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oxicologie Analytique & Clinique (2014) 26, 32—38

Disponible en ligne sur

ScienceDirectwww.sciencedirect.com

RTICLE ORIGINAL

tude de la stabilité de sept benzodiazépines, de laéthadone et du zolpidem dans des taches de sang

tability of seven benzodiazepines together with zolpidem and methadone inloodstains

Carole Jamey ∗, Antoine Tracqui, Bertrand Ludes,Jean-Sébastien Raul

Laboratoire de toxicologie, institut de médecine légale, 11, rue Humann, 67000 Strasbourg,France

Disponible sur Internet le 5 mars 2014

MOTS CLÉSStabilité ;Taches de sang ;Benzodiazépines

RésuméObjectif. — Étudier la stabilité de sept benzodiazépines (alprazolam, bromazépam, clobazam,clonazépam, diazépam, tétrazépam et triazolam), de la méthadone et du zolpidem dans destaches de sang en vue d’un recueil sur les scènes de crime.Méthode. — Des gouttes de 50 �L de sang surchargé à 10 ng/mL sont déposées sur des lames enverre puis conservées selon différentes durées (24 heures, 48 heures, 72 heures, une semaineet un mois) et conditions environnementales (lumière et obscurité à température ambiante,(−) 20 ◦C, (+) 4 ◦C, (+) 35 ◦C et extérieur). Le sang séché est ensuite prélevé avec une lame descalpel, pesé puis réhydraté pendant une demi-heure avec un tampon pH 9,5. Une extractionen phase liquide est réalisée puis l’analyse est effectuée par UPLC-MS/MS. En parallèle, le sangséché est prélevé à l’aide d’écouvillons préalablement imprégnés de sérum physiologique, puistraité comme le sang pesé.Résultats. — Les molécules testées sont stables aussi bien par pesée que par écouvillonnage,excepté pour le clonazépam à (−) 20 ◦C et à l’extérieur. Après un mois d’exposition, pour

l’ensemble des analytes des pertes au-delà de 50 % peuvent également être constatées à (+)35 ◦C et dans les conditions extrêmes.Conclusion. — Cette étude permet de démontrer la stabilité des sept benzodiazépines, de la méthadone et du zolpidem dans des gouttes de sang séché sans influence majeure de la duréed’exposition et des conditions environnementales. Au vu des résultats, une nouvelle approche

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : c.jam@laposte.net (C. Jamey).

http://dx.doi.org/10.1016/j.toxac.2014.02.007352-0078/© 2014 Société Francaise de Toxicologie Analytique. Publié par Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Stabilité de benzodiazépines, méthadone et zolpidem dans des taches de sang 33

analytique pourrait être envisagée, en l’espèce l’analyse toxicologique des taches de sang surune scène de crime.© 2014 Société Française de Toxicologie Analytique. Publié par Elsevier Masson SAS. Tousdroits réservés.

KEYWORDSStability;Bloodstains;benzodiazepines

SummaryObjective. — Studying stability of seven benzodiazepines (alprazolam, bromazepam, clobazam,clonazepam, diazepam, tetrazepam and triazolam) together with methadone and zolpidem inbloodstains for a sampling on crime scene.Methods. — Drops of 50 �L of blood overloaded with 10 ng/mL were deposited on glass slidesand stored under various conditions of time (24 h, 48 h, 72 h, one week and one month) andenvironments (light and darkness at room temperature, (−) 20 ◦C, (+) 4 ◦C, (+) 35 ◦C and out-side). Dried blood is then removed with a scalpel blade, weighed and rehydrated for 30 minwith a pH 9.5 buffer. A liquid phase extraction was carried out and analysis was performed byUPLC-MS/MS. In parallel, dried blood was collected using swabs, previously impregnated withsaline solution, then analyzed as previously described.Results. — The analytes tested were found stable as well as by scratching or swabbing, exceptedfor clonazepam (−) 20 ◦C and outside. After one month, losses up to 50% could be observed at(+) 35 ◦C and in outside conditions for all drugs analyzed.Conclusion. — This study shows the stability of seven benzodiazepines together with methadoneand zolpidem in dried blood spots with no major influence of exposure time and environmentalconditions. In view of results, a new analytical approach could be considered, e.g. toxicologicalanalysis of bloodstains on a crime scene.© 2014 Société Française de Toxicologie Analytique. Published by Elsevier Masson SAS. All

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rights reserved.

