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ESTUDIO DE PROTEÍNAS IMPLICADAS EN LA BIOSÍNTESIS DE PARED
CELULAR EN RESPUESTA A DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS EN
LEVADURAS: BÚSQUEDA DE BLANCOS TERAPÉUTICOS
VALENTINA DIAZ SANTOYO
DIRECTORA: CLAUDIA MARCELA PARRA GIRALDO Bact, M.Sc, PhD.
CODIRECTOR: ANDRÉS CEBALLOS GARZÓN Bact, PhD.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ
2021
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ESTUDIO DE PROTEÍNAS IMPLICADAS EN LA BIOSÍNTESIS DE PARED
CELULAR EN RESPUESTA A DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS EN
LEVADURAS: BÚSQUEDA DE BLANCOS TERAPÉUTICOS
VALENTINA DIAZ SANTOYO
ESTUDIANTE DE BACTERIOLOGÍA
APROBADO POR
___________________________________________
CLAUDIA MARCELA PARRA GIRALDO Bact, M.Sc, Ph.D
DIRECTORA
___________________________________________
ANDRÉS CEBALLOS GARZÓN Bact, Ph.D
CODIRECTOR
___________________________________________
MELVA LINARES LINARES Bact, M.Sc
PAR EVALUADOR
___________________________________________
CARLOS JAVIER ALMÉCIGA DÍAZ Q.F, Ph.D
PAR EVALUADOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ
2021
3
Nota de Advertencia:
Artículo 23 de la Resolución Nº13 de Julio de 1946.
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer primeramente a Dios por permitirme culminar este trabajo, por colocar personas
a mi alrededor que fueron indispensables y de gran ayuda en su realización, por haberme dado la
fortaleza para no desistir y por ser mi guía durante toda la carrera.
Agradezco a mis padres y hermana por estar conmigo en cada paso y ser mi apoyo incondicional,
por acompañarme en los momentos de incertidumbre y ser esa voz de aliento que me impulsaba a
seguir trabajando con dedicación. A mi hermana por levantarme el ánimo, ser mi mejor amiga y
darme las mayores lecciones de aprendizaje.
Agradezco a mi directora Claudia Parra por recibirme en su grupo de investigación y orientarme
en este camino de aprendizaje continuo, por darme su apoyo incondicional y motivarme a seguir
creciendo tanto a nivel profesional como personal, también agradezco a mi codirector Andrés
Ceballos por compartir sus conocimientos, guiar y retroalimentar cada parte de este proceso de
investigación, por estar atento y ayudarme a solucionar cada dificultad que se presentó.
Finalmente, quiero agradecer a mis amigos y a mi grupo de investigación (MICOH-P) por
acogerme en el laboratorio y hacer ameno este proceso, en especial a María José Jiménez y Hernán
Millán.
5
Tabla de contenido
Resumen ....................................................................................................................................... 8
1. Introducción .......................................................................................................................... 9
2. Problema de investigación .................................................................................................. 10
3. Justificación ........................................................................................................................ 12
4. Marco teórico ...................................................................................................................... 12
4.1 Género Candida .................................................................................................................... 12
4.1.1 Candida glabrata ........................................................................................................... 13
4.1.1.1 Infección y tratamiento ............................................................................................. 14
4.1.1.2 Mecanismo de resistencia frente azoles y equinocandinas....................................... 14
4.1.1.3 Vía (CaM/CaL) y su papel en la ganancia de resistencia a los azoles y
equinocandinas......................................................................................................................... 15
4.2 Pared celular fúngica ........................................................................................................... 16
4.3 Glicosilación de proteínas .................................................................................................... 20
4.4 Enzimas involucradas en la glicosilación de proteínas ........................................................ 24
4.5 Sistema CRISPR-CAS ......................................................................................................... 26
4.5.1 Sistema CRISPR-CAS9 ................................................................................................ 26
4.6 Antecedentes ......................................................................................................................... 28
5. Pregunta de investigación ................................................................................................... 29
6. Objetivos ............................................................................................................................. 29
6.1 Objetivo general ................................................................................................................... 29
7. Materiales y métodos .......................................................................................................... 30
7.1 Cepas utilizadas y fármacos ................................................................................................. 30
7.2 Reactivación, mantenimiento e identificación de las levaduras .......................................... 31
7.3 Pruebas de susceptibilidad ................................................................................................... 32
7.4 Evaluación de estrés oxidativo, osmótico y térmico ............................................................ 33
7.5 Evaluación del efecto de los perturbadores de la pared celular blanco de calcoflúor y rojo
Congo …………………………………………………………………………………………………..33
7.6 Diseño bioinformático para la construcción de mutantes mediante el sistema CRISPR-
Cas9 …………………………………………………………………………………………………..33
7.6.1 Obtención del plásmido, transformación y validación ................................................ 34
8. Resultados ........................................................................................................................... 35
8.1 Evaluación de la susceptibilidad antifúngica a caspofungina y fluconazol en mutantes de
S. cerevisiae ...................................................................................................................................... 35
8.2 Evaluación de estrés oxidativo, osmótico y térmico y, agentes perturbadores de la pared
celular …………………………………………………………………………………………………..42
6
8.3 Efecto de tunicamicina solo y en combinación con caspofungina en C. glabrata ................ 47
8.4 Diseño bioinformático-sgRNA ............................................................................................. 49
Discusión ..................................................................................................................................... 56
9. Conclusiones ....................................................................................................................... 63
10. Perspectivas......................................................................................................................... 64
11. Bibliografía ......................................................................................................................... 64
12. Anexos ................................................................................................................................. 75
Lista de tablas
Tabla 1. Proteínas involucradas en la vía de la N-glicosilación. ............................................................. 24
Tabla 2. Proteínas involucradas en la vía de la O-manosilación ............................................................. 25
Tabla 3. Levaduras usadas en este estudio. ............................................................................................ 30
Tabla 4. Proteínas evaluadas en este estudio. ......................................................................................... 35
Tabla 5. Características sgRNA ............................................................................................................ 53
Tabla 6. Cebadores ............................................................................................................................... 55
Lista de figuras
Figura 1. Estructura de la pared celular ................................................................................................. 18
Figura 2. Vía de la N-glicosilación ........................................................................................................ 22
Figura 3. Vías de glicosilación .............................................................................................................. 23
Figura 4. Estructura Cas9 ..................................................................................................................... 26
Figura 5. Sistema CRISPR-Cas9 ........................................................................................................... 28
Figura 6. Determinación del perfil de susceptibilidad a caspofungina .................................................... 39
Figura 7. Determinación del perfil de susceptibilidad a fluconazol ........................................................ 41
Figura 8. Concentración mínima inhibitoria de fluconazol en condiciones basales y bajo la inhibición de
la proteína calmodulina.......................................................................................................................... 43
Figura 9. Respuesta al estrés ................................................................................................................ 45
Figura 10. Respuesta frente agentes perturbadores de la pared celular ................................................... 46
Figura 11. Curva de crecimiento de C. glabrata en presencia de Tunicamicina (TM) ............................ 47
Figura 12. Concentración mínima inhibitoria de caspofungina a nivel basal y bajo la inhibición de la N-
glicosilación en C. glabrata. .................................................................................................................. 48
Figura 13. Crecimiento de C. glabrata en presencia de Fph y TM solos y en combinación .................... 48
Figura 14: Plásmido pV1382 para la transformación de C. glabrata ...................................................... 55
Lista de anexos
Anexo 1. Identificación por MALDI-TOF MS ....................................................................................... 75
7
Índice de abreviaturas
AG: Aparato de Golgi
BC: Blanco de Calcoflúor
CaM/CaL: Calmodulina/Calcineurina
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria
GPI: Glicosilfosfatidilinositol
CWI: Cell Wall Integrity/ Integridad de la pared celular
DP: Dolichol Phosphate/Dolicol Fosfato
EFI: Enfermedad fúngica invasiva
Fph: Fluphenazine/Flufenazina
HOG: High Osmolarity Glicerol/Glicerol de alta osmolaridad
HS: Hot Spot/Punto caliente
MAPK: Mitogen-activated Protein Kinase/Proteína quinasa activada por mitógenos
PKC: Protein Kinase C/Proteína quinasa C
RC: Rojo Congo
RE: Retículo Endoplasmático
RER: Retículo Endoplasmático Rugoso
SDA: Sabouraud
TM: Tunicamicina
YPD: Yeast extract Peptone Dextrose/Extracto de levadura peptona dextrosa
8
Resumen
Introducción: La EFI (Enfermedad fúngica invasiva) han aumentado en los últimos años como
resultado del incremento de pacientes inmunocomprometidos, siendo de particular interés las
causadas por la levadura C. glabrata (segunda especie más prevalente en el mundo causando
candidemia), debido a que con alta frecuencia es resistente a los azoles y con un aumento
importante a las equinocandinas, provocando fallas terapéuticas y altas tasas de mortalidad. Por
esta razón, la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos es relevante; una de las estrategias para
lograr identificar posibles blancos es el estudio de proteínas esenciales que participen en la
respuesta a los fármacos.
Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de la deleción o inhibición de proteínas
implicadas en la biosíntesis de pared celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés.
Metodología: Se evaluaron mutantes haploinsuficientes de S. cerevisiae para 15 proteínas
implicadas en la biosíntesis de la pared celular frente a los fármacos caspofungina, fluconazol y
frente a diferentes tipos de estrés (térmico, osmótico, oxidativo, agentes disruptores de la pared
celular e inhibición de la vía CaM/CaL), además se determinó la susceptibilidad de C. glabrata al
inhibidor de la N-glicosilación TM (Tunicamicina) solo y en combinación con caspofungina.
Finalmente, con base a los resultados obtenidos en S. cerevisiae se eligieron 2 proteínas para
realizar el diseño bioinformático del sistema CRISPR-Cas9 con el interés de evaluar el fenotipo
de los mutantes en aislamientos clínicos de C. glabrata resistentes.
Resultados: Se encontró que la deleción de genes asociados con la biosíntesis de manoproteínas
conduce a una disminución de la CMI (Concentración mínima inhibitoria) en presencia de
caspofungina, además que las proteínas de tipo GPI son importantes en la respuesta al fluconazol,
por otro lado, la depleción de alguno de los genes implicados en la biosíntesis o formación de la
pared celular genera levaduras con mayor susceptibilidad frente agentes disruptores de esta. Se
identificó que la proteína con anclaje GPI Ecm33 participa en la respuesta de la mayoría de las
condiciones evaluadas y que la vía de señalización CaM/CaL es importante en la respuesta frente
al fluconazol y la TM. Por otro lado, la combinación de TM y caspofungina logro disminuir la
CMI en aislados de C. glabrata resistentes. Adicionalmente, se obtuvieron los sgRNA para las
proteínas Mnn9 y Ecm33 y el constructo del plásmido pV1382 para la construcción de mutantes
mediante el sistema CRISPR-Cas9.
9
Conclusiones: El entendimiento de la dinámica de la pared celular en presencia de fármacos
permite una mejor comprensión de la adaptación al estrés generado por estos, en este estudio se
encontró que las manoproteínas tienen un rol importante en la respuesta a caspofungina, se observó
que la deleción de genes implicados en la biosíntesis de manoproteínas en S. cerevisiae condujo a
disminución de la CMI, además en C. glabrata la inhibición de la vía de la N-glicosilación en
combinación con caspofungina logró disminuir la CMI en aislados resistentes. Resultados que en
conjunto son prometedores pues evidencian que la ausencia de manoproteínas en la pared celular
afecta el crecimiento de la levadura, sin embargo, es necesario continuar el estudio en C. glabrata
para validar los resultados.
1. Introducción
Las enfermedades fúngicas son un problema de salud pública, presentándose en aproximadamente
300 millones de personas anualmente y generando altas tasas de mortalidad (1,2). Candida spp. es
uno de los géneros más prevalentes y las especies C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C.
parapsilosis y C. krusei son las más representativas (3). La EFI por Candida spp. corresponde a la
presentación clínica con mayores tasas de mortalidad, con una incidencia global de ~750.000 casos
por año, generalmente atribuidas a C. albicans. Sin embargo, en la actualidad, la prevalencia de
otras especies no albicans se reporta con mayor frecuencia, dentro de las que se destaca C. glabrata
pue se ha convertido en la segunda especie más aislada a nivel mundial y la responsable de la
mayoría de los aislamientos resistentes a las equinocandinas (4,5).
C. glabrata hace parte de la microbiota del ser humano y se encuentra filogenéticamente más
estrecha a S. cerevisiae que a C. albicans. Esta especie se caracteriza por presentar baja
susceptibilidad a los azoles y rápida ganancia de resistencia frente las equinocandinas, hecho que
provoca fallas terapéuticas y aumento de mortalidad, lo que genera preocupación a nivel mundial
y conlleva a la necesidad de buscar dianas antifúngicas con el fin de desarrollar nuevos fármacos
que permitan una alternativa en el tratamiento de estas infecciones (5,6).
El estudio proteínas implicadas en la respuesta a los fármacos, permite evidenciar moléculas
esenciales en la adaptación y tolerancia a los mismos, siendo de especial interés aquellas que se
relacionan con la pared celular fúngica debido a que es una estructura ausente en mamíferos y
esencial para el hongo (7,8). Además, la comprensión de la dinámica de la pared celular en la
respuesta al fármaco también permite dar entendimiento a la participación de dichas proteínas en
10
este proceso. Walker y colaboradores (9) encontraron que la exposición a caspofungina genera
alteraciones en los componentes que conforman la pared celular como mecanismo compensatorio
ante la depleción del glucano. Por otro lado, también se ha demostrado que la alteración de la pared
celular por diversos agentes conlleva a la activación de múltiples vías de señalización en la
levadura que permiten la sobreexpresión de genes involucrados en la síntesis de los componentes
que la conforman (10,11).
Teniendo en cuenta lo mencionado, este estudio tuvo como objetivo evaluar los fenotipos de
levaduras con deleción o inhibición en proteínas implicadas en la biosíntesis de pared celular en
respuesta a diferentes condiciones de estrés, además del posterior diseño bioinformático para la
construcción de mutantes de las proteínas con mejores resultados mediante CRISPR-Cas9 en C.
glabrata con el fin de proponer nuevas dianas antifúngicas.
2. Problema de investigación
En el planeta tierra existen alrededor de 8,7 millones de especies eucarióticas, de los cuales los
hongos representan cerca del 7% (611.000 especies) de este número, alrededor de 600 son
patógenos humanos(12). Dentro de estas 600 especies, el género Candida es el más prevalente con
~200 especies de las cuales al menos 20 se han descrito como causantes de EFI (13). La especie
C. albicans es la más representativa, sin embargo, otras especies como C. glabrata, C. tropicalis,
C. parapsilosis y C. krusei también tienen relevancia clínica (3). A pesar de que son pocas las
especies implicadas, el fondo de acción mundial para las infecciones fúngicas (GAFFI The Global
Action Fund for Fungal Infections) ha estimado que 300 millones de personas padecen EFIs cada
año de los cuales 1,5 millones mueren (1,2).
Las enfermedades causadas por los hongos tienen diferentes presentaciones clínicas (superficiales,
invasivas). Las EFIs son las que exhiben menores tasas de incidencia, sin embargo son las que
presentan los mayores porcentajes de mortalidad con porcentajes ~50%, siendo los principales
géneros causantes Cryptococcus spp, Candida spp, Aspergillus spp y Pneumocystis spp.
Adicionalmente el aumento de infecciones que inducen inmunosupresión como el VIH/SIDA y
las intervenciones médicas invasivas, han contribuido a la incidencia actual de estas enfermedades,
ya que generalmente se presentan cuando no existe una adecuada función o respuesta inmune
(14,15)
11
El género Candida es la cuarta causa de infección del torrente sanguíneo asociada al cuidado de la
salud, con tasas de mortalidad que varían entre el 45-75%. Actualmente la prevalencia de especies
no albicans como C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata y C. krusei está aumentando, con
interés particular en las infecciones causadas por C. glabrata debido a su susceptibilidad reducida
a azoles a causa del uso generalizado de estos en el tratamiento profiláctico, además de
mecanismos intrínsecos y adquiridos; también debido a su rápida capacidad en la generación de
resistencia a equinocandinas, considerándose como la especie con la mayor frecuencia de
resistencia en los hospitales; y posicionándose como la segunda especie más aislada de América
del Norte, tercera en Europa y cuarta en América Latina (5,6,14–17).
En la actualidad existen 3 familias de antifúngicos para el tratamiento de las EFIs: azoles,
equinocandinas y polienos (anfotericina B). Además del reducido arsenal de antifúngicos, el
tratamiento se dificulta, debido a: (I) aumento de cepas resistentes a los azoles, (II) ganancia rápida
de resistencia a las equinocandinas y (III) alta toxicidad de la anfotericina B. En este sentido, la
instauración del tratamiento es un desafío; si bien, las guías de práctica clínica recomiendan el uso
de equinocandinas como fármaco de primera línea, debido a su baja toxicidad y alta eficacia frente
a los aislados resistentes a azoles, el creciente aumento de cepas de C. glabrata resistentes a las
mismas genera preocupación mundial pues limita aún más las opciones disponibles (5,6,18). Por
lo tanto, la identificación de nuevos blancos antifúngicos es necesaria. Ante esto, los abordajes
proteómicos en respuesta a la exposición de las diferentes clases de antimicóticos, toman
importancia como un método eficiente para la identificación de posibles proteínas objetivo que
permitan el desarrollo de opciones terapéuticas (7,19).
