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MATEUS BATISTA SIMÔES
ESTUDO DA SÍNTESE DE CARBON DOTS VIA CARBONIZAÇÃO
HIDROTÉRMICA E AVALIAÇÃO FRENTE A BIOSSISTEMAS
CAMPINAS
2014
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
MATEUS BATISTA SIMÕES
ESTUDO DA SÍNTESE DE CARBON DOTS VIA CARBONIZAÇÃO
HIDROTÉRMICA E AVALIAÇÃO FRENTE A BIOSSISTEMAS
ORIENTADOR: PROF. DR. OSWALDO LUIZ ALVES
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA
AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA
NA ÁREA DE QUÍMICA INORGÂNICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
POR MATEUS BATISTA SIMÕES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. OSWALDO LUIZ ALVES.
_______________________
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2014
iv
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Química Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Si51e
Simões, Mateus Batista, 1990-
SimEstudo da síntese de carbon dots via carbonização hidrotérmica e avaliação
frente a biossistemas / Mateus Batista Simões. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
SimOrientador: Oswaldo Luiz Alves. SimDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Química.
Sim1. Nanoestruturas de carbono. 2. Fluorescência. 3. Nanotoxicologia. I. Alves,
Oswaldo Luiz. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III.
Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study on the synthesis of carbon dots via hydrothermal
carbonization and evaluation towards biosystems Palavras-chave em inglês: Carbon nanostructures
Fluorescence
Nanotoxicology Área de concentração: Química Inorgânica Titulação: Mestre em Química na área de Química Inorgânica Banca examinadora: Oswaldo Luiz Alves [Orientador]
Adley Forti Rubira Juliano Alves Bonacin Data de defesa: 17-07-2014 Programa de Pós-Graduação: Química
vi
vii
Dedico esta dissertação aos meus pais,
José Carlos e Isabel, pelo seu
incondicional amor, incentivo e
compreensão! Esta conquista é nossa!
viii
ix
“Eu sei que o meu trabalho é uma gota no oceano, mas sem ele, o
oceano seria menor.”
Madre Teresa de Calcutá
x
xi
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus pelas oportunidades que recebi durante toda
minha vida e hoje me colocaram em uma das melhores universidades do
Brasil, a UNICAMP, tendo a oportunidade de trabalhar com pessoas de
imenso talento e competência.
Agradeço os sacrifícios que meus pais se propuseram e ainda se propõe a
enfrentar com o objetivo de me ajudar a conquistar meus sonhos e toda a
paciência e incentivo ao longo desta jornada, que por vezes é incerta e
tenebrosa.
Agradeço ao Professor Oswaldo a possibilidade de desenvolver este trabalho e
conviver em um ambiente cientificamente rico. Levarei comigo exemplos do
LQES por toda a vida.
Giulianna, sua presença me completa e me faz querer ser um homem melhor a
cada dia! Sua compreensão e respeito sobre as minhas escolhas, seu apoio e
suporte foram fundamentais para a conclusão desta dissertação. Amo você
incondicionalmente!
Agradeço aos meus irmãos, Fernando e Simone, por todos os momentos que
compartilhamos. Como caçula, os exemplos deles ajudaram a moldar o que eu
sou hoje.
Agradeço os amigos de Campinas e LQES, em especial a Ana Carolina, por
todas as discussões científicas e por fazer os momentos em Campinas mais
agradáveis.
xii
Agradeço os amigos que ficaram em São Carlos, que mesmo com a distância
nunca se esqueceram de mim e sempre se preocuparam comigo. Desejo a
todos vocês – Anderson, Elias, Isaias, Giorgio, Glauco, Lucas Quintal, Lucas
Sponton, Luis Felipe, Michelle, Natan, Pedro Barrenha, Pedro Martins,
Ricardo – sucesso e felicidade sempre!
Agradeço ao Roberto pela disponibilidade e ajuda nas análises de
internalização celular realizadas na UNIFESP.
Agradeço a Marilia Horn e Virginia, estas duas pessoas incríveis, que foram
responsáveis pelo meu ingresso na pesquisa e me deram uma base muito boa
para desenvolver este trabalho! A competência e sabedoria delas me causa
admiração!
Agradeço à FAPESP pela bolsa concedida e todo o suporte financeiro para o
desenvolvimento deste trabalho (processo 2012/22612-5).
Por fim, agradeço todos os funcionários do Instituto de Química e da
UNICAMP por suas contribuições para a execução deste trabalho.
xiii
Súmula Curricular
Dados Pessoais:
Nome: Mateus Batista Simões
E-mail: [email protected]
Formação Acadêmica:
Mestrado em Química Inorgânica (Agosto/2012 – Julho/2014)
Local: Laboratório de Química do Estado Sólido (LQES) – Instituto de
Química – Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) – Campinas/SP.
Título: “Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e
Avaliação Frente à Biossistemas”
Orientador: Prof. Dr. Oswaldo Luiz Alves
Bacharelado em Química com Ênfase Tecnológica (Fevereiro/2008 –
Julho/2012)
Local: Instituto de Química de São Carlos (IQSC) – Universidade de São
Paulo (USP), São Carlos/SP.
Produção Bibliográfica:
Capítulo de Livro:
1. ALVES, O. L.; MORAES, A. C. M.; SIMÕES, M. B.; FONSECA, L. C.;
NASCIMENTO, R. O.; HOLTZ, R. D.; FARIA, A. F. Nanomaterials. In:
DURÁN, N.; GUTERRES, S. S.; ALVES, O. L. (Eds.). Nanotoxicology:
Materials, Methodologies and Assessments. Nova Iorque: Springer, 2014, p. 1
– 29.
xiv
2. Aceito para publicação: SIMÕES, M. B.; HORN, M. M.; MARTINS, V. C.
A.; PLEPIS, A. M. G. Influence of Starch Oxidation in Drug Delivery
Behavior of Chitosan/Corn Starch Films. In: CAMPANA-FILHO, S. P. (Ed.)
Advances in Chitin Science – Volume XIV.
Resumos expandidos publicados em anais de congressos
1. SIMÕES, M. B.; HORN, M. M.; PLEPIS, A. M. G.; MARTINS, V. C. A. .
Chitosan/Starch Films as Controlled Drug Delivery System. In: 7th
International Symposium on Natural Polymers and Composites, 2010,
Gramado. CD-Rom do 7th International Symposium on Natural Polymers and
Composites, 2010., 2010.
Resumos publicados em anais de congressos
1. SIMÕES, M. B. ; HORN, M. M. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.
. Comportamento Reológico de Blendas Quitosana/Amido/Ciprofloxacina:
Efeito do Poliol. In: 18º Simpósio Internacional de Iniciação Científica da
USP, 2010, São Paulo. Anais do 18º SIICUSP, 2010.
2. SIMÕES, M. B. ; PLEPIS, A. M. G. ; HORN, M. M. ; MARTINS, V. C. A.
. Géis de Quitosana/Amido/Ciprofloxacina: Efeito da Oxidação do Amido e
da Adição de Glicerol. In: 7º Encontro de Bioengenharia, 2010, São Carlos.
Cd-Rom do 7º Encobio, 2010.
3. HORN, M. M. ; SIMÕES, M. B. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.
. Blends based on modified starch and chitosan: effect of ciprofloxacin
xv
addition in rheological properties and in drug delivery behaviour. In: Polychar
19 - World Forum on Advanced Materials, 2011, Kathmandu. Book of
Abstracts. Kathmandu: Tribhuvan University and the Nepal Polymer Institute,
2011. p. 195.
4. SIMÕES, M. B. ; HORN, M. M. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.
. Influência da Oxidação do Amido em Filmes de Quitosana/Amido na
Liberação Controlada de Ciprofloxacina. In: 19º Simpósio Internacional de
Iniciação Científica da USP, 2011, São Carlos. Anais do 19º SIICUSP, 2011.
5. SIMÕES, M. B.; ALVES, O. L.; Synthesis of Carbon Dots by
Hydrothermal Carbonization of Glucose. In: 1st International Symposium on
Nanoparticles/Nanomaterials and Applications, 2014, Caparica. Proceedings
of the 1st International Symposium on Nanoparticles/Nanomaterials and
Applications. Caparica: Proteomass Scientific Society, 2014, p.413.
xvi
xvii
Resumo
ESTUDO DA SÍNTESE DE CARBON DOTS VIA CARBONIZAÇÃO
HIDROTÉRMICA E AVALIAÇÃO FRENTE A BIOSSISTEMAS
Carbon dots foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de
glicose e as condições de síntese foram otimizadas utilizando-se um
planejamento fatorial. Os carbon dots foram caracterizados por espectroscopia
na região do infravermelho, espectroscopia na região do ultravioleta-visível,
microscopia eletrônica de transmissão, além de ter seu perfil de fluorescência
estudado, sendo que o máximo de excitação ocorre na região do ultravioleta e
o máximo de emissão na região do azul. Testes hemolíticos foram realizados
com as nanopartículas que apresentaram maior rendimento quântico e
mostraram que não há indução de hemólise, demonstrando que o material tem
elevado potencial para aplicação in vivo. Carbon dots também foram
sintetizados adicionando-se um precursor contendo nitrogênio à glicose, e
conseguiu-se um aumento de 2,3 vezes no rendimento quântico dos carbon
dots, considerando a condição de síntese otimizada pelo planejamento fatorial
(rendimento quântico de 13,2%). O comprimento de onda de excitação e
emissão não foi modificado e o material também não apresentou efeito
hemolítico. Por fim, utilizando-se as condições ótimas de síntese, carbon dots
também foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de pectina,
demonstrando que o método de síntese é robusto e válido para fontes de
carbono alternativas. Os carbon dots obtidos de pectina apresentam um
rendimento quântico de 3,6% e foram caracterizados pelas mesmas técnicas
utilizadas para os carbon dots de glicose.
Palavras chaves: nanoestruturas de carbono, fluorescência, nanotoxicologia
xviii
xix
Abstract
STUDY ON THE SYNTHESIS OF CARBON DOTS VIA
HYDROTHERMAL CARBONIZATION AND EVALUATION TOWARDS
BIOSYSTEMS
Carbon dots were obtained by hydrothermal carbonization of glucose
and the synthesis parameters were optimized by a factorial design of
experiments. The carbon dots were characterized by infrared spectroscopy,
ultraviolet-visible spectroscopy, transmission electron microscopy, beyond to
have its fluorescence profile studied, and it was observed that the maximum
excitation occurs at the ultraviolet range and the maximum emission at the
blue range of the spectrum. Hemolytic trials were performed with the
nanoparticles of highest quantum yield, and the results showed that no
hemolysis was provoked, demonstrating that he material have a raised
potential to in vivo applications. Carbon dots were also synthetized adding a
precursor containing nitrogen to the glucose and an increase of 2.3 times was
observed on the quantum yield, already taking into account the optimizes
synthesis condition by the factorial design (quantum yield of 13.2%). The
wavelength of excitation and emission was not modified and the material do
not showed hemolytic effect again. Lastly, with the optimized synthesis
parameters, carbon dots were also obtained by hydrothermal carbonization of
pectin, evidencing that the synthesis protocol is robust and effectual to
alternatives carbon sources. The carbon dots of pectin presented a quantum
yield of 3.6% and were characterized by the same techniques utilized to the
carbon dots of glucose.