Introduction

L’étude des gouttes de sang séché (dried blood spot [DBS]) apris de plus en plus d’ampleur durant la décennie écoulée,représentant une alternative analytique utilisée notam-ment dans le domaine néonatal avec le dépistage destroubles métaboliques [1,2], dans les études pharmaco-toxicocinétiques [3,4], dans le suivi des concentrationsthérapeutiques de divers médicaments [5—7] ou encoredans le dépistage de substances illicites [8—10]. Cettetechnique présente de nombreux avantages par rapportà un échantillon de sang conventionnel, en particulierun faible volume de prélèvement (< 50 �L), des condi-tions de conservation et de transport simplifiées ainsiqu’un risque diminué d’infection par des agents pathogènes[11—13].

De plus, les avancées technologiques dans le domainede la spectrométrie de masse en tandem ont permis uneamélioration en matière de sensibilité et de spécificité favo-risant l’utilisation de plus en plus fréquente des DBS entoxicologie clinique mais également en toxicologie médico-légale où le volume d’échantillon sanguin est parfois trèsréduit [14—17]. Au vu des ces données, une autre approcheanalytique en toxicologie judiciaire pourrait être envisa-gée avec le recueil des traces de sang sur les scènes decrimes.

Les taches de sang figurent parmi les preuves maté-rielles les plus fréquemment rencontrées sur une scènede crime. L’individualisation du sang humain a été effec-tuée pendant des décennies en utilisant le système ABO

zder

t plus récemment le typage ADN. L’analyse toxicologiquees taches de sang pourrait être intéressante dans cer-aines situations, par exemple, la détermination du statutoxicologique de la victime au moment des faits, mêmei aucun cadavre n’est retrouvé sur les lieux du crime,ais également de l’auteur s’il a laissé des traces de sang

u niveau de la scène de crime. Par ailleurs, lorsque lesmpreintes génétiques ne peuvent être comparées à uneéférence, la détection de xénobiotiques dans une tache deang pourrait contribuer à l’identification de la victime oue l’auteur.

Habituellement, l’analyse par DBS repose sur un volumerémesuré de sang ou un matériau buvard normalisé. Dans laécouverte de sang sur une scène de crime, il s’agit d’uneatrice encore peu étudiée, sans conservateur et dans lalupart des cas sans réfrigération. Ces facteurs soulèventa question de la présence encore possible de moléculesans ce type de prélèvement mais également de leur sta-ilité.

Jusqu’à présent, les études de stabilité de diversesolécules, notamment les benzodiazépines, ont été réa-

isées à partir de sang total ou de supports DBS18—24]. Très peu de travaux ont été faits directementur des taches de sang [25—27]. Dans cette optique,ous avons étudié la stabilité de sept benzodiazépinesalprazolam, bromazépam, clobazam, clonazépam, dia-

épam, tétrazépam et triazolam), de la méthadone etu zolpidem dans du sang exposé à des conditionsnvironnementales et des périodes de temps diffé-entes.

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atériels et méthodes

ubstances et réactifs

es substances suivantes : alprazolam, bromazépam, clo-azam, clonazépam, diazépam, tétrazépam, triazolam,razépam, méthadone et zolpidem ont été obtenus à laoncentration de 1 mg/mL auprès de la société LipomedMundolsheim, France). L’acétonitrile (Lichrolsolv qualitéPLC), l’isopropanol, le n-heptane et le dichlorométhaneour analyse proviennent respectivement des sociétés MerckDarmstadt, Allemagne), VWR BDH Prolabo (Strasbourg,rance) et Carlo Erba (Rodano, Italie). Les sels de chloruree sodium, de chlorure d’ammonium et de formiate d’amm-nium ont été obtenu auprès de VWR BDH Prolabo (Stras-ourg, France), de Fisher Chemical (Illkirch, France) ete Fluka (groupe Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier,rance). L’acide formique et l’ammoniaque 28 % pro-iennent de VWR BDH Prolabo (Strasbourg, France). L’eauidistillée a été produite par un système MilliQ de chezillipore (Molsheim, France).