Se ha demostrado que la exposición a caspofungina o azoles, induce aumento de expresión de
proteínas que participan en múltiples procesos celulares como: mantenimiento de la pared celular,
metabolismo de lípidos, transcripción, traducción, control del ciclo celular, entre otras, siendo de
particular interés las proteínas involucradas en el mantenimiento de la pared celular, pues al ser
una estructura ausente en mamíferos y esencial en la viabilidad del hongo, la convierten en un
blanco ideal para la búsqueda de nuevas moléculas antifúngicas (8,20–22). Por esta razón,
proteínas con aumento de expresión después de la exposición a estos fármacos serán el motivo de
estudio del presente trabajo, con el interés de determinar el fenotipo de levaduras con deleciones
12
en genes o bajo inhibición de proteínas implicadas con la biosíntesis de la pared celular abordado
desde el modelo de S. cerevisiae y C. glabrata.
3. Justificación
Las opciones terapéuticas disponibles en la actualidad para las EFIs son reducidas, por lo que
estudios enfocados en la búsqueda de dianas antifúngicas son pertinentes para el desarrollo de
nuevos fármacos que sean eficaces frente aislamientos resistentes, selectivos de hongos y que
presenten baja o nula toxicidad, destacándose la pared celular y su biosíntesis como reservorio de
blancos antifúngicos, debido a que esta estructura está ausente en humanos. Por lo tanto, con el
estudio de proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular, se espera dilucidar la
importancia de estas en la respuesta a diferentes condiciones de estrés, con el interés de encontrar
posibles dianas antifúngicas que sean evaluadas en futuras investigaciones en el diseño de nuevos
fármacos.
4. Marco teórico
4.1 Género Candida
Género perteneciente al filum Ascomycota que comprende más de 200 especies, dentro de las
cuales 20 presentan un interés clínico. Son levaduras que carecen de pigmento melánico y pueden
tener diferente morfología (globosa, ovoide, elíptica, cilíndrica) según la especie, poseen
reproducción asexual (holoblástica) y pueden o no formar hifas verdaderas o pseudohifas,
clamidoconidios y tubo germinal. Generalmente su crecimiento se da en un rango de temperatura
de 25-28 ˚C, sin embargo, los patógenos humanos logran crecimiento a los 37 ˚C. Se caracterizan
por colonizar las mucosas de mamíferos (tracto respiratorio superior laringe, boca, faringe y
mucosas genitales) principalmente el tracto gastrointestinal, también pueden encontrarse en la piel
en la región perianal, interdigital y umbilical (23). Las infecciones producidas por estas levaduras
(candidiasis) se deben al desbalance en la respuesta inmune del hospedero y pueden ir desde
infecciones superficiales hasta llegar a ser invasivas comprometiendo la vida del paciente (4).
.La incidencia y prevalencia de las especies del género varía según la ubicación geográfica en la
que, por ejemplo, C. parapsilosis es la segunda especie más común en Europa y la región de Asia
y el Pacifico, mientras que C. tropicalis predomina más en América Latina (14,24,25). En el año
2017 se reportó en el territorio nacional cerca de 757.928 infecciones fúngicas, afectando al 1,5%
13
de la población y dentro de las cuales 600.000 correspondieron a candidiasis, con disminución de
aislamientos de C. albicans y aumento de otras especies como C. parapsilosis (26).
4.1.1 Candida glabrata
Corresponde a un microorganismo unicelular haploide que no posee la capacidad de formar tubo
germinativo, pseudohifas o hifas como C. albicans, presenta blastoconidias que varían entre 1-
4um generadas mediante reproducción asexual por gemación. Forma colonias lisas, brillantes y de
color crema en agar Sabouraud (SDA), en CHROMagar las colonias pueden presentar colores que
van desde rosa hasta morado. Con respecto a la bioquímica, esta especie es capaz de asimilar y
fermentar solo glucosa y trehalosa (27).
C. glabrata fue añadida al género Candida hasta el año 1978, ya que anteriormente había sido
clasificada en el género Torulopsis debido a su incapacidad para formar pseudohifas, característica
requerida a la fecha en la clasificación del género Candida, sin embargo, la estructuración de
dichos parámetros inclusivos fue reevaluada, teniendo entonces que para 1978 la descripción de
pseudohifas en Candida cambio e incluyo la ausencia de estas (28). En años posteriores, el estudio
de la levadura permitió identificar que posee 13 cromosomas y 5294 marcos abiertos de lectura
(ORF, open reading frame), de los cuales solamente el 6,25% (331) han sido caracterizados,
dejando cerca del 93,7% (4963) sin caracterizar (29).
Si bien C. glabrata tiene relevancia clínica en el género Candida, posee una relación
filogenéticamente más estrecha con S. cerevisiae que con C. albicans (30), pues pertenecen al
mismo clado, mientras que C. albicans hace parte de un clado diferente que presenta recodificación
del codón CUG, traduciéndose este como serina en lugar de leucina. A raíz de esta relación
evolutiva, la mayoría de los genes codificados en S. cerevisiae tienen un ortólogo en C. glabrata,
lo que permite observar fenotipos similares en múltiples procesos celulares (31,32). En general, la
levadura S. cerevisiae es usada como modelo para estudiar sistemas en eucariotas, primero por su
fácil manipulación y experimentación, y en segundo lugar por la gran cantidad de datos
disponibles, en los que se incluyen colecciones de mutantes las cuales se han convertido en una
herramienta útil en el conocimiento de la función génica, lo que en conjunto permite la
investigación de múltiples genes y proteínas, y siendo aún más razonable como sistema modelo
para C. glabrata por su cercana evolución (33,34).
14
4.1.1.1 Infección y tratamiento
Como se mencionó anteriormente, las especies de Candida hacen parte de la microbiota del ser
humano. Sin embargo, en la actualidad, el aumento de pacientes con sistema inmune
comprometido ha permitido mayor frecuencia de infecciones, además de reportarse incremento en
la mortalidad. Por otro lado, también se reporta distribución por grupo etario donde la frecuencia
de C. glabrata es mayor en los ancianos y más baja en niños y recién nacidos (15,16,27)
La familia de moléculas para el tratamiento de estas infecciones son los azoles, los polienos y las
equinocandinas. Los azoles se conforma por imidazoles y triazoles, moléculas fungistáticas que
actúan inhibiendo la enzima lanosterol-14-alfa-desmetilasa codificada por el gen ERG11
encargada de la síntesis del ergosterol, componente clave de la membrana celular, lo que conlleva
a la acumulación de esteroles tóxicos y posteriormente estrés en la membrana celular (18,35,36).
Los polienos se consideran fungicidas al unirse directamente al ergosterol y generar el posterior
ensamblaje del fármaco-ergosterol en poros acuosos de la membrana celular conduciendo a la
perdida de contenidos celulares y por ende la muerte de la levadura (18,37). Finalmente, las
equinocandinas son fármacos fungicidas que actúan a nivel de pared celular, inhibiendo la enzima
1,3-B-d-glucano sintetasa encargada de la síntesis de glucano codificada por los genes FKS (18).
4.1.1.2 Mecanismo de resistencia frente azoles y equinocandinas
Los azoles son los fármacos más comúnmente usados para la candidiasis, además son
generalmente recetados como tratamiento profiláctico o empírico debido a su biodisponibilidad y
seguridad, lo que tiene repercusión directa en la ganancia de resistencia por su uso prolongado y
generalizado. En la actualidad, estos fármacos no son recomendados para tratar las infecciones
por C. glabrata, ya que, es una de las especies no albicans que presenta altas tasas de resistencia
frente a estos (18,38).
Generalmente la resistencia adquirida a los azoles en C. glabrata es el resultado de la aparición de
mutaciones de ganancia de función en el factor de transcripción Pdr1, que conduce a la
sobreexpresión de bombas de e-flujo de la familia ABC (ATP Binding cassette) (Cdr1-Cdr2-
Snq2), permitiendo de esta manera la expulsión del fármaco y evitando su acumulación a nivel
intracelular (38,39).
15
La resistencia adquirida a las equinocandinas en C. glabrata está dada por mutaciones en los
puntos calientes HS1 y HS2 (HS, Hot spot) de los genes FKS1 y FKS2 que codifican la diana del
antifúngico, conllevando a la pérdida de afinidad entre la enzima y el fármaco. En la mayoría de
las especies de Candida las mutaciones aparecen en el gen FKS1, sin embargo, en C. glabrata las
mutaciones se han descrito en los HS del gen FKS1 y FKS2, más específicamente en FKS2 entre
los aminoácidos 659 - 667 para HS1 y entre los aminoácidos 1374 – 1581 para HS2 (5,6)
Se ha descrito que dichas mutaciones aparecen como producto de la presión selectiva debido al
uso constante de estos antifúngicos como terapia, por lo que la evolución de la resistencia a las
equinocandinas esta mediana por 3 pasos, estrés celular inicial, adaptación al fármaco y escape
genético. En primer lugar, la exposición a las equinocandinas genera la activación de varias vías
de respuesta al estrés generado por el fármaco, dentro de las que se destacan la vía de la integridad
de la pared celular, la vía de la proteína quinasa C (PKC protein kinase C), la vía de la proteína
quinasa activada por mitógenos (MAPK mitogen-activated protein kinase), la vía
Calmodulina/Calcineurina (CaM/CaL), entre otras, las cuales activan efectores que promueven la
tolerancia al estrés y en consecuencia la adaptación al fármaco mediante regulación positiva de
varios genes entre los que se encuentran el gen FKS2 que conlleva al aumento de la síntesis de
glucano. Finalmente, la combinación de esos factores y otros como la condición inmunológica del
paciente y las características farmacocinéticas del fármaco, entre otras, permiten y potencian el
escape genético y la resistencia estable mediante la aparición de mutaciones en las regiones HS1
y HS2 de los genes FKS (6).
4.1.1.3 Vía (CaM/CaL) y su papel en la ganancia de resistencia a los azoles y
equinocandinas
Está bien descrito que la vía CaM/CaL juega un papel esencial en la respuesta al estrés celular. La
calcineurina es una proteína fosfatasa serina/treonina que es dependiente del calcio y calmodulina,
presenta dos subunidades Cna y Cnb, donde la subunidad Cna posee acción catalítica y está
conformada por 3 dominios, dominio de unión a la calmodulina, dominio de unión a la subunidad
Cnb y un dominio autoinhibidor. Por otro lado, la Cnb es la subunidad reguladora (40,41).
El estrés celular genera como respuesta aumento de las concentraciones citoplasmáticas de Ca2+,
lugar donde este se une a la proteína calmodulina permitiendo su activación. Posteriormente la
calmodulina se une a la subunidad Cna de la calcineurina, complejo que es estabilizado por la
16
chaperona 90 (Hsp90). Finalmente, la subunidad catalítica Cna desfosforila factores de
transcripción como Crz1, el cual se transloca al núcleo y promueve la expresión de múltiples genes
que codifican proteínas implicadas en la respuesta al estrés celular (42).
La vía CaM/CaL participa en múltiples procesos celulares. Se ha descrito un papel en la
homeostasis del calcio, biosíntesis de esfingolípidos y pared celular, progresión del ciclo celular,
virulencia, mantenimiento de la integridad de la pared celular, termotolerancia, adaptación al estrés
térmico, oxidativo, osmótico y del RE, además de estar implicada en la respuesta a los antifúngicos
(41–43).
Frente a los azoles, la inhibición de la calcineurina por medio de fármacos como tacrolimus
(FK506) o ciclosporina (CsA) conllevan a la muerte de la levadura. Además, la deleción de alguna
de las subunidades de la proteína genera levaduras hipersensibles a los azoles (44–47). Por otro
lado, se ha identificado que la resistencia a los azoles dependiente de calcineurina, es un proceso
mediado por la proteína Rta2 en C. albicans y S. cerevisiae, la cual está implicada en la
movilización de lípidos en la membrana plasmática (48,49). En conjunto, se deja clara evidencia
que la vía es necesaria para mediar la respuesta frente al estrés ejercido por el azol.
Esta vía también participa en la respuesta frente a las equinocandinas, la activación aguas abajo
del factor de transcripción Crz1 promueve la expresión de genes como FKS2 implicados en la
biosíntesis del glucano de la pared celular. Además la inhibición de la calmodulina por medio del
fármaco flufenazina (Fph, Fluphenazine) provoca disminución de la CMI y retorno de la
susceptibilidad a caspofungina (45,47,50).
4.2 Pared celular fúngica
La pared celular es una estructura celular que determina la forma de la célula, participa en la
interacción con el medio, permite el paso de sustancias desde y hacia el exterior, y además la
protege de las amenazas físicas, químicas y biológicas. Esta estructura generalmente representa el
20% de la biomasa de una célula, y aproximadamente una quinta parte del genoma de las levaduras
está dedicado a su biosíntesis. Puede tener un grosor variable que oscila entre 200-300nm, y resulta
por la asociación de diferentes componentes (polisacáridos, glucoproteínas, lípidos) que se
encuentran enlazados entre sí ya sea por medio de enlaces covalentes, puentes de hidrogeno o
mediante interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas (51,52).
17
Polisacáridos de la pared fúngica
a. Glucano: Es el componente más abundante de la pared celular, se encuentra unido
covalentemente a la quitina. Se forma por la unión de moléculas de β-D-glucosa,
encontrando β-1,6-glucano y β-1,3-glucano, siendo este último el componente principal
que le confiere a la levadura elasticidad y resistencia a la tracción. Su síntesis es llevada a
cabo desde la membrana plasmática, lugar donde reside la enzima 1,3-β-d-glucano sintasa
responsable de su formación la cual es codificada por los genes FKS. Por otro lado, el β-
1,6-glucano juega un papel vital en la estructura de la pared, ya que permite la unión de β-
1,3-glucano y proteínas por medio del grupo GPI (gicosilfosfatidilinositol) (51–54).
b. Quitina: Corresponde a polímeros lineales de N-acetil glucosamina con enlaces β-1,4
asociados entre si mediante puentes de hidrógenos. A pesar de ser un componente
minoritario es esencial para la rigidez de la pared. Se encuentra en la parte interna de la
misma y, al igual que el glucano su síntesis se lleva a cabo en la membrana plasmática,
donde se localiza la quitina sintasa, enzima encargada de su síntesis. Los genes que
codifican para esta enzima son denominados como CHS (51,52,54).
c. Manano: Los mananos son polisacáridos formados por uniones de moléculas de manosa;
Se asocian a proteínas formando manoproteínas las cuales están altamente glicosiladas a
través de modificaciones postraduccionales con oligosacáridos ligados a N y ligados a O.
Se localizan en la parte externa de la pared celular y, son conformados en su gran mayoría
por homopolímeros de manosa, de 3-5% de proteínas y de 1-2% de fosfato. Este polímero
es responsable de conferir hidrofobicidad (51,52,54)
Proteínas de la pared fúngica
Las proteínas participan de forma activa con la pared celular. Como se mencionó anteriormente,
se encuentran en complejo con los polisacáridos formando las manoproteínas, las cuales poseen
una amplia distribución. Se pueden encontrar en la membrana celular o unidas a la pared
(integrales), con mayor abundancia en la capa más externa. Dentro de las proteínas integrales se
destacan aquellas que reciben un anclaje tipo GPI, el cual es añadido al extremo C-terminal y le
permite a la proteína su ensamblaje en la pared, generalmente se unen a β-1,6 glucanos y cumplen
diversas funciones, participan en la biosíntesis y remodelación de la pared, están implicadas en la
adquisición de hierro y detoxificación de radicales libres de oxígeno, además de ser esenciales en
18
la adherencia y formación de biopelículas. Por otro lado, se encuentran las proteínas Pir que están
unidas directamente a los β-1,3 glucanos y otras proteínas localizadas tanto en la membrana como
en la pared cumpliendo funciones específicas en el ensamblaje y remodelación de todos los
componentes, donde se destacan transglicosidasas, quitinasas, glucanasas, entre otras
(51,52,54).(Figura 1)
Figura 1. Estructura de la pared celular
Se evidencian los componentes principales de las especies del género Candida. Tomado de Lenardon MD et al, 2020
(55).
Síntesis de la pared celular
A nivel de la membrana plasmática se lleva a cabo la producción del glucano y la quitina, las
glicoproteínas comienzan su síntesis en el RE (Retículo endoplasmático) y finalizan en el AG
(Aparato de Golgi), lugares donde reciben diferentes modificaciones postraduccionales como
oligosacáridos ligados a N u O, anclajes GPI, y cadenas de manosa para finalmente ser secretadas
al espacio de la pared celular, donde se realiza el ensamblaje con los glucanos y la quitina presente
mediante glicosiltranferasas y otras enzimas encargadas de dar el entrecruzamiento entre los
componentes, formando de esta manera 2 capas una externa conformada principalmente por
manoproteínas y, una interna en cercanía a la membrana plasmática que presenta los glucanos y
quitina (22).
19
El orden en el que dichos componentes son integrados no ha sido del todo dilucidado, sin embargo,
a través de ensayos con protoplastos, en los cuales se evalúa de manera secuencial el material
formado, se ha establecido que el componente inicial es el 1,3-β-d-glucano, requerido para la
incorporación tanto de β1,6-glucano como de manoproteínas, seguido del ensamblaje de diversas
proteínas de pared celular como las que poseen anclaje GPI y finalmente la deposición de quitina
(56,57).