Keywords: carbon nanostructures, fluorescence, nanotoxicology
xx
xxi
Sumário
Lista de Tabelas .......................................................................................... xxiii
Lista de Figuras ............................................................................................ xxv
1 Introdução ...................................................................................................... 1
1.1 Carbon Dots .............................................................................................. 5
1.2 Sínteses Hidrotérmicas ............................................................................. 9
1.3 Relevância do Trabalho .......................................................................... 11
2 Objetivos....................................................................................................... 13
3 Procedimento Experimental ....................................................................... 15
3.1 Materiais ................................................................................................. 15
3.1.1 Reagentes .......................................................................................... 15
3.1.2 Equipamentos ................................................................................... 15
3.2 Métodos................................................................................................... 15
3.2.1 Planejamento fatorial para síntese de carbon dots ........................... 16
3.2.2 Purificação dos carbon dots ............................................................. 17
3.2.3 Caracterização dos carbon dots........................................................ 18
3.2.4 Aplicações Biológicas ...................................................................... 19
4 Resultados e Discussão ................................................................................ 23
4.1 Obtenção dos Carbon Dots a Partir da Glicose ...................................... 23
xxii
4.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão .......................................... 26
4.1.2 Espectrofluorimetria e Rendimento Quântico .................................. 30
4.1.3 Planejamento Fatorial ....................................................................... 40
4.1.4 Espectroscopia de UV-Vis ............................................................... 42
4.1.5 Espectroscopia de Infravermelho ..................................................... 43
4.2 Obtenção dos Carbon Dots a Partir de Pectina ...................................... 47
4.3 Obtenção de Carbon Dots Contendo Nitrogênio ................................... 52
4.4 Aplicações Biológicas ............................................................................ 57
4.4.1 Ensaios Hemolíticos ......................................................................... 58
4.4.2 Internalização Celular....................................................................... 62
5 Conclusões .................................................................................................... 67
6 Perspectivas .................................................................................................. 69
Referências Bibliográficas ............................................................................. 71
Anexo A ........................................................................................................... 79
xxiii
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Planejamento fatorial para avaliar a influência do tempo de reação,
temperatura e concentração dos reagentes na síntese dos carbon dots via HTC
.......................................................................................................................... 16
Tabela 2 – Tamanho médio dos carbon dots obtidos a partir da carbonização
hidrotérmica da glicose, determinado por meio das análises das imagens de
microscopia eletrônica de transmissão. ............................................................ 29
Tabela 3 – Valores da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão
máximas das diferentes amostras de carbon dots sintetizados a partir da
carbonização hidrotérmica da glicose. ............................................................. 37
Tabela 4 – Rendimento quântico médio dos carbon dots obtidos utilizando-se
glicose como fonte de carbono. ........................................................................ 39
Tabela 5 – Dados estatísticos (limite de confiança de 95%) para o
planejamento fatorial sobre a síntese de carbon dots utilizando glicose como
fonte de carbono. .............................................................................................. 40
Tabela 6 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da
amostra Gli_E em diferentes concentrações. ................................................... 58
Tabela 7 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da
amostra Gli_E_TTDDA em diferentes concentrações. ................................... 60
xxiv
xxv
Lista de Figuras
Figura 1 – Ilustração esquemática da densidade de estados de um sólido
expandido (“bulk”), quantum dots de diferentes tamanhos e uma molécula
diatômica (adaptado de Alivisatos9). .................................................................. 3
Figura 2 – Fotografia de quantum dots de Seleneto de Cádmio sintetizados no
LQES, evidenciando a alteração na coloração do material com a variação do
tamanho das nanopartículas (adaptado de Romano, 200711
). ............................ 4
Figura 3 – Levantamento sobre a produção científica relacionada ao tema
carbon dots, realizada em junho de 2014 (Web of Science, topic = “carbon
dots”). ................................................................................................................. 6
Figura 4 – Diagrama com propriedades e aplicações dos carbon dots
(adaptado de Li et al.23
) ...................................................................................... 8
Figura 5 – Fotografia de uma autoclave moderna, utilizada no LQES, com
controle de temperatura e agitação e medidor digital de pressão. ................... 11
Figura 6 – Fotografia das soluções antes e após a carbonização hidrotérmica,
sendo (a) a solução de glicose em NaOH 0,15mol.L-1 e (b) a solução obtida
após a reação na autoclave. .............................................................................. 23
Figura 7 – Imagem de TEM mostrando a presença de grandes aglomerados no
produto de reação. ............................................................................................ 24
Figura 8 – Representação esquemática mostrando as soluções antes e após o
processo de purificação, bem como a fotografia digital evidenciando o
fenômeno de Espalhamento Tyndall. ............................................................... 26
xxvi
Figura 9 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a)
Gli_A, (b) Gli_B, (c) Gli_C e (d) Gli_D, juntamente com os respectivos
histogramas de distribuição do tamanho das partículas. .................................. 27
Figura 10 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras
(a) Gli_E, (b) Gli_F, (c) Gli_G e (d) Gli_H, juntamente com os respectivos
histogramas de distribuição do tamanho das partículas. .................................. 28
Figura 11 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_A mostrando que a
emissão em 445 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 30
Figura 12 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_B mostrando que a
emissão em 445 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 31
Figura 13 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_C mostrando que a
emissão em 450 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 32
Figura 14 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_D mostrando que a
emissão em 450 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 33
Figura 15 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E mostrando que a
emissão em 450 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
xxvii
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 34
Figura 16 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_F mostrando que a
emissão em 445 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 34
Figura 17 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_G mostrando que a
emissão em 445 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 35
Figura 18 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_H mostrando que a
emissão em 440 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 36
Figura 19 – Superfície de resposta para otimização das condições de síntese.41
Figura 20 – Espectro UV-Vis das soluções de carbon dots (glicose como fonte
de carbono) diluídas em água deionizada em concentração de 0,1 mg.mL-1
. . 42
Figura 21 – Espectro de infravermelho da glicose em pastilha de KBr. ......... 43
Figura 22 – Espectro de infravermelho das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C e
Gli_D em pastilha de KBr. ............................................................................... 44
Figura 23 – Espectro de infravermelho das amostra Gli_E, Gli_F, Gli_G e
Gli_H em pastilha de KBr. ............................................................................... 45
xxviii
Figura 24 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra
CdotPec, juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho
das partículas. ................................................................................................... 47
Figura 25 – Espectro de fluorescência da amostra CdotPec mostrando que a
emissão em 430 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em
detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com
comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 48
Figura 26 – Espectro UV-Vis da solução de CdotPec diluída em água
deionizada na concentração de 0,1 mg.mL-1
. ................................................... 50
Figura 27 – Espectro de infravermelho da amostra CdotPec e do precursor
pectina em pastilha de KBr. ............................................................................. 51
Figura 28 – Estrutula molecular do reagente 4,7,10-trioxa-1,13-
tridecanodiamina (TTDDA). ............................................................................ 53
Figura 29 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra
Gli_E_TTDDA, juntamento com o respectivo histograma de distribuição do
tamanho das partículas. .................................................................................... 53
Figura 30 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E_TTDDA mostrando
que a emissão em 445 nm é independente do comprimento de onda da
excitação (em detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV
(b) com comprimento de onda de 380 nm). ..................................................... 54
Figura 31– Espectro de infravermelho das amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA
em pastilha de KBr. .......................................................................................... 56
Figura 32 – Espectro UV-Vis da solução de Gli_E_TTDDA diluída em água
deionizada na concentração de 0,1 mg.mL-1
. ................................................... 57
xxix
Figura 33 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra
Gli_E diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico. ........................... 59
Figura 34 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra
Gli_E_TTDDA diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico. ............ 61
Figura 35 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com
a amostra Gli_E em um concentração de 100 µg.mL-1
, com excitação em 405
nm. .................................................................................................................... 63
Figura 36 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com
a amostra Gli_E_TTDDA em um concentração de 100 µg.mL-1
, com
excitação em 405 nm. ....................................................................................... 65
Figura 37 – Espectro de emissão da amostra Gli_E diluída em tampão PBS na
concentração de 0,5 mg.mL-1, com excitação em 405 nm. ............................. 79
Figura 38 – Espectro de emissão da amostra Gli_E_TTDDA diluída em
tampão PBS na concentração de 0,2 mg.mL-1, com excitação em 405 nm. ... 79
xxx
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
1
1 Introdução
Richard Philips Feynman, em conferência realizada em 1959 no
Encontro Anual da Sociedade Americana de Física, foi o primeiro cientista a
indagar quais seriam os efeitos nos materiais quando estes fossem
manipulados próximos à escala atômica1, apresentando grande contribuição
para o que se entende por nanotecnologia nos dias atuais. Hoje, o investimento
global em nanotecnologia supera a cifra de cinco bilhões de dólares,
demonstrando ser uma área de muito interesse científico e tecnológico2. Este
interesse advém do fato das propriedades dos nanomateriais poderem ser
moduladas pelo tamanho de suas partículas3, sendo que as características do
material no seu estado macro (bulk) podem divergir consideravelmente de
quando na escala nanométrica. Esta discrepância tem duas causas principais4:
Efeitos de superfície causados pela elevada razão de átomos
superficiais. Átomos na superfície apresentam menos vizinhos do que no
interior, gerando um número de coordenação menor e ligações deficientes.
Assim, os átomos na superfície são menos estáveis do que no interior do
sólido, podendo-se observar alterações na temperatura de fusão, nas transições
de fase e até mesmo em algumas propriedades termodinâmicas, como por
exemplo, apresentar capacidade calorífica negativa3.
Efeitos quânticos causados pelo confinamento quântico em
materiais com elétrons delocalizados, no qual a densidade de estados e a
energia das partículas terão uma dependência com o tamanho3.
Semicondutores no estado bulk possuem uma energia mínima para excitar um
elétron do estado fundamental de valência para uma vacância na banda de
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
2
condução, denominada de energia de band-gap (Eg), cujo valor irá depender
da composição do semicondutor. Quando um elétron consegue vencer esta
barreira tem-se o surgimento de um éxciton. Este éxciton apresenta um
tamanho finito, definido pelo diâmetro do éxciton de Bohr (aB), que se for
maior do que o tamanho da partícula acarretará num confinamento espacial
dos transportadores de carga, aumentando sua energia. Assim, as propriedades
óticas e eletrônicas passam a depender do tamanho da partícula, quando neste
regime de confinamento5.
Um exemplo marcante da nanotecnologia é a Taça de Licurgo, uma
peça romana com mais de 1600 anos, a qual já apresentava a utilização de
nanopartículas de ouro e prata na sua constituição6. Esta taça,
surpreendentemente, muda sua coloração dependendo se a luz é transmitida ou
refletida por ela, devido ao fenômeno de ressonância superficial de banda
plasmônica, no qual acontecem transições eletrônicas coletivas de elétrons
livres na superfície do metal nanoestruturado7.
Outro exemplo emblemático da nanotecnologia são os quantum dots.
Quantum dots são materiais nanométricos que apresentam efeitos de
confinamento quântico, fato que altera suas propriedades eletroeletrônicas,
sendo muito conhecidos por sua alta fotoluminescência, podendo ser
utilizados em LEDs, monitores e como agentes biológicos de imagem8. Os
primeiros quantum dots estudados para estes fins eram baseados em
semicondutores, tais como InAs, CdS, CdSe.
Para se entender os fenômenos que levam a estas diferentes
propriedades, alguns aspectos da mecânica quântica devem ser mencionados.
Cada átomo apresenta seu próprio orbital atômico. Quando dois átomos se
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
3
combinam entre si, observa-se a interação destes dois orbitais atômicos
gerando dois orbitais moleculares: um ligante, que apresenta menor energia e
estabiliza a ligação química; e outro antiligante, que apresenta maior energia e
desestabiliza a ligação. Entretanto, quando um número muito grande de
átomos interagem entre si, observar-se uma grande quantidade de níveis de
energia próximos um dos outros, levando a formação de bandas de energia.
