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N0 02 ISAL 0029 Année 2002

THESE

Etude pharmacologique de la voie de signalisation impliquée dans l’apoptose

des péricytes rétiniens induite par les produits avancés de glycation (albumine

bovine modifiée par le méthylglyoxal)

Présentée devant

L’institut National des Sciences Appliquées de Lyon

Pour obtenir

Le grade de docteur en Biochimie

par

Ulriche DENIS

DEA de Biochimie (Université LyonI)

Soutenue publiquement le 27 Juin 2002 devant la commission d’Examen

JURY:

Pr José CUNHA-VAZ (rapporteur)

Pr Michel LAGARDE

Dr Marc LECOMTE

Pr Thierry LEVADE (rapporteur)

Dr Nicolas WIERNSPERGER

Cette thèse a été préparée au sein de l’Unité de Recherche de Microangiopathie Diabétique (UTMD) LIPHA/INSERM U-352, à l’INSA de Lyon

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AVANT-PROPOS

Les travaux menés au cours des deux premières années de thèse ont fait l’objet d’un

brevet, déposé en Octobre 2000. Au terme de la confidentialité, les données scientifiques ont

été présentées par des publications (publiée et soumise) ou des communications (orale et

écrites). En voici les références.

BREVET

Marc Lecomte, Ulriche Denis, Clarisse Paget, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde.

Utilisation d’inhibiteurs de l’apoptose des péricytes pour le traitement et /ou la prévention de

la rétinopathie diabétique. Brevet FR2815541, enregistré le 24 Octobre 2000, publié le 26

avril 2002. WO02/34201, publié le 2 mai 2002.

PUBLICATION

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Clarisse Paget, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger

and Michel Lagarde. Advanced Glycation End-Products (AGE) induce apoptosis of bovine

retinal pericytes in culture: involvement of DAG/ceramide production and oxidative stress

induction. Free Radic. Biol. Med., sous presse

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Caspase-10 is involved in Advanced Glycation End-Products (AGE)-induced

apoptosis in cultured bovine retinal pericytes. En préparation

COMMUNICATION ORALE

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Advanced Glycation End-Products (AGE) induce apoptosis of cultured bovine

retinal pericytes: implication of caspases and DAG/ceramide production. 11th meeting of the

European Association for the study of Diabetic Eye Complications (EASDEC), Paris,

France, 14-18 mai 2001, Diabetes and Metabolism, 2001, 27, suppl. 2, O23.

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POSTERS

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Caspase-10 is involved in Advanced Glycation End-Products (age)-induced

apoptosis in cultured bovine retinal pericytes. 62nd Annual Meeting and Scientific Sessions

of the American Diabetes Association, San Francisco, USA, 14-18 June 2002, Diabetes,

2002, suppl., N° 815.

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Advanced Glycation End-Products (AGE) induce apoptosis of cultured bovine

retinal pericytes: implication of caspases and DAG/ceramide production. Charleston

Ceramide Conference, Charleston, USA, 11-14 November 2001.

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Advanced Glycation End-Products (AGE) induce apoptosis of cultured bovine

retinal pericytes: implication of caspases and DAG/ceramide production. 61th Annual

Meeting and Scientific Sessions of the American Diabetes Association. Philadelphia,

USA, 22-26 June 2001, Diabetes, 2001, suppl. 2, p A192, N° 781-P.

Ulriche Denis, Marc Lecomte, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger and Michel

Lagarde. Advanced Glycation End-Products (AGE) induce apoptosis of cultured bovine

retinal pericytes: implication of caspases and DAG/ceramide production. 2ème journée

scientifique annuelle de l’Institut Multidisciplinaire de Biochimie et des Lipides (IMBL).

Villeurbanne, France, 14 juin 2001.

19

19

ABREVIATIONS

ABTS 2,2'-azyno-di (3-éthylbenzathiazoline-sulfonate)

ADN acide désoxyribonucléique

z-AEVD-fmk z-alanine-glutamate-valine-aspartate-fmk

AGE advanced glycation end-product (produits avancés de glycation)

AGPI acide gras polyinsaturé

AR aldose réductase

ARNm acide ribonucléique messager

A-SMase acidic sphingomyelinase (sphingomyélinase acide)

ATP adénosine triphosphate

BSA bovine serum albumin (albumine sérique de bœuf)

CCM chromatographie sur couche mince

CML carboxyméthyllysine

DAG diacylglycérol

DETAPAC diethylenetriamine pentaacetic acid (acide diéthylènetriamine

pentaacétique)

z-DEVD-fmk z-aspartate-glutamate-valine-aspartate-fmk

DHA docosahexaenoic acid (acide docosahexaénoïque)

DID diabète insulino-dépendant

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (milieu de Eagle modifié par

Dulbecco)

DMSO diméthyl sulfoxyde

DNID diabète non insulino-dépendant

DPBS Dulbecco’s phosphate buffered saline (tampon phosphate salin de

Dulbecco)

DTT dithiotréitol

ECL enhanced chemiluminescence (chimioluminescence amplifiée)

EDTA ethylenediamine tetraacetic acid (acide éthylènediamine tétraacétique)

EGTA ethylene glycol tetraacetic acid (acide éthylène glycol tétraacétique)

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

fmk fluorométhyl cétone

GAPDHase glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

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GPx glutathion peroxydase

GSH glutathion réduit

HBSS Hanks’ balanced salt solution (solution tamponnée saline de Hanks)

HEPES acide (hydroxy-2-ethyl)-4-pipérazinyl-1-2-éthanesulfonique

z-IETD-fmk z-isoleucine-glutamate-thréonine-aspartate-fmk

z-LEHD-fmk z-leucine-glutamate-histydine-aspartate-fmk

MGX méthylglyoxal

NAC N-acétyl-L-cystéine

N-SMase neutral sphingomyelinase (sphingomyélinase neutre)

PBS phosphate-buffered saline (tampon phosphate salin)

PC phosphatidylcholine

PKC protéine kinase C

PLA2 phospholipase A2

PLC phospholipase C

PS phosphatidylsérine

ROS reactive oxygen species (dérivés actifs de l’oxygène)

SDS dodécylsulfate de sodium

SOD superoxyde dismutase

SVF sérum de veau fœtal

TBS Tris buffer saline (tampon Tris salin)

TCA trichloroacetic acid (acide trichloroacétique)

TEMED N,N,N’,N’-tétraméthyléthylènediamine

TLC thin layer chromatography (chromatographie sur couche mince)

TLCK tosyle de lysinechlorométhylcétone

Tris Tris (hydroxyméthyl)-amino méthane

TTBS tween Tris buffer saline (tampon Tris salin contenant du tween)

z-VAD-fmk z-valine-alanine-aspartate-fmk

z-VDVAD-fmk z-valine-aspartate-valine-alanine-aspartate-fmk

z- benzyloxycarbonyl

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RESUME Une des premières altérations morphologiques des microvaisseaux rétiniens, observée

dans la phase préclinique de la rétinopathie diabétique, est la disparition sélective des péricytes par apoptose. L’objectif de ce travail de thèse a été de tester l’hypothèse que les produits avancés de glycation (AGE) peuvent induire l’apoptose des péricytes rétiniens en culture et dans l’affirmative d’explorer la voie de signalisation intracellulaire mise en jeu au cours de ce processus apoptotique.

Les AGE (3 µM) induisent l’apoptose des péricytes, associée à la formation intracellulaire de diacylglycérols (DAG) et de céramides, produits par l’activation séquentielle de phosphatidylcholine-phospholipase C couplée à la sphingomyélinase acide. Une forte concentration en glucose (25 mM) n’a pas eu d’effet sur l’apoptose des péricytes et la production endogène des deux lipides. L’inhibition de la formation des DAG et des céramides n’abolit que partiellement l’apoptose, suggérant que les AGE activent une autre voie de signalisation menant à l’apoptose, indépendante des deux lipides. L’apoptose des péricytes induite par les AGE est également gouvernée par l’activation de différentes caspases. Alors que la caspase-8 initiatrice ne semble pas être présente dans les péricytes rétiniens de bœuf, la caspase-10 initiatrice (et peut-être la caspase-2) participe à la transduction du message apoptotique en générant les DAG et les céramides. Les deux voies de signalisation activées par les AGE semblent induire une altération de la perméabilité de la membrane mitochondriale, caractérisée par l'activation de la caspase-9. Cette dernière activerait alors les caspases effectrices, comme la caspase-3, impliquées dans la phase d'exécution de l'apoptose. Nous avons également montré l’induction d’un stress oxydant dans la voie de signalisation menant à l’apoptose des péricytes. Les AGE induisent une production d’espèces radicalaires de l’oxygène (ROS) et/ou modifient le statut redox intracellulaire, ce qui contrôlerait la génération de DAG et de céramides et qui altérerait ensuite la fonction mitochondriale.

En conclusion, ces travaux montrent que les AGE, qui s’accumulent dans la membrane basale des microvaisseaux rétiniens au cours du diabète, sont capables d’induire la perte des péricytes par apoptose in vitro. De plus, cette étude permet de proposer une voie de signalisation activée par les AGE menant à l’apoptose des péricytes rétiniens. La perte précoce des péricytes rétiniens est considérée comme le point de départ dans l'évolution de la rétinopathie diabétique. Le ralentissement, ou la prévention, de la disparition des péricytes par une approche pharmacologique contre une des nouvelles cibles enzymatiques identifiées dans ce travail constitue donc une nouvelle perspective de traitement de la rétinopathie diabétique.

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ABSTRACT

One of the earliest morphological changes in retinal microvessels observed during the subclinic phase of diabetic retinopathy is the selective loss of intramural pericytes by apoptosis. The aim of this study was to test the hypothesis that Advanced Glycation End-Products (AGE) could promote pericyte apoptosis in vitro and further investigate the signaling cascade leading to cell death.

AGE (3 µM) induce pericyte apoptosis associated to an intracellular formation of diacylglycerol (DAG) and ceramide, produced after activation of phosphatidylcholine-phospholipase C coupled with acidic sphingomyelinase. High concentration of glucose (25 mM) neither affects apoptosis nor endogenous levels of both lipids. Dual inhibition of DAG and ceramide production only partially protects pericytes against apoptosis, suggesting a lipid-independent apoptotic pathway induced by AGE. Pericyte apoptosis induced by AGE also involves caspase activation. Initiator caspase-8 seems to be absent from bovine retinal pericytes. On the contrary, initiator caspase-10 (and perhaps caspase-2) is involved in the apoptotic pathway and generates DAG and ceramides. The two apoptotic signaling pathways induced by AGE seem to converge to mitochondrial permeability alteration, characterized by caspase-9 activation. This caspase most likely further activates effector caspases, such as caspase-3, involved in the execution stage of apoptosis. Oxidative stress induction in AGE-induced apoptosis has also been shown. AGE induce radical oxygen species (ROS) production and/or redox status alteration, which acts upstream of DAG/ceramide formation and sequentially to mitochondrial damage.

In conclusion, our study shows that AGE, accumulated in the basement membrane of retinal microvasculature during the long course of diabetes, can induce pericyte loss by apoptosis in vitro. Furthermore, based on the results presented we are able to propose a signaling pathway induced by AGE leading to pericyte apoptosis. Early loss of pericytes in retinal microvessels is considered to be the start point of retinopathy pathogenesis. Retardation or prevention of pericyte dropout by pharmacological intervention against one of the new targets described in this work provides new therapeutic perspective for diabetic retinopathy.

23

3

A mes parents

4

5

6

7

REMERCIEMENTS

Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au sein de l’unité de

Microangiopathie Diabétique, LIPHA-INSERM U352, co-dirigés par le professeur Michel

LAGARDE et le Docteur Nicolas WIERNSPERGER. Je leur suis tout particulièrement

reconnaissante de la confiance qu’ils ont su me témoigner en m’intégrant dans leur unité de

recherche et de l’opportunité qu’ils m’ont offerte de me former à la recherche.

Je souhaite exprimer toute ma reconnaissance et mon estime aux membres du jury:

Monsieur le Professeur Docteur José Cunha-Vaz,

Qui me fait l’honneur de juger ce travail et me fait bénéficier de sa longue expérience dans le

domaine de la rétinopathie diabétique. Qu’il me soit permis ici de lui exprimer toute ma

gratitude et ma respectueuse considération.

Monsieur le Professeur Michel LAGARDE,

Pour l’intérêt constant qu’il a porté à mes travaux, sa disponibilité et la libre discussion qu’il a

su instaurer. Je souhaite, à cette occasion, lui exprimer ma sincère reconnaissance.

Monsieur le Docteur Marc LECOMTE,

Qui a dirigé avec beaucoup d’intérêt et de sérieux ce travail de thèse. Je souhaite tout

particulièrement lui exprimer toute ma reconnaissance pour m’avoir fait bénéficier de son

expérience, de ses nombreux conseils avisés et de sa grande disponibilité, m’aidant ainsi à

faire les premiers pas dans le monde de la recherche.

Monsieur le Docteur Nicolas WIERSNPERGER,

Que je remercie chaleureusement pour sa bienveillance à mon égard et son soutient au cours

de ces quatre années. Malgré une forte attirance pour la physiologie, je lui suis reconnaissante

de l’intérêt qu’il a porté à mes travaux de biochimie (et à mes performances sportives !).

8

Monsieur le Professeur Docteur Thierry LEVADE

Je lui adresse mes profonds remerciements pour avoir accepté d’évaluer ce travail de thèse. Je

suis honorée de sa présence, ses compétences reconnues dans les domaines des lipides et de

l’apoptose exposés dans ce mémoire en font un juge pertinent. Qu’il soit assuré de ma sincère

gratitude.

Ce travail a pu être mené grâce au soutien financier de la société LIPHA. Je souhaite

remercier Mr Yves BONHOMME, Directeur du secteur Recherche et Développement du

groupe LIPHA, pour l’intérêt qu’il a porté à mes travaux et la confiance qu’il m’a accordé.

Je souhaite également exprimer tous mes sincères remerciements à tous les autres membres

de l’équipe LIPHA:

Anne-marie, pour sa fraîcheur et son empathie quotidienne.

Audrey, pour son soutient et sa bonne humeur, solides à toute épreuve. Je lui souhaite bonne

chance pour sa carrière professionnelle et pour son rôle de maman (déjà bien engagé…).

Brigitte, pour son assistance logistique, sa disponibilité et sa gentillesse.

Claire, collègue d’un temps, pour ses fou-rires inépuisables et son enseignement des

statistiques.

Corinne, pour sa force de caractère, ses conseils et sa serviabilité.

Daniel et Edouard, pour leur aide amicale et leur sympathie.

Elodie et Karen, les petites dernières, mais qui semblent «grandir» vite, vite, vite. Je leur

souhaite de sépanouir dans la recherche !

Lysiane, pour ses «petits coups de main» spontanés (petits mais utiles !) et pour sa

sympathie.

Patricia et Yann, pour leur participation très active dans la réalisation d’une partie de mes

travaux et pour le soutient et la sympathie qu’ils ont sues me manifester.

Pierre, pour sa compagnie, ses petits conseils et sa gentillesse. Je lui souhaite une belle fin de

thèse.

Samer, pour sa sympathie, l’intérêt qu’il a porté à mes travaux, et toutes ces discussions

riches en conseils et en connaissances scientifiques.

9

Mais je remercie également :

l’ensemble des membres du laboratoire de Biochimie et Pharmacologie de l’INSA, pour

l’attention et la sympathie qu’ils m’ont témoignées au cours de ces quatre années passées

parmi eux.

Je tiens tout particulièrement à remercier,

Chantal, pour son aide technique dans la purification du DHA et pour ses encouragements et

son attention particulière.

Evelyne et Catherine, pour leurs conseils précieux sur les techniques d’immunodétections

notamment, contribuant largement à la réalisation d’une partie de ce travail.

Madeleine et Madeleine, pour leur aide amicale dans l’utilisation du matériel de

radioactivité et leur disponibilité, notamment pour me faire un peu de monnaie…

Mais également:

André, Caroline, Céline, Hélène, Isabelle, Laurence, Laurent, Olivier, Patrique

Vanpedeguen, Véronique et Zuri, pour leur bonne humeur, leur gentillesse permanente et

leur soutient.

Les bouchers de l’abattoir de Corbas,

pour leur accueil matinal tout en fraîcheur, et qui ont récupéré avec précaution et efficacité

tous ces yeux de bœuf.

La société INSAVALOR,

Qui a géré l’aspect financier de ma thèse, et les personnels pour leur assistance logistique.

Richard, ma famille et mes amis,

qui ont su me soutenir et m’encourager et qui, malgré leur «incompétence scientifique» ont

manifesté de l’intérêt pour mes travaux de thèse.

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11

TABLE DES MATIERES AVANT-PROPOS………………………………………………………………….. 17

ABREVIATIONS………………………………………………………………….. 19

RESUME……………………………………………………………………...……….. 21

ABSTRACT…………………………………………………………………………… 22

INTRODUCTION…………………………………………………………………. 23

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………. 29

LA RETINOPATHIE DIABETIQUE…………………………………………….. 31 I-LE DIABETE SUCRE ET SES COMPLICATIONS……………………………………… 31

1-Le diabète insulino-dépendant (type I ou DID)…………………………….…. 31 2-Le diabète sucré non insulino-dépendant (type II ou DNID)…………………. 32 3-Les complications chroniques du diabète sucré……………….…………….… 33

II-LA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE……………….…. 33

1-Structure et fonction des microvaisseaux rétiniens………………………….… 34 2-Altérations de la structure et de la fonction des microvaisseaux rétiniens……36

2-1-Les phases cliniques de la rétinopathie diabétique…………………………. 36 2-2-Les modifications structurales et fonctionnelles au cours de la rétinopathie diabétique………………………………………………………………………... 38

2-2-1-La membrane basale……………………………………………… 38 2-2-2-Les péricytes………………………………………...……………… 38 2-2-3-Les modifications morpho-fonctionnelles de la barière hémato-rétinienne et de l’endothélium rétinien………..…………………….……39

III- LA PATHOGENESE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE………………….….…. 41

1-L’hypothèse hémodynamique……………………………………………….….. 41 2- Les hypothèses biochimiques……………………………………………….….. 42

2-1-La voie des polyols……………………………………………………… 42 2-2-L’activation de la protéine kinase C (PKC)…………………….…....…. 44

12

2-3-La voie des hexosamines……………………………………..…………. 45 2-4-La glycosylation non enzymatique……………………………………… 47

2-4-1-La formation des produits avancés de glycation……………… 47 2-4-2-Les produits avancés de glycation……………………………. 50 2-4-3-Les conséquences pathologiques de la glycation……………... 51

2-4-3-1-La glycation de la matrice extracellulaire………………. 51 2-4-3-2-La glycation des protéines circulantes et intracellulaires. 52 2-4-3-3-L’interaction des AGE avec leurs récepteurs………..…. 52

2-4-4- AGE et rétinopathie…………………………………………... 56 2-5-Le stress oxydant………………………………………………………. 58

2-5-1-Le stress oxydant dans le diabète: cause ou conséquence?…... 58 2-5-2-La production de radicaux libres…………………………….. 59 2-5-3-La modification des défenses antioxydantes…………...……... 60 2-5-4-Le stress oxydant et la rétinopathie diabétique…..……….…... 61

L’APOPTOSE……………………………………………………..………………….… 63 I-INTRODUCTION………………………………..………………………………………... 63 II-LES CARACTERISTIQUES DE L’APOPTOSE…………………………………………. 64

1-Les stigmates morphologiques………….……………………………………….. 64 2-Les stigmates biochimiques…………….……………………………………….. 65

2-1-L’externalisation de marqueurs membranaires………………….……… 66 2-2-La fragmentation de l’ADN…………………………….……………….. 66 2-3-L’atteinte mitochondriale……………………………….………………. 67

III- LES MECANISMES MOLECULAIRES DE L’APOPTOSE…………………………… 68

1-La phase d’induction: les signaux de mort..……………………………………. 69 2-De C. elegans aux mammifères…………………………………………….….… 69 3-Les caspases………………………………………………………………….…… 70

3-1-La nomenclature et les différentes classifications des caspases……….... 70 3-2-Les descriptions structurales………………………………………….…. 72 3-4-Les mécanismes d’activation des caspases……………………………… 73

3-4-1-L’autoactivation des caspases initiatrices…………………...… 73 3-4-2-La transactivation des caspases………………………………. 75

3-5-Les mécanismes de contrôle de l’activation des caspases…………..…... 76 3-5-1-La régulation par phosphorylation………………………….... 76 3-5-2-La régulation redox des caspases………………………….…. 77 3-5-4-La localisation subcellulaire des caspases………………….... 78 3-5-5-Les inhibiteurs de caspases………………………………….... 78

13

3-6-Les substrats protéolytiques des caspases………………………………. 79 3-7-L’apoptose caspase-indépendante………………………………………. 80

4-La famille de Bcl-2……………………………………………………………..… 81 4-1-Le rôle des protéines de la famille de Bcl-2…………………………….. 81 4-2-La régulation de la fonction des membres de la famille de Bcl-2….…… 83

5-Le stress oxydant……………………………………………………….…….….. 84 5-1-La formation des espèces radicalaires de l’oxygène (ROS) dans l’apoptose……………………………………………………………………. 84 5-2-La modification des défenses antioxydantes dans l’apoptose……….….. 86

6-Les céramides……………………………………………………………...…….. 86 6-1-Le métabolisme des sphingolipides…………………………………..…. 86 6-2-Les voies enzymatiques de formation des céramides dans l’apoptose….. 88 6-3-Les sites subcellulaires de la génération de céramides pro-apoptotiques.. 90 6-4- Les mécanismes de régulation des voies de synthèse des céramides dans l'apoptose : synthèse de novo et sphingomyélinases.….………………….…. 92

6-4-1-La voie de biosynthèse de novo…………………………….…. 92 6-4-2-La voie des sphingomyélinases…………….………………….. 92

6-5-Les cascades de signalisations activées par les céramides et leurs conséquences sur l’apoptose et la prolifération cellulaire……….……………94

6-5-1-Les céramides et la voie des c-jun-terminal kinases (JNK)…... 94 6-5-2-Les céramides et la mitochondrie………………………….….. 95

6-6-La régulation des niveaux endogènes des céramides: l’équilibre survie/mort cellulaire…………………………………………………….….. 96

6-6-1-La voie de la sphingosine-1-phosphate……………………….. 97 6-6-2-La sphingomyéline synthase……………………………….….. 98 6-6-3-La glucosylcéramide synthase…………………………….…... 99

MATERIEL ET METHODES……………………………………..………. 101

MATERIEL……………………………………………………………………….……..….103 I-REACTIFS………………………………………………………….……………………..103 II-APPAREILS………………………………………………………..…………….……… 104 METHODES………………………………………………………………………….……...104 I-PREPARATIONS DES AGE-METHYLGLYOXAL (AGE-MGX)…………….…...……. 104

1-Préparation d'AGE-MGX dépourvus en ions métalliques………..….…..…. 104 2-Dosage de l'acide ascorbique………………………………………..…….…… 105

14

II-CULTURE CELLULAIRE………………………………………………….…..……… 106

1-Mise en culture primaire des péricytes rétiniens de bœuf……..…..………… 106 2-Trypsination des péricytes rétiniens de bœuf………….…………...……….… 107 3-Culture des péricytes rétiniens en présence de glucose et d’AGE-MGX………………………….………………………………………..…….…..… 107 4-Culture des péricytes rétiniens en présence de divers agents pharmacologiques………………………………………………………………… 108

III-DETECTION ET QUANTIFICATION DE L'APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS…………………………………………………………………………………108

1-Marquage à l’annexine V et à l’iodure de propidium……………….…………. 108 2-Dosage ELISA des oligonucléosomes…………………………………………… 109

