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ETUDE. DES COMPOSES PHENOLIQUES DE NICOTIANA TABACUM VARIETE XANTHI,
AU COURS DE L' HTFEOTION A 20° C
PAR LE VIRUS DE LA lI10SAIQ,UE DU TABAC, SOUOHE OOIiIf1UNE.
-000-
Josette TLNGUY -(1968)-
-000-
l N T R 0 DUC T ION
Le travail effectué au cours de l'année précédente et
qui est résumé dans le rapport de 1967 a permis: d'identifierles phénols des feuilles de tabaœdes variétés XaQ!hi et §amsEffi,d'établir la distribution de ces substances dans les feuilles de
Ni~~iana_Xanth~, sain, végétatif, cultivé à 20 et 30° C, et desuivre les changements intervenant dans leur composition au mo~
ment de la floraison.
L'étude des composés phénoliques au cours de l'infec
tion virale à 20 et 30° C, dans des Nic2~a~~~~~~, à l'étatvégétatif, puis après floraison a "été abordée. Les variationssubies par les phénols après infection par le virus de la mo~
saïqu.e du tabac dans une variété totalement sensible au virus,ont été examinées, et exposées dans le rapport de l'an dernier.
Les résu~tats obtenus ont alors permis de tirer uncertain nombre de conclusions, en particulier que la formationde lésions locales nécrotiques chez lii~~~ian~~anthi se traduitpar une production importante de deux composés phénoliques(férulylglucose et scopoline), possédant chacun un groupementméthoxyle (0 CH3).
L'utilisation de nouveaux solvants chromatographiques,et l'aide apportée par J.B. HARBORI\1E, permettent cette année de
montrer que l'infection à 20° C du ~~~o~jan~~~thi à l'étatvégétatif, par le virus de la mosaique du tabac souche commune,s'accompagne de la production de férulvl-1 glucose de scopoline,
-------------~~---~--~~---~d'un certain nombre de ~~È~!~~9.~~ présentant entre elles desanalogies de structure, et, d'une importante accumulation d'acide
!~~~l1:~_~~!~~~~~·
- 2 -
Le travail est divis~ en~ois chapitres
Discussion, Expérimentation.
Résultats,
Le chapitre concernant les résultats comprend trois
parties: la première traite de l'identification des diff~rentes
combinaisons de l'acide f~rulique dans le ~~nthi virosé à 20° C,
la seconde donne les résu~tats des dosages des phénols totaux et
des principales substances, tandis ~ue les caractéristiques des
composés apparaissant après infection virale à 20° C du Nic?ti~
~thi son-c exposées dans le dernier paragraphe.
L'expérimentation ayant été décrite dans le rapport de1967, seuJ_es les nouvelles techniques utilisées, et les modifi
cations apportées à certaines manipulations sont données.
- 3 -
RES U L T ~ T S
l - J!lise en évidence dans le Nicotiana Xanthi virosé à. 20° Cd' un___ "_~'."_~_~-._~~__. -_._._._. _ •._ ." •__..__ ._.. .~ __._. ~ ~_.. _ ...~. • .•.~~~. ~_....J...._ ._._. __~
ester de l' aci.Q..§ fé:t:~iSLue et.dL~.Ji.lucose L_~~__Jte_ déxivif3de
l'acid..§.. guinigue ..
Il a été montré l'an dernier que Ilhypersensibilité du
Nicotiana Xanthi à l'égard du virus de la mosaique du tabac,
s'accompagnait en partic~ùier d'une accumulation de férulylglucose.
Les études récentes indiquent llexistence d1esters des
acides cinnamiques et de sucres et de dérivés de l'acide quinique.
Les caractéristiques chromatographiques et spectroBcopiques de
ces deux types de combinaisons sont voisines, ce qui explique
qu'elles aient été confondues.
Le butanol acétique et l'acide acétique dilué ne sépa
rant pas de façon satisfaisante les différents esters d'un m~me
acide cinnamique, le premier problème àrésoudre est de trouver
un ou plusieurs solvants capables de bien les séparer. Il devientet:
ensuite nécessaire d1isoler de purifier chaque produit, afin
d'étudier son spectre, sa résistance à l'hydrolyse acide et al
caline, et d'identifier les J.~ésidus phénoliques et non phénoliques
apparaissant dans les hydrolysats.
Les solvants utilisés en particulier le butanol ammo
niaque et le butanol ethanol, sont ceux proposés par Hl..RBORNE et
COffifER (13) .. Les dérivés des acides cinnamiques et du glucose
ont des Rf plus élevés que ceu~ des esters de l'acide quinique
dans le butanol aIilIDoniaque et le butanol éthanol, tandis que
c'est le contraire dans le butanol acétique. Ces différents compo
sés possédant une double liaison peuvent exister sous deux formes
isomères cis et trans, qui se transformen+' facilement l'unedans
- 4 -
l'autre, et sont séparées par chromatographie sur papier dans
l'acide acétique dilué.
Il est très difficile de comparer directement un Rfexpérimental aL~ valeurs signalées dans la littérature, étant
dOffi~é la difficulté d'obtenir des Rf reproductibles. Il devient
indispensable d'opérer sur chaque chromatogra~lille par comparaison
avec des produits de référence. Oonvùe la cajorité de ceux-ci ne
sont pas disponi"bles comm.ercialement, j.l est nécessaire de les
isoler de plantes où ils ont été signalés.
Les esters du glucose ont é-c;é identifiés par fT.1.1.RBOIDŒ
et CORI,ŒR (13), dans les feuilles de ~2P§llu?__~~ti~s, les pé
tales de J?é.t-lill:L2_hÈ_rJ..cla e-t d 'l~rLt.~rr.hJEL1ffi.. ~aius. Les acidesferD~ylquinique ont été mis en évidence dane les grains verts
de café par PIOTET et Bru.lmE~ŒERGER (16), et LENTrillR et DELTHERJ~GE
(14). CORSE et al (4) ont déterminé la structure du depside le
plus important, c'est-à-dire l'acide férulyl-3 quinique. L'acide
caféyl-4 quinique fut détecté pour la première fois dans les
grains verts de café par SONDHEI~illR (20), qui le désigna sous le
nom de bande "510". Sa struoture fut éluoidée par WAISS (26).L'acide p-oüumaryl quinique a été trouvé dans les pommes et les
poires par C1JRTWRIGHT et al (1). WILLIi~lS (27) a montré qu'il
existait deux isomères dont le plus important était de l'acide
p-ooumaryl-3 quinique, et que ce phénol était abondant dans les
pomnes vertes à cidre de la variété "YarliD-KiJ.2.D_Bj)_l".