Une poche de sang total avec héparinate de lithium estournie par l’EFS (Établissement francais du sang, Stras-ourg, France). Elle a été testée négative pour les moléculesmpliquées dans cette étude de stabilité. La poche a étéliquotée puis conservée à (—) 20 ◦C jusqu’à utilisation.

tude de la stabilité

ne quantité de 40 mL de sang est surchargée avec les benzodiazépines, la méthadone et le zolpidem à laoncentration de 10 ng/mL. Ce taux représentant uneoncentration thérapeutique ou infrathérapeutique pour lesolécules testées. Des gouttes de 50 �L de ce sang sontéposées sur des lames en verre puis conservées à l’abrie la lumière à (−) 20 ◦C et à (+) 4 ◦C dans des chambresroides, à température ambiante et à (+) 35 ◦C dans unetuve. Elles sont également exposées à la lumière naturelle

température ambiante. Afin de reproduire des conditionse rapprochant de la réalité, des lames sont aussi dépo-ées à l’extérieur subissant ainsi les différentes variationslimatiques.

La stabilité des molécules a été étudiée sur des périodese 24 heures, 48 heures, 72 heures, une semaine et un mois’exposition. Pour avoir un résultat statistique cohérent,haque condition a été analysée dix fois. De plus, deuxonditions de recueil ont été étudiées. Le prélèvement paresée de la tache pour permettre une quantification desolécules et le prélèvement par écouvillonnage utilisé lalupart du temps sur la scène de crime.

xtraction

e sang séché est prélevé avec une lame de scalpel,esé puis réhydraté avec 0,5 mL de tampon de chlorure’ammonium (NH4Cl) à 28 %, pH 9,5. Il est alors conservé

l’abri de la lumière durant 45 minutes. Le sang réhydratést extrait par 3 mL d’un mélange dichlorométhane/n-

eptane/isopropanol (25/65/10 ; v/v) en présence de 2 nge prazépam utilisé comme standard interne. Après agita-ion puis centrifugation, la phase organique est évaporée

sec, à 45 ◦C, à l’aide d’un évaporateur-concentrateur.

spdé

C. Jamey et al.

’extrait sec est repris par 50 �L d’un mélange formiate’ammonium (NH4COOH) 5 mM, pH 3/acétonitrile (50/50 ;/v) et 10 �L sont injectés dans un système de chroma-ographie liquide ultra haute performance couplée à lapectrométrie de masse en tandem (UPLC/MS/MS).

En parallèle, le sang séché est prélevé à l’aide d’uncouvillon préalablement imprégné de sérum physiologique.a totalité de la tache est recueilli par frottement de’écouvillon sur la lame. La réhydratation se fait égale-ent avec 0,5 mL de tampon NH4Cl, pH 9,5. L’écouvillon

st ensuite soniqué durant 15 minutes puis placé une heure l’abri de la lumière. La suite de l’extraction est identique celle du sang pesé.

onditions analytiques

es analyses ont été réalisées selon la méthode dévelop-ée par Humbert et al. [28]. La partie chromatographiest constituée d’un système Acquity UPLC de chez WatersMA, États-Unis). L’élution est faite sur une colonne Waterscquity UPLC HSS C18 (2,1 × 150 mm ; 1,8 �m) avec un gra-ient d’acétonitrile dans un tampon NH4COOH 5 mM, pH 3.lle est maintenue à 45 ◦C et le débit est de 0,4 mL/min pourn temps d’analyse de 15 minutes.

La détection est réalisée sur un spectromètre de masseandem de type Quattro Premier Waters avec une ionisa-ion en mode positif et une acquisition en mode multipleeaction monitoring (MRM).

alidation de la méthode

a méthode a été validée avec les critères suivants : la limitee quantification ; la linéarité ; le rendement d’extraction ;a justesse ; la précision et l’effet matrice. Cette validation

été réalisée à partir de gouttes de sang placées 6 heures àempérature ambiante à l’abri de la lumière.

La linéarité a été déterminée avec dix niveaux deoncentration (0,2 — 0,5 — 1 — 2 — 5 — 10 — 20 — 50 — 100 et00 ng/mL). Les droites de calibration correspondent à uneégression linéaire estimée par la méthode des moindresarré et exprimée par le coefficient de corrélation R2.

