posteriormente durante 48 h más a 37ºC en
atmósfera húmeda.
5.3. Selección de mutantes de Aspergillus fumigatus
Aquellas colonias que crecieron en las placas de transformación se resembraron por estría en
una placa de AMM estándar e incubaron durante 48 h a 37ºC. Tras repetir el proceso dos veces
más, colonias bien aisladas se resembraron en placas individuales de PDA para obtener conidios
de varios transformantes independientes.
94
En primer lugar, las cepas se analizaron por PCR para comprobar si habían incorporado
correctamente el ADN transformante. Esta comprobación previa nos permitió reducir
notablemente el número de transformantes que posteriormente analizamos por Southern-blot.
Para poder realizar la PCR obtuvimos mini-preparaciones de ADN genómico a partir de
protoplastos de cada aislado. Para ello, se inocularon los conidios de los distintos aislados con
hisopos estériles en alícuotas de 0,8 mL de SDN+Zn en tubos de 1,5. Se incubaron durante 15
horas a 37ºC en agitación. El micelio se sedimentó por centrifugación, se retiró el sobrenadante,
se añadieron 0,8 mL de tampón PB con VinoTaste (ver apartado 4.1 de materiales y métodos) y
los tubos se incubaron tumbados durante 30 minutos a 37ºC y 120 rpm. Se sedimentaron los
protoplastos a 2000 g durante 5 minutos a 4ºC y se suspendieron en 0,62 mL de tampón de
lisis (20 mM Tris-HCl [pH7,5], 50 mM EDTA, 0,2% SDS). Se incubaron 10 minutos a 37ºC en bloque
térmico. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo/isoamílico y se precipitó con 3,0 M AcNa y 0,7
volúmenes de isopropanol del mismo modo descrito anteriormente. Finalmente, se suspendió
en 30-40 L de agua Milli-Q y se analizó su calidad en un gel de agarosa al 0,8.
5.4. Obtención de cepas PyrG– a partir de cepas mutantes PyrG+
Las construcciones utilizadas para mutar en sus propios loci los genes en estudio portaban el
gen pyrG de Aspergillus niger como marcador de selección flanqueado por dos regiones
idénticas ausentes en el genoma del hongo (Tgst, hisG o lacI). Éstas secuencias permitieron que
ocurriera espontáneamente un proceso de recombinación intracromosomal que eliminara el
marcador pyrG, de manera que las cepas se convirtieron en auxótrofas para uracilo. Para
seleccionar estas cepas se realizaron resiembras sucesivas en medio AMMU suplementado con
1 mg/mL de ácido 5´-fluororótico (5´-FOA) (Fermentas #R0811). Cuando este compuesto se
metaboliza por acción de la orotidina monofosfato decarboxilasa (proteína codificada por el gen
pyrG) se produce 5-fluoro-UMP (5-FUMP) que se convierte en 5-FUDP. Finalmente, el 5-FUDP se
transforma en 5-FUTP o 5-FdUMP. El 5-FUTP se incorpora al mRNA, el cual no se puede traducir
en el ribosoma. Por otra parte, el 5-FdUMP inhibe irreversiblemente la acción de la timidilato
sintasa y, por tanto, la síntesis de dTMP. Por tanto, al perder el gen pyrG, los hongos crecen
normalmente en medio con 5´-FOA, mientras que en presencia del gen pyrG las células fúngicas
se intoxican y dejan de crecer. Las cepas recuperadas se cultivaron en placas AMM y AMMU,
para comprobar que efectivamente habían perdido el gen pyrG. Estas cepas resultaron muy
útiles pues nos sirvieron para poder introducir una segunda mutación en la misma cepa usando
el mismo marcador de selección.
6. Obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos
La obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos de Aspergillus y E. coli se realizó
conforme a los procedimientos experimentales que se describen a continuación.
95
6.1. Obtención de ADN genómico de Aspergillus y análisis por Southern-blot
El ADN genómico de Aspergillus se extrajo a partir de micelio obtenido a partir de 20-40 mL de
medio AMM inoculado con 106 esporas/mL e incubado a 37ºC en agitación (200 rpm) durante
~24 horas. Este micelio se recogió por filtración y se lavó con agua destilada previamente a su
congelación en nitrógeno líquido. El micelio congelado se pulverizó en mortero y al polvo
obtenido se añadieron 1,6 mL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl [pH7,5], 50 mM EDTA, 0,2%
SDS) y 0,16 mL de SDS 10% (w/v). La mezcla se homogenizó por suave pipeteo y se incubó
durante 15 minutos a 65ºC en baño de agua. Tras ello, se añadieron 1,8 mL de tampón de
dilución (50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, [pH 8]). De esta mezcla se extrajeron las proteínas,
restos de pared y otros contaminantes con 1 volumen de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1).
Este paso se repitió hasta que la interfase quedó clara. Se realizó una última extracción con 1
volumen de cloroformo-isoamílico (24:1) y posteriormente se precipitó el ADN a partir de la fase
acuosa añadiendo 0,1 volúmenes de AcNa 3,0 M y 0,7 volúmenes de isopropanol, mezclando
por inversión y centrifugando a 3000 g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se lavó
con etanol al 70% (v/v), se dejó secar al aire, se suspendió en 0,6 mL de 10 mM Tris-ClH (pH 8,0),
se añadieron 10 L de una solución de RNAsa (DNAsa free) (10 mg/mL) y se incubaron a
temperatura ambiente durante 40 minutos. Para comprobar la calidad y cantidad, se analizaron
muestras de 1 L en un gel de agarosa al 0,8% y se guardó el resto a –20ºC hasta su utilización.
El ADN genómico se digirió con las enzimas de restricción adecuadas (~4 µg por muestra) y se
analizó mediante Southern-blot en geles de agarosa al 0,8%. Después se transfirió en
condiciones neutras a membranas de nylon (Hybond, Amersham) mediante capilaridad
siguiendo un protocolo estándar (189). Las sondas usadas para detectar los fragmentos de
interés se marcaron por random priming con dUTP-digoxigenina siguiendo las instrucciones del
DIG DNA Labelling Kit (Roche). La hibridación y detección de las sondas se realizó por
quimioluminiscencia según las instrucciones del DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche).
Los fragmentos de ADN utilizados como sondas para la comprobación de cepas mutantes por
Southern-blot se especifican en las leyendas de las correspondientes figuras en las que se
muestra la construcción y análisis por Southern blot.
6.2. Obtención de ARN total de Aspergillus y análisis por Northern-blot
El ARN total de A. fumigatus se purificó a partir de micelio obtenido por filtración de cultivos de
50 mL del medio correspondiente inoculado con 5 × 107 esporas, e incubados a 37ºC durante 20
horas. Tras recoger el micelio por filtración, se congeló y pulverizó totalmente en un mortero en
presencia constante de nitrógeno líquido. La extracción del ARN se realizó a partir de 100 mg de
micelio pulverizado de acuerdo a las instrucciones del RNeasy Plant mini kit (QIAGEN). El ARN
total (10 µg por muestra) se separó mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes
en geles de agarosa al 1% con 2,2 M de formaldehído. El ARN se transfirió por capilaridad a
membranas neutras de nylon según protocolo estándar (189).
Las sondas para la detección, se prepararon y marcaron radiactivamente siguiendo el siguiente
protocolo: Se desnaturalizaron ~50 ng de ADN de cada sonda en un volumen de 10 L hirviendo
96
10 minutos en baño de agua y se enfriaron rápidamente en hielo. A continuación, se añadieron
al tubo mantenido en hielo: 1L del oligonucleótido de interés (0,5M final), 3 L del dNTP mix
sin dCTP (25M cada uno), 1,5L de [-32P] dCTP (20Ci; 6,66 picomoles final), 2L Buffer
Klenow 10 y 2L Klenow (2 U/L) (Thermo Scientific #EP0054). La mezcla se incubó durante 1
hora a 37ºC en baño de agua.
La membrana con el ARN se pre-hibridó en tampón de hibridación (17,08 g/L NaH2PO4 anhidro,
50,78 g/L Na2HPO4 anhidro, 1 mM EDTA, 7% SDS) durante 1 hora a 65ºC. La sonda marcada
radiactivamente se desnaturalizó durante 10 minutos a 100ºC en bloque térmico y se añadió al
tampón de hibridación. La membrana se incubó con la sonda durante ~20 horas a 65ºC. Las
membranas se lavaron con SSC2 (0,03 M citrato sódico, 0,3 M NaCl, pH 7,0) + 0,1% SDS durante
5 minutos a 42ºC y después con tampón de hibridación 0,5 (diluido con agua) durante 20
minutos a 65ºC. Finalmente, se hizo un nuevo lavado con SSC2 + 0,1% SDS durante 15 minutos
a 65ºC. Las membranas se expusieron a -80ºC con pantalla intensificadora entre 2 horas y 8 días,
según la intensidad de la señal detectada.
Las sondas usadas para detectar la expresión de los diferentes genes se obtuvieron por PCR
usando las parejas de oligonucleótidos y plásmidos molde que se relacionan en la Tabla 3.
Tabla 3. Sondas utilizadas en experimentos de Northern-blot
Gen Tamaño Parejas de oligonucleótidos1 Plásmido
zrfB 507pb ZRFB-D/JA300* pZRF21g
zrfC 510pb ZRFC-D/JA54* pZRF30c aspf2 961pb JA166/JA167* pZRF30c
gfp 556pb JA502/qSGFP-R* pSGFP1
zafA 1037pb JA57/JA58* pZAF14
hisG 867pb JA493/JA494* pHISG
luciferasa 1146pb LUC-D/LUC-R* pLUC1 AFUA_2G03850 416pb JA421/JA422* pZRF21g
1Los oligonucleótidos señalados con un asterisco fueron los utilizados en la reacción de marcaje.