Le p-coumaryl-1 glucose est alors isolé d'un extrait
de pétales d'L~t~~rp_~.ummajus, le férulyl-1 glucose et le
caféyl-1 glucose sont obtenus de ~yp_~~ hy~~~a, tandis que
l'acide p-coumaryl-3 quinique est ex-~rait de pornDles vertes à
cidre. C'est à partir de grains verts de café de la
variété ~o~s§t~ que les acides ferulyl-3 et caféyl-4 quiniquesont isolés et purifiés.
- 5 -
Le tableau l donne les caractéristiques chromatogra
phiques et spectroscopiques des dérivés des acides cinnamiques
détectés dans les tabacs vi~osés à 20° C.
Le tableau II représente les aglycones et les résidus
non phénoliques détectés apr~;s élution et hydrolyse des prin
cipaux spots.
L'infectJ_on zc 20° C d'lUl ~h.Qojîj_El.pa__Xlmthi par le virus
de la mosaique du tabac, fait appara1.tre pour l'acide férulique
deux type s d'esters : un ester du Glucose (fé..rJ1J..y.J::...t.&.ucose),un ester de l'acide quinique (,ê-..çJ_cte féruJ.ylguini_9.."Lh.eJ. L'acide
férulylquinique est en réalité un mélange de trois isomères
dont le plus important est l'~cid~~Xl-3 quiAiJL~ (voir tableau 1 et II).
li' "1 ~-<··~.·1 o;~/)V 0 <J'\/
on\1
O/C~.~(OCH3, r 1 1l-\0cl\w ;S r JI~Ia ~OH':\- : .
HO :OH•OH
~acid.v "~Vw..Bu~.3~..
La formation de lésions locales nécrotiques se traduit
donc par une production importante de férulyl-1 glucose. Ce
composé n'est jamais décelé dans des "cabacs sains ou virosés à
30° C. Le tabac inoculé par le virus de la mosaique et qui
séjourne à 20° C accumule l'acide p-coumaryl-3 quinique mais sur
tout les acides férulylquinique en particulier l'acide férulyl-3
quinique. Ces substances ne sont qu l à l'état de traces dans les
tabacs sains et disparaissent au moment de la généralisation duvirus dans la plante c l est-à-dire à 30° C.
- 6 -
Le l'Ii.9.o.tJ9.lla__t§.]J.~(J9!:~ variété Salll_s_~ totalemen-c sensible
au virus ne produit ni les acides férulylquiniQue ni le
fénuyJ 31ucose, quant à la jco~)oline son accumulation est nuindre
que dans la vari8té ;X:ap.th~.•
L!hypersensibilité slaccompagne également d'llile aug
mentation C'..08 acides cl:lorogénique (acide caféyl-3 quinique,
acide caféyl-4 qninique et acide caféyl-5 quinique), de la rutLYle
(rhanmogluc8side-·3 que:ccétine), et de la nicotiflorine
(rham...Yloglucos=Lcle-3 kaempférol).
Il devient alors indispensable de procéder à une
estimation CJ.uan-l;itative des composés phénoliques totaux., puis à
des dosages séparés des principales substances.
II - D'2.?aze. gl.g)_é3..l_.c:1§.ls._Ç.o.E1P_0_S~_;L.PJléA9Jl.tl-u.§_s_. __:g:..s_iJ..llla_tj.oYL...9-~nti.ta..t.}~
3!3_S_.Pl'ir;.9~~1)aJ~g G••ICL'llfl..ê t a'!::Lc.§..s_aJ2F_è..ê.-~é.l@L~ iOll_J2.aJ:'..cll.r~a:..tographie
s1fL: .P~~.P1.E3_Z: 0
Le Qosage utilise la grande oxydabilité des substances
phénoliqueso Le réactif employé est Q~ mélange de phosphomolybdate
et de tungstate de sodium, qui est réduit lors de l'oxydation des
phénols en milieu alcalin, ~n un mélange de bleus de tungstene
et de molybdène. La coloration produite (absorption maximum com
prise entre 725 et 750 p) est propo~tionr~elle au taux de composés
phénoliques. La composj.tion de ce réactif a été établie par FOLIN
et DENIS (8) y puis modifiÉB par FüLIN et CIOCl...LTEU (7).
La même méthode est a)pliquée aux composés séparés et
purifiés par chromatographie sur papier. Dans tous les cas, on
compare à t"-.Yle gamme étalon préparée dans les m~mes conditions lf'
l1urle dosage global des substances phénoliques, la cOlITbe étalon
est établie avec de l'acide chlorogénique (acide caféyl-3 quinique~
les résultats sont alors exprimés en mg d'acide chlorogénique$
:lf q-u-<- .Q... d04o.... 1N\.O~~ M 1 u-~..w- ",,~~.,t~
dL 1"'\P~ Je..- + "-"·
- 7 -
Les phénols dosés séparément sont les suivants
- acides chlorogénique (caféyl-3 quinique
caféyl-4 quinique
caféyl-5 quinique).
- acides férulylquiniQue (3 isomères).
- acide p-coumarylquinique.
- férGùyl-1 glucose.
- scopolinc (gluooside-7 scopolétine).
- ru-cine et nicotiflorine (rhalilll.oglucoside-3quercétine), (rhamnoglucose-3 kaempférol).
La scopoline (glucoside-7 scopolétine) ne possédant
aucun hydroxyle libre, ne réagit pas avec le réactif de FOLIN
CIOC':..L':r:~U. Il est alors nécessaire de romp:ce par hydrolyse
acide la liaison hétérosidique, afin de libérer la scopolétine
et de la doser.
L'hypersensibilité du Xan~h~ à l'égard du virus de la
mosaïque du tabac se traduit par une augmentation des composés
phénoliques totaux (tableaux: III, IV, V, VI, VII; figures
1, 2). L'accroissement est tr8s important lors des séjours
compris entre 60 et 120 heures. Ce phénomène diminue progres
sivement, et à partir d'un temps de 204 heures à 20° C, les
quantités en phénols totaux sont plus importantes dans les
plantes saines témoins que dans les tabacs infectés correspon
dants. Une chute en phénols totaux est éG'8.1emellt constatée
après une période de 24 heures 8 20° C a]Jr(~s inoculation de la
plante par le virus.