La limite de quantification (LOQ) a été évaluée ennjectant des concentrations décroissantes des molécules

tester. Elle est définie comme étant la concentration lalus basse avec un rapport signal sur bruit de 10:1 et unoefficient de variation n’excédant pas 20 %.

Les rendements d’extraction ont été établis à 10 ng/mLn comparant les aires des pics de sang surchargé avantxtraction avec les aires des pics de sang surchargé aprèsxtraction.

Les précisions intra- et inter-séries ainsi que la justessee la méthode ont été testées en surchargeant le sang total

10 ng/mL (n = 6 ; 5 jours). La précision est exprimée avec leoefficient de variation (CV %) et la justesse correspond auourcentage de déviation entre la concentration théoriquet la concentration mesurée.

L’effet matrice a été évalué en utilisant la méthodeécrite par Matuszewski et al. [29]. Le sang blanc est extrait,

urchargé avec les analytes à la concentration de 10 ng/mLuis analysé (B). Les aires des pics sont comparées à celleses analytes injectés directement (A). L’effet matrice esttabli d’après la formule EM % = B/A × 100. Une valeur de

des t

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Stabilité de benzodiazépines, méthadone et zolpidem dans

100 % signifie qu’il n’y a aucun effet de la matrice, unevaleur inférieure à 100 % indique une suppression d’ions etune valeur supérieure à 100 % suggère une production d’ions.

En parallèle, une comparaison entre le sang frais et lesang séché a été effectué sur la linéarité et la limite dequantification à partir de gouttes de 50 �L.

Résultats

Validation de la méthode

Dans les conditions analytiques décrites et pour l’ensembledes composés, la méthode est linéaire de 1 ng/mL à200 ng/mL ce qui correspond à une gamme de 50 pg à10 000 pg/goutte de sang. Les coefficients de corrélationR2 sont supérieurs à 0,99. Les résultats obtenus sont simi-laires pour le sang liquide et le sang séché (Tableau 1).

Les LOQs sont comprises entre 0,2 ng/mL et 1 ng/mL cor-respondant à 10 pg et 50 pg/goutte de sang (Tableau 1).

Les rendements d’extraction sont compris entre 75 %et 91 % et aucun effet matrice majeur n’a été observé(Tableau 2).

La précision et la justesse intra- et inter-série de laméthode ont été déterminées en analysant des gouttes de

sang séché (n = 6) à la concentration de 10 ng/mL, sur unejournée et sur cinq jours consécutifs. Les résultats sontprésentés dans le Tableau 2. La précision intra-série estcomprise entre 9,8 % et 13,6 % avec une justesse de —7,5 % à

l(ls

Tableau 1 Limites de quantification et linéarités dans les gou

Composes LOQ (pg/goutte) Linéarité sang f

Alprazolam 10 10—10 000 (R2 =

Bromazépam 25 25—5000 (R2 =

Clobazam 10 10—10 000 (R2 =

Clonazépam 50 50—10 000 (R2 =

Diazépam 10 10—10 000 (R2 =

Tétrazépam 10 10—10 000 (R2 =

Triazolam 50 50—10 000 (R2 =

Méthadone 10 10—10 000 (R2 =

Zolpidem 10 10—10 000 (R2 =

Tableau 2 Paramètres de validation : précision, justesse, ren

Composés Rendement(n = 6)

Intra-série

(%) Précision (CV %) Justesse(biais %)

Alprazolam 83,4 10,3 −3,6

Bromazépam 78,3 11,8 −7,5

Clobazam 89,3 11,5 4,5

Clonazépam 75,3 13,6 3,7

Diazépam 81,2 10,9 −0,8

Tétrazépam 77,7 11,5 −3,9

Triazolam 80,2 12,9 3

Méthadone 90,4 9,8 4,6

Zolpidem 87,8 8,2 0,9

aches de sang 35

,6 % et la précision inter-série est inférieure à 17,2 % avecne justesse comprise entre —11,8 et 13,7 %.