A partir de los datos por northern blot, se realizó una cuantificación relativa de la expresión de
cada gen usando Fiji, un paquete de procesamiento de imagen basado en ImageJ (190). Para ello
se digitalizaron las imágenes de las autorradiografías y las imágenes del ARN 18S obtenidas a
partir del análisis del ARN total de la muestra en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Fiji
permite medir la intensidad de la señal en una determinada área, de modo que nos permitió
cuantificar con valores absolutos las intensidades tanto de las señales radiactivas, como de sus
respectivos controles. Los datos obtenidos se normalizaron dividiendo el valor de la señal
radiactiva por su respectivo control. El cociente se representó mediante un gráfico de barras.
6.3. Obtención de ADN plasmídico de Escherichia coli y análisis de restricción
La obtención de mini-preparaciones de ADN plasmídico de E. coli se realizó mediante el
procedimiento estándar de lisis alcalina. Se dispensaron alícuotas de 1 mL de LB+amplicilina en
tubos de 1,5 mL y se inoculó cada uno con una colonia bien aislada de la cepa de interés. Se
97
incubaron durante 15 horas a 37ºC a 200 rpm. Tras ello, las células se sedimentaron por
centrifugación a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa y se retiró el medio por
aspiración con bomba de vacío. Las células se suspendieron en 0,1 mL de tampón P1 (50 mM
Tris-HCl [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,25 mg/mL RNAsa), se añadieron 0,1 mL de tampón P2 (0,2 M
NaOH, 1% SDS) y se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente. Tras esto, se añadieron 0,1
mL de tampón P3 (3 M AcK pH 5,5), se mezclaron bien y se centrifugaron 10 minutos a 16000
g. Tras ello se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se precipitó el ADN usando
isopropanol/etanol, tal y como se ha descrito previamente (ver apartado 4.2 de Materiales y
métodos).
Los análisis de restricción de ADN plasmídico se realizaron de manera estándar en tubos de 1,5
mL añadiendo los distintos componentes de la reacción en el orden y cantidades señaladas en
la Tabla 4.
Tabla 4. Reacción prototípica para un análisis de restricción estándar
Orden Componente Cantidad total por reacción
Volumen
1º H2O - 42 L
2º Tampón 10 1 5 L
3º Solución de ADN 0,2-1,5 mg 2 L
4º Enzima de restricción (10 U/L) 10 unidades 1 L
Total 50 L
7. Extracción y análisis por Western-blot de proteínas totales de Aspergillus
Los extractos de proteínas totales de Aspergillus se obtuvieron a partir de muestras de micelios
obtenidos por filtración de cultivos de 50 mL inoculado con 5 × 107 esporas e incubados a 37ºC
durante 18-20 horas. Tras recoger los micelios por filtración, se hicieron alícuotas de 100 mg de
micelio (peso húmedo), se congelaron con nitrógeno líquido y se liofilizaron. A las muestras de
micelios liofilizadas se añadieron 300 mg de Glasperlen de 0,4-0,6 mm de diámetro (Braun
Biotech, BBI-8541701) y se rompieron en FP120 Fast Prep (Bio101/Savant) mediante 3 pulsos de
20 segundos a máxima velocidad. Una vez pulverizados, se añadió 1 mL de tampón de lisis (0,2
M NaOH, 0,2% (v/v) 2-mercaptoetanol) por muestra de micelio pulverizado, se agitaron
vigorosamente al vortex, se extrajo la fracción líquida a la cual se añadieron 75 L de TCA al
100% (w/v) y se incubaron durante 10 minutos en hielo. Tras sedimentar las proteínas por
centrifugación durante 5 minutos a 16000 g, se retiró el sobrenadante, el pellet se lavó con
una solución de TCA al 0,2% y se suspendió en 0,2 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8,5). Para comprobar
la cantidad y calidad de las proteínas extraídas, alícuotas 2 L de cada extracto se suspendieron
en tampón de electroforesis desnaturalizante 4 (0,25 M Tris-HCl [pH 6,8], 8% SDS, 40 mM DTT,
40% Glicerol, trazas de azul de bromofenol) y se analizaron mediante electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE, T = 12%; 30 mA por gel) según el protocolo
estándar (189).
Para realizar el análisis por Western-blot las distintas muestras de proteínas se separaron
mediante SDS-PAGE (T = 12%) y se transfirieron durante una hora a una membrana de PVDF
previamente humedecida en metanol aplicando una corriente de 300 mA en presencia de
98
tampón de transferencia (20 mM Tris, 0,19 M Glicina, 10% (v/v) Metanol). El éxito de las
transferencias se comprobó gracias al uso de marcadores de peso molecular pre teñidos (Page
Ruler Prestained Plus, Thermo Scientific, #26619), que pueden verse a simple vista. Tras ello, las
membranas se bloquearon con una solución de leche en polvo desnatada al 5% (w/v) durante
30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió a la solución de bloqueo la cantidad
recomendada del anticuerpo adecuado y se incubó ~18 horas a 6-8ºC en una noria con suave
agitación. En caso de ser necesaria la adición de un anticuerpo secundario, la membrana se lavó
3 veces durante 10 minutos con tampón TBST (10 mM Tris-HCl [pH7,5], 150 mM NaCl, 0,2% (v/v)
Tween-20) para quitar el exceso de anticuerpo primario, se añadió la cantidad adecuada del
anticuerpo secundario correspondiente sobre el propio tampón y se incubó durante 90 minutos
a temperatura ambiente en suave agitación. Los anticuerpos utilizados en este trabajo se
encuentran recopilados en la Tabla 5. En cualquier caso, como paso previo al revelado las
membranas se lavaron 3 veces durante 10 minutos con tampón TBST y una vez con TBS (TBST
sin Tween-20). En todos los casos, se procedió al revelado quimioluminiscente usando el kit
WesternBright ECL (Advansta, K-12045-D50) sobre películas CL-XPosure Film (Thermo Scientific,
#34089) y usando una máquina de revelado M35 X-OMAT (Kodak).
Tabla 5. Anticuerpos utilizados
Anticuerpo Especificaciones Fuente
Anti-c-myc-Peroxidase
Monoclonal (clon 9E10) primario producido en ratón y conjugado a peroxidasa. No necesita secundario
Roche (ref. 11814150001)
Anti-GFP, C-terminal
Monoclonal primario producido a partir de células de ratón. Reconoce el extremo C-terminal de la GFP
BD living colors JL-8 (ref. 8371-2)
Anti-GFP, N-terminal
Policlonal primario producido en conejo frente al epítopo 3-17 de la GFP y conjugado al hapteno KLH
Sigma (ref. G1544)
Anti-V5 tag Monoclonal primario producido a partir del clon SV5-Pk1 en células de ratón. Reconoce el epítopo: IPNPLLGL
Bio Rad (ref. MCA1360)
Anti-actin (C-2) Monoclonal primario producido a partir de células de ratón. Reconoce el epítopo 350-375 del C-terminal de la actina humana (100% identidad con la de A. fumigatus)
Santa Cruz Biotech (ref. sc-8432)
Anti-mouse IgG (H+L)-Peroxidase
Policlonal secundario producido en caballo y conjugado a peroxidasa
Enzo life Sciences (ref. VC-PI-2000-M001)
Anti-rabbit IgG (H+L)-Peroxidase
Policlonal secundario producido en cabra y conjugado a peroxidasa
BioRad (ref. 170-6515)
8.- RT-q-PCR
Se usó la técnica conocida como Real Time Quantitative PCR para cuantificar de forma más
precisa los niveles de expresión de zrfB, zrfC y zafA en distintas cepas.
Extractos de ARN obtenidos por el método detallado en el apartado 6.2 de esta sección se
cuantificaron por espectrofotometría con NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y se igualaron a
una concentración de 150 ng/L. Tras ello, se eliminaron los restos de ADN de la muestra con
1,5g de RQ1 RNAse free DNAse I (Promega, M6101) y siguiendo las instrucciones del
99
fabricante, y se comprobó su eliminación realizando una PCR convencional para el gen de interés
de cada muestra, en la que no se observó amplificación.
Posteriormente se procedió a la síntesis de cDNA a partir de cada muestra por random priming
usando la SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18064-014) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
La cuantificación se realizó mediante el método Ct usando como control el valor del ARN 18S
en cada muestra. Para ello, una vez obtenido el cDNA, se preparó una dilución 1/4 del mismo
para medir los genes de interés, y una dilución 1/1600 para medir el ARN 18S. Las reacciones de
RT-q-PCR se prepararon con: 5 L de SYBR Premix Ex Taq (TAKARA, RR420A), 0,25 L de cada
oligo (6 M) 2,5 L de agua MilliQ y 2 L de muestra. Se hicieron duplicados de cada muestra.
Las parejas de oligos utilizadas (Tabla 6) habían sido validadas con anterioridad mediante la
cuantificación de diluciones seriadas de ADN genómico de Aspergillus.
La reacción y la medición de los resultados se realizó con CFX96 Real-Time System (Bio Rad) (39
ciclos: 10’ a 95ºC; 20’ a 59ºC; 20’ a 72ºC). La normalización de los datos se realizó mediante la
aplicación de la fórmula (2Ct problema – Ct 18S).
