ESTUDIO DE LA SECUENCIA PEPTÍDICA

Las proteínas son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos definida genéticamente

Esta secuencia de aminoácidos constituye la estructura primaria de la proteína y es el nivel fundamental en el que se basan los niveles más elevados

La secuencia de una proteína es similar entre especies pero no es idéntica

Las proteínas han evolucionado mediante cambios en sus secuencias de aminoácidos. Algunos cambios son conservadores y otros no conservadores

DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE UNA PROTEÍNA: SECUENCIACIÓN

1953: Sanger secuenció la insulina

Método experimental

1ª Fase: Determinar la composición de aa• Hidrólisis ácida• Cromatografía

(Actualmente existen secuenciadores automáticos)

2ª Fase: Identificar el aa N-terminalMarcar el aa N-terminal

1-fluor-2,4 dinitrobenceno (DNF) (der. amarillo)Cloruro de dansilo (ClDNS) (Der. Fluorescente)

Hidrólisis del péptidoSeparación de aa (electroforesis, cromatografía)

Identificación del aa marcado

3ª Fase: Degradación de EDMAN• Marcar el aa N-terminal con fenilisotiocianato (PITC) en medio alcalino (se forma el derivado feniltiocarbanilo)• Se hidroliza el enlace peptídico entre los residuos 1 y 2 (medio ácido anhidro fuerte)• Se identifica el derivado del residuo N-terminal por HPLCEl resto del polipéptido sigue intacto por lo que puede repetirse el proceso para determinar el 2º aminoácidoPor repetición continuada puede secuenciarse el polipéptido desde el extremo N-terminal

Identificación del residuo C-terminal

• Hidrazina (NH2-NH2): rompe enlaces peptídicos y forma

derivados de hidrazina con todos los aa excepto el C-

terminal

• Carboxipeptidasa A: hidroliza el último enlace peptídico

FDNB Sanger2,4-dinitrofluorbenceno

Reactivos para identificar NH2 terminales

Después de la hidrólisis

F

NO2

NO2

NO2

NO2

CR

COOH

HNHAmarillo, se extrae con cloroformo (los demás productos de hidrólisis

ionizados no se extraen)

DNS-Cl Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo

Cloruro de dansilo

Después de la hidrólisis

CR

COOH

HNHAnálogo a FDNB pero fluorescente

(detecta cantidades mínimas)

S Cl

O

O

N

CH3

CH3

S

O

O

N

CH3

CH3

Hidrazinolisis NH2-NH2

Después de la hidrólisis

El terminal queda libre y los demás como hidracidas

NH2-NH2CR

COOH

HNH2CR

CO

HNH2

NH NH2

Reactivos para identificar COOH terminales

“Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003

DEGRADACIÓN DE EDMAN

Marcaje

Liberación

Marcaje

Liberación

1ª vuelta

2ª vuelta

SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS

“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002