tude de la stabilité

a stabilité des analytes a été déterminée sur une période’un mois à partir de six conditions différentes de conser-ations. Pour suivre l’évolution des molécules dans leemps, le sang séché a été pesé afin d’obtenir des résul-ats quantitatifs. Ces concentrations ont été comparées

la concentration initiale de 10 ng/mL correspondant à00 pg/goutte de sang. Au début de l’étude, la masse’une goutte de sang séché est de 9,5 mg ± 0,8 mg pour’ensemble des conditions. En comparaison, celle d’uneoutte de sang frais est de 49,7 mg ± 2,7 mg. Après un mois’exposition, la masse est de 9,4 mg ± 0,7 mg pour une expo-ition à (−) 20 ◦C, à (+) 4 ◦C et à température ambiantet de 7,6 mg ± 2,5 mg pour une exposition à (+) 35 ◦C et à’extérieur.

De plus, pour suivre les variations de l’exposition, deselevés quotidiens de températures ont été effectués. Lesariations sont faibles pour les enceintes thermostatées, de−) 22 ◦C à (−) 15 ◦C et de (+) 4 ◦C à (+) 6 ◦C pour les chambresroides à (−) 20 ◦C et à (+) 4 ◦C, de (+) 35 ◦C ± 2 ◦C poura conservation dans l’étuve. Elles sont plus élevées à la

umière naturelle et à l’obscurité. Elles sont comprises entre+) 16,9 ◦C et (+) 27,6 ◦C avec une moyenne de (+) 23,2 ◦C ;e soleil étant en exposition directe sur les lames déposéesur la paillasse et sur celles placées dans une armoire à

ttes de sang frais et de sang séché.

rais (pg/goutte) Linéarité sang séché (pg/goutte)

0,9986) 10—10 000 (R2 = 0,9983)0,9975) 25—5000 (R2 = 0,9950)0,9988) 10—10 000 (R2 = 0,9933)0,9959) 50—10 000 (R2 = 0,9934)0,9941) 10—10 000 (R2 = 0,9952)0,9972) 10—10 000 (R2 = 0,9941)0,9955) 50—10 000 (R2 = 0,9956)0,9957) 10—10 000 (R2 = 0,9971)0,9958) 10—10 000 (R2 = 0,9968)

dement d’extraction et effet matrice.

Inter-série Effet matrice(n = 6)

Précision (CV %) Justesse(biais %)

(%)

14,1 −7,2 98,515,7 −11,8 97,914,9 9,1 9817,2 13,7 96,412,3 −3,7 101,214,9 −8,7 99,116,4 9,9 95,812,8 8,5 102,710,9 4,2 104,3

36 C. Jamey et al.

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igure 1. Diagrammes de stabilité des sept benzodiazépines, de

’abri de la lumière. Concernant l’environnement externe,es variations de température sont les plus importantes avecne minimale de (+) 2,3 ◦C et une maximale de (+) 38,7 ◦Cour une moyenne de (+) 22,8 ◦C. L’étude ayant été réaliséurant le mois de mars, les conditions climatiques ont étérès disparates.

La stabilité des molécules a été étudiée avec dixouttes de sang pour chaque condition de temps et’environnements. À partir des résultats obtenus, des dia-rammes ont été établis pour chaque molécule testée. Ilsont réalisés avec les concentrations moyennes estimées enonction du facteur « temps × environnement » (Fig. 1). Sura période étudiée, toutes les molécules ont été détectéesvec des variations plus ou moins importantes en fonction du

ieu d’expositions. Une estimation du pourcentage de perte

été calculée entre j0 et j+28 (Tableau 3). Il varie de 0 à 95 %elon la molécule et l’environnement. De plus, la diminu-ion de concentrations des analytes n’est pas linéaire entre

p3t(

Tableau 3 Pourcentage de perte entre j0 et j+28 dans les diff

Composés Obscurité

(−) 20 ◦C (+) 4 ◦C (+) 20

Alprazolam 2 0 0

Bromazépam 25 3 10

Clobazam 0 0 0

Clonazépam 90 25 0

Diazépam 0 0 0

Tétrazépam 20 30 15

Triazolam 20 20 10

Méthadone 10 0 0

Zolpidem 0 5 0

thadone et du zolpidem entre j0 et j+28.