Tabla 6. Oligonucleótidos usados para RT-q-PCR
Nombre Secuencia (5’ 3’) ZAFA-D1 GGCAAGTCATTTACCGACAGC
ZAFA-R1 TCGATGACTTGACATGTTGGACG
ZRFB-D ACCGGCAGAAGAAGCATTGA
ZRFB-R ACCGCATCACCATCAACTCA
ZRFC-D CAAACTCTCGGTGCTCGTCA ZRFC-R GAAGACAATCACCACCAGCA
18SRNA-D TGTTAAACCCTGTCGTGCTG
18SRNA-R GTACAAAGGGCAGGGACGTA
9.- Técnicas de ingeniería genética utilizadas rutinariamente
Se usó la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) y se realizaron digestiones de plásmidos
con enzimas de restricción y reacciones de ligación para procedimientos rutinarios de clonación
y subclonación de fragmentos de ADN mediante transformación de E. coli.
9.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR se utilizó con mucha frecuencia para obtener fragmentos de ADN genómico y para la
comprobación de mutantes. Para el primer caso se utilizó el enzima Pfu Turbo DNA Polimerase
(Thermo Scientific #EP0501), mientras que para reacciones rutinarias de comprobación de
mutantes se utilizó la Taq DNA Polimerase (New England Biolabs, #M0267L). Las reacciones de
PCR se prepararon según se describe en la Tabla 7. Los oligonucleótidos utilizados en la
realización de este trabajo se encuentran recopilados en la Tabla 8.
100
Las temperaturas de anillamiento de los distintos oligonucleótidos (entre 54-61ºC), se calcularon
para cada caso usando la herramienta Oligo Analyzer (http://eu.idtdna.com/calc/analyzer), disponible online. La temperatura de elongación siempre fue 72ºC, excepto en los casos en que el amplicón fue > 2,5 kb en cuyo caso la temperatura de elongación fue de 70ºC. La duración de
las reacciones de elongación fue de 1 minuto por kilopar de bases (kb) (para la Taq polimerasa) o de 2 minutos por kb (para la Pfu polimerasa). El nº total de ciclos osciló entre 32 y 35.
1Alternativamente se añadieron 0,5 L de la Pfu DNA polimerasa (2,5 U/L)
Tabla 8. Oligonucleótidos
Nombre Secuencia (5’ 3’) ZRFB-D ACCGGCAGAAGAAGCATTGA
ZRFC-D CAAACTCTCGGTGCTCGTCA
LUC-D TCCATGTACACCTTCGTCACCT
LUC-R CTTCTTGGCCTTGATCAGGATCTC qSGFP-R GACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTC
JA15 GAAGAATGATCAGAGGAGTGG
JA54 GATTCGTTAACAGCTTCAGAGCAAACAAGG
JA57 TACTTCCGTCGTCGACCATCG
JA58 CCGTGTGCGTCCGTGAATGCG JA109 CATCTACACTGCTCTTGTGGAGC
JA153 ACTAGTCCGGAGCCTCCGCGTC
JA157 ATCAGCATAAGCACGAGGG
JA166 ATGTCTAGAATAATGGCTGCTCTCCTCCG
JA167 GATATCGGATCCTCGCCTAAGTGC JA197 TGTCTCCATCCAGATTGGCACGC
JA205 TGCTTCTCCAGCTTCGGATCC
JA240 TGGAGGGTTAACGGACGTCGTCTGCC
JA281 TGGGAGAGGAACTCTTGG
JA298 AGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
JA300 AGTGAAGCGTTTCGAGTTGGGC JA400 CCCGGGAATTCAAAACTCGGGAAG
JA401 TCTAGACGAGCATCATCCCCCATGGT
JA403 ACTAGTGAATTCACCTGACCGGGA
JA404 ACTCGTAGATCCGCACACATCG
JA415 GATATCTTGTACATACTTTTCTCTGCCC JA421 AGATGATTTCGAGGTCGCCTTGT
JA422 GAGCTCTCGCCTTATTGCCCTT
JA436 CAGTACTACCACCGCTTTGTTG
JA437 CAGTATAGCGACCAGCATTCAC
JA463 GAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTAC JA493 GCGCGATACAGACCGGTTCAGAC
JA494 CAGAACAACGTTTCGCTGCTGACCA
Tabla 7. Reacción típica de PCR
Orden Componente Cantidad
1º H2O 19,375 – x L 2º PCR buffer (10) con Mg2+ 2,5 L 3º Oligonucleótido A (10 M) 1,25 L
4º Oligonucleótido B (10 M) 1,25 L 5º Dilución del ADN molde x L 6º dNTPs (10 mM de cada) 0,5 L 7º Taq DNA polimerasa (5 U/L)1 0,125 L
Total 25 L
101
JA498 GAGAGCTAGCCATTGGCAACGGAG JA499 AGCCATCAAGATGCATGGTTCGTTTGT
JA502 GCGACGTAAACGGCCACAAGTTC
JA505 GCCGTTAGGGATATCTGCAATGAGTGCGT
9.2. Mutagénesis dirigida
Para la creación de las distintas versiones mutadas de los promotores de zrfB y zrfC se utilizó la
técnica de mutagénesis dirigida sobre plásmidos. Para ello, un plásmido que portaba el
fragmento de ADN que se deseaba modificar se sometió a una reacción de PCR para amplificar
todo el plásmido con dos oligonucleótidos complementarios que portaban hacia la mitad de su
secuencia la mutación que se deseaba introducir. Para este propósito se utilizó el enzima Pfu
Turbo DNA Polimerase (Thermo Scientific #EP0501). En este caso, a diferencia de las reacciones
de PCR estándar, se realizaron tan sólo 15-16 ciclos a una temperatura de elongación de 68ºC,
con un tiempo de elongación de 2 minutos por kilobase a amplificar y una temperatura de
anillamiento de 55ºC. Tras ello, se comprobó que la amplificación había funcionado
correctamente analizando 10 L de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 0,8%, y después
se añadió a la reacción 1 L de la enzima de restricción DpnI (10 U/L) y se incubó a 37º durante
90 minutos para eliminar restos del plásmido original. Por último, se usaron 5 L de la solución
final para transformar E. coli DH5
9.3. Clonación de fragmentos de PCR
Los amplicones obtenidos mediante PCR se purificaron conforme a las instrucciones descritas
en QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen, 28706). Los fragmentos de PCR purificados que habían
sido obtenidos con la Taq DNA polimerasa, que no tienen actividad exonucleasa 3’5’, se
clonaron de forma sistemática mediante el procedimiento del TA-cloning en el plásmido pGEM-
T-easy (Promega, A137A). Los fragmentos de PCR purificados obtenidos con la Pfu DNA
polimerasa, que al contrario que la Taq DNA polimerasa si exhibe actividad exonucleasa 3’5’,
se incubaron a 72ºC durante 15 minutos en presencia de 0,2 mM dATP y 5 unidades de Taq DNA
polimerasa para añadir un nucleótido de adenina en cada extremo 3’ con el fin de hacer posible
su posterior clonación mediante el procedimiento del TA-cloning en el plásmido pGEM-T-easy
(Promega, A137A). En todos los casos, las reacciones de ligación de los distintos fragmentos de
ADN a los plásmidos de interés se realizaron utilizando las condiciones del prospecto de la T4
DNA ligase (Thermo Scientific, #EL0011).
9.4. Transformación de células competentes de Escherichia coli
Todos los plásmidos construidos se rescataron transformando la cepa DH5 de E. coli. Para
transformar esta bacteria se añadieron 5 L de cada reacción de ligación a 0,1 mL de una
suspensión de células competentes (DO600nm = 10). Esta mezcla se incubó durante 30 minutos en
102
hielo, tras lo cual se le aplicó un choque térmico transfiriendo los tubos a un baño de agua a
42ºC durante 1 minuto y después a hielo durante 1 minuto. Se añadieron 0,8 mL de medio LB
líquido y se incubaron 1 hora a 37ºC a 200 rpm antes de sembrarlas por extensión en medio
selectivo (LB+ampicilina). Además, los plásmidos construidos utilizando el p-GEM-T-easy
(Promega, A137A) se seleccionaron por -complementación sobre placas de LB+ampicilina
suplementadas con 32L de Bluo-Gal (25 mg/mL) y 3L de IPTG 1 M. Todas las placas se
incubaron a 37ºC durante 15 horas, se re-seleccionaron varios transformantes independientes,
se obtuvieron mini-preparaciones de DNA plasmídico y se realizó un análisis de restricción con
las enzimas adecuadas para comprobar si el plásmido que portaban era el esperado. Finalmente,
se guardaron stocks en glicerol a –80ºC de las cepas de E. coli con las construcciones adecuadas.
10. Plásmidos utilizados para generar cepas mutantes de S. cerevisiae
Los plásmidos utilizados para generar todas las cepas mutantes de S. cerevisiae construidas
durante la elaboración de este trabajo se recopilan en la Tabla 9.
Tabla 9. Plásmidos para transformar Saccharomyces cerevisiae
Plásmido Descripción Referencia
pRS425 Vector episómico para levadura derivado del pBLUESCRIPT II que porta el marcador auxotrófico LEU2.
(191)
pRS426 Vector episómico para levadura derivado del pBLUESCRIPT II que porta el marcador auxotrófico URA3.
(191)
pRIM2 Porta el marcador KanMX6 flanqueado por la región promotora y terminadora de gen RIM101 de S. cerevisiae. Se utilizó para construir la cepa HTP1.
Este trabajo
pPZ1 Derivado del pRS426. Porta las regiones codificantes de V5-pacCwt-VC155 y VN173-ZafA, ambas bajo el control del promotor GAL1. Se utilizó para construir la cepa HTP12.
Este trabajo
pZAF146 Derivado del pRS426. Porta la región codificante de vEGFP-ZafA bajo el control del promotor GAL1. Se utilizó para construir la cepa HTP13 (cepa control).
Este trabajo
pASPF2-ZRF34 Derivado del pRS425. Porta la región codificante de la luciferasa NanoLuc (136) bajo control del PzrfCwt y del terminador ADH1. Se utilizó para construir la cepa HTP14.