Integridad de la pared celular
Esta estructura es capaz de sufrir modificaciones ante la presencia de diferentes ambientes que le
generen estrés, sin embargo, vías de señalización le permiten responder al estrés con el fin de
mantener una estructura óptima. La vía de la integridad de la pared celular (CWI, Cell wall
integrity) es la que principalmente regula estas respuestas, mediante proteínas quinasas activadas
por mitógenos (MAPK) que son capaces de translocarse al núcleo para, allí, regular la
transcripción, como por ejemplo Slt2 / Mpk1 que se activan frente a ciertas variaciones
ambientales y a alteraciones de la pared celular, provocando en últimas una respuesta
compensatoria con aumento de expresión de genes que participan en la síntesis de glucano, quitina,
mananos y proteínas. Sin embargo, otras vías de señalización como la vía CaM/Cal también
participan en la biogénesis y adaptación frente al estrés causado en la pared celular (45,58,59).
Los componentes de la pared celular, además de ser claves para la funcionalidad y conformación
estructural, también juegan un papel importante en la virulencia, adherencia e interacción con el
hospedero, pues al ser la parte más externa de la levadura el reconocimiento por parte del sistema
inmunológico se desarrolla con las macromoléculas de la superficie, actuando como receptores de
ligandos presentes en células inmunes, epiteliales y endoteliales, las cuales reconocen
principalmente mananos (manoproteínas) y péptidos desencadenando así la respuesta inmune
(51,53,60–62). Por otro lado, la pared celular ha sido ampliamente estudiada como blanco de los
antifúngicos, ya que la mayoría de los componentes presentes en la misma no se encuentran en los
humanos y generalmente son esenciales para la viabilidad de la levadura, por esta razón es un
objetivo ideal para el diseño de fármacos (8,61).
El estudio de los componentes que conforman la pared celular (glucano-quitina-manoproteínas)
como blancos antifúngicos, ha permitido el desarrollo e implementación de fármacos como las
equinocandinas (inhibidores de la síntesis de glucano), las cuales actualmente tienen uso global y
20
son eficaces. Sin embargo, el desarrollo de la nikomicina y polioxina (inhibidores síntesis de
quitina), son menos eficaces puesto que no afectan de forma significativa a las principales especies
del género Candida (8). Ante esto, la evaluación de otras proteínas y componentes de la pared
celular es relevante en la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos.
4.3 Glicosilación de proteínas
La glicosilación de proteínas se debe a un proceso metabólico encontrado en todos los reinos de la
vida. En los hongos, juega un papel importante en la adición de carbohidratos a las proteínas
presentes en la pared celular, garantizando así una conformación estructural adecuada que
garantiza la viabilidad celular (63).
Las manoproteínas presentes en la pared celular contienen manosa mediante enlaces N u O. Este
proceso tiene lugar en la luz del retículo endoplasmático rugoso (RER) donde se agregan residuos
de manosa a moléculas aceptoras de azúcares de dolicol fosfato (DP) mediado por
glicosiltranferasas (GTs). En la N glicosilación la proteína Alg7 es la encargada del primer paso
del procesamiento del precursor, dado por la adición de N-acetilglucosamina (61–63).
La N-glicosilación se divide en 2 etapas secuenciales, (a) inicia en el RER donde se lleva a cabo
la síntesis y transferencia del precursor del oligosacárido Glc3Man9GlcNAc2 ligado al dolicol a la
proteína diana y (b) consiste en el procesamiento y maduración de glicanos ligados a N en el AG
y RER. La transferencia del precursor a residuos de asparagina (Asn) en la proteína diana, esta
mediado por oligosacaril transferasas (OST). Posteriormente la vía de la N-glicosilación continúa
con el procesamiento y maduración, mediante enzimas del RER, denominadas manosil
oligosacárido glucosidasa I que elimina la unidad α 1,2-glucosa más externa, y la manosil
oligosacárido glucosidasa II que recorta los siguientes α residuos de 1,3-glucosa conformando el
Glc1Man9GlcNAc2, el cual funciona como punto de control de calidad en el RE uniéndose al
complejo Calnexina/Calreticulina que cumple la función de sensor de plegamiento. A este nivel
la glucosidasa II elimina el último residuo de glucosa y si el plegamiento es correcto, la proteína
es expulsada del RER después que la α 1,2-manosidasa elimina un residuo de manosa,
conformando el GlcNAc2Man8 (61–63).
El procesamiento posterior se define como el punto de divergencia del proceso de N-glicosilación
entre levaduras y humanos, pues las enzimas que participan no están presentes en estos últimos.
21
En C. albicans la proteína unida al precursor GlcNAc2Man8 es reconocida por una α 1,6-
manosiltransferasa (Och1) encargada de agregar el primer residuo de manosa que funciona como
cebador para construir el esqueleto de α 1,6-manosa. En S. cerevisiae este es alargado en primer
lugar por M-Pol I (Manosa polimerasa I) que añade entre 3 a 7 residuos de manosa y
posteriormente por un complejo multimérico M-Pol II (Manosa polimerasa II). De manera
paralela, el esqueleto de α 1,6-manosa sirve como andamio para que Mnn5 agregue residuos de α
1,2-manosa, los cuales son alargados por manosiltranferasas Mnt4, Mnt5 y de la familia de genes
MNN2, terminando con residuos de α 1,3-manosa añadidos por Mnn1 en S.cerevisiae, sin embargo
se ha descrito que para C.albicans los residuos de α 1,2-manosa son usualmente cubiertos por β
1,2-manosa añadida por la familia de genes BMT, además las ramas de α 1,2-manosa también
22
pueden presentar fosfomanano sintetizado por las fosfomanosiltransfersas Mnt3 y Mnt5 (61–63)
(Figura 2).
Figura 2. Vía de la N-glicosilación
Se evidencian las similitudes y divergencia en la vía de la N-glicosilación entre los humanos y los hongos, el proceso
inicia en el RER y finaliza en el AG. Los recuadros y flechas verdes hacen referencia a la vía común, los azules a la
vía en hongos y las flechas rojas al procesamiento en humanos. Modificado de Martínez-Duncker et al, 2014 (63)
En cuanto a la O-manosilación, esta difiere sustancialmente entre humanos y C. albicans, pues
mientras la levadura solo presenta manosilglicanos ligados a O, los humanos tienen cerca de 6
tipos adicionales de glucanos que difieren en el primer azúcar añadido. El proceso inicia en el RER
y finaliza en el AG en ambos organismos, en C. albicans comienza por la adición de una manosa
a los residuos de serina o treonina presente en la proteína mediante manosil transferasas
pertenecientes a 3 grupos Pmt1 (Pmt1 y Pmt5), Pmt2 (Pmt2 y Pmt6) y Pmt4. Una vez la proteína
23
se transporta al AG Mnt1 y Mnt2 alargan la cadena, dicha estructura también puede presentar
fosfomananos (62–64). (Figura 3)
Figura 3. Vías de glicosilación
Tomado de Murciano C et al, 2011 (64)
Como se describió anteriormente, el proceso de glicosilación comprende una serie de pasos e
implica la participación de múltiples enzimas que en últimas permiten la producción de
manoproteínas esenciales para el mantenimiento de la pared celular. La pérdida de funcionalidad
de algunas de las enzimas implicadas genera defectos en el procesamiento de las manoproteínas
conllevando a: separación celular alterada, defectos morfológicos, reordenamientos en la
composición de la pared celular, incapacidad de formar biopelículas, inviabilidad celular, adhesión
reducida, atenuación de virulencia, entre otros. Por esta razón, las vías de glicosilación actualmente
se consideran posibles dianas antifúngicas para el estudio de nuevas opciones terapéuticas, pues a
pesar del desarrollo del inhibidor de la N-glicosilación tunicamicina y su eficacia frente a Candida,
la presencia de la proteína diana Alg7, en eucariotas imposibilita su uso (63).
24
4.4 Enzimas involucradas en la glicosilación de proteínas
N-glicosilación
Tabla 1. Proteínas involucradas en la vía de la N-glicosilación.
Complejos de proteínas
Proteínas
Función
Microorganismo
Referencia
Glicosiltransferasas
(GTs)
-Alg7: UDP-N-acetil-glucosamina-1-
P transferasa. --Alg13: α 1,3-manosiltransferasa.
--Alg14: Componente de la
transferasa UDP-GlcNAc. --Alg1: β 1,4-manosiltransferasa.
--Alg2: 𝛼1,3-𝛼1,6-
manosiltransferasa.
--Alg11:𝛼1,2-𝛼1,6-manosiltransferasa
Participan en la modificación del dolicol en la
cara citosólica del RER, mediante el uso de azúcares nucleotídicos UDP-GlcNAc y GDP-
Man para sintetizar el componente intermedio
Dol-PP-GlcNAc2Man5.
C. albicans (63)
--Alg3/9: 𝛼1,3-manosiltransferasa.
--Alg12: 𝛼1,6-manosiltransferasa.
--Alg6/8: 𝛼1,3-glucosiltransferasa.
--Alg10: 𝛼1,2-glucosiltransferasa
Median el procesamiento del componente
intermedio Dol-PP-GlcNAc2Man5 en el
lumen del RER, usando Dol-PP-Glc y Dol-PP-Man como donantes para sintetizar el Dol-PP-
Glc3Man9GlcNAc2.
Oligosacaril tranferasas (OST)
Compuesto de 9
subunidades transmembrana
--Wbp1: Subunidad β. --Swp1: Subunidad (δ)
--Stt3: Subunidad catalítica.
--Ost1: Subunidad 𝛼.
--Ost2: Subunidad Ɛ. --Ost3: Subunidad γ.
--Ost4: Subunidad OST
--Ost5: Subunidad ζ. --Ost6: Subunidad OST.
Encargadas de la transferencia del Dol-PP-GlcNAc2Man9Glc3 a los residuos de
asparagina de la proteína naciente mediante
enlaces nitrógenos de carboxamida.
S. cerevisiae,
Glucosidasa I --Cwh41: Manosil-oligosacárido
glucosidasa.
Elimina la unidad α 1,2-glucosa más externa. C. albicans
25
Glucosidasa II --Rot 2: Subunidad catalítica. --Gtb1: Subunidad de la glucosidasa
II
Elimina el residuo de α 1,3-glucosa más externa dejando expuesto el epítopo del
GlcNAc2Man9Glc1 que permite el paso por
control de calidad de las glucoproteínas.
C. albicans
Och1 --Och1: α 1,6-manosiltransferasa. Se encarga de la adición del primer residuo de manosa.
C. albicans
M-Pol I
(Manano polimerasa I)
--Mnn9 y Van1: Manosiltransferasas. Encargadas de añadir entre 3 a 7 residuos de
manosa.
S. cerevisiae
M-Pol II (Manano polimerasa II)
--Mnn9, Anp1, Mnn10, Mnn11 y Hoc1: α 1,6-manosiltransferasa
Encargadas de alargar la cadena de manosa. S. cerevisiae
Manosiltransferasas --Mnt4: α 1,3-manosiltransferasa.
--Mnt5: α 1,2-manosiltransferasa.
--Mnn2 y Mnn5: α 1,2-manosiltransferasa.
--Mnn1: α 1,3-manosiltransferasa.
Median la elongación de la cadena de manosa. C. albicans y S.
cerevisiae
BMT
(B-manosiltransferasas)
--Bmt1-6 Median la β 1,2-manosilación en los extremos
de la cadena de manosa.
C. albicans
Fosfomanosiltransferasas --Mnt3 y Mnt5: Manosiltransferasas Encargadas de agregar un residuo de manosa
al glicano por un enlace fosfodiéster.
C. albicans
O-manosilación
Tabla 2. Proteínas involucradas en la vía de la O-manosilación
Complejos de
proteínas
Proteínas
Función
Microorganismo
Referencia
PMT (Proteínas
manosiltransferasas)
--Pmt1, Pmt5, Pmt2, Pmt6, Pmt4: Proteínas O-manosiltransferasas.
Se encargan de añadir un residuo de manosa a los residuos de treonina o serina de la
proteína naciente.
C. albicans (63)
Manosiltransferasas --Mnt1, Mnt2: α 1,2-manosiltransferasas --KRE2(Mnt1), KTR1 y KRT3: α 1,2-
manosiltransferasas
Participan en la elongación de las cadenas de manosa.
Juntas añaden el segundo y tercer residuo de
manosa.
C. albicans
S. cerevisiae
(65)
26
4.5 Sistema CRISPR-CAS
El sistema CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/(Cas
Associated) se identificó como un método eficiente de inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas
que media la protección contra ADN exógeno proveniente de fagos y plásmidos, permitiéndoles
en términos generales escindir el ADN o ARN invasor. El continúo estudio del sistema logro
reinventarlo y adaptarlo en 2012 como un mecanismo eficiente para la edición de genes dirigida,
lo que actualmente ha logrado impactar la ingeniería genética (66,67).
Dependiendo el mecanismo de acción y los componentes que participan, el sistema CRISPR se
divide en 2 clases la cuales presentan a su vez diferentes tipos: los de la clase 1 se caracterizan por
presentar diferentes subunidades efectoras, y se encuentran los tipos I, III y IV. Por otro lado, los
de la clase 2 ejercen su función efectora a través de una única proteína multidominios encontrando
en el tipos II la proteína Cas9, tipo V Cas12 y VI Cas13 (67,68).
4.5.1 Sistema CRISPR-CAS9
Este tipo de sistema está conformado por la endonucleasa 9, un ARN de guía corta (sgRNA) y una
secuencia PAM (Motivo adyacente del protoespaciador). La endonucleasa es bilobulada, posee un
lóbulo con actividad nucleasa (NUC) y un lóbulo de reconocimiento (REC). El lóbulo NUC
presenta los dominios HNH, RuvC y PI, siendo este último el encargado de la interacción con
PAM. Por otro lado, el lóbulo REC posee 2 dominios REC1 y REC2. Los dominios HNH y RuvC
son los encargados de la actividad endonucleasa (67,69). (Figura 4)
Figura 4. Estructura Cas9
(A) Gen Cas9. Tomado de Nishimasu et al., 2014 (69). (B) sgRNA. Tomado de: http://www.sgrna.org/qa-of-sgrna/
3’
5’
A.
B.
27
El sgRNA se diseña como un único RNA que contiene el crRNA (CRISPR RNA) y el tracrRNA
(Transactivating crRNA). crRNA corresponde a las repeticiones de CRISPR, sin embargo, fue
diseñado como la secuencia 5´ que determina el ADN de interés por medio de emparejamiento de
bases de Watson-Crick y el tracrRNA hace referencia a la secuencia ubicada en 3´que media la
unión con Cas9 (70).
Finalmente, la secuencia PAM del ADN es esencial para el reconocimiento de Cas9 por medio del
dominio PI mediante unión especifica de bases, corresponde a una secuencia corta que se encuentra
adyacente a la secuencia de interés, para CRISPRCas9 la secuencia PAM corresponde a la tripleta
NGG (66).
La edición del ADN por medio del sistema CRISPR-Cas9 comprende una serie de pasos que en
últimas tienen como objetivo modificar una secuencia de ADN. El proceso generalmente inicia
con la inserción de un plásmido que contiene el sistema CRISPR-Cas9 en la célula de interés, una
vez insertado se expresa la proteína Cas9 que se ensambla al sgRNA por medio del tracrRNA en
el surco central entre los lóbulos REC y NUC, posteriormente el complejo Cas9-sgRNA reconoce
la secuencia de interés mediante emparejamiento de bases entre el ADN y crRNA formando el
complejo sgRNA-DNA y Cas9, además de las interacciones entre el dominio PI ubicado en el
lóbulo NU de Cas9 y la secuencia PAM adyacente, lugar donde inicia la separación de la doble
hebra de ADN. En este punto el dominio HNH se acerca a la cadena complementaria y la escinde,
lo mismo ocurre con RuvC en la hebra no complementaria generando así la ruptura de la doble
hebra (DSB), ante la cual se activan mecanismos de reparación de ADN, más específicamente de
reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ), en el caso que no haya una hebra molde,
por lo tanto, se generan inserciones y deleciones de nucleótidos aleatorias provocando Indels en el
genoma de la célula (67,71). (Figura 5)
28
Figura 5. Sistema CRISPR-Cas9
Imagen creada por Marius Walker, Wikimedia.
4.6 Antecedentes
La pared celular fúngica es la parte más externa de la levadura, le confiere la forma y permite la
interacción con el medio, compuesta principalmente por polisacáridos y proteínas, es una
estructura vital para la levadura. La exposición a fármacos como las equinocandinas disminuyen
la viabilidad celular al truncar la síntesis del componente más abundante de la pared, el glucano,
provocando de esta manera alteración en la conformación de la misma y desencadenando la muerte
del hongo. De igual manera, los azoles al interferir directamente con la membrana celular, impiden
la correcta síntesis y ensamblaje de los componentes presentes en la pared (22,36,54,72). A pesar
de esto, la estructura es dinámica y altera su composición en respuesta a los fármacos mediante la
regulación positiva de diferentes genes involucrados en la síntesis de los compuestos que la
conforman (10,19,53).
Se ha demostrado que la exposición a caspofungina y a los azoles en C. albicans y S. cerevisiae
genera una respuesta compensatoria mediante la sobreexpresión de proteínas GPI y enzimas
involucradas en la biosíntesis de glucano, mananos y quitina, en el intento de restablecer la solidez
de la pared, conduciendo a levaduras que presentan mayores porcentajes de quitina y mananos
(7,9,20,21,72,73).