0 et j+28. Concernant l’alprazolam, sur un mois le pour-entage de perte n’excède pas 10 % pour l’ensemble desonditions d’exposition. Cependant, entre un jour et septours la diminution de concentration peut atteindre 40 %our (+) 4 ◦C, (+) 35 ◦C, pour une exposition à la lumière etour l’extérieur. Dans la même période, des augmentationse 10 % à 40 % sont également constatées. Pour le broma-épam, le pourcentage de perte finale peut atteindre 60 %elon l’exposition. En 24 heures, une diminution de 40 à 60 %st notée pour (−) 20 ◦C, pour la température ambiante etour l’extérieur. Une augmentation progressive est ensuiteonstatée jusqu’au vingt-huitième jour pour atteindre uneerte finale de 10 à 25 %. Pour le clobazam, les concentra-ions sont relativement stables sur une semaine exceptée

◦

our (−) 20 C et l’extérieur où le taux peut atteindre0 % d’analytes en plus. Au bout d’un mois, une augmen-ation de 10 à 15 % de la concentration est relevée pour+) 4 ◦C et pour la température ambiante. Une perte de

érentes conditions d’expositions.

Lumière

◦C (+) 35 ◦C (+) 20 ◦C Extérieur

25 0 1050 10 6025 0 5065 65 9550 10 3565 0 7060 20 8040 0 2040 0 40

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Stabilité de benzodiazépines, méthadone et zolpidem dans

25 à 50 % est obtenu pour (+) 35 ◦C et l’extérieur. Concer-nant le clonazépam, en 24 heures le pourcentage de pertevarie entre 20 % et 95 %. La dégradation est ensuite pro-gressive pour l’ensemble des conditions exceptée pour laconservation à l’obscurité où aucune perte n’est constatéeen fin d’étude. Les concentrations en diazépam sont stablespour des expositions à (−) 20 ◦C et à température ambiante.Quelques fluctuations sont contrastées à (+) 4 ◦C. À (+) 35 ◦C,la décroissance s’effectue par paliers pour attendre 50 %de la concentration originale. Un taux final de 65 % estobservé pour l’exposition à l’extérieur. Les concentrationssont stables pour le tétrazépam à l’exception de (+) 35 ◦C etl’extérieur où une diminution progressive s’effectue entrele deuxième et le troisième pour attendre une perte de70 % au vingt-huitième jour. Pour le triazolam, des variationssont constatées pour l’ensemble des conditions sur toute lapériode d’étude. Le pourcentage de perte est compris entre10 et 80 %. Les concentrations en méthadone sont relative-ment stables avec une diminution maximale de 40 % pour (+)35 ◦C. Enfin, peu de pertes sont observées pour le zolpidemexcepté pour (+) 35 ◦C et l’extérieur où 40 % sont relevées.

Les résultats des prélèvements par écouvillonnage sontsimilaires à ceux du sang pesé. Tous les analytes ont étédétectés à l’exception du clonazépam à (−) 20 ◦C et àl’extérieur. Les résultats sont purement qualitatifs. Les airesdes pics des molécules testées sont de deux à douze foismoins abondantes que celles du sang pesé. Par contre, ellessont toutes supérieures aux aires des LOQs déterminées dansle Tableau 1. Les variations de réponses des analytes en fonc-tion du temps et de l’environnement sont identiques à cellesdu sang pesé.

Discussion

Les résultats de cette étude ont montré une stabilité satis-faisante pour l’ensemble des composés testés, excepté pourle clonazépam à (−) 20 ◦C et à l’extérieur. Toutes les molé-cules ont été détectées après un mois d’exposition. Lesconditions les plus défavorables sont celles à (+) 35 ◦C etcelles à l’extérieur avec des pourcentages de perte compris,respectivement entre 25 % et 65 % et 10 % et 95 %. L’effet dela lumière n’est pas significatif car à température ambianteles concentrations sont 10 à 20 % plus élevées pour uneconservation à l’obscurité. De même, les résultats sont rela-tivement similaires entre (−) 20 ◦C ; (+) 4 ◦C et (+) 23 ◦C. Parailleurs, les variations de concentrations observées durantcette période sont aléatoires et sont indépendantes du lieuet du temps de conservation. Des hypothèses peuvent êtreémises pour expliquer ces fluctuations. Le support de dépôta pu interférer avec le sang et adsorber une partie desmolécules. Le choix s’est porté sur la lame de verre car unmatériau inerte et non poreux était nécessaire pour faci-liter le recueil des taches de sang et permettre ainsi uneanalyse quantitative. La déshydratation du sang a pu égale-ment intervenir dans ces variations car l’aspect des gouttesétait différent entre une exposition au froid et une expo-sition à une température supérieure à (+) 20 ◦C. Le sang