Este trabajo
pASPF2-ZRF35 Derivado del pRS425. Porta la región codificante de la luciferasa NanoLuc (136) bajo control del PzrfCPR123456 y del terminador ADH1. Se utilizó para construir la cepa HTP15.
Este trabajo
11. Construcción de cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae
Se cultivaron las cepas de S. cerevisiae deseadas en 50 mL de medio YEPD a 30ºC durante el
tiempo necesario hasta que las células alcanzaron el inicio de la fase de crecimiento exponencial.
En este momento las células se sedimentaron a 3000 g durante 5 minutos y se lavaron una vez
con agua Milli-Q estéril y otra vez con el tampón TE/LiAc (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1 M
LiAc [pH7,5]). Tras ello se suspendieron de nuevo en 0,5 mL de tampón TE/LiAc y se hicieron
103
alícuotas de 50 L de la suspensión de células en tubos de 1,5 mL. Para cada transformación se
añadieron ~1 g de ADN transformante (ADN lineal o plasmídico) disuelto en agua, 5L de
Salmon sperm DNA (10 mg/mL) (Thermo-Fischer Scientific, 15632-011) y 0,3 mL de PEG 4000 al
50% (w/v) (Merck, 25322-68-3). Esta mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC en agitación.
Posteriormente se le aplicó un choque térmico a 42ºC en baño de agua durante 15 minutos, se
sedimentaron las células por centrifugación a 10000 g durante unos segundos, se retiró el
sobrenadante, se suspendieron las células en tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH7,5]),
se sembraron en placas de medio selectivo y se incuban 48 horas. Tras este periodo de
incubación, se reaislaron los transformantes en medio selectivo fresco antes de proceder a su
análisis.
La selección de la cepa de S. cerevisiae HTP1, se realizó en placas de YEPD acidificado (pH ~ 5
con HCl) suplementado con 200 g/mL geneticin (G418) y 0,2 mM ZnSO4. Las demás cepas
mutantes de S. cerevisiae (HTP12-15) se seleccionaron en medio SDA suplementado con 1 mM
ZnSO4 y la mezcla CSM drop-out adecuada.
Las cepas de interés se inoculan en 1 mL de YEPD dispensados en tubos de 1,5 mL que se
cultivaron tumbados durante 18-20 h a 28ºC en agitación. Las células se sedimentaron por
centrifugación, se retiró el sobrenadante y se suspendieron en 0,15 mL de tampón P1 (50 mM
Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM EDTA), se añadieron 0,15 mL de tampón P2 y se incubaron a 65ºC
durante 20 minutos. Tras haberlos dejado enfriar se añadieron 0,15 mL de tampón P3 y la
suspensión del ADN genómico se clarificó centrifugando a 20000 g durante 20 minutos a 4ºC.
A continuación, 0,4 mL de los sobrenadantes clarificados se transfirieron a tubos nuevos y el
ADN genómico se precipitó con AcNa/isopropanol, según se ha descrito. El ADN se suspendió en
15 L de 10 mM Tris-ClH (pH 8,0) y se analizó su calidad por electroforesis en geles de agarosa
0,8%.
12. Ensayo de BiFC in vivo en Saccharomyces cerevisiae
Para analizar la posible interacción entre PacC72 y ZafA in vivo a nivel de ADN en el promotor de
zrfC se utilizó la técnica de complementación por bifluorescencia molecular (BiFC). Para ello se
generó una cepa de S. cerevisiae que co-expresaba versiones marcadas de ambas proteínas:
PacC72::VC, en la que PacC72 llevaba fusionada en su extremo carboxilo el dominio C-terminal de
la proteína Venus-EYFP (192) (VC155) (133), y VN::ZafA, que llevaba fusionada en su extremo
amino el dominio N-terminal de la proteína Venus-EYFP (VN173) (133).
Para inducir la producción de proteínas en las cepas de S. cerevisiae bajo el control del promotor
GAL1, se inocularon dichas cepas en 10 mL de medio YEPR y se incubaron a 28ºC durante ~24
horas. Posteriormente se recogieron las células por centrifugación a 3000 g durante 5 minutos,
se retiró el sobrenadante y se inocularon en 50 mL de medio SRA suplementado con 1 M ZnSO4
y el CSM drop-out adecuado según las auxotrofías, y se incubaron 24 horas a 28ºC. Tras ello, el
cultivo se repartió en dos matraces y a uno de ellos se indujo la expresión añadiendo 2%
galactosa; así resultaron dos cultivos, SRA+Gal y SRA–Gal que se incubaron durante 14 h más
antes de repartirse de nuevo cada uno en dos matraces, uno de los cuales se suplementó con
100 M ZnSO4. Finalmente, tras 6 horas de incubación a 28ºC a 200 rpm se midió la DO600nm de
104
todos los cultivos, se prepararon suspensiones iguales de células con una DO600nm = 1, se
sedimentaron por centrifugación, se suspendieron en 0,1 mL de tampón de BiFC (NaPO4 [pH
8,0], 0,15 M NaCl, 5% glicerol), se dispensaron en una placa multipocillo negra y se midió en un
lector de placas Varioskan Flash (Thermo Scientific) tras excitación a 485 nm y emisión a 528 nm
durante 1 segundo y con excitación a 515 nm y emisión a 528 nm durante 1 segundo tras la
excitación. Se realizaron 3 mediciones de cada pocillo a intervalos de 2 minutos.
Bibliografía.
107
1. O’Gorman CM, Fuller HT, Dyer PS. 2009. Discovery of a sexual cycle in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Nature 457:471–474.
2. Latgé J-P. 2003. Aspergillus fumigatus, a saprotrophic pathogenic fungus. Mycologist 17:56–61.
3. Ibrahim-Granet O, Philippe B, Boleti H, Boisvieux-Ulrich E, Grenet D, Stern M, Latge JP. 2003. Phagocytosis and intracellular fate of Aspergillus fumigatus conidia in alveolar macrophages. Infect Immun 71:891–903.
4. Hasenberg M, Behnsen J, Krappmann S, Brakhage A, Gunzer M. 2011. Phagocyte responses towards Aspergillus fumigatus. Int J Med Microbiol 301:436–444.
5. Bruns S, Kniemeyer O, Hasenberg M, Aimanianda V, Nietzsche S, Thywissen A, Jeron A, Latgé J-P, Brakhage AA, Gunzer M. 2010. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog 6:e1000873.
6. McCormick A, Heesemann L, Wagener J, Marcos V, Hartl D, Loeffler J, Heesemann J, Ebel F. 2010. NETs formed by human neutrophils inhibit growth of the pathogenic mold Aspergillus fumigatus. Microbes Infect 12:928–936.
7. Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhlemann Y, Weiss DS, Weinrauch Y, Zychlinsky A. 2004. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science (80- ) 303:1532–1535.
8. Stergiopoulou T, Meletiadis J, Roilides E, Keiner DE, Schaufele R, Roden M, Harrington S, Dad L, Segal B, Walsh TJ. 2007. Host-Dependent Patterns of Tissue Injury in Invasive Pulmonary Aspergillosis. Am J Clin Pathol 349–355.
9. Tekaia F, Latgé J-P. 2005. Aspergillus fumigatus: saprophyte or pathogen? Curr Opin Microbiol 8:385–392.
10. Casadevall A, Pirofski L. 2001. Host-pathogen interactions: the attributes of virulence. J Infect Dis 184:337–344.
11. Krappmann S. 2016. How to invade a susceptible host: cellular aspects of aspergillosis. Curr Opin Microbiol 34:136–146.
12. Quereshi S, Paralikar P, Pandit R, Razzaghi-Abyaneh M, Kon K, Rai M. 2016. Chapter 12 – Pulmonary aspergillosis: diagnosis and treatmentThe Microbiology of Respiratory System Infections. Elsevier Inc.
13. Latgé J. 1999. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev 12:310–350.
14. Munoz P, Singh N, Bouza E. 2006. Treatment of solid organ transplant patients with invasive fungal infections: should a combination of antifungal drugs be used? Curr Opin Infect Dis. 19:365–370.
15. Singh N, Paterson DL. 2005. Aspergillus infections in transplant recipients. Clin Microbiol Rev 18:44–69.
16. Steinbach WJ, Juvvadi PR, Fortwendel JR, Rogg LE. 2011. Newer combination antifungal therapies for invasive aspergillosis. Med Mycol 49 Suppl 1:S77-81.
17. Van Der Linden JWM, Camps SMT, Kampinga GA, Arends JPA, Debets-Ossenkopp YJ, Haas
108
PJA, Rijnders BJA, Kuijper EJ, Van Tiel FH, Varga J, Karawajczyk A, Zoll J, Melchers WJG, Verweij PE. 2013. Aspergillosis due to voriconazole highly resistant Aspergillus fumigatus and recovery of genetically related resistant isolates from domiciles. Clin Infect Dis 57:513–520.
18. Hood MI, Skaar EP. 2012. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen–host interface. Nat Rev Micro 10:525–537.
19. Corbin BD, Seeley EH, Raab A, Feldmann J, Miller MR, Torres VJ, Anderson KL, Dattilo BM, Dunman PM, Gerads R, Caprioli RM, Nacken W, Chazin WJ, Skaar EP. 2008. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science 319:962–5.
20. Vignesh KS, Landero Figueroa JA, Porollo A, Caruso JA, Deepe GS. 2013. Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor-induced Zn Sequestration Enhances Macrophage Superoxide and Limits Intracellular Pathogen Survival. Immunity 39:10.1016/j.immuni.2013.09.006.
21. Vignesh KS, Landero Figueroa JA, Porollo A, Caruso JA, Deepe GS. 2013. Zinc Sequestration: Arming Phagocyte Defense against Fungal Attack. PLoS Pathog 9:e1003815.