Ahora bien, en C. glabrata, la exposición a los azoles también genera la sobreexpresión de
proteínas implicadas en la remodelación de la pared celular (74,75). Para el caso de la
caspofungina, la información es un poco más limitada, sin embargo la exposición a esta evidenció
29
que esta especie posee un comportamiento diferencial aumentando en mayor proporción la
cantidad de mananos en comparación con otras especies de Candida (9). Además, el abordaje
proteómico frente al fármaco realizado en una tesis doctoral del grupo de investigación de Micosis
Humanas y Proteómica de la Pontificia Universidad Javeriana, arrojo resultados que permiten
corroborar este mecanismo, debido a que se evidencio expresión de proteínas involucradas con la
biosíntesis de mananos, además de otras con anclaje GPI (76).
Finalmente, múltiples estudios han abordado la importancia de proteínas que responden a los
fármacos principalmente en C. albicans y S. cerevisiae, encontrando que la pérdida de los genes
que las codifican conlleva a defectos estructurales de la pared celular y provocan alteración en la
adherencia, virulencia, morfología y crecimiento, además que condicionan a la levadura, pues le
impide generar una respuesta adecuada. (77–82). Por otro lado, para C. glabrata la importancia e
impacto de estas proteínas no ha sido muy evaluada, pese a esto, se evidencia en conjunto que
estas tienen un rol esencial en la tolerancia frente a los antifúngicos, lo que las convierte en
moléculas de estudio en el intento de identificar posibles blancos terapéuticos o coadyuvantes de
los fármacos existentes.
5. Pregunta de investigación
¿Cuál es el fenotipo de levaduras con deleción o inhibición de proteínas implicadas en la
biosíntesis de pared celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés?
6. Objetivos
6.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de la deleción o inhibición de proteínas implicadas en la biosíntesis de pared
celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés.
Objetivos específicos
• Determinar el perfil de susceptibilidad a caspofungina y fluconazol y, el fenotipo frente a
condiciones de estrés (térmico, oxidativo, osmótico, agentes perturbadores de la pared
celular, inhibición CaM/CaL) en mutantes de proteínas implicadas en la biosíntesis de la
pared celular en S. cerevisiae.
30
• Evaluar el efecto del inhibidor de glicosilación ligada a N, tunicamicina, solo y en
combinación con caspofungina en C. glabrata sensible y resistente a caspofungina.
• Realizar el diseño bioinformático para la construcción de dos mutantes de proteínas
implicada en la biosíntesis de pared celular para la levadura C. glabrata.
7. Materiales y métodos
7.1 Cepas utilizadas y fármacos
La cepa utilizada de S. cerevisiae BY4743 (parental) y el conjunto derivado de mutantes de
deleción (heterocigotos diploides) (Tabla 1) pertenecen a la colección Yeast Knockout (YKO)
enmarcada en el Saccharomyces genome deletion project. (http://www-
sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html) que posee la subdivisión de
Micosis humanas y proteómica (MICOH-P) del Grupo de investigación de Enfermedades
infecciosas de la PUJ. De igual manera, las cepas de referencia C. parapsilosis 22019, C. krusei
6258, C. glabrata 2001 y las cepas clínicas de C. glabrata 1875,1256 y 916 fueron obtenidas del
banco de microorganismos que posee la subdivisión MICOH-P (Tabla 1). Los fármacos
caspofungina, fluconazol, flufenazina y tunicamicina (TM) fueron obtenidos de Sigma-Aldrich,
para su utilización se realizó una solución stock en DMSO, a excepción del fluconazol, el cual fue
diluido en agua destilada estéril.
Tabla 3. Levaduras usadas en este estudio.
CEPAS UTILIZADAS
Especie Descripción
S. cerevisiae BY4743 (cepa parental)
Biosíntesis de manoproteínas
mnn9Δ/MNN9
ktr1Δ/KTR1
mnn5Δ/MNN5
mnn10Δ/MNN10
sec53Δ/SEC53
31
Biosíntesis y proteínas con anclaje GPI
flo1Δ/FLO1
ccw12Δ/CCW12
ecm33Δ/ECM33
pst1Δ/PST1
gwt1Δ/GWT1
Biosíntesis de glucano
fks1Δ/fks1
fks2Δ/fks2
Biosíntesis de quitina
chs3Δ/CHS3
Biosíntesis de membrana
erg3Δ/ERG3
erg11Δ/ERG11
C. glabrata Cepas clínicas
1875 (Resistente a caspofungina)
1256 (Resistente a caspofungina)
0916 (Sensible a caspofungina)
Cepa de referencia
2001
C. parapsilosis Cepa de referencia
22019
7.2 Reactivación, mantenimiento e identificación de las levaduras
En primer lugar, se llevó a cabo la reactivación de las células que se encontraban almacenadas a -
80ºC, para esto, las levaduras se sembraron en agar SDA y se incubaron durante 48h a 30ºC,
posteriormente se repicaron en agar SDA manteniendo las mismas condiciones de incubación.
Pasadas las 48h, ambos cultivos fueron almacenados a 4ºC.
Las levaduras fueron identificadas mediante el sistema MALDI-TOF MS siguiendo los
lineamientos del fabricante. Las levaduras se incubaron durante 24-36h en agar SDA, a partir de
estas, se colocó una colonia en una placa de acero de 96 puntos (Bruker Daltonic), se agregaron
10uL de ácido fórmico y se dejó secar a temperatura ambiente, seguido, se agregaron 10uL de la
matriz HCCA (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) (proporcionada por el proveedor). Cada muestra
se realizó por duplicado, los espectros de masas de proteínas fueron analizados mediante el
software Flex Control y los espectros de referencia MALDI Biotyper versión 3.1 7311 (espectros
principales) (Bruker Dal-tonics, Bremen, Alemania). Los resultados del MALDI-TOF MS fueron
comparados y se obtuvo una puntuación de acuerdo con las especificaciones técnicas del
32
fabricante, de la siguiente manera: identificación correcta de género y especie (≥2.0),
identificación correcta de género (1.7-2.0) y sin identificación confiable (<1.7).
7.3 Pruebas de susceptibilidad
Las pruebas de susceptibilidad antifúngica se llevaron a cabo mediante el método de microdilución
en caldo siguiendo los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI-BMD),
guía M27-A3, con algunas modificaciones para la levadura S. cerevisiae (82), y para la
combinación de inhibidores con antifúngico. Las levaduras se cultivaron en agar extracto de
levadura peptona dextrosa (YPD extracto de levadura 1%, peptona 2% y dextrosa 2%) 24h a 30ºC,
posteriormente, se prepararon suspensiones de la levadura en medio líquido YPD a una
concentración de 0.5x103 -2.5 x 103 células/mL y se añadió un inóculo de 100 μL a una placa de
96 pocillos que contenía diluciones dobles seriadas de caspofungina (8ug/mL-0,003μg/mL),
fluconazol (64-0,125μg/mL) o flufenazina (15μg/mL). Finalmente, la CMI (Concentración
mínima inhibitoria) se determinó visualmente y mediante densitometría a 595nm como la
concentración más baja de fármaco que provocó una disminución significativa (CMI-2 o ≥50%)
en comparación con la del control de crecimiento sin fármaco después de 24h para caspofungina
y 48h para fluconazol a 30ºC. El control de calidad se aseguró probando las cepas C. parapsilosis
ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258 recomendadas por el CLSI (83), se realizaron 2
experimentos independientes (réplicas biológicas).
Para evaluar el efecto de la inhibición de la glicosilación ligada a N con el fármaco tunicamicina
se hizo uso de aislamientos clínicos de C. glabrata, los cuales se suspendieron en medio líquido
RPMI 1640 a una concentración final de 0.5x103 -2.5x103 células/mL y, se añadió un inóculo de
100 μl a una placa de 96 pocillos que contenía diluciones del fármaco tunicamicina (5ug/mL-
0,312ug/mL), la placa fue incubada durante 48h a 37ºC, se realizaron 2 experimentos
independientes. Con base a los resultados obtenidos en este ensayo se eligió la concentración de
0,625μg/mL para realizar la combinación con el fármaco caspofungina (único ensayo), siguiendo
la guía M27-A3 (83), se prepararon suspensiones como se describió anteriormente, en placas de
96 pocillos que contenían diluciones dobles seriadas de caspofungina (8ug/mL-0,03ug/mL) con o
sin él inhibidor de la N glicosilación, tunicamicina (0,625ug/mL), la CMI se determinó a las 24h
de incubación a 37ºC.
33
Para los ensayos con 2 experimentos independientes los resultados graficados se realizaron con el
promedio de los datos obtenidos.
7.4 Evaluación de estrés oxidativo, osmótico y térmico
La evaluación frente a estrés osmótico y oxidativo se llevó a cabo mediante un ensayo de puntos
(único ensayo) en agar YPD solo y con NaCl (0,5 M y 1M) y/o Menadiona (0,05mM y 0,1mM).
Se prepararon diluciones seriadas de la levadura en solución salina partiendo de 1x106células/mL
(0,5 McFarland) hasta llegar a una concentración de 1x103 células/mL. Finalmente, se colocó 5uL
de cada una de las diluciones en las diferentes placas de agar y se incubaron durante 48h a 30ºC
para la evaluación de estrés oxidativo y osmótico, y durante 48h a 30ºC, 37ºC y 42ºC para la
evaluación del estrés térmico.
7.5 Evaluación del efecto de los perturbadores de la pared celular blanco de calcoflúor
y rojo Congo
Los perturbadores de pared celular Rojo Congo (RC) y Blanco de Calcoflúor (BC) fueron
utilizados para determinar la respuesta a estrés en los mutantes de S. cerevisiae. El ensayo se llevó
a cabo tal y como se describe en el numeral 7.4, con variaciones en el agente utilizado (único
ensayo), en este caso las placas de agar YPD contenían 50 ug/mL y 100 ug/mL de blanco de
calcoflúor (inhibidor del ensamblaje de la quitina naciente) (84) y 100 ug/mL de rojo Congo
(inhibidor del ensamblaje del β-1,3-glucano) (85).
7.6 Diseño bioinformático para la construcción de mutantes mediante el sistema
CRISPR-Cas9
Con base en los resultados obtenidos (mayor afectación en el fenotipo), se decidió hacer la
construcción de 2 mutantes para las proteínas Mnn9 (implicada en el alargamiento del esqueleto
del manano en la N-glicosilación) y Ecm33 (Proteína GPI implicada en el mantenimiento de la
pared celular) en aislamientos clínicos de C. glabrata.
Las secuencias de los genes que codifican las proteínas Mnn9 ID: CAGL0L12804g y Ecm33 ID:
CAGL0M01826g fueron obtenidas a partir de la base de datos Candida Genome Database
(http://www.candidagenome.org/) que provee información de genes y proteínas de algunas de las
34
especies de Candida, incluida C. glabrata. Una vez identificada, se procedió a seleccionar el
sgRNA (puntuación de eficiencia Mnn9: 64,98%-Ecm33: 67.74%) en el servidor Chop-Chop
(https://chopchop.cbu.uib.no/), este fue insertado en el vector con el que se introducirá el sistema
en la levadura, a través del programa SnapGene Viewer, en este caso, se hizo uso del plásmido
desarrollado por Vyas (pV1382) (86), que contiene la endonucleasa Cas9, el sgRNA, un marcador
de selección NatR (Resistencia a Nourseotricina) y secuencia de la enzima de restricción BsmBI.
Además, se diseñó la plantilla de reparación que será entregada a la levadura junto con el plásmido
(2 codones stop, secuencia de la enzima de restricción BamHI, y secuencias homologas del gen de
interés).
Se diseñaron 2 pares de cebadores por gen, uno obtenido por el mismo servidor Chop-Chop para
amplificar el gen en la región de la modificación y el otro en Primer BLAST
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar todo el gen correspondiente.
7.6.1 Obtención del plásmido, transformación y validación
En este apartado se menciona el procedimiento que se realizará cuando se dé continuidad de las
perspectivas del presente trabajo.
La construcción de mutantes de C. glabrata se llevara a cabo mediante el uso del sistema CRISPR-
Cas9 siguiendo el protocolo utilizado por Ceballos y colaboradores (76).
Brevemente, la sgRNA se insertará en el plásmido pV1382 que previamente será sometido a
digestión con la enzima BsmBI, generando extremos pegajosos que permitirán generar el plásmido
recombinante.
Después de obtener el plásmido, este se amplificará en E. coli DHα y se purificará para realizar la
posterior transformación mediante electroporación en la levadura (87). Las células transformadas
se cultivarán en agar YPD suplementado con el marcador de selección nourseotricina. Una vez
aisladas las levaduras resistentes a la nourseotricina, se procederá a realizar una PCR para
amplificar el segmento de ADN del gen en el que se llevó a cabo la mutación, seguido de una
digestión con la enzima BamHI, que permitirá detectar las levaduras transformadas que integraron
la plantilla de reparación mediante la observación de dos bandas en el gen de agarosa. Finalmente
35
se confirmará la mutación mediante secuenciación de gen de interés en las levaduras que
presentaron 2 bandas.
Nota: Esta metodología corresponde a los métodos estándar que se llevan a cabo en el laboratorio
del grupo de investigación de Micosis Humana y Proteómica de la Pontificia Universidad
Javeriana (76).
8. Resultados
8.1 Evaluación de la susceptibilidad antifúngica a caspofungina y fluconazol en mutantes
de S. cerevisiae
Las mutantes de proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular se visualizan en la (Tabla
1), la elección se llevó a cabo siguiendo tres parámetros, (I) proteínas que presentan sobreexpresión
en presencia de caspofungina o fluconazol, (II) proteínas que en base a la literatura ha sido
demostrado su rol esencial en el mantenimiento y biosíntesis de la pared celular y, (III) proteínas
que generan alteraciones en el contenido de glucanos, manano o quitina cuando hay deleción del
gen codificante.
Tabla 4. Proteínas evaluadas en este estudio.
Proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular
Proteína Función (Saccharomyces genoma database) Referencia
Biosíntesis de manoproteínas
Mnn9
Longitud: 395 a.a
Peso molecular: 45949.9 Da
Subunidad del complejo manosiltransferasa de Golgi; este complejo media el alargamiento del esqueleto del manano del
polisacárido, N-glicosilación.
I y III
(76,88)
Mnn5
Longitud: 586 a.a
Peso molecular: 67199.9 Da
α-1,2-manosiltransferasa; responsable de la adición de la segunda
manosa unida a las ramas en la columna vertebral de manano de
los oligosacáridos, se localiza en un primer compartimento de Golgi, N-glicosilación.
Ktr1
Longitud: 393 a.a
36
Peso molecular: 46016.4 Da
α -1,2-manosiltransferasa; implicado en la glicosilación de proteínas ligadas a O y N; miembro de la familia de
manosiltransferasa KRE2 /MNT1.
Mnn10
Longitud: 393 a.a
Peso molecular: 46746.4 Da
Subunidad de un complejo manosiltransferasa de Golgi, que media el alargamiento de la cadena principal del manano; proteína
de membrana de la familia manosiltransferasa, N-glicosilación.
III (88)
Sec53
Longitud: 254 a.a Peso molecular: 29054.1 Da
Fosfomanomutasa; implicado en la síntesis de GDP-manosa y
dolicol-fosfato-manosa; requerido para el plegamiento y glicosilación de proteínas secretoras en la luz del RE; PMM2
homólogo humano complementa a mutantes de levadura.
(I)
Biosíntesis y proteínas con anclaje GPI
Flo1
Longitud: 1537 a.a
Peso molecular: 160585.1Da
Proteína similar a la lectina involucrada en la floculación; proteína
de la pared celular tipo GPI que se une a las cadenas de manosa en
la superficie de otras células, confiere capacidad de formación de
flóculos que es sensible a la quimotripsina y resistente al calor; importante para la co-floculación con otras levaduras, mediando la
interacción con especies específicas.
(I)
Ccw12
Longitud: 133 a.a
Peso molecular: 13052.7 Da
Manoproteína de la pared celular; desempeña un papel en el
mantenimiento de áreas recién sintetizadas de la pared celular; se
localiza en la periferia de las yemas pequeñas y en la región del tabique de las yemas más grandes.
I y III
(88,89)
Ecm33
Longitud: 429 a.a
Peso molecular: 43761.9
Proteína anclada a GPI implicada en la captación eficaz de glucosa; posible papel en el crecimiento de la yema apical; El
anclaje de GPI en la membrana plasmática es crucial para su
funcionamiento. Posee un parálogo Pst1.
I y II
(20,81)
Pst1
Longitud: 444 a.a Peso molecular: 45786.1 Da
Proteína de la pared celular que contiene un sitio putativo de unión
a GPI; secretado por protoplastos en regeneración; regulada por la activación de la vía de integridad celular, mediada por
Rlm1p; regulado por el daño de la pared celular a través de la
interrupción de FKS1.
I
(21)
Gwt1
Longitud: 490 a.a Peso molecular: 55484.7 Da
Proteína implicada en la acilación de inositol de GlcN-PI; la
acilación de inositol de glucosaminil fosfatidilinositol (GlcN-PI) forma glucosaminil (acil) fosfatidilinositol (GlcN (acil) PI), un
II y III
(91)
37
Enzima diana del antifúngico en desarrollo clínico
Manogepix (90).
intermedio en la biosíntesis de anclas de glucosilfosfatidilinositol (GPI). Proteína con ortólogo en humanos.
Biosíntesis de glucano
Fks1
Longitud: 1876 a.a
Peso molecular: 214847.9Da Enzima diana de la familia
de las equinocandinas.