Estas bandas serão centradas próximas aos níveis moleculares diatômicos,
gerando o que conhecemos por banda de condução e banda de valência.
Figura 1 – Ilustração esquemática da densidade de estados de um sólido expandido
(“bulk”), quantum dots de diferentes tamanhos e uma molécula diatômica (adaptado de
Alivisatos9).
Entretanto, para os quantum dots, descontinuidades começam a ser
observadas em virtude do efeito confinamento quântico. A estrutura eletrônica
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
4
do material é modificada, surgindo elétrons delocalizados. Estes elétrons
fazem com que níveis discretos de energia passem a ser observados, como
pode ser observado na Figura 1. Esta Figura também permite observar que a
energia do band-gap de um quantum dot ficará entre a do sólido expandido e
da molécula. Sendo assim, é possível modular a estrutura eletrônica do
material, controlando o tamanho de suas partículas, levando às propriedades
eletroeletrônicas desejadas10
.
Figura 2 – Fotografia de quantum dots de Seleneto de Cádmio sintetizados no LQES,
evidenciando a alteração na coloração do material com a variação do tamanho das
nanopartículas (adaptado de Romano, 200711
).
Como exemplo, tem-se o sulfeto de cádmio (CdS), o qual apresenta
um band-gap de 1,7 eV quando em partículas de 20 nm contra um Eg de 2,4
eV quando em partículas de 2 nm9. A dependência do valor da energia do
band-gap reflete-se, em casos específicos de energia, na cor dos compostos,
como pode ser observado nos quantum dots de seleneto de cádmio (CdSe)
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
5
sintetizados no LQES (Figura 2)11
. Porém, apesar do elevado rendimento
quântico e controlável luminescência, os tradicionais quantum dots
inorgânicos apresentam como desvantagem a conhecida e elevada toxicidade
de alguns destes elementos12
, impossibilitando o uso destes materiais na área
biomédica.
1.1 Carbon Dots
Diversas classes de nanomateriais já foram estudadas. Após a
descoberta do fulereno (C60)13
e dos nanotubos de carbono14
, a utilização de
nanomateriais baseados em carbono passou a atrair enorme interesse nas
pesquisas em virtude da potencial aplicação nas mais diversas áreas15
: catálise,
aproveitamento energético, eletrônica, biomedicina, sensores, entre outras,
possibilitando o surgimento de novas nanoestruturas, tais como o grafeno,
nanofios, filmes, membranas e quantum dots de carbono16
.
Os quantum dots de carbono, também denominados carbon dots, são
um dos mais recentes alótropos de carbono descobertos. A descoberta de tais
nanomateriais ocorreu de maneira acidental, quando pesquisadores tentavam
purificar nanotubos de carbono17
. Primeiramente, houve um hiato sobre as
pesquisas envolvendo tal material, conforme levantamento realizado no Web
of Science® em junho de 2014, porém nos últimos três anos observa-se um
aumento brusco nos artigos publicados sobre carbon dots, bem como o
número de citações destes artigos.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
6
Figura 3 – Levantamento sobre a produção científica relacionada ao tema carbon dots,
realizada em junho de 2014 (Web of Science, topic = “carbon dots”).
Estas nanoestruturas de carbono quando suficientemente pequenas (2-
10 nm) começam a apresentar luminescência, possivelmente devido a efeitos
de confinamento quântico aliados com defeitos na sua superfície16; 18; 19
, sendo
que algumas partículas maiores do que este tamanho crítico podem também
apresentar luminescência após terem sua superfície passivada16; 20
. Os carbon
dots, apesar de possuírem menor rendimento quântico quando comparados aos
quantum dots de semicondutores19
, apresentam menor citotoxicidade, maior
biocompatibilidade, resistência a fotodegradação e inércia química em relação
a degradação metabólica16; 18; 19; 20
, sendo um possível substituto dos quantum
dots que possuem elementos tóxicos na sua composição (principalmente Cd,
Se, Te e As), com potencial aplicação na área biomédica como sensores e
agentes de imagem. Trabalhos recentes comparam a eficiência dos carbon
dots com a de já comercializados quantum dots de seleneto de cádmio
recobertos com sulfeto de zinco (CdSe/ZnS). Foi observado que os carbon
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
7
dots são tão eficientes quanto aos já utilizados quantum dots aliados a uma
menor toxicidade12
. Contudo, para a aplicação destes materiais na área
biomédica, muitas vezes torna-se necessário sua funcionalização, seja para
aumentar sua solubilidade em meio aquoso ou mesmo diminuir respostas
imunológicas. Dentre as alternativas possíveis, destaca-se o recobrimento das
partículas com polietilenoglicol (PEG), que aumenta a solubilidade das
partículas em meio aquoso e aumenta o tempo de circulação venosa21
. Pode
ainda ser usado o ácido fólico, que atua como sensor para distinguir células
cancerígenas de células normais22
.
Além da possível aplicação na área biomédica, os carbon dots
apresentam potencial papel em fotocatálise, optoeletrônica, sensores para
efeito Raman intensificado pela superfície (SERS, do inglês surface enhanced
raman scattering)23
, entre outros, como exemplificado na Figura 4.
Para exemplificar a ampla gama de aplicação dos carbon dots, a
literatura descreve sua utilização em sensores para detecção seletiva de íons
divalentes de mercúrio24; 25
e cobre26
, detecção de íons férrico27
, íons sulfeto28
,
glicose quando aliado em um nanocompósito com grafeno e nanopartículas de
ouro29
, quercetina30
, tintas biocompatíveis31
, tinta fluorescente para evitar
falsificação e garantir autenticidade27
, sensibilizador para células
fotoeletroquímicas32
, fabricação de nanocompósitos de polímeros
luminescentes33
, entre outras.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
8
Figura 4 – Diagrama com propriedades e aplicações dos carbon dots (adaptado de Li et
al.23
)
Vários métodos de síntese dos carbon dots são descritos na literatura.
Podem-se utilizar duas estratégias para a síntese de nanomateriais: em uma,
chamada de “top-down”, parte-se de um material bulk e o desgasta até a
escala nanométrica, geralmente por um processo físico; a outra estratégia,
chamada de “bottom-up”, baseada na organização de precursores moleculares
para a criação da nanoestrutura, ou seja, um processo mais químico. Para a
síntese dos carbon dots, ambas as estratégias têm sido utilizadas. Dentre os
processos top-down, destaca-se a obtenção de carbon dots por exfoliação
eletroquímica de grafite32
ou fibras de carbono34
e a ablação a laser de
grafite35
. Os processos bottom-up são mais reportados na literatura e envolvem
uma extensa gama de métodos de síntese e fontes de carbono, destacando-se a
carbonização de glicose mediada por ultrassom36
, pirólise de precursores
orgânicos, como carboidratos37
e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)38
,
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
9
carbonização e oxidação ácida de fuligem12; 15; 39; 40
, oxidação térmica de sais
de amônio quaternários41; 42
, carbonização de polietilenoglicol (PEG)43
ou de
ácido cítrico com uréia31
ou etilenodiamina28; 44
assistida por micro-ondas e
carbonização de glicose utilizando micelas reversas45
. Entretanto, muitas
destas técnicas são trabalhosas e exigem a utilização de equipamentos ou
reagentes caros, tornando-as pouco atrativas19
. Assim, um método que se
mostra viável, uma vez que é simples e requer materiais de baixo custo, é a
carbonização hidrotérmica (HTC, do inglês Hydrothermal Carbonization)46; 47;
48; 49. Várias fontes de carbono já foram utilizadas para a síntese de carbon
dots via HTC, tais como ácido ascórbico50
, ácido cítrico27
, albumina de soro
bovino (BSA)51
, carboidratos40
, casca de frutas24; 29
, citrato de sódio25
,
gelatina52
, glicose53
, glucosamina54
, polissacarídeos33
, quitosana55
, seda56
, suco
de laranja57
, tabaco26
e muitas outras. Nota-se que uma grande parte destes
materiais de partida apresentam baixo valor e algumas vezes são até mesmo
resíduos industriais, os quais podem ter seu valor agregado aumentado quando
utilizados como precursores para a obtenção de carbon dots.
1.2 Sínteses Hidrotérmicas
O termo hidrotérmico tem origem na geologia, sendo usado para
designar a ação da água em elevadas temperaturas e pressão, levando à
formação de minerais e modificações na crosta terrestre58
. Apesar das
confusões existentes sobre a definição da técnica, em grande parte pela
presença do prefixo hidro, que tem origem do grego hydros (água), a síntese
hidrotérmica pode ser compreendida como um conjunto de reações químicas
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
10
heterogêneas que ocorrem em um sistema fechado na presença de solvente,
aquoso ou não59
. O primeiro registro da utilização de condições hidrotérmicas
para a síntese de materiais é de 1845, quando E. T. Schafthual preparou
partículas finas de quartzo. Posteriormente, teve-se o início das sínteses de
vários silicatos, argilas, hidróxidos e óxidos, sendo que já em 1900, mais de
150 espécies já haviam sido sintetizadas. Em 1940, iniciou-se o crescimento
de cristais sob condições hidrotérmicas e estudos sobre equilíbrios de fase.
Atualmente, uma ampla gama de materiais pode ser obtida por esta técnica,
até mesmo nanopartículas com tamanho e morfologia controlados58
.
A síntese hidrotérmica apresenta uma grande quantidade de vantagens,
podendo-se destacar a possibilidade de obtenção de produtos com elevada
pureza e homogeneidade, distribuição estreita de tamanho de cristais,
processos de etapa única, sínteses rápidas e com baixo consumo energético,
crescimento de cristais de baixa solubilidade, variação de composição química
e muitas outras aplicações59
. Além disso, hoje são disponíveis autoclaves
modernas (Figura 5), que permitem o controle rigoroso da temperatura e
agitação do meio reacional, além de permitir trabalhar sob uma atmosfera
específica e controlada, potencializando, assim, as vantagens da síntese
hidrotérmica.
Utilizando-se como substrato qualquer tipo de biomassa, pode-se
realizar a carbonização hidrotérmica – expandindo a visão de que os
tratamentos hidrotérmicos são utilizados somente para substâncias inorgânicas
– sendo possível a obtenção de carvões com diferentes morfologias e materiais
nanoestruturados de carbono com diversos tamanhos e formas48; 49
.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
11
Figura 5 – Fotografia de uma autoclave moderna, utilizada no LQES, com controle de
temperatura e agitação e medidor digital de pressão.
A carbonização hidrotérmica é uma técnica simples, econômica e
eficiente, que vem sendo citada dentro de uma proposta ambientalmente
amigável, visto que não causa danos ao meio ambiente, além de ser uma
maneira de evitar/diminuir a emissão de gases causadores do efeito estufa46
.
1.3 Relevância do Trabalho
Considerando a obtenção de nanoestruturas por meio da síntese
hidrotérmica, é importante a realização de estudos visando a elaboração de
protocolos de síntese que sejam reprodutivos e bem compreendidos. Ademais,
Forno
Sistema de
arrefecimento
Controlador digital
de temperatura e
agitação e medidor
digital de pressão.
Medidor analógico
de pressão.
Haste de agitação
Conectores do reator
(termopar, haste de
agitação, tubos de
injeção e remoção de
material)
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
12
deve-se trabalhar com a possibilidade do escalonamento da produção, bem
como a diminuição dos custos envolvidos, objetivando a produção industrial
dos sistemas de interesse.