22. Botella H, Peyron P, Levillain F, Poincloux R, Poquet Y, Brandli I, Wang C, Tailleux L, Tilleul S, Charrire GM, Waddell SJ, Foti M, Lugo-Villarino G, Gao Q, Maridonneau-Parini I, Butcher PD, Castagnoli PR, Gicquel B, De Chastellier C, Neyrolles O. 2011. Mycobacterial P 1-Type ATPases mediate resistance to Zinc poisoning in human macrophages. Cell Host Microbe 10:248–259.
23. Ganz T. 2009. Iron in Innate Immunity: Starve the Invaders. Curr Opin Immunol 21:63–67.
24. Jenssen H, Hancock REW. 2009. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91:19-29
25. Ganz T. 2007. Molecular control of iron transport. J Am Soc Nephrol 18:394–400.
26. Abergel RJ, Clifton MC, Pizarro JC, Warner JA, Shuh DK, Strong RK, Raymond KN. 2008. The siderocalin/enterobactin interaction: A link between mammalian immunity and bacterial iron transport. J Am Chem Soc 130:11524–11534.
27. Fritsche G, Nairz M, Theurl I, Mair S, Bellmann-Weiler R, Barton HC, Weiss G. 2008. Modulation of macrophage iron transport by Nramp1 (Slc11a1). Immunobiology 212:751–757.
28. Byrd T, Horwitz MA. 1989. Interferon gamma-activated human monocytes downregulate transferrin receptors and inhibit the intracellular multiplication of Legionella pneumophila by limiting the availability of iron. J Clin Invest 83:1457–1465.
29. Kambe T, Yamaguchi-Iwai Y, Sasaki R, Nagao M. 2004. Overview of mammalian zinc transporters. Cell Mol Life Sci C 61:49–68.
30. Papanikolaou G, Pantopoulos K. 2005. Iron metabolism and toxicity. Toxicol Appl Pharmacol 202:199–211.
31. Bullen JJ, Rogers HJ, Spalding PB, Ward CG. 2006. Natural resistance, iron and infection: a challenge for clinical medicine. J Med Microbiol 55:251–258.
109
32. Tapiero H, Tew KD. 2003. Trace elements in human physiology and pathology: zinc and metallothioneins. Biomed Pharmacother 57:399–411.
33. Andreini C, Bertini I, Cavallaro G, Holliday GL, Thornton JM. 2008. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. JBIC J Biol Inorg Chem 13:1205–1218.
34. Calera JA, Haas H. 2009. Cations (Zn, Fe), p. 107–129. In Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. American Society of Microbiology.
35. Auld DS. 2001. Zinc coordination sphere in biochemical zinc sites. Biometals 14:271–313.
36. Krishna SS, Majumdar I, Grishin N V. 2003. Structural classification of zinc fingers. Nucleic Acids Res 31:532–550.
37. Prasad AS. 1993. Essentiality and toxicity of zinc. Scand J Work Env Heal 19 Suppl 1:134–136.
38. Outten CE, Halloran T V. 2001. Femtomolar Sensitivity of Metalloregulatory Proteins Controlling Zinc Homeostasis. Science (80- ) 292:2488 LP-2492.
39. Eide DJ. 2006. Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc. Biochim Biophys Acta 1763:711–22.
40. Gaither L a, Eide DJ. 2001. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals 14:251–70.
41. Kambe T, Tsuji T, Hashimoto A, Itsumura N. 2015. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiol Rev 95:749–84.
42. Shusterman E, Beharier O, Shiri L, Zarivach R, Etzion Y, Campbell CR, Lee I-H, Okabayashi K, Dinudom A, Cook DI, Katz A, Moran A. 2014. ZnT-1 extrudes zinc from mammalian cells functioning as a Zn2+/H+ exchanger. Metallomics 6:1656–1663.
43. Ohana E, Hoch E, Keasar C, Kambe T, Yifrach O, Hershfinkel M, Sekler I. 2009. Identification of the Zn2+ binding site and mode of operation of a mammalian Zn2+ transporter. J Biol Chem 284:17677–17686.
44. Palmiter RD. 2004. Protection against zinc toxicity by metallothionein and zinc transporter 1. Proc Natl Acad Sci U S A 101:4918–4923.
45. Eide DJ. 2009. Homeostatic and adaptive responses to zinc deficiency in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 284:18565–9.
46. Vicentefranqueira R, Moreno MÁ, Calera JA, Leal F. 2005. The zrfA and zrfB Genes of Aspergillus fumigatus Encode the Zinc Transporter Proteins of a Zinc Uptake System Induced in an Acid , Zinc-Depleted Environment. Eukaryot Cell 4:837–848.
47. Yasmin S, Abt B, Schrettl M, Moussa TAA, Werner ER, Haas H. 2009. The interplay between iron and zinc metabolism in Aspergillus fumigatus. Fungal Genet Biol 46:707–713.
48. Laity JH, Andrews GK. 2007. Understanding the mechanisms of zinc-sensing by metal-response element binding transcription factor-1 (MTF-1). Arch Biochem Biophys 463:201–210.
110
49. Kimura T, Kambe T. 2016. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. Int J Mol Sci 17:10–12.
50. Ogo OA, Tyson J, Cockell SJ, Howard A, Valentine RA, Ford D. 2015. The Zinc Finger Protein ZNF658 Regulates the Transcription of Genes Involved in Zinc Homeostasis and Affects Ribosome Biogenesis through the Zinc Transcriptional Regulatory Element. Mol Cell Biol 35:977–987.
51. Warnhoff K, Roh HC, Kocsisova Z, Tan C-H, Morrison A, Croswell D, Schneider DL, Kornfeld K. 2017. The Nuclear Receptor HIZR-1 Uses Zinc as a Ligand to Mediate Homeostasis in Response to High Zinc. PLoS Biol 15:e2000094.
52. Chimienti F, Devergnas S, Favier A, Seve M. 2004. Identification and Cloning of a β-Cell–Specific Zinc Transporter, ZnT-8, Localized Into Insulin Secretory Granules. Diabetes 53:2330 LP-2337.
53. Palmiter RD, Cole TB, Quaife CJ, Findley SD. 1996. ZnT-3, a putative transporter of zinc into synaptic vesicles. Proc Natl Acad Sci 93:14934–14939.
54. Wilson S, Bird AJ. 2016. Zinc sensing and regulation in yeast model systems. Arch Biochem Biophys 611:30–36.
55. Zhao H, Eide DJ. 1997. Zap1p, a metalloregulatory protein involved in zinc-responsive transcriptional regulation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 17:5044–5052.
56. Herbig A, Bird AJ, Swierczek S, McCall K, Mooney M, Wu C-Y, Winge DR, Eide DJ. 2005. Zap1 activation domain 1 and its role in controlling gene expression in response to cellular zinc status. Mol Microbiol 57:834–46.
57. Hatayama M, Aruga J. 2010. Characterization of the tandem CWCH2 sequence motif: a hallmark of inter-zinc finger interactions. BMC Evol Biol 10:53.
58. Bird AJ, McCall K, Kramer M, Blankman E, Winge DR, Eide DJ. 2003. Zinc fingers can act as Zn2+ sensors to regulate transcriptional activation domain function. EMBO J 22:5137 LP-5146.
59. Frey AG, Bird AJ, Evans-Galea M V, Blankman E, Winge DR, Eide DJ. 2011. Zinc-Regulated DNA Binding of the Yeast Zap1 Zinc-Responsive Activator. PLoS One 6:e22535.
60. Zhao H, Butler E, Rodgers J, Spizzo T, Duesterhoeft S, Eide D. 1998. Regulation of zinc homeostasis in yeast by binding of the ZAP1 transcriptional activator to zinc-responsive promoter elements. J Biol Chem 273:28713–28720.
61. Moreno MA, Ibrahim-Granet O, Vicentefranqueira R, Amich J, Ave P, Leal F, Latge JP, Calera JA. 2007. The regulation of zinc homeostasis by the ZafA transcriptional activator is essential for Aspergillus fumigatus virulence. Mol Microbiol 64:1182–1197.
62. Schneider R de O, Fogaça N de SS, Kmetzsch L, Schrank A, Vainstein MH, Staats CC. 2012. Zap1 Regulates Zinc Homeostasis and Modulates Virulence in Cryptococcus gattii. PLoS One 7:e43773.
63. Böttcher B, Palige K, Jacobsen ID, Hube B, Brunke S. 2015. Csr1/Zap1 Maintains Zinc Homeostasis and Influences Virulence in Candida dubliniensis but Is Not Coupled to Morphogenesis. Eukaryot Cell 14:661–670.
111
64. Bird AJ, Blankman E, Stillman DJ, Eide DJ, Winge DR. 2004. The Zap1 transcriptional activator also acts as a repressor by binding downstream of the TATA box in ZRT2. EMBO J 23:1123 LP-1132.
65. Waters BM, Eide DJ. 2002. Combinatorial control of yeast FET4 gene expression by iron, zinc, and oxygen. J Biol Chem 277:33749–33757.
66. Zhao H, Eide D. 1996. The yeast ZRT1 gene encodes the zinc transporter protein of a high-affinity uptake system induced by zinc limitation. Proc Natl Acad Sci U S A 93:2454–8.
67. MacDiarmid CW, Gaither LA, Eide D. 2000. Zinc transporters that regulate vacuolar zinc storage in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 19:2845–55.
68. MacDiarmid CW, Milanick MA, Eide DJ. 2003. Induction of the ZRC1 metal tolerance gene in zinc-limited yeast confers resistance to zinc shock. J Biol Chem 278:15065–15072.