étant plus friable à température ambiante et à (+) 35 ◦C.De même, la faible concentration de 10 ng/mL peut être unfacteur déterminant dans la variation des diagrammes. Dansles différentes études de stabilité publiées [18,20—23], les

D

Lr

aches de sang 37

oncentrations des benzodiazépines sont comprises entre00 ng/mL et 10 000 ng/mL soit 20 à 1000 fois plus concen-rées que celle étudiée. Les résultats obtenus peuvent alorstre très différents. Pour le diazépam dans le sang totalt après un mois à (+) 4 ◦C, Skopp et al. [20] constatentne perte de 15 % pour une concentration de 5000 ng/mL ;tanasov et al. [23] de 40 % pour 300 ng/mL ; Alafzil et al.22] de 10 % pour 100 ng/DBS ; Pépin et al. [18] de 25 % pour0 000 ng/mL après deux mois et aucune perte pour notretude. De même pour le clonazépam, El Mahjoub et al. [21]bservent des diminutions sur un mois de 15 % à (−) 20 ◦C,e 35 % à (+) 4 ◦C et de 55 % à température ambiante pourne concentration de 250 ng/mL ; Pépin et al. [18] de 30 % à−) 20 ◦C, de 100 % à (+) 4 ◦C après un mois et de 100 % aprèsrois jours à (+) 25 ◦C alors que dans les taches de sang ellesont de 90 % à (−) 20 ◦C, 25 % à (+) 4 ◦C, de 0 % à l’obscuritét de 65 % à la lumière. Pour le bromazépam et le cloba-am, Skopp et al. [20] constatent des dégradations en unois de 40 % à (+) 4 ◦C pour des concentrations de l’ordree 200 ng/mL ; Pepin et al. [18] de 30 % à (−) 20 ◦C, de 35 %

(+) 4 ◦C et de 40 % à 70 % à (+) 25 ◦C en deux mois et pourotre étude de 25 % à (−) 20 ◦C ; inférieure à 5 % à (+) 4 ◦C ete 10 % à température ambiante. Concernant l’alprazolam,e tétrazépam, le triazolam et le zolpidem, Pépin et al. [18]bservent des pertes comprises entre 5 % et 95 % pour (−)0 ◦C, de 5 % à 85 % à (+) 4 ◦C et de 20 % à 98 % à (+) 25 ◦Cur une période de 2 mois alors que notre étude révèle desertes inférieures à 25 % à (−) 20 ◦C, inférieures à 30 % à+) 4 ◦C et inférieures à 20 % à température ambiante. Enfin,our la méthadone, Saracino et al. [30] décrivent une dégra-ation inférieure à 10 % à (+) 25 ◦C pour une concentratione 250 ng/mL et aucune dégradation pour notre étude.

Le prélèvement par écouvillonnage a montré égalementne très bonne stabilité des molécules même dans les condi-ions les plus extrêmes. La difficulté analytique réside dans’extraction des analytes avec ce type de support. En l’étatctuel et sous réserve d’étude à venir, la nature de la scènee crime obligera surtout à effectuer des prélèvements àartir d’écouvillon.

onclusion

ette étude démontre, malgré les variations observées, latabilité des molécules testées dans les différentes condi-ions pour de faibles concentrations et de faibles volumes’échantillons. Le recueil des traces de sang sur une scènee crime peut constituer une nouvelle approche analy-ique d’un point vu qualitatif. L’analyse toxicologique de ceype d’échantillon pourra apporter des informations intéres-antes sur l’influence d’une substance sur la victime ou sur’auteur au moment des faits. Elle pourra être complémen-aire de l’expertise génétique et de la morpho-analyse.

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

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emerciements

es auteurs remercient le Pr Nicolas Meyer, du laboratoiree biostatistique de la faculté de médecine de Strasbourg,our sa collaboration à cette étude.

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