A síntese dos carbon dots é de fundamental importância para sua
aplicação, visto que o perfil de fotoluminescência é dependente do tamanho
das partículas. Assim, para sua utilização em larga escala, é necessária uma
rota de síntese que seja bem conhecida, possibilitando direcionar o material
para a aplicação de desejada16; 19
. A HTC tem demonstrado grande potencial
para a síntese de materiais de carbono com diferentes formas e tamanhos,
mesmo em escala nanométrica48
. A HTC, a partir de resíduos de biomassa e
sacarídeos, vem demonstrando ser extremamente viável para a síntese de
nanomateriais de carbono e apresenta como vantagens agregar valor a uma
matéria prima de baixo custo e abundante além de diminuir a emissão de gases
que contribuem para o efeito estufa46
. Entretanto, apesar de promissora, ainda
há poucos estudos sobre os mecanismos envolvidos e quais os parâmetros que
influenciam efetivamente a obtenção dos diferentes materiais.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
13
2 Objetivos
Considerando os aspectos apresentados, os Objetivos Gerais deste
Projeto podem ser divididos em dois grupos: inicialmente busca-se realizar
uma avaliação das condições da síntese hidrotérmica sobre as propriedades
dos carbon dots e, posteriormente, obter o mesmo material com a
incorporação de nitrogênio na sua estrutura com o intuito de verificar seu
comportamento frente à biossistemas. Finalmente, os objetivos específicos
deste trabalho são discriminados mais detalhadamente a seguir:
Avaliar, como o auxílio de um planejamento fatorial, como os
diferentes parâmetros de síntese (temperatura, tempo de reação e concentração
da fonte de carbono) afetam o rendimento quântico, tamanho e morfologia dos
carbon dots obtidos por meio de sacarídeos com diferente grau de
complexidade;
Caracterizar estruturalmente e morfologicamente os carbon
dots, bem como avaliar sua luminescência;
Otimizar as condições de síntese para obter carbon dots com
elevada fluorescência, criando um rota de síntese robusta;
Obter carbon dots com a incorporação de nitrogênio e estudar a
influência desta incorporação na luminescência do material, objetivando sua
aplicação in vivo;
Prova de conceito, avaliando a hemólise provocada pelo
material com e sem nitrogênio na sua estrutura.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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14
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
15
3 Procedimento Experimental
3.1 Materiais
3.1.1 Reagentes
Ácido sulfúrico P.A. Synth, água deionizada Milli-Q®, brometo de
potássio grau espectroscópico Merck, D-glicose Anidra P.A. Synth, etanol
absoluto P.A. Neon, hidróxido de sódio em pastilha P.A. Synth, pectina obtida
de maçã Sigma-Aldrich®, sacarose anidra P.A. Synth, sulfato de quinino 98%
Sigma-Aldrich®, tampão Dubelcco Sigma-Aldrich
® e tampão PBS Sigma-
Aldrich®.
3.1.2 Equipamentos
Reator Parr – Modelo 4843; sistema de filtração à vácuo Millipore;
liofilizador Terroni – modelo LD300TT; espectrofluorímetro Varian – modelo
Cary Eclipse; prensa hidráulica Carver – Modelo 3855; espectrofotômetro de
infravermelho ABB Bomem, série MB – modelo FTLA2000-102;
espectrofotômetro de UV-Vis Shimadzu – modelo 1650PC; leitor de
microplacas Anthos – modelo Zenith 200RT e microscópio eletrônico de
transmissão Zeiss – modelo Libra.
3.2 Métodos
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
16
3.2.1 Planejamento fatorial para síntese de carbon dots
Utilizou-se um planejamento fatorial completo, avaliando a
combinação de 3 fatores (temperatura, tempo e concentração da fonte de
carbono) em dois níveis (+ e -), consistindo em um planejamento 23. Este tipo
de planejamento é um dos mais utilizados como triagem, a fim de se
determinar quais são as variáveis que mais influenciam uma determinada
resposta60
. Construiu-se uma tabela (Tabela 1) para a realização do
planejamento fatorial, sendo que as variáveis avaliadas foram: temperatura
(condição -: 120ºC; condição +: 160ºC), tempo (condição -: 4 h; condição +: 8
h) e concentração inicial da fonte de carbono (condição -: 2% massa/volume;
condição +: 6% massa/volume). Os valores utilizados foram baseados em
dados reportados na literatura47; 55
. O rendimento quântico foi selecionado
como resposta para a alteração dos diferentes parâmetros.
Tabela 1 – Planejamento fatorial para avaliar a influência do tempo de reação, temperatura
e concentração dos reagentes na síntese dos carbon dots via HTC
Experimento Tempo Temperatura Concentração Denominação
1 + + + Gli_A
2 - + + Gli_B
3 + - + Gli_C
4 - - + Gli_D
5 + + - Gli_E
6 - + - Gli_F
7 + - - Gli_G
8 - - - Gli_H
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
17
Numa síntese típica, uma massa adequada de glicose (1,4 g ou 7,8
mmol nas condições - ; 4,2 g ou 23,4 mmol nas condições +) era dissolvida
em 70 mL de uma solução de NaOH 0,15 mol.L-1
previamente preparada. Esta
solução foi então transferida para o reator Parr com capacidade de 100 mL, ou
seja, o volume ocupado do reator era de 70%. Após o fechamento do reator, o
aquecimento era iniciado, sob agitação de 100 rpm para homogeneizar o meio
reacional. O tempo de reação começava a ser contabilizado no momento em
que a temperatura de interesse era atingida.
3.2.2 Purificação dos carbon dots
O processo de purificação dos carbon dots foi realizado baseado em
informações literatura53
. A solução marrom escuro obtida após o tratamento
no reator foi filtrada em membrana de acetato de celulose de 0,22 µm – Merck
Millipore.
O filtrado foi transferido para tubos Falcon de 50 mL, congelado em
nitrogênio líquido (-196ºC) e liofilizado durante cinco dias. Posteriormente, o
sólido marrom/preto obtido foi disperso em etanol com a ajuda de um banho
de ultrassom (15 min) e deixou-se decantar por 2 h. O material foi filtrado em
membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 µm – Merck
Millipore, gerando uma solução amarelada.
O solvente foi removido com o auxílio de um evaporador rotativo e o
sólido obtido (carbon dots purificados) foi redisperso em água deionizada e
armazenado em geladeira protegido da luz.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
18
3.2.3 Caracterização dos carbon dots
3.2.3.1 Espectroscopia de Fluorescência e Determinação de Rendimento
Quântico
Levou-se uma solução 0,1 mg.mL-1
de carbon dots diluída em água
deionizada ao espectrofluorímetro e avaliou-se o máximo de excitação e
emissão. Os espectros foram obtidos utilizando os valores máximos
encontrados de excitação e emissão, utilizando abertura de fenda de 10 nm.
A determinação do rendimento quântico61
(Q) foi realizada em
triplicata utilizando sulfato de quinino como referência (Qref = 54%),
empregando soluções com absorbância inferior a 0,1 no comprimento de onda
de excitação, por meio da seguinte equação:
(
) (
) (
)
Equação 1
Sendo Q o rendimento quântico, I a área integrada do espectro de
emissão, A a absorbância no comprimento de onda de excitação e n o índice
de refração do solvente. O sub-índice “ref” refere-se aos valores obtidos para o
sulfato de quinino, o qual apresenta rendimento quântico conhecido.
3.2.3.2 Espectroscopia de UV-Vis
Uma solução 0,1 mg.mL-1
de carbon dots diluída foi colocada em uma
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
19
cubeta de quartzo e foi registrado o espectro entre 190 e 800 nm, utilizando
água deionizada como referência.
3.2.3.3 Espectroscopia de Infravermelho
Transferiu-se uma alíquota de 100 µL de uma solução concentrada de
carbon dots (10 mg.mL-1
) para um almofariz de ágata e levou-se a uma estufa
à 80ºC para a evaporação do solvente. Posteriormente, adicionou-se
aproximadamente 100 mg de brometo de potássio (KBr) e pastilhou-se a
amostra, prensando-a em uma prensa hidráulica sob 4 toneladas de pressão
durante 30 s. Foram realizados 64 scans por espectro, com resolução de 4 cm-1
e a faixa de medição foi de 4000 a 400 cm-1
.
3.2.3.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
As análises de microscopia foram realizadas sob voltagem de
aceleração de 120 kV. Para o preparo da amostra, gotejou-se uma solução 25
µg.mL-1
de carbon dots diluída em água deionizada em um grid de cobre
recoberto com carbono (300 mesh) e o solvente foi seco em estufa à 40ºC.
A determinação da distribuição de tamanho das partículas foi realizada
com o auxílio do software ImageJ, contando-se 150 partículas.
3.2.4 Aplicações Biológicas
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
20
3.2.4.1 Ensaio Hemolítico
O protocolo para avaliar a resposta hemolítica das nanopartículas foi
adaptado do método descrito na norma técnica E2524-08(2013) da ASTM (do
inglês, American Society for Testing and Materials)62
. Concentrado de
hemácias de sangue tipo B+ foi obtido do Hemocentro da Universidade
Estadual de Campinas (Unicamp). Um volume de 2 mL do concentrado de
hemácias foi transferido para um tubo plástico e completou-se o volume para
10 mL com tampão fosfato salino Dulbecco livre de Ca2+
e Mg2+
(DPBS). A
solução resultante foi homogeneizada levemente e, posteriormente,
centrifugada a 10000 rpm por 10 minutos à 4ºC. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e as hemácias foram lavadas por mais três vezes
com DPBS. Após a lavagem, as hemácias foram reconstituídas em 10 mL de
DPBS, formando a solução HTS (Hemoglobina Total do Sangue).
O controle positivo do teste (100% de hemólise) foi preparado
adicionando-se 100 µL da solução HTS em um tubo Eppendorf contendo 900
µL de água deionizada. O controle negativo (0% de hemólise) foi preparado
adicionando-se 100 µL da solução HTS em um tubo Eppendorf contendo 900
µL de DPBS. Ambos os controles foram realizados em triplicata.
Para os testes com as nanopartículas, 100 µL da solução HTS foi
adicionada a um tubo Eppendorf e adicionou-se volumes adequados de DPBS
e de uma solução estoque dos carbon dots testado (15 mg.mL-1
em DPBS), de
maneira que o volume final fosse de 1 mL, nas diferentes concentrações de
carbon dots: 3,750; 1,500; 0,750; 0,375; 0,150; 0,075 e 0,015 mg.mL-1
. Todas
as concentrações foram testadas em triplicata.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
21
Os tubos foram homogeneizados e incubados em banho seco por 3
horas à 25ºC, sendo homogeneizados a cada 30 minutos. Após o período de
incubação, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 rpm.
Posteriormente, 100 µL dos sobrenadantes foram recolhidos, transferidos para
uma microplaca de 96 poços e leu-se o valor de absorbância em 540 nm em
um leitor de microplacas. O valor de absorbância em 540 nm das soluções de
carbon dot nas concentrações utilizadas sem adição da solução HTS foi
medido para minimizar qualquer possível interferência da absorção dos
carbon dots nas medidas de absorbância do ensaio hemolítico.
A porcentagem de hemólise é calculada pela seguinte equação63
:
( ) (
) Equação 2
onde, Absam é o valor de absorbância em 540 nm do sobrenadante da
solução de carbon dot incubada com as hemácias, Absb é o valor de
absorbância em 540 nm da solução de carbon dot não incubadas, AbsC- é o
valor de absorbância em 540 nm do controle negativo e AbsC+ é o valor de
absorbância em 540 nm do controle positivo.