69. Pagani A, Villarreal L, Capdevila M, Atrian S. 2007. The Saccharomyces cerevisiae Crs5 Metallothionein metal-binding abilities and its role in the response to zinc overload. Mol Microbiol 63:256–269.
70. Ellis CD, MacDiarmid CW, Eide DJ. 2005. Heteromeric protein complexes mediate zinc transport into the secretory pathway of eukaryotic cells. J Biol Chem 280:28811–28818.
71. Kumánovics A, Poruk KE, Osborn KA, Ward DM, Kaplan J. 2006. YKE4 (YIL023C) Encodes a Bidirectional Zinc Transporter in the Endoplasmic Reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 281:22566–22574.
72. Jensen LT, Ajua-Alemanji M, Culotta VC. 2003. The Saccharomyces cerevisiae High Affinity Phosphate Transporter Encoded by PHO84 Also Functions in Manganese Homeostasis. J Biol Chem 278:42036–42040.
73. Amich J, Calera JA. 2014. Zinc acquisition: A key aspect in aspergillus fumigatus virulence. Mycopathologia 178:379–385.
74. Amich J, Leal F, Calera JA. 2009. Repression of the acid ZrfA/ZrfB zinc-uptake system of Aspergillus fumigatus mediated by PacC under neutral, zinc-limiting conditions. Int Microbiol. 12:39–47.
75. Citiulo F, Jacobsen ID, Miramón P, Schild L, Brunke S, Zipfel P, Brock M, Hube B, Wilson D. 2012. Candida albicans Scavenges Host Zinc via Pra1 during Endothelial Invasion. PLoS Pathog 8:e1002777.
76. Amich J, Vicentefranqueira R, Leal F, Calera JA. 2010. Aspergillus fumigatus survival in alkaline and extreme zinc-limiting environments relies on the induction of a zinc homeostasis system encoded by the zrfC and aspf2 genes. Eukaryot Cell. 9:424–437.
77. Amich J, Vicentefranqueira R, Mellado E, Ruiz-Carmuega A, Leal F, Calera JA. 2014. The ZrfC alkaline zinc transporter is required for Aspergillus fumigatus virulence and its growth in the presence of the Zn/Mn-chelating protein calprotectin. Cell Microbiol 16:548–564.
78. Vicentefranqueira R, Amich J, Laskaris P, Ibrahim-Granet O, Latgé JP, Toledo H, Leal F, Calera JA. 2015. Targeting zinc homeostasis to combat Aspergillus fumigatus infections. Front Microbiol 6:1–7.
112
79. Korndörfer IP, Brueckner F, Skerra A. 2007. The Crystal Structure of the Human (S100A8/S100A9)2 Heterotetramer, Calprotectin, Illustrates how Conformational Changes of Interacting α-Helices Can Determine Specific Association of Two EF-hand Proteins. J Mol Biol 370:887–898.
80. Hayden JA, Brophy MB, Cunden LS, Nolan EM. 2013. High-affinity manganese coordination by human calprotectin is calcium-dependent and requires the histidine-rich site formed at the dimer interface. J Am Chem Soc 135:775–787.
81. Urban CF, Ermert D, Schmid M, Abu-Abed U, Goosmann C, Nacken W, Brinkmann V, Jungblut PR, Zychlinsky A. 2009. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog 5(10): e1000639..
82. Slavic K, Krishna S, Derbyshire ET, Staines HM. 2011. Plasmodial sugar transporters as anti-malarial drug targets and comparisons with other protozoa. Malar J 10:165.
83. Prati F, Goldman-Pinkovich A, Lizzi F, Belluti F, Koren R, Zilberstein D, Bolognesi ML. 2014. Quinone-amino acid conjugates targeting leishmania amino acid transporters. PLoS One 9 (9): e107994.
84. Serra-Cardona A, Canadell D, Arino J. 2015. Coordinate responses to alkaline pH stress in budding yeast. Microb Cell 2:182–196.
85. Bignell E, Negrete-Urtasun S, Calcagno AM, Haynes K, Arst HN, Rogers T. 2005. The Aspergillus pH-responsive transcription factor PacC regulates virulence. Mol Microbiol 55:1072–84.
86. Cornet M, Gaillardin C. 2014. pH signaling in human fungal pathogens: A new target for antifungal strategies. Eukaryot Cell 13:342–352.
87. Peñalva MA, Tilburn J, Bignell E, Arst Jr. HN, Peñalva MA, Arst HN. 2008. Ambient pH gene regulation in fungi: making connections. Trends Microbiol. 16:291–300.
88. Peñalva MA, Arst Jr. HN. 2004. Recent advances in the characterization of ambient pH regulation of gene expression in filamentous fungi and yeasts. Annu Rev Microbiol. 58:425–451.
89. Peñalva MA, Lucena-Agell D, Arst HN. 2014. Liaison alcaline: Pals entice non-endosomal ESCRTs to the plasma membrane for pH signaling. Curr Opin Microbiol 22:49–59.
90. Tilburn J, Sarkar S, Widdick DA, Espeso EA, Orejas M, Mungroo J, Peñalva MA, Arst Jr. HN. 1995. The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid- and alkaline-expressed genes by ambient pH. EMBO J. 14:779–790.
91. Espeso EA, Tilburn J, Sanchez-Pulido L, Brown C V, Valencia A, Arst Jr. HN, Peñalva MA. 1997. Specific DNA recognition by the Aspergillus nidulans three zinc finger transcription factor PacC. J Mol Biol 274:466–480.
92. Espeso E a, Roncal T, Díez E, Rainbow L, Bignell E, Alvaro J, Suárez T, Denison SH, Tilburn J, Arst HN, Peñalva M a. 2000. On how a transcription factor can avoid its proteolytic activation in the absence of signal transduction. EMBO J 19:719–28.
93. Mingot JM, Espeso EA, Diez E, Peñalva MA. 2001. Ambient pH signaling regulates nuclear localization of the Aspergillus nidulans PacC transcription factor. Mol Cell Biol. 21:1688–
113
1699.
94. Herranz S, Rodríguez JM, Bussink H-J, Sánchez-Ferrero JC, Arst HN, Peñalva M a, Vincent O. 2005. Arrestin-related proteins mediate pH signaling in fungi. Proc Natl Acad Sci U S A 102:12141–6.
95. Calcagno-Pizarelli AM, Negrete-Urtasun S, Denison SH, Rudnicka JD, Bussink H-J, Múnera-Huertas T, Stanton L, Hervás-Aguilar A, Espeso E a, Tilburn J, Arst HN, Peñalva M a. 2007. Establishment of the ambient pH signaling complex in Aspergillus nidulans: PalI assists plasma membrane localization of PalH. Eukaryot Cell 6:2365–75.
96. Hervás-Aguilar A, Peñalva M a, Galindo A. 2010. Receptor-independent Ambient pH signaling by ubiquitin attachment to fungal arrestin-like PalF. J Biol Chem 285:18095–18102.
97. Bignell EM. 2012. Conservation in Aspergillus fumigatus of pH-signaling seven transmembrane domain and arrestin proteins, and implications for drug discovery. Ann N Y Acad Sci 1273:35–43.
98. Galindo A, Hervás-Aguilar A, Rodríguez-Galán O, Vincent O, Arst HN, Tilburn J, Peñalva M a. 2007. PalC, one of two Bro1 domain proteins in the fungal pH signalling pathway, localizes to cortical structures and binds Vps32. Traffic 8:1346–64.
99. Galindo A, Calcagno-Pizarelli AM, Arst HN, Peñalva MÁ. 2012. An ordered pathway for the assembly of fungal ESCRT-containing ambient pH signalling complexes at the plasma membrane. J Cell Sci 125:1784–95.
100. Rodríguez-Galán O, Galindo A, Hervás-Aguilar A, Arst HN, Peñalva M a. 2009. Physiological involvement in pH signaling of Vps24-mediated recruitment of Aspergillus PalB cysteine protease to ESCRT-III. J Biol Chem 284:4404–12.
101. Vincent O, Rainbow L, Tilburn J, Arst HN, Pen MA. 2003. YPXL / I Is a Protein Interaction Motif Recognized by Aspergillus PalA and Its Human Homologue, AIP1/Alix. Mol Cell Biol 23:1647–1655.
102. Diez E, Alvaro J, Espeso EA, Rainbow L, Suarez T, Tilburn J, Arst Jr. HN, Peñalva MA. 2002. Activation of the Aspergillus PacC zinc finger transcription factor requires two proteolytic steps. EMBO J 21:1350–9.
103. Peñas MM, Hervás-Aguilar A, Múnera-Huertas T, Reoyo E, Peñalva M a, Arst HN, Tilburn J, Penas MM, Hervas-Aguilar A, Munera-Huertas T, Peñalva MA, Arst Jr. HN. 2007. Further characterization of the signaling proteolysis step in the Aspergillus nidulans pH signal transduction pathway. Eukaryot Cell. 6:960–970.
104. Hervás-Aguilar A, Rodríguez JM, Tilburn J, Peñalva M a, Arst Jr. HN. 2007. Evidence for the direct involvement of the proteasome in the proteolytic processing of the Aspergillus nidulans zinc finger transcription factor PacC. J Biol Chem. 282:34735–34747.
105. Bussink H-J, Bignell EM, Múnera-Huertas T, Lucena-Agell D, Scazzocchio C, Espeso EA, Bertuzzi M, Rudnicka J, Negrete-Urtasun S, Peñas-Parilla MM, Rainbow L, Peñalva MÁ, Arst HN, Tilburn J. Refining the pH response in Aspergillus nidulans: a modulatory triad involving PacX, a novel zinc binuclear cluster protein.