IV-DOSAGE DES CERAMIDES ET DES DIACYLGLYCEROLS (DAG) DANS LES PERICYTES RETINIENS…………………………………………………………………. 111

1-Extraction des lipides…………………………………………………….……… 111 2-Phosphorylation par la DAG-kinase…………………………………….……… 112

2-1- Réactifs et solutions…………………………………………………... 112 2-2- Réaction de phosphorylation………………………………………….. 113

3-Quantification des produits phosphorylés………………………………….… 113

V-DOSAGE DES PROTEINES PAR COLORATION AU NOIR AMIDE……………....… 114 VI-IMMUNODETECTION DES CASPASES ET DE RAGE SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE (WESTERN BLOTTING)…………………………………………... 114

1-Préparation des échantillons……………………………………….………….. 114 2-Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et

coloration au bleu de Coomassie……………………………………………. 115 3-Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose…….………. 116 4-Immunodétection des protéines transférées………………………….………. 116

4-1-Tampons utilisés………………………………………………….………. 116 4-2-Révélation des protéines………………………………………….………. 116 4-3-Spécificité de la reconnaissance antigénique……………………….…….. 117 4-4-Standardisation des signaux par rapport à l'actine………….……….……. 118

VI-TRAITEMENT STATISTIQUE DES RESULTATS…………………………………… 118

15

RESULTATS/DISCUSSION…………………………………………………. 119

CHAPITRE I EFFETS D'AGENTS IMPLIQUES DANS LE DIABETE (AGE ET GLUCOSE) SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS……...……. 123 I-EFFETS DES AGE-MGX SUR LES PERICYTES RETINIENS………………………… 123

1-L'apoptose des péricytes……………………………………………………….. 123 2-La production de DAG et de céramides dans les péricytes………………….. 126

II-EFFETS DU GLUCOSE SUR LES PERICYTES RETINIENS…………………………. 126 III-IMMUNODETECTION DU RECEPTEUR AUX AGE, RAGE, SUR LES PERICYTES RETINIENS………………………………………………………………………….……. 128 IV-DISCUSSION………………………………………………………………….……….. 129

CHAPITRE II IDENTIFICATION DES VOIES DE PRODUCTION DE CERAMIDES ET DE DAG INDUITES PAR LES AGE-MGX DANS LES PERICYTES RETINIENS ………………………………………………………………………………………..……. 135 I-VOIES DE PRODUCTION DES CERAMIDES ACTIVEES DANS LES PERICYTES…. 135

1-Implication d'une céramide synthase (ou sphinganine-acyl-transférase) ?… 136 2-Implication d’une sphingomyélinase acide?…………………………………... 137

II-VOIE DE PRODUCTION DES DIACYLGLYCEROLS DANS LES PERICYTES : implication d’une phosphatidylcholine-phospholipase C?………………………………… 140 III-DISCUSSION…………………………………………………………………………... 143 CHAPITRE III IMPLICATION DE CASPASES DANS L'APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS INDUITE PAR LES AGE-MGX…………………………………… 147 I-EFFETS D’INHIBITEURS PEPTIDIQUES DES CASPASES………………………...…. 147

1-Les inhibiteurs peptidiques……………………………………………….……. 148 2-Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur l'apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX…………………………………………………….…. 148

16

3-Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur la production des DAG et des céramides induite par les AGE-MGX……………………………………….……150

II-IMMUNODETECTIONS DES CASPASES-2, 8 et 10 DANS LES PERICYTES SOUMIS AUX AGE-MGX…………………………………………………………………………… 152

1-Immunodétection de la caspase-8……………………………………………… 153 2-Immunodétection de la caspase-10……………………………………………. 154 3-Immunodétection de la caspase-2……………………………………………… 157

III-DISCUSSION…………………………………………………………………………. 159 CHAPITRE IV INDUCTION D’UN STRESS OXYDANT DANS LES PERICYTES RETINIENS TRAITES PAR LES AGE-MGX…………………………………… 167 I-LES DIFFERENTES CLASSES D’ANTIOXYDANTS TESTES…………………………. 167 II-EFFETS DE LA N-ACETYL-L-CYSTEINE (NAC)………………...……………...…… 168

III-EFFETS DES AUTRES ANTIOXYDANTS SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES INDUITE PAR LES AGE-MGX………………………………………….…………………171 IV-TRAITEMENT DES AGE-MGX PAR DES CHELATEURS DE METAUX ET LEUR

EFFET SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES RETINIENS……………………………… 172

V-IMMUNODETECTION DE LA CASPASE-10 DANS LES PERICYTES CULTIVES AVEC LES AGE-MGX ET LA NAC (10 µM)………………………………………………..……. 175 VI-DISCUSSION…………………………………………………………………..………. 177

CONCLUSIONS/PERSPECTIVES……………………………………..… 183

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………….. 193

ANNEXES……………………………………..………………………………………236

17

23

INTRODUCTION

24

25

La rétinopathie diabétique représente une des complications microvasculaires les plus

invalidantes du diabète, pouvant mener à son stade ultime à la cécité. Cette maladie se

caractérise par une atteinte progressive structurale et fonctionnelle des microvaisseaux

rétiniens (artérioles, veinules et capillaires). Ces microvaisseaux sont constitués de cellules

endothéliales, du coté luminal du vaisseau et de péricytes enfouis dans la membrane basale.

La rétine est le tissu dans lequel le rapport péricytes/cellules endothéliales est le plus élevé

(1:1), mais dans la phase précoce de la maladie, ce rapport diminue, principalement à cause

de la disparition sélective des péricytes. La disparition des péricytes s’accompagne d’un

épaississement de la membrane basale, d’un dysfonctionnement de l’endothélium et de

perturbations hémodynamiques et rhéologiques, qui conduisent alors à l’apparition de

territoires rétiniens ischémiés et enfin à une néovascularisation. Il n’existe pas à ce jour de

traitement pharmacologique préventif ou curatif.

Ainsi, une des altérations caractéristiques de la rétinopathie diabétique est la disparition

précoce des péricytes. Plusieurs travaux suggèrent aujourd’hui que les péricytes disparaissent

par apoptose et non par nécrose. Trois équipes ont en effet montré ex vivo, dans des rétines

prélevées post-mortem sur des patients diabétiques de longue durée, la présence de péricytes

apoptotiques (Mizutani et al., 1996, Li W et al., 1997, Podesta et al., 2000). Mais les

mécanismes moléculaires inducteurs ainsi que les voies de signalisation intracellulaire par

lesquels ils disparaissent n’ont pas été décrits à ce jour.

La formation accélérée des produits avancés de glycation (AGE) au cours du diabète

(Baynes et al., 1989) est une des hypothèses biochimiques proposée pour expliquer

l’apparition et le développement des complications microvasculaires rétiniennes. Les AGE

s’accumulent tout au long du diabète, altérant les interactions entre les cellules et la matrice

extracellulaire et diverses fonctions protéiques. L’accumulation de produits d’Amadori

(Schalkwijk et al., 1999) et d'AGE (Stitt et al., 1997) a notamment été mise en évidence au

niveau de la membrane basale des microvaisseaux rétiniens. Les AGE sont également connus

pour interagir avec des récepteurs, comme p60, p90 (Yang et al., 1991) complexés à la

galectine-3 (Vlassara et al., 1995) ou RAGE (Schmidt et al., 1992; Neeper et al., 1992) et

induire des réponses cellulaires variées. La colocalisation des AGEs avec leur récepteur p60

(Stitt et al., 1997) et RAGE (Soulis et al., 1997) a été démontrée au niveau des

microvaisseaux rétiniens. De plus, les péricytes présentent également à leur surface

membranaire des récepteurs aux AGE, comme p60 et p90 (Chibber et al., 1997) et RAGE

(Yamagishi et al., 1995). Par ailleurs, de nombreux travaux ont mis en évidence la toxicité

des AGE sur les péricytes in vitro (Yamagishi et al., 1995; Chibber et al., 1997; Ruggiero-

26

Loppez et al., 1997) et in vivo (Hammes et al., 1991). L’ensemble de ces données suggère

ainsi une participation directe des AGE dans la disparition précoce des péricytes observée au

cours de la rétinopathie diabétique.

Au cours de cette étude, nous nous sommes tout particulièrement intéressés aux effets

des AGE-méthylglyoxal (AGE-MGX) sur les péricytes rétiniens bovins. Le méthylglyoxal est

un dicarbonyle dont la concentration sanguine est fortement augmentée chez le diabétique

(Beisswenger et al., 1999) et dont les niveaux de production sont corrélés à la sévérité des

complications microvasculaires (McLellan et al., 1994). Ce dicarbonyle peut modifier les

résidus arginine pour former de l’argpyrimidine (Shipanova et al., 1997) et des imidazolones

(Lo et al., 1994) ou des résidus lysine pour produire de la carboxyéthyllysine (CEL) (Ahmed

et al., 1997) et le dimère méthylglyoxal-lysine (MOLD) (Nagaraj et al., 1996). Les produits

avancés de glycation dérivant du méthylglyoxal ont d’ailleurs été décrits comme les

modifications chimiques majeures observées au cours du diabète (Degenhardt et al., 1998;

Shamsi et al., 1998).

L’objectif de ce travail de thèse a consisté dans un premier temps à tester l’hypothèse

que les AGE-MGX, préparés à partir d’albumine de sérum de bœuf, pouvaient induire

l’apoptose des péricytes en culture et dans l’affirmative à explorer la voie de signalisation

intracellulaire mise en jeu au cours de ce processus apoptotique, au moyen d’agents

pharmacologiques ou d’anticorps contre certaines caspases, utilisés en immunodétection.

Ce mémoire de thèse comporte trois grandes parties:

- La première partie est une étude bibliographique, qui rappelle d’abord les connaissances

actuelles sur la rétinopathie diabétique et les différents mécanismes pathogéniques proposés

pour expliquer cette complication microvasculaire du diabète. Un second chapitre portant

sur l’apoptose a également été développé, afin d’en décrire les modifications

morphologiques et biochimiques caractéristiques.

- La seconde partie décrit le matériel et les méthodes employés au cours du travail

expérimental.

- La troisième partie expose l’ensemble des résultats obtenus et la discussion. Elle contient

quatre chapitres:

- Les effets d’agents impliqués dans le diabète (AGE et glucose) sur l’apoptose

des péricytes et la formation intracellulaire de DAG et de céramides.

- L’identification des voies de production des DAG et de ceramides activées en

réponse aux AGE- MGX dans les péricytes rétiniens.

27

- L’implication de caspases dans l’apoptose des péricytes induite par les AGE-

MGX.

- L’induction d’un stress oxydant dans les péricytes rétiniens traités par les AGE-

MGX

28

29

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

30

31

CHAPITRE I

I-LE DIABETE SUCRE ET SES COMPLICATIONS

Connu dès l’Antiquité égyptienne et gréco-romaine, le diabète doit son nom à la perte

urinaire excessive qui le caractérise sur le plan clinique, celle-ci étant accompagnée d’une soif

intense. Le diabète sucré est caractérisé par une élévation permanente de la glycémie et la

présence de sucre dans les urines. La classification internationale du diabète sucré et des

anomalies de la tolérance au glucose se fonde sur des caractéristiques cliniques,

correspondant à deux mécanismes pathogéniques différents. Le diabète sucré est ainsi

subdivisé en diabète insulino-dépendant (dit de type I) ou non insulino-dépendant (dit de type

II), selon la nécessité vitale de recours à l’apport d’insuline, présente dans le premier type,

absente dans le second. L’insuline, hormone hypoglycémiante, est sécrétée par les cellules β

des îlots de Langerhans du pancréas. Elle stimule l’absorption du glucose sanguin par les

tissus dits insulino-dépendants (le foie, le muscle squelettique et le tissu adipeux) et son

stockage sous forme de glycogène (glycogenèse). Dans le foie, l’insuline inhibe également les

voies métaboliques de la production de glucose (la néoglucogénèse et la glycogénolyse).

1-Le diabète insulino-dépendant (type I ou DID)

Atteignant dans la plupart des cas l’enfant et l’adulte jeune, le diabète sucré de type I

(également nommé diabète juvénile) est lié au développement d’une auto-immunité la

(présence d’anticorps plasmatiques dirigés contre les cellules d’îlots) responsable de la

destruction des cellules β insulino-sécrétrices des îlots de Langerhans pancréatiques. Il

entraîne donc une carence absolue et définitive en insuline. Il représente environ 10% des cas

de diabète sucré dans les pays occidentaux.

Le rôle de facteurs environnementaux dans la pathogenèse du diabète de type I a été

suggéré depuis longtemps. Les principaux facteurs incriminés, identifiés à partir

d’observations épidémiologiques, seraient des composants alimentaires, tels que des

composés riches en nitrosamines (Dahlquist, 1998) et une alimentation lactée (lait de vache)

(Knip et Akerblom, 1999) ou des infections virales (virus du groupe des entérovirus, comme

coxsakie B) (Viskari et al., 2000).

LA RETINOPATHIE DIABETIQUE

32

Le traitement thérapeutique du diabète de type I consiste en des injections journalières

d'insuline, associées à un régime alimentaire finement contrôlé en glucose et en amidon.

2-Le diabète sucré non insulino-dépendant (type II ou DNID)

Cette forme clinique du diabète sucré est de loin la plus fréquente dans les pays

développés (plus de 80% des diabétiques) et atteindrait plus de 2 % de la population

mondiale. L’installation du diabète de type II est généralement insidieuse. Le DNID survient

majoritairement après 40 ans chez les sujets obèses et sa prévalence augmente avec l’âge. De

ce fait, il porte également le nom de «diabète gras» ou «diabète mature». Si les processus

physiopathologiques impliqués dans la maladie sont de mieux en mieux connus, ses causes

initiales restent mal définies. Deux grands mécanismes participent à l’hyperglycémie :

1-Une résistance du foie, des tissus musculaires et adipeux à l’action de l’insuline

(l’insulinorésistance) : le défaut de la sensibilité à l’insuline fait intervenir d'une part une

réduction du nombre des récepteurs à l’insuline associée à une altération des mécanismes

cellulaires en aval du récepteur et d'autre part une réduction du nombre des transporteurs

membranaires, dépendants de l’insuline, permettant l’entrée cellulaire du glucose et des corps

gras. Il en résulte une diminution du métabolisme du glucose par le foie, le muscle et le tissu

adipeux et une augmentation des niveaux lipidiques circulants (triglycérides, acides gras

libres). Le diabète sucré de type II est souvent associé à l’excès de poids. La surcharge en

masse grasse de l’organisme majore la résistance à l’action de l’insuline et favorise ainsi

l’éclosion du diabète sucré. Le surpoids apparaît cependant plus comme un facteur précipitant

la révélation du diabète qu’un facteur étiologique direct.

2-Une anomalie de la sécrétion d’insuline (a) en valeur absolue ou (b) relative aux

besoins: les phases précoces du diabète de type II sont en effet caractérisées par une

hyperinsulinémie et une hyperglycémie mais la sécrétion est inadéquate et insuffisante en

regard des besoins accrus en insuline générés par l'insulinorésistance périphérique. Au cours

de l’évolution de la maladie, une baisse progressive de la phase sécrétoire est observée,

résultant d'une baisse de la sensibilité des cellules β au stimulus glucosé associée à une perte

en masse de ces cellules par apoptose, induite par l’hyperglycémie (Kaneto et al., 1996) et

l’hyperlipidémie (Shimabukuro et al., 1998a). On parle ainsi aujourd’hui de glucotoxicité et

lipotoxicité. Le patient atteint de DNID présente alors une hyperglycémie à jeun.

Cette maladie est généralement traitée par une réduction de la charge pondérale (régime

alimentaire et exercice physique), associée ou non à la prise d’anti-diabétiques oraux, comme

les biguanides et des thiazolidinediones qui sensibilisent à l’action de l’insuline, améliorant

33

l'insulinorésistance, et/ou des sulfonylnurées et des glinides qui stimulent la sécrétion

d'insuline.

3- Les complications chroniques du diabète sucré

Si les complications aiguës métaboliques (comme l’hypoglycémie) se raréfient grâce à

la meilleure prise en charge, à l’éducation et à l’auto-surveillance des diabétiques, les

complications chroniques demeurent le lourd tribut du diabète sucré au long cours. La

normalisation insuffisante et inconstante de la glycémie par les traitements médicamenteux en

constitue la cause principale. De plus, le caractère quasi asymptomatique de l’hyperglycémie

modérée au long cours favorise sa négligence et expose largement à la survenue des

complications. Les complications dégénératives du diabète sucré sont classiquement divisées

en deux groupes principaux: la macroangiopathie (maladie des gros vaisseaux), la

microangiopathie (maladie des petits vaisseaux).

La macroangiopathie désigne, d’une manière générale, l’ensemble des lésions

artérielles allant de l’altération discrète de l’intima à l’obstruction complète de certains

vaisseaux, entraînant une ischémie du territoire périphérique correspondant. Chez le sujet

diabétique, elle se traduit principalement par une athérosclérose accélérée.

La microangiopathie consiste en des lésions des petits vaisseaux de l’organisme

(artérioles, veinules et capillaires) de diamètre inférieur à trente microns. Elle se caractérise

par des anomalies structurales, telles qu’un épaississement de la membrane basale des

microvaisseaux, et des anomalies fonctionnelles comme une augmentation de la perméabilité

qui s’accompagne d’une fuite de protéines plasmatiques. Ces lésions microvasculaires sont

retrouvées, à des degrés variables, au niveau de divers tissus et organes mais leur expression

clinique est seulement manifeste au niveau rénal (néphropathie), neuronal (neuropathie) et

rétinien (rétinopathie)

II-LA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE

La rétinopathie diabétique, localisation oculaire de la microangiopathie diabétique,

constitue la première cause de cécité acquise dans les populations en âge de travailler (20-70

ans), la dégénérescence maculaire étant la première cause chez les personnes âgées (> à 70

ans).

34

1-Structure et fonction des microvaisseaux rétiniens

Localisée à l’intérieur du globe oculaire, postérieure à la cornée, entre l’endothélium

pigmentaire et l'humeur vitrée, la rétine neuronale comporte (Figure 1):

- un étage de réception formé par les cellules photoréceptrices: cônes et bâtonnets

- un étage de transmission représenté par les cellules bipolaires et ganglionnaires

La partie neuronale de la rétine est séparée du lit vasculaire choroïdien par l'épithélium

pigmentaire, et du vitré par une membrane nommée limitante interne. Deux étages de cellules

impliquées dans la transmission des signaux nerveux sont visibles: les cellules de la nucléaire

externe qui transmettent le signal juste après la photoréception, et les cellules bipolaires

situées entre les cellules de la nucléaire externe et les cellules ganglionnaires qui envoient le

signal au niveau du nerf optique.

Figure 1: représentation schématique d’une coupe transverse de la rétine humaine

L'apport de substrats métaboliques et d'oxygène par le sang dans la rétine est assuré

par la présence d'un lit microvasculaire inégalement réparti dans deux régions,

majoritairement à la surface de la rétine mais également enfouis dans la couche de cellules

bipolaires (Figure 1). Les microvaisseaux rétiniens sont constitués de deux types cellulaires,

les cellules endothéliales formant une monocouche sur la membrane basale du coté luminal

du microvaisseau, et les péricytes enfouis dans la membrane basale (Figure 2). La rétine est le

Lit vasculaire choroïdien

Epithélium pigmentaire

Photorécepteurs

Limitante externe

Limitante interne

Cellules ganglionnaires

Plexiforme interne

Nucléaire interne(cellules bipolaires)

Plexiforme externe

Nucléaire externe

Étage de transmission

Étage de réception

Lit microvasculaire rétinien:

veinuleartèriole

capillaires

35

tissu où le rapport entre les cellules endothéliales et les péricytes est le plus élevé (1:1) chez

l’Homme (Speiser et al., 1968).

Figure 2: Coupe transversale d'un capillaire rétinien

Les cellules endothéliales participent à la formation et à la fonction de la barrière

hémato-rétinienne (BHR), également constituée des péricytes et des cellules neuronales

(cellules de Müller). La BHR, rendue étanche par l’existence de jonctions serrées entourant

les cellules de l’endothélium et par le contact avec les cellules de Müller et les péricytes,

contrôle les échanges entre le sang et les espaces extra-vasculaires par voie transcellulaire

sélective active. Les cellules endothéliales participent également à la régulation de

phénomènes physiologiques. Elles jouent en effet un rôle important dans la régulation du

tonus vasculaire en sécrétant des agents vaso-dilatateurs comme la prostaglandine PGI2

(Moncada et al., 1976) et le monoxyde d’azote (NO) (Furchgott, 1966), ainsi que des vaso-

constricteurs tels que les endothélines (endothéline-1, -2,-3) (Yanagisawa et al., 1988) et les

prostaglandines PGH2 et TxA2 (Moncada et Vane, 1978). Les cellules endothéliales

interviennent également dans la régulation de la fibrinolyse en produisant l’activateur du

plasminogène tissulaire (tPA) et l'inhibiteur-1 de l'activateur de plasminogène (PAI-1) (Grant

et Guay, 1991). Enfin, elles constituent le lieu de synthèse de facteurs de croissance (Brooks

et al., 1991) ou de constituants protéiques de la membrane basale, tels que la fibronectine, le

collagène IV ou la laminine (Mandarino et al., 1993).

Les péricytes, nommés également cellules murales, par leur localisation, semblent jouer

un rôle dans l’intégrité et la fonction de la paroi capillaire. Les péricytes pourraient avoir une

activité contractile et moduler le tonus microvasculaire (Kelley et al., 1987), de façon

similaire aux cellules musculaires lisses dont ils dériveraient. Comme les cellules

Cellulesendothéliales

Péricyte Membrane basale

.

36

endothéliales, ils synthétisent des constituants de la membrane basale (Mandarino et al.,

1993), ils participent à la régulation du tonus vasculaire en produisant par exemple des

prostacyclines, vasodilatatrices, (Hudes et al., 1988) et interviennent également dans le

contrôle de l'hémostase en sécrétant la trombospondine, molécule d'adhésion des plaquettes à

l'endothélium, et le PAI-1 (Canfield et al., 1989). Malgré leur localisation à l'intérieur de la

membrane basale, les péricytes émettent des prolongements cytoplasmiques permettant des

contacts directs avec les cellules endothéliales par des jonctions gap, des molécules

d'adhésion ou la sécrétion de facteurs solubles, mais ils interagissent probablement aussi avec

les cellules de la rétine neuronale (Ruggiero et al., 1997). Ils joueraient ainsi un rôle

important dans la régulation du métabolisme des cellules endothéliales. Il a été montré in

vitro que les péricytes réduisent la croissance des cellules endothéliales (Orlidge et D’amore,

1987), stimulent leur synthèse de prostaglandines (PGI2) ou les protègent contre le stress

oxydant (Yamagishi et al., 1993), et contrôleraient également leur prolifération en activant le

TGF-� (Transforming Growth Factor-�) (Antonelli-Orlidge et al., 1989).

2-Altérations de la structure et de la fonction des microvaisseaux

rétiniens

L’atteinte micro-circulatoire survenant au cours de la rétinopathie diabétique est

probablement multifactorielle. Plusieurs mécanismes intriqués, résultant de facteurs généraux

et locaux jouent un rôle dans la genèse et l’évolution de la microangiopathie rétinienne.

2-1-Les phases cliniques de la rétinopathie diabétique

Bien que l’expression clinique de la rétinopathie diabétique varie temporellement d’un

malade à l’autre, trois phases d’atteinte distinctes ont pu être définies (Figure 3):

La phase non-proliférante, préclinique : Les premières modifications structurales des

microvaisseaux rétiniens, observées au cours du diabète, sont un épaississement de la

membrane basale (Ashton, 1974), une disparition sélective (parce que seule visible ?) des

péricytes (Cogan et al., 1961) et une altération des cellules endothéliales, comme leur

prolifération (Engerman et al., 1967). Certains microvaisseaux voient même la disparition des

péricytes et des cellules endothéliales par apoptose entraînant l’apparition de capillaires

acellulaires (Engerman, 1989; Mizutani et al., 1996). Il en résulte une baisse de la résistance

mécanique de la paroi vasculaire favorisant la formation de microanévrismes, qui peuvent

générer des microhémorragies. Ces lésions structurales induisent d’autre part un défaut de la

37

barrière hémato-rétinienne (BHR), qui se caractérise par une hyper-perméabilité. Il en résulte

une transsudation des liquides intravasculaires (oedèmes) et d’exsudats lipidiques.