3.2.4.2 Imunofluorescência e Análise por Microscopia Confocal da
Internalização dos Carbon Dots
As células HeLa foram cultivadas em placas de 6 poços (1x105 células
por poço) sobre lamínula de vidro e, após 24 horas, as células foram tratadas
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
22
por 24 horas adicionais com 100 µg.mL-1
das soluções de carbon dots
testadas. As células foram lavadas com solução salina balanceada de Hanks
(HBSS) [10 mM Hepes (pH 7,4); 1,4 M NaCl; 1,26 mM CaCl2; 0,34 mM
Na2HPO4; 0,4 mM MgSO4; 0,4 KH2PO4; 0,5 mM MgCl2; 5,5 mM KCl] e
incubadas por 30 minutos com 3 µg.mL-1
de WGA conjugado com Alexa
Fluor 594 (Invitrogen, Eugene, OR, EUA), para marcação da membrana
plasmática. A seguir, as células foram lavadas com HBSS. As lâminas foram
analisadas em microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP8
(Leica, Mannheim, Alemanha), com objetiva 63x (Plan-Neofluar, abertura
numérica de 1.75) sob óleo de imersão. Os carbon dots foram excitados com
laser de diodo (λexc = 405 nm, λem = 430-550 nm), enquanto que o WGA-
Alexa Fluor 594 foi excitado com laser HeNe (λexc = 552 nm, λem = 600-640
nm). As imagens foram tratadas utilizando-se o programa Adobe Photoshop
CS5 e Adobe Illustrator CS5.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
23
4 Resultados e Discussão
4.1 Obtenção dos Carbon Dots a Partir da Glicose
Após a dissolução da quantidade adequada de glicose na solução 0,15
mol.L-1
de NaOH, obteve-se uma solução transparente, a qual foi adicionada
ao reator. Ao fim dos tratamentos térmicos, obtiveram-se soluções marrom
escuro com a presença ou não de sólidos pretos dependendo da temperatura e
tempo de reação estabelecida pelo planejamento fatorial, como pode ser
observado na Figura 6:
(a) (b)
Figura 6 – Fotografia das soluções antes e após a carbonização hidrotérmica, sendo (a) a
solução de glicose em NaOH 0,15mol.L-1 e (b) a solução obtida após a reação na
autoclave.
Respeitando-se a aleatoriedade na ordem da realização dos
experimentos no planejamento fatorial, a primeira condição de síntese
realizada utilizou um tempo de reação de 4 h, temperatura de 160ºC e 6% de
concentração massa/volume da fonte de carbono (condição referente a amostra
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
24
Gli_B). Inicialmente, seguiu-se os procedimentos estabelecidos na literatura
que utilizam centrifugação a 16000 rpm por 45 min para separar aglomerados
e grandes partículas formadas durante a síntese47
. Entretanto, após a
centrifugação não foi observada a formação de precipitado e a análise da
amostra por microscopia de transmissão mostrou a presença de grandes
aglomerados, conforme observado na Figura 7, confirmando que a simples
centrifugação não é suficiente para a obtenção uma solução pura de carbon
dots.
Figura 7 – Imagem de TEM mostrando a presença de grandes aglomerados no produto de
reação.
A simples centrifugação não foi suficiente para a purificação dos
carbon dots, mesmo com a modificação das condições de síntese, por
exemplo, aumentando o tempo de reação para 24 h e aumento da temperatura
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
25
de síntese para 200ºC. Sendo assim, foi necessário encontrar uma maneira de
purificar e isolar os carbon dots antes de dar continuidade nas demais
caracterizações do material. Um novo levantamento bibliográfico foi realizado
a fim de verificar quais outros métodos poderiam ser empregados para o
isolamento dos carbon dots. Observou-se que outros trabalhos reportados na
literatura utilizavam o método de diálise40; 54; 61
, cromatografia de exclusão
molecular12
, cromatografia líquida de alta eficiência64; 65
, precipitação por
troca de solvente39; 41
e extração por solventes53
, sendo que estes dois últimos
foram testados inicialmente por serem mais simples e acessíveis. A
precipitação por troca de solvente não se mostrou eficiente, visto que mesmo
com a adição de considerável volume de acetona, um solvente com constante
dielétrica conhecidamente bem inferior ao da água, não foi observado
precipitação. Por outro lado, o método de extração por solvente, descrito no
item 3.2.2 deste documento, mostrou-se eficiente para a purificação e
isolamento dos carbon dots, conforme será evidenciado adiante com as
imagens de microscopia eletrônica de transmissão.
Seguindo o protocolo desenvolvido para a purificação dos carbon dots,
a solução obtida após o tratamento hidrotérmico foi filtrada em membrana de
acetato de celulose, sendo retida uma quantidade expressiva de material
aglomerado. Esta quantidade dependia das condições de síntese utilizadas. O
filtrado ainda apresentava uma coloração escura. Dando continuidade com o
processo de purificação, após a liofilização do filtrado, resuspensão do sólido
obtido em etanol absoluto e filtração em membrana de PVDF de 0,22 µm,
uma solução amarelada era obtida. O etanol era eliminado com o auxílio de
um evaporador rotativo e as partículas eram novamente suspensas em água
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Dissertação de Mestrado
26
deionizada, gerando uma solução amarelada, conforme pode ser observado na
Figura 8.
Figura 8 – Representação esquemática mostrando as soluções antes e após o processo de
purificação, bem como a fotografia digital evidenciando o fenômeno de Espalhamento
Tyndall.
É interessante destacar que, ao incidir um laser nesta solução, foi
observado o fenômeno de espalhamento Tyndall, indicando a presença de
partículas dispersas em solução. Ou seja, tem-se uma suspensão, em princípio,
de carbon dots purificados.
4.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão
A observação das imagens obtidas por microscopia de transmissão
mostra a presença de pequenas partículas com formato aproximadamente
esférico e poucos aglomerados em todas as amostras, evidenciando a formação
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
27
dos carbon dots, conforme pode ser observado na Figura 9 e na Figura 10. A
distribuição do tamanho das partículas foi realizado com o auxílio do software
ImageJ, contabilizando-se 150 partículas.
Figura 9 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a) Gli_A, (b)
Gli_B, (c) Gli_C e (d) Gli_D, juntamente com os respectivos histogramas de distribuição
do tamanho das partículas.
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28
Figura 10 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a) Gli_E, (b)
Gli_F, (c) Gli_G e (d) Gli_H, juntamente com os respectivos histogramas de distribuição
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
29
do tamanho das partículas.
É interessante observar nas imagens de microscopia eletrônica de
transmissão das amostras que a distribuição de tamanho nas diferentes
amostras não é homogênea. Os valores médios, bem como seu desvio, estão
reportados na Tabela 2.
Tabela 2 – Tamanho médio dos carbon dots obtidos a partir da carbonização hidrotérmica
da glicose, determinado por meio das análises das imagens de microscopia eletrônica de
transmissão.
Amostra Tamanho Médio (nm)
Gli_A 4,8 ± 1,4
Gli_B 5,6 ± 1,6
Gli_C 15,9 ± 5,4
Gli_D 4,7 ± 0,8
Gli_E 4,1 ± 0,5
Gli_F 3,9 ± 0,7
Gli_G 3,1 ± 0,5
Gli_H 4,4 ± 1,0
Observa-se que em todas as amostra, há partículas entre 2 e 10 nm,
com a presença de poucos aglomerados. A amostra Gli_C é uma exceção,
sendo que apresenta partículas variando entre 5 e 30 nm, com tamanho médio
de 15,9 ± 5,4 nm. As demais amostram apresentam tamanho médio inferior a
5,6 nm, indicando que as partículas são de fato muito pequenas, permitindo a
manifestação do fenômeno de confinamento quântico.
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Dissertação de Mestrado
30
4.1.2 Espectrofluorimetria e Rendimento Quântico
As medidas de espectrofluorimetria mostraram que o comprimento de
onda máximo no qual ocorre a excitação e emissão dos carbon dots é
praticamente independente das condições de síntese utilizadas. Somente
pequenas diferenças são observadas nos espectros de emissão e excitação nas
diferentes condições, o mesmo acontecendo quando se altera a fonte de
carbono utilizada para a obtenção dos carbon dots, onde sempre é observada
uma fluorescência na região azul do espectro visível.
Na amostra Gli_A, observa-se que o máximo de emissão ocorre com
comprimento de onda de excitação em 350 nm (ultravioleta próximo) e
emissão em 445 nm, ou seja, apresenta fluorescência azul.
Figura 11 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_A mostrando que a emissão em 445
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
31
Além disso, conforme pode ser observado na Figura 11, nota-se que a
emissão é dependente do comprimento de onda da excitação, ou seja,
alterando-se a excitação, desloca-se o comprimento de onda no qual ocorre a
emissão, comportamento este já observado e descrito na literatura para os
carbon dots19; 66; 67
. Outro fator interessante de se observar é a largura à meia
altura das bandas de excitação e de emissão, as quais apresentam os valores de
83 e 96 nm, respectivamente.
A amostra Gli_B também apresenta como máximo de excitação o
comprimento de onda de 350 nm e o máximo de emissão em 455 nm, bem
como o comportamento de emissão dependente do comprimento de onda de
excitação, conforme pode ser observado na Figura 12:
Figura 12 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_B mostrando que a emissão em 445
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
32
A largura à meia altura da banda de excitação da amostra Gli_B é de
77 nm e da banda de emissão máxima é de 106 nm.
A amostra Gli_C apresenta um leve deslocamento para o vermelho na
excitação e emissão, sendo que o máximo de excitação ocorre em 360 nm e o
máximo de emissão em 450 nm, conforme observado na Figura 13.
Figura 13 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_C mostrando que a emissão em 450
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Novamente pode ser observado que o máximo de emissão é
dependente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação. O valor da
largura à meia altura da banca de excitação é de 85 nm e da banca de emissão
é de 97 nm.
O mesmo comportamento da amostra Gli_C foi observado na amostra
Gli_D, a qual apresenta comprimento de onda máximo de excitação em 360
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
33
nm e emissão máxima em 450 nm. O máximo do espectro de emissão também
mostra uma dependência com o comprimento de onda de excitação. A largura
à meia altura da banda de excitação é de 87 nm e da banda de emissão é de 96
nm, como mostra a Figura 14.
Figura 14 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_D mostrando que a emissão em 450
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Já a amostra Gli_E apresenta um comprimento de onda máximo de
excitação de 345 nm. O máximo de emissão ocorre em 450 nm. É interessante
observar que a amostra Gli_E apresentou um deslocamento para o azul no
espectro de excitação. A amostra apresenta o mesmo comportamento em que a
emissão depende do comprimento de onda de excitação. A largura à meia
altura da banda de excitação é de 85 nm e da banda de emissão é de 105 nm.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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34
Figura 15 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E mostrando que a emissão em 450
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
A amostra Gli_F também apresentou o máximo de excitação em 345
nm, porém o máximo de emissão ocorre em 445 nm.
Figura 16 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_F mostrando que a emissão em 445
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
35
A largura à meia altura da banda de excitação da amostra Gli_F é de
88 nm e da banda de emissão é de 100 nm.
O mesmo perfil também foi observado na amostra Gli_G. O máximo
de excitação ocorre em 345 nm, sendo que a largura à meia altura desta banda
é de 83 nm. Já o máximo de emissão ocorre em 445 nm, com largura à meia
altura de 100 nm. Novamente observa-se que o máximo de emissão é
dependente do comprimento de onda de excitação, conforme pode ser
observado na Figura 17.