106. Peñalva M, Arst H. 2002. Regulation of gene expression by ambient pH in filamentous fungi and yeasts. Microbiol Mol Biol 66:426–446.
114
107. Li W, Mitchell AP. 1997. Proteolytic activation of rim1p, a positive regulator of yeast sporulation and invasive growth. Genetics 145:63–73.
108. Lamb TM, Mitchell AP. 2003. The transcription factor Rim101p governs ion tolerance and cell differentiation by direct repression of the regulatory genes NRG1 and SMP1 in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol2003/01/02. 23:677–686.
109. Li M, Martin SJ, Bruno VM, Mitchell AP, Davis DA. 2004. Candida albicans Rim13p, a protease required for Rim101p processing at acidic and alkaline pHs. Eukaryot Cell2004/06/11. 3:741–751.
110. Ramón AM, Fonzi WA. 2003. Diverged binding specificity of Rim101p, the Candida albicans ortholog of PacC. Eukaryot Cell 2:718–728.
111. Baek YU, Martin SJ, Davis DA. 2006. Evidence for novel pH-dependent regulation of Candida albicans Rim101, a direct transcriptional repressor of the cell wall ??-glycosidase Phr2. Eukaryot Cell 5:1550–1559.
112. O’Meara TR, Norton D, Price MS, Hay C, Clements MF, Nichols CB, Alspaugh JA. 2010. Interaction of Cryptococcus neoformans Rim101 and protein kinase a regulates capsule. PLoS Pathog 6 (2): e1000776
113. Spielvogel A, Findon H, Arst HN, Araújo-Bazán L, Hernández-Ortíz P, Stahl U, Meyer V, Espeso EA. 2008. Two zinc finger transcription factors, CrzA and SltA, are involved in cation homoeostasis and detoxification in Aspergillus nidulans. Biochem J 414:419–29.
114. Soriani FM, Malavazi I, Da Silva Ferreira ME, Savoldi M, Von Zeska Kress MR, De Souza Goldman MH, Loss O, Bignell E, Goldman GH. 2008. Functional characterization of the Aspergillus fumigatus CRZ1 homologue, CrzA. Mol Microbiol 67:1274–1291.
115. Hernández-Ortiz P, Espeso EA. 2013. Phospho-regulation and nucleocytoplasmic trafficking of CrzA in response to calcium and alkaline-pH stress in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol 89:532–551.
116. Yoshimoto H, Saltsman K, Gasch AP, Li HX, Ogawa N, Botstein D, Brown PO, Cyert MS. 2002. Genome-wide Analysis of Gene Expression Regulated by the Calcineurin/Crz1p Signaling Pathway in Saccharomyces cerevisiae . J Biol Chem 277:31079–31088.
117. Kullas AL, Martin SJ, Davis D. 2007. Adaptation to environmental pH: integrating the Rim101 and calcineurin signal transduction pathways. Mol Microbiol 66:858–871.
118. Cramer RA, Perfect BZ, Pinchai N, Park S, Perlin DS, Asfaw YG, Heitman J, Perfect JR, Steinbach WJ. 2008. Calcineurin target CrzA regulates conidial germination, hyphal growth, and pathogenesis of Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell 7:1085–1097.
119. Chilton IJ, Delaney CE, Barham-Morris J, Fincham DA, Hooley P, Whitehead MP. 2008. The Aspergillus nidulans stress response transcription factor StzA is ascomycete-specific and shows species-specific polymorphisms in the C-terminal region. Mycol Res 112:1435–1446.
120. O’Neil JD, Bugno M, Stanley MS, Barham-Morris JB, Woodcock NA, Clement DJ, Clipson NJWW, Whitehead MP, Fincham DA, Hooley P. 2002. Cloning of a novel gene encoding a C2H2 zinc finger protein that alleviates sensitivity to abiotic stresses in Aspergillus nidulans. Mycol Res 106:491–498.
115
121. Shantappa S, Dhingra S, Hernández-Ortiz P, Espeso EA, Calvo AM. 2013. Role of the Zinc Finger Transcription Factor SltA in Morphogenesis and Sterigmatocystin Biosynthesis in the Fungus Aspergillus nidulans. PLoS One 8. (7): e68492.
122. Mellado L, Arst HN, Espeso EA. 2016. Proteolytic activation of both components of the cation-stress responsive Slt pathway in Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell 27.
123. Mingot JM, Tilburn J, Diez E, Bignell E, Orejas M, Widdick DA, Sarkar S, Brown C V, Caddick MX, Espeso EA, Arst Jr. HN, Peñalva MA. 1999. Specificity determinants of proteolytic processing of Aspergillus PacC transcription factor are remote from the processing site, and processing occurs in yeast if pH signalling is bypassed. Mol Cell Biol. 19:1390–1400.
124. Jarvik JW, Telmer C a. 1998. Epitope tagging. Annu Rev Genet 32:601–618.
125. Margolin W. 2012. The Price of Tags in Protein Localization Studies. J Bacteriol 194:6369–6371.
126. Swulius MT, Jensen GJ. 2012. The helical mreb cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 is an artifact of the N-terminal yellow fluorescent protein tag. J Bacteriol 194:6382–6386.
127. Brothers SP, Janovick JA, Conn PM. 2003. Unexpected Effects of Epitope and Chimeric Tags on Gonadotropin-Releasing Hormone Receptors: Implications for Understanding the Molecular Etiology of Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab 88:6107.
128. Tolbert LM, Lameh J. 2002. Antibody to Epitope Tag Induces Internalization of Human Muscarinic Subtype 1 Receptor. J Neurochem 70:113–119.
129. Ledent P, Duez C, Vanhove M, Lejeune A, Fonzé E, Charlier P, Rhazi-Filali F, Thamm I, Guillaume G, Samyn B, Devreese B, Van Beeumen J, Lamotte-Brasseur J, Frère J-M. 1997. Unexpected influence of a C-terminal-fused His-tag on the processing of an enzyme and on the kinetic and folding parameters. FEBS Lett 413:194–196.
130. Romano JD, Schmidt WK, Michaelis S. 1998. The Saccharomyces cerevisiae Prenylcysteine Carboxyl Methyltransferase Ste14p Is in the Endoplasmic Reticulum Membrane. Mol Biol Cell 9:2231–2247.
131. Liu W, Mellado L, Espeso EA, Sealy-Lewis HM. 2014. In Aspergillus nidulans the suppressors suaA and suaC code for release factors eRF1 and eRF3 and suaD codes for a glutamine tRNA. G3 (Bethesda) 4:1047–57.
132. Basehoar AD, Zanton SJ, Pugh BF. 2004. Identification and Distinct Regulation of Yeast TATA Box-Containing Genes. Cell 116:699–709.
133. Hu C-D, Chinenov Y, Kerppola TK. 2002. Visualization of Interactions among bZIP and Rel Family Proteins in Living Cells Using Bimolecular Fluorescence Complementation. Mol Cell 9:789–798.
134. Kerppola TK. 2008. BIMOLECULAR FLUORESCENCE COMPLEMENTATION (BiFC) ANALYSIS AS A PROBE OF PROTEIN INTERACTIONS IN LIVING CELLS. Annu Rev Biophys 37:465–487.
135. Miller KE, Kim Y, Huh W-K, Park H-O. 2015. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis: advances and recent applications for genome-wide interaction studies. J Mol Biol 427:2039–2055.
116
136. Masser AE, Kandasamy G, Kaimal JM, Andréasson C. 2016. Luciferase NanoLuc as a reporter for gene expression and protein levels in Saccharomyces cerevisiae . Yeast 33:191–200.
137. Orejas M, Espeso E a, Tilburn J, Sarkar S, Arst HN, Peñalva M a. 1995. Activation of the Aspergillus PacC transcription factor in response to alkaline ambient pH requires proteolysis of the carboxy-terminal moiety. Genes Dev 9:1622–1632.
138. Espeso E a, Arst HN. 2000. On the mechanism by which alkaline pH prevents expression of an acid-expressed gene. Mol Cell Biol 20:3355–63.
139. Espeso EA, Peñalva MA. 1996. Three binding sites for the Aspergillus nidulans PacC zinc-finger transcription factor are necessary and sufficient for regulation by ambient pH of the isopenicillin N synthase gene promoter. J Biol Chem 271:28825–28830.
140. Virgilio S, Cupertino FB, Bernardes NE, Freitas FZ, Takeda AAS, Fontes MR de M, Bertolini MC. 2016. Molecular Components of the Neurospora crassa pH Signaling Pathway and Their Regulation by pH and the PAC-3 Transcription Factor. PLoS One 11:e0161659.
141. Espeso EA, Tilburn J, Arst HN, Peñalva MA. 1993. pH regulation is a major determinant in expression of a fungal penicillin biosynthetic gene. EMBO J 12:3947–56.
142. Keller NP, Nesbitt C, Sarr B, Phillips TD, Burow GB. 1997. pH Regulation of Sterigmatocystin and Aflatoxin Biosynthesis in Aspergillus spp. Phytopathology 87:643–648.
143. MacCabe AP, Orejas M, Perez-Gonzalez JA, Ramon D. 1998. Opposite patterns of expression of two Aspergillus nidulans xylanase genes with respect to ambient pH. J Bacteriol 180:1331–1333.
144. Gielkens M, González-Candelas L, Sánchez-Torres P, Van De Vondervoort P, De Graaff L, Visser J, Ramón D. 1999. The abfB gene encoding the major ??-L-arabinofuranosidase of Aspergillus nidulans: Nucleotide sequence, regulation and construction of a disrupted strain. Microbiology 145:735–741.
145. Hutchings H, Stahmann KP, Roels S, Espeso EA, Timberlake WE, Arst HN, Tilburn J. 1999. The multiply-regulated gabA gene encoding the GABA permease of Aspergillus nidulans: A score of exons. Mol Microbiol 32:557–568.