Subunidad catalítica de 1,3-β-D-glucano sintasa; funcionalmente
redundante con subunidad catalítica alternativa Gsc2p; se une a la
subunidad reguladora Rho1p; involucrado en la síntesis y el mantenimiento de la pared celular; se localiza en sitios de
remodelación de la pared celular; FKS1 tiene un parálogo, GSC2.
III
(88)
Fks2 (Gsc2)
Longitud: 1895 a.a
Peso molecular: 216982.7Da
Enzima diana de las
equinocandinas.
Subunidad catalítica de 1,3-β-glucano sintasa; involucrado en la
formación de la capa interna de la pared de las esporas; actividad
regulada positivamente por Rho1p y negativamente por Smk1p.
FKS2 tiene un parálogo, FKS1.
I
(20,21)
Biosíntesis de quitina
Chs3
Longitud: 1165 a.a
Peso molecular: 131593.5Da
Enzima diana del antifúngico
nikomicina Z (92).
Quitina sintasa III; cataliza la transferencia de N-
acetilglucosamina (GlcNAc) a quitina; necesario para la síntesis
de la mayor parte de la quitina de la pared celular.
II y III (88)
Biosíntesis de membrana Erg3
Longitud: 365 a.a
Peso molecular: 42730.6 Da
Esterol desaturasa C-5; glicoproteína que cataliza la introducción de un doble enlace C-5 (6) en el episterol, un precursor en la
biosíntesis de ergosterol.
I
(20,21)
Erg11
Longitud: 530 a.a
Peso molecular: 60726.8 Da
Enzima diana de los azoles.
Lanosterol 14-alfa-desmetilasa; cataliza la desmetilación C-14 del
lanosterol para formar 4,4 '' - dimetilcolesta-8,14,24-trieno-3-
beta-ol en la ruta de biosíntesis de ergosterol.
38
La información de la función y características de las proteínas fue obtenida de la base de datos
Saccharomyces Genome Database. Obtenido de: https://www.yeastgenome.org/.
Las cepas fueron identificadas por el equipo MALDI-TOF MS (Anexo 1), las pruebas de
susceptibilidad para caspofungina permitieron conocer la CMI tal y como se observa en la Figura
6.
La cepa parental de S. cerevisiae BY4743 presentó una CMI de 0,25 μg/mL frente al inhibidor de
síntesis de glucano caspofungina.
Este cribaje inicial con caspofungina permitió identificar el perfil de susceptibilidad de los
mutantes de genes implicados con la biosíntesis de pared celular. De las 15 mutantes evaluadas,
8/15 (53%) presentaron disminución en la CMI en comparación con la cepa parental. De estas, 5
son mutantes de genes implicados en el proceso de biosíntesis de manoproteínas (Mnn9-Mnn5-
Ktr1-Mnn10-Sec53), 2 son mutantes que codifican proteínas de tipo GPI (Ccw12-Flo1) y una a
biosíntesis de glucano (Fks1). Dentro del grupo de las manoproteínas todas se vieron afectadas, lo
que podría indicar que los mananos juegan un papel importante en la estructuración de la pared
celular y en la respuesta a caspofungina. Además, curiosamente las mutantes de proteínas con
anclaje GPI que presentaron menor CMI también están relacionadas con mananos, a pesar de no
estar involucradas directamente en su biosíntesis. Por otro lado, las mutantes con deleciones en
genes responsables de la biosíntesis de la membrana celular o quitina no se vieron afectadas en el
perfil de susceptibilidad en comparación con la cepa parental.
39
Figura 6. Determinación del perfil de susceptibilidad a caspofungina
Se determinó la susceptibilidad de S. cerevisiae cepa parental BY4749 y mutantes de múltiples proteínas implicadas
en la biosíntesis de la pared celular. La barra de colores demarca el tipo de proteína o proceso al cual está asociada
(Morado: Biosíntesis de manoproteínas. Azul: Biosíntesis y proteínas con anclaje GPI. Verde: Biosíntesis de glucano.
Rojo: Biosíntesis de quitina. Amarillo: Biosíntesis de membrana) y la estrella hace referencia a la CMI. La barra de
color verde representa el crecimiento. La cepa 22019 es la levadura de referencia C. parapsilosis que permitió validar
la prueba.
Respecto al fluconazol, la cepa parental presentó una CMI de 16 μg/mL. Mientras que en las
mutantes se identificaron 7/15 (47%) con CMI <16 μg/mL, 3 asociadas a proteínas GPI (Ecm33-
Pst1-Gwt1), 2 a biosíntesis de membrana plasmática (Erg3-Erg11), una relacionada con biosíntesis
de manoproteínas (Sec53) y una con biosíntesis de quitina (Chs3), las mutantes restantes (8/15) no
presentaron cambio en el perfil de susceptibilidad a fluconazol con respecto a la cepa parental.
CONCENTRACIÓN CASPOFUNGINA (μg/mL) CEPA
CMI
40
Como se pudo observar frente al fluconazol se vieron afectadas proteínas de la mayoría de los
procesos evaluados, lo que sugiere que una pared celular adecuada es importante para la respuesta
frente al fluconazol. Además, al ser la membrana plasmática el punto de partida de síntesis o
localización de componentes, su alteración tendrá repercusión directa en el ensamblaje de la pared
celular.
En conjunto, se observó diferencia entre la cepa parental BY4743 y mutantes haploinsuficientes
de proteínas implicadas en la biosíntesis de pared celular, lo que indica que posiblemente la pérdida
de un alelo en estás, afecta la correcta síntesis del producto proteico comprometiendo así la aptitud
de la levadura y, permitiendo distinguir un fenotipo con respecto a la cepa salvaje.
41
Figura 7. Determinación del perfil de susceptibilidad a fluconazol
Se determinó la susceptibilidad de S. cerevisiae cepa parental BY4749 y mutantes de múltiples proteínas implicadas
en la biosíntesis de la pared celular. La barra de colores demarca el tipo de proteína o proceso al cual está asociada (Morado: Biosíntesis de manoproteínas. Azul: Biosíntesis y proteínas con anclaje GPI. Verde: Biosíntesis de glucano.
Rojo: Biosíntesis de quitina. Amarillo: Biosíntesis de membrana) y la estrella hace referencia a la CMI. La barra de
color verde representa el crecimiento. La cepa 22019 es la levadura de referencia C. parapsilosis que permitió validar
la prueba.
A partir de los resultados obtenidos fue seleccionada una mutante para cada uno de los procesos
evaluados, a excepción de la biosíntesis de manoproteínas y proteínas GPI, donde se eligieron 2,
esto con el fin de evaluar condiciones de estrés. Las mutantes elegidas son representantes de cada
grupo, no hubo criterios específicos para la elección.
CONCENTRACIÓN FLUCONAZOL (μg/mL) CEPA
CMI
42
8.2 Evaluación de estrés oxidativo, osmótico y térmico y, agentes perturbadores de la
pared celular
Como se describió anteriormente, la vía CaM/CaL es esencial en la respuesta frente a algunas
condiciones de estrés, por lo que su inhibición o pérdida de funcionalidad afectan múltiples
procesos biológicos en la levadura, por lo cual se hizo uso del inhibidor de la proteína calmodulina,
flufenazina (Fph, fluphenazine) solo y en combinación con fluconazol para evidenciar el fenotipo
de las levaduras frente la inhibición de la vía y su papel en la respuesta a fluconazol,
respectivamente (Figura 8).
No se observó disminución del crecimiento con el uso de Fph (15ug/mL). Sin embargo, la
combinación de los fármacos (Fph+Fluconazol) condujo a la disminución de CMI de la mayoría
de las levaduras evaluadas (7/8), confirmando así que la vía CaM/CaL es importante para la
respuesta/tolerancia frente a los azoles. El ensayo permitió identificar mutantes que fueron más
sensibles a la combinación de los fármacos con respecto a la cepa parental, dentro de las que se
destacan mutantes para las proteínas Ecm33 y Fks2.
43
Figura 8. Concentración mínima inhibitoria de fluconazol en condiciones basales y bajo la inhibición de la proteína
calmodulina.
La barra de colores demarca el tipo de proteína o proceso al cual está asociada (Morado: Biosíntesis de manoproteínas.
Azul: Biosíntesis y proteínas con anclaje GPI. Verde: Biosíntesis de glucano. Rojo: Biosíntesis de quitina. Amarillo:
Biosíntesis de membrana) y la estrella hace referencia a la CMI. La barra de color verde representa el crecimiento.
CEPA CONCENTRACIÓN FLUCONAZOL (μg/mL)
CMI
44
Estrés térmico
La evaluación del estrés térmico, osmótico y oxidativo se observa en la Figura 9. En cuanto al
estrés térmico no hubo diferencias entre la cepa parental y las mutantes, por lo que se puede deducir
que ninguna de las deleciones afecta la capacidad de crecimiento a 30 y 37 °C. Por otro lado, no
se observó crecimiento considerable a 40 °C en ninguna de las levaduras evaluadas.
Estrés osmótico
No hubo diferencias en el crecimiento en la concentración de 0,5M NaCl (Figura 9). Sin embargo,
se identificaron 3 mutantes con mayor dificultad de crecimiento en el medio que contenía NaCl
1M en comparación con la cepa parental, las cuales estaban asociadas a la biosíntesis de
manoproteínas (Ktr1), proteínas con anclaje GPI (Ecm33) y biosíntesis de glucano (Fks2), por otro
lado,
Estrés oxidativo
La menadiona (2-metil-1,4-naftalenodiona inductor de ROS) fue utilizada como agente oxidante.
En este ensayo únicamente se observó diferencia con la mutante para la proteína con anclaje GPI
Ecm33 en la concentración de 0,07mM de menadiona. Sin embargo, ninguna de las levaduras
logro crecer a 0,14mM (Figura 9).
45
Figura 9. Respuesta al estrés
(A) Estrés térmico 37 °C y 40 °C. (B) Estrés osmótico, las levaduras crecieron en presencia de 0,5 y 1M de NaCl. (C) Estrés oxidativo, las levaduras crecieron en
presencia de 0,07 y 1,4 mM de menadiona (Med). El medio YPD sin ningún agente estresante a 30 °C se consideró como el control de crecimiento.
46
Agentes disruptores de la pared celular
Frente al RC se observó disminución de crecimiento en las levaduras con deleciones involucradas
en la biosíntesis de manoproteínas (Mnn9-Ktr1), biosíntesis y proteínas con anclaje GPI (Ecm33-
Gwt1) y biosíntesis de glucano (Fks2). Por otro lado, se observó mayor crecimiento en
comparación con la cepa parental en la mutante de la proteína Chs3, la cual está encargada de la
síntesis de quitina.
Con respecto al BC dos mutantes se vieron afectadas a la concentración de 100 μg/mL, una
perteneciente a la biosíntesis de manoproteínas (Mnn9) y la otra de la categoría de proteínas con
anclaje GPI (Ecm33). En esta última se observó mayor disminución del crecimiento. No hubo
diferencias a 50μg/mL, además, las mutantes de estas proteínas mostraron disminución de
crecimiento frente a ambos colorantes.
Los resultados obtenidos se podrían explicar por la disminución de componentes específicos en la
pared celular, que podrían estar conllevando al aumento de glucanos y/o quitina y por ende más
susceptibilidad a los colorantes (Figura 10).
Figura 10. Respuesta frente agentes perturbadores de la pared celular
(A) Las levaduras crecieron en presencia de 100ug/mL de Rojo Congo (RC) y (B) en presencia de 50 y 100 ug/mL de
Blanco de calcoflúor (BC)
47
8.3 Efecto de tunicamicina solo y en combinación con caspofungina en C. glabrata
Se determinó que la TM afecta considerablemente el crecimiento de C. glabrata a partir de la
concentración de 0,5 μg/mL, e inhibición completa del desarrollo a la concentración de 2,5 μg/mL
(Figura 11)
Figura 11. Curva de crecimiento de C. glabrata en presencia de Tunicamicina (TM)
Las figuras hacen referencia a las cepas evaluadas. Cuadrado CAGL1875, triángulo CAGL1256, triángulo invertido
CAGL916 y rombo CAGL2001.
Teniendo en cuenta la dinámica de la pared celular que se ha descrito en la adaptación al estrés
frente agentes perturbadores de esta, la asociación de TM y antifúngicos genera interés, pues se
evita que el mecanismo compensatorio o de rescate entre en funcionamiento. Por lo que se evaluó
la combinación de caspofungina con TM. En este caso, la combinación se realizó con 0,625ug/mL
de TM, (concentración que no genera toxicidad) (Figura 11) con el fin de identificar si la
interrupción del mecanismo compensatorio desencadenado por la caspofungina permite disminuir
la CMI frente a la equinocandina (Figura 12).
48
Figura 12. Concentración mínima inhibitoria de caspofungina a nivel basal y bajo la inhibición de la N-glicosilación
en C. glabrata.
Para C. glabrata una CMI ≥0,5μg/mL frente caspofungina en microdilución en caldo se interpreta como levaduras
resistentes siguiendo el CLSI. La estrella hace referencia a la CMI. La barra de color verde representa el crecimiento.
La combinación de TM y caspofungina no genero cambios en la CMI, frente a los aislamientos
sensibles a caspofungina de CAGL916 y CAGL2001, sin embargo, en los aislamientos resistentes
CAGL1875 y CAGL1256 logró disminuir la CMI de forma significativa (>8 μg/mL a 1μg/mL).
Por otro lado, teniendo en cuenta la importancia de la vía CaM/CaL en múltiples procesos
biológicos incluyendo la respuesta antifúngica y además conociendo su participación en la
respuesta frente a la TM, se decidió probar la combinación con el inhibidor de CaM/CaL Fph.
(Figura 13)
Figura 13. Crecimiento de C. glabrata en presencia de Fph y TM solos y en combinación
La barra de color verde representa el crecimiento.
CONCENTRACIÓN CASPOFUNGINA (μg/mL) CEPA
CMI
CONCENTRACIONES (μg/ mL) CEPA
49
La combinación de Fph y TM logro disminuir el crecimiento en las 3 cepas evaluadas,
evidenciándose un mayor efecto de la combinación en la cepa CAGL1256. Indicando que la vía
CaM/CaL también es importante en la respuesta al estrés generado por la TM.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se corrobora la importancia de las manoproteínas en
la respuesta antifúngica en aislamientos clínicos de C. glabrata. Además, se plantea que ruta de la
N-glicosilación tiene un potencial importante en la búsqueda de dianas antifúngicas, pues la
presencia de la proteína blanco de la TM en eucariotas imposibilita su uso terapéutico en humanos.
Es así que la siguiente etapa de este estudio es la construcción de mutantes C. glabrata MNN9Δ,
proteína que participa en la ruta de la N-glicosilación y es exclusiva en hongos. Asimismo, se hará
la construcción de mutantes C. glabrata ECM33Δ, ya que quedó demostrado su rol en el
mantenimiento de la pared celular.
8.4 Diseño bioinformático-sgRNA
Con base en los resultados del objetivo 1 y 2, se eligieron las proteínas Mnn9 y Ecm33 para la
construcción de mutantes mediante el sistema CRISPR-CAS9 en C. glabrata, pues se evidenció
que tanto el proceso de glicosilación como las proteínas GPI juegan un papel importante en la
respuesta a las diferentes condiciones de estrés evaluadas.
Las secuencias de los genes que codifican para cada una de las levaduras se encuentran a
continuación, en color negro la región codificante y en gris claro se muestran 1000 pb antes y
después de esta región.
Las letras en rojo hacen referencia al codón de inicio y de parada, el sgRNA se encuentra subrayado
en color verde, la secuencia PAM en amarillo y los dos pares de cebadores en color azul y gris.