Figura 17 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_G mostrando que a emissão em 445
nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Finalmente, como pode ser observado na Figura 18, a amostra Gli_H
apresenta como comprimento de onda máximo de excitação o valor de 345
nm. O valor do comprimento de onda máximo de emissão é de 440 nm.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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36
Diferente das demais amostras, o comprimento de onda máximo de
emissão é independente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.
Além disso, a largura à meia altura da banca de excitação máxima é de 100
nm e da banda de emissão máxima é de 98 nm.
Figura 18 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_H mostrando que a emissão em 440
nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada
com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
A origem da fluorescência dos carbon dots ainda não é totalmente
compreendida e conhecida. Acredita-se que a fluorescência possa ser fruto de
dois fatores: o primeiro, relacionado ao próprio fenômeno de confinamento
quântico; e o segundo, devido a diferentes traps de energia na superfície das
carbon dots, originados pela presença de grupos funcionais oxigenados na
superfície das partículas66; 67
.
Estes dois fatores nos ajudam a compreender as pequenas diferenças
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
37
observadas nos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão dos
carbon dots, bem como o motivo das bandas de excitação e emissão serem
alargadas.
A Tabela 3 apresenta os valores da largura à meia altura das bandas de
excitação e emissão, bem como os valores máximos de emissão e excitação.
Tabela 3 – Valores da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão máximas das
diferentes amostras de carbon dots sintetizados a partir da carbonização hidrotérmica da
glicose.
Amostra λexc (nm)
Largura à meia
altura da banda de
excitação (nm)
λem (nm)
Largura à meia
altura da banda
de emissão (nm)
Gli_A 350 83 445 96
Gli_B 350 77 445 106
Gli_C 360 85 450 97
Gli_D 360 87 450 96
Gli_E 345 85 450 105
Gli_F 345 88 445 100
Gli_G 345 83 445 100
Gli_H 345 100 440 98
A observação dos dados da Tabela 3, juntamente com os valores de
tamanho médio dos carbon dots (apresentados na Tabela 2), não permite
distinguir claramente qual dos dois fatores – tamanho ou traps superficiais de
energia – é dominante na fluorescência do material.
Sendo conhecida a seguinte relação:
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38
Equação 03
onde, E é energia, h a constante de Planck, c a velocidade da luz no vácuo e λ
o comprimento de onda da radiação. Espera-se que as amostras que
apresentam menor tamanho de partícula, emitam em menor comprimento de
onda, uma vez que, de acordo com o efeito de confinamento quântico, as
partículas menores apresentam maior energia. É observada certa tendência
neste comportamento. A amostra Gli_C é a que apresenta o maior tamanho
médio (15,9 ± 5,4 nm) e emite no maior comprimento de onda observado entre
as amostras (450 nm). Entretanto, apesar desta tendência, alguns desvios são
observados. Por exemplo, a amostra Gli_H é a que emite no menor
comprimento de onda, porém não é a amostra que apresenta a menor
distribuição de tamanho (4,4 ± 1,0 nm contra 3,1 ± 0,5 nm da amostra Gli_G).
Sendo assim, observa-se que os dois fatores atuam simultaneamente na
fluorescência do material. Este fato dificulta a modulação da energia de band-
gap, como é possível com os tradicionais quantum dots inorgânicos.
Além disso, a máxima emissão dependente do comprimento de onda
de excitação pode ser compreendida pelos fenômenos de confinamento
quântico e a presença de diferentes traps de energia na superfície dos carbon
dots66; 67
. Alterando-se o comprimento de onda de excitação, alteram-se as
partículas que estão sendo excitadas – em virtude da distribuição de tamanho
não ser totalmente homogênea, conforme relatado na Tabela 2 – e também são
alterados os traps de energia que serão excitados, os quais, consequentemente,
emitirão em novos comprimentos de onda.
Para a determinação do rendimento quântico dos carbon dots obtidos a
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
39
partir de glicose, selecionou-se o sulfato de quinino como referência, o qual
apresenta os máximos de excitação e emissão numa região muito próxima da
dos materiais obtidos.
A Tabela 4 mostra o valor médio obtido pela realização em triplicata
para cada amostra.
Tabela 4 – Rendimento quântico médio dos carbon dots obtidos utilizando-se glicose como
fonte de carbono.
Amostra Rendimento Quântico Médio (%)
Gli_A 4,4 ± 0,2
Gli_B 4,5 ± 0,2
Gli_C 4,4 ± 0,1
Gli_D 3,6 ± 0,3
Gli_E 5,8 ± 0,1
Gli_F 3,6 ± 0,1
Gli_G 4,7 ± 0,2
Gli_H 3,3 ± 0,1
Os valores de rendimento quântico determinados variam entre 3,3 e
5,8%, sendo coerentes com os valores descritos na literatura36; 40; 47; 53
utilizando-se glicose como fonte de carbono, os quais dificilmente ultrapassam
7%.
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40
4.1.3 Planejamento Fatorial
Com o auxílio do software STATISTICA foi possível avaliar
estatisticamente quais variáveis interferem significativamente no valor do
rendimento quântico do material obtido, sendo possível otimizar as condições
de síntese.
A Tabela 5 apresenta os valores dos dados estatísticos utilizando um
limite de confiança de 95% (nível de significância = 0,05).
Tabela 5 – Dados estatísticos (limite de confiança de 95%) para o planejamento fatorial
sobre a síntese de carbon dots utilizando glicose como fonte de carbono.
Efeitos Erro t (16) p
Média das
interações 4,2917 0,0328 130,8101 0,000000
Tempo (1) 1,0667 0,0656 16,2560 0,000000
Temperatura (2) 0,5833 0,0656 8,8900 0,000000
Concentração
(3) -0,1667 0,0656 -2,5400 0,021840
1*2 -0,0333 0,0656 -0,5080 0,061838
1*3 -0,7500 0,0656 -11,4300 0,000000
2*3 -0,1333 0,0656 -2,0320 0,059101
1*2*3 -0,4167 0,0656 -6,3500 0,000010
Nota-se que tanto o aumento do tempo de reação como da temperatura
exercem uma influência positiva na síntese, contribuindo para um maior
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Dissertação de Mestrado
41
rendimento quântico. Por outro lado, o aumento da concentração inicial dos
reagentes leva a uma diminuição do rendimento quântico. É interessante notar
também que os efeitos das interações de segunda ordem
(temperatura/concentração e tempo/temperatura) não são significativos, visto
que o valor de p calculado é maior do que o nível de significância 0,05. Além
disso, as interações tempo/concentração e tempo/temperatura/concentração
apresentam efeito negativo, evidenciando que o aumento da concentração
inicial dos reagentes contribui para a diminuição do rendimento quântico,
mesmo quando combinada com outro parâmetro.
Desta forma, é possível observar a condição otimizada de síntese
através de um gráfico contendo a superfície de resposta, no caso o rendimento
quântico, em função dos parâmetros de síntese (Figura 19).
Figura 19 – Superfície de resposta para otimização das condições de síntese.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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42
Observa-se que o máximo de rendimento quântico é obtido utilizando
um maior tempo de síntese (6 h) e maior temperatura (160ºC) em conjunto
com uma menor concentração inicial de reagentes (2% massa/volume).
4.1.4 Espectroscopia de UV-Vis
O espectro UV-Vis das amostras obtidas a partir da glicose pode ser
observado na Figura 20.
Figura 20 – Espectro UV-Vis das soluções de carbon dots (glicose como fonte de carbono)
diluídas em água deionizada em concentração de 0,1 mg.mL-1
.
Observa-se que em todos os espectros há a presença de uma banda
intensa na faixa entre 260 e 280 nm, característica de transições π-π*, típica de
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43
ligação C=C de aromáticos. Além disso, algumas amostras apresentam um
ombro em 340 nm característico de transições n-π*, típica de ligações C=O. A
observação destas duas bandas é um forte indicativo da formação dos carbon
dots43; 67; 68
.
4.1.5 Espectroscopia de Infravermelho
Os espectros de infravermelho obtidos para as diferentes amostras
apresentam grande similaridade, porém são muito diferentes do material de
partida, indicando a formação dos carbon dots. O espectro infravermelho de
carboidratos é muito complexo e de difícil interpretação, pois abaixo da região
de 1500 cm-1
há uma série de modos vibracionais das ligações C-H e C-O, que
são característicos do carboidrato em questão69; 70
. A Figura 21 apresenta o
espectro de infravermelho da glicose.
Figura 21 – Espectro de infravermelho da glicose em pastilha de KBr.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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44
Além das bandas características abaixo de 1500 cm-1
, é possível
observar a presença de uma banda larga e intensa próximo de 3400 cm-1
referente ao estiramento da ligação O-H, além de bandas estreitas e de baixa
intensidade em 2949, 2915 e 2892 cm-1
referentes aos diferentes modos de
estiramento dos grupos C-H, C-H2 e O-C-H70
.
A Figura 22 apresenta os espectros das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C
e Gli_D os quais apresentam praticamente bandas na mesma região espectral.
Figura 22 – Espectro de infravermelho das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C e Gli_D em
pastilha de KBr.
Em todas as amostras nota-se claramente uma banda estreita e intensa
em 1600 cm-1
característica da vibração da ligação C=C polarizada pela
vizinhança, corroborando as transições eletrônicas observadas na
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
45
espectroscopia UV-Vis36
. Observa-se uma banda em 2931 cm-1
característica
do estiramento da ligação C-H. Ainda, a grande hidrofilicidade e estabilidade
coloidal das partículas pode ser atribuídas a grupos funcionais presentes na
superfície do material, como evidenciado pela banda em 3415 cm-1
característica do estiramento da ligação –OH, a banda de carbonila (C=O) em
torno de 1770 cm-1
e a banda em 1415 cm-1
típica de estiramento do íon
carboxilato (–COO-)
24; 53.
O espectro das demais amostras – Gli_E, Gli_F, Gli_G e Gli_H – pode
ser visualizado na Figura 23.
Figura 23 – Espectro de infravermelho das amostra Gli_E, Gli_F, Gli_G e Gli_H em
pastilha de KBr.
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46
Observa-se que os espectros também são muito similares com os
espectros apresentados na Figura 22. A única diferença apreciável se dá na
ausência da banda em torno de 1770 cm-1
, característica do estiramento da
ligação C=O e na diminuição da banda em 1415 cm-1
referentes aos
estiramentos do íon carboxilato. Entretanto, as partículas continuam
apresentando alta solubilidade em meio aquoso e excelente estabilidade
coloidal, indicando a presença de grupos funcionais oxigenados em sua
superfície.
As diferenças observadas na Figura 23 nos ajudam a compreender o
motivo pelo qual as amostras Gli_E e Gli_G apresentam os maiores
rendimentos quânticos observados. Carbon dots submetidos a um tratamento
oxidante com permanganato de potássio (KMnO4), um agente oxidante que
converte grupos hidroxila em grupos carboxílicos e/ou carbonilas, tiveram sua
fluorescência suprimida71; 72
. Além disso, o caráter doador de elétrons dos
grupamentos hidroxila pode contribuir para o aumento da fluorescência73; 74
.
Ou seja, as condições de síntese nestas amostras podem ter favorecido a
conversão de grupos carboxílicos e carbonila em grupamentos hidroxila.