146. Eisendle M, Oberegger H, Buttinger R, Illmer P, Haas H. 2004. Biosynthesis and uptake of siderophores is controlled by the PacC-mediated ambient-pH regulatory system in Aspergillus nidulans. Eukaryot Cell 3:561–563.
147. Trushina N, Levin M, Mukherjee PK, Horwitz BA. 2013. PacC and pH-dependent transcriptome of the mycotrophic fungus Trichoderma virens. BMC Genomics 14:138.
148. Bertuzzi M, Schrettl M, Alcazar-Fuoli L, Cairns TC, Muñoz A, Walker L a, Herbst S, Safari M, Cheverton AM, Chen D, Liu H, Saijo S, Fedorova ND, Armstrong-James D, Munro C a, Read ND, Filler SG, Espeso E a, Nierman WC, Haas H, Bignell EM. 2014. The pH-responsive PacC transcription factor of Aspergillus fumigatus governs epithelial entry and tissue invasion during pulmonary aspergillosis. PLoS Pathog 10.
149. Franco-Frías E, Ruiz-Herrera J, Aréchiga-Carvajal ET. 2014. Transcriptomic analysis of the role of Rim101/PacC in the adaptation of Ustilago maydis to an alkaline environment. Microbiol (United Kingdom) 160:1985–1998.
117
150. Ment D, Alkan N, Luria N, Bi F-C, Reuveni E, Fluhr R, Prusky D. 2014. A Role of AREB in the Regulation of PACC-Dependent Acid-Expressed-Genes and Pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides. Mol Plant-Microbe Interact 28:154–166.
151. Tamayo EN, Villanueva A, Hasper AA, Graaff LH d, Ramón D, Orejas M. 2008. CreA mediates repression of the regulatory gene xlnR which controls the production of xylanolytic enzymes in Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol 45:984–993.
152. Kunitake E, Hagiwara D, Miyamoto K, Kanamaru K, Kimura M, Kobayashi T. 2016. Regulation of genes encoding cellulolytic enzymes by Pal-PacC signaling in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol 100:3621–3635.
153. Bergh KT, Brakhage AA. 1998. Regulation of the Aspergillus nidulans penicillin biosynthesis gene acvA (pcbAB) by amino acids: implication for involvement of transcription factor PACC. Appl Environ Microbiol 64:843–9.
154. Litzka O, Papagiannopolous P, Davis MA, Hynes MJ, Brakhage AA. 1998. The penicillin regulator PENR1 of Aspergillus nidulans is a HAP-like transcriptional complex. Eur J Biochem 251:758–767.
155. Kato N, Brooks W, Calvo AM. 2003. The Expression of Sterigmatocystin and Penicillin Genes in Aspergillus nidulans Is Controlled by veA, a Gene Required for Sexual Development. Eukaryot Cell 2:1178–1186.
156. Martín JF. 2000. Molecular Control of Expression of Penicillin Biosynthesis Genes in Fungi: Regulatory Proteins Interact with a Bidirectional Promoter Region. J Bacteriol 182:2355–2362.
157. Andrianopoulos A, Hynes MJ. 1990. Sequence and functional analysis of the positively acting regulatory gene amdR from Aspergillus nidulans. Mol Cell Biol 10:3194–3203.
158. Griggs DW, Johnston M. 1991. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Pnas 88:8597–8601.
159. De Rijcke M, Seneca S, Punyammalee B, Glansdorff N, Crabeel M. 1992. Characterization of the DNA target site for the yeast ARGR regulatory complex, a sequence able to mediate repression or induction by arginine. Mol Cell Biol 12:68–81.
160. Vilar JMG, Saiz L. 2005. DNA looping in gene regulation: from the assembly of macromolecular complexes to the control of transcriptional noise. Curr Opin Genet Dev 15:136–144.
161. Fonzi WA. 1999. PHR1 and PHR2 of Candida albicans encode putative glycosidases required for proper cross-linking of beta-1,3- and beta-1,6-glucans. J Bacteriol 181:7070–7079.
162. El Barkani A, Kurzai O, Fonzi WA, Ramon A, Porta A, Frosch M, Muhlschlegel FA. 2000. Dominant Active Alleles of RIM101 (PRR2) Bypass the pH Restriction on Filamentation of Candida albicans. Mol Cell Biol 20:4635–4647.
163. Davis D, Wilson RB, Mitchell AP. 2000. RIM101-dependent and-independent pathways govern pH responses in Candida albicans. Mol Cell Biol 20:971–8.
164. Nobile CJ, Nett JE, Hernday AD, Homann OR, Deneault JS, Nantel A, Andes DR, Johnson AD, Mitchell AP. 2009. Biofilm matrix regulation by Candida albicans Zap1. PLoS Biol 7.
118
165. Mühlschlegel FA, Fonzi WA. 1997. PHR2 of Candida albicans encodes a functional homolog of the pH-regulated gene PHR1 with an inverted pattern of pH-dependent expression. Mol Cell Biol 17:5960–7.
166. Ramon AM, Porta A, Fonzi WA. 1999. Effect of environmental pH on morphological development of Candida albicans is mediated via the PacC-related transcription factor encoded by PRR2. J Bacteriol 181:7524–7530.
167. Sarkar S, Caddick MX, Bignell E, Tilburn J, Arst HN. 1996. Regulation of gene expression by ambient pH in Aspergillus: Genes expressed at acid pH. Biochem Soc Trans 24:360–363.
168. Viladevall L, Serrano R, Ruiz A, Domenech G, Giraldo J, Barceló A, Ariño J. 2004. Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 279:43614–43624.
169. Serrano R, Martín H, Casamayor A, Ariño J. 2006. Signaling alkaline pH stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae through the Wsc1 cell surface sensor and the Slt2 MAPK pathway. J Biol Chem 281:39785–39795.
170. Hollomon JM, Grahl N, Willger SD, Koeppen K, Hogan DA. 2016. Global Role of Cyclic AMP Signaling in pH-Dependent Responses in Candida albicans. mSphere 1:e00283-16.
171. Orij R, Brul S, Smits GJ. 2011. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim Biophys Acta - Gen Subj 1810:933–944.
172. Orij R, Postmus J, Beek A Ter, Brul S, Smits GJ. 2009. In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology 155:268–278.
173. Dechant R, Binda M, Lee SS, Pelet S, Winderickx J, Peter M. 2010. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. EMBO J 29:2515–2526.
174. Kaur S, Mishra P, Prasad R. 1988. Dimorphism-associated changes in intracellular pH of Candida albicans. Biochim Biophys Acta 972:277–282.
175. Robson GD, Prebble E, Rickers A, Hosking S, Denning DW, Trinci APJ, Robertson W. 1996. Polarized growth of fungal hyphae Is defined by an alkaline pH gradient. Fungal Genet Biol 20:289–298.
176. Thevelein J, Beullens M, Honshoven F, Hoebeeck G, Detremerie K, den Hollander J a, Jans a W. 1987. Regulation of the cAMP level in the yeast Saccharomyces cerevisiae: intracellular pH and the effect of membrane depolarizing compounds. J Gen Microbiol 133:2191–2196.
177. Thevelein JM, De Winde JH. 1999. Novel sensing mechanisms and targets for the cAMP-protein kinase A pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol.
178. Steegborn C. 2014. Structure, mechanism, and regulation of soluble adenylyl cyclases - similarities and differences to transmembrane adenylyl cyclases. Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis 1842:2535–2547.
179. Bahn Y-S, Xue C, Idnurm A, Rutherford JC, Heitman J, Cardenas ME. 2007. Sensing the environment: lessons from fungi. Nat Rev Microbiol 5:57–69.
119
180. Dudev T, Lim C. 2002. Factors governing the protonation state of cysteines in proteins: An ab initio/CDM study. J Am Chem Soc 124:6759–6766.
181. Lin YL, Lim C. 2004. Factors Governing the Protonation State of Zn-Bound Histidine in Proteins: A DFT/CDM Study. J Am Chem Soc 126:2602–2612.
182. Mikles DC, Bhat V, Schuchardt BJ, Deegan BJ, Seldeen KL, McDonald CB, Farooq A. 2013. PH modulates the binding of early growth response protein 1 transcription factor to DNA. FEBS J 280:3669–3684.
183. Bensen ES, Martin SJ, Li M, Berman J, Davis DA. 2004. Transcriptional profiling in Candida albicans reveals new adaptive responses to extracellular pH and functions for Rim101p. Mol Microbiol 54:1335–1351.
184. Causton HC, Ren B, Koh SS, Harbison CT, Kanin E, Jennings EG, Lee TI, True HL, Lander ES, Young RA. 2001. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes. Mol Biol Cell 12:323–37.
185. Serrano R, Ruiz A, Bernal D, Chambers JR, Ariño J. 2002. The transcriptional response to alkaline pH in Saccharomyces cerevisiae: Evidence for calcium-mediated signalling. Mol Microbiol 46:1319–1333.
186. Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166:557–580.
187. d’Enfert C. 1996. Selection of multiple disruption events in Aspergillus fumigatus using the orotidine-5’-decarboxylase gene, pyrG, as a unique transformation marker. Curr Genet. 30:76–82.
188. Cove DJ. 1966. The induction and repression of nitrate reductase in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim Biophys Acta. 113:51–56.
189. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis T. 2001. Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory Press., Cold Spring.
190. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez J-Y, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A. 2012. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods 9:10.1038/nmeth.2019.
191. Christianson TW, Sikorski RS, Dante M, Shero JH, Hieter P. 1992. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene 110:119–122.
192. Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A. 2002. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotech 20:87–90.