>Gen MNN9/CAGL0L12804g
5´→3´ Forward
CGCAAGACGACTGCGAAGATGATCACAGCATCGAGGAAAGAGACGAGGACAAGGTTGATGGTGAAGCAGA
AGCAGAAGCAGTAGCAGTATCAGAAGCAGAAGGTGAAGCAGAAGCTGGGCCTGAAATCCCAAGTGGAGCT
GGAGATGATACCTGTACTGGGGGTCAGGGGACACTCGAGAACCATCACATCACCAGTCAGGAGACCAACC
AGGATATCGAGTATAAGGCGGACCAGGAAGAAGGTGAGAAGACGTGTGTAGAGGCCAACTGCGACGGTGA
CAAGAAGTGCGAAGAGGACGACGACCACTCGCACCTGGCGATCGAGGACGGCGCGATCCCCACGCCTAAC
ATCACGAGGGATGTCCAGGGAGCCTTCACAAAGGATGTTCAAGGAGCCATTACCATCAACAACCACAGCT
ACGAATTCCAGTTCCCTTCCCGCACCGCAGACACCGACAGGAAGCTGTTCCTCAGCATCTGCAACAAGAT
ATGGTCCGAGAGACCTACCAAATAGACATATATATTGCATTTCCCGCACTCACACCCTCCTCCACAACAT
50
AATAAACATAATAAACATAATCTACATAATCTTAAAAGTATACGGACGGTAGATCAGCCAAAACGCACTA
GACAATACAGAGACGATGATGAGGTGCTTATTACCCAAGAAACAACATCACTAAAAACGTCATACTAAGA
AAAGTTTTCTGCGCATTCGCGACAGCTGGGGAAAGGCACGCATCACATTTTAAGAGGACGATGCCAAGGC
CAAACAAACAACACGTATGATTTTGGATTGGGCAGTGGAGTATTAGCCGCTGGTTGGAGGAGCAGTGATA
GGTAGAAGAGAGTGCTAGTCTGATCCGAGCCGTATATCCTCTTTTGAAGTGTGCTGAAACAAGAAAGGAG
CCTCTTTTCACAAGGTTTGCGCGGAAAACATAACGAAAAATATTGATAGCTGCTTGACATTGCAGTGCTA
AACGTATTTGGGTGTTCAAGATGGGTTTGAAGTTTACCAAATATCGTATGCGCAAGAACCCGCTCTATTT
GCTGCTGGTTCCTGTTGCTCTTTTGACAGTTTTCCTGATTTTCAGGTCGGATAGCGACGGTCTGTTTGGT
ACTGGTTCCCTGGCGAACTTCCAATGGGCTGATGAGCGTGAGAGAACTTTCTATTTCCCATACAGCTCTA
AGTTCAAGATGCCTAAATATTCTTATAAAGTCAAGAGCCGAAACTGGATGTTCCGTGACAACAAAGACGA
CAGAATTCCAAATGGACATGTCGCCAAGTATGACCTTAACAAGCTTCACTCCACCAGTGATGCAGCAGTC
AACAAGGAACAAGTTTTGATATTAACTCCTATGCAAACTTTCCACCAGGCCTATTGGGACAATCTATTGC
AATTGACCTACCCAAGAGACCTACTGGAGCTAGGATTTATCATCCCAAAATCTGCATCTGGTGACGCTGC
ATTAAAACAACTTGAAGCCGCTGTTAAGAGAGCTCAAACGGACAAGAAAAACAACAGATTTGGAAAAGTC
ACCATCCTACGTCAGGACTCTAAGGGATTCGATAAATTACAAGAGAAGGAGAGACACGCGCTGGCTGTTC
AAAAGGAGAGAAGAAGTGCCATGGCGTTGGCAAGAAACGAACTGCTATTTTCTACAATTGGTCCACATAC
ATCTTGGGTACTATGGTTAGATGCTGACATAATTGAGACAAAACCTTCATTGATCCAAGACATGACAGCT
TTGAACAAACCAGTCTTGGCTGCTAATGTGTACCAAAGATATTTTGATGAGGCTGAGAACAAGCCATCGA
TTAGACCATATGATTTCAACAATTGGGCTGATAGCCAAATTGCTCAAGAACTTGGTGATAAGATGGGTGA
CGACGAAATCATTGTTGAGGGTTATGCCGAGATTGCTACCTATAGACCATTGATGGCTCACTTTTACACA
CCAGACGGACCACCAAATGAATTGATGTCGCTGGATGGTGTCGGCGGTGGTTGTACATTGGTAAAGGCTG
AAGTACACAGAGATGGTGCTATGTTCCCAACTTTCCCATTTTACCATTTGATCGAGACTGAAGGGTTTGC
TAAGATGGCCAAGAGATTGAACTACGAAGTATTCGGCTTGCCAAACTATTTAGTATTCCACATCGAGGAA
AGAAACGACTAAATGTCTCCCAATCAATTGTTTTTGAAGCCCTGACCATTTGATGGAAACATGTGGTTGC
CCTAATGTAAGTGTATCATATCCAATTCTATAGAAATATAAACTCATAAATTCCTATACCTATTATACAT
TACAAATATCAGAATATAATGTCCTTTTCATCATATTTATTAATTATTACACTATCACAGATCATGGTAC
TAGTTCCTCTCACATTGTAATTATTACCATGAGCATTAATTTTTCAAAAATCTGCATTTGTTAGAGTCCT
TCCAGAAAAAAGAATACCAAGAAATAGCATTTCCCATAAGTTTGATTATTTGTAAACAGGTGGTCTGTCA
TTCTTATTTCTTTGCAGTCTCAATATCATCCATTCAATGGAATCCTTGATACCTTCTCCGGTCAATGCGC
AAACCGGCAGTACTCTGCTGTCCCTTGCACTCATATGTTCGGCAATCCTATTAAAAATTTCTTTTATATC
CTGTACTTCCATTCTTTCAGGCTTGTCTTGTTTATTCGCTAACATGAGAATAGGTATACCTTCGATTTCA
TCATCCATCACTATTGTTCGCAGAGTTTCACTGCACTCATCAATCCTTGATCTATCAGTACTATCCACCA
CAAATATGATTCCATGGCATTGAGGATAGTATTCAGACCACATAGCCCGCAGAGATGCCTGCCCACCAAC
ATCCCAAAACTTTAGTATGCTGCGGTTATTATCTACTGGTATCGTAGCCACATTCTGTCCAACTGTGGGT
GCTATCTTATCTAAGGGTTTCGAATGCATCGAGTACTCTTTCTTTAGTGTCTCGAGAAAAGTCGTCTTCC
CAGCATTATCTAGACCGAGGATCAATATCGAGTATTGCTCTCGCTTGTTCCAGTTGTTGTATAGTCCCTT
GACCAAGTGAAACATCTTCAAGTCCGAAAGTTGTCTTATATGTTCTATTGTCTCTCACAGCTTATGTCTC
ACAAACGTGGCTATATGATTTACTGAGTAGTT
5´→3´ Reverse
AACTACTCAGTAAATCATATAGCCACGTTTGTGAGACATAAGCTGTGAGAGACAATAGAACATATAAGAC
AACTTTCGGACTTGAAGATGTTTCACTTGGTCAAGGGACTATACAACAACTGGAACAAGCGAGAGCAATA
CTCGATATTGATCCTCGGTCTAGATAATGCTGGGAAGACGACTTTTCTCGAGACACTAAAGAAAGAGTAC
TCGATGCATTCGAAACCCTTAGATAAGATAGCACCCACAGTTGGACAGAATGTGGCTACGATACCAGTAG
ATAATAACCGCAGCATACTAAAGTTTTGGGATGTTGGTGGGCAGGCATCTCTGCGGGCTATGTGGTCTGA
ATACTATCCTCAATGCCATGGAATCATATTTGTGGTGGATAGTACTGATAGATCAAGGATTGATGAGTGC
AGTGAAACTCTGCGAACAATAGTGATGGATGATGAAATCGAAGGTATACCTATTCTCATGTTAGCGAATA
AACAAGACAAGCCTGAAAGAATGGAAGTACAGGATATAAAAGAAATTTTTAATAGGATTGCCGAACATAT
GAGTGCAAGGGACAGCAGAGTACTGCCGGTTTGCGCATTGACCGGAGAAGGTATCAAGGATTCCATTGAA
TGGATGATATTGAGACTGCAAAGAAATAAGAATGACAGACCACCTGTTTACAAATAATCAAACTTATGGG
AAATGCTATTTCTTGGTATTCTTTTTTCTGGAAGGACTCTAACAAATGCAGATTTTTGAAAAATTAATGC
51
TCATGGTAATAATTACAATGTGAGAGGAACTAGTACCATGATCTGTGATAGTGTAATAATTAATAAATAT
GATGAAAAGGACATTATATTCTGATATTTGTAATGTATAATAGGTATAGGAATTTATGAGTTTATATTTC
TATAGAATTGGATATGATACACTTACATTAGGGCAACCACATGTTTCCATCAAATGGTCAGGGCTTCAAA
AACAATTGATTGGGAGACATTTAGTCGTTTCTTTCCTCGATGTGGAATACTAAATAGTTTGGCAAGCCGA
ATACTTCGTAGTTCAATCTCTTGGCCATCTTAGCAAACCCTTCAGTCTCGATCAAATGGTAAAATGGGAA
AGTTGGGAACATAGCACCATCTCTGTGTACTTCAGCCTTTACCAATGTACAACCACCGCCGACACCATCC
AGCGACATCAATTCATTTGGTGGTCCGTCTGGTGTGTAAAAGTGAGCCATCAATGGTCTATAGGTAGCAA
TCTCGGCATAACCCTCAACAATGATTTCGTCGTCACCCATCTTATCACCAAGTTCTTGAGCAATTTGGCT
ATCAGCCCAATTGTTGAAATCATATGGTCTAATCGATGGCTTGTTCTCAGCCTCATCAAAATATCTTTGG
TACACATTAGCAGCCAAGACTGGTTTGTTCAAAGCTGTCATGTCTTGGATCAATGAAGGTTTTGTCTCAA
TTATGTCAGCATCTAACCATAGTACCCAAGATGTATGTGGACCAATTGTAGAAAATAGCAGTTCGTTTCT
TGCCAACGCCATGGCACTTCTTCTCTCCTTTTGAACAGCCAGCGCGTGTCTCTCCTTCTCTTGTAATTTA
TCGAATCCCTTAGAGTCCTGACGTAGGATGGTGACTTTTCCAAATCTGTTGTTTTTCTTGTCCGTTTGAG
CTCTCTTAACAGCGGCTTCAAGTTGTTTTAATGCAGCGTCACCAGATGCAGATTTTGGGATGATAAATCC
TAGCTCCAGTAGGTCTCTTGGGTAGGTCAATTGCAATAGATTGTCCCAATAGGCCTGGTGGAAAGTTTGC
ATAGGAGTTAATATCAAAACTTGTTCCTTGTTGACTGCTGCATCACTGGTGGAGTGAAGCTTGTTAAGGT
CATACTTGGCGACATGTCCATTTGGAATTCTGTCGTCTTTGTTGTCACGGAACATCCAGTTTCGGCTCTT
GACTTTATAAGAATATTTAGGCATCTTGAACTTAGAGCTGTATGGGAAATAGAAAGTTCTCTCACGCTCA
TCAGCCCATTGGAAGTTCGCCAGGGAACCAGTACCAAACAGACCGTCGCTATCCGACCTGAAAATCAGGA
AAACTGTCAAAAGAGCAACAGGAACCAGCAGCAAATAGAGCGGGTTCTTGCGCATACGATATTTGGTAAA
CTTCAAACCCATCTTGAACACCCAAATACGTTTAGCACTGCAATGTCAAGCAGCTATCAATATTTTTCGT
TATGTTTTCCGCGCAAACCTTGTGAAAAGAGGCTCCTTTCTTGTTTCAGCACACTTCAAAAGAGGATATA
CGGCTCGGATCAGACTAGCACTCTCTTCTACCTATCACTGCTCCTCCAACCAGCGGCTAATACTCCACTG
CCCAATCCAAAATCATACGTGTTGTTTGTTTGGCCTTGGCATCGTCCTCTTAAAATGTGATGCGTGCCTT
TCCCCAGCTGTCGCGAATGCGCAGAAAACTTTTCTTAGTATGACGTTTTTAGTGATGTTGTTTCTTGGGT
AATAAGCACCTCATCATCGTCTCTGTATTGTCTAGTGCGTTTTGGCTGATCTACCGTCCGTATACTTTTA
AGATTATGTAGATTATGTTTATTATGTTTATTATGTTGTGGAGGAGGGTGTGAGTGCGGGAAATGCAATA
TATATGTCTATTTGGTAGGTCTCTCGGACCATATCTTGTTGCAGATGCTGAGGAACAGCTTCCTGTCGGT
GTCTGCGGTGCGGGAAGGGAACTGGAATTCGTAGCTGTGGTTGTTGATGGTAATGGCTCCTTGAACATCC
TTTGTGAAGGCTCCCTGGACATCCCTCGTGATGTTAGGCGTGGGGATCGCGCCGTCCTCGATCGCCAGGT
GCGAGTGGTCGTCGTCCTCTTCGCACTTCTTGTCACCGTCGCAGTTGGCCTCTACACACGTCTTCTCACC
TTCTTCCTGGTCCGCCTTATACTCGATATCCTGGTTGGTCTCCTGACTGGTGATGTGATGGTTCTCGAGT
GTCCCCTGACCCCCAGTACAGGTATCATCTCCAGCTCCACTTGGGATTTCAGGCCCAGCTTCTGCTTCAC
CTTCTGCTTCTGATACTGCTACTGCTTCTGCTTCTGCTTCACCATCAACCTTGTCCTCGTCTCTTTCCTC
GATGCTGTGATCATCTTCGCAGTCGTCTTGCG
Para esta proteína el sgRNA elegido se puede visualizar en la Tabla 3.
>Gen ECM33/CAGL0M01826g
5´→3´ Forward
TATTTCATGTAACATATTCACCGCTTTGATATCAAGACAAAAGAGCATATTTGAATTCTTGTGCAATATC
AGGAACAAAAAGAAAAATGTGGTTGAAGTGTAAGAGCAGGGTAAACCAGTATAGTTAACGGTAGTATCAC
GAAAGCTGGTTGTGGAACAGACTAACCTGGTTGATATATAGATTGATTTGGAAACAGTAATTATTATAAT
TATTATTAATAGTGGGGTATCGATTGGGTCTATATTTTTACAAAACTAGATAAATTGGAATAAAATAAAA
ACAAACTTTGTAAAACGATTTCTTTTTATGGGTTCCATCAGAGCTTTAAAAAGAACAAAAAATAAAAATT
TTTATAAGGATAACGAAAATGAAGCAAGTAGCTCCAACTAGCTCCCTTTAATTGTATGGGTAAGTTATTG
TCCTGTGGACAAGAAAACGTCTGTAAACTATGCCAAACTTTATCTCCTTTTCTCTTTTCTTATAATTAAG
GAATTTATGGGGATTTTTGAAAGTGTAAAAAATGTCATTAAAAGAGCGTTACGTCTAGTGTCTAACTGTC
52
AGTGCTGCTGCAGAAAAAAAAACGGTAACTTCGGAAAGAGTGTGTCTTTTCCGAAAGTGAAGAAAGCTAA
CAATTCTTCCTGGAGTTTAAAGAGAAGAACAAAACATCCTGGTCTGCCGTTTGTTATTTTGTTATCAATA
GTTTCACTTTGTCTCTATATATGGTTTAAAAGATCAACTGGTGAGTGGAAATAACAAGGAGTGAGCACGC
CCGAAACAACATTCCTATTGTATAAATATTTTTGTTCGTCTCAATTTCAGTGGAGTTATTAGTTATTAAA
TGCGATTGGTTGAGATGTAATGAAGGAAGTACATTTCACACAAAAAATATATCTGTGGTGTGAAAGTAAA
TTTCGATCTCTTATAATTTTTTTCTCAGTAGAAGAGGGGAAGGAATAACTGTAATAAATAAATTATTGAG
CTATTATTTCGTCTACCTCATCATAGCAAAGCGACGGCGACAGCAGCGACGGCACCGAAGAAGGAGCCGG
CTGGGAAGACTTCTTGGGCGGCGGCACCCTTAGACTTCTTGGTCTTGGTGGAGGAAGTGGAAGCAGTGTC
GTTGGATCTGGCGGTAACAGTAGCGGAAGCGGAGGAAGAGGCGGAAGAAGAGCGGGATCTGGAAGACATG
CTGATGGAAGTGGAAGTAGCACCGTTCTTGCAGACGAAGGAGTCACCTTGGATGGCACCCTTGCTTTGTA
GGGACTTCAAAGGAGAGCAGGAGAAGTTACCGGAGACGGTGTTGAAAGTGGCACCACCTCTGACGGACTT
CAAGGAGGACAAGTCCAAAGTGGTGAAGTTACCGGTGATGTCGATGGCACCGCCGACAGTTTGGACGTTC
TTCAAACCGTCGATGGTCTTCAAGTTAGTGTTGTTGGCGACGACCAGACCACCGCCGACGGAGGTCAAGT
TCAAGAAGGACAACTGGGTCAAGTCATCGTTGGAGACAACGGATAGGGATTGACCGACCTTGGACAAGTG
GGTCAAGTTCAAAGTGGAGATGGTGTTGTTGATGAAACCCAGGGAGGCGTTAACGGACTCCAGCTTGGCG
AAAGAGGCGTTTTGGACGTCTCTCAAGGTGATGTTGTTGGCCCAGATCAAGTTGTCAAAGGACACGGCGG
TTTCATCGGCGTTGGAGGCGAATTGCAAAGCACCTGACACGGATTCCAAAGAGGACTTGAAAGAGTTCAA
GTATCTGTTGTTGTTGATGTTTAGGACGTTGACCTCTTTCAAAGAGCCGAAACCTTCGACGGACTCCAAA
GAGGTGTCGGAGACGACGATGTTGTTGGCGGATTGCAAGTTAGTGTTGAAAGTGGAGATGGCTGGCAGAG
TGATCAAGTTGATGGTGTCGACTTCTTCCAGCGCACCGAAGGACGCAGTGGTCAAGATGGTCAAGTCCTG
CATGTTCAAAGCACCGGTGATCTCCTTGACGGAGTCAGCAGCAAAAGAGCCCAAGGAGGTGGCATTGTAG
ATTCTCAAAGAACCATCGATCTTCTTGACACCGGCTAGCGCAGCAGAGCCAAGAGCACCAGTGATGGTCA
AGTTACCAACAATGGTCTCACACCCGCTGTACTTGTCCAGATCAGACTGTGCAGTAGCAGTAGCACTGCT
ACCAAGAGAACACCCAGATGGAACATCGTCAGATGTAGAGTTCTGACCCAAAACAGAAGTAGCCATAGCG
GCATATACCAATGATGTGACCTTCATTATTTTATTTTATTTGTTTTTTTATTGTAATTCGTCGTTGTTTC
CTTTCTCCTCCCGATTCCCCACCAGTATGTGTCTTGCTACCCAAGGGCACTAGCTTTATATAGCTTCACC
CAGAAGTGAAAAAAATTTTTCATTTTCCCGTTTTGTTTGTTTGTGTTTTCTCGTCCGTTTACTGCGCTCT
CTCTCTCCCCCTCTGATGTTTACCAATTTCTCTGTTGGTACCACACAAACACCCGCAGCAAGTTTCGGTT
ATTTTTCCCGTCTCTCTCCCGTCCCTCTCTCTCTACGGGTGTTTCTTCGTGTGATGACACGACCCAGACC
GCGTTTTTGGGTGTCCCGCGCGCACTTCTGGGTCGCCAGGTACCGCATTGTCTTGCGTGTCAACATATAG
TGTTCTTGTATTGACATACAATACAATACAATACAACAATACAACAATACAACACAATACAACACAATAC
AATACAACAACACATCAATATAACGTTTGTGGTAATACCATAATATAACTGTGTACCCCCCCCCTCTCTC
GTGGGAGCGTGGCTCACGACCTGAGGTTTGGGTATTTCTTGTCTTGGCCCTTTCGAAACTAGCAAGTTCA
TTCCCCTCTTAGAAGTAGCACAGAAATGATACACTCTCGAAACGTACAGGCGCTGCTGGACGGTATGCTC
GGCGGGTGCGACGTGCTGGAGGGCACCGTGCCGGTGCCCGCCCTGCACAGCGTAGCTCTGCTCTCCGCAG
ACACGGGATCCATCATATCCTTCAGCAAAGAGCACGACCTCGAGCATGGCCCAGCGGAGCACGACTCCCT
CAACAACTTGCGTATCATGGCACTGCTGGTCAAGGACAAGTTCTCCTCGGACGAGAAGAAGTCCTGCGAG
AAGGGCTACGACCTCGACGGCGGCCACAGGGCGTACACCTACGACGTCGAGGACCTGCACGCCAGCGTGA
CCAGGATCCCCGATAGCGACCTCCTGCTCATGCTCCTCGCCCACAG
5´→3´ Reverse
CTGTGGGCGAGGAGCATGAGCAGGAGGTCGCTATCGGGGATCCTGGTCACGCTGGCGTGCAGGTCCTCGA
CGTCGTAGGTGTACGCCCTGTGGCCGCCGTCGAGGTCGTAGCCCTTCTCGCAGGACTTCTTCTCGTCCGA
GGAGAACTTGTCCTTGACCAGCAGTGCCATGATACGCAAGTTGTTGAGGGAGTCGTGCTCCGCTGGGCCA
TGCTCGAGGTCGTGCTCTTTGCTGAAGGATATGATGGATCCCGTGTCTGCGGAGAGCAGAGCTACGCTGT
GCAGGGCGGGCACCGGCACGGTGCCCTCCAGCACGTCGCACCCGCCGAGCATACCGTCCAGCAGCGCCTG
TACGTTTCGAGAGTGTATCATTTCTGTGCTACTTCTAAGAGGGGAATGAACTTGCTAGTTTCGAAAGGGC
CAAGACAAGAAATACCCAAACCTCAGGTCGTGAGCCACGCTCCCACGAGAGAGGGGGGGGGTACACAGTT
ATATTATGGTATTACCACAAACGTTATATTGATGTGTTGTTGTATTGTATTGTGTTGTATTGTGTTGTAT
TGTTGTATTGTTGTATTGTATTGTATTGTATGTCAATACAAGAACACTATATGTTGACACGCAAGACAAT
GCGGTACCTGGCGACCCAGAAGTGCGCGCGGGACACCCAAAAACGCGGTCTGGGTCGTGTCATCACACGA
AGAAACACCCGTAGAGAGAGAGGGACGGGAGAGAGACGGGAAAAATAACCGAAACTTGCTGCGGGTGTTT
53
GTGTGGTACCAACAGAGAAATTGGTAAACATCAGAGGGGGAGAGAGAGAGCGCAGTAAACGGACGAGAAA
ACACAAACAAACAAAACGGGAAAATGAAAAATTTTTTTCACTTCTGGGTGAAGCTATATAAAGCTAGTGC
CCTTGGGTAGCAAGACACATACTGGTGGGGAATCGGGAGGAGAAAGGAAACAACGACGAATTACAATAAA
AAAACAAATAAAATAAAATAATGAAGGTCACATCATTGGTATATGCCGCTATGGCTACTTCTGTTTTGGG
TCAGAACTCTACATCTGACGATGTTCCATCTGGGTGTTCTCTTGGTAGCAGTGCTACTGCTACTGCACAG
TCTGATCTGGACAAGTACAGCGGGTGTGAGACCATTGTTGGTAACTTGACCATCACTGGTGCTCTTGGCT
CTGCTGCGCTAGCCGGTGTCAAGAAGATCGATGGTTCTTTGAGAATCTACAATGCCACCTCCTTGGGCTC
TTTTGCTGCTGACTCCGTCAAGGAGATCACCGGTGCTTTGAACATGCAGGACTTGACCATCTTGACCACT
GCGTCCTTCGGTGCGCTGGAAGAAGTCGACACCATCAACTTGATCACTCTGCCAGCCATCTCCACTTTCA
ACACTAACTTGCAATCCGCCAACAACATCGTCGTCTCCGACACCTCTTTGGAGTCCGTCGAAGGTTTCGG
CTCTTTGAAAGAGGTCAACGTCCTAAACATCAACAACAACAGATACTTGAACTCTTTCAAGTCCTCTTTG
GAATCCGTGTCAGGTGCTTTGCAATTCGCCTCCAACGCCGATGAAACCGCCGTGTCCTTTGACAACTTGA
TCTGGGCCAACAACATCACCTTGAGAGACGTCCAAAACGCCTCTTTCGCCAAGCTGGAGTCCGTTAACGC
CTCCCTGGGTTTCATCAACAACACCATCTCCACTTTGAACTTGACCCACTTGTCCAAGGTCGGTCAATCC
CTATCCGTTGTCTCCAACGATGACTTGACCCAGTTGTCCTTCTTGAACTTGACCTCCGTCGGCGGTGGTC
TGGTCGTCGCCAACAACACTAACTTGAAGACCATCGACGGTTTGAAGAACGTCCAAACTGTCGGCGGTGC
CATCGACATCACCGGTAACTTCACCACTTTGGACTTGTCCTCCTTGAAGTCCGTCAGAGGTGGTGCCACT
TTCAACACCGTCTCCGGTAACTTCTCCTGCTCTCCTTTGAAGTCCCTACAAAGCAAGGGTGCCATCCAAG
GTGACTCCTTCGTCTGCAAGAACGGTGCTACTTCCACTTCCATCAGCATGTCTTCCAGATCCCGCTCTTC
TTCCGCCTCTTCCTCCGCTTCCGCTACTGTTACCGCCAGATCCAACGACACTGCTTCCACTTCCTCCACC
AAGACCAAGAAGTCTAAGGGTGCCGCCGCCCAAGAAGTCTTCCCAGCCGGCTCCTTCTTCGGTGCCGTCG
CTGCTGTCGCCGTCGCTTTGCTATGATGAGGTAGACGAAATAATAGCTCAATAATTTATTTATTACAGTT
ATTCCTTCCCCTCTTCTACTGAGAAAAAAATTATAAGAGATCGAAATTTACTTTCACACCACAGATATAT
TTTTTGTGTGAAATGTACTTCCTTCATTACATCTCAACCAATCGCATTTAATAACTAATAACTCCACTGA
AATTGAGACGAACAAAAATATTTATACAATAGGAATGTTGTTTCGGGCGTGCTCACTCCTTGTTATTTCC
ACTCACCAGTTGATCTTTTAAACCATATATAGAGACAAAGTGAAACTATTGATAACAAAATAACAAACGG
CAGACCAGGATGTTTTGTTCTTCTCTTTAAACTCCAGGAAGAATTGTTAGCTTTCTTCACTTTCGGAAAA
GACACACTCTTTCCGAAGTTACCGTTTTTTTTTCTGCAGCAGCACTGACAGTTAGACACTAGACGTAACG
CTCTTTTAATGACATTTTTTACACTTTCAAAAATCCCCATAAATTCCTTAATTATAAGAAAAGAGAAAAG
GAGATAAAGTTTGGCATAGTTTACAGACGTTTTCTTGTCCACAGGACAATAACTTACCCATACAATTAAA
GGGAGCTAGTTGGAGCTACTTGCTTCATTTTCGTTATCCTTATAAAAATTTTTATTTTTTGTTCTTTTTA
AAGCTCTGATGGAACCCATAAAAAGAAATCGTTTTACAAAGTTTGTTTTTATTTTATTCCAATTTATCTA
GTTTTGTAAAAATATAGACCCAATCGATACCCCACTATTAATAATAATTATAATAATTACTGTTTCCAAA
TCAATCTATATATCAACCAGGTTAGTCTGTTCCACAACCAGCTTTCGTGATACTACCGTTAACTATACTG
GTTTACCCTGCTCTTACACTTCAACCACATTTTTCTTTTTGTTCCTGATATTGCACAAGAATTCAAATAT
GCTCTTTTGTCTTGATATCAAAGCGGTGAATATGTTACATGAAATA
Para esta proteína el sgRNA elegido se puede visualizar en la Tabla 3.
Tabla 5. Características sgRNA
Característica Mnn9 Ecm33
sgRNA AGCCCATTGGAAGTTCGCCAGGG ACCATCGATCTTCTTGACACCGG
%GC (Guanina-
Citosina)
55 45
Puntuación de
eficiencia
64,98 67,74
54
Auto -
complementariedad
0 0
Después de definir los sgRNA (Tabla 3), se seleccionó el vector pV1382 para insertarlos. El vector
pv1382 contiene la endonucleasa Cas9, el marcador de selección NatR y la secuencia de la enzima
de restricción BsmBI, además se realizó una plantilla de reparación que será entregada junto con
el plásmido (2 codones stop, secuencia de la enzima de restricción BamHI, y secuencias
homologas del gen de interés) (Figura 12).
Enzima de restricción BsmBI: La enzima reconoce los sitios CGTCTC (1/5) ^ presentes en el
plásmido y corta para permitir la inserción del sgRNA en ese punto, como se describe a
continuación.
a. Reconocimiento por parte de la enzima en el plásmido pV1382
AAATGATCGGAGACGGAATTCCGTCTCGTTTTAGAGCTAGA
TTTACTAGCCTCTGCCTTAAGGCAGAGCAAAATCTCGATCT
b. Corte e inserción del sgRNA
sgRNA Mnn9
AAATGATCGAGCCCATTGGAAGTTCGCCAGTTTTAGAGCTAGA
TTTACTAGCTCGGGTAACCTTCAAGCGGTCAAAATCTCGATCT
sgRNA Ecm33
AAATGATCGACCATCGATCTTCTTGACACGTTTTAGAGCTAGA
TTTACTAGCTGGTAGCTAGAAGAACTGTGCAAAATCTCGATCT
BsmBI
BsmBI
55
Figura 14: Plásmido pV1382 para la transformación de C. glabrata
También se eligieron 2 pares de cebadores, uno permitirá amplificar la secuencia del gen una vez
hecha la transformación (resaltados en gris) y el otro amplificar la secuencia que se desea insertar
(plantilla de reparación -resaltados en azul):
Tabla 6. Cebadores
Mnn9
Amplificar
plantilla
F-TACCAAATATCGTATGCGCAAG
R-CCATTTGGAATTCTGTCGTCTT
Amplificar
gen *
F-CTGGTTGGAGGAGCAGTGAT
R- TCCATCAAATGGTCAGGGCT
Rcomplement- AGCCCTGACCATTTGATGGA
Ecm33
Amplificar
plantilla
F-TTGGTAACTTGACCATCACTGG
R-AGTGTTGAAAGTGGAGATGGCT
F-AAGCTAGTGCCCTTGGGTAG
56
Amplificar
gen*
R-CATCATAGCAAAGCGACGGC
Rcomplement-GCCGTCGCTTTGCTATGATG
*Estos pares de cebadores se eligieron en la secuencia del gen 1000 pb antes y después de la región
codificante.
Plantillas de reparación
Azul: Secuencias homologas del gen
Rojo: Codones de parada
Verde: Secuencia reconocimiento enzima BamHI
MNN9 plantilla de reparación
F:GTATGGGAAATAGAAAGTTCTCTCACGCTCATCAGCCCATTGGAAGTTCGCCATAATGAGG
ATCCAACCAGTA
R:TACTGGTTGGATCCTCATTATGGCGAACTTCCAATGGGCTGATGAGCGTGAGAGAACTTTC
TATTTCCCATAC
ECM33 plantilla de reparación
F:GCCCAAGGAGGTGGCATTGTAGATTCTCAAAGAACCATCGATCTTCTTGACACTAATGAGG
ATCCCTAGCGCA
R:TGCGCTAGGGATCCTCATTAGTGTCAAGAAGATCGATGGTTCTTTGAGAATCTACAATGCC
ACCTCCTTGGGC
Una vez realizada la transformación de la levadura, se procederá a realizar la validación de la
mutación tal y como se describe en materiales y métodos numeral 7.6.1.
Discusión
Los fármacos actualmente disponibles para tratar las enfermedades fúngicas son limitados, sumado
a esto, la ganancia de resistencia simultánea, la toxicidad y efectos secundarios de algunos, limitan
aún más las opciones terapéuticas, situación que amerita hacer un llamado a la comunidad
científica para desarrollar nuevos antifúngicos que sean eficaces y con toxicidad selectiva. Pese a
que en los últimos años este ha sido un tema de estudio, son pocas las nuevas moléculas que han
logrado llegar a etapas de desarrollo clínico, además, la presencia de múltiples vías compartidas
57
entre los hongos y humanos por su naturaleza eucarionte dificultan la explotación completa de
dianas moleculares para el desarrollo de nuevos fármacos, dejando un tema con amplio campo de
investigación (93,94).
La evaluación del proteoma de levaduras frente a la exposición a los antifúngicos es interesante,
puesto que permite obtener pistas en la identificación de proteínas con potencial de blanco
terapéutico. Dentro del grupo de proteínas implicadas en la respuesta a antifúngicos, las proteínas
que participan en la biosíntesis y funcionalidad de las estructuras ausentes en los mamíferos son
relevantes, como es el caso de la pared celular, estructura vital para la supervivencia del hongo
(7,8,21).
La pared celular está conformada por glucano, quitina y manoproteínas, componentes que se
encuentran en estrecha interacción con el fin de mantener una buena conformación estructural y
función de la misma, por lo que las alteraciones o ataques en estos componentes activan múltiples
vías de señalización, entre las cuales se encuentra la vía de integridad de la pared celular (CWI,
Cell wall integrity), la cual tiene como objetivo la prevención de la lisis celular a través de la
reorganización estructural de la misma, proceso que conlleva diferentes mecanismos, (I) cambios
en las proporciones de los polisacáridos, (II) variaciones en las asociaciones y conexiones entre
los diferentes compuestos y (III) aumento de la actividad enzimática y redistribución de la
maquinaria a los sitios afectados, lo que en conjunto permite restablecer la pared y responder al
agente estresante, además también se ha reportado movilización de iones de Ca2+ que generan la
activación de la vía CaM/CaL (11,95).
En este estudio se evaluaron proteínas relacionadas con la biosíntesis de la pared celular en
respuesta a caspofungina o fluconazol, divididos en cinco grupos, cada uno asociado a la síntesis
especifica de un componente clave para la formación de la pared celular. En el grupo de la
biosíntesis de manoproteínas (Mnn9,Mnn5,Ktr1,Mnn10,Sec53) se evidenció que las deleciones de
los genes evaluados generan en las levaduras mayor sensibilidad frente caspofungina (Figura 6),
hecho que ha sido demostrado y atribuido a la imposibilidad de aumentar el manano en las
mutantes ante la depleción del glucano por la acción del fármaco, debido a que la alteración de la
pared causada por la caspofungina desencadena la activación de un mecanismo compensatorio que
conlleva al incremento de manoproteínas y sobreexpresión de proteínas implicadas en su
biosíntesis, obteniendo levaduras con mayor contenido de mananos en su pared, mecanismo que
58
evidencia la capacidad de la pared celular para alterar su composición en respuesta al estrés y la
importancia de las manoproteínas frente la respuesta antifúngica (10,73,95,96).
Otras mutantes que también se vieron afectadas frente a caspofungina fueron las que poseen
deleciones en genes que codifican proteínas con anclaje GPI (Flo1-Ccw12), este tipo de proteínas
participan en el mantenimiento y remodelación de la pared celular, por lo que es de esperarse que
la deleción altere el fenotipo frente al fármaco (97,98).
El abordaje con fluconazol permitió identificar que la mayor parte de los grupos de mutantes
evaluados 4/5 (biosíntesis de manoproteínas, biosíntesis y anclaje GPI, biosíntesis de quitina y
membrana plasmática) tuvieron disminución de la CMI (Figura 7), lo que indica que son
necesarios para responder ante el fármaco. Además, la alteración indirecta en el ensamblaje
correcto de los componentes de la pared a causa de la disrupción en la membrana plasmática
también pudo contribuir al fenotipo obtenido, como lo describió Sorgo y colaboradores (72). Por
otro lado, se pudo observar la participación de Erg3 (Esterol Δ⁵,⁶-desaturasa, esencial para la
síntesis de ergosterol) en la capacidad de supervivencia frente al azol, ya que está bien descrito
que las alteraciones en este gen confieren resistencia (99,100). No se observó mayor sensibilidad
en mutantes con deficiencias de glucanos, sin embargo, estos y los demás grupos de proteínas
evaluadas presentaron diferencias con respecto a la cepa parental al inhibir la vía CaM/CaL
(Figura 8) demostrando que está implicada en la respuesta al fluconazol, como ha sido descrito
para especies del género Candida spp (46).
La inhibición de la vía si bien puede tener repercusiones en la capacidad de respuesta celular de la
levadura, los fenotipos distinguibles se observan generalmente cuando a esta inhibición se le
agrega un factor estresante (50). Por otro lado, las mutantes de proteína implicada en la biosíntesis
de glucano Fks2 y la proteína GPI Ecm33 fueron las que más disminuyeron la CMI en presencia
de Fph, lo que podría ser explicado porque la activación de la vía CaM/CaL conduce a la
desfosforilación del factor de transcripción Crz1, el cual promueve la expresión del gen FKS2, en
este caso, la deleción de dicha proteína, sumado a la no activación del factor Crz1 por la inhibición
de la calmodulina conllevaron al fenotipo observado en las mutantes para Fks2. En cuanto a la
proteína Ecm33 esta es importante para viabilidad de la levadura, ya que sus defectos conducen a
alteración de la pared celular, mayor sensibilidad a los fármacos, atenuación de la virulencia en C.
albicans, entre otros (101,102), por lo que la disminución de la CMI en esta mutante hace pensar
59
que la vía también está implicada en la regulación de expresión de esta proteína. Como se ha
descrito en otras proteínas de la familia Ecm en donde la vía CaM/CaL está implicada en la
regulación (103).
Las diferentes condiciones de estrés evaluadas permitieron identificar que ninguna de las
deleciones condiciona el crecimiento a 37 °C (Figura 9). Además no es de extrañarse que S.
cerevisiae no haya crecido a 40 °C, ya que se han descrito temperaturas optimas de crecimiento
entre 25 y 30 °C (104). Aunque esta especie es capaz de adaptarse a diversas condiciones
ambientales, el crecimiento a altas temperaturas es reportado usualmente en levaduras patógenas
humanas, en donde logran crecer hasta los 42 °C como resultado de la adaptación a los diversos
entornos del medio ambiente y del cuerpo humano (105).
Con respecto a la respuesta al estrés osmótico, se ha demostrado que en S. cerevisiae está mediada
por la presencia de osmorreceptores en la membrana celular, se ha identificado a Sln1 y Sho1 como
los sensores que desencadenan la activación de la vía de glicerol de alta osmolaridad (HOG, High
osmolarity glicerol), la cual provoca la activación de la MAPK Hog1 que se transloca al núcleo y
promueve la expresión de múltiples genes, dentro de los que se destaca GPD1, el cual genera
aumento de la producción de glicerol, mecanismo que permite retornar la homeostasis celular
(106,107).
Los resultados obtenidos en la respuesta al estrés osmótico evidenciaron menor capacidad de
crecimiento en proteínas implicadas en biosíntesis de manoproteínas (Ktr1), proteínas con anclaje
GPI (Ecm33) y biosíntesis de glucano (Fks2) (Figura 9), lo que se relaciona con estudios previos
que identificaron menor capacidad de osmotolerancia en mutantes de genes FKS y otros
implicados en la glicosilación de proteínas (108). Con respecto a FKS2, la hiperosmolaridad a
nivel extracelular además de desencadenar la activación de la vía HOG, también se ha demostrado
que aumenta las concentraciones intracelulares de Ca2+, desencadenando la activación de la vía
CaM/CaL, Crz1 y por ende aumento de expresión del gen FKS2 (109), lo podría explicar el
fenotipo observado, destacando el rol esencial de los glucanos en la tolerancia al estrés osmótico.
La proteína Ecm33 participa en el mantenimiento y biogénesis de la pared celular por lo que
evidentemente su deleción conduce a una estructura alterada que condiciona el fenotipo observado
(81,101). Por otro lado, no se observó disminución de crecimiento en las mutantes para las
proteínas Erg3 y Erg11, resultado no esperado teniendo en cuenta que se han descrito alteraciones
60
del crecimiento en levaduras con mutaciones en los genes ERG implicados en la biosíntesis del
ergosterol (110,111).
El estrés oxidativo ha sido relacionado con varios procesos celulares, donde a partir de la reducción
del O2 se pueden generar múltiples especies reactivas (ROS, Reactive oxigen species) dentro de
los que se destacan peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (• OH) y anión superóxido
(O2-). Sin embargo, las levaduras y en general los eucariotas presentan múltiples mecanismos para
contrarrestar y proteger los componentes celulares de estos a través de la participación de enzimas
y vías de señalización como la vía HOG, además de la activación del factor de transcripción Yap1,
el cual promueve la expresión de proteínas antioxidantes. A pesar de esto, la exposición a altas
concentraciones de agentes oxidantes provoca la acumulación de ROS que conllevan a defectos
en el ciclo celular, alteración de lípidos de membrana, inactivación de proteínas, entre otros
(112,113). En este estudio, únicamente se vio disminución del crecimiento en las levaduras
mutantes para la proteína GPI Ecm33 (Figura 9), resultado que se relaciona con lo reportado en
la literatura, pues la exposición a otros agentes oxidativos condujo a deficiencias en el crecimiento
en mutantes para la proteína GPI Ecm33 demostrando su papel en la respuesta frente a este tipo de
estrés (102,114).
Frente al estrés osmótico y oxidativo las alteraciones se presentaron principalmente en las mutantes
para la proteína GPI Ecm33, otros grupos no mostraron diferencias con respecto a la cepa parental.
Sin embargo, llama la atención que las mutantes para la proteína Gwt1 no se hayan comportado
de una manera similar, pues esta participa en la síntesis de los anclajes GPI, por lo que bajas
concentraciones de la misma generaran alteraciones en todas las proteínas con este tipo de anclaje,
afectando directamente la composición de la pared celular (115). Esto puede deberse al tipo de
mutante haploinsuficiente utilizado.
Con respecto a los agentes perturbadores de la pared celular RC y BC los resultados mostraron
efectos distinguibles en el fenotipo entre las mutantes evaluadas (Figura 10), atribuido a las
variaciones en el contenido de quitina o glucano, de este modo, se ha descrito que levaduras con
alto contenido de quitina son susceptibles a los efectos del BC, mientras que mayor crecimiento
se relaciona directamente con un bajo contenido del componente (116).
Frente al RC se ha observado sobreexpresión de genes implicados en los procesos evaluados en el
presente estudio, de particular interés genes como KTR2, FKS1, FKS2, CHS1, CHS3 y múltiples
61
proteínas GPI (117), por lo tanto, es previsible que las deleciones que afectan directamente estos
productos génicos van a comprometer el fenotipo de la levadura, en este caso, se observó
disminución de crecimiento en las levaduras con deleciones en genes de las proteínas Mnn9, Ktr1,
Ecm33, Fks2 y Gwt1 (Figura 10). Sin embargo, en el mutante de la proteína Chs3, se observó
mayor crecimiento. Chs3 está encargada de la generación del mayor porcentaje de quitina, lo que
sugiere que posiblemente otras proteínas de la familia logran compensar la deficiencia de esta,
impidiendo de esta manera la compensación con glucanos y por ende menor susceptibilidad al RC
(118).
Frente a la exposición a BC (Figura 10) las mutantes de las proteínas Mnn9 y Ecm33 fueron las
únicas que presentaron disminución en el crecimiento, lo cual en conjunto con lo observado en RC
(menor crecimiento para levaduras con deleciones en los genes Mnn9 y Ecm33) es explicado por
las variaciones en la composición de la pared celular de estas mutantes, donde se describe que la
ausencia de dichas proteínas, genera en la levadura mayores porcentajes de quitina y glucano en
su pared celular o son más sensibles a ambos perturbadores (55,58,81,88,95,97,118,119).
La deleción de manoproteínas y proteínas con anclaje GPI no solamente afectan la composición
de la pared, también comprometen la virulencia y adherencia de las células, es así como se ha
demostrado que la pérdida de múltiples proteínas que participan tanto en la N o en la O
glicosilación o que poseen anclajes GPI generan fenotipos menos virulentos y mayores tasas de
supervivencia en modelos murinos de candidiasis diseminada con C. albicans, esto debido a que
el cambio en la composición de la pared celular genera alteraciones en el reconocimiento y
activación de la respuesta inmune, además de disminución en la adherencia y formación de
biopelículas (64,98,120–122). Por otro lado, para C. glabrata, aunque esta información es muy
limitada, se ha observado que la deleción de proteínas que participan en el mismo complejo
enzimático en la N-glicosilación conducen a diferentes niveles de virulencia, mostrando quizás un
comportamiento diferencial con respecto a C. albicans, sin embargo, la formación de biopelículas
si se ve afectada por lo que queda por dilucidar diferencias estructurales específicas que conlleven
a los fenotipos observados (123,124).
El aumento de mananos en respuesta a caspofungina en C. glabrata y la disminución de la CMI
para mutantes de manoproteínas en S. cerevisiae en presencia de caspofungina (Figura 6) nos
condujo a evaluar el efecto de la TM, antibiótico implicado en la inhibición de la N-glicosilación
62
en eucariotas, más específicamente se une a la proteína Alg7, truncando la adición del primer N-
acetilglucosamina al DP en el RE, impidiendo la generación del precursor Glc3Man9GlcNAc2 y
por ende el correcto plegamiento de las proteínas, ocasionando así estrés del retículo
endoplasmático por acumulación de proteínas mal plegadas y, desencadenando la activación de lo
que se denomina como respuesta de proteína desplegada (UPR, Unfolded protein response)
mecanismo que permite mantener la homeostasis del RE, por otro lado las proteínas presentes en
la pared celular fúngica son altamente glicosiladas, por lo que la inhibición de este proceso conduce
a la formación de una ultraestructura aberrante, pues muchas de estas proteínas además de estar
ancladas cumplen funciones de mantenimiento y remodelación (9,36,125). Lo que desencadena la
activación de la CWI ante la deficiencia de manoproteínas y conduce a un mecanismo
compensatorio en el que hay variaciones en el contenido de polisacáridos y por ende aumento de
glucanos y quitina, generando levaduras más sensibles a agentes como BC (95,126).
La inhibición de la N-glicosilación en C. glabrata (Figura 11) dejo en evidencia que la capacidad
de crecimiento de la levadura se ve muy comprometida a bajas concentraciones del fármaco,
además la combinación con caspofungina (Figura 12) confirmó que las manoproteínas son
importantes para la respuesta al estrés generado por las equinocandinas permitiendo disminuir la
CMI a caspofungina en cepas resistentes. Por otro lado, se comprobó que la vía CaM/CaL es
requerida en la adaptación a múltiples tipos de estrés incluido el generado por la TM pues se ha
demostrado que hay activación de vías de señalización dentro de las que se destaca la vía
CaM/CaL, al parecer, mediado por el aumento de las concentraciones citoplasmáticas de Ca2+ en
respuesta a la TM (127,128).
Los mecanismos compensatorios en la pared celular ante la falta de alguno de los componentes
presentes, es lógica, sin embargo, en este estudio, los dos aislamientos resistentes de C. glabrata
evaluados presentan una mutación puntual en el gen FKS2, lo que indica que la síntesis de glucano
no está truncada en presencia de caspofungina, sin embargo, las mutaciones presentes en la familia
de los genes FKS han sido relacionadas con menor capacidad catalítica de la enzima, teniendo
efectos directos en la respuesta de la levadura (129) y pudiendo llegar a tener repercusión en los
demás componentes de la pared celular, pues se han descrito levaduras con niveles de quitina
aumentados (130), por lo que la disminución de la CMI en combinación con TM se relaciona
directamente con aumento de mananos en la pared celular de estas levaduras volviéndolas más
63
susceptibles a la TM y confirmando que las manoproteínas juegan un rol esencial en la respuesta
frente a la equinocandina, correlacionándose con hallazgos de pared celular con alto contenido de
mananos y sobreexpresión de genes implicados en la ruta de su biosíntesis en C. glabrata expuesta
a caspofungina (9,76).
Si bien la TM es prometedora, su uso en humanos no es posible, puesto que la enzima diana Alg7
es compartida en los eucariotas, con una similitud del 41,45% entre la proteína de C. glabrata y el
hombre, a pesar de parecer un porcentaje relativamente bajo, la similitud es suficiente para inhibir
la N-glicosilación en ambos eucariotas. Ante esto, otras proteínas implicadas en esta ruta de
glicosilación y que sean específicas de hongos podrían considerarse prometedores blancos
terapéuticos, por esta razón, se realizó el diseño bioinformático para el desarrollo del sistema
CRISPR-Cas9 de la proteína Mnn9 y próximamente se hará uso del sistema para construir
mutantes en C. glabrata MNN9Δ con el fin de confirmar que la inhibición del alargamiento de las
cadenas de manosa en la N-glicosilación mantiene el fenotipo observado en mutantes de S.
cerevisiae. Además, también se realizará con la proteína Ecm33, pues las mutantes con deleciones
de esta proteína fueron los que se vieron más afectados en la mayoría de los ensayos evaluados.
Finalmente, cabe mencionar que, a pesar de encontrar diferencias entre las mutantes de diferentes
grupos, posiblemente se hubiese podido observar fenotipos más marcados entre proteínas del
mismo grupo en levaduras con deleciones homocigotas, pues la haploinsuficiencia, aunque genera
una reducción significativa de la expresión génica, no logra el fenotipo observado en una mutante
nula (131,132).
9. Conclusiones
• La pared celular fúngica es una estructura dinámica que se adapta a las condiciones de
estrés, uno de los mecanismos de respuesta es la variación en la proporción de los
componentes que la conforman.
• Frente a fluconazol se destaca la participación de proteínas implicadas en biosíntesis de
manoproteínas, quitina, membrana plasmática y proteínas con anclaje GPI en la respuesta
frente al fármaco, pues sus deleciones conducen a una menor CMI.
• Las manoproteínas desempeñan un papel importante en la respuesta a la caspofungina, las
deleciones de estas conllevan a disminución de la CMI.
64
• La deleción de la proteína Ecm33 y Mnn9 afectan la tolerancia frente a los agentes
perturbadores de la pared celular RC y BC.
• La proteína con anclaje GPI Ecm33 desempeña un rol esencial en la pared celular, su
deleción condujo a levaduras con CMI más baja a fluconazol y alteración de crecimiento
frente al estrés generado por NaCl, Med, RC y BC.
• La vía CaM/CaL participa en la adaptación a fluconazol y TM, pues su inhibición conlleva
a disminución de la CMI y el crecimiento, respectivamente.
• El uso de TM en combinación con caspofungina logró disminuir la CMI en cepas de C.
glabrata resistentes.
10. Perspectivas
• Evaluar el efecto de la inhibición de las vías de la N-glicosilación y CaM/CaL en
combinación con caspofungina en aislamientos clínicos de C. glabrata resistentes.
• Construcción de mutantes para las proteínas Mnn9 y Ecm33 en C. glabrata por medio del
sistema CRISPR-Cas9.
• Evaluar las mutantes generadas en la adaptación a condiciones de estrés (osmótico,
oxidativo, térmico, agentes perturbadores de la pared celular).
• Evaluar la patogenicidad y formación de biopelículas de las mutantes MNN9Δ y ECM33Δ
de C. glabrata.
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12. Anexos
Anexo 1. Identificación por MALDI-TOF MS
Bruker Daltonik MALDI Biotyper
Clasificación de resultadosNombre ID Organismo Puntuación
1875
( ++ ) ( A )
1256
( ++ ) ( A )
916
( ++ ) ( A )
2001
( ++ ) ( A )
BY4743
( + ) ( B )
Mnn9
( ++ ) ( A )
Mnn5
( ++ ) ( A )
Ktr1
( ++ ) ( A )
Mnn10
( ++ ) ( A )
Sec53
( + ) ( B )
Ccw12
( + ) ( B )
Flo1
( ++ ) ( A )
Ecm33
( ++ ) ( A )
Pst1
( ++ ) ( A )
Gwt1
( + ) ( B )
Fks1
( + ) ( B )
Fks2
( + ) ( B )
Chs3
( + ) ( B )
Erg3
( + ) ( B )
Erg11
( + ) ( B )
22019
( ++ ) ( A )22019 Candida parapsilosis 2.01
Erg3 Saccharomyces cerevisiae 1.886
Erg11 Saccharomyces cerevisiae 1.99
Chs3 Saccharomyces cerevisiae 1.996
Fks2 Saccharomyces cerevisiae 1.912
Gwt1 Saccharomyces cerevisiae 1.839
Fks1 Saccharomyces cerevisiae 1.788
Ecm33 Saccharomyces cerevisiae 2.15
Pst1 Saccharomyces cerevisiae 2.01
Ccw12 Saccharomyces cerevisiae 1.968
Flo1 Saccharomyces cerevisiae 2.037
Mnn10 Saccharomyces cerevisiae 2.049
Sec53 Saccharomyces cerevisiae 1.915
Mnn5 Saccharomyces cerevisiae 2.104
Ktr1 Saccharomyces cerevisiae 2.048
BY4743 Saccharomyces cerevisiae 1.872
Mnn9 Saccharomyces cerevisiae 2.004
2001 Candida glabrata 2.173
916 Candida glabrata 2.124
1256 Candida glabrata 2.115
1875 Candida glabrata 2.167
Rango Descripción Símbolo Color
1.700 ... 1.999 Probable identificación de género ( + ) Amarillo
0.000 ... 1.699 Identificación no confiable ( - ) Rojo
2.000 ... 3.000 Alta probabilidad de identificación a nivel de especie ( +++ ) Verde