Ainda assim, as amostras Gli_F e Gli_H apresentaram um baixo
rendimento quântico. Apesar de não ter sido identificada a presença de grupos
carbonilas nestas amostras através da espectroscopia de infravermelho, é
necessária a utilização de uma técnica que seja mais quantitativa para
determinar com rigor a presença de diferentes grupos funcionais nos carbon
dots, como a espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-X (XPS).
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47
4.2 Obtenção dos Carbon Dots a Partir de Pectina
Com a intenção de verificar se o protocolo de síntese obtido é de fato
robusto e válido para outras fontes de carbono, utilizou-se a condição de
síntese otimizada (8 h de síntese, 160ºC e concentração de 2% em massa de
fonte de carbono) para a obtenção de carbon dots a partir de pectina. A pectina
é um carboidrato muito mais complexo do que a glicose. É um polissacarídeo
muito abundante e um dos principais resíduos da indústria de suco de frutas
cítricas, correspondendo a até 42,5% da massa do resíduo sólido gerado por
este tipo de indústria75
.
Após o tratamento hidrotérmico, obteve-se uma solução marrom, a
qual foi purificada segundo o mesmo protocolo utilizado para os carbon dots
obtidos a partir de glicose. Após a purificação, obteve-se uma solução
marrom/amarelada, a qual foi nomeada CdotPec.
As imagens de microscopia eletrônica de transmissão confirmam a
obtenção das partículas, conforme pode ser visualizado na a seguir:
Figura 24 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra CdotPec,
juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho das partículas.
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48
A distribuição do tamanho de partículas foi realizado com o auxílio do
software ImageJ, contabilizando-se 150 partículas. Observa-se a formação de
partículas com formato aproximadamente esférico, sem a presença de
aglomerados, com tamanho médio de 8,4 ± 2,4 nm. Entretanto, a distribuição
de tamanhos é larga, sendo possível encontrar partículas com tamanho
variando de 4 a 16 nm.
Uma solução diluída em água deionizada da amostra foi levada ao
espectrofluorímetro e novamente observou-se uma fluorescência azul (Figura
25).
Figura 25 – Espectro de fluorescência da amostra CdotPec mostrando que a emissão em
430 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra
iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
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49
O espectro de excitação dos CdotPec é similar ao dos carbon dots
obtidos da glicose com máximo em 360 nm. Por outro lado, observa-se que o
máximo de emissão se dá em 430 nm, ou seja, houve um deslocamento para o
azul (blue-shift) em relação aos carbon dots de glicose. Novamente, observa-
se que a fluorescência não obedece a Equação 03. Segundo esta equação,
partículas grandes deveriam apresentar um red-shift na fluorescência.
Entretanto, os CdotPec apresentam um dos maiores tamanho médio
observados (8,4 ± 2,4 nm) e emitem no menor comprimento de onda (430 nm)
entre as amostras estudadas. Isso é um indicativo de que a origem da
fluorescência nos carbon dots é muito complexa e pode ser influenciada por
vários fatores.
Além disso, como pode ser observado na Figura 25, a emissão é
independente do comprimento de onda de excitação do material. Isso pode ser
um indicativo que os grupos funcionais presentes na superfície das partículas
sejam mais homogêneos, fazendo com que a emissão ocorra com um
comprimento de onda fixo. Esta homogeneidade é corroborada pelo menor
valor da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão, os quais são,
respectivamente, de 55 e 73 nm.
É interessante destacar que os carbon dots obtidos a partir de pectina
são inéditos, haja vista que não há reportado na literatura a obtenção de
carbon dots utilizando tal fonte de carbono.
O rendimento quântico dos CdotPec foi determinado em 3,6 ± 0,2%, o
qual é próximo ao valor encontrado para os carbon dots de glicose. As
similaridades observadas nos carbon dots obtidos por diferentes fontes de
carbono (glicose e pectina) pode ser compreendida pelo fato dos materiais
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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50
pertencerem à mesma classe química: carboidratos. A diferente complexidade
de cada um – glicose, um monossacarídeo, e pectina, um polissacarídeo –
parece não influenciar no produto final, fazendo com o comportamento dos
diferentes materiais sejam bastante similares.
O espectro UV-Vis da amostra CdotPec também corrobora a formação
dos carbon dots, conforme observado na Figura 26:
Figura 26 – Espectro UV-Vis da solução de CdotPec diluída em água deionizada na
concentração de 0,1 mg.mL-1
.
Observa-se um pico intenso em 280 nm referente a transições π-π* de
compostos aromáticos e um ombro em torno de 340 nm característico de
transições n-π* de ligação C=O.
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51
O espectro de infravermelho dos CdotPec e da pectina também são
muito distintos, corroborando a formação das nanopartículas, conforme pode
ser observado na Figura 27.
Figura 27 – Espectro de infravermelho da amostra CdotPec e do precursor pectina em
pastilha de KBr.
Novamente observa-se uma banda em 1625 cm-1
característica de
dupla ligação entre carbonos quando polarizadas pela vizinhança e uma banda
em 3440 cm-1
característica de estiramento da ligação –OH. Nota-se também a
ausência de bandas de carbonila e íons carboxilato, as quais estavam presentes
para algumas amostras dos carbon dots de glicose. Ainda assim, apesar da
menor quantidade de grupos funcionais oxigenados na superfície, os CdotPec
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
52
também apresentam boa estabilidade coloidal e elevada solubilidade em água.
4.3 Obtenção de Carbon Dots Contendo Nitrogênio
Com o auxílio do planejamento fatorial foi possível determinar as
condições de síntese que levam a obtenção de carbon dots com elevado
rendimento quântico. Entretanto, mesmo com as condições otimizadas, o
maior rendimento quântico obtido é relativamente baixo (5,8%) se comparado
com os tradicionais quantum dots inorgânicos. Desta maneira, algumas
estratégias são utilizadas para aumentar o rendimento quântico dos carbon
dots, destacando-se o tratamento ácido da superfície do material39; 76
,
passivação com polietilenoglicol12; 21; 68
e incorporação de outros elementos na
estrutura do material. Entre estes elementos, já foram reportados na literatura a
utilização de boro77
, nitrogênio26; 56; 78
, enxofre79; 80
e fósforo81; 82
.
A vantagem de incorporar outros elementos na estrutura do material se
dá pelo fato de, geralmente, não ser necessário aumentar o número de etapas
de síntese e a possibilidade de modificar o comprimento de onda no qual
ocorre a fluorescência56; 82
. Considerando estes aspectos, carbon dots foram
sintetizados na mesma condição da amostra Gli_E (8 h, 160ºC e 2% em massa
de glicose), utilizando-se glicose como fonte de carbono e adicionando-se 3
mL de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (TTDDA), cuja estrutura está
representada na Figura 28, o qual é uma conhecida e utilizada fonte de
nitrogênio para a síntese de carbon dots modificados51; 71; 83
. Esta quantidade
de TTDDA adicionada equivale a uma proporção em mol de glicose:TTDDA
de 1:2.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
53
Figura 28 – Estrutula molecular do reagente 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina
(TTDDA).
O mesmo protocolo de síntese e purificação foi utilizado para a síntese
dos carbon dots contendo nitrogênio, os quais serão denominados
Gli_E_TTDDA. Após todos os tratamentos, obteve-se uma solução
marrom/amarelada. A análise por microscopia eletrônica de transmissão
confirma a obtenção das partículas, conforme evidencia a Figura 29, as quais
apresentam tamanho médio de 4,6 ± 1,0 nm, com a presença de alguns
aglomerados, os quais não foram observados na amostra Gli_E.
Figura 29 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra Gli_E_TTDDA,
juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho das partículas.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
54
A amostra Gli_E_TTDDA também apresenta fluorescência azul, com
excitação no ultravioleta próximo. O máximo de excitação ocorre em 350 nm
e o máximo de emissão em 445 nm. O valor é muito próximo ao encontrado
para a amostra Gli_E, indicando que a incorporação de nitrogênio na estrutura
não altera o perfil de fluorescência do material. Novamente observa-se que a
emissão é dependente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.
Isso é esperado, visto que a amostra apresenta uma distribuição larga de
tamanho, com partículas variando de 2 a 7 nm. Além disso, espera-se que haja
diferentes traps de energia na superfície do material, que são excitados com
diferentes valores de energia e, consequentemente, emitem em diferentes
comprimentos de onda.
Figura 30 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E_TTDDA mostrando que a emissão
em 445 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra
iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
55
A observação da Figura 30 permite destacar que há outro máximo no
espectro de excitação em 295 nm, porém não há emissão apreciável quando a
amostra é excitada com este comprimento de onda. Fazendo a deconvolução
da curva de excitação, é possível observar que a largura à meia altura da banda
é de 95 nm e a largura à meia altura da banda de emissão é de 103 nm. Estes
valores elevados corroboram a hipótese de que a fluorescência é afetada pela
larga distribuição de tamanho das partículas e pela presença de diferentes
traps de energia na estrutura do material66
.
A incorporação de nitrogênio no material não causou mudanças
significativas nos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão do
material, porém observou-se um substancial aumento no rendimento quântico.
O valor determinado em triplicata foi de 13,2 ± 0,2%, o que corresponde a um
aumento de 2,3 vezes em relação à amostra Gli_E, a qual apresentou um
rendimento quântico de 5,8%.
O espectro de infravermelho da amostra Gli_E_TTDDA comprova a
incorporação de nitrogênio na estrutura do material, como pode ser
visualizado na Figura 31.
Observa-se uma banda larga e intensa em torno de 3400 cm-1
,
característica do estiramento da ligação –OH e uma banda intensa e estreita
em 1600 cm-1
, característica da ligação C=C polarizada pela vizinhança. É
interessante destacar que esta banda em 1600 cm-1
está sobreposta por outra
banda muito intensa e estreita em 1636 cm-1
referente ao modo de deformação
da ligação N-H55
. Além desta banda, outra banda bem estreita em 1350 cm-1
referente ao estiramento da ligação C-N78
e a banda estreita e intensa em 1115
cm-1
, característica do estiramento da ligação C-NH-C84
, confirmam a
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
56
incorporação de nitrogênio na estrutura do carbon dots.
Figura 31– Espectro de infravermelho das amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA em pastilha de
KBr.
O espectro UV-Vis da amostra Gli_E_TTDDA é apresentado na
Figura 32. Assim como a amostra Gli_E, a amostra Gli_E_TTDDA apresenta
uma banda em 280 nm característica de transições π-π* de ligações C=C de
compostos aromáticos e um ombro em 340 nm, referente à transições
eletrônicas do tipo n-π* de ligação C=O.
É interessante notar que as bandas não estão bem definidas,
possivelmente graças à presença de transições de grupos nitrogenados, os
quais também absorvem no ultravioleta, causando a sobreposição das bandas
observadas85
.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
57
Figura 32 – Espectro UV-Vis da solução de Gli_E_TTDDA diluída em água deionizada na
concentração de 0,1 mg.mL-1
.
A influência do nitrogênio não é bem compreendida no aumento do
rendimento quântico dos carbon dots. Acredita-se que sua presença contribui
para a formação de defeitos e traps de energia que irão contribuir de maneira
cooperativa com o efeito de confinamento quântico para o aumento do
rendimento quântico do material78; 86
. Desta maneira, nota-se que a
incorporação de nitrogênio na estrutura dos carbon dots pode ser considerada
benéfica para a obtenção de partículas com maior fluorescência.
4.4 Aplicações Biológicas
Considerando a aplicação potencial dos carbon dots como sondas
fluorescentes para bioimagem celular37; 56; 57; 83; 87
, foram realizados ensaios
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
58
hemolíticos e testes de internalização celular, para garantir que os carbon dots
obtidos apresentam capacidade de utilização in vivo.