L’augmentation du flux sanguin et de la pression vasculaire, associés aux défauts

structuraux de la paroi, contribuent largement à la formation des microanévrismes et à

l’apparition de petites hémorragies et accentuent également l'hyper-perméabilité au niveau de

la BHR. La viscosité des constituants sanguins (hyperagrégabilité des plaquettes, baisse de la

fibrinolyse) se trouve également augmentée favorisant la formation de microthrombi,

probablement au niveau des capillaires acellulaires. Ces phénomènes contribuent ainsi à

l'occlusion des capillaires et la non-perfusion de territoires rétiniens (Lorenzi et Gerhardinger,

2001).

Figure 3: Les phases cliniques du développement de la rétinopathie diabétique

Épaississement de la membrane basale

Disparition des péricytes

Altération des cellules endothéliales

Atteintes de l’hémodynamique rétinienne:

- flux sanguin

- pression vasculaire

ANOMALIES STRUCTURALES ANOMALIES FONCTIONNELLES

Hyperglycémie

- viscosité-agrégation plaquettaire

Hypoxie

Libération de facteurs de croissanceNéovascularisation

Cécité

Capillaires acellulaires

Défauts de la barrière hémato-rétinienne

Formation de microanévrismes

Hémorragies en pointExsudats lipidiques

OedèmeOcclusion des capillaires

Phase non-proliférante

Phase préproliférante

Phase proliférante

Atteintes de l’hémostase:

Microvaisseaux rétiniens

38

La phase pré-proliférante: Les altérations structurales et fonctionnelles conduisent à

l’occlusion des capillaires rétiniens et/ou la formation d’exsudats menant à l’œdème rétinien.

L’ensemble de ces modifications coopèrent pour induire une non-perfusion des capillaires

avec une ischémie.

La phase proliférante: L’ischémie résultante stimule l’extravasation et la prolifération

des cellules endothéliales par la production locale de facteurs de croissance dans les régions

ischémiées, en particulier le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (Aiello et al.,

1994), aboutissant à la formation de néovaisseaux intrarétiniens. Le développement d’une

néovascularisation proliférante avec des néovaisseaux fragiles entraîne les conséquences les

plus graves pour la vision par des décollements de la rétine, des hémorragies dans le vitré, qui

peuvent mener à la cécité (Frank et al., 1995).

2-2-Les modifications structurales et fonctionnelles au cours de la

rétinopathie diabétique.

La composition cellulaire, la structure et la fonction des microvaisseaux rétiniens sont

fortement altérés au cours de la rétinopathie diabétique.

2-2-1-La membrane basale

La première manifestation histologique visible de la rétinopathie consiste en un

épaississement de la membrane basale (Ashton et al., 1974), résultant de l’augmentation de la

synthèse de ses composants protéiques. En effet, en comparaison avec des sujets sains, des

diabétiques montrent une augmentation des niveaux des transcrits du collagène IV (Roy et al.,

1994), composant structural essentiel de la membrane basale, et de la fibronectine (Roy et al.,

1996), composé protéique localisé tout particulièrement au niveau des zones de contacts entre

les deux types cellulaires. L’augmentation de l’expression de ces protéines pourrait être

induite par l’hyperglycémie (Cagliero et al., 1991b). Mais l’épaississement de la membrane

basale résulterait également de la formation et de l’accumulation d’AGE, qui lui confèrent

une résistance aux protéases (Mott et al., 1997) et limitent ainsi la protéolyse.

2-2-2-Les péricytes

Une des altérations caractéristiques de la rétinopathie, concomitante à l’épaississement

de la membrane basale, est la disparition précoce des péricytes, abaissant le rapport

39

numérique péricytes/cellules endothéliales de 1 à 0,3 et même à 0,1 pour les stades ultimes de

la maladie chez l’Homme (Cogan et al., 1961). Des travaux récents réalisés à partir de rétines

humaines prélevées post-mortem chez des patients diabétiques de longue durée ont permis de

proposer que les péricytes mourraient par apoptose, également nommée mort cellulaire

programmée. La détection des péricytes apoptotiques a été effectuée in situ sur les rétines

entières par la méthode TUNEL (terminal UDP nick end labelling), qui consiste à marquer les

fragments d’ADN résultant d’un clivage internucléosomal (Mizutani et al., 1996). Une autre

équipe, après purification des péricytes de rétines de patients diabétiques, a montré par la

technique de la RT-PCR une augmentation de l’expression du gène d’une protéase impliquée

dans l’apoptose, la caspase-3 ou CCP32 (Cystéine Proteases Protein 32 kDa) (Li W et al.,

1999). Venant à l’appui de ces données, une étude récente sur des péricytes rétiniens de

diabétiques décrit la surproduction de la protéine Bax, une protéine pro-apoptotique

appartenant à la famille des Bcl-2 (Podesta et al., 2000).

2-2-3-Les modifications morpho-fonctionnelles de la barrière hémato-

rétinienne et de l’endothélium rétinien

Au cours du diabète, les propriétés de la barrière hémato-rétinienne, constituée des trois

types cellulaires (cellules endothéliales, péricytes et cellules de Müller), est affectée. Le

passage trans-cellulaire de solutés et de protéines plasmatiques serait en effet augmenté par

un accroissement de l’endocytose des cellules endothéliales (Gardiner et al., 1995) et de la

transcytose de constituants plasmatiques (Stitt et al., 2000a et b). L’augmentation du transport

trans-endothélial semble impliquer les cavéoles, microdomaines membranaires capables de

s’invaginer et de former des vacuoles intracellulaires (Stitt et al., 2000a). Ce processus

d’internalisation a été décrit comme stimulé par le facteur de perméabilité VPF (vascular

permeability factor)/VEGF (Feng et al., 1999), augmenté dans la rétine de patients

diabétiques au cours de la phase précoce de la maladie (Mathews et al., 1997). D’autre part,

le passage para-cellulaire de solutés serait également modifié, du fait d’une altération de la

morphologie et de la perméabilité des jonctions serrées. Parmi les différents composants

protéiques, l’occludine et ZO-1 et ZO-2 représentent des protéines essentielles dans la

fonction de la BHR L’occludine est une protéine transmembranaire reliée aux plaques

protéiques cytosoliques de ZO-1 et ZO-2 (Zonula Occluden), elles-mêmes connectées aux

filaments d’actine (Fanning et al., 1999). Le rôle des cellules neuronales dans la perméabilité

de la BHR a été montré. Elles participent notamment à la synthèse des protéines des jonctions

serrées, telles que la ZO-1 (Gardner et al., 1997). La diminution de l’expression de

40

l’occludine, observée dans la rétine des rats diabétiques (Antonetti et al., 1998), pourrait être

liée à la disparition par apoptose des cellules neuronales (Barber et al., 1998).

L’endothélium microvasculaire rétinien présente également des dysfonctions au cours

du diabète, favorisant l’occlusion des microvaisseaux et l’hypoxie des tissus. La production et

la sécrétion de différents facteurs sont en effet modifiés, favorisant alors des troubles de

l’hémostase. Par exemple, une diminution de l’activité fibrinolytique est observée dans les

microvaisseaux rétiniens de diabétiques de type II (Walmsley et al., 1991), liée à une baisse

de l’expression de tPA (Lutty et al., 1991) et d’une hausse de celle de PAI-1 (Cagliero et al.,

1991a et 1991b), et résulte en l’accumulation de fibrine. D’autre part, une augmentation de

l’agrégation plaquettaire est également observée dans les capillaires de rétines de rats

diabétiques (Ishibashi et al., 1981). La modification de la charge électrostatique de surface

des cellules endothéliales, consistant en une baisse de la charge nette négative (Raz et al.,

1988), favoriserait l’adhésion des cellules circulantes et l’occlusion des microvaisseaux.

Enfin, l’expression de ligands pour les molécules d’adhésion est augmentée. Il a été ainsi

montré que des molécules d’adhésion des cellules endothéliales (ICAM-1, molécule-1

d’adhésion intercellulaire des leucocytes et P-sélectine) (McLeod et al., 1995) et des

neutrophiles (intégrines) (Barouch et al., 2000) sont surexprimées dans la rétine de patients

diabétiques.

L’ensemble de ces phénomènes coopère pour la formation de microthrombi (fibrine-

plaquettes, entourées de leucocytes et d’érythrocytes), dont la prévalence augmente avec la

durée du diabète (Boeri et al., 2001). Ces auteurs ont également montré la colocalisation des

microthrombi et de cellules endothéliales apoptotiques. Ils suggèrent une coopération

mutuelle entre les phénomènes de thrombose et d’apoptose. Alors que l’agrégation

plaquettaire peut induire des dommages à l’endothélium par des phénomènes

d’ischémie/reperfusion, les cellules endothéliales apoptotiques peuvent devenir pro-

coagulantes (Bombeli et al, 1997), hyper-adhésives (Hébert et al, 1998) et contribuer ainsi à

la formation des microthrombi. L’administration d’aspirine, anti-agrégant et anti-

inflammatoire, à des chiens diabétiques a permis de réduire les microhémorragies et la

formation des capillaires acellulaires, suggérant une relation causale de la formation de

microthrombi pour les dysfonctionnements vasculaires (Kern et Engerman, 2001).

41

III- LA PATHOGENESE DE LA RETINOPATHIE DIABETIQUE

Il est aujourd’hui admis que l’hyperglycémie est le facteur initial essentiel menant aux

complications microvasculaires liées au diabète. Le rôle du contrôle de l’hyperglycémie dans

l’apparition et le développement des complications microvasculaires du diabète, notamment

au niveau rétinien, a en effet été clairement établi par des études épidémiologiques menées

aux USA (DCCT, 1993) et en Europe (UKPDS, 1998).

Les mécanismes de la toxicité du glucose au niveau des tissus cibles des complications

du diabète sont multiples. Différents mécanismes pathogéniques ont pu être proposés pour

expliquer les altérations de la fonction et de la structure des microvaisseaux rétiniens au cours

du diabète. Un des mécanismes, appelé hypothèse hémodynamique, est lié à la physiologie de

la microcirculation et au flux sanguin. Cinq hypothèses biochimiques distinctes ont également

été proposées pour expliquer les effets toxiques du glucose sur la paroi vasculaire. Trois

concernent des modifications aiguës et répétées de flux métaboliques (l’activation de la voie

des polyols, de la protéine kinase C et des hexosamines) alors que les deux autres concernent

des changements cumulatifs et chroniques (augmentation de la glycosylation non

enzymatique et l’apparition d'un stress oxydant).

1-L’hypothèse hémodynamique

Plusieurs auteurs suggèrent que les modifications structurales microvasculaires

observées très tôt au cours du diabète ont pour origine des perturbations hémodynamiques.

L’hyperglycémie induirait en effet une perte de l’autorégulation rétinienne du flux sanguin

associée à une hyper-perméabilité de la paroi microvasculaire (Porta, 1996).

Au cours du développement de la rétinopathie diabétique, la perte de la régulation du

tonus vasculaire a été mise en évidence, se caractérisant par l’augmentation de la pression et

du flux sanguin et la vasodilatation chronique des microvaisseaux. Ce stress hémodynamique

engendrerait une réponse adaptative de la paroi vasculaire et progressivement un

épaississement de la membrane basale. L’hyperperfusion des microvaisseaux provoque en

effet une augmentation de la pression hydrostatique au niveau de l’endothélium avec pour

conséquence une surproduction des protéines de la matrice. Riser (Riser et al., 1992) a pu

montrer, in vitro, l’induction de l’expression des ARNm des protéines de la matrice

extracellulaire lors d’une distension des capillaires.

L’épaississement de la membrane basale, associé à l’hypertension, induirait l’altération

de la BHR associée à une hyperperméabilité des microvaisseaux (Dosso et al., 1999). Celle-ci

42

se caractérise par un passage à travers l’endothélium de macromolécules circulantes,

induisant l’apparition d‘exudats, un des principaux signes cliniques de la rétinopathie

diabétique (Porta, 1996).

2- Les hypothèses biochimiques

2-1-La voie des polyols

Dans les tissus non insulino-indépendants, tels que le cerveau ou la rétine, l’absorption

du glucose est directement proportionnelle à la concentration sanguine en glucose et est donc

plus élevée au cours du diabète. Les voies de métabolisme du glucose (la glycolyse et la voie

des pentoses phosphates) ne suffisent pas à réduire la concentration intracellulaire accrue en

glucose. Le métabolisme du glucose excédentaire est alors pris en charge par la voie des

polyols, qui fait intervenir séquentiellement l’aldose réductase et la sorbitol déshydrogénase.

L’aldose réductase, activée uniquement en présence de fortes concentrations de glucose (Km:

70 mM), réduit le glucose en sorbitol, le donneur d’hydrogène étant le NADPH. La sorbitol

déshydrogénase oxyde par la suite une partie du sorbitol formé en fructose en utilisant le

NAD+ comme cofacteur (Figure 4).

Figure 4: la voie des polyols

Les conséquences biochimiques de l’activation de cette voie de métabolisme sont une

accumulation de sorbitol et de fructose ainsi qu’une modification des rapports

NADPH/NADP+ et NAD+/NADH.

1)- Le sorbitol ne diffuse pas à travers la membrane. Son accumulation induit ainsi un

stress osmotique. L’hyperosmolarité provoque la baisse de l’entrée dans les cellules

d'osmolytes physiologiques dont le myo-inositol. Le défaut en myo-inositol entrave le

métabolisme des phosphoinositides, la production de diacylglycérol (DAG), formé à partir de

ces phosphoinositides, et d’inositol triphosphate (Li et al., 1990). La baisse des DAG induit

alors un défaut d’activation de la PKC et de la Na-K ATPase (Greene et al., 1987).

Glucose Sorbitol Fructose Aldose réductase Sorbitol déshydrogénase

NADPH NADP+ NAD+ NADH

43

2)- L’augmentation de la production de fructose pourrait pour sa part, avoir une

conséquence néfaste sur la glycation non-enzymatique de protéines intracellulaires. Le

fructose présente en effet un pouvoir glyquant supérieur au glucose, du fait d’une proportion

de la forme linéaire ouverte plus grande (Suarez et al., 1988).

3)- L’activation de la voie des polyols induit également une altération du potentiel

redox des cellules. La formation de sorbitol s’accompagne d’une baisse des ressources en

NADPH au détriment d’autres réactions qui nécessitent également ce cofacteur. Par exemple,

la glutathion réductase requiert des niveaux élevés de NADPH pour réduire le glutathion

oxydé (GSSG) et restaurer ainsi les niveaux endogènes de glutathion réduit (GSH). La

diminution en NADPH entrave le cycle redox de régénération de GSH et aboutit ainsi à la

génération d’un stress oxydant (Bravi et al., 1997). D’autre part, la baisse en NADPH peut

également limiter d’autres réactions enzymatiques, comme la formation de NO par la NO

synthase (Cameron and Cotter, 1992), conduisant ainsi à une déficience de la production de

NO, observée chez le patient diabétique (Calver et al., 1992).

4)- L’épuisement en NAD+, résultant de l’oxydation du sorbitol en fructose, peut d’autre

part réduire l'activité d'enzymes dépendants de NAD+. Par exemple, l'altération de la

glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDHase) induirait une accumulation du

glycéraldéhyde-3-phosphate et une orientation de son métabolisme vers la synthèse de novo

des diacylglycérols (Figure 5) (Wolf et al., 1991). L’activation de la voie des polyols en

réponse à une hyperglycémie pourrait en fait induire deux effets opposés sur l’activation de la

PKC. La diminution en myo-inositol entraîne en effet une baisse en phosphoinositides et par

conséquent une baisse des DAG, alors que la biosynthèse de novo des DAG peut être

stimulée en conséquence de l’altération du rapport NADH/NAD+.

La présence de l’aldose réductase a été mise en évidence dans de nombreux tissus, tels

que les nerfs, le cristallin, le glomérule rénal et la rétine. Au niveau rétinien, cet enzyme est

présente aussi bien dans les péricytes que les cellules endothéliales, bien que son expression

semble mineure dans les cellules endothéliales (Kennedy et al., 1983). Dans le contexte du

diabète, une augmentation de la production des polyols au niveau rétinien a été montré aussi

bien chez des patients diabétiques (Bravi et al., 1997) que chez des rats diabétiques

(Tomlinson, 1993). Les inhibiteurs de l’aldose réductase (comme le sorbinil, le tolrestat,

l’épalrestat ou le polnarestat) ont été développés dans l’hypothèse que le métabolisme du

glucose par cette voie induirait une baisse des complications vasculaires. Toutefois, alors que

les traitements d’animaux diabétiques avec ces inhibiteurs préviennent certaines

complications microvasculaires (Suarez et al., 1988), les rares études cliniques menées chez

44

l’Homme ont présenté des résultats controversés (Hotta et al., 1990; Sorbinil Retinopathy

Trial Research Group, 1990).

2-2-L’activation de protéines kinases C (PKC)

Un second mécanisme pathogénique proposé dans le développement des complications

microvasculaires du diabète est l’activation de protéines kinases C (PKC), résultant de la

modification des taux de diacylglycérol (DAG) (Idris et al., 2001). Parmi les douze isoformes

décrites de PKC, seules trois semblent être activées par les DAG dans la rétine, les PKC-α, ε

et βII (Koya et King, 1998), cette dernière serait plus particulièrement impliquée lors du

diabète (Inoguchi et al., 1992). L’augmentation des DAG, observée dans divers tissus,

notamment la rétine (Inoguchi et al., 1992; Shiba et al., 1993) résulte majoritairement de la

stimulation de la voie de biosynthèse de novo à partir des trioses phosphates. L’accumulation

de ces intermédiaires provient en effet de l’activation de la voie de la glycolyse, pouvant être

associée à une diminution de leur métabolisme vers le pyruvate du fait d’une altération de

l’activité GAPDHase, dépendante du cofacteur NAD+ (Figure 5).

Figure 5: L’activation des PKC

Les conséquences de cette activation dans les complications microvasculaires

rétiniennes sont multiples. La phospholipase A2 (PLA2) est activée et libère de l’acide

arachidonique (AA) et de la prostaglandine E2 (PGE2), ayant pour conséquence l’inhibition de

la pompe Na/K ATPase (Kowluru et al., 1998). L’AA libéré pourrait également agir en

synergie avec les DAG pour l’activation de PKC (Lu et al., 2000). La phosphorylation de

protéines de structure, comme l’actine et la vinculine (Schliwa et al., 1984), et de protéines

DAG PKC

Biosynthèsede novo

PA

DAG: diacylglycérolDHAP: dihydroxyacétone phosphateGAP: glycéraldéhyde-3-phosphateGADPHase: GAP déshydrogénaseG3P:glycérol-3-phosphatePA: phosphatidate

triose-phosphate

Glycolyse

Glucose

NADH/NAD+

Pyruvate

(GAP)G3PDHAP

(+) Transduction d’un signal

GADPHase

45

des jonctions serrées, comme l’occludine et ZO-1 (Antonetti et al., 1999), causerait une

réorganisation du cytosquelette, associée à un désassemblage des jonctions intercellulaires

aboutissant à une hyper-perméabilité vasculaire des microvaisseaux rétiniens. La voie de la

PKC participerait également aux dysfonctionnements de l’endothélium rétinien. Une

augmentation de l’expression de l’endothéline-1, vasoconstrictrice, (Park et al., 2000) ainsi

qu’une inhibition constitutive de la NO synthase (Chakravarthy et al., 1998) ont en effet été

associées à l’activation de PKC.

L’implication de la voie de l’activation de la PKC dans le développement des

complications diabétiques, notamment la rétinopathie, est suggérée par les travaux de l’équipe

de King où l’administration à des rats diabétiques d’un inhibiteur spécifique de la PKC-βII

(LY 3333531) normalise les dysfonctionnements vasculaires rétiniens (Ishii et al., 1996).

D’autre part, l’utilisation de vitamine E, prévenant l’accumulation de DAG par l’activation de

la DAG-kinase (Lee et al., 1999), améliore également le flux sanguin microvasculaire rétinien

et la perfusion rétinienne (Bursell et al., 1999).

2-3-La voie des hexosamines

Une nouvelle hypothèse biochimique est formulée pour rendre compte de la

glucotoxicité vasculaire dans le développement des complications liées au diabète.

L’hyperglycémie génèrerait une augmentation du flux du glucose dans la voie des

hexosamines, qui consiste en la conversion du glucose en UDP-N-acétylglucosamine.

L’augmentation de la concentration intracellulaire en glucose induit la formation accrue de

fructose-6P qui est alors métabolisé en glucosamine-6P en présence de glutamine, par

l’enzyme glucosamine:fructose amidotransférase (GFAT) puis transformé finalement en

UDP-N-acétylglucosamine (UDP-GlcNac) (Figure 6) (pour revue: Schleicher et Weigert,

2000). L’accumulation de l’intermédiaire métabolique, le fructose-6P, résulterait d’une

altération de l’activité GAPDHase, par une production mitochondriale de ROS (Du X.L. et

al., 2000) et/ou d’une baisse du rapport NAD+/NADH par la voie des polyols (Chapitre III-2-

1-). La GFAT, enzyme dont l’activité est limitante dans la voie des hexosamines, est présente

dans une variété de types cellulaires, tels que les cellules endothéliales microvasculaires (Wu

et al., 2001), les adipocytes, les cellules musculaires squelettiques, les cellules mésangiales et

glomérulaires (Nerlich et al., 1998).

46

Figure 6: La voie des hexosamines et conséquences

L’activation de la voie des hexosamines a été impliquée dans diverses altérations

biochimiques. La formation de UDP-GlcNac aurait comme conséquence l’activation du

facteur de transcription Sp-1 (Du X.L. et al., 2000), en augmentant sa O-glycosylation et

réduisant sa phosphorylation (Kadonaga et al., 1988; Haltiwanger et al., 1998). Dans des

cellules endothéliales d’aorte de bœuf, il a été décrit que l’activation de Sp-1 induit

l’expression des cytokines TGF-β1 et PAI-1 (Du X.L. et al., 2000). Une étude menée dans

des cellules mésangiales indiquent que la surproduction de TGF- β1 et de composants de la

matrice résulterait de l’activation de la voie des hexosamines. Les effets de fortes

concentrations de glucose sont en effet mimés avec la D-glucosamine et bloqués lorsque la

GFAT est inhibée (Kolm-Litty et al., 1998).

Mais la voie des hexosamines serait également responsables des dysfonctionnements

cellulaires qui mènent à l’insulino-résistance. L’augmentation du flux de glucose dans cette

voie métabolique altérerait en effet l’activité et la translocation du transporteur du glucose

Glut-4 à la membrane, dans des cellules musculaires (Cooksey et al., 1999) ou des adipocytes

(Chen et al., 1997), probablement par l’activation de PKC (Filipis et al., 1997).

Glucose

Glucose-6P

Fructose-6P Glucosamine-6P N-acétyl-glucosamine-6P

N-acétyl-glucosamine-1P

UDP- N-acétyl-glucosamine(UDP-GlcNac)

GFAT

Glutamine Glutamate

GFAT: Glucosamine-fructose-amidotransférase

Signalisationintracellulaire

O-glycosylation de facteur de transcription (Sp1)

Expression de gènes(TGF-β, PAI-1)

Translocation de protéines(PKC, Glut-4)

47

Les cibles potentielles intracellulaires de l’UDP-GlcNac sont nombreuses. Diverses

protéines cytoplasmiques et nucléaires peuvent effectivement être O-glycosylées. L’activation

de la voie des hexosamines pourrait ainsi induire diverses modifications biochimiques,

comme l’expression de gènes et la fonctions de protéines, impliquées dans la pathogenèse des

complications diabétiques.

2-4-La glycosylation non enzymatique

Un des mécanismes pathogéniques proposé pour expliquer la toxicité vasculaire du

glucose, est la formation accrue de produits avancés de glycation, également nommés AGE

(Advanced Glycation End-Products) formés par la glycosylation non-enzymatique de

protéines (Baynes et al., 1989), d’ADN (Lee et Cerami, 1990) et de lipides (Bucala et al.,

1993). La formation et l’accumulation des AGE sont en effet accélérées au cours du diabète

(Guthrow et al., 1979; Hammes et al., 1999) et reliées sur le plan clinique aux complications

vasculaires (Brownlee, 1995). Par exemple, la sévérité des complications microvasculaires

observée chez les patients diabétiques atteints de rétinopathie a été corrélée avec les quantités

d’AGE contenues dans le collagène de la peau (Beisswenger et al., 1995) et dans le sérum

(Ono et al., 1998).

2-4-1-La formation des produits avancés de glycation

La glycosylation non-enzymatique a été découverte in vitro par Louis-Camille Maillard

en 1912, en observant l’apparition d’une couleur jaune-brun lors du chauffage de sucres

réducteurs (glucose) avec des acides aminés (glycine). Il montra que cette réaction peut se

produire à 37 °C, température corporelle, caractéristique primordiale pour la physiopathologie

humaine. Cette réaction a été redécouverte 50 ans plus tard lors des processus

d’industrialisation de la nourriture où elle intervient dans l’altération et la cuisson des

aliments.

Nommée aujourd’hui réaction de Maillard, la glycosylation non-enzymatique est la

réaction par laquelle les sucres réducteurs (ou des dicarbonyles) se lient de façon covalente

aux groupes amines libres de protéines, d’ADN et de lipides pour former des intermédiaires

métaboliques instables, pouvant se réarranger de façon diverse au cours d’un processus long

et complexe et donner naissance à de multiples produits avancés de glycation (Figure 7).

48

Figure 7: La réaction de Maillard

Un sucre réducteur, sous sa forme linéaire, réagit par son groupe aldéhyde libre avec le

groupe amine libre d’acides aminés basiques contenus dans certaines protéines (lysine,

hydroxylysine, arginine, histidine), de phospholipides (phosphatidyléthanolamine) ou d’ADN

(guanine) pour former une glycosylamine (ou base de Schiff). La base de Schiff générée peut

se réarranger de façon plus stable sous la forme d’une céto-amine, appelée produit

d’Amadori ou produit de glycation précoce. Ces phases précoces de la réaction de Maillard

sont rapides et réversibles et la formation de ces intermédiaires instables dépendant de la

concentration en substrats (protéines et sucre réducteur) et de leur temps d’exposition l’un à

l’autre. Un produit d’Amadori bien connu est l’hémoglobine glyquée (HbA1c), découverte

par S. Rahbar (1968), utilisé chez le diabétique comme indice du contrôle métabolique du

glucose sur 100 jours (durée de vie du globule rouge) (Koenig et al., 1976).

Les produits d’Amadori subissent une série de réarrangements intramoléculaires. Ils

peuvent subir une fragmentation oxydative, consistant en une oxydation en présence

d’oxygène et d’ions métalliques pour libérer l’anion superoxyde (O2-.) et des produits de

glycoxydation comme la carboxyméthyllysine (CML) ou la pentosidine. Une fragmentation

non-oxydative (transferts d'hydrogène par exemple) peut également avoir lieu et conduire à

la formation d’αααα-dicarbonyles (ou α-oxoaldéhydes) comme le 1-, 3- et 4-désoxyglucosone,

CH2OH

RNCH

(CHOH)n

CH2OH(CHOH)n-1

RNHCH2

C O

H2O

+CHO

(CHOH)n

CH2OH

RNH2

Sucre réducteur Base de Schiff(glycosamine)

Produit d'Amadori(céto-amine)

RNHCH2

COOH

Carboxyméthyllysine

HC OCCH2

(CHOH)2

CH2OH

O

3-désoxyglucosone

HC OCCH3

O

Méthylglyoxal

AGE

RNH2

Mn+

O2 O2-.

H2O

Protéine

- R-NH 2

αααα-dicarbonyles

49

et probablement le méthylglyoxal ou le glyoxal, à partir de fructosamine, comme cela a été

décrit récemment in vitro (Thornalley et al., 1999). Ces dicarbonyles, extrêmement réactifs

vis à vis des groupes amines, vont à leur tour réagir avec des protéines, pour donner

naissance aux AGE (ou produits de Maillard), composés chimiquement stables. Les

dicarbonyles propagent ainsi la réaction de Maillard en formant des ponts intra et

intermoléculaires dans certaines protéines. Mais les AGE peuvent également se former à

partir de la réaction d’un dicarbonyle avec un produit d’Amadori (Cerami et al., 1988). Ces

phases intermédiaires ou finales de la réaction de Maillard sont lentes et irréversibles. Ainsi

les produits finaux de glycation, dont le facteur limitant principal de formation est la vitesse

de renouvellement des protéines, caractérise surtout des protéines structurales de durée de vie

prolongée, comme le collagène ou les composants de la membrane basale.

La voie de Maillard décrit ainsi les modifications des amines par des sucres réducteurs

mais également, dans un sens plus large, par des dicarbonyles, pouvant être issus de diverses

voies métaboliques et conduire à la formation d’AGE. Par exemple, le méthylglyoxal (MGX)

peut se former à partir de la fragmentation des trioses phosphates (Phillips et Thornalley,

1993) et lors de l’oxydation de l’acétone au cours du métabolisme des corps cétoniques dans

le foie (Koop et Casazza, 1985). Lors de l’hyperglycémie, la vitesse de formation du MGX

chez les diabétiques dépasse les capacités de détoxification de ce produit dans les cellules, par

les systèmes enzymatiques de glyoxalase, qui convertit le MGX en un intermédiaire, le

lactoylglutathion (par la glyoxalase I), lui-même converti en D-lactate (par la glyoxalase II)

(Thornalley, 1993). La dégradation de MGX en D-lactate dépendrait surtout de la glyoxalase-

I (Shinohara et al., 1998). La concentration sanguine de MGX est fortement augmentée chez

le diabétique (Beisswenger et al., 1995) et cette augmentation est corrélée avec la sévérité des

complications vasculaires (McLellan et al., 1994). De plus, les AGE de protéines formés

après réaction avec ce dicarbonyle (la carboxylethyllysine (CEL) et les sels d’imidazolium

comme MOLD (methylglyoxal-lysine dimer) sont décrits comme des produits majeurs

observés lors du diabète (Degenhardt et al., 1998).

Les sucres réducteurs peuvent également induire des modifications de protéines par un

mécanisme indépendant de la voie de Maillard. L’auto-oxydation des sucres réducteurs

(Figure 8), catalysée par les ions métalliques, produit en effet des dicarbonyles et des AGE

(Wolff et Dean, 1987). Le glucose dans sa forme ouverte subit une énolisation et réduit les

ions métalliques. Le radical ènediol généré peut être oxydé en dicarbonyle de type

désoxyglucosone. La réaction du dicarbonyle avec les protéines mène à la formation d’AGE.

50

Ces réactions génèrent des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène (réaction de

Fenton) à partir duquel peuvent se former des radicaux hydroxyles (réaction d’Haber-Weiss).

Toutefois, cette voie a été décrite in vitro et les conditions de réactions (fortes concentrations

en métaux) ne sont pas représentatives de celles observées in vivo, où les concentrations de

métaux libres sont finement régulées.

Figure 8: L'autooxydation des sucres réducteurs

2-4-2-Les produits avancés de glycation

La réaction des protéines avec des dicarbonyles, issus du métabolisme des cellules lors

du diabète, est un processus multiple et complexe, qui aboutit à la formation d’une grande

diversité de structures chimiques d’AGE, tant par la variété des dicarbonyles générés que les

acides aminés avec lesquels ils réagissent. Ainsi, le terme AGE regroupe un ensemble

hétérogène de molécules. Les modifications structurales induites au cours de la glycation sont

diverses. Les protéines peuvent subir des pontages intra ou intermoléculaires et/ou présenter

une fluorescence du fait de la formation de cycles intramoléculaires.

Bien que différentes techniques d’identification des AGE soient exploitées, (mesures de

fluorescence, dosages immunologiques, analyses par chromatographie haute pression ou en

phase gazeuse…), elles présentent certains biais et ne permettent pas de rendre compte de

l’hétérogénéité des AGE in vivo. Par exemple, alors que la pentosidine présente une

fluorescence caractéristique (325-390 nm) (Mac Cance et al., 1993), la majorité des autres

AGE fluorescents absorbent à 370 nm et émettent à une longueur d’onde de 440 nm. De plus,

cette méthode de détection exclue les AGE non fluorescents, comme la CML ou la pyrraline,

qui semblent être majoritaires (Makita et al., 1992). D’autre part, les dosages

immunologiques, employés dans la détection ou la quantification des AGE, sont réalisés à

partir d’anticorps polyclonaux dirigés contre des AGE de structures diverses et parfois mal

Sucre réducteur

Ènediol

Radical ènediolM(n-1)+

Mn+

O2

Carbonyle AGER-NH2

OH .

H2O2

O 2-.O 2-.

Attaques radicalaires

51

définies, obtenus par des modifications in vitro d’albumine (généralement) par un sucre

(Makita et al., 1992). Il semblerait que l’antigène majoritairement reconnu par ces anticorps

soit la CML (Reddy et al., 1995), qui est non fluorescent.

Des structures isolées in vitro ont toutefois pu être identifiées dans les tissus de

diabétiques, comme la pyrraline résultant de la réaction de résidus lysine avec la 3-

désoxyglucosone et suivie de réactions intramoléculaires (déshydratation et cyclisation)

(Hayase et al., 1989), la pentosidine formée par la réaction entre un pentose et des résidus

arginine et lysine (Sell et Monnier, 1989), des imidazolones produits de la réaction entre la 3-

désoxyglucosone et un résidu arginine (Niwa et al., 1997), la CML formée par la réaction

d’un résidu lysine avec le glyoxal ou l’ascorbate (Dunn et al., 1990) ou encore par la

dégradation oxydative d’un produit d’Amadori (fructosamine) (Fu et al., 1996). La CEL, le

GOLD (glyoxal-lysine dimer) et le MOLD seraient directement issus de la réaction du

méthylglyoxal (CEL et MOLD) et du glyoxal (GOLD) avec les lysines des protéines (Wells-

Knecht et al., 1996). GOLD et MOLD appartiennent à une famille d’AGE, les «crosslines»,

qui établissent des ponts intermoléculaires.

2-4-3-Les conséquences pathologiques de la glycation

La formation des AGE est accélérée au cours du diabète et leur accumulation a été

corrélée positivement au développement des complications microvasculaires (Brownlee,

1995). Trois grands mécanismes généraux sont proposés pour expliquer les changements

pathologiques causés par les AGE.

2-4-3-1-La glycation de la matrice extracellulaire

Les protéines de la matrice extracellulaire comme le collagène ou la laminine sont des

cibles privilégiées de la glycation de part leur faible taux de renouvellement. La glycation des

composants de la matrice modifie leur structure et donc leurs propriétés physico-chimiques,

comme une baisse de leur solubilité et de leur flexibilité (Schnider et Kohn, 1982) et une

résistance aux protéases (Mott et al., 1997) qui conduit à une accumulation progressive au

cours du diabète. Les AGE de la matrice pourraient contribuer à l’augmentation de la

perméabilité vasculaire en altérant l’adhérence des cellules endothéliales et compromettant

leur réplication normale (Podesta et al., 1997), affectant ainsi les propriétés de la barrière

hémato-rétinienne.

52

2-4-3-2- La glycation des protéines circulantes et intracellulaires

La glycation des protéines circulantes, directement en contact avec le glucose sanguin,

est également observée. Par exemple, la glycation de l’hémoglobine, formant le produit

d’Amadori HbA1c (hémoglobine glyquée), induit une augmentation de sa viscosité à

l’intérieur des globules rouges (Brownlee et al., 1984). La glycation des immunoglobulines,

décrite au niveau des fragments Fc et Fab, affecte les propriétés d’agglutination du

complément (Hammer et al., 1990) et les activités des IgG et des IgM (Cheta et al., 1991). De

par leur faible taux de modification par la glycation, ces protéines sont considérées comme

des marqueurs de glycation, au même titre que l’HbA1c.

La formation d’AGE sur des protéines intracellulaires a également été décrite. En effet,

l’hyperglycémie peut induire, dans des tissus non insulino-dépendants, une augmentation

intracellulaire de sucres comme le glucose-6-phosphate, le fructose et les trioses phosphates

ou de dicarbonyles comme le méthylglyoxal. Ces composés, plus réactifs que le glucose,

induisent une formation des AGE à partir de protéines cytosoliques, altérant ainsi leur

fonction. Par exemple, la glycation du bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) dans les

cellules endothéliales affecte son activité mitogénique (Giardino et al., 1994).

2-4-3-3-L’interaction des AGE avec leurs récepteurs

En plus de leur formation à partir de protéines fonctionnelles, les AGE extracellulaires

participent au développement des anomalies de la (macro et de la) microangiopathie

diabétique par l’intermédiaire de récepteurs membranaires spécifiques, capables d’internaliser

les AGE par endocytose et de les dégrader dans les lysosomes et/ou d’induire la transduction

d’un signal intracellulaire. Ces différents récepteurs ont été identifiés sur une variété de types

cellulaires comme les macrophages, les monocytes, les cellules endothéliales, les cellules

musculaires lisses, les fibroblastes, les cellules mésangiales ou les neurones (moteurs et

périphériques) (Brett et al., 1993; Li YM et al., 1996).

MSR-I et –II : Parmi les différents types de récepteurs isolés, les premiers identifiés ont

été les récepteurs scavengers de la classe A (MSR-A ou Macrophage Scavenger Receptor) de

type I (220 kDa) et II (170 kDa) des macrophages (Radoff et al., 1988). Cette famille de

récepteurs constitue le système majeur de dégradation des AGE. Les macrophages captent et

internalisent les AGE de protéines et de LDL par endocytose puis les dégradent dans les

lysosomes (Araki et al., 1995). Ces récepteurs semblent impliqués dans la macroangiopathie

53

diabétique en internalisant les LDL-modifiés et en formant les cellules spumeuses dans les

plaques athéromateuses (Sakata et al., 2001).

AGE-R : Par la suite, un complexe trimérique récepteur des AGE (AGE-R) a été

identifié. Il est constitué d’une protéine nommée p60 de 48 kDa (ou AGE-R1), d’une seconde

nommée p90 de 80 kDa (ou AGE-R2) (Yang et al., 1991) et d’une lectine liant le galactose,

la galectine-3 de 32 kDa (ou AGE-R3) (Vlassara et al., 1995). La détermination des

séquences N-terminales des protéines p60 et p90, purifiées à partir de foie de rat, a permis de

déterminer que p60 et p90 présentent une homologie de séquence élevée avec les séquences

N-terminales respectivement de l’oligosaccharyltransferase humaine de 48 kDa (OST-48,

95% d’homologie) et de la phosphoprotéine de 80K-H humaine (73% d’homologie) (Li Y.M.

et al., 1996). Par ailleurs, la séquence N-terminale de la protéine p90 d’origine humaine est

identique à celle de la 80K-H humaine (Goh et al., 1996). Les protéines p60 et p90 seraient

en fait les protéines préalablement identifiées OST-48 et 80K-H (Li Y.M. et al., 1996; Stitt et

al., 1999). Initialement localisée dans le réticulum endoplamique rugueux, OST-48 est une

protéine transmembranaire également exprimée à la surface de la membrane plasmique (Li

Y.M. et al., 1996). Elle présente un fragment N-terminal extracellulaire long, un seul passage

transmembranaire et un fragment C-terminal cytosolique court (9 résidus aminés) (Silberstein

et al., 1992; Li Y.M. et al., 1996). Alors que la protéine p60/OST-48 présente une activité de

liaison des AGE (Li Y.M. et al., 1996), p90/80K-H est une protéine soluble sous-

membranaire et ne lie pas les AGE (Li Y.M. et al., 1996). Décrite initialement comme un

substrat de PKC (Hirai et Shimizu, 1990), p90/80K-H a également été identifiée comme une

protéine phosphorylée sur la tyrosine lors de l’activation du récepteur au FGF dans des

fibroblastes, alors capable de fixer la protéine adaptatrice GRB-2 (Goh et al., 1996). De façon

intéressante, la phosphorylation de p90/80K-H est également stimulée lors de la liaison

d’AGE au complexe AGE-R mais semble être PKC-dépendante (Stitt et al., 1999).

Le troisième composant du complexe AGE-R est la galectine-3. Malgré l’absence de

signal d’adressage à la membrane plasmique et de domaine transmembranaire, la galectine-3

est transloquée du cytoplasme à la surface externe de la membrane en réponse au stimulus

AGE (Vlassara et al., 1995). Son niveau d’expression est également stimulé en présence

d’AGE (Stitt et al., 1999) ou au cours du diabète (Pugliese et al., 2000). La galectine-3 est

capable de lier les AGE. Le domaine de liaison aux AGE est contenu dans le peptide C-

terminal de 18 kDa mais diffère de celui de liaison aux carbohydrates. La fixation des AGE à

la galectine-3 induit la formation d’un complexe protéique de haut poids moléculaire où les

deux constituants sont liés par covalence (Vlassara et al., 1995). Le rôle exact de la galectine-

54

3 joué dans la structure et la fonction du complexe AGE-R reste indéterminé. Il a été proposé

qu’elle intervienne dans la formation et dans la stabilisation de la structure du complexe, ainsi

que dans la fixation d’un large spectre d’AGE malgré une affinité de liaison modérée du fait

de liaisons covalentes avec les AGE.

Récemment, il a été montré in vitro dans des cellules endothéliales microvasculaires

rétiniennes, que le complexe AGE-R, constitué de p60, p90 et galectine-3, est localisé dans

les domaines membranaires riches en cavéoline (cavéoles). Les AGE, se liant à p60 et la

galectine-3, sont internalisés et orientés vers les endosomes et les lysosomes (Stitt et al.,

2000b). Cette étude montre que AGE-R est impliqué dans la capture, l’internalisation et la

dégradation des AGE. Les cavéoles sont des microdomaines enrichis en glycosphingolipides,

de cholestérol, de cavéoline et d’autres structures impliquées dans la transduction de signaux

comme les sphingomyélines, ou des protéines de signalisation telles que la famille des src-

tyrosine kinases (Brown et London, 2000). L’enrichissement de ces structures en AGE-R

suggère l’implication de ce récepteur dans la transduction de signaux intracellulaires. Le

complexe AGE-R a en effet été impliqué dans des réponses cellulaires variées comme la

prolifération (Chibber et al., 1997) ou l’expression de gènes comme les facteurs de croissance

PDGF (platelet-derived growth factor) (Doi et al., 1992) ou IGF-I (insulin-like growth factor-

I) (Pugliese et al., 1997). Une première ébauche de la voie de signalisation sous-jacente à la

liaison des AGE à ce complexe se présente aujourd’hui. La phosphorylation de la protéine

p90 en réponse aux AGE (Stitt et al., 1999) suggère son implication dans l’initiation d’une

cascade de signalisation. Des travaux préliminaires plus récents menés sur les mêmes cellules

(cellules endothéliales) suggèrent la phosphorylation de p90 lors de la liaison des AGE avec

le complexe AGE-R, induisant l’activation des MAP kinases Erk1/Erk2 (Cai et al., 2001).

RAGE : Le récepteur aux AGE le mieux caractérisé à l’heure actuelle est RAGE

(Receptor for AGE) (Schmidt et al., 1992; Neeper et al., 1992). RAGE apparaît de plus en

plus être un récepteur impliqué dans l’induction d’un signal intracellulaire plutôt que dans la

capture et l’élimination des AGE.

Il s’agit d’une glycoprotéine de 35 kDa (Neeper et al., 1992; Srikrishna et al., 2002)

complexée à une protéine extracellulaire analogue de la lactoferrine (LF-L pour lactoferrin-

like) (Schmidt et al., 1992), également pourvue d’une activité de liaison des AGE, mais dont

la fonction reste à ce jour indéterminée. Le récepteur RAGE est relié structurellement à la

famille des immunoglobulines, possédant une séquence N-terminale extracellulaire

comprenant un domaine de type V et deux de type C (Neeper et al., 1992), un domaine

transmembranaire et un fragment peptidique C-terminal court (43 résidus aminés) du coté

55

cytosolique, riche en résidus glutamates et présentant une similarité de séquence avec le

fragment cytosolique de l’antigène de surface CD20 (Neeper et al., 1992). Le domaine

cytoplasmique est décrit comme nécessaire dans la signalisation intracellulaire (Huttunen et

al., 1999). En comparaison au complexe AGE-R, la cascade des événements intracellulaires

couplés au récepteur RAGE a été plus largement étudiée (Figure 9). Dans les cellules

endothéliales de veine de cordon ombilical humain, l’interaction des AGE avec RAGE induit

un stress oxydant intracellulaire (Yan et al., 1994; Bierhaus et al., 1997) qui entraîne

l’activation de signaux faisant intervenir une cascade de kinases, p21ras, dont l’activation est

redox dépendante (Lander et al., 1995), la phosphatidylinositol-3-kinase, la protéine kinase

Akt, une MAP kinase et finalement l’activation d’un facteur de transcription NF-κB (Yan et

al., 1994; Lander et al., 1997; Deora et al., 1998). L’activation de NF-κB dans ces cellules

peut être inhibée par divers antioxydants comme l’acide lipoïque (Bierhaus et al., 1997) ou

les enzymes antioxydantes (Yan et al., 1994), suggérant qu’au cours de la voie de

transduction, certains dérivés actifs de l’oxygène sont produits. Un dérivé de l’oxygène,

produit lors de la liaison d’AGE au récepteur RAGE, vient d’être identifié. Il s’agit de l’anion

superoxyde, produit par une NADPH oxydase (Wautier et al., 2001). Cependant, le

mécanisme de couplage de RAGE à l’induction d’un stress oxydant reste à ce jour

indéterminé. L’activation de NF-κB pourrait modifier l’expression de différents gènes, selon

le type cellulaire (Figure 9).

RAGE est un récepteur qui présente des affinités de liaison avec des ligands très divers.

Parmi les différents AGE connus, au moins deux structures ont été décrites comme des

ligands de RAGE : la carboxyméthyllysine et les imidazolones (Kislinger et al., 1999). Le

récepteur RAGE semble être impliqué dans la maladie d’Alzheimer ou dans les maladies avec

atteintes de neurones ou de cellules gliales, dans lesquelles un dépôt amyloïde est observé.

RAGE lie le peptide β amyloïde et sa liaison induit la surexpression de RAGE (Yan et al.,

1996). Dans un contexte non pathologique, RAGE lie également l’amphotérine, une protéine

abondante dans le système nerveux central en développement, participant à la croissance et la

différentiation des cellules nerveuses (Brett et al., 1993). Il est intéressant de noter que

RAGE, par liaison à l’amphotérine, peut initier dans des cellules neuronales deux voies de

signalisation intracellulaire indépendantes, l’une concernant la voie décrite précédemment, la

seconde impliquant l’activation de la protéine rac (Huttunen et al., 1999). Les interactions

RAGE-amphotérine pourraient jouer aussi un rôle pathologique dans le pouvoir invasif

(formation de métastases) des cellules cancéreuses d’une tumeur (Tagushi et al., 2000).

56

Figure 9: Liaison des AGE à RAGE et conséquences selon le type cellulaire

2-4-4- AGE et rétinopathie

Diverses études suggèrent l'implication des AGE dans le développement de la

rétinopathie diabétique. La présence et l’accumulation progressive de produits d’Amadori

(Schalkwijk et al., 1999) et d’AGE (Stitt et al., 1997) a été mise en évidence sur les protéines

de la membrane basale des microvaisseaux rétiniens. Différents récepteurs aux AGE ont été

localisés dans le lit capillaire rétinien: les composants p60 et p90 du complexe AGE-R ont été

identifiés sur les deux types cellulaires rétiniens (Stitt et al., 1997; Chibber et al., 1997),

RAGE est également présent dans les cellules microvasculaires rétiniennes, les cellules

endothéliales (Yan et al., 1994) et les péricytes (Yamagishi et al., 1995). Dans les

microvaisseaux rétiniens, la colocalisation des AGE avec leurs récepteurs (p60, p90 et

RAGE) (Stitt et al., 1997; Soulis et al., 1997), suggère que les AGE puissent être impliqués

Vasoconstricteurs: endothéline-1 (Bierhaus et al., 1998)Pro-coagulants: thrombomoduline (Bierhaus et al., 1998) PAI-1 (Yamagishi et al., 1998)Facteurs de croissances: VEGF (Yamagishi et al., 1997)

RAGEAGE

Stress oxydant

P21ras/MAP kinase

NF-κB

Expression de gènes

Cytokines pro-inflamatoires: TNF-α, IL-1 (Vlassara et al., 1988)

MACROPHAGES :(macroangiopathie)

CELLULES ENDOTHELIALES :(microangiopathie dont la rétinopathie)

CELLULES MESANGIALES :(néphropathie)

Facteurs de croissances: VEGF (Yamagishi et al., 2002b)

X ?

57

dans le dysfonctionnement vasculaire rétinien. Deux travaux récents, menés chez des

animaux, soutiennent l’hypothèse d’un rôle direct des AGE dans le développement des

complications microvasculaires rétiniennes. Lors de la perfusion de rats normo-glycémiques

avec de l’albumine glyquée (AGE), ce produit s’accumule dans les microvaisseaux rétiniens

et dans les péricytes, colocalise avec les récepteurs aux AGE et induit l’épaississement de la

membrane basale (Stitt et al., 1997) ainsi que l’altération de la perméabilité de la BHR,

associée à la surexpression dans la rétine du facteur de perméabilité VEGF (Stitt et al.,

2000a). Par ailleurs, une aggravation de la néphropathie (Yamamoto et al., 2001) et de la

rétinopathie (communication personnelle) a été montrée dans des souris diabétiques de type I

et transgéniques pour le récepteur RAGE.

Différentes études in vitro montrent que les AGE altèrent la prolifération des deux types

cellulaires. Ils inhibent en effet la croissance des péricytes rétiniens (Yamagishi et al., 1995;

Chibber et al., 1997; Ruggiero-Loppez et al., 1997) alors qu’ils favorisent la multiplication

des cellules endothéliales (Chibber et al., 1997; Ruggiero-Loppez et al., 1997). Les AGE sont

également capables d’induire l’apoptose des péricytes rétiniens et de stimuler leur sécrétion

de VEGF (Yamagishi et al., 2002a). Ces différents effets semblent résulter de la liaison des

AGE avec leurs récepteurs RAGE (Yamagishi et al., 1995 et 2000) ou avec le complexe

AGE-R (Chibber et al., 1997).

Par ailleurs, dans ces cellules microvasculaires rétiniennes, les AGE peuvent aussi

induire des altérations de la glycosylation enzymatique affectant le métabolisme des

glycoconjugués. Par exemple, des altérations spécifiques des sucres des glycoprotéines

induites par les AGE ont été mises en évidences dans les cellules endothéliales des

microvaisseaux rétiniens (Rellier et al., 1997). Celles-ci semblent résulter d’une augmentation

de différentes activités glycosidases (enzymes du catabolisme) associée à une diminution des

activités glycosyltransférases (enzymes de synthèse) (Rellier et al., 1999). Les AGE affectent

également le métabolisme des glycosphingolipides des cellules microvasculaires rétiniennes.

Alors qu’ils augmentent la quantité de toutes les espèces moléculaires dans les deux types

cellulaires, ils diminuent spécifiquement un ganglioside particulier, le GD3, dans les péricytes

rétiniens (Natalizio et al., 2001); cette diminution serait la conséquence d’une baisse de

l’activité de la GD3-synthase (Natalizio, 2002). Les glycoconjugués, formant le glycocalix,

sont impliqués dans les processus d’interactions cellule-cellule et cellule-matrice permettant

la reconnaissance, la communication et l’adhésion cellulaire. Une altération de leur

composition, notamment dans les cellules microvasculaires rétiniennes, pourrait avoir des

conséquences diverses dans le développement de la rétinopathie diabétique, comme par

58

exemple une adhésion accrue des cellules circulantes à l’endothélium (Chibber et al., 2000),

pouvant ainsi participer à l’occlusion des capillaires dans la rétine.

Le rôle critique des AGE dans le développement des complications microvasculaires de

la rétine a été établi par l’utilisation d’inhibiteurs de la glycation, comme l’aminoguanidine.

L’aminoguanidine, administrée à des rats diabétiques, dès le début de la maladie (Hammes et

al., 1991 et 1994) ou seulement après 6 mois de diabète (Hammes et al., 1995), ralentit en

effet le développement de la rétinopathie en prévenant la disparition des péricytes, la

formation de microanévrismes et la néovascularisation (Hammes et al., 1991), en limitant la

formation de capillaires acellulaires et en abolissant la formation de microthrombi (Hammes

et al., 1994), phénomènes associés à une diminution de la formation d’AGE fluorescents au

niveau de la rétine (Hammes et al., 1995). Mais les effets protecteurs de l’aminoguanidine

uniquement par son action anti-glycante sont aujourd’hui controversés. Le traitement de rats

(Kern et al., 2000) et de chiens diabétiques (Kern et Engerman, 2001) avec l’aminoguanidine

n’a pas diminué les taux d’AGE circulants (hémoglobine-AGE) et d’AGE de collagène de la

queue (pentosidine), bien que certaines lésions rétiniennes aient été abolies (microanévrismes,

capillaires acellulaires, disparition des péricytes). L’aminoguanidine pourrait également

protéger de certaines complications microvasculaires en agissant comme un antioxydant

(Giardino et al., 1998; Kowluru et al., 2000) ou en réduisant la formation de NO par la NO

synthase inductible (iNOS) (Corbett et al., 1992; Kowluru et al., 2000; Carmo et al., 2000b),

enzyme dont l’activité est augmentée dans la rétine de rats diabétiques (Carmo et al., 2000b)

et dont l’activation pourrait être corrélée à une augmentation de la perméabilité de la barrière

hémato-rétinienne (Carmo et al., 2000a).

2-5-Le stress oxydant

Le stress oxydant résulte d'un déséquilibre entre la production de radicaux libres dérivés

de l’oxygéne (ROS) et leur destruction par des systèmes de défenses antioxydantes. Lorsqu'ils

ne sont pas détoxifiés, les radicaux libres non détoxifiés peuvent engendrer des dommages de

la structure et du métabolisme cellulaire en attaquant de nombreuses cibles, comme les

protéines, l'ADN et les lipides.

2-5-1-Le stress oxydant dans le diabète: cause ou conséquence?

Bien que le stress oxydant soit un phénomène non-spécifique d’altérations cellulaires, il

est évoqué dans le cadre des complications vasculaires du diabète. En effet, diverses études

59

cliniques ont mis en évidence une augmentation du stress oxydant en mesurant notamment

des marqueurs de la peroxydation lipidique. Par exemple, les niveaux plasmatiques de

TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) (Altomare et al., 1992) ou d’isoprostanes

(8-épi-PGF2α) (Gopaul et al., 1995), sont significativement augmentés chez les diabétiques

de type II, dont la glycémie est mal contrôlée par rapport à des patients bien suivis ou des

sujets contrôles. Nourooz-Zadeh et al., (1997) ont par ailleurs montré une baisse de vitamine

E (standardisée par rapport au taux de cholestérol) et une augmentation d’isoprostanes dans le

plasma. La plupart de ces études ont ainsi permis d’établir une corrélation directe entre le

contrôle glycémique et l’apparition du stress oxydant. Il a notamment été montré que le taux

urinaire sécrété de la 8-épi-PGF2α est réduit lors d’une amélioration du contrôle métabolique

(Davi et al., 1999).

Le rôle du stress oxydant dans le développement des complications vasculaires liées au

diabète, reste toutefois un sujet de controverse. Certains auteurs décrivent le stress oxydant

comme la conséquence des dysfonctionnements vasculaires résultant de l’hyperglycémie. Le

stress oxydant, caractérisé par exemple par l’augmentation des produits de peroxydation

lipidique (Jennings et al., 1987), est en effet plus élevé chez les patients diabétiques

présentant des complications microvasculaires. De plus, l’équipe de J. Baynes a montré que

l’oxydation des acides aminés des protéines de la matrice extracellulaire n’est pas modifiée

chez le diabétique (Wells-Knecht et al., 1997), suggérant qu’il n’y ait pas d’augmentation

généralisée du stress oxydant par le diabète. Le Pr J. Baynes propose plutôt l’hypothèse d’un

stress carbonyle, qui consiste en une augmentation de substrats (glucose et lipides), induisant

une formation accrue de produits de glycoxydation (Baynes et Thorpe, 1999).

2-5-2-La production de radicaux libres

L’hyperglycémie peut induire une production accrue de radicaux libres selon différents

mécanismes, déjà évoqués précédemment: la fragmentation oxydative des produits

d’Amadori (chapitre 2-3-1-1), l’auto-oxydation du glucose (chapitre 2-3-1-2), la liaison des

AGE à leur récepteurs (2-3-3-3), et l’altération du potentiel redox, par la voie des polyols.

Récemment, l’équipe de Brownlee (Nishikawa et al., 2000; Du X.L. et al., 2000) vient

de formuler une hypothèse biochimique reliant directement les ROS produits par la

mitochondrie, plus particulièrement l’anion superoxyde, à la voie des polyols, à l’activation

de la PKC, la formation d’AGE dérivés du méthylglyoxal, la voie des hexosamines et

l’activation de NF-κB (Figure 10). Les auteurs démontrent en effet, dans des cellules

60

endothéliales aortiques bovines, que la normalisation de la production de l’anion superoxyde

mitochondrial (au moyen d’agents bloquant la chaîne respiratoire mitochondriale, de

mimétiques de la SOD ou en surexprimant la SOD mitochondriale) abolit les différentes voies

métaboliques induites par l’hyperglycémie, suggérant que celles-ci soient sous le contrôle de

l’anion superoxyde généré en excès. Ce radical oxygène serait produit par une augmentation

du gradient de proton généré par la chaîne respiratoire mitochondriale, suite à une production

accrue du cofacteur NADH, résultant de l’oxydation de pyruvate issu de la glycolyse.

2-5-3-La modification des défenses antioxydantes

Différentes études ont rapporté une altération de ces systèmes antioxydants au cours du

diabète. Ainsi, une diminution de la capacité anti-oxydante plasmatique totale (intégrant les

antioxydants enzymatiques et non-enzymatiques) a été mise en évidence chez les patients

DNID (Ceriello, 1997). De même, une étude, menée sur de nombreux diabétiques (de type II)

Figure 10: La mitochondrie: le lien unificateur entre les différents mécanismes pathogéniques proposés dans les complications microvasculaires.

TCA

NADH

e-

Mitochondrie

O2-.

GA3PDHase

AGEMéthylglyoxal

Fructose Sorbitol AR

Pyruvate

Pyruvate

GA3P

Glucose

1,3-BPG

G3P: glycérol-3-phosphateGA3P: glycéraldéhyde-3-phosphate1,3-BPG: 1,3 bisphosphate glycéraldéhydeTCA: cycle des acides tricarboxyliques

PKC+G3P DAG

Fructose-6PGFAT

Glucosamine-6P UDP-GlcNac

61

(467), a montré une baisse significative des défenses antioxydantes dans les érythrocytes

(vitamine E, C, A, GSH, SOD, catalase) associée à une augmentation de la peroxydation

lipidique (TBARS) (Sundaram et al., 1996).

La diminution des activités des enzymes antioxydantes pourrait s’expliquer par la

glycation de leur site actif, comme cela a été décrit pour la SOD érythrocytaire (Arai et al.,

1987). Des expériences de glycation in vitro ont également montré une altération des activités

enzymatiques de la catalase (Yan et Harding, 1997) de la GSH réductase (Blakytny et

Harding, 1992) ou de la GPx (Baldwin et al., 1995), suggérant une modification de ces

enzymes au cours du diabète.

Certaines études ont rapporté non pas une diminution mais une augmentation des

défenses antioxydantes enzymatiques, suggérant un mécanisme compensatoire à une

production de ROS. Par exemple, une augmentation des activités GPx et catalase

érythrocytaires a été montrée chez des patients DNID (Rema et al., 1995) et une

augmentation des niveaux d’ARNm de la SOD et de la catalase dans le rein de rats

diabétiques a également été mise en évidence (Sechi et al., 1997).

2-5-4-Le stress oxydant et la rétinopathie diabétique

Certaines études ont montré une corrélation entre la présence d’un stress oxydant dans

l’organisme et la rétinopathie diabétique. Par exemple, l’altération du GSH et de la GPx

érythrocytaires de patients DNID, associée à une augmentation de la peroxydation lipidique,

est d’autant plus manifeste lorsque les malades présentent une rétinopathie (Uzel et al., 1987).

Des patients DNID, ayant développé une rétinopathie, montrent également une altération des

activités des enzymes antioxydantes érythrocytaires (Rema et al., 1995).

Mais l’apparition d’un stress oxydant localisé dans la rétine même a également été

démontrée lors d’un diabète clinique et expérimental, et in vitro dans des cellules rétiniennes.

La rétine de rats diabétiques présente en effet une diminution des défenses enzymatiques

antioxydantes (Crouch et al., 1978; Kowluru et al., 1997) ainsi qu’une diminution de

glutathion (Kowluru et al., 1994; Agardh et al., 1998) et une augmentation de TBARS

(Kowluru et al., 1996). L’implication spécifique d’un stress oxydant dans la dégénération des

péricytes, phénomène précoce dans la rétinopathie diabétique, a été proposée par divers

travaux. Une étude récente menée sur des rétines de patients diabétiques, prélevées post-

mortem, montrent en effet une baisse de l’expression de la GSH réductase et de la SOD et une

augmentation du transcrit du gène de la GPx dans les péricytes rétiniens pré-apoptotiques (Li

62

W et al., 1999). Ces auteurs suggèrent un rôle du stress oxydant dans la mort des péricytes.

Cette hypothèse est soutenue par différents travaux montrant que le traitement de rats

diabétiques avec un antioxydant, le trolox (Ansari et al., 1998) ou la nicanartine (Hammes et

al., 1997), ou encore avec un mélange d’antioxydants (Kowluru et al., 2001) prévient la

disparition des péricytes rétiniens. Des expériences in vitro montrent également une altération

des défenses antioxydantes des péricytes rétiniens, cultivés dans un environnement

diabétique. Les péricytes, soumis à des fortes variations en concentration de glucose,

présentent une baisse de GSH intracellulaire, associée à une augmentation de la synthèse de

GPx (Li W. et al., 1998). En revanche, lorsque les péricytes sont cultivés de façon chronique

avec des AGE une augmentation des activités catalase et SOD a pu être mesurée (Paget et al.,

1998).

63

CHAPITRE II

I- INTRODUCTION

Le concept d’apoptose (provenant d’une locution grecque signifiant «chute des

feuilles») a été introduit en 1972 par Kerr et Wyllie pour désigner une forme de mort

cellulaire totalement différente de la nécrose, seule forme de mort connue et individualisée à

cette époque, aussi bien sous l’angle morphologique que biochimique. Alors que la nécrose

est subie passivement par la cellule suite à une agression extérieure, l’apoptose ou mort

cellulaire génétiquement programmée est un processus actif organisé temporellement au

cours duquel la cellule exprime un ensemble de gènes entraînant des modifications

morphologiques, biochimiques et structurales aboutissant à sa destruction «sans trace» et

complète.

La mort cellulaire programmée fait partie intégrante de la physiologie normale d’un

organisme: ce phénomène de mort cellulaire intervient dans l’élimination des cellules âgées

ou endommagées, dans la dégénérescence des cellules surnuméraires, en particulier lors du

développement embryonnaire ou le fonctionnement et l’homéostasie du système immunitaire.

Il est cependant crucial à la survie de l’organisme que cette mort cellulaire soit étroitement

régulée: une mort inappropriée va être aussi délétère pour l’organisme qu’une prolifération

excessive. Un dérèglement de l’apoptose ou de son contrôle est en effet impliqué dans de

nombreuses pathologies humaines. D’une part, l’inhibition de l’apoptose, aboutissant à la

prolifération incontrôlée d’une population cellulaire, joue un rôle fondamental à différentes

étapes de la carcinogenèse ou dans certains désordres auto-immuns. D’autre part, une

stimulation anormale de l’apoptose, conduisant à une perte cellulaire, est observée dans

certaines maladies neurodégénératives caractérisées par une mort neuronale massive

(Alzheimer, Parkinson), dans des maladies cardiovasculaires (infarctus), ou dans le SIDA

caractérisé par la disparition des lymphocytes T4. Plusieurs études suggèrent que l’apoptose

puisse également être impliquée dans les complications vasculaires du diabète, comme la

rétinopathie. Une apoptose excessive a en effet été montrée notamment dans les cellules

neuronales (Barber et al., 1998) et dans les péricytes rétiniens (Mizutani et al., 1996; Li W. et

al., 1997; Podesta et al., 2000).

L'étude des mécanismes moléculaires de l'apoptose a été fortement investie dans

l'optique de développer des outils pharmacologiques visant à corriger une apoptose exacerbée

ou d'induire l'apoptose dans des cas de cancer, par exemple. Mais cette approche ne semble

L’APOPTOSE

64

pas aussi aisée puisqu’il semble exister un continuum entre la mort cellulaire par apoptose et

celle par nécrose. En effet, quelques études rapportent que des cellules, bien que protégées

contre l’apoptose, notamment par une surexpression de protéines mitochondriales de la

famille des Bcl-2 (Meilhac et al., 1999) ou une déficience en caspases, protéases de

l’apoptose (Kolenko et al., 1999), peuvent mourir par nécrose.

II-LES CARACTERISTIQUES DE L’APOPTOSE

Les premières descriptions de l’apoptose ont attribué beaucoup d’importance aux

aspects morphologiques des modifications que subissent les cellules pendant ce phénomène.

Pendant longtemps, la seule façon d’identifier l’apoptose fut d’observer les bourgeonnements

de la membrane cellulaire, la condensation de la chromatine dans le noyau et l’apparition des

corps apoptotiques (Kerr et al., 1972, Duvall et Wyllie, 1986). Puis vinrent la description

moléculaire spécifique de l’apoptose, telle que la fragmentation internucléosomale de la

chromatine, des changements de la composition membranaire ou l’atteinte mitochondriale.

1- Les stigmates morphologiques

Lorsqu’une cellule entre en apoptose, les premiers événements d’atteintes structurales

observables (1) sont la ségrégation de la chromatine à la périphérie de l’enveloppe nucléaire,

la condensation du cytoplasme malgré une intégrité apparente de la membrane plasmique, et

la formation d’invaginations des membranes plasmiques et nucléaires, donnant un aspect de

bourgeon à la surface membranaire périphérique. L’apparition de ces modifications

morphologiques s’accompagne d’un isolement de la cellule apoptotique des cellules voisines.

L’évolution des invaginations membranaires aboutit (2) à la fragmentation de la cellule en

petits éléments, appelés corps apoptotiques, composés de membrane plasmique qui englobe

du cytoplasme, des organites et parfois des fragments nucléaires. Ce n’est que dans cette

deuxième étape du processus apoptotique qu’une altération morphologique d’organites

cytoplasmiques peut être observée, telle que la dilatation du réticulum endoplasmique ou la

désagrégation des polysomes (Kerr et al., 1972). In vivo, (3) les corps apoptotiques sont

rapidement phagocytés par les macrophages ou les cellules voisines avant l’altération des

membranes, dégradés par les lysosomes et réduits en résidus «non-reconnaissables», évitant

ainsi toute réaction inflammatoire (Figure 11). In vitro, (absence de macrophages), ils peuvent

néanmoins être dégradés suivant un processus de nécrose dite secondaire, caractérisée par une

rupture de la membrane plasmique et une désintégration des organites.

65

Figure 11: Les modifications morphologiques

d’une cellule en apoptose et en nécrose

Contrairement à l’apoptose, la nécrose, considérée comme une mort cellulaire non

coordonnée, est caractérisée par une modification de la perméabilité membranaire entraînant

une dilatation du cytoplasme et des organites tels que le réticulum endoplasmique et les

mitochondries: la cellule se gorge d’eau (4). La chromatine nucléaire flocule et la synthèse

protéique diminue. La rupture des membranes (5) conduit au relargage dans le milieu

environnant du contenu cytoplasmique, déclenchant une réaction inflammatoire (Allen et al.,

1997).

2- Les stigmates biochimiques

De nombreux changements biochimiques sont observés dans les cellules apoptotiques.

Il s’agit par exemple d’une modification des flux calciques responsables de l’activation de

nombreuses enzymes, dont des nucléases qui induisent la fragmentation de l’ADN (Ucker et

al., 1992; Wu et al., 2000), de l’activation de transglutaminases impliquées dans la

réorganisation des éléments du cytosquelette menant aux invaginations membranaires et à la

formation des corps apoptotiques (Gentile et al., 1992), de l’activation de protéases à

cystéines (les caspases), de la production accrue de céramides ou encore de la génération de

radicaux libres…

(1)

(3)

(2)(4)

(5)

nécrose apoptose

66

2-1- L’externalisation de marqueurs membranaires

Si l’intégrité de la membrane plasmique des cellules apoptotiques est préservée, la

membrane est néanmoins modifiée. Elle perd en effet son asymétrie et expose un

phospholipide particulier, la phosphatidylsérine (PS), sur le feuillet externe de la membrane.

Les mécanismes d’une telle translocation sont encore mal définis, mais pourraient être liés à

l'inhibition d'une translocase (qui transporte les PS et les PE sur le feuillet interne) et à la

stimulation Ca2+-dépendante d’une "scramblase" responsable du phénomène flip-flop des

phospholipides (Bratton et al., 1997). Ce phénomène apparaît tôt dans l’apoptose et semble

indépendant du type cellulaire. Un changement de l’expression de sucres est également

observé à la surface des cellules apoptotiques ou de ces fragments (Duvall et al., 1985). Ces

sucres sont reconnus par les récepteurs de la vitronectine et de la fibronectine des

macrophages (Savill et al., 1990; Fadok et al., 1992).

In vivo, l’expression précoce de ces différents marqueurs membranaires à la surface des

cellules entrant en apoptose permet la reconnaissance des cellules apoptotiques et donc une

élimination précoce afin d’éviter toute réaction inflammatoire.

2-2- La fragmentation de l’ADN

La mort par apoptose est caractérisée par un clivage de la chromatine nucléaire en

fragments double-brins. L’activation de la première endonucléase décrite, une endonucléase

calcium-dépendante, provoque la fragmentation de l’ADN au niveau des régions charnières

entre les oligonucléosomes, sur lesquels s’enroule l’ADN, libérant ainsi des éléments

nucléaires dont la taille est un multiple entier de 180-200 paires de bases et donnant ainsi un

aspect d’échelle sur gel d’agarose (Wyllie, 1980). Cette «échelle d’ADN» a longtemps été

considérée comme une caractéristique de l’apoptose. Cependant, des résultats plus récents ont

montré que l’apoptose pouvait s’accompagner de fragmentation de l’ADN en éléments de

grandes tailles (50-300 kb), visibles uniquement en électrophorèse en champ pulsé (Cohen et

al., 1992). Le clivage de l’ADN semble ainsi procéder par étapes successives: la première

correspond à la fragmentation en éléments de grandes tailles due à l’activation

d’endonucléases calcium-dépendantes, telles que l’ADNaseII (Wu et al., 2000) et une

nucléase de 40kDa (DNAseI-like endonucléase) (Ucker et al., 1992). La seconde étape fait

intervenir des endonucléases magnésium et/ou calcium dépendantes, telles que l’ADNaseI

(Oliveri et al., 2001) ou CAD (caspase activated DNAse) (Enari et al., 1998) aboutissant à la

formation de fragments de petites tailles.

67

Toutefois, bien que le clivage internucléosomal soit décrit dans de nombreux types

cellulaires, ce processus ne semble pas être une condition sine qua non de l’apoptose. Une

absence de fragmentation de l’ADN a en effet été mise en évidence dans des cellules

apoptotiques (Cohen et al., 1992, Collins et al., 1992). En revanche, des fragments de 100-

300 kpb ont également été observés dans des cellules en nécrose (Bicknell et Cohen, 1995).

La fragmentation d’ADN ne peut donc être considérée comme caractéristique de l’apoptose

que lorsqu’elle est associée à une morphologie typique de l’apoptose.

2-3- L’atteinte mitochondriale

Depuis la découverte de Bcl-2, protéine inhibant l’apoptose et située dans la

membrane des mitochondries (Sentman et al., 1991), de nombreux auteurs ont mis en

évidence l’implication des mitochondries au cours du processus apoptotique. Leur

participation dans l’apoptose est associée à une transition de la perméabilité membranaire

(MTP) et un effondrement du potentiel transmembranaire mitochondrial (∆Ψm), résultant de

l’ouverture de mégapores mitochondriaux. Du fait de sa haute concentration en solutés, un

gonflement osmotique progressif de la matrice est parfois observé, dont l’aboutissement

ultime est la rupture physique de la membrane externe. L’ouverture de ces pores est décrite

comme l’étape d’intégration du signal apoptotique et de non-retour de la cellule vers

l’apoptose. La MPT peut en effet être induite directement par de nombreux facteurs

apoptotiques tels que : - le calcium, - les espèces réactives de l’oxygène, - un changement de

pH (Crompton, 1999) et - Bax, protéine pro-apoptotique de la famille des Bcl-2 (Marzo et al.,

1998b), mais également de façon indirecte par : - des caspases, - des céramides, - la protéine

p53 (suppresseur de tumeur), capables de moduler l’activité de protéines de la famille des

Bcl-2 (cf chapitre La famille des Bcl-2).

Les conséquences de l’ouverture des mégapores sont multiples: rupture du

métabolisme énergétique, formation de radicaux libres lors du découplage de la chaîne

respiratoire, libération de facteurs apoptotiques séquestrés dans la matrice, comme le

cytochrome c, des caspases, AIF (Apoptosis Inducing Factor), augmentation de la

concentration de Ca2+ intracellulaire…(Petit et al., 1997; Gross et al., 1999). Cette altération

des mitochondries se produit avant les changements biochimiques de la membrane plasmique

et la fragmentation de l’ADN.

68

III- LES MECANISMES MOLECULAIRES DE L’APOPTOSE

L'apoptose peut être divisée en trois phases séquentielles dans le temps, (1) la phase

d'initiation, (2) la phase d'exécution, toutes deux réversibles et modulables par des facteurs

anti-apoptotiques, et (3) la phase de dégradation protéolytique et nucléaire qui est irréversible

et se traduit par des modifications morphologiques et biochimiques (Figure 12).

Figure 12: Modélisation du processus apoptotique

(1) la phase d’induction: de nombreux signaux très différents, physiologiques comme

pathologiques, intra comme extracellulaires ont été identifiés comme pouvant déclencher

l’apoptose. Ainsi l’apoptose peut être induite par la carence en facteurs de croissance (NGF,

Il-2), par certains récepteurs membranaires (Fas, ΤΝF-R) lorsqu’ils sont stimulés et liés à

leurs ligands, par des dommages intracellulaires causés par radiations ionisantes, des agents

cytotoxiques, chocs osmotiques…

(2) la phase d’exécution: les différents signaux de mort sont alors intégrés par la cellule qui,

en fonction de son phénotype et de son état physiologique, va orienter sa réponse vers la mort

ou la prolifération. Cette intégration fait appel à un certain nombre de médiateurs

intracellulaires anti- ou pro-apoptotiques tels que les caspases, le stress oxydant, les protéines

de la famille de Bcl-2, les céramides...

(3) la phase de dégradation: en dépit de la diversité de ces signaux de mort, toutes les

cellules engagées dans le processus apoptotique montrent des modifications morphologiques

et biochimiques similaires suggérant l’existence d’une phase effectrice commune à tous les

types cellulaires.

Signal Médiateurs intracellulaires

Intégrationdes signaux Effecteurs

Mort cellulaire

(1) phase d’initiation

(2) phased’exécution

(3) phase dedégradation

Phases réversibles et modulables:

* Mitochondrie ?* ...

Phase irréversible:

* dommagescellulaires

* récepteursde mort

* carences enfacteurs decroissance

* radiations* drogues* ...

* caspases initiatrices* famille des Bcl-2* céramides* ROS* p53* kinases/phosphatases* facteurs de transcription* IAP* ...

* caspases effectrices* nucléases

* protéolyse* dégradation de l’ADN

69

1- La phase d’induction: les signaux de mort

La phase d’induction de l’apoptose peut être déclenchée par des stimuli aussi variés que

des radiations ionisantes (Farrell et al., 1998), une carence en facteurs de croissance

(Martinou et al., 1999; Tammariello et al., 2000), des drogues cytotoxiques (Bose et al.,

1995; Boland et al., 1997), du glucose (Kaneto et al., 1996), des acides gras (Paumen et al.,

1997; Shimabukuro et al., 1998a et b) ou des cytokines, notamment celles de la famille des

TNF (TNF-α, Fas-L…) par l'intermédiaire de leurs récepteurs, appelés également «récepteur

de mort». Les membres de la famille du TNF-R possèdent un domaine de mort cytoplasmique

(DD ou Death Domain), essentiel pour l’exécution du programme apoptotique (Itoh et

Nagata, 1993). Parmi les membres de la famille impliqués dans la mort cellulaire, il convient

de citer les récepteurs Fas ou CD95 (Itoh et al., 1991), TNF-R1 ou p55 (Loetscher et al.,

1990), TRAIL-R1 et TRAIL-R2 (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) (Chaudhary et

al., 1997). Expérimentalement, l'apoptose peut également être induite par des céramides

exogènes (Obeid et al., 1993) ou des ROS (Goldkorn et al., 1998).

2- De C. elegans aux mammifères

La majeure partie de nos connaissances actuelles sur les mécanismes moléculaires de

la régulation de l’apoptose provient de travaux menés sur le nématode Cænorhabditis elegans

(Hengartner et al., 1994). Ainsi, la sélection par mutagenèse chimique de larves au cours du

développement a permis l’identification de 11 gènes impliqués dans la régulation de la mort

cellulaire programmée chez C. elegans. Parmi ceux-ci trois furent identifiés comme des

régulateurs clés de l’apoptose dans toutes les cellules somatiques. Il s’agit de CED-3, CED-4

et CED-9 (CED pour le gène Cænorhabditis elegans death). CED-3 et CED-4 sont tous deux

requis pour l’apoptose, alors que CED-9 régule négativement ce phénomène.

Le clonage de ces différents gènes a révélé que (Figure 13)

- CED-3 code pour une protéase à cystéine homologue à l’enzyme de conversion de

l’IL-1β: ICE (Interleukin Converting Enzyme) maintenant désignée comme caspase-1 (Yuan

et al., 1993).

- CED-4 code pour une protéine ayant des homologies avec la protéine humaine

APAF-1 (Zou et al., 1997).

- CED-9 code pour une protéine homologue à la protéine anti-apoptotique Bcl-2,

préalablement identifiée chez l’Homme (Hengartner et al., 1994).

70

Figure 13: Conservation des différentes grandes familles de protéines impliquées

dans l’apoptose du nématode aux vertébrés.

3- Les caspases

Certaines protéases ne sont pas simplement des enzymes de dégradation mais des

molécules de signalisation hautement régulées contrôlant des processus biologiques critiques

pour la cellule par le biais de protéolyses limitées et spécifiques. Une famille de protéases, les

caspases, illustre parfaitement ce concept. En effet, de nombreuses études, menées plus

particulièrement au cours de la dernière décennie, ont mis en évidence que ces protéases

jouaient un rôle clef dans la signalisation de l’apoptose. Les caspases, présentes sous la forme

de zymogènes inactifs et activées en réponse à des signaux apoptotiques induisent le

démantèlement et la déstructuration de la cellule en clivant de façon spécifique des protéines

cellulaires clefs.

3-1- La nomenclature et les différentes classifications des caspases

Les caspases ont été impliquées dans l’apoptose avec la découverte du gène ced-3 et

l’identification d’un analogue de son produit (CED-3) chez les mammifères, la protéase à

cystéine ICE (Yuan et al., 1993). Ces travaux précurseurs ont conduit à l’identification d’un

nombre croissant de protéases à cystéine, présentant des homologies de séquences avec CED-

3. Ces protéases présentent une spécificité stricte de clivage de leur substrat après un résidu

acide aspartique. Une nouvelle nomenclature proposée par Alnemri et al. (1996) les regroupe

désormais sous le nom de caspases (cysteine aspartate-specific proteases). L’ICE, qui fut

chronologiquement la première identifiée, a donc été tout naturellement rebaptisée caspase-1.

A ce jour, 14 caspases ont été identifiées.

C. elegans Vertébrés

CED-9

CED-4

CED-3

Bcl-2

APAF-1

Caspases

EGL-1 Bik/BakInhibiteurs des régulateurs

Protéases

AdaptateursRégulateurs

71

Différentes classifications de ces protéases ont été proposées en fonction du critère de

comparaison (Figure 14):

(1) L’analyse phylogénétique des caspases a permis de définir trois sous familles: les

famille de la caspase-1 (les caspases-1, 4, 5, 11), la famille de la caspase-2 (les caspases-2, 9)

et la famille de la caspases-3 (les caspases-3, 6, 7, 8, 10) (Alnemri et al., 1996).

(2) En revanche, sur la base de leur spécificité de substrat, les caspases ont pu être

classées différemment en trois sous groupes: le groupe I dont le substrat préférentiel est

[W/L]EHD, le groupe II et le groupe III (Figure 14). Alors que les protéases du groupe II

exigent un résidu aspartate à la fois en position -1 et en -4 du site de clivage protéolytique

(DXXD), les protéases du groupe III sont plus tolérantes vis à vis du résidu aminoacide en

position –4 (XE[I/T/H/V]D) (Thornberry et al., 1997).

(3) La troisième classification proposée tient compte de la fonction des différentes

caspases. Deux grands groupes ont été ainsi définis: les caspases impliquées dans

l’inflammation, responsables de l’activation de cytokines et les caspases apoptogènes

activées au cours de la transduction d’un signal de mort. Se distinguant par leur temps

d'implication dans la voie de signalisation de l'apoptose, ces dernières ont été classées en

deux sous-groupes: les caspases initiatrices, activées au cours la phase d'initiation de

l'apoptose (caspases-2, 8, 9, 10) et les caspases effectrices, activées en cascade par des

caspases initiatrices et impliquées dans la phase de dégradation de l'apoptose (caspases-3, 6,

7) (Alnemri, 1999).

Figure 14: Les différentes classifications des caspases

45

111

3768

10

92

Caspase Groupe

IIII

IIIIIIIIIIIII

IIIII

Substrat préférentiel

(W/L)EHD-X/YVAD-X(W/L)EHD-X

? WEHD-X

DEVD-XDEVD-X

VEHD-X/VEID-NLETD-X

IEXD-X/LEXD-X

LEHD-XVDVAD-X/DEHD-X

Activation de cytokines

Caspasesinitiatrices

Caspaseseffectrices

Famille de la caspase-1

Famille de la caspase-3

Famille de la caspase-2

72

3-2-Les descriptions structurales

Toutes les caspases sont synthétisées sous forme de pro-enzymes inactives. Elles

présentent une séquence peptidique conservée, comprenant un prodomaine N-terminal de

longueur variable, un domaine qui deviendra après clivage la grande sous-unité (de 17 à 21

kDa), nommée p20, et un domaine C-terminal qui constituera la petite sous-unité (de 10 à 14

kDa), nommée p10 (Figure 15).

Les prodomaines sont variables à la fois dans leur taille et dans leur séquence. Ainsi les

caspases-3, 6, 7 ont un prodomaine court (contenant moins de 29 résidus acides aminés) alors

que les caspases-1, 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11 ont un prodomaine long (contenant au moins 103

résidus acides aminés, et jusqu’à 200 résidus pour les caspases-8, 10). Les segments N-

terminaux des caspases-8 et 10 contiennent des domaines effecteurs de mort (DED, death

effector domain), alors que les caspases-1, 2 4 et 9 possèdent un domaine de recrutement des

caspases (ou caspase recruitment domain: CARD). Ces différents domaines (DED et CARD)

sont impliquées dans le processus d’activation des caspases par des interactions protéines-

protéines (Chapitre III-3-3-).

Epissage alternatif des caspases-10 et 2

Pour résumer, le masse moléculaire de chacun des précurseurs dépend essentiellement

de la longueur du prodomaine. Toutefois, plusieurs isoformes de tailles distinctes des

caspases-2 et 10 ont été mises en évidence. Ces isoformes résultent d’un épissage alternatif de

l’ARNm. Ainsi, 4 isoformes ont pu être isolées pour la caspase-10 (nommées 10-a, 10-b, 10-c

et 10-d) (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincenz et Dixit, 1997; Ng et al., 1999). Les

premières isoformes découvertes, 10-a (53 kDa) et 10-b (59 kDa), diffèrent d’un fragment

peptidique (6 kDa) contenu dans la grande sous-unité et de la composition de leur sous-unité

p10. La caspase-10-c (30 kDa) est une protéine tronquée, constituée essentiellement du

prodomaine. Bien qu’elle ne présente pas d’activité protéolytique in vitro, elle est toutefois

capable d’induire l’apoptose in vivo. Enfin la caspase-10-d (59 kDa) est un hybride des

caspases-10-a et 10-b puisqu’elle comporte la sous-unité p10 de la forme 10-a et la sous-unité

p20 de la forme 10-b. Alors que les 4 isoformes de la caspase-10 sont apoptogènes, la

caspase-2, présente sous deux isoformes 2L (48 kDa) et 2S (34 kDa), est capable de réguler

positivement (2L) et négativement (2S) l’apoptose (Wang L. et al., 1994).

Etant donné l’hétérogénéité et les fonctions variables des caspases, j’ai choisi, pour des

raisons de clarté et d’adéquation à mon travail de recherche, de ne traiter par la suite que les

caspases apoptogènes, les caspases initiatrices et effectrices.

73

3-3-Les mécanismes d’activation des caspases

La conversion de la caspase de l’état de zymogène en un enzyme mature nécessite au

moins deux clivages protéolytiques limités au niveau des résidus acides aspartiques, flanquant

chacun la grande sous-unité. Les éléments protéiques de l’enzyme ainsi libérés vont pouvoir

s’assembler de sorte à former un hétérodimère actif de structure générale (p10/p20)2, dont le

domaine catalytique contient la séquence consensus QACXG (Gln-Ala-Cys-X-Gly) (Walker

et al., 1994) (Figure 15).

Figure 15: Mécanisme général d’activation des caspases par protéolyse

Les caspases, protéolysées sur le versant COOH d’un résidu aspartate, ont la

caractéristique de cliver leur substrat également après un aspartate. Ceci leur confère ainsi la

capacité de s’autoactiver et/ou d’être activée par d’autres caspases. Il peut donc y avoir une

cascade d’activation entre les différentes caspases. Une fois les caspases initiatrices activées

(mécanisme d’autoactivation), elles vont pouvoir cliver d’autres caspases encore à l’état de

zymogène, notamment les caspases effectrices (mécanisme d’hétéroactivation).

3-3-1-L’autoactivation des caspases initiatrices

L'autoactivation des caspases initiatrices implique l’oligomérisation des zymogènes,

sous le contrôle de protéines adaptatrices. Ces molécules adaptatrices couplent les

procaspases aux senseurs apoptotiques, tels que les récepteurs de mort ou la mitochondrie. Il

en résulte une concentration locale élevée en proenzymes permettant la protéolyse inter- et

intra-moléculaire.

Prodomaine p20 p10 Procaspase

Caspase matureet active

domaine catalytique

Clivages protéolytiques

QACXG

QACXG

QACXG

74

L’activation des procaspases-2, 8, 10

L’activation des caspases 2, 8 et 10 résulte de la stimulation de récepteurs

membranaires de mort. En réponse à un ligand, le récepteur se trimérise et recrute des

protéines adaptatrices par son domaine de mort DD (figure 16).

La procaspase-8 (Kischkel et al., 1995) ou la procaspase-10 (Kischkel et al., 2001)

oligomérisent par l'intervention de la protéine adaptatrice FADD (Fas protein with DD) au

niveau de leur domaine DED. FADD, par son domaine DD, peut être directement couplé au

récepteur Fas (Chinnaiyan et al., 1995) ou indirectement au TNF-R1 par l’intermédiaire de

TRADD (TNF-R Associated protein with DD) (Hsu et al., 1995) (Figure 16). Le complexe,

ainsi constitué du récepteur, de FADD et de la procaspase, est nommé DISC (death-inducing

signaling domains DED complex).

Le recrutement de la caspase-2 au récepteur se fait par l’interaction séquentielle de

TRADD, sur le domaine CARD de la caspase (Hsu et al., 1995) avec d’autres protéines, sur

les domaines DD, la sérine/thréonine kinase RIP (Receptor Interacting Protein) (Stanger et

al., 1995) et la protéine RAIDD (RIP-Associated ICH-1/CED-3-homologous protein with

DD) (Duan et dixit, 1997) (Figure 16).

Figure 16: L’autoactivation des caspases initiatrices 2, 8 et 10

DD: domaine de mort DED: domaine effecteur de mortCARD: domaine de recrutement des caspasesDISC: complexe de mort (récepteur, FADD, procaspase-8 ou 10)

procaspase-8 ou -10

Fas

FADD

TNF-R1

TRADDFADD

TNF-R1

DISC

procaspase-2

RAIDD

RIPTRADD

75

L’activation de la procaspase-9

Le mécanisme de maturation de la caspase-9 est comparable à celui des caspases

initiatrices 2, 8 et 10. Son activation dépend de la formation d’un complexe multiprotéique,

nommé apoptosome (Li P. et al., 1997), constitué du cytochrome c libéré de la mitochondrie,

de l’homologue humain de CED-4 (Zou et al., 1997): APAF-1 (Apoptotic Protease-

Activating Factor-1), d’ATP et de la procaspase-9 (Zou et al., 1999) (Figure 17).

Dans ce complexe, APAF-1 joue le rôle de protéine adaptatrice. Il possède en effet une

région de liaison CARD, impliquée directement dans le recrutement de la procaspase-9 (Li P.

et al., 1997). Lorsque les cellules sont quiescentes, APAF-1, est séquestré à la surface de la

mitochondrie (Zou et al., 1997) dans une conformation tridimensionnelle inactive. Dans un

contexte apoptotique, le cytochrome c et l’ATP lient APAF-1, induisant un changement

conformationnel permettent de démasquer alors la région CARD: la procaspase-9 est ainsi

recrutée.

Figure 17: La formation de l’apoptosome et l’activation de la caspase-9

3-3-2-La transactivation des caspases effectrices

Les caspases-3, 6 et 7, regroupées sous le nom de caspases effectrices, ne peuvent être

activées par un mécanisme d’autoactivation. En effet, ces protéases disposent d’un

ATP Remaniement conformationnel

Cytochrome cAPAF-1

Mitochondrie

CARD

CARD

CARDATP

ATP

ATP CARD

ATPCARD

CARDCARDCARD

Procaspase-9

Oligomérisation

76

prodomaine court incapable d’initier leur oligomérisation et leur activation. Ainsi leur clivage

protéolytique est pris en charge par d’autres caspases, généralement des caspases initiatrices.

Des études, menées sur des extraits cellulaires (Srinivasula et al., 1996; Muzio et al., 1997)

ou sur des cellules de levures transfectées (Kang et al., 1999), ont en effet démontré que les

caspases initiatrices sont capables d’activer efficacement les caspases effectrices. Dans ces

systèmes, l’activation protéolytiques des procaspases 3 et 7 par l’action directe des caspases-8

et 10 a été mise en évidence (Nagata, 1997; Stennicke et al., 1998; Kang et al., 1999). De

même, la caspase-9 est capable d’induire l’activation des procaspases-3 et 7 (Li P. et al.,

1997; Srinivasula et al., 1998). Alors que le clivage des procaspases-3 et 7 peut résulter de

l’action directe des caspases-8, 9 et 10, des expériences in vitro montrent que la procaspase-6

est clivée uniquement par les caspases-3 et 7 (Srinivasula et al., 1998; Slee et al., 1999).

Ainsi, les caspases-8, 9, 10 sont décrites comme les protéases gouvernant l’activation

séquentielle des caspases effectrices dans l’apoptose médiée par les récepteurs ou par la

mitochondrie. Ce type d’activation en cascade permettrait la régulation et l’amplification du

signal apoptotique.

Toutefois, des études in vitro démontrent que les caspases effectrices peuvent également

cliver des caspases initiatrices. Par exemple, la caspase-3 est douée d’une activité

protéolytique vis-à-vis de la procaspase-8 (Stennicke et al., 1998) et des procaspases-2 et 9

(Slee et al., 1999). La caspase-6 active est également capable de protéolyser les caspases

initiatrices-8 et 10 (Slee et al l, 1999). Ces différents travaux suggèrent l’existence d’une

boucle de rétrocontrôle in vivo.

3-4-Les mécanismes de contrôle de l’activation des caspases

Etant donné les effets dévastateurs que pourrait avoir une activation inopportune des

caspases, il n’est pas surprenant que ces acteurs moléculaires de l’apoptose soient étroitement

modulés. En effet, leur activation protéolytique et leur activité enzymatique sont finement

régulées. Leur localisation dans certains compartiments subcellulaires représenterait

également un mode de régulation de ces protéases.

3-4-1- La régulation par phosphorylation

De nombreuses études ont rapporté que l’apoptose pouvait être régulée par des protéines

kinases et des protéines phosphatases (Anderson, 1997). Des études in vitro suggèrent que les

caspases sont des phosphoprotéines. Par exemple, un marquage métabolique de cellules au

77

32P, suivi d’un stimulus apoptotique, a révélé que plusieurs caspases étaient radiomarquées et

que leur phosphorylation inhibait leur activité enzymatique (Martins et al., 1998).

Une autre étude indique que la protéine kinase Akt, activée par des facteurs de

croissance, peut phosphoryler spécifiquement la caspase-9, inhibant ainsi son clivage

protéolytique dépendant du cytochrome c et son activité enzymatique (Cardone et al., 1998).

3-4-2-La régulation redox des caspases

La génération de ROS est susceptible d’affecter directement l’activité enzymatique des

caspases, protéases contenant une cystéine dans leur site actif. Ces dernières requièrent en

effet la présence du groupement thiol réduit pour leur fonction protéolytique (Nobel et al.,

1997; Hampton et al., 1998). La régulation négative des caspases par les ROS a été suggérée.

Par exemple, l’activité enzymatique des caspases, mesurée dans les lysats de cellules Jurkat T

traitées avec Fas-L, est inhibée par l’addition directe de peroxyde d’hydrogène (Hampton et

Orrenius, 1997). Par la suite, cette équipe a également montré, dans les neutrophiles activés

par un ester de phorbol, que l’activité enzymatique de caspases n’est détectée que lors d’une

inhibition de la NADPH-oxydase: la baisse de la production de ROS potentialise ainsi

l’activité protéolytique des caspases (Fadeel et al., 1998). Mais les ROS sont décrits comme

des inducteurs de l’apoptose. Des études de cinétiques d’induction de l’apoptose par le

peroxyde d’hydrogène ont montré en réalité que l’activation de caspases est observable

quelques heures après la génération de ROS (Hampton et Orrenius, 1997). Alors que les

espèces radicalaires inhibent directement l’activité des caspases, elles induisent des

altérations de la mitochondrie, dont l’ouverture des pores de transition de perméabilité. Il en

résulte une libération du cytochrome c, l’activation de la caspase-9 et des caspases effectrices

(Kluck et al., 1997; Stridh et al., 1998).

L'activité des caspases semble également être régulée par une S-nitrosylation

réversible du groupement thiol du site actif. Il a été en effet montré in vitro que la fixation du

monoxyde d’azote (NO) abolit aussi bien l’activation protéolytique (Li J. et al., 1999) que

l’activité enzymatique des caspases (Li J. et al., 1997). Ainsi, NO, présentant également un

rôle pro-apoptotique (Kolb, 2001), peut réguler l’apoptose de certains types cellulaires, tels

que les lymphocytes, les neutrophiles ou les hépatocytes, en inhibant directement les

caspases.

78

3-4-3-La localisation subcellulaire des caspases

Longtemps, les procaspases ont été décrites comme des protéines uniquement

cytosoliques. Des études récentes ont montré que certaines caspases sont également présentes

dans la mitochondrie. En effet, les zymogènes des caspases-2 et 9 (Susin et al., 1999a), de la

caspase-3 (Mancini et al., 1998) et de la caspase-8 (Qin et al., 2001) ont pu être localisés dans

l’espace intermembranaire mitochondrial. Ce n’est qu’en présence d’un signal apoptotique

qu’ils sont libérés dans le cytoplasme où ils sont alors clivés en caspases actives. D’autre part,

les caspases semblent également pouvoir migrer du cytoplasme vers le noyau. En effet, la

présence de la caspase-9 active dans le noyau de neurones et de cardiomyocytes (Susin et al.,

1999) a été démontrée. La localisation nucléaire transitoire de la caspase-3 a également été

mise en évidence (Krajewska et al., 1997). Enfin, la découverte d’un signal de localisation

nucléaire dans le prodomaine de la caspase-2 (Colussi et al., 1998) est un autre argument pour

proposer un rôle fonctionnel des caspases au niveau du noyau.

Ainsi, la séquestration des procaspases dans des compartiments cellulaires (la

mitochondrie ou le cytoplasme) semble constituer un mode de régulation de ces protéases, en

limitant leur activation et en les maintenant à distance de leurs substrats dans les cellules en

vie.

3-4-4-Les inhibiteurs de caspases

L’étape de recrutement des caspases initiatrices aux récepteurs de mort peut être régulée

par une protéine nommée FLIP (FLICE (caspase-8) Inhibitory Protein), identifiée initialement

chez le virus de l’herpès et le virus molluscipox. FLIP contient deux domaines effecteurs de

mort (DED) qui lui permet de lier la protéine adaptatrice FADD et/ou les caspases 8 et 10

(Thome et al., 1997), les rendant ainsi inaccessibles lors de la mise en place du complexe

moléculaire apoptotique sous-membranaire (DISC) (Droin et al., 2001).

La grande famille des protéines homologues à Bcl-2 joue un rôle majeur dans la

régulation de l’apoptose en contrôlant la libération du cytochrome c de la mitochondrie et

l’activation séquentielle de la caspase-9 et des caspases effectrices (chapitre III-4). La

libération du cytochrome c n’apparaît pas comme suffisante pour induire l’activation de la

caspase-9 et des caspases effectrices. En effet, des protéines appartenant à la famille des IAPs

(Inhibitor of Apoptosis Proteins) maintiennent la caspase-9 et les caspases effectrices (3, 7)

inactives, selon un mécanisme d’inhibition compétitive (Deveraux et Reed, 1999). Cette

inhibition est levée par une protéine mitochondriale smac, alors libérée dans le cytosol au

cours du processus apoptotique (Du C. et al., 2000).

79

Les caspases peuvent également être inhibées, de façon plus ou moins spécifique, par

des inhibiteurs peptidiques synthétiques (Garcia-Calvo et al., 1998), développés dans

l’optique d’élucider leur rôle au cours du processus apoptotique. Ces peptides, constitués

généralement de 4 résidus d’acides aminés dont l’aspartate en position P1, miment le site de

clivage des substrats naturels des caspases (Figure 14). Ils sont rendus perméables aux

cellules par des groupements chimiques bloquant les fonctions NH2 et COOH terminales,

comme par exemple les groupements benzyloxycarbonyl (z) ou acétyl (Ac) pour la fonction

NH2 et les groupements aldéhyde (CHO) ou fluorométhylcétone (fmk) pour la fonction

COOH. La structure générale des ces inhibiteurs peptidiques peut être ainsi décrite: z/Ac-

XXXD-CHO/fmk (X définissant un résidu d’acide aminé). Les dérivés aldéhydiques sont des

inhibiteurs réversibles (XXXD-CHO), tandis que les composés méthylcétones (XXXD-fmk),

qui réagissent avec la cystéine du site actif des caspases, sont des inhibiteurs irréversibles.

Initialement synthétisés pour des études in vitro, de rares études rapportent l’utilisation

des ces dérivés peptidiques chez l’animal. Par exemple, l’injection intraveineuse de

l’aspartate modifié z-D-fmk (dérivé néanmoins non spécifique d’une caspase) prévient

l’apoptose dans le foie de rats induite par une ischémie/reperfusion (Cursio et al., 1999). Le

challenge actuel est de développer des inhibiteurs non-peptidiques hautement spécifiques

d’une caspase ciblée, en vue d’une possible utilisation à visée thérapeutique. L’identification

récente de dérivés de la nitroisatine, inhibiteurs sélectifs des caspases-3 et-7 (Lee et al.,

2000), ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques.

3-5- Les substrats protéolysés par les caspases

Le rôle fondamental des caspases est d’éteindre les systèmes de protection cellulaire

en inactivant des protéines impliquées dans le maintien de l’intégrité cellulaire ou la

résistance à l’apoptose, et d’activer des protéines qui participent à la destruction cellulaire.

L’action des caspases sur leurs différents substrats induit l’isolement des cellules

apoptotiques des cellules environnantes, des perturbations du cytosquelette, des altérations de

la réplication et de la réparation de l’ADN, la fragmentation nucléaire et enfin la

désintégration générale de la cellule. C’est en ce sens que les caspases, notamment les

caspases effectrices, sont considérées comme les acteurs moléculaires principaux de la phase

de dégradation au cours du processus apoptotique.

Un grand nombre de protéines substrats de protéolyse par des caspases, autres que les

procaspases, ont été identifiées. Les protéines cibles, clivées après un résidu Asp, regroupent

des protéines impliquées dans la dégradation et la réparation de l’ADN ou dans certaines

80

cascades de signalisation, des protéines cytoplasmiques, nucléaires, ou encore des protéines

des membres de la familles du protooncogène Bcl-2. A titre d’exemple, le clivage de la

protéine ICAD, Inhibiteur de CAD (Caspase-Activated Desoxyribonuclease) induit une perte

d’inhibition de la nucléase CAD menant à la fragmentation de l’ADN nucléaire (Enari et al.,

1998). La dégradation de l'ADN est un phénomène associé à une baisse de la réparation de

l'ADN. Par exemple, le clivage de la protéine PARP (poly(ADP-ribose) polymerase) conduit

à une perte de l’activité de cet enzyme à réparer l’ADN (Lazebnik et al., 1994). Les caspases

clivent également les protéines de la lamina nucléaire, telles que la lamine A (Takahashi et

al., 1996), contribuant à la condensation chromatidienne observée lors du phénomène

apoptotique. Des protéines du cytosquelette, telles que l’actine (Mashima et al., 1997) ou des

protéines impliquées dans le remodelage du cytosquelette, comme Gas-2 (Brancolini et al.,

1995), sont également clivées, menant à la déstructuration et au réarrangement du

cytosquelette et au bourgeonnement de la membrane plasmique. Certaines protéines kinases

sont également clivées par les caspases (PKCδ: Emoto et al., 1995; MEKK-1: Cardone et al.,

1997), produisant des formes tronquées constitutivement actives. Il semblerait que ces kinases

activent en cascade la voie SAPK/JNK (Cardone et al., 1997; Lee et al., 1997), menant à la

phosphorylation de facteurs de transcription, comme c-jun, et régulant la transcription de

gènes. Des protéines anti-apoptotiques de la famille des Bcl-2 sont également clivées. Cette

protéolyse permet d’abolir leurs propriétés protectrices et de produire également des

fragments capables d’induire l’apoptose (Bcl-2: Cheng et al., 1997) alors que le clivage de

certains membres pro-apoptotiques potentialise leurs effets (Bid: Li H. et al., 1998)

Il faut noter aussi que certains substrats ne sont pas clivés dans tous les types

cellulaires. L’actine, par exemple, clivée dans les neurones ou les thymocytes (Villa et al.,

1998) ou la lignée cellulaire U937 (Mashima et al., 1997), n’est pas dégradée dans d’autres

types cellulaires, telles que les péricytes (Shojaee et al., 1999), ou de nombreuses lignées

cellulaires tumorales (Rice et al., 1998). Cette hétérogénéité pourrait refléter des variations

dans l’accessibilité du substrat par les caspases.

3-6-L’apoptose caspase-indépendante

L’implication des caspases dans le processus apoptotique est bien établie. Certaines

études, menées notamment au sein du groupe de G. Kroemer, ont montré cependant que

l’apoptose peut être induite sans la participation de caspases. Ce type d’apoptose semble être

contrôlé par un facteur protéique libéré de la mitochondrie: AIF (Apoptosis Inducing Factor)

81

(Susin et al., 1996; Susin et al., 1999b; Daugas et al., 2000). AIF est une protéine homologue

à la ferredoxine bactérienne ou aux NADH-oxydoréductases, mais qui présente également

une activité protéasique (Susin et al., 1996). Au cours du processus apoptotique, AIF, localisé

dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie, est relargué dans le cytoplasme puis

transloqué dans le noyau, où il est capable d’induire à lui seul la condensation de la

chromatine nucléaire et générer des fragments d’ADN (Susin et al., 1999b; Daugas et al.,

2000).

4- La famille de Bcl-2

Les protéines de la famille de Bcl-2 sont les principales actrices de la régulation du

processus apoptotique. Bcl-2 a été la première protéine homologue de CED-9 décrite chez les

mammifères (Vaux et al., 1988). La translocation t(14, 18) retrouvée dans les lymphomes

folliculaires de type B a conduit à l’identification du proto-oncogène Bcl-2 (B cell

lymphoma) chez l’Homme (Tsujimoto et al 1984). Depuis sa mise en évidence, Bcl-2 s’est

révélée faire partie d’une famille sans cesse croissante de protéines régulatrices de l’apoptose.

Si on se réfère à leur fonction biologique, les protéines de la famille de Bcl-2 peuvent être

classées en deux sous-familles: des protéines anti-apoptotiques, telles que Bcl-2 (Hockenbery

et al., 1990), Bcl-XL (Boise et al., 1993), Bcl-W (Gibson et al., 1996) et des protéines pro-

apoptotiques, telles que Bax (Oltvai et al., 1993), Bcl-XS (Boise et al., 1993), Bad (Yang et

al., 1995), Bid (Wang et al., 1996).

Tous les membres de la famille de Bcl-2, à l’exception de Bad et Bid, sont des

protéines membranaires, présentes principalement dans la membrane externe mitochondriale

mais également dans le réticulum endoplasmique ou la membrane nucléaire externe (Nguyen

et al., 1993; Akao et al., 1994). A l’inverse, Bad et Bid sont des protéines cytosoliques dont la

translocation vers la mitochondrie et l’insertion dans la membrane mitochondriale s’effectue

au cours du processus apoptotique (Del Peso et al., 1997; Li H. et al., 1998; Wang et al.,

1999).

4-1-Le rôle des protéines de la famille de Bcl-2

Le mécanisme prédominant par lequel les membres de la famille Bcl-2 régulent

l’apoptose semble être le contrôle de la formation de l’apoptosome (cytochrome c/APAF-

1/caspase-9), en modulant la fuite mitochondriale du cytochrome c. En effet, alors que Bcl-2

(Kluck et al., 1997) ou Bcl-XL (Vander Heiden et al., 1997) inhibent l’apoptose en bloquant

82

directement la sortie du cytochrome c, la surexpression ou l’activation de Bax dans des

cellules (Pastorino et al., 1998) conduit à la libération du cytochrome c.

Deux mécanismes de régulation de la libération du cytochrome c par les protéines de

la famille de Bcl-2 ont été proposés. Ces protéines contrôleraient l’ouverture des mégapores

mitochondriaux en se liant avec une protéine constitutive de ce complexe: l’ANT (Adenosine

Nucleotide Translocator) (Marzo et al., 1998a), induisant ainsi la transition de la perméabilité

mitochondriale, l’effondrement de ∆Ψm et menant à la rupture de la membrane externe

mitochondriale (Figure 18). Mais la formation de grands canaux à cytochrome c est

également proposée. L’équipe de Martinou a démontré récemment la capacité de Bax à

polymériser (Antonsson et al., 2000) et à s’insérer dans la membrane mitochondriale pour

former des grands canaux permettant le passage de cytochrome c (Antonsson et al., 2001),

sans gonflement osmotique ni rupture physique de la membrane (Martinou et al., 1999)

(Figure18).

Divers travaux démontrent par ailleurs que les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 sont

également impliquées dans le maintien de l’intégrité mitochondriale. En effet Bcl-2, ou ses

Bax (ou bax-like protéine)

ANT (Adenosine Nucleotide Translocator)

VDAC (voltage-dependant anion channel)

cytochrome C

Matrice

Membrane interne

Membraneexterne

Eau/solutésBcl-2/Bcl-XL

A ) Rupture de la membraneexterne mitochondriale

B ) Formation d’un grand canal

Molécules < 1.5 kDa

∆Ψm

Mégapore

Figure 18 : La sortie du cytochrome c mitochondrial: deux mécanismes proposés

Crêtes

83

homologues, est capable de bloquer la génération de ROS (Kane et al.,1993), de stabiliser le

potentiel transmembranaire en régulant le flux de protons (Vander Heiden et al., 1999), ou

encore de moduler l’homéostasie du calcium mitochondrial (Zhu et al., 1999). Le blocage de

la sortie du cytochrome c par les protéines anti-apoptotiques peut être décrit comme la

conséquence indirecte de leurs effets protecteurs sur l’homéostasie mitochondriale. En effet,

Bcl-2 préviendrait la fuite du cytochrome c en compensant le déséquilibre ionique,

probablement à l’origine de la baisse de ∆Ψm, de l’ouverture des mégapores et de la rupture

de la membrane externe mitochondriale. Il semble en fait que les protéines anti-apoptotiques

régulent plus la physiologie mitochondriale que la simple redistribution du cytochrome c.

4-2-La régulation de la fonction des protéines de la famille de Bcl-2

Une des caractéristiques importantes des protéines de la famille de Bcl-2 est de

pouvoir former des homo- ou des hétérodimères. Il semble en fait que l’équilibre entre la vie

ou la mort soit influencé par le type et la proportion de dimères anti ou pro-apoptotiques

(Oltvai et al., 1993). Ainsi, la formation majoritaire de dimères anti-apoptotiques préserve la

vie cellulaire, alors que la présence accrue de dimères pro-apoptotiques conduit vers la mort

cellulaire. La proportion de chaque type de dimères dépend de l'expression de ces protéines,

de leur niveau de phosphorylation ou encore de clivages protéolytiques.

Le niveau d'expression de ces protéines est modulable. Dans certains modèles

cellulaires, les membres pro-apoptotiques, dont la transcription reste silencieuse dans les

cellules saines, sont transcrits en réponse à un signal de mort. Par exemple, la stimulation de

la transcription du gène Bax est sous le contrôle de la protéine p53 (Miyashita et Reed, 1995),

une protéine qui régule le cycle cellulaire lorsque l’ADN est endommagé.

L’exemple le plus caractéristique de la régulation par phosphorylation est celui de la

protéine Bad. Sa localisation subcellulaire et sa translocation du cytosol vers la mitochondrie

sont sous le contrôle d’enzymes de phosphorylation activées en présence de facteurs de

survie, comme les protéines kinases Akt (Del Peso et al., 1997) ou Raf-1 (Wang H.G. et al.,

1994) et d’une phosphatase, la calcineurine (Wang et al., 1999), activée au cours du

processus apoptotique. A l’état phosphorylé, Bad est séquestré dans le cytosol en se liant avec

une protéine soluble nommée 14-3-3, alors que la déphosphorylation de Bad permet sa

translocation vers la mitochondrie et la formation de dimères pro-apoptotiques. Bcl-2 est

également une phosphoprotéine. La phosphorylation de Bcl-2 potentialise sa fonction anti-

apoptotique sans affecter sa localisation subcellulaire (la mitochondrie). Bcl-2 peut être

84

phosphorylée par différents acteurs enzymatiques, comme la PKCα (Ruvolo et al., 1998). Le

taux de phosphorylation de cette protéine est cependant modulé par la protéine phosphatase

2A (PP2A) (Ruvolo et al., 1999), enzyme activée par les céramides, orientant ainsi la cellule

vers la mort.

Alors que l’adressage mitochondrial de Bad est sous le contrôle de l’état de

phosphorylation, la translocation de Bid du cytosol vers la mitochondrie résulte d’un clivage

protéolytique par la caspase-8 (Li H. et al., 1998). Les membres anti-apoptotiques de la

famille de Bcl-2 peuvent également subir des clivages protéolytiques par des caspases, qui

aboutissent à la génération de fragments C-terminaux pro-apoptotiques (Bcl-2: Cheng et al.,

1997).

5- Le stress oxydant Le stress oxydant, résultant d’un déséquilibre entre la production de radicaux libres

dérivés de l’oxygène (ROS) et leur destruction par les défenses antioxydantes, est décrit

aujourd’hui comme un mécanisme impliqué dans la réponse apoptotique (revues voir:

Chandra et al., 2000; Andrieu-Abadie et al., 2001).

Une faible concentration de H2O2 exogène, une espèce oxydante dérivée des ROS

(Hampton et Orrenius, 1997; Goldkorn et al., 1998) ou des peroxydes lipidiques (Sandstrom

et al., 1994) sont en effet capables de provoquer l’apoptose de cellules en culture. Par ailleurs,

de nombreux inducteurs de l’apoptose, comme le TNF-α (Liu et al., 1998), peuvent altérer les

défenses antioxydantes, par exemple le GSH. D’autres inducteurs, tels que les céramides

exogènes (Quillet-Mary et al., 1997), des drogues cytotoxiques comme la daunorubicine

(Mansat-de Mas et al., 1999) ou encore le glucose (Kaneto et al., 1996) peuvent entraîner la

formation de radicaux libres. De plus, de nombreux antioxydants cellulaires, comme la N-

acétyl-L-cystéine (Liu et al., 1998), et des enzymes antioxydantes, comme la glutathion

peroxydase (Nomura et al., 1999), la catalase (Sandstrom et Buttke, 1993) ou la superoxyde

dismutase (Patel, 1998) sont capables de prévenir l’apoptose.

5-1-La formation des espèces radicalaires de l’oxygène (ROS) dans

l’apoptose

Les ROS peuvent être produits dans la cellule par différentes voies, la principale source

étant la réduction d’une molécule d’O2 en radical anion superoxyde (O2-.). L’O2

-. peut être

formé dans certains organites cellulaires, comme les mitochondries lors d’un

dysfonctionnement de la chaîne respiratoire (Kane et al., 1993). La rupture de la chaîne

85

respiratoire mitochondriale induit la fuite d’électrons au niveau de deux sites principaux, le

complexe I et le complexe III (Fernandez-Checa et al., 1998). Les électrons libérés sont alors

capables de réduire l’oxygène pour générer l’O2-.. Divers travaux ont montré une production

de ROS au niveau mitochondrial dans les cellules apoptotiques. Par exemple, le traitement de

cellules avec le TNF-α augmente la production de ROS par la mitochondrie (Schulze-Osthoff

et al., 1992), alors que la surexpression de la superoxyde dismutase à manganèse, enzyme

antioxydante mitochondriale, inhibe l’effet toxique du TNF-α (Wong et Goeddel, 1988). Bien

que les mécanismes moléculaires exacts mis en jeu dans le dysfonctionnement du transfert

d’électrons restent mal définis, la formation de ROS pourrait notamment résulter de la

libération du cytochrome c (Ghafourifar et al., 1999), constituant essentiel du complexe III de

la chaîne respiratoire. La perte du cytochrome c du complexe III bloque en effet le transfert

d’électrons, ceux-ci s’échappent et réduisent l’oxygène. La libération mitochondriale de

cytochrome c, observée dans de nombreux modèles apoptotiques en réponse à différents

agents de mort, s’accompagnerait donc d’une production parallèle de ROS. D’ailleurs, la

protéine Bcl-2, protéine capable de bloquer la fuite du cytochrome c, inhibe également la

génération de ROS (Kane et al., 1993; Cai et Jones, 1998).

Bien que la mitochondrie soit considérée comme le producteur essentiel de ROS, la

génération du radical anion superoxyde l’O2-. peut également dépendre de certaines activités

enzymatiques. La réduction de l’oxygène en O2-. semble surtout catalysée par des NAD(P)H

oxydases membranaires, présentes dans certains types cellulaires, dont l’endothélium

microvasculaire rétinien (Ellis et al., 1998). Une fois formé, le radical O2-. peut se dismuter

spontanément ou par l’action de superoxyde dismutase, aboutissant à la formation de

peroxyde d’oxygène (H2O2). La génération de O2-. par des NAD(P)H oxydases, a été

rapportée au cours de l’apoptose. La déprivation en facteurs de croissance (Tammariello et

al., 2000), le ligand de Fas (Khwaja et Tatton, 1999), ou encore diverses drogues

anticancéreuses (Sizimu et al., 1998) induisent en effet une formation accrue de ROS en

activant des NAD(P)H oxydases. Celles-ci semblent être sous le contrôle de caspases (Simizu

et al., 1998; Khwaja et Tatton, 1999). L’inhibition de ces NAD(P)H oxydases prévient la

libération de cytochrome c et l’activation des caspases effectrices, suggérant un effet des ROS

générés sur l’intégrité mitochondriale. Il a d’ailleurs été montré que le peroxyde d’hydrogène

(exogène) est capable d’induire l’activation de la caspase-9 (via le cytochrome c) et des

caspases effectrices (Yamakawa et al., 2000). Mais d’autres enzymes, comme

l’hypoxanthine:xanthine oxydase (Frank et al., 1998), les NO synthases (Binder et al., 1999;

86

Ghafourifar et al., 1999) ou les lipoxygénases (O'Donnell et al., 1995), peuvent également

être responsables de la formation de ROS au cours du processus apoptotique.

5-2-La modification des défenses antioxydantes dans l’apoptose

En plus d’une production de radicaux libres excédant les capacités de défenses

antioxydantes, l’induction d’un stress oxydant peut également résulter d’une baisse des

antioxydants cellulaires. Des études font état, par exemple, d’une diminution de glutathion

(GSH) dans différents modèles apoptotiques soumis à Fas (Van den Dobbelsteen et al.,

1996), au ΤΝF-α (Liu et al., 1998), à des drogues comme la puromycine (Ghibelli et al.,

1998) ou du glucose (Li W. et al., 1998). L’altération des défenses antioxydantes

enzymatiques a également été rapportée au cours de l’apoptose. Par exemple, dans les

cellules-β de pancréas en apoptose après traitement au TGF-β, la formation accrue de ROS

résulte d’une baisse de l’expression et de l’activité des enzymes GPX et SOD (Islam et al.,

1997).

Par contre, quelques études décrivent une augmentation des antioxydants cellulaires en

réponse à des stimuli de mort, suggérant que ces cellules sont capables de s’adapter et de se

défendre. Par exemple, la résistance à l’apoptose de cellules cancéreuses MCF-7 soumises au

TNF-α (Briehl et al., 1997) a été associée à une augmentation de l’expression de la SOD.

6- Les céramides Les céramides, lipides appartenant au groupe des sphingolipides, sont impliqués dans la

régulation de diverses réponses cellulaires, comme la prolifération, la différenciation et

l’apoptose (Perry et Hannun, 1998). Le mode d’action et la régulation de la production des

céramides ont été particulièrement investis au cours des dix dernières années, du fait d’un rôle

émergent des céramides comme effecteur moléculaire de l’apoptose. Plusieurs études ont

montré en effet une production de céramides intracellulaires dans les cellules apoptotiques,

précédant l’apparition des atteintes biochimiques et morphologiques de l’apoptose, suggérant

que les céramides puissent être impliqués dans la transduction du signal menant à la mort

cellulaire (Kolesnick et Krönke, 1998; Mathias et al., 1998).

6-1-Le métabolisme des sphingolipides

Les céramides occupent un rôle central dans le métabolisme des sphingolipides. Le

métabolisme des céramides débute par la biosynthèse de novo (Figure 19) initiée par une

87

réaction de condensation de la sérine avec du palmitoyl-CoA, pour former la 3-

cétosphinganine, alors réduite en dihydrosphingosine. La céramide synthase

(dihydrocéramide synthase ou sphinganine N-acyl-transférase) catalyse l’acylation de la

dihydrosphingosine en dihydrocéramide. Les céramides, formés sous l’action d'une

désaturase (dihydrocéramide réductase), s'accumulent sur la face cytosolique du RE (Merrill

et Wang, 1992; Michel et Van Echten-Deckert, 1997) et servent de précurseur pour la

synthèse de sphingolipides complexes, comme les sphingomyélines et divers

glycosphingolipides (Figure 19), alors orientés dans différents compartiments subcellulaires.

De façon réciproque, le catabolisme de ces différents sphingolipides complexes s’opère

en étapes successives sous l’action de divers enzymes et peut mener à la formation de

céramides. Par exemple, les sphingomyélines peuvent être catabolisées par des

sphingomyélinases (SMases), des phospholipases C spécifiques des sphingomyélines, qui

hydrolysent la liaison phosphodiester pour libérer des céramides et de la phosphorylcholine

(Figure 19). Différentes isoformes de SMases ont été identifiées et se distinguent

essentiellement par leur pH optimum d’activité. Deux formes de sphingomyélinases acides

(A-SMase) (pH optimum est de 4.5-5.5) ont été identifiées: une forme sécrétée Zn2+-

dépendante (Spence et al., 1989; Schissel, et al., 1996) et une forme cellulaire Zn2+-

indépendante (Barnholz et al., 1966; Levade et al., 1986), localisée dans les compartiments

cellulaires acides, tels que les lysosomes ou les endosomes (Kanfer et al., 1966), mais

également dans les cavéoles de la membrane plasmique (microdomaines riches en SM) de

différents types cellulaires, comme les fibroblastes (Liu et Anderson, 1995; Zundel et al.,

2000). Quatre formes de la sphingomyélinase neutre (N-SMase) (pH optimum d’activité

7.4) ont été identifiées: le premier enzyme décrit est Mg2+-dépendant (Rao et Spence, 1976)

et est associé à la membrane plasmique (Spence et al., 1982), le second est Mg2+-

indépendant et cytosolique (Okazaki et al., 1994), le troisième est Mg2+et DTT-dépendant et

nucléaire (Tamiya-Koizumi et al., 1989) et le quatrième est présent dans la chromatine et

l’enveloppe des noyaux (Alessenko et Chatterjee, 1995). Enfin, la forme alcaline de la

sphingomyélinase (pH optimum de 9) est un enzyme Mg2+ et Zn2+-indépendant, présent

dans la muqueuse intestinale et la bile (Nyberg et al., 1996).

Le catabolisme des céramides implique l’action de céramidases, produisant des acides

gras et de la sphingosine. Trois isoformes pH-dépendantes de céramidases ont été identifiées:

une céramidase acide, localisée dans les lysosomes (Sugita et al., 1972), une céramidase

neutre membranaire (Slife et al., 1989) localisée dans les cavéoles (Romiti et al., 2001) et

une forme neutre-alcaline (El Bawab et al., 1999) localisée dans la mitochondrie (El Bawab

et al., 2000). Dans la plupart des cas, la sphingosine est métabolisée en sphingosine 1-

88

phosphate par une sphingosine kinase (Spiegel et al., 1996) (voie de la sphingosine 1-

phosphate, Figure 19). Les céramidases exercent une fonction importante dans la régulation

des niveaux endogènes de sphingosine et de sphingosine 1-phosphate. En effet, la voie

majoritaire de formation de sphingosine 1-P semble être la dégradation du céramide plutôt

que sa synthèse de novo (Michel et al., 1997).

Figure 19: Métabolisme des sphingolipides et formation des céramides dans l’apoptose.

(d’après Hannun et Luberto, 2000, Cell. Biology)

6-2- Les voies enzymatiques de formation des céramides dans l’apoptose

La formation des céramides au cours du processus apoptotique peut résulter de

l'activation de la biosynthèse de novo ou de l’hydrolyse de sphingomyélines (SM) par

diverses sphingomyélinases. L'activation de ces voies enzymatiques peut être modulée par

des stimuli physiologiques ou environnementaux (Figure 19).

Sérine + Palmitoyl-CoASérine palmitoyl

transferase3-Cétosphinganine

Sphinganine(dihydrosphingosine)

Acide gras-CoA

Dihydrocéramide

Désaturase

Céramide synthase

Céramide

Sphingomyéline

DAG

Sphingosine

Sphingosine 1-phosphate

Glucosylcéramide

GlycolipidesGangliosides (GD3)

Sphingosine 1-Pphosphatase

Sphingosine kinase

PtdCho

SM synthase

Choline-P

SMases

Céramidases

Céramide synthaseGlucosylcéramide synthaseCérébrosidases

biosynthèse de novo

cycle de la sphingomyéline voie des glycosphingolipides

NH

OH

CH2OH

O

CH3 (CH2)n

Stimuli de stress (drogues, radiations…)Acides gras libres

Stimuli physiologiques (TNFα, IL-1β, Fas-L...) +

+

voie de la sphingosine-1-phosphate

Lactosylcéramide

89

L’induction de la synthèse de novo au cours du processus apoptotique a été observée

en réponse à des stimuli de stress, comme des drogues cytotoxiques, la daunorubicine, dans

des lymphocytes (Bose et al., 1995; Boland et al., 1997) ou les radiations ionisantes dans des

cellules de la peau (Farrell et al., 1998). Les acides gras libres, comme le palmitate,

précurseurs métaboliques, sont également capables d'induire l'apoptose de cellules

hématopoïétiques (Paumen et al., 1997) ou des cellules β du pancréas (Shimabukuro et al.,

1998a et b). Normalement dirigés dans la mitochondrie pour entrer dans le cycle de la β-

oxydation, les acides gras libres en excès sont en effet orientés vers la voie de biosynthèse de

novo des céramides, processus impliqué notamment dans la lipotoxicité de la cellule β

observée au cours du diabète (Unger et Orci, 2001).

Diverses études ont montré la participation de la voie des SMases (A-SMase

membranaire et N-SMases membranaires et nucléaires) dans la formation des céramides au

cours du processus apoptotique. L’implication de l'A-SMase dans la transduction du message

apoptotique semble dépendre du type cellulaire. Son rôle a été démontré dans des cellules

dépourvues en cet enzyme, comme des hépatocytes issus de souris dont les deux allèles du

gène sont inactivés (A-SMase-/-) (Lin et al., 2000; Paris et al., 2001; Kirschnek et al., 2000)

ou des lymphocytes de patients atteints de la maladie de Niemann-Pick (Santana et al., 1996;

Kirschnek et al., 2000), alors que la A-SMase n’interviendrait pas dans les thymocytes ou

des cellules B et T activées (Santana et al., 1996; Lin et al., 2000). L’activation de l’A-

SMase semble également dépendre de la nature du stimulus (Lozano et al., 2001). Des

études ont montré son activation en réponse à Fas-ligand (Brenner et al., 1998; Kirschnek et

al., 2000; Lin et al., 2000) ou à des radiations ionisantes (Santana et al., 1996; Lozano et al.,

2001), mais resterait inactive en réponse à des drogues (Lozano et al., 2001). Toutefois,

certains travaux menés sur des lymphocytes A-SMase-/- avec les mêmes stimuli (anticorps

anti-Fas ou radiations ionisantes) remettent en question le rôle réel de l’A-SMase (Bezombes

et al., 2001).

L’implication de la N-SMase (forme membranaire notamment) dans l’apoptose semble

plus généralement reconnue. Elle a été décrite dans l’apoptose de divers modèles cellulaires,

en réponse à des stimuli aussi variés que des cytokines comme le TNF-α, Fas, l’interleukine-

1, une déprivation en facteurs de croissance (Mathias et al., 1998) ou encore des drogues

cytotoxiques (Bezombes et al., 2001).

90

6-3-Les sites subcellulaires de la production de céramides pro-apoptotiques

Alors que les céramides synthétisés de novo s’accumulent sur la face cytosolique du

réticulum endoplasmique (Michel et Van Echenten-Deckert, 1997), la voie des

sphingomyélinases peut mener à la formation de céramides dans différents compartiments

subcellulaires.

La membrane plasmique

La membrane plasmique contient des microdomaines membranaires, associés à la

cavéoline (les cavéoles) ou non (les radeaux lipidiques). Ces microdomaines sont enrichis en

sphingolipides comme les sphingomyélines et les gangliosides, en cholestérol et en différents

constituants protéiques comme des récepteurs membranaires, tel que TNF-R, des protéines

particulières, comme les protéines à pied d’ancrage glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) et

des protéines de signalisation, telle que la famille des src-tyrosine kinases (Brown et London,

2000). Des travaux récents suggèrent que ces structures sont impliquées dans la transduction

du message apoptotique (Ko et al., 1999; Zundel et al., 2000). Des activités

sphingomyélinases acide (Liu et Anderson, 1995; Zundel et al., 2000) et neutre (Veldman et

al., 2001) ont été décrites au niveau de ces microdomaines et sont associées à une production

cavéolaire de céramides.

La formation des céramides sur le feuillet interne ou externe de la membrane semble

dépendre de la SMase impliquée. Dans ces microdomaines, la N-SMase, active à pH neutre,

fonctionnelle au niveau de la membrane plasmique (Hofmeister et al., 1997) et orientée du

coté cytosolique (Veldman et al., 2001) induit l'accumulation de céramides sur le feuillet

interne. Bien que la localisation membranaire de l'A-SMase et son activation (à pH acide)

restent mal définies à l'heure actuelle, son activation pourrait mener à l'accumulation de

céramides sur le feuillet externe de la membrane plasmique. Au niveau de ces

microdomaines, cet enzyme, actif à pH acide, pourrait être naturellement orienté vers la

lumière des cavéoles (espace extracellulaire) ou transloqué de la face interne vers la face

externe (Grassmé 2001) lors d'un stimulus apoptotique. L'acidification nécessaire, possible

par l'activation d'une ATPase (Mineo et Anderson, 1996), nécessiterait l'isolement transitoire

de la lumière de la cavéole du milieu extracellulaire par un phénomène d'internalisation.

Cette hypothèse est soutenue par des travaux qui montrent que, dans des thymocytes traités

avec le TNF-α ou l’IL-1, seule l’activation de la l’A-SMase requiert l’internalisation du

complexe récepteur-ligand (Hofmeister et al., 1997). Les céramides formés sous l'action

d'une A-SMase extracellulaire peuvent également s'accumuler et se compartimenter sur la

91

surface externe de la membrane formant ainsi des radeaux lipidiques, permettant l'agrégation

de récepteurs membranaires et leur activation (Grassmé et al., 2001).

Les lysosomes

Depuis la découverte d’une activité A-SMase dans les lysosomes (Kanfer et al., 1966),

ces organites ont longtemps été considérés comme le seul site d’activation de l’A-SMase.

Bien que les céramides produits sous l’action de l’A-SMase semblent bien participer à la

transduction du message apoptotique, au moins dans certains types cellulaires comme les

lymphocytes (Santana et al., 1996) ou les hépathocytes (Lin et al., 2000; Paris et al., 2001),

leur synthèse dans les lysosomes reste discutée. En effet, l’enrichissement des lysosomes en

céramides, qui résulte de l’endocytose de LDL hydrolysées par une SMase, n’affecte pas le

taux d’apoptose des lymphocytes (Ségui et al., 2000), montrant l’incapacité de ces céramides

à transmettre un message apoptotique. D’ailleurs, les céramides naturels à longue chaîne

formés dans les lysosomes de fibroblastes de patients atteints de la maladie de Farber

(déficience en céramidase acide) restent séquestrés dans ces compartiments acides (Chatelut

et al., 1998). Dans ces modèles montrant la participation de l’A-SMase, il serait alors

intéressant d'étudier la localisation subcellulaire de cet enzyme.

Le noyau

Le noyau, riche en sphingomyélines (Spangler et al., 1975) et pourvu d'une activité N-

SMase (Tamiya-Koizumi et al., 1989; Alessenko et Chatterjee, 1995), semble constituer un

nouveau site de formation de céramides dans des cellules apoptotiques. Par exemple,

l'hypoxie dans des hépatocytes de rat induit l'activation de cet enzyme, la production de

céramides nucléaires et l'apoptose (Tsugane et al., 1999). Mais les mécanismes d'action de

ces céramides nucléaires ne sont pas élucidés à ce jour.

La mitochondrie

Des travaux récents menés au sein du groupe de Hannun (Birbes et al., 2001) montrent

que la mitochondrie pourrait être un nouveau site d'accumulation de céramides pro-

apoptotiques. Ces observations ont été confortées par des données montrant que la

mitochondrie contient bien de la sphingomyéline et des enzymes du métabolisme des

sphingolipides, tels que des activités SMase et sphingomyéline synthase (données non

publiées du groupe Hannun) ainsi qu'une céramidase (El Bawab et al., 2000). Ces différents

travaux ouvrent de nouvelles perspectives quant aux mécanismes d'induction et de régulation

de la formation des céramides mitochondriaux.

92

6-4- Les mécanismes de régulation des voies de synthèse des céramides dans l'apoptose : synthèse de novo et sphingomyélinases

6-4-1-La voie de biosynthèse de novo

La formation des céramides, issus de la voie de biosynthèse de novo est associée à

une augmentation soit de l'activité de la sérine-palmitoyl transférase (SPT) (catalysant la

première étape de synthèse) (Paumen et al., 1997; Farrell et al., 1998; Shimabukuro et al.,

1998a), soit celle de la céramide synthase (ou sphinganine acyl transférase) (catalysant

l’avant dernière étape) (Bose et al., 1995; Boland et al., 1997) (Figure 19). La mise en

évidence de l’activation de la céramide synthase dans le contexte apoptotique a été largement

facilitée par la découverte d’une toxine fongique qui inhibe spécifiquement cet enzyme: la

fumonisine B1 (Wang et al., 1991; Merrill et al., 1996). Le mécanisme d'activation de ces

deux enzymes est encore mal défini à l’heure actuelle. L'augmentation de l'activité

enzymatique résulte généralement d'une augmentation de la transcription et de la synthèse

protéique de ces enzymes, suggérant l'implication de facteurs de transcriptions comme p53

(Dbaibo et al., 1998).

6-4-2- La voie des sphingomyélinases

La régulation de l’activation des N-SMase et A-SMase, majoritairement observée

lors de la stimulation d’un récepteur de mort par son ligand, est sous le contrôle de facteurs

variés, qui semblent être spécifiques de la forme enzymatique impliquée.

La régulation par des protéines adaptatrices

Un modèle du récepteur au ΤΝF-α, développé par l’équipe de Krönke, a permis de

définir l’existence de deux domaines localisés dans la partie cytoplasmique du récepteur,

impliqués spécifiquement dans l’activation des SMases (Wiegmann et al., 1994).

L’activation de la A-SMase dépend d’une région C-terminale, nommée DD (death domain)

(Wiegmann et al., 1999). L’activation de la A-SMase dépend de la formation d’un complexe

protéique constitué des protéines adaptatrices FADD et TRADD (Wiegmann et al., 1999),

recrutées au niveau du domaine DD, et de caspase(s) initiatrice(s) (Brenner et al., 1998;

Schwandner et al., 1998), bien que l’implication des caspases initiatrices 8 et 10/b soit

controversée (Schwandner et al., 1998). L'activation de la N-SMase dépend d'une région

peptidique nommée NSD (Neutral Sphingomyelinase activation Domain). Au niveau de ce

domaine NSD est recrutée spécifiquement une protéine adaptatrice, nommée FAN (Factor

93

Associated with N-sphingomyelinase), capable d’activer directement la N-SMase (Adam-

Klages et al., 1996).

La régulation par des lipides

Le diacylglycérol (DAG) a été le premier lipide décrit dans la régulation de la

production de céramides induite par des récepteurs de mort. Ce médiateur lipidique, résultant

de l’hydrolyse de phosphatidylcholines (PC) par une phospholipase C spécifique de PC (PC-

PLC) est en effet capable d’activer l’A-SMase (Kolesnick, 1987; Schütze et al., 1991;

Wiegmann et al., 1994; Liu et Anderson, 1995). L’exploration de la voie d’activation en

cascade de la PC-PLC et de la A-SMase a été facilitée par la découverte d’un dérivé de

xanthate, le D609, décrit comme un inhibiteur de la PC-PLC (Müller-Decker, 1989). Cette

activation séquentielle a été mise en évidence dans des cellules stimulées par Fas-L (Cifone

et al., 1995; Genestier et al., 1998), TNF-α (Schütze et al., 1992) ou l’interleukine-I (Liu et

Anderson, 1995) et semble prendre lieu dans les cavéoles (Liu et Anderson, 1995). Bien que

certains auteurs aient montré que la production de DAG dépend de l’activation de caspases

initiatrices (Genestier et al., 1998), le mécanisme exact de couplage du récepteur à la PC-

PLC n’est pas élucidé.

L’acide arachidonique (AA), libéeé sous l'action de la phospholipase A2 cytosolique

(cPLA2), est également un régulateur de l’hydrolyse des sphingomyélines en activant la N-

SMase (Jayadev et al., 1997). La production d’AA est clairement liée à l’activation des

récepteurs transmembranaires. Toutefois le mécanisme de couplage de la cPLA2 à la N-

SMase reste à élucider.

La régulation par le glutathion

Des études récentes ont mis en évidence l’importance du statut redox de la cellule

dans la régulation de la production de céramides au cours de l’apoptose. La N-SMase semble

être l’enzyme de formation des céramides régulé par le stress oxydant. Des travaux menés au

sein du groupe de Hannun ont montré, in vitro (Liu et Hannun, 1997) et dans un système

cellulaire (Liu et al., 1998), la régulation négative de la N-SMase par le glutathion réduit. La

baisse de glutathion réduit intracellulaire, observée notamment en réponse au TNF-α (Liu et

al., 1998) ou Fas (Van den Dobbelsteen et al., 1996), induit ainsi la formation de céramides

sous l'action de la N-SMase. Cet effet du glutathion est spécifique de la N-SMase et n'est pas

observé pour l'A-SMase (Liu et Hannun, 1997). Cet enzyme semble, de façon plus générale,

sensible à un environnement oxydant. En effet, l’activation de la N-SMase est également

observée lors de l’addition directe de H2O2 (Goldkorn et al., 1998; Singh et al., 1998) ou d'un

94

traitement des cellules avec des agents prooxydants, tels que la daunorubicine (Mansat-de

Mas et al., 1999) ou l’aminotriazole (Singh et al., 1998). De ces différents travaux menés

dans des cellules, il est toutefois difficile de conclure si les ROS activent directement la N-

SMase ou s’ils agissent indirectement en diminuant la réserve de glutathion réduit.

La régulation par les protéines kinase C

Dans certains modèles cellulaires, les PKC semblent réguler négativement la N-

SMase (Chmura et al., 1996 et 1997; Mansat et al., 1997), modulant ainsi la réponse

apoptotique. Le rôle des PKC a été montré par l’utilisation d’esters de phorbol et de

phosphatidylsérine, suggérant plutôt l’implication de PKC classiques (α, β, γ) et/ou

nouvelles (δ, ε, η, θ, µ) que de PKC atypiques (ζ, λ, ι) (Mansat et al., 1997), ces dernières

étant dépourvues en site de liaison pour les DAG ou les esters de phorbol.

6-5-Les cascades de signalisation activées par les céramides et leurs

conséquences sur l’apoptose

D'une manière générale, les céramides peuvent induire l’apoptose selon deux grands

mécanismes indépendants. Ils peuvent propager un signal de mort en régulant la transcription

de produits de gènes, via la cascade des kinases du facteur de transcription c-jun, ou par un

mécanisme qui met en jeu la mitochondrie (Figure 20). Ces voies de signalisations peuvent

être gouvernées par l'activation de cibles enzymatiques directes des céramides, comme la

CAPK (Ceramide Activated Protein Kinase) (Mathias et al., 1991) ou les CAPP (Ceramide

Activated Protein Phosphatase), dont la PP2A (Protein Phosphatase 2A) (Dobrowsky et al.,

1993). Mais les céramides semblent également pouvoir induire l’apoptose en étant

métabolisés en sphingosine (SP) par une céramidase (Figure 19). Ce sphingolipide est en

effet capable d’orienter la cellule vers l’apoptose en activant, par exemple, la voie des JNKs

(c-JUN-Terminal Kinases) nommée aussi SAPKs (Stress-Activated Protein Kinases) ou en

inhibant la voie mitogénique des MAPK (Mitogen Activated-Protein Kinase) (Pyne, 2001).

6-5-1-Les céramides et la voie des c-JUN-terminal kinases (JNKs)

Des travaux ont montré que l’apoptose céramide-dépendante peut être médiée par la

voie des kinases JNKs (Verheij et al., 1996; Xia et al., 1995) (Figure 20). Bien que la

cascade de signalisation apoptotique intégrant la voie SAPKs/JNKs reste à ce jour mal

définie, son implication conduit à l’activation de certains facteurs de transcription, tels que c-

jun (Sawai et al., 1995). C-jun semble également pouvoir être activé par phosphorylation

95

sous l’action directe d’une CAPP, activée par les céramides (Reyes et al, 1996) (Figure 20).

Dans le contexte apoptotique, les cibles de c-jun semblent être diverses, bien qu’encore mal

définies à l’heure actuelle. Par exemple, dans les cellules T, c-jun, activé en réponse à la

génération intracellulaire de céramides, induit la réponse apoptotique par une régulation

transcriptionnelle de l’ARN messager, tels que ceux pour le ligand de Fas ou le TNF-α (Herr

et al., 1997), qui sont alors adressés à la membrane plasmique, interagissent avec leur

récepteur et amplifient la réponse apoptotique.

6-5-2-Les céramides et la mitochondrie

Au cours du processus apoptotique, l'accumulation intracellulaire de céramides est

souvent associée à une altération mitochondriale, caractérisée par une transition de

perméabilité membranaire (MPT), la génération de ROS et la diffusion libre de facteurs

apoptotiques (caspases, cytochrome c, