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ESTUDIO QUIMICO DE LAS
FRACCIONES HUMICAS y
LIPIDICAS
EN SUELOS DE DIFERENTE ORIGEN
POR
RODRIGO l. MARTINEZ FERNANDEZ
Memoria del trabajo de investigación realizado por el
Lcdo. Rodrigo I. Martínez como parte práctica del XXX Curso
Internacional de Edafología y Biología Vegetal, realizado en el
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla
(CSIC), España.
La dirección de este trabajo estuvo a cargo del Dr.
Francisco J. González-Vila, de la Unidad de Química y Física
Ambiental, del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología
de Sevilla.
Fdo.: Dr. Francisco J. González-Vila.
f Fdo.: Lcdv. r. Martínez
Sevilla, Julio de 1993
Deseo expresar mi agradecimiento a las siguientes
personas e instituciones:
Al Dr. Francisco J. González-Vila, Investigador Científico
del IRNA (CSICl, Profesor-Guía de este trabajo, por su
acertada dirección y sin cuya inestimable ayuda y orientación
no hubiese sido posible su realización.
Al Dr. Francisco Martín Martínez, Profesor de Investigación
del IRNA (CSICl, por su gentileza al poner a mi disposición
los recursos humanos y técnicos para el desarrollo del
trabajo.
Al Dr. Luis Clemente Salas, Profesor de Investigación del
IRNA (CSICl, coordinador del curso, por su disposición
permanente de interés en todas las etapas del trabajo.
Al Dr. José Luis Mudarra, por su dedicación y estímulo
durante el desarrollo de las clases teóricas del curso.
A mis compañeros de Unidad, Leda. Angela Mancha y Dres. José
Carlos del Río, Zaharie Moldovan y José Bautista, por su
amistad, apoyo y colaboración.
A Dña. Trinidad Verdejo, por su valiosa ayuda y cooperación
en la realización del trabajo.
A las siguientes instituciones que patrocinaron el XXX Curso
Internacional de Edafología y Biología vegetal y que hicieron
posible mi traslado y estancia en Sevilla: UNESCO, Instituto
de Cooperación Iberoamericana (ICI), Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC) y la Universidad de
Sevilla.
Por último mi agradecimiento a todas las personas de la
Uni versidad de Concepción-Chile, que de una u otra forma
apoyaron y facilitaron mi estadía en Sevilla.
:.r::nmu
1.- INTRODUCCION
11.- MATERIAL Y METO DO
11.1.- Suelo empleado
11.2.- preparación de la muestra de suelo para su estudio
11.3.- Características fisico-químicas de lOS suelos estudiados
11.4.- Extraccion y traccionamiento de las tracciones numicas y lipldlcas
11.5.- Caracterizacion por espectroscopla de lntrarrojo con transtormada de
1
15
15
17
17
20
Fourier (FT-1R) de los acidos nUmicos 24
11.6.- Analisis por cromatogratia de GasesEspectrometria de Masas (GC-MS) de las tracciones lipldicas 24
11.7.- Metodos de derivatizacion 2/
111.- RESULTADOS Y DISCUS10N 29
111.1.- caracterizacion tisico-quimica de los suelos 29
111.1.1.- Determinación de A.H. y A.F. 32
111.2.- caracterizacion de los A.H. por FT-IR 34
111.3.- caracterización de los extractos lipldicos libres y ligados al compleJo organo-mineral de los diterentes suelos
1V.- CONCLUSIONES
V.- B1BL10GRAF1A
V1.- ANEXO
46
64
68
73
I.- INTRODUCCION.
La Materia Orgánica (M.O.) del suelo está constituida
por un conjunto de fracciones entre las que se incluyen:
a) componentes inalterados de los restos de plantas y
tejidos de animales¡
b) productos orgánicos de neoformación muy estables, que
representan la fase final del proceso de degradación
de los restos orgánicos¡
c) productos intermedios sintetizados biológica o
químicamente en el transcurso del citado proceso¡
d) productos de síntesis secundaria de los
microorganismos¡
e) componentes de células microbianas muertas¡
f) productos de interacción entre éstos y la fracción
inorgánica del suelo, etc. (Kononova¡ 1961; Schnitzer
y Khan, 1972).
Se admite generalmente que la M.O. del suelo es uno
de las principales factores edafogenéticos¡ y que es una de
las variables que más influyen sobre sobre la fertilidad del
suelo ¡ dados sus conocidos efectos sobre la estructura
(efecto físico), sobre el nivel de nutrientes (efecto
químico) y sobre la biomasa microbiana¡ para la que
representa su única fuente energética (efecto bioquímico)
(Stevenson, 1982).
" ~.
En la última década el estudio de la M.O. se ha
extendido notablemente al reconocerse la presencia en
ambientes acuáticos y sedimentarios de fracciones similares
a las del Humus, y demostrarse el importante papel que
desempeñan en reacciones y procesos geoquímicos y
medioambientales (Christman y Gjessing, 1983; Aiken et al.,
1985; Mac Carthy et al., 1990).
El contenido de M.O. de los suelos es muy variable,
según el origen, localización geografica, manejo, etc. de los
mismos. En los suelos naturales la cantidad de M.O. está
determinada exclusivamente por los factores formadores de
suelo, es decir, vegetación, topografía, material parental
y tiempo. Así, un Mollisol puede llegar a tener entre un 5
Y 6% de M.O. en los primeros 15 cm de espesor, mientras, en
el extremo opuesto, un suelo arenoso tiene menos del 1%.
Asimismo, mientras que los suelos tropicales (Oxisoles)
tienen muy poca M.O., los bien drenados pueden alcanzar
muchas veces el 10%. En suelos agrícolas, el contenido de
M.O. permanece prácticamente constante si se mantiene un
equilibrio dinámico entre las pérdidas por mineralización y
las adiciones orgánicas (Flaig, 1978).
3.-
Dada la enorme complejidad y heterogeneidad de los
constituyentes potenciales de la M.O., se recurre
tradicionalmente a una clasificación simplificada de ésta en
Sustancias Húmicas (S.H.) y Sustancias No Húmicas, de acuerdo
a sus afinidades tanto químicas como funcionales. Las S.H.
son aquellas que se extraen del suelo con soluciones
alcalinas fuertes, y suelen constituir entre el 50 y 85% de
la M.O. del suelo. Constituyen una mezcla de estructuras
macromoleculares con un amplio rango de pesos moleculares,
amorfas, de caracter ácido, hidrofílicas, polidispersas, de
color amarillo a pardo-negruzco. En general, se caracterizan
por dos importantes propiedades comunes: resistencia a la
degradación microbiana y facilidad para formar sales y
complejos con iones metálicos e hidróxidos y para
interaccionar con arcillas minerales y algunos compuestos
orgánicos (González-Vila, 1974).
Una división comunmente utilizada para clasificar
las S.H. distingue las siguientes fracciones:
- Acidos Húmicos (A.H.), solubles en medio básico e
insolubles en medio ácido.
- Acidos Fúlvicos (A.F.), solubles en medio básico y
ácido. Se aislan por diversos procedimientos de la
disolución que queda al precipitar los A.H en medio
ácido.
4.-
- Huminas, fracción no soluble en medio básico ni ácido.
Se pueden extraer mediante el uso de tratamientos
ácidos enérgicos o por soluciones alcalinas moderadas o
fuertes. En los últimos años se asiste a un inusitado interés
por el estudio de la fracción Humina, relegada
tradicionalmente con respecto a las otras dos, lo que ha
determinado la proposición de nuevos métodos de aislamiento
y estudio (Almendros y col., 1980; Almendros y González-Vila,
1987; Dupuis y Cheverry, 1973).
En una convención de expertos celebrada
recientemente en Berlín se propuso el protocolo de
fraccionamiento y nomenclatura de la S.H. que se presenta en
el esquema de la Fig. 1 (Thurman et al.1987). Dicho esquema
ha sido adoptado por todos los miembros de la International
Humic Substances Society, ampliamente difundida por todos los
paises.
La composición de las fracciones húmicas pueden
variar según el tipo de suelo y según los procedimientos de
extracción y fraccionamiento utilizados. En todos los casos
la composición elemental y la funcionalidad difieren por
completo de la de los precursores vegetales que le dan
origen.
Dlesolved Matorlals
~---Ir-,.PRETREATMENT
I Solld Materlals t
5.-
o.g. "ttratlon, I'pld IIxtraction, etc.
e.g. drying,slevlng, rIotatlon, deminerallzatlon, etc.
11. EXTRACTION
•. 9. adsorptlonlXAD, e.g, NaOH, pyrophos, concentration, re· phate, DMSO, etc. verseosmosls,otc.1 ~
--------SOluble Inalkall
Sovrce descriptor Fulvlc·acld 'ractlon
111. ACIDIFICATION
Sovrce descriptor Humlc·acld 'racIJon
~ IV. PURIFICATION ~
Sovrce descflptor Fulvlc acld!
'.g. remoyal o, Inorganlc and Identl"able organlc componente by phyalcal methods
1 V. VERIFICATION
Source descriptor Humlc aelde
Fig. 1.- Protocolo de análisis y nomenclatura de las S. H. Extraído Thurman, 1987.
6.-
El estudio de la composición estructural de las
diferentes fracciones húmicas ha sido probablemente el
principal tópico abordado por los investigadores interesados
en la Quimica del Humus, que tiene sus comienzos a finales
del pasado siglo. En la abundante bibliografia existente, es
posible observar la gran variavilidad de técnicas físicas no
destructivas (espectroscopías de adsorción) y técnicas
degradativas que han sido utilizadas en estos estudios. Como
consecuencia de los mismos se ha llegado en muchos casos a
la proposición de un gran número de modelos, que sería
prolijo citar. A título de ejemplo podemos citar el sugerido
por Haworth en 1971, que tuvo una amplia aceptación.
Según este modelo, los A.H. están constituidos por
los elementos fundamentales que se observan en el esquema de
la Fig. 2. El componente básico es un núcleo aromático
complejo de tipo polinuclear cíclico y con radicales
semiquinónicos estables, que contiene cadenas alifáticas
laterales y grupos funcionales periféricos. El tratamiento
con HCl 2% (hidrolisis ácida) revela la presencia de
aminoácidos, carbohidratos (hexosas, pentosas, ácido urónico,
aminoazúcares, etc.), compuestos cíclicos nitrogenados,
ácidos grasos, etc. La hidrolisis alcalina, en cambio, libera
otros compuestos cíclicos y aromáticos (derivados del benzol,
naftalina, entracenos, furanos, tiofeno, etc.) y unidades
fenólicas que pueden ser derivadas de ligninas o flavonoides.
Las cadenas laterales están constituidas por compuestos
7.-
mayoritariamente hidrofílicos (polipéptidos, carbohidratos,
etc.) y además, pueden presentar sustituciones por grupos
funcionales diversos, principalmente carboxilos, aminas,
metoxilos, etc.
Peptides - - - - - - - - -Carbohydrates I " " I
I I I
Metbls
, .-" '" I , ..-
......... ,; ,; I
¡reORE " l I __ ..... I
,. , ....... I / ..... , - -----------Pnenolic acids
Fig. 2.- Representación esquemática de los A. H. Extraído Haworth, 1971.
Muy recientemente Wershaw (1992) ha propuesto el
modelo de Micelio-Membrana (Fig. 3) para la estructura de las
S.H. de suelos y sedimentos, y, en particular, para explicar
el comportamiento de las mismas en las interacciones con
xenobióticos.
COVNTER ION
'iO¡\¡tO!<.¡'Z:D POLAR GRG....;'::>
POSITIVELY· CHAAGED SITES
8.-
CARBOXYLA TE GROVPS
........... AMPHIPHILE MO~EC'JLE
Fig. 3.- Representación de la estructura Micelio-Membrana de los A.H. Extraído Wershaw, 1992.
9.-
El proceso de humificación o de formación de S.H.
puede definirse como la suma de reacciones y procesos que
provocan la formación de los distintos compuestos húmicos
coloidales de neoformación a partir de los productos de
descomposición y alteración de la M.O. original. Los
mecanismos que regulan las reacciones de humificación, que
implican una al teración drástica de los materiales
precursores, no están del todo claros, debido a su elevada
complejidad. De hecho, un adecuado conocimiento de la
humificación requiere que en su estudio se considere no sólo
la identificación del material precursor o la determinación
del producto final, sino también el conocimiento de los
mecanismos enzimáticos operativos intermedios, que no son
controlados, y que son responsables de la formación de muchas
de las moléculas policondensadas (González-Vila, 1974).
Hoy en día existen una gran variedad de modelos
para explicar las síntesis de las S.H. Todos ellos se
caracterizan por proponer la existencia de una serie de
reacciones que son directamente responsables de la formación
de S.H., ya sea por un proceso de degradación o un proceso
de agregación. Uno de estos modelos es el propuesto por
Hatcher y Spiker (1987), como una modificación de la "teoria
lignocelulósica" desarrollada por Waksman (1932), y que estos
autores denominan Degradación de Biopolímeros (BD). Según
este modelo, los biopolimeros producidos metabolicamente en
la célula vi va, son parcialmente degradados en el medio
ambiente favoreciendo la síntesis de las S.H. (Fig. 4).
Vascular Plants
cellulo8es hemlcelluloul IIgnln
Mlcroorganlama and Nonvaacular planta
protelns
carbohydrates IIplda
melanina
10. -
cutin parattlnlo macromolecule suberln unknowns
labllo moleculea
1 complete mlnerallzation
mlcroblologlcally refractory
iubatancea lablle moleculea
1 j complete mlnerallzatlon
IIgnln cutln suberln
Humin
...
paratt/n/c macromo/ecu/ea me/anlna unknowna
ox/datlve degradatlon
HumIc aelds
i 1 """, .. "'"'''''' Fufvlc aolda
Fig. 4.- Modelo de la Degradación de Biopolimeros (BD) Extraido Hatcner y Spiker, 1987.
11.-
El modelo contrapuesto propone la condensación o
repolimerización de las moléculas orgánicas de bajo peso
molecular, que son sintetizadas a partir del rompimiento de
los enlaces de los polímeros originales. Este proceso se
llama Condensación Abiótica CAC) (Hedges, 1987) y presupone
que es el Acido Fúlvico el material precursor de los Acidos
Húmicos,al contrario de lo que plantea el modelo ED (Fig. 5).
Es fácil de suponer que ambos modelos no se
excluyen reciprocamente, ya que en realidad la degradación
de los biopolímeros es una etapa dentro del proceso AC.
Flaig (1966) resume el conjunto de los procesos que
intervienen en la transformación de compuestos orgánicos del
suelo en S.H. de la siguiente manera:
los carbohidratos y las proteinas suministran la energía
a los microorganismos del suelo, cuya autolisis produce
aminoácidos, péptidos y amonio.
- ligninas y otros compuestos fenólicos experimentan una
serie de reacciones, principalmente de degradación
oxidativa, demetilación y deshidrogenación e incrementan
su aromaticidad y grado de polimerización.
- estos polimeros experimentan 2 tipos de reacciones: a) son
degradados a CO, y H,O o se transforman por rotura de
anillos aromáticos en compuestos alifáticos que pueden servir
como fuentes de energía a los microorganismos y b) se
condensan con aminoácidos, péptidos y amonio para formar
S.H.
<.1h o ~ ~ ~ ~
"-jl
lb VA
'Ó '1-
ti '" ~ w - ~ "'. <t ti:
W <t ti: ..J U :;) Z u - W
...J
~
REMINERAI.IZATION
~ S
Qj '1"
o." ,," ",'"
.J ~G
<3
12.-
Fig. 5.- Esquema de los modelos de Degradación de Biopolímeros (BD) y Condensación Abiótica (AC). Extraído Kedges, 1987.
13.-
sin lugar a dudas, dentro del amplio espectro de
sustancias presentes en el Humus, las fracciones de Acidos
Húmicos y Lípidos, representantes mayoritarios de las
Sustancias Húmicas y No Húmicas del suelo respectivamente,
son las que han recibido y reciben principal atención debido
al importante papel que desempeñan en el suelo. En los
últimos años se ha incrementado enormemente el estudio de
estas fracciones orgánicas, como consecuencia directa del
desarrollo de mejores métodos y técnicas de análisis, como
las espectroscopías de infrarrojo (IR-TF), de resonancia
magnética nuclear (RMN), Y de resonancia de espín electrónico
(ESR),y, en particular por el avance de técnicas de
separación e identificación entre las que destaca la
cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), etc.
En lo que respecta a los A.H. tambien es de
destacar a la hora de valorar la importancia de su estudio,
que hoy en día se enfrenta éste con un enfoque
interdisciplinario que involucra a edafólogos, agrónomos,
químicos, biólogos y medioambientalistas, en general, por su
ubiquidad y multifuncionalidad en los medios más diversos.
En cuanto a la fracción lipídica, representa la
fracción de compuestos no húmicos de la M.O. más importantes
por su directa influencia sobre las propiedades del suelo y
sobre el crecimiento de las plantas (stevenson, 1982). Estos
14. -
son compuestos orgánicos que por su diversidad representan
más un grupo analítico que un tipo de compuesto específico,
ya que se definen operativamente por su solubilidad en
disolventes orgánicos (metanol, etanol, cloroformo, etc.) o
mezclas de éstos. Por esta razón, en la fracción lipídica se
encuentran desde compuestos relativamente simples como los
ácidos grasos hasta otros mucho más complejos como los
esteroles, hidrocarburos polinucleados, grasas, ceras y
resinas.
También es muy variable la cantidad en que estos
compuestos se encuentran en el suelo, siendo más abundantes
en aquellos con mayor aporte de restos de plantas y tejido
microbiano (Stevenson, 1982). Las grasas, ceras y resinas son
los compuestos mejor representados cuantitativamente en el
suelo, en cambio, los esteroles y los ácidos grasos se
encuentran en muy poca cantidad.
En el presente informe se presenta el estudio de
las fracciones de ACIDOS HUMICOS y LIPIDOS de suelos de
diverso origen, con el objeto de determinar la variabilidad
de contenidos y comparar las características de las mismas
por técnicas diversas, entre las que destaca la
espectroscopía de infrarrojo y la combinación de
cromatografía de gases-espectrometría de masas.
15. -
II.- MATERIAL Y METODO.
II.1.- Suelos empleados.
Las muestras de suelo utilizadas en este estudio
fueron tomadas de suelos venezolanos y españoles, como se
especifica en la Tabla 1.
Tabla 1.- Muestras de suelo utilizadas en este estudio.
- -
MUESTRA ORIGEN
\ 1 Maracay - Venezuela
I 2 cantagallo - Venezuela
3 Uribeque - Venezuela
4 Turen - Venezuela
5 Coria del Río - España I
6 Coria del Río - España i
Las muestras 5 y 6 se tomaron de un suelo ubicado
en la finca experimental "Aljarafe" del IRNA. De acuerdo a
las normas del Soil Taxonomy (1975) este suelo está
clasificado como un vertic Xerofluvens.
Este tipo de suelo tiene a un régimen de humedad
xérico. Son suelos profundos, bien drenados, de color pardo
oliváceo a pardo grisáceo y de textura moderadamente fina a
fina, con ligero agrietamiento vertical. El perfil se
caracteriza por un horizonte superficial Ap, de 15 a 20 cm
de espesor, de textura francoarcillosa a arcillolimosa, de
16.-
color pardo, estructura poliédrica subangular fina o migajosa
bien desarrollada y consistencia friable. Un horizonte AC de
20 cm de espesor promedio, de color pardo, textura
arcillolimosa, estructura poliédrica subangular media
ligeramente desarrollada y consistencia friable a firme. A
continuación un horizonte C, de color pardo grisáceo, textura
arcillosa y estructura masiva con tendencia a prismático.
Timudo (1992) caracterizó algunos parámetros físicos y evaluó
las posibilidades de establecer un laboreo de conservación
en este suelo.
Mudarra (1988) caracterizó climáticamente a la zona
de Coria del Río como de clima mesotérmico seco-subhúmedo,
con moderado exceso de agua en el invierno; donde la Tº media
anual es de 17.0ºC siendo el mes de julio, con una media de
33.5ºC, el más cálido y enero, con 5.2ºC, el mes más frío.
Por el contrario, el mes de máxima pluviosidad es diciembre
(111.1 mm) y el de mínima junio con sólo 0.8 mm; el promedio
de precipitación anual en la zona es de 514.0 mm.
Las muestras de suelos venezolanos aun no están
caracterizadas desde un punto de vista edafogenético,
pertenecen a suelos vírgenes y actualmente se procede a su
estudio en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central
de Venezuela.
17.-
II.2.- Preparación de la muestra de suelo para su estudio.
Cada una de las 6 muestras de suelo se molió en un
molino de anillos y se pasó a través de un tamiz de 0.05 mm
de malla, lo suficiente para homogenizar las muestras y
aumentar la superficie de contacto, para así aumentar el
rendimiento de las extracciones.
II.3.- Caracterización fisico-química de los suelos
estudiados.
Los parámetros fisico-químicos se determinaron
mediante los métodos oficiales de análisis de suelos del
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de España
(1986), que se describen a continuación:
pH: A 10 g de muestra se añaden 25 mI de agua destilada, se
agita durante 10 minutos y posteriormente se deja reposar
otros 30 minutos. Los electrodos del pH-metro se calibraron
previamente con las soluciones patrones de PO,H,K 0.025 M,
PO,HNa, O. 025 M Y B,07Na,.
Conductividad Eléctrica: Para la determinación de la
Conductividad Eléctrica (CE) se hace uso de un puente de
Wheatstone y una célula de conductividad apropiada,
comparando a la misma temperatura la resistencia eléctrica
18. -
de la muestra y de una solución valorada de cloruro potásico,
refiriendose el resultado a 25ªC.
Carbonatos: se determinan con CIH dilo en un disposi ti va
cerrado (calcímetro), a presión y temperatura constante,
donde el incremento de volumen se considera una medida
directa del CO. desprendido.
Materia Orgánica Oxidable: Para la determinación del carbono
orgánico oxidable, tanto en las muestras totales de suelo y
sus fracciones de A.H y A.F se utilizó, por su comodidad,
rapidez y exactitud, el método de Walkley y Black (1934).
Resumidamente: a la muestra de suelo se le agregan 10 mI de
dicromato potásico 1N y 20 mI de ácido sulfúrico concentrado
y se agita. A continuación se le añaden 200 mI de agua
destilada y 10 mI de ácido fosfórico y se deja reposar
durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se agrega 1 mI
de solución de difenilamina y se valora cuidadosamente con
sulfato ferroso amónico 5N, hasta que el color vira a verde.
Para el cálculo de la Materia Orgánica Total (M.O.t.) se
utilizó 0.5 g de suelo multiplicando el valor de Carbono
Orgánico Oxidable por el factor 1.72, mientras que para la
determinación del Carbono Orgánico de los A.H. y A.F. los
pesos respectivos fueron de 0.25 g Y 1.5 g.
19. -
Nitrógeno: Para la medición del Nitrógeno se utilizó una
variante de la técnica Kjeldahl según la cual, la muestra de
suelo se digiere con ácido sulfúrico y sustancias oxidables
que faciliten la transformación del nitrógeno en ión amonio,
se destila en medio alcalino y se valora posteriormente.
Fósforo: Para la determinación del Fosforo disponible, se
extrae éste con C03 HNa 0.5 M a un pH aproximadamente
constante de 8.5. A continuación se toma una alícuota de 5
mI a la cual se le añade una solución de molibdato amónico;
una vez que haya terminado el desprendimiento de CO, se añade
1 mI de solución diluida de CI,Sn. Posteriormente se mide a
longitud de onda de 660 nm la transmitancia de la solución
en un fotocolorímetro durante 10 minutos.
Potasio: Para la medición del Potasio extraible, se disponen
25 g de muestra de suelo en un tubo de centrífuga, al cual
se le añaden 25 mI de acetato amónico y se agita durante 10
minutos. Despues se decanta el líquido sobrenadante y se
compara con la emisión producida por soluciones patrones
preparadas previamente en el fotómetro de llamas.
20.-
11.4. - Extracción y Fraccionamiento de las fracciones húmicas
y lipídicas.
Los protocolos seguidos para la extracción y
fraccionamiento de las sustancias húmicas y lípidos de las
muestras de suelo en estudio se resumen en las Figuras 6 y
7 respectivamente.
I~E~T~ I I
P,07Na.-NaOH (1: 1)
J
SUSTANCIAS HUMICAS I RESID~O~l
H,SO,
f 1 I ~~~DO~ ;ULVI~OS I ACIDOS HUMICOS 1
Fig. 6.- Protocolo de extracción y fraccionamiento de las S.H. de las muestras estudiadas.
21 .-
MUESTRA ¡ ,
C1 2 CH2 : MeOH (2: 1)
Soxhlet 12 horas
r LIPIDOS LIBRES RESIDUO I
HCl 2N
RESIDUO DESMINERALIZADO
C1 2 CH2 :MeOH
(2:1)
Soxhlet 12 h
LIPIDOS LIGADOS
Fig. 7.- Protocolo de extracción y fraccionamiento de los lípidos de las muestras en estudio.
22.-
Para la extracción de A.H. en cantidad suficiente
para su caracterización fisico-química se partió de una
cantidad de suelo variable (40-60 g), según los contenidos
de Carbono Orgánico Oxidable en A.H. anteriormente
determinado, donde se partia de sólo 1 g. de suelo.
, El procedimiento de extracción se llevo a cabo en
tubos de centrífuga con 30 mI del agente extractor (P2 07 Na,-
NaOH (1:1». La suspensión se agitó durante 24 horas, al cabo
de este tiempo se centrifuga a 5000 rpm durante 10 minutos,
separándose la solución sobrenadante de sustancias húmicas
coloreadas. Este proceso se repitió hasta que los extractos
presentaron nula o escasa coloración. Con el fin de minimizar
los efectos del contacto con el álcali, los extractos fueron
diariamente acidificados con H2SO, 2N hasta PH 1.
Una vez finalizada la extracción se separó la
fracción de A.H. precipitados en medio ácido, de los A.F. en
solución, por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos.
El A.H. aislado de cada muestra se lavó con agua destilada
mediante centrifugaciones sucesivas de 5 minutos a 5000 rpm;
posteriormente se secó en una estufa a 40·C.
En la extracción de lípidos se distinguen los
directamente extraidos del suelo (lípidos libre) de aquellos
asociados al complejo organo-mineral (lípidos ligados),
siguiendo la metodología propuesta por Moucawi et al, 1981.
23.-
Las cantidades de suelos utilizada para la
extracción y fraccionamiento de los lípidos libres fue
aproximadamente de 20 g. Una vez aislados éstos y
desmineralizado el suelo la cantidad de partida para la
extracción de los lípidos ligados fue de 15 g.
Para la extracción de lípidos libres se dispuso un
equipo Soxhlet con 100 mI del agente extractor (C1 2CH2 :MeOH
(2:1)), durante 12 horas. Los extractos totales se
concentraron por destilación a presión reducida, se secaron
bajo corriente de nitrógeno y se pesaron.
Una vez extraído los lípidos libres, cada muestra
se secó al aire y se le eliminó los carbonatos con HCl 2N
hasta desaparición de efervescencia. Posteriormente se lavó
con agua destilada, por centrifugaciones sucesivas a 5000 rpm
por 5 minutos, hasta eliminación de cloruros, lo cual se
comprobó con N03 Ag.
seguidamente cada muestra se secó al aire, se pesó
y se procedió de forma similar a la anteriuor descrita para
la extracción de los lípidos libres.
La escasa cantidad de extractos, tanto de lípidos
libres como de ligados, no justificó la separación de estos
en sus sUbfracciones, por lo que los extractos totales fueron
directamente derivatizados para su posterior estudio por
24.-
cromatografía gaseosa-espectrometría de masas.
11.5.- Caracterización por Espectrocopía de Infrarrojo
con transformada de Fourier (FT-IR) de los Acidos
Húmicos.
El espectro de absorción de IR de cada muestra se
obtuvo utilizando la técnica de pastilla de BrK, en la
proporción de 1 mg de A.H. por 200 mg de BrK. Cada espectro
se hizo entre 400 y 4000 cm-l, en un espectrofotómetro de 1R
TF Nicolet modo 5 DX E.
11.6.- Análisis por Cromatografía de Gases-Espectrometría de
Masas (GC-MS) de las fracciones lipídicas.
El procedimiento de análisis de los extractos fue
idéntico para todas las muestras estudiadas; la separación
se realizó en columnas capilares de sílice fundida de 20 m
de longitud y con 0.2 mm de diámetro interno, impregnada de
aV-IOI. La columna se instaló en el cromatógrafo de gases
Hewlett-Packard modo 5730A con detector de ionización de
llama (FID).
En la Tabla 2 se observan los parámetros
considerados en la separación de los componentes.
25.-
TABLA 2.- Parámetros del cromatógrafo de gases.
Flujo del gas portador 1 ml/min
Modalidad de inyección Splitless
Tº detector FID 300·C
Tº portal de inyección 250ºC
Purga del septum 2ml/min
Tº inyección 50ºC
Tº inicial T(1) 100ºC
Velocidad hasta T(1) 32ºc/min
Tiempo a T(1) O min
Tº final T(2) 300ºC
Tiempo a T(2) 15 min
Velocidad a T(2) 6ºC/min
26.-
Esta técnica permite la separación de los
componentes individuales de cada muestra. Para su
identificación se utilizó un sistema cromatógrafo de
gasesjespectrómetro demasasjcomputador Hewlett-Packardmod.
5988 A. En la Tabla 2 se recogen los parámetros
cromatográficos y en la Tabla 3 aquellos de MS. El gas
portador fue Helio a un flujo de 1 mljmin.
TABLA 3.- Condiciones de trabajo del MS.
Modo de ionización Impacto electrónico
Voltaje de ionización 70 eV
Voltaje del multiplicador 200 v
Rango de masas 40 - 600 uma
Velocidad de barrido 850 umajs
Umbral de detección de masas 200 cuentas
Para la identificación de cada componente se
compararon sus espectros de masas con los de la librería del
ordenador (Wiley), con los tabulados (EPA), con los
existentes en la bibliografía y con los definidos a partir
de sustancias patrones.
27.-
II.7.- Métodos de derivatización.
Las diferentes ténicas de deri vatización tienen por
objeto hacer más volátiles aquellos compuestos orgánicos,
como alcoholes, ácidos grasos, esteroles, etc., que por su
baja volatilidad no pueden ser normalmente analizados por
cromatografía gaseosa. En este trabajo se usaron dos
técnicas:
Metilación con Diazometano etereo: se uso para metilar los
grupos carboxilos de ácidos grasos. El Diazometano se preparó
con N-metil-N-Nitroso-p-tolueno-sulfonamida (diazald),
dietilenglicol-monometil-éter (Carbitol) y KOH en agua, en
un tubo de ensayo con éter. El Diazometano etereo se hizo
pasar, bajo corriente de nitrógeno, por cada uno de los
extractos diluidos en metanol, por 2 a 3 minutos
aproximadamente, hasta que la suspención adquiría'un color
amarillento; este proceso se repitió 3 veces cada 24 horas
para asegurar una metilación completa de las muestras.
Al finalizar el proceso el metanol se eliminó por
evaporación con nitrógeno y los extractos se colocaron en
frío.
28.-
Silanización con N,O-bis-(Trimetilsilil) trifluoracetamida
(BSTFA): se uso para silanizar los grupos -OH de alcoholes,
esteroles, etc. A cada extracto se le agregó 0.5 mI de BSTFA,
preparado en ampollas, y se agitó hasta disolución. A
continuación se colocó las muestras a 65·C por 20 minutos,
luego se evaporó con nitrógeno y se redisolvió en cloroformo
para inyectar en el cromatógrafo.
29.-
11I.- RESULTADOS Y DISCUS10N.
III.1.- Caracterización fisico-química de las muestras.
En la Tabla 4 se presentan los resultados obtenidos del
análisis de algunos parámetros fisico-químico de las muestras:
Tabla 4.- Parámetros fisico-químicos de las muestras en estudio
Muestra PH CE past CaC03 % P disp ppm ppm
1 7.0 0.37 1.0 28.5
2 6.2 0.36 0.0 10.0
3 6.7 0.61 0.0 3.5
4 7.2 1.02 3.8 42.0
5 7.7 0.66 12.1 17.5
6 _1 7.6 0.81 12.6 18.5 I
--_ ... _- ---_ .. _- -------, --_ ... __ ..... - ___ 1
Tabla 4.- Continuación
Muestra K disp C org % N Kjel C/N ppm
1 91 2.16 0.17 11.2
2 125 1.33 0.10 10.9
3 191 0.54 0.05 9.7
4 208 1.05 0.12 10.6
5 315 0.70 0.06 10.1
6 266 0.68 0.06 10.1 ---- --_._- --_ .. _--- ----- -
30.-
Ninguno de los suelos estudiados presenta va lores de pH
extremos. Sin embargo, llama claramente la atención el valor de
conductividad eléctrica que presenta la muestra del suelo venezolano de
Turen (muestra 4), muy superior al de los otros suelos, lo que es
indicativo de la mayor presencia de sales en este suelo. Por otra parte,
la conductividad de las muestras de los suelos de Maracay (1) y
Cantagallo (2) son muy bajas, aproximadamente la mitad del valor
alcanzado por la muestra Uribeque (3) y las de Caria (5 y 6).
Es notable la gran diferencia que existe entre las muestras
de suelo en lo que se refiere a su contenido en carbonatos, ya que
en algunas (Cantagallo y Uribeque) no se detectan, otras (Maracay y
Turen) presentan valores relativamente bajos, y, finalmente, en las
muestras de suelos de Caria se observa un valor extremadamente alto, como
corresponde a los tlpicos suelos calizos de esta zona.
Esta dispersidad de valores también se manifiesta en el
Fósforo disponible. Asi, las muestras Maracay, Cantagallo y Caria
presentan valores relativamente semejantes, muy diferentes a los de la
muestra Uribeque que presenta un valor entre 3.5 y 9.0 veces más bajo que
aquellas, y la muestra Turen que presenta un valor extremadamente alto
con respecto a las anteriores.
En lo que se refiere al Potasio disponible, las muestras
venezolanas mantienen valores semejantes, a excepción del suelo Maracay
que presenta un valor relativamente bajo, mientras los de Caria presentan
contenidos algo superiores a todos los suelos venezolanos.
31.-
Los contenidos de Nitrógeno de las muestras de suelos de
Caria y Uribeque son aproximadamente la mitad de los que presentan las
otras muestras, entre las que Cantagallo y Turen presentan valores muy
parecidos y Maracay el valor más alto.
En cuanto a 1 Carbono orgán ico, las muestras de sue los
venezolanos presentan valores muy dispares, destacando el elevado
porcentaje de la muestra Maracay (2,16 %), frente al valor muy bajo de
la muestra Uribeque (0,54 %). Este y los suelos de Caria pueden
considerarse como muy pobres en materia orgánica, y consecuentemente,
como poco fértiles. De hecho, de acuerdo a las clases de aptitud relativa
para uso agrícola, los suelos de Caria se caracterizan como de aptitud
moderada para el cultivo de olivo, de aptitud marginal para trigo,
algodon, girasol, alfalfa y cítricos y de aptitud nula para el maíz.
El casi idéntico bajo nivel que presentan las dos muestras
de Caria en C orgánico y la similitud en el resto de parámetros químicos
determinados, a excepción del K disponible, se debe a que ambas
corresponden al mismo tipo de suelo (Vertic Xerofluvens)
La relación C/N presenta valores muy similares en todas las
muestras. Se mantiene la tendencia observada en el análisis de los otros
parámetros en cuanto a que es la muestra de Maracay la que presenta el
valor más alto, Cantagallo y Turen tienden a valores muy semejantes y
Ur i beque presenta e 1 va 1 or más bajo, al i gua 1 que los canten i dos en
carbonatos, Fósforo, Carbono Orgánico y Nitrógeno.
Aunque el conocimiento del nivel total de M.O. del
suelo es importante, dada la ya mencionada influencia decisiva
32.-
en las propiedades fisico-químicas de los suelos, y es necesaria su
determinación a la hora de evaluar la capacidad de éstos ya sea para
fines productivos o de conservación, también es importante conocer cual
es el estado y calidad de dicha M.O., sobre todo su grado de
humificación. Tradicionalmente se ha considerado la relación G/N como un
índice adecuado del grado de humificación, pero si se quiere tener un
conocimiento más completo se debe recurrir a la determinación de los
contenidos en fracciones húmicas, ácidos húmicos (A.H.) y ácidos fúlvicos
(A.F.), ya la relación entre ambas.
111.1.1.- Determinación de A.H y A.F.
La determinación de A.H. y A.F. de las muestras en estudio
dió los resultados que se presentan en la tabla 5
Tabla 5.- Valores de la determinación de los A.H. y A.F. de las muestras
MUESTRA 1 2 3 4 5 6
A.H. % 1.46 0.51 0.54 0.93 0.90 0.80
A.F. % 0.53 0.41 0.26 0.42 0.18 0.18
AH/AF % 2.75 1.24 2.07 2.21 5.00 4.44
I
I
I
!
?O _ ~~.
Como era de esperar existe una correlación directa entre los
contenidos de M.O. de los distintos suelos y la contribución a ésta de
las fracciones húmicas. Asi, comparando los resultados obtenidos en cada
muestra se observa que las muestras Maracay, Turen y Cantagallo, las de
mayor contenido en M.O., presentan los mayores niveles de A.H. y A.F.,
sobre todo las dos primeras. Del mismo modo, la muestra Uribeque, que
presentó el nivel más bajo de M.O, se caracteriza por un bajo porcentaje
de A.H. y A.F. Las muestras de Caria mantienen la coincidencia de valores
anteriormente mencionada.
El análisis de la relación A.H./A.F., utilizada clásicamente
para evaluar el grado de humificación o madurez de la M.O. de un suelo,
revela que el nivel de A.H. es aproximadamente el doble que el de A.F.
en la mayorla de las muestras, e incluso cuatro vveces mayor en los
suelos con menor contenido en M.O .. Estos resultados coinciden
básicamente con los obtenidos por diferentes autores para extractos
húmicos de suelos diversos (González-Vila, 1974; Velasco de Pedro, 1988;
Hoyos de Castro y col., 1982), e indican que todos ellos son suelos muy
evolucionados.
Los resultados obtenidos en la determinación cuantitativa de
los A. H. Y A. F. de estas muestras son una prueba evidente de las
variabilidades a las que está sujeto el estudio de las S.H. del suelo.
Entre estas variables es preciso considerar la naturaleza del agente
extractor y las caracteristicas del suelo, ya que ambos factores pueden
condicionar las propiedades de las S.H.
34.-
III.2.- Caracterización de los Acidos Húmicos por FT-IR.
El uso de la espectroscopía infrarroja (IR) se ha mostrado
como extraordinariamente útil en el estudio de las S.H., como lo
demuestra la extensa bibliografía existente sobre el tema. En general,
la aplicación más relevante es la evaluación de la funcionalidad química.
Sin embargo, el estud io por IR se ha ut il izado frecuentemente para
dilucidar aspectos tales como la evaluación de los efectos de diferentes
agentes extractores, el efecto de la acción de diversos tratamientos
químicos, la formación de complejos metal-A.H., la interacción de
pesticidas y herbicidas con S.H., las diferencias entre S.H. de distinto
origen, etc. (González-Vila, 1974, Mac Carthy y Rice, 1985).
A pesar de la gran variedad y complejidad que pueden
presentar los espectro de IR de los A.H. existen algunas bandas
particulares características de todos ellos. Stevenson (1982) presenta
como las principales bandas de absorción comunes a los A.H. las de 3300,
2900, 1720 Y 1250 cm-'; además, de otras más débiles pero igualmente
características, como como las que aparecen a 1500, 1460 Y 1390 c~'
En la Tabla 6 se presentan las asignaciones propuestas por
diversos autores para las principales bandas de absorción en el IR de
A.H. de diversos orígenes.
35.-
TABLA 6.- Principales bandas de absorción en el IR de SH (Kononova, 1966; Stevenson y Goh, 1971; Orlov y col, 1962; Schnitzer y Khan, 1972 - Tomado de González-Vila, 1974 -. Del Río, 1989. Stevenson, 1982; Mac Carthy y Rice, 1985).
BANDA cm-1 ASIGNACION
3640 Tensión de grupos OH libres y alcoholes primarios, tanto alifáticos como aromáticos
3400-3300 Tensión de grupos OH unidos a H
2900-2850 Tensión C-H alifático
1725-1720 C=O de COOH y tensión C=O de carbonilo cetónico
1660-1630 C=C aromático, H unido a C=O de carbonilo, doble enlace conjugado con C=O; COO-
1620-1600 Tensión de C=C de anillos aromáticos; H unido a C=O
1590-1517 Tensión de COO- simétrico, deformación N-H + tensión de C=N; C=C aromático
1450-1380 Deformación de OH; deformación de C-H de grupos -CH, y -CH,COO-
1300-1200 Tensión C-O, deformación OH de COOH
1170-950 Tensión c-o de polisacáridos; Si-O de impurezas de silicatos
850-750 Vibración de C-H aromáticos fuera del plano olefínico y H aromáticos en bencenos polisustituidos, tensión de Si-O
,
36.-
En las Figs. 8, 9, 10, 11, 12 Y 13 se presentan los espectros
de FT-IR de los seis A.H. aislados de los diferentes suelos.
En general, todos ellos son similares a los señalados en la
bibliografía para A.H. Presentan las bandas características a 3300, 2900,
1720 Y 1250 cm·1 (Stevenson,1982), aunque se observan diferencias en las
respectivas intensidades de estas bandas que responden a la particular
naturaleza de cada uno de los A.H.
Para facilitar el estudio comparativo de los diferentes
espectros hemos considerado tres regiones diferentes:
Región 3700-2300 cm-I_
Esta región se caracteriza por presentar fuertes vibraciones
de tensión de grupos OH y CH y otra no tan importante de grupos NH.
Todas las muestras presentan una banda ancha entre los 3300
y 3400 cm- I, la cual incluye a distintos modos de tensión de los grupos
OH asociados tanto inter corno intramolecularmente, es decir, OH
alcohólicos, de agua, de COOH, etc_ Tan sólo el A.H. extraído del suelo
Cantagallo (Fig. 9) presenta bandas a 3700 y 3617 cm- I, que sugieren la
presencia de grupos OH de distinto origen.
Las bandas correspondientes a la tensión de C-H alifático a
2920 y 2850 cm- I, que representan los modos de tensión antisimétrico y
37.-
simétrico de grupos CH" son similares en intensidad en las seis muestras
estudiadas lo que sugiere un similar grado de alifaticidad en todas
ellas. El origen de esta absorción puede ser muy variado, ya que pueden
constituir cadenas alifáticas de material lipídico y/o restos de péptidos
presentes como parte estructural del A.H., o asociados fisicamente al
entorno por mecanismos diversos (Schnitzer y Khan, 1972).
Región 1900-1300 cm"l.
En esta región se observan mayores diferencias entre los
espectros. Se caracteriza por las bandas de vibración de anillos
aromát icos, varios modos de vibración de carboni lo y vibraciones de
tens i ón de CH,.
De las bandas características de esta región para A.H. las
centradas en 1720 y 1610 cm"l están presentes en todos los espectros, con
pequeñas diferencias de intensidad. La de 1720 cm"l representa las
vibraciones de C=O en grupos carboxilos, mientras que la de 1610 cm"l se
asigna a la tensión de C=C de anillo aromático o bien a C=O unido
fuertemente a H.
La banda centrada alrededor de 1540 cm"l, debida a los modos
de tensión de COO- simétrico y C=C aromático, se presenta muy debilmente
en 4 de las muestras, los A.H. de Uribeque (Fig. 10) Y Coria (5) (Fig.
12) no presentan bandas a esta frecuencia, lo que indica la ausencia de
estos grupos, en particular el menor carácter en aromáticos de estos A.H.
38.-
La tensión de C=C aromático y/o la vibración II de amida de
enlace peptídico asignada alrededor de los 1470 cm-l no se reconoce en la
muestra Uribeque, en cambio el resto de las muestras si la presenta,
aunque muy debilmente. Esta banda ha sido correlacionada por numerosos
autores (González-Vila, 1974) al contenido en nitrógeno de los A.H.
Más fuertemente marcada se observa la banda cercana a los
1400 cm-l, característica dela presencia de deformaciones de OH y las
deformaciones de C-H de grupos -CH' y -CH'COO-, la cual está presente en
las muestras Maracay (Fig. 8), Uribeque y las de Coria; los espectros de
los A. H. de Cantaga 110 y Turen (F i gs. 9 y 11) muestran esta banda
desplazada hacia los 1422 cm-l.
Región 1300-700 cm-l.
En esta región se presentan las mayores diferencias entre los
distintos espectros. Sin embargo, todas ellas presentan dos bandas bien
definidas alrededor de los 1040 y en el intervalo 1100-1200 cm-l, que se
asignan respectivamente a la tensión C-O de polisacáridos y Si-O de
impurezas de silicatos, y a la tensión C-O y deformación OH de COOH. Se
comprueba así la presencia de minerales arcillosos, que normalmente se
eliminan con ácido fluorhídrico en tratamientos de purificación drásticos
de A.H. que no se aplicaron en nuestro caso,
Las otras bandas características de esta región se encuentran
entre los 750 y 900 cm'l y se asignan a la presencia de vibraciones fuera
de plano del H aromático y vibraciones C-H aromáticos, todas las muestras
presentan bandas muy débiles y en constante desplazamiento en esta zona.
39.-
Existe una amplia variabilidad de dificil explicación entre
los distintos A.H.; como normalmente ocurre en la información
bibliográfica existente. Así, los A.H. del suelo Maracay (Fig. 8)
presenta 2 bandas muy débiles a 704 y 821 cm'!; el A.H. Cantagallo (Fig.
9), en cambio, presenta una muy débil a 753 cm'! y otra más fuerte a los
910 cm'!; en la muestra Caria del Río (5)(Fig. 12) existen también 2
bandas, una débil a 708 y otra fuerte a los 882 cm'!; los A.H. de los
suelos Uribeque (Fig.l0), Turen (Fig. 11) y Caria del Río (6) (Fig. 13)
presentan bandas débi les entre 700 y 776 cm'!.
lJJ (..)
Z <t: 1-1-H ::.: en z <t: o: 1-
~
119.0 -
115-
-110-
-105-
-100-
-95-
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84·°1 ,''/, I I 4000 3000 2000
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Fig. 8.- Espectro de IR del A.H. del suelo Maracay.
1000 400.0
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Fig. 9.- Espectro de IR del A.H. del suelo Cantagallo.
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Fig. 10.- Espectro de IR del A.H. del suelo Uribeque.
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Fig. 11.- Espectro de IR del A.H. del suelo Turen.
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Fig. 12.- Espectro de IR del A.H. del suelo Coria del Río (5).
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I 2000 iOOO
Fig. 13.- Espectro de IR del A.H. del suelo Coria del Río (6).
400.0
.p. U1
46.-
111.3.- Caracterización de los extractos lipídicos libres y ligados al
complejo órgano-mineral de los diferentes suelo.
El estudio de la fracción lipídica de los diferentes suelos
se realizó en base a la cuantificación y caracterización de los
respectivos extractos de lípidos libres y lípidos ligados. Los
porcentajes de extractos se presentan en la tabla 7.
Tabla 7.- Peso y porcentajes de los extractos de lípidos libres y ligados de las muestras de suelo.
Lípidos Lípidos Lípidos libres Muestra libres ligados +
mg % mg % Lípidos ligados
1 43.3 0.22 75.6 0.49 0.71
2 9.7 0.05 18.8 0.12 0.17
3 21.1 0.10 5.2 0.03 0.13
4 11.1 0.06 18.4 0.12 0.18
5 32.6 0.16 30.1 0.20 0.36
6 9.9 0.05 19.3 0.14 0.19
Los contenidos totales en lípidos de las muestras (suma de
las fracciones libres y ligadas) son muy similares, a excepción de la
muestra 1 (Maracay) y 5 (Caria) que presentan valores más elevados (doble
y cuadruple respectivamente). En todos los casos, sin embargo, las
proporciones de lípidos en los suelos estudiados están dentro del amplio
intervalo de valores encontrados en suelos de diferente origen
(Stevenson, 1982).
47.-
Llama especialmente la atención el hecho de que, a excepción
de la muestra Uribeque, en el resto de las muestras se extraen
aproximadamente dos veces más lípidos ligados que lípidos libres. Se
confirma, por tanto, la conveniencia o necesidad de seguir la metodología
elegida para evaluar correctamente la importancia cuantitfttiva de la
fracción lipídica.
Comparando estos resultados con las cantidades de M.O.t. de
cada muestra, anteriormente discutidas, se observa que hay una
correlación directa entre estos valores para las muestras más ricas
(Maracay) y las más pobres en M.O.t. (Uribeque), que no se confirma en
las demás. Esto se debe fundamentalmente a la variabilidad del porcentaje
de material lipidico ligado, e indirectamente, por tanto, a la diferente
afinidad del complejo órgano-mineral para fijar este material
hidrofÓbico.
El estudio de la composición de los diferentes extractos se
realizó mediante la técnica cromatografía de gases-espectrometría de
masas (GC-MS). En las Figs. 14 - 25 se presentan los cromatogramas de ión
total (TIC) de los extractos libres y ligados de las diferentes muestras.
En cada pico cromatográfico se indica por una letra la
naturaleza química del mismo, correspondiendo la numeración a la cantidad
de átomos de carbono de los integrantes de las diferentes series
homólogas. En la Tabla 8 se especifíca el significado de cada una de las
letras.
48. -
En las Tablas 9 y 10 se resumen las composiciones de las
distintas fracciones de lípidos en los diferentes suelos.
Tabla 8.- Naturaleza química de los compuestos presentes en los extractos lipídicos.
Denominación Grupo de Compuestos
A Acidos Grasos Libres
S n - alcanos
e Alcoholes primarios
D Sutil fosfatos
E Ftalatos
F Acido bencenodicarboxílico metil ester
G Metoxi~di -propi 1 iJencenos _ .. _- -
Aunque no se ha realizado la experimentación necesaria para
cuantificar los diferentes tipos de compuestos aislados, nos referiremos
en lo sucesivo a proporciones relativas de cada uno de ellos en base a
las medidas de alturas de picos cromatográficos, normalizando los
diferentes cromatogramas al mismo número de cuentas en las respuestas del
FID o MS.
En general, las series de compuestos identificados son
similares en las dos fracciones en todos los suelos, con variantes
cuantitativas escasamente significativas y con distribuciones muy
similares. Las principales series de compuestos identificados en todos
los casos son n-alcanos, ácidos grasos tanto libres como metilados y
alcoholes primarios, que constituyen los componentes principales de
49.-
Tabla 9.- Compuestos presentes en la fracción de lípidos libres de las muestras estudiadas.
MUESTRAS
COllpuesto 1 2 3 4 5 6
A 12-24 16-24 14-22 12-24 12-24 14-24
B 13-16 14-21 13-21 13-22 18-21 13-21
C 18-22 18-22 18-22 11-22 11-22 18-22
D + + + + + +
E + - + + + +
F + - + + + +
G - - - - - --~
L~~ .. ------ . .. ---
Tabla 10.- Compuestos presentes en la fracción de lípidos ligados de las muestras estudiadas.
MUESTRAS
Compuesto 1 2 3 4 5 6
A 12-22 14-22 14-22 12-22 12-24 14-22
B 21 13-22 14-22 13-21 19-22 13-22
C 11-22 17-22 12-22 19-22 11-22 19-22
D + + + + + + E + - + + + + F - - + - + -G + - - - - -
50. -
tejidos de plantas y animales y microorganismos (Stevenson, 1982).
n-alcanos: en todas las muestras de suelo se han identificado la serie
de n-alcanos e,,-e,2' predominando el homólogo e", sin embargo, la fracción
de lípidos ligados de la muestra de suelo Maracay (Fig. 20) se
caracteriza por presentar sólo el n-alcano eu'
Es muy sorprendente que en las series de n-alcanos no se
hayan identificado homólogos de alto peso molecular (> e,,), típicos de
las ceras de plantas superiores (Eglinton et al, 1968), que probablemente
constituyen la principal fuente de material lipídico en los suelos. Este
dato está en fase de confirmación, para lo que vamos a partir de mayores
cant idades de estractos, y se prevé hacer una opt imi zac ión de las
condiciones cromatográficas, por un lado, y nuevas inyecciones en el modo
SIM, por otro.
Acidos Grasos Libres: Se han identificado en forma de ésteres metílicos,
ya que se procedió rutinariamente a la metilación y silanización de las
muestras antes de los análisis por Ge-MS.
En todas las muestras de suelo, las series encontradas (e14 -
e,,) y su distribución es similar y es típica de organismos vivos,
predominando los homólogos e16 y e18 • En la fracción del suelo Maracay es
donde se observó la mayor abundancia de éstos, llegando a constituir
aproximadamente el 75% de la fracción de lípidos libres (Fig. 14) y el
60% de ligados al complejo órgano-mineral (Fig. 20). En el resto de
muestras de suelo se observan valores muy similares de abundancia de
51.-
ácidos grasos libres.
También se detectaron en todas las muestras en cantidades traza
metil ésteres de ácidos grasos, de origen microbiano, y los ácidos grasos
ramificados Cl , y C¡¡-
Alcoholes primarios: De la misma forma, son similares en todos los casos
las series de n-alcoholes encontradas (CH-C,,) y su distribución. No
obstante, sólo en la fracción de lípidos libres de las muestras de suelo
Turen (Fig.17) y Caria (5) (Fig.18) yen la fracción de lípidos ligados
de Maracay (Fig. 20), Uribeque (Fig. 22) Y Caria (5) (Fig. 24), se han
identificado homólogos de menor peso molecular « Cn ), característicos
representantes de la actividad microbiana.
Ftalatos de alquilo: Aparecen prácticamente en todas las muestras, a
excepción de la muestra de suelo Cantagallo (Figs. 15 y 21). Son
especialmente abundantes en las fracciones de lípidos libres de Uribeque
(Fig.16) y Caria (5) (Fig. 18) donde alcanzan valores entre el 40 y 45%.
Los ftalatos de dialquilo son comunmente utilizados en la industria de
pesticidas, plásticos, aceites, etc. (Peakall, 1975), y han sido
ampliamente detectados, como contaminantes, en muestras de muy diverso
origen.
Compuestos Aromáticos: Son típicos componentes de las fracciones
lipídicas de suelos, y provienen de la fragmentación de biopolímeros
tales corno ligninas, flavonoides, taninos, etc. Aparecen en todas las
fracciones de los suelos estudiados en cantidades pequeñas.
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64.-
IV.- CONCLUSIONES.
Las principales conclusiones del estudio realizado,
en cuatro suelos de Venezuela y dos de España, se resumen en
los siguientes puntos:
1.- Los suelos estudiados presentan dispares características
fisico-químicas en casi todos los parámetros analizados,
especialmente en conductividad eléctrica, carbonatos, fósforo,
potasio y carbono orgánico, como corresponde a sus diferentes
orígenes.
2.- La muestra de suelo de Maracay se caracteriza por un alto
contenido en Materia Orgánica Total. Por el contrario, la
muestra de suelo de uribeque y los suelos de Coria del Río
pueden considerarse como muy pobres en Materia Orgánica.
3.- En todas las muestras de suelos estudiadas el nivel de
ácidos húmicos (A.H.) es muy superior al de ácidos fúlvicos
(A.F.), llegando a ser incluso cuatro veces mayor en los suelos
con menor contenido en Materia Orgánica. Se deduce, por tanto,
que la Materia Orgánica de todos los suelos presenta un elevado
grado de evolución.
65.-
4.- El estudio de caracterización de los ácidos húmicos por FT
IR indica que todos ellos tienen un similar grado de
alifaticidad, de acuerdo con las intensidades de las bandas a
2920 y 2850 cm-1• Por el contrario, el análisis de las
intensidades de bandas centradas alrededor de 1600 y 1540 cm-1
indica que son diferentes en su grado de aromaticidad. Una
particularidad destacable en todos los espectros es la buena
resolución de la banda a 1725 cm-' , correspondiente a la
absorción de c=o en grupos COOH, el más importante grupo
fucional en las macromoleculas húmicas.
5.- Los contenidos en lípidos totales de los suelos estudiados
son muy similares y están dentro del intervalo de valores
encontrados en suelos de diferente origen. Es de señalar que en
todos los casos, a excepción del suelo Uribeque, se extrajo el
doble de lípidos ligados al complejo órgano-mineral que lípidos
libres, lo que demuestra la conveniencia e importancia de la
metodología empleada para evaluar correctamente la fracción
lipídica del suelo desde el punto de vista cuantitativo.
~F:.-
6.- El estudio de la naturaleza química de los componentes de
las fracciones de lípidos libres y ligados al complejo órgano
mineral, realizado por GC-MS, muestra que series de n-alcanos
(C,,-C 2., con el homólogo C'9 como predominante), ácidos grasos
saturados (CH-C,., predominando los homólogos C16 y C18 ), y
alcoholes primarios (C,a-C", aunque en algunos casos se han
detectado homólogos < C,3 , de origen microbiano) constituyen los
principales compuestos identificados en todos los casos. No se
distinguen, sin embargo, diferencias significativas en la
distribución de las diferentes series.
7.- En todas las fracciones lipídicas se han detectado en
diferentes proporciones series de ftalatos de dialquilo,
asociados a diferentes fuentes de contaminación, así como
compuestos aromáticos funcional izados procedentes de ligninas
y biopolímeros afines. También se detectaron en todas las
muestras, en cantidades traza, metil ésteres de ácidos grasos,
de origen microbiano, y los ácidos grasos ramificados C'5 y C,7 .
57.-
8.- En general, la caracterización de muestras de suelos
mediante el estudio de las fracciones lipídicas y la
caracterización quimico-estructural de las fracciones húmicas,
sólo abordado en este estudio mediante FT-IR, parece ser una
via adecuada para distinguir entre suelos de diverso origen
desde el punto de vista edafogenético. Al mismo tiempo, estos
estudios permiten determinar parámetros de gran validez
potencial para evaluar la capacidad productiva y/o de
conservación de los suelos, de acuerdo con las actuales
tendencias.
58.-
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B.- Espectro de masas del Alcano e 19:0.
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D.- Espectro de masas de Tri-iso-butil fosfato.
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E.- Espectro de masas de Di-iso-butil talato.
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F.- Espectro de masas de 1,4 ácido dicarboxi1ico metil estero
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![EQUILIBRIO QUIMICO]](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5572028c4979599169a3b84c/equilibrio-quimico-55b4f9afcb0e1.jpg)