4.4.1 Ensaios Hemolíticos
As amostra Gli_E e Gli_E_TTDDA foram submetidas aos ensaios
hemolíticos pelo fato de apresentarem os maiores valores de rendimento
quântico entre as amostras obtidas. Estes ensaios são importantes para garantir
que o material não causa danos significativos às hemácias e, desta maneira,
possam apresentar potencial utilização em aplicações intravenosas.
Ambas as amostras não apresentaram hemólise. O rompimento das
hemácias provoca a liberação da hemoglobina na solução, o qual apresenta um
máximo de absorção em 540 nm. Entretanto, a leitura em triplicata da
absorbância em 540 nm foi nula em todas as concentrações testadas,
evidenciando que não houve hemólise provocada pelos carbon dots.
Tabela 6 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da amostra Gli_E em
diferentes concentrações.
Concentração
(mg.mL-1
)
Absorbância
(540 nm)
Concentração
(mg.mL-1
)
Absorbância
(540 nm)
C+ 0,4 0,375 0,0
C- 0,0 0,750 0,0
0,015 0,0 1,500 0,0
0,075 0,0 3,750 0,0
0,150 0,0
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
59
Na Tabela 6 a concentração C+ é o controle positivo no qual ocorre
100% de hemólise (hemácias em solução hipotônica – água deionizada) e a
concentração C- é o controle negativo no qual não ocorre hemólise (hemácias
em tampão DPBS – tampão fosfato-salino). Desta maneira, nota-se que houve
0% de hemólise em todas as concentrações testadas, as quais são
concentrações muito elevadas considerando quaisquer ensaios biológicos. A
observação visual das soluções centrifugadas também permite confirmar que
não houve hemólise, conforme a Figura 33.
Figura 33 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra Gli_E diluídas
em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico.
Observa-se que em todas as soluções houve a formação de um
precipitado de hemácias no fundo dos tubos e não houve alteração na
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
60
coloração das soluções, assim como ocorre no controle negativo.
O mesmo comportamento foi observado na amostra Gli_E_TTDDA,
conforme pode ser observado na Tabela 7.
Tabela 7 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da amostra
Gli_E_TTDDA em diferentes concentrações.
Concentração
(mg.mL-1
)
Absorbância
(540 nm)
Concentração
(mg.mL-1
)
Absorbância
(540 nm)
C+ 0,8 0,375 0,0
C- 0,0 0,750 0,0
0,015 0,0 1,500 0,0
0,075 0,0 3,750 0,0
0,150 0,0
Novamente observa-se que houve 0% de hemólise em todas as
concentrações testadas. Dado confirmado pela observação visual das soluções
centrifugadas, conforme observado a seguir:
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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61
Figura 34 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra Gli_E_TTDDA
diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico.
Observa-se que todas as soluções mantiveram o mesmo aspecto do
controle negativo, com a formação de um precipitado de hemácias e sem
alteração de coloração das soluções. Ou seja, em todas as concentrações
testadas, não foi observada hemólise.
Este resultado concorda com o fato da literatura apresentar os carbon
dots como sistemas de baixa toxicidade. Além da baixa toxicidade, foi
reportado na literatura a internalização dos carbon dots pelas hemácias,
indicando que o material tem uma capacidade praticamente nula de destruir
este tipo de célula88
.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
62
4.4.2 Internalização Celular
A fluorescência apresentada pelos carbon dots, aliada a sua baixa
toxicidade celular, fazem deste material um promissor agente de imagem para
marcador celular. Partindo-se desta premissa, ensaios de internalização foram
realizados como “prova de conceito”, avaliando a internalização dos carbon
dots em células HeLa, uma linhagem de células muito utilizado como modelo
para estudos de internalização22; 37
.
Os testes foram realizados com as amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA,
as quais apresentaram excelente comportamento frente aos ensaios
hemolíticos, reforçando seu potencial de utilização in vivo. A internalização
foi avaliada com o auxílio da microscopia confocal, entretanto só era possível
realizar a excitação em 405 nm, valor fora do máximo de excitação das
amostras. Ainda assim, as amostras apresentam fluorescência quando
excitadas neste comprimento de onda, porém a emissão ocorre em 500 nm,
conforme pode ser observado no Anexo A. Ou seja, com a excitação em 405
nm, observa-se que as amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA emitem uma
fluorescência verde.
Conforme pode ser observado na Figura 35, não há comprovação da
internalização da amostra Gli_E. Uma vez que a excitação ocorreu fora da
região máxima da amostra, não é possível afirmar com segurança se houve ou
não internalização ou se não foi possível detectar sua fluorescência. É
interessante relembrar que o rendimento quântico da amostra Gli_E é
relativamente baixo e foi determinado com excitação em 360 nm. Ou seja,
fora do comprimento de onda máximo de excitação, o rendimento quântico
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
63
será ainda menor.
Figura 35 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com a amostra
Gli_E em um concentração de 100 µg.mL-1
, com excitação em 405 nm.
Além disso, a amostra Gli_E não foi funcionalizada com nenhuma
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Dissertação de Mestrado
64
molécula que conferisse especificidade para a internalização das
nanopartículas pelas células HeLa. Por estas razões não é possível afirmar
categoricamente se houve internalização ou se a fluorescência não foi
detectada pela microscopia confocal.
Por outro lado, quando observamos as células HeLa incubadas com a
amostra Gli_E_TTDDA na Figura 36, notamos pequenas regiões dentro das
células emitindo uma fluorescência verde. Considerando que a amostra
Gli_E_TTDDA emite fluorescência verde quando excitada em 405 nm,
garante-se que houve a internalização do material.
O corante WGA-594 é um marcador para a membrana plasmática das
células HeLa, delimitando a extensão da célula. A sobreposição das imagens
(merge) de excitação da amostra Gli_E_TTDDA e do corante WGA-594
evidencia que as partículas estão no interior das células, comprovando a
internalização. Sendo assim, observa-se que a amostra Gli_E_TTDDA
apresenta grande potencial para ser utilizado como marcador celular, visto que
sua internalização foi observada mesmo sem a funcionalização do material,
fato que pode aumentar sua capacidade de marcação celular.
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
Dissertação de Mestrado
65
Figura 36 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com a amostra
Gli_E_TTDDA em um concentração de 100 µg.mL-1
, com excitação em 405 nm.
Entretanto, mesmo com a confirmação da internalização, há a
necessidade de se realizar ensaios com marcadores específicos de organelas
para compreender melhor quais delas participam no processo de internalização
e compreender melhor o processo de internalização celular como um todo.
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66
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67
5 Conclusões
Foi possível por meio de um planejamento fatorial elaborar um
protocolo de síntese robusto, que permite a obtenção de carbon dots utilizando
diferentes fontes de carbono. Nas condições de síntese otimizadas, carbon
dots obtidos a partir de glicose (amostra Gli_E) apresentaram um rendimento
quântico de 5,8% e tamanho médio de 4,1 nm. Carbon dots sintetizados a
partir de pectina (CdotPec) apresentam rendimento quântico de 3,6% e
tamanho médio de 8,4 nm. Ambas nanopartículas apresentaram fluorescência
azul, com um pequeno deslocamento no máximo de emissão.
Com o intuito de se obter nanopartículas com maior rendimento
quântico, carbon dots foram sintetizados com a incorporação de nitrogênio na
sua estrutura (Gli_E_TTDDA). O rendimento quântico foi elevado para
13,2%, um aumento de aproximadamente 2,5 vezes com relação aos carbon
dots sem a incorporação de nitrogênio. O perfil de fluorescência não foi
modificado, com excitação no ultravioleta próximo e emissão no azul. O
tamanho médio das partículas foi de 4,6 nm.
Vale ressaltar que com as técnicas de caracterização utilizadas –
espectroscopia de infravermelho, espectroscopia UV-Vis, fluorescência e
microscopia eletrônica de transmissão – não foi possível determinar a origem
da fluorescência das nanopartículas. Considerando as explicações descritas na
literatura, acredita-se que haja um efeito cooperativo entre traps de energia na
superfície dos carbon dots e efeito de confinamento quântico nas
nanopartículas que levam a fluorescência do material, porém não permitem a
previsão do seu perfil de fluorescência. Além disso, este efeito cooperativo
Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas
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68
nos ajuda a compreender o motivo das bandas de emissão e excitação serem
alargadas, além do comprimento de onda máximo de emissão ser dependente
do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.
Por fim, para garantir a potencial aplicação in vivo do material como
agente de imagem, testes hemolíticos mostraram que as amostras Gli_E e
Gli_E_TTDDA não causam hemólise. Além disso, comprovou-se que a
amostra Gli_E_TTDDA é internalizada por células HeLa, uma linhagem de
células amplamente utilizada como modelo para ensaios de internalização,
comprovando a capacidade das nanopartículas serem utilizadas como agente
de imagem.
É interessante observar que a amostra foi internalizada mesmo sem ser
funcionalizada com alguma molécula que confere especificidade para a
internalização e não é tóxica, haja vista que não apresentou hemólise. Ou seja,
o material obtido apresenta grande potencial para aplicações in vivo como
agente de imagem para determinadas linhagens de células.
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69
6 Perspectivas
O estabelecimento de uma rota de síntese robusta, que permite a
obtenção de carbon dots a partir de diversas fontes de carbono é emblemático,
de alto impacto e elevada importância. Todavia, este trabalho – pioneiro na
ciência brasileira – abre novas e amplas perspectivas de pesquisas.
A origem da fluorescência dos carbon dots ainda é um desafio para
toda a comunidade científica. A compreensão deste fenômeno pode tornar
possível a modulação da fluorescência do material, assim como é observado
nos tradicionais quantum dots inorgânicos. Para tanto, técnicas mais
complexas de caracterização – espectroscopia de fotoelétrons de raios-X
(XPS), ressonância magnética de carbono 13 (RMN-C13
), espectrometria de
massas, entre outras – aliada a cálculos teóricos, podem trazer resultados
promissores. Uma extensiva caracterização estrutural de um material tão
pequeno e complexo também é um desafio, na qual a microscopia eletrônica
de transmissão de alta resolução pode contribuir com informações relevantes.
A incorporação de outros elementos além do nitrogênio na estrutura do
material pode levar a carbon dots com maior rendimento quântico e com
diferentes faixas espectrais de emissão e excitação.
A abundância de grupos funcionais oxigenados na superfície dos
carbon dots abre a possibilidade de funcionalização com moléculas que
confiram especificidade para o material atuar como marcador específico para
determinados grupos celulares. Além disso, é necessária uma investigação
mais refinada sobre o processo de internalização dos carbon dots, avaliando
quais organelas atuam ativamente neste processo.
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70
Ensaios de genotoxicidade também são de grande relevância para
ampliar e concretizar a potencial aplicação in vivo dos carbon dots.
Sendo assim, nota-se que este trabalho inovador e pioneiro abre novas
possibilidades em várias áreas da química e da biologia. Efetivamente, os
estudos realizados são de grande importância, abrindo as portas e
estabelecendo uma nova plataforma de pesquisa, na qual, certamente, ainda
existem muitas e relevantes perguntas a serem respondidas.
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Dissertação de Mestrado
79
Anexo A
Figura 37 – Espectro de emissão da amostra Gli_E diluída em tampão PBS na concentração
de 0,5 mg.mL-1, com excitação em 405 nm.
Figura 38 – Espectro de emissão da amostra Gli_E_TTDDA diluída em tampão PBS na
concentração de 0,2 mg.mL-1, com excitação em 405 nm.