- 8 -
2 0) Acides__chloro~.nigue - Rutine et Nic_otifl.o,,!'j...E§..
a) Acides _cll_1_9ro.Kéni..g..lL~.
Les tabacs virosés séjournant à 20° C entre despériodes comprises entre 60 et 144 heures ont des teneurs en
acide chlorogénique beaucoup plus élevées que les tabacs sains
correspondants (tableaux VIII, IX ; figures: 3,4). A partir
d'un temps de 168 heures à 20° C, l'augmentation est moins
importante, et les mesures établies sur des tabacs de la variété
X~thi récoltés en Février 1968 ont montré que ces acides subis
saient une certaine diminution par rapport aux m~mes substances
contenues dans les plantes saines témoins. Une baisse est aussi
notée dans des Nicotian2 Xanth~ séjournant 24 heures à 20° C
après inoculation.
b) Ruti!l.e_ ~t l{icotiflorine_.
Comme le montre les résultats (tableaux ~ X, XI ; figures : 5,6), les courbes enregistrées avec la rutine et la
nicotiflorine sont similaires à celles établies pour les acides
chlorogénique. L'accumulation appara1t maximale dans des tabacs
nécrosés de la variété Xanthi ayant séjourné à 20° C entre les
périodes comprises entre 60 heures et 120 heures.
3°) Les.acides p-coumaryl et férulylguinigue.
Le Nicotiana Xanthi inoculé avec le virus de la mosaïque
du tabac réagit à 20° C en accumulant de l'acide p-coumarylquiniqueet surtout de l'acide férulylquinique (tableaux: XII, XIII,
XIV, XV ; figures: 7, 8, 9, 10). La production en acide
férulylquinique appara!t @tre maximale au cours d'un séjour
de 108 heures à 20° C, elle décroît ensuite tout en restant rela
tivement élevée. Le p-coumarylquinique semble surtout s'accu
muler dans des tabacs virosés à 20° Centre 60 heures et 108
heures.
- 9 -
40) !ér...~lKl_U:..cos~_..::.._Sc9'poline.
Le férulylglucose et la scopoline ne sont jamais
détectér dans les extraits (' ~ feuilles d'un Nicotiana Xanth::..
sain. Le férUlylglucose COll~ence à apparattre COfEQe le montreles résultats (tableaux: XVI, XVII; figure: 11, 12) dans des
tabacs virosés ayant passé 72 heures à 20° C après inoculation.
La scopoline (talJleau : XVIII ; figuTe : 13) est synthétiséeun peu avant puisq"l.... 1elle se détecte à partir d 'v.ne période de
48 heures à 20° Co La teneur en férulylglucose augmente réguliè
rement et est maximale pour des séjours à 20° C compris entre
120 et 156 heures. Quant à la scopoline son maximum semble
~tre atteint dans ml ~icotiana Xanthi séjournant 108 heures à
20° C après inoculation 0 La teneur en cette substance décro1trégulièrem8nt mais reste cppendant importante pour un tabac
infecté ayant séjourné 216 heures à 20° C.
III - ]Ltude des substances apparai8sant dans _~~_.Ficoti'?-paXa;nthi
infecté à 20° C par le virus de la m~~~ï~JLd~tabac soucheQ..ornmune.
La formation de lésions locales nécrotiques chezNicotiana tabacum var o Xanth~, se traduit par vne importante
production de composés possédant un certain nombre de caracté
ristiques communes. Ils sont invisibles sans réactifs en lumière
ultra-violette, mais donnent en présence d1une solution concen
trée d'ammoniaque une fluorescence bleue. Cette réaction estégalement obtenue après pulvérisation au carbonate de sodium.
Ces différentes substances sont toujours accompagnées de deux
autres composés également invisibles dans l'Ultra-violet sans
réactifs, mais devenant violets soit au contact de vapeurs d' a.œ.mc_
niaque, soit en présence d1un réactif alcalin.
- 10 -
Le tableau XIX donne les Rf de ces substances dansun grand nombre de solvants.
Ces divers composés sont transférés dans un solvant
non miscible à l'eau comme l'éther éthylique, puis repris par
une solution alcaline de bicarbonate de sodium. Après réacidi
fication, la solution aqueuse est extraite à nouveau par de
l'4ther éthylique. Les opérations SOnt effectuées de la façon
suivante :
extrait initial aqueux
+éthylique
~couche éthérée
1
éther
/aqueuse débarassée d 1 un
nombre de substances
phase
grand
+
[couche éthérée l 1
solution .aqueuse 3 %
~bicarbonate de sodium en
/couche bicarbonatée
1est rendue acide avec Hcl 6N (ph = 1)
éther
~phase aqueuse
+éthylique
~1couche éthérée lIt
- 11 -
La solution alcaline faible doit neutraliser les cons
tituants les plus acides, en les transformant en sels solubles
dans l'eau; les composés les moins acides doivent donc se trou
ver dans la couche éthérée 1, tandis que les plus acides doivent
~tre dans la couche éthérée II.
Seules les substances dOlli~ant une fluorescenoe violette
en présence de vapeurs d'ammoniaque passent en totalité dans
la phase éthérée II.
Les principaux composés appelés (1, J, K, L, M, et N)sont séparés par la chromatographie sur papier et élués avec de
l'éthanol contenant 30 %d'eau. La première séparation se fait
par une chromatographie linéaire dans le butanol éthanol, tandis
que la dernière purification est accomplie par une chromatographie
bidimensionnelle (butanol éthanol en première direction - acide
acétique 2 %en seconde direction).
Chaque éluat donnant une réaction fortement positive
avec le réactif de FOLIN CIOCALTEU, les substances sont donc
réductrices.
Il n'est pas possible d'isoler en une seule opération
dans le butanol éthanol les composés l et J. La chromatographie
à deux dimensions réalisée en utilisant le butanol éthanol, et
un solvant aqueux montre qu'il y a en réalité 3 substances (1,J et S).
La figure 14 montre la position de ces constituantssUl~ un chromatogramme, tandis que le tableau XX, donne les Rf
de ces composés dans les solvants précédents.
J, est toujours accompagné d'un composé H, donnant une
fluorescence jaune vert, en présence de vapeurs d'arnrùoniaque,
ou après pulvérisation au carbonate de sodium.
- 12 -
La distribution de ces nombreuses substances apparais ..
sant dans un Xa~thi virosé à 20° C est donnée par le schéma de
chromatogramme (figure 15).
Chaque éluat est sownis à une hydrolyse acide. L'extrait aqueux est repris par de l'éther éthylique. Cette couche
éthérée est alors mise à sec et rendue alcoolique. La couche
aqueuse est débarassée de son acidité, et les deux phases sont
chromatographiées.
Dans tous les cas, il apparatt dans la couche étha
nolique les substances déjà décelées dans les extraits directs
non hydrolysés, à savoir les composés invisibles sans réactifsen lumière ultra-violette, mais développant une fluorescence
violette après exposition aux vapeurs d'ammoniaque, ou après
pulvérisation avec un réactif alcalin.
Les composés S, K, L, dOffiLent naissance par hydrolyse
acide aux substances M et N. D'autre part, M et N dans desconditions acides se transforment partiellement en L.
Dans l'hydrolysat acide de J, on détecte un composé(Q), apparaissant bleu en ultra-violet sans réactifs, et deve
nant jaune vert lumineux après pulvérisation au carbonate de
sodium, ou en présence de vapeuxsd'ammoniaql1e. Cette substarceproviendrait de l'hydrolyse acide de H. Elle a des Rf dans les
solvants utilisés très proches de ceux des acides o-coumarique
et gentisique. Les fluorescences et les colorations développéessans ou avec les réactifs spéoifiques de ces trois composés(o-coumarique - gentisique - Q) sont identiques. Ce produit pourrait ~tre hydroxylé en ortho.
Un chromatogramn1e à deux dimensions de ce m~me hydro
lysat de J, révèle une isomérisation partielle de J en l. Eneffet la substance J non hydrolysée s'isomérise partiellement enl dans le solvant aqueux. Les composés l et J seraient alors deux
- 13 -
formes isomères (trans et cis).
Les chromatogrammes réalisés sur toutes les phases
aqueuses et révélés au phtalate d'aniline hydrogéné met-cent en
évidence deux sucres : le glucose et-l~binose.
Les figures 16 ••• 2~, et les tableaux correspondants
(XXI ... XXVI) permettent de mieux comprendre les similitudes
existant entre ces nombreuses substances.
Dans un travail ultérieur, il sera réalisé les hydro
lyses basiques, ainsi que les mesures spectroscopiques de ces
divers composés.
- 14 -
DIS C U S S ION
Des perturbations importantes doivent intervenir dans
la cha1ne de biosynthèse des phénols au cours de l'infection
virale et de la floraison.
Il appara1t important de réunir les données relatives
à la formation des composés phénoliques dans le tabac.
C'est l'emploi des molécules marquées par 14C qui
a fait faire les plus grands progrès dans l'étude de la bio
synthèse des composés phénoliques. Les substances sont i~tro
duites sous forme de solution liquide, par absorption par une
surface coupée, généralement dans un organe détaché de la plante.
Cela peut apporter des modifications importantes et non inter
prétables du métabolisme, mais quelles que soient les réserves
que l'on puisse faire et les précautions qu'elles imposent, il
n'en reste pas moins vrai que c'est l'emploi des traceurs radio
actifs qui a conduit aux résultats les plus importants.
Dans cette partie, nous envisageons les mécanismes de
formation dans les feuilles de tabac d'un certain nombre de
composés phénoliques comme l'acide chlorogénique, l'aoide
p-coumarylquinique, la lignine et la scopoline.
L'utilisation de molécules marquées par 14C a permis
à RUNECKLES (17) de montrer que l'acide p-coumarique et le
p-coumaryl-1 glucose sont les précurseurs de l'acide chlorogénique
~'acide caféyl-3 quinique), dans les feuilles de tabac de la
variété Delcre~, tandis que l'acide cinn~ique et le cinnamyl-1
glucose sont les intermédiaires dans la biosJn~thèse de l'acide
p-coumarylquinique. Les esters du glucose (cinnamyl-1 glucose et
p-coumaryl-1 glucose) sont plus facilement incorporés dans les
dérivés de l'acide qUll~ique, que les acides libres correspondants.
- 15 -
Une autre observation importante, est que l'acide caféique n'est
pas métabolisé en acide chlorogénique.
Les différentes réactions sont résumées par les
schémas suivants :
c
'-',0• •1
•1"', 1v,-'
- 16 -
Les résultats sent similaires à ceux obtenus par
UNDERHILL et al (25) sur la bios3rnthèse de la quercétine dans
le sarr~sin (Xp~opyr~ tart~~icum). Le noyau B de la querc~t~p
(ce noyau ayant une hydroxylation identique à celui de l'acide
caféylQuinique), et les carbones 2, 3 et 4 sont formés à par
tir des acides cinna~iQue et p-cûumarique.
Ces d:.:..nnée,3 sent un peu différentes de celles rapportées par L:.~\~:: et ZlJCKER (: 5) 9 dans les tubercules de pomme de
terrG (Sol.a.:11u.rr~_J;~bJ=;J::"'Li?-~) ("Ker...nebec"), puisque ces derniersont trcuV8 ~~e les acides cL~amyl-3 et p-coumaryl-3 quiniqueinterviennent dill18 la oiosynthèse de l'acide chlorogénique. Ils
ni ont pu détectJl' une stimulation de synthèse de l'acide caféyl-3
quinique par l'acidd p-coumo..rique.
JIA.KSON et ZUCKER (1~) ont montré qu'une préparation de
polyphénoloxydase extraite de tubercules de pOlmne de terre, est
capable d'oxyder lja~ide _-coumaryl-3 quinique en acide caféyl-3
quinique 7 e-c également de transformer l'acide p-coumarylshikimique
en acide caféylshikimiqueo
D'après Ru~BCKLES (18), l'acide férulique est activement
métabolisé dans les tissus de feuilles de Nicotiana taba~ var.
pel_~rest en acide glucosidoférulique, en férulyl-1 glucose en
scopoline et à ml degré moindre en acide férulyl-3 quinique. Les
résultats obtenus permettent de dire que l'acide féruliqueni intervierlt pas dans la fo:rmation de l'acide chlorogénique
(acide cafsyl-:Z; ,":11inique). Au cours des expériences réalisées à
la lumière~ il s'accumule surtout de l'acide glucosidoférulique,
- 17 -
de la scopoline, puis un peu de férulyl-1 glucose et de l'acideférulyl-3 quinique. A l' obscurité le métabolite prédominant cle
synthétisé est le férulyl-1 glucose.
L'incorporation de l'acide férulique et de l'acide
p-coumarique dans les esters du glucose et dans les glucosides
correspondants, avec cependant une plus grande incorporation
dans les derniers a été constatée par RUNECKLES et WOOLRICH
(19) dans les feuilles de tabac de la variété De~9Fest.
Le ill~me phénomène a été observé par HARBOR1Œ et CO~~R
(13). Ces derniers ont montré que lorsque les acides cinnamiques
sont fournies à des pétioles de feuilles détachées d'un grand
nombre de plantes (Sol_aE_~pecies - Raphanus sativus - Datura
knightii), il se forme surtout les esters de ces acides et des
sucres.
Pour DEWEY et STEPKA (5) la scopoline serait métabo
lisée dans le tabac d'après le schéma suivant :
- 18 -
Il Y aurait méthylation durant la conversion de lanicotine en nornicotine~
HARBOIDTE (12) note la présence da.l.1S des extraits ~e
fleurs de nombreuz8s Solanées: d'esculine de cichoriine et de
soopoline. Il en conclue que le précurseur CO~Jllil à la scopolino
et à la cichorillle serait de l'esculine.
C'est l'utilisation de moléculES marquées d'acide félu
lique qui a per~is à RUlfECKLES (18) de montrer que cet acide
est métabolisé dans les feuilles de ~i~otian~ tabacum variété
Delcrest en scopolinen
Il est alors il:lportant de conna1tre les intermédiaires
conduisant de l'acide férulique à la scopoline.
Les travatLX ~("éalisés pa~ STEeK (21) sur les feuilles
de tabacs de la variété Hic~S2 mettent en évidence le rOle de l'a
cide glucosidoférulique dans la biosynthèse de la soopoline.
Ce composé est très instable et se tr~~sforme en un sel basique.
Les résu_ltats obtenus par STEeK (21) permettent éga
lement de penser que le férulyl-1 glucose n'intervient pas dans
le processus précédent mais a lli~ rOle ioportant puisqu'il semble
~tre à l'origine de la lignine dans le tabac.
Parmi les précurseurs les plus probables de l'acide
glucosidoférulique, se trouvent l'acide férulique et l'acide
caféyl-4 glucose.
Les expériences faites par STECK (22) sur les feuilles
de tabacs de la variété ~jcks montrent que c'est l'acide féru
lique et non l'acide caféyl-4 glucose qui est incorporé dans
l'acide glucosidoféruliquee De la même façon l'acide caféique
est rapidement métabolisé en acide glucosidoférulique. Cela signi
fie donc que, seuls les aglycones sont invoqués dans la bio
genèse de la scopoline, et que la méthylation précède la g1llcosi
dation.
- 19 -
La transformation de l'acide glucosidoférulique enscopoline peut théoriquement s'effectuer à partir de l'isomère
cis, ou de Ir isomère trm:.s ou des deux.
STECK (22) a montré à l'aide des traceurs radioactifs
que, seul l'acide trans glucosidoférulique est hydroxylé en acide
trans hydroxy-2, glucose-4, méthoxy-5 cinnamique, et que cette
derni8re substance est convertie en scopolinc par lli1e trans-cis
isomérisation. Il ne semble pas que cette dernière réactionsoit photosensible e
Les différentes réactioTISconduisant à la formation de
scopoline à partir de l'acide caféique dans les feuilles de
tabac sont dOlli1GeS par la figure suivante :
- 20 -
Le processus de formation de la scopolétine ùans lestissus de tabac cultivés 1-B__Y2-_tl'0, et proposé par FRITIG (9) estdifférent du précédent •
Il est :résUlIlé de la manière suivante
Pour l'auteur, la synthèse préalable et rapide de la
seopolétine exclut l'intervention dlun intermédiaire cowùe
l'acide glucosidoférulique. La scopoline proviendrait de la
glucosidation de la scopolétine libre. D'autre part, la méthy
la-cion précède la cyclisation, et doit se faire lorsque les
- 21 -
substituants sur le noyau aromatique sont en place.
Dans ce m~me travail, FRITIG met également en évidence
la gran~e vitesse de renouvvllement du chlorogénique.
STECK (22) n'a jamais pu obtenir une incorporationsignificative d3 caféyl ,.. ..:L do féru~ylglucose en scopolétine, il
a cependant tralivé uno certaine conversion de scopolétine exogène
en scopolino dans 10s fel.lilles de tabac. Cette transformation
est oxtrGmement rapi.de. Cependant, après 72 heures de métabolisme,
la scopolétlilO n'ost pas un aussi bon précurseur de la scopoline
que l'acide trans glucosidoférulique.
Il est très possible que dos feuilles intactes et des
tissus de tabac cultivés in vitro peuvent avoir des voies de
synthèse différentes pour la scopoline.
Sachant que la phénylalanine ou un de ses dérivés enC6 - C
3(10), ost à l'origine de l'acide caféique dans le tabac,
si on résume la cha1ne de biosynt~èse des phénols dans les feuil
les de Ni~~tiana tabac~ s'établirait suivant le schéma donnépar la figure 25~
Les composés soulignés sont ceux qui s'accumulent
dans le ~tia~~a X§.p_~hi, lors d'wleinfection à 20° C par le
virus de la mosaïque du tab~~.
Cette chatne de bios~lthèse pose un certain nombre de
problèmes, en particulier ceux relatifs à l'hydroxylation, à
la méthylation et à l'estérification.
On peut penser que la formation d'ortho-diphénols à
partir de monophénols peut-~tre réalisée dans la plante par la
~hénolase, système enzymatique complexe.
LEVY et ZUCKER (15) ont montré qu'une préparation de
phénolase extraite de la pomnle de terre tr&~sforme l'acide
- 22 -
p-coumarylQuiniQue (1 OH) en acide chlorogéniQue (2 OH). Les
phénolases possédant dellX types d'activité, d'une part, elles sont
susceptioles de transformer les monophénols en diphénols (acti
vité crédolaGe), d'autre part, elles oxydent les diphénols enQuinones (activité catécholaso). Dans la plante il faut donc
adme-ctre Que les diphénols formés sont protégés contre la
deuxième activité.
La méthylat ion de s gl'oupoment s OH doit pouvoir se faire
par l'intermédiaire de la méthionine, agissant comme donneur du.
groupement méthyle (CH3
) (voir rapport 1967). Des systèmes
enzymatiQues susceptioles d'effectuer cette réaction (par exemple
la transformation de l'acide caféique en acide féruliQue) ont
été mis en évidence chez les végétaux supérieurs par Fll{[LE etNELSON (6) et chez les microorganismes par CATROUX (2).
SWAIl'T (23) pense qui il est également possiole Que le s
groupements méthoxyles se fassent par une méthoxylation directe
du cycle oenzénique, sans passer par le stade phénol. Les fonc
tions phénols apparaitraient par déméthoxylation et, il y aurait
ainsi protection des ortho-diphénols vis à vis de l'activité caté
cholase des phénolases.
En ce qui concerne les acides phénols, plus particuliè
rement les acides cinnamiques, les esters constituent leur forme
de comoinaison la plus courante. Des préparations enzymatiQues,susceptioles de provoquer la formation de ces esters ont été
isolées chez les microorganismes par TOWERS (24), et ohez les
végétaux supérieurs par CORl'ŒR et ffflAIN (3). Mais ces mécanismes
sont à l'heure actuelle peu connus.
- 23 -
EXP E R l H E N T A T ION
L'obtention à l'état pur d'un seul composé phénolique,
à partir d'tm mélange complexe est réalisée par l'utilisation de
la chromatographie sur papier, éventuellement à l'échelle pré
parative. C'est la seule méthode susceptible de résoudre tous
les problèmes de fractionllement m~me lorsqu'un extrait végétal
contient IDl grand nombre de substancesphénoliques. Dans quel
ques cas de grandes feuilles chromatographique épais (WHATlf~N
nO 3) sont employées. La solution à analyser est déposée sur toute
la longueur des feuilles. Les papiers épais ne donnent pas
touj ours à_es séparations satisfaisantes, et il est préférable
d'effectuer ces fractionnements sur du papier courant ( \~HATNAN
nO 1). Après sépara-Gion dans un solvant convenable, les bandes
sont découpées puis éluées avec de l'alcool éthylique contenant
30 %d'eau. Dans de nombreux cas, il n'est pas possible d'isoler
un produit en une seule opération, car la bande renferman~ la
substance contient plusieurs pigments. Il faut après avoir fait
la première séparation, purifier à nouveau d,lns "Lill autre so]
vante Il peut ~tre nécessaire de reCOG~encer l'opération plusieuxs
fois.
Par approches successives, on peut isoler à l'état
pur chaque composé phénolique. Il est toujours important en
effectuant ce travail de se référer conti...~uellement au chroma
tograll'1ffie à deux dimensions, qui permet de situer à chaque instant
l'état d'avancement des fractionnements.
Parfois la chromatographie à une se"Lùe dimension, ne
permet pa~ quelque soit le solvant utilisé, de bonnes séparations.
- 24 -
On doit alors effectuer des chromatogr~nes à deux dimensionssur papLer 'vlHl.. THAliT nO 1•
Les produits chromatographiquement purs sont mis
directement en solution dans la liqueur d'élution.
Le tableau XXVII donne les différents solvants utilisés
pour la purification des substances phénoliques.
Il faut d'abord comparer les Rf dans plusieurs solvants,
avec ceux des produits de référence, puis utiliser la spectro
scopie en milieu neutre et alcalin.
Il devient ensuite nécessaire d' ef,cectuer sur ces
produits pUl'S, une hydrolyse acide ou alcaline, et éventuellement
les deux. Le phénol simple (aglycone) est détecté à l'aide de
la chromatographie et de la spectroscopie. Toujours en faisant
a~pel à ces m@mes méthodes, les glucides et les autres produits
intervenant dans 12:. struct"l:tr8 du composé naturel, sont identifiés.
Les détails de ces opérations sont exposés dans le
rapport de travail (1967), ct dans le rapport de stage (Liverpool
1967) •
Cependant, quelques modifications sont apportées. Ainsi
l'hydrolyse acide réalisée sur des extraits totaux de feuilles
virosées à 20 0 C de Nicotiana Y:..antlli pour obtenir la scopolétine,
est effectuée avec de l'acide chlorhydrique 2N. La solution
étant rendue normale, les opérations sont faites au bain-r,larie
bouillant pendant 45 minutes.
L'hydrolyse alcaline des esters des acides cinnamiques
et des sucres, et des dérivés de l'acide quinique est effectuée
- 25 -
par de la soude, en rendant la solution 2N. Elle est réalisée
à la température du laboratoire durant 35 minutes.
La réalisation du spectre cl' 'Lme substance après son
élution est une opération assez délicate. Le problème le plus
important est d'éliminer l'interférence des impuretés que le
solvant extrait du lJapier. Le lavage préalable du papier n'est
pas satisfaisant, car 3 chaque foj_s qu'un solvant circule sur
le papier, il extrait de nouvelles impuretés. Une pr'écaution
utile consiste à traiter le papier de la m~me manière que la
chromatographie proprement dite, mais sans déposer la solution
à analyser. On obtient alors après élut ion, une solution conte
nant uniquement, les impuretés du papier et c'est par rapport
à cette liqueur que le spectre de la substance est tracée. La
même chose est réalisée lors U8S dosages de substances, après
séparation par chromatographie sur papier puis élut ion.
Il est préférable d'avoir un éluat aussi concentré
que possible de façon à le diluer avec du solvant pur. Ainsi
les impuretés qut se trouvent en ;jros proportionnelles au
volume du solvffilt ayant traversé une certaine surface de papier,
se trouvent réduites à Ull. taux minimum.
Il est Jécessaire de définir la nature du solvant
utilisé, et de comparer les spectres des corps à étudier à des
spectres de produits de référence préparés dans les mêmes condi
tions.
1 0) ~es_F.§acJ;ifs_.
a) Jlé.~~.Q_~~iJ_de FOL]ll. CIOCALTEU.Un mélange contenant 100 g de tungstate de sodium
(Na2W04 ·2H20), 25 g de molybdate de sodium (Na2Mo04. 2H20),
- 26 -
700 ml d'eau, 50 ml d'acide phosphoriQue à 85 '/; et t 00 ml d'acide
chlorhydriQue concentré, est mis à bouillir sous réfrigérant à
reflux)ende,nt 10 heures. A:.;rès ce temps, 150 g de s1-ùfate le
lithiUlll, 50 ml dl eau et QuelQues gom:tes de brome sont aj outés.
Le mélange est alors chauffé à 100 0 C, de façon à pouvoir éli
miner l'excès de brome. La liQueur est ensuite mise à refroidir,
diluée à un litre, puis filtrée. Elle est gardée au frigidaire
dans lme bouteille bien fermée.
b) 8_<2.-t\l:l:;.i.op:-"de. __carJ)_Qna~te_j __ç_ soSLiU]Jl..
Elle est faice en dissolvan.t 20 g de CC3Na2 anhydre
dans 100 ml d'eau.
c) UtilisatioE dt'.. réactif.~_.. --~ ~ ~ .. _·_~,··, ~, '·~2 _. -=-"""
Une prise d'essai convenable; de la solu-cion à doser
étant faite, on complE~te à 10 ml avec de l'eau distillée. Après
addition d'1 ml du réactif de FOLIN CIOCALTEU, il est ajouté
trois minutes plus tard 2 ml de la solution (Je carbonate de so
diUlll. Après chaque réactif, il est nécessaire de bien agiter les
tubes, afin d'obtenir Dne solution homogène.
Les tubes sont mis au bain-marie bouillant durant
1 minute puis mis à refroidir. Après avoir dilué la solution
bleue à 25 ml avec de l'eau distillée, lc?s densités optiQues
sont mesurées à 725 9r' une heure après la fin des opérations,
sur Dn spectrophotomètre Unicam 500.
Les lectures sont faites par rapport à un blanc, ne
contenant Que de l'eau additio:.-uée des réactifs.
Les résultats sont établis à l'aide d'une courbe éta
lon enregistrée à partir d'w~e solution de référence, obtenue
en dis801vant 100 mg du marQueu.T dans un litre d'eau (100'i/ml).
Ici les teneurs en phénols totamc sont exprimées en mg d'acide
chlorogéniQue pour 100 g de poids frais.
- 27 -
Les différentes substances phénoliques (marqueurs
phénols du tabac) dosées aprbs élution de chromatogra.IffiJe de
papier, dOY1jlent "lm léger précipité après adc1it ion de carbonate.
Il est alors nécessaire de filtrer les solutions avant les
lectures. Dans t011S les cas, le blanc se trouve constitué par une
solution contenant les impuretés du papier et dans laquelle on
ajoute les réactifs et que l'on dilue à 25 ml avec de l'eau dis
tillée.
Les différentes gam>,cs élalon sont préparées dans les
m~mes conditicl1s que le dosage proprement dit. Les nombreux
produits de référence son-:~ closables pour des concentrations
comprises entre 1 et 100/ml.
(1)
(2 )
(3)(4 )
(5 )
(6)
~~l(9( 10( 11)(12 )( 13 )(14 )
(15 )( 16 )(17 )
(18 )
( 19)
(20)
(21)
~~~~(24)
(25)
(26)
(27)
- 28 -
B l B LlO G R A PHI E
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I3J?l Y..8.J}.t.ê, ..A = butanol · 4, acide acétique 1 , eau 5·B = acide acétique 10 p 100
0 = butanol · '1 ~ arnmoniaque 2 l" 1· "
D = butanol · 4, éthanol . 1 , eau 2,2· .E = acide acétique 2 p 100
Marg'lle~ ..OAG 1 =FEG 1 =:porr 1 =FEQ 3 =PCQ. 3 =
caféyl - 1 glucose (:P~till1i~b~jda)
férulyl - 1 glucose (J?ét~ l2-.Y_1rr.l.da)
p - coumaryl - 1 glucose (Antirr4jnum majus)
férulyl - 3 quiniq~e(café variété Robust~)
p - coumaryl - 3 quinique(ponunes vertes à cidre)
-
TABLEAU 'I . Cc\~QC.\:èRis\:'9ues c.nRomatO'ijRaphi9oes et spech~o5cop;9ues des dé R' vé..s de.~
oc.\des ç,tnVlomiqves dans le Xan\::.h\ infec\:.é èt r';;.O·c. ro~ \e \Ji R\)5 de \0 mosaïgue. do\:.abac.
Rg ~ -\00 dans les so\"an,"s: Spec\-~es lel:. OH ù. 9S0
) F \\JOr,:H?~C.~(\c(!,~.
i\m\n 6.l\ma~UV
S~~w A 8 C- D E ~max (m(-A-) UV ..(O"}--'-) lmt'-l Nr\3·a\co\\
)(f\NT~'.
D 49 63 J. 'l~ :l.~'i. (oL9S). ~a,5 ~63 tW b\ew~ "OW:.
D. D' ~~S. (é.l9S), ~s,
6\~~65 11,~1 3 46 6Cl, 19 l!L~éL 4& ~
-ip~D" 4-1 1-0,~1 b\UlJ~ ~- - -
E. i-~ 15. ~5 9 54- 6i l 'io ~30. (a.~Q.,). ~1~. ~So sa - ~
G. ses '19 -19 69 65 J '1-5 ~O, (~oo), ~~O «,G~ 50 ~~. ~
MAR9UEU~
C AG-.-1. 43 t~ ,6~ 60,1-0 a.so, C~05)J ?d4 ~bS ()ô b\qu, ~
FEG-.1. '51 ~o -\q 69 65,1-5 ~40, <,~oo), ~~o ~~~ sa, b\eLV 'OOû:.
PCG-.1 5'3 ~B a~ 1~ 6~, ~o OL~S" ' 3-\a, .;),bO sa, - ~
FEQ-3 65 'li. ~1 ?> 49 . 63 .1~ ~~r;), (c195),~5 a.b! 4& b\uw 'OOlk..
PCQ.~ '7:).., ts.~'5 '3 54 6'i,'io ~~O, td.9~). ~--\c1I :lISO 'So . ~
TABLEAU ::II. • L~~ Q~lycones et \es ~is\dv5 '('Ion phé.no\\9ves de\:.ec.\-é.s apRQ.s hydRO\y5~ d~
d~A.\\lé':) àe-s oc.ides c",nnom"\9 v€J5 , dons ,~ Xonl'r\\ \/\p.osé à a.o·c.
~~~ \-\Y]) RO LYSE AcidE. HYDR.OLycoE BASIQ\JE.
~ m.ovt., ~~
~~COV\e ~ a11~ 1t-~t:q-wL~ .
XANH'l\
])
}~~~. .o.M~~e nad~~~D' D.Cicf.e., '.DU ~
I: ;Qcide;1;'~e. Acldt~ .a.dd.~t·co~~ ..
~(..ficr-)
fi -aUd~ fw-futu-~(~) ~~. ~~ ~~'.MAR.9JEURS
FEG-. ..f ~~[~) cf.~ ~~ ~
FE9·~ ~cAdel~~ (~) aWi(,~ 4eJ.<i~ ~ IflrlAp.~
PC9.~ Iaw:!"f'~ . Qade.~~ .acide,f-'~ ~,~
TABLERU ID. J)OSAGE :DES ~NOLS TOTAUX
~V\~ur en Ph2nols locaux.en mS à'ddd.e c'n\oro~iYli'1\J~/ --\OO~ P.t:
X.V.S 40h à 20°C. 90X.V. MT Il Il -'\1 <g, r5
x.v.s 92h à 20°C 90X.V.MT Il
" -'\.:t <J, tS
'X.v.s 110h à 200(9-i/~s
X. V.MT Il Il -1 31,150
X,V.S 1~2n à 20°C~?>,15'
X.V.MT II Il '83, t5
1 X.V.MT 1'2h.à 200C~s1-2h.à30'c. -1001
1 , " . '5S,t-S.'1 X.V.MT nh a 20°(. 1/ -i4'\\'~~OC1
"A~LEAU li. 'DOSAGE :DES P~ENOLc) TOTAUX..
Teneur en Ph~nols tot.vx
~V\ mg d'~c\d~ c'rl\oroején\que 1~OOCà RF
x. V. S 4011 ~ 200' 1--i.~5X.V. MI Il Il
"'\00
X.V.S ~h ~ 20 0 (q.1,~5X. V. MT Il Il
""\05
X.V.S 96h à 20 0 Ç'f1,~S
><. V. Mi II ,.93,15"
X.V,s "?Oh.Q <ooc 11, .'L5X.V.MT Il Il
-10'h~O
X.V,~ 144'0 à 200C1-1,~5
X.V.MT \1 Il~~,'50
X.V.S 192h ~ 20°,"'f3/f5
X. V.MT Il Il .~~, 'SO
X.V.5 :: Nlco\:idna 'Xdl"\'t.h' Sain 1 e.c.at veqetat.it.
X.V. MT: N\co\:ia\'\a. Xa\'\r'n\ V'p.,osé, 1 etai: v~èta~i~.P. F:I Poids fr~'5.
]OSAGE DES PHENOLS TOTAUX JUilLET 196t
1TeV\elJr 12Y1 ph~no\s l:otaV1'en ~ dac.\de cn\orogeY1\que 1'""00~ P. F
,
X.Y.5 ;!211 à 20°C ~2.,SO
X.V.MT 1\ Il -115
X.V. '5 96\'1 11 <.O°c. 1-~,':f5X. V.MT '1 '1
-1éh5
X.V.S 10cah cl 2O"C ~~,'50
X.V.MT " li -1OLb,S'O
~.V.S 12,Oh .à 20o~ ~/50X. V.MT " If
-"\18, 15
X.Fl..F~U.S 72h.3 wee .-'\0'5X.H,.FEU.MT li ,I
A1~,~O
X.ç:l..FBJ.S 1zo~ ~ 20 0 ç. --1°11'50X. Ro. FEU.I'H '4 " '153, 15
1.. H•• fL.S 120h ~ 20°(, c!2tb'5X. FL. FL.MT Il Il 3«'0
X J:"L.l=""ev ~
X. FL. FL ::
S : Sàin
. 1MT ~ V\("ose
TABLEAU \,IL :DOSAGR DES ~HENQLS TOTAUX.
Tene.ur ~n Ph~O\S totaUX1
en mg dacide ch'orogé.n \qUe./100§ Po F 1
X.V.S. ~h à 200 e 1--100
X.V.MT. Il Il ;tg,7Z6" 1
X. V•rot T. 4'Bh à 2.O°C , J\OO
X.V.S Il Il '1-'6, t 5
)(.V.s 60h ~ 20°C ~~,T5
X.V.MT Il Il -1'5"0
X.V.S. 12h à 20°' -115
X.V.MT l' Il ~ li~ ,.f-;>
X.V.S ~k 2DOC gSX.V.MT Il Il ..-\ 3,l,50
X.V.S. 96h à 2DOc 93,'1-5X. V.MT. .. Il -1~g,l5
)( N.Ci. 108h à 20°C~bJ.Q.'5
X.V.MT Il " -'\~~,~S
X.V.S 120h à 200(. 93,TSX.V.MT. Il Il -1~i, 't'5
X.V.S 132h à 20°(.~~I':J.S
X.V.NT Il &1-i"8 1 =t-S
)(.V.S 144n à 200(;. . i-g Ii-SX.V.MT Il .' "'\otil, '50.X.V.S 156n à 20°C i-S, >.J5'X.V.NT. Il n 90
X.V.S 1-aoh ~ 2.0 0 C -1o=l,cso 1
1
X. V.NT Il " -'\18, 't5
X.V.S 192h Q 20°C.90
)C.V.MT Il " . 93,'t'S-
X.V.S 216h ~ 20°C. -1°t,50X.V.MT " If 1-i.lci'5.
""00
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E\)o\uhon des \:ene\JAS en p'néno\s ~o~au)( 00 cou~s de LlV'lfechon vl~a\e. à. ao·c
do NicotiQna 'tan\:hi, pa~ \e \Jù~vs de \a mosCl\9ue d~ ~aboc. JANviER -1968.
60 96 ·nol " J
TABLEAU \Ill. roSAGE: J)ES P~~L.S TOt"AU)( AVRil -1968 •
Ten~ur en Phé....o\..s. 1:0\:.8\.1"
en Mf dac\de c"'\oro~én\qve1J\OO~ P.f
X.V.S 24h à 200 e !f~, ~c:;;
X.V.MT. 1\ " b~,SO
x. V. '5 30h ~ 200e t~,~')
')(. V. MT Il,. 11,'50
X.v.s 36., à 200 e ':f -1, ~'.i
X.V.MT " " ~l,SO
X. V.s 4Sh à 200 Ç 1-1.:L'.iX. V.MT Il l' <aS
X.V.S 540 à 20°' --100 ~"'I-..".M"
X.V.MT Il Il '1--1 ,cl5 ~~.\I.S.
X.V.S 60h ~ 20°C 1-1, c2e;)
X.Y.MT 1\ u --100
X.V.S 66'h il 20°C 'l--i •.1'5X.V.MT Il Il 100
X.V.S 1.2~ à 20°<:, 'l-1,Ol.SX.V.MT II Il ~Ot,50
X.V.S S4h à 2ace '15X. V.MT Il ,. -1'" 5
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WhOTV"nU\'\ WhahY\a.~ "Ottc A~·-t nO~ 6EW BAW(P~~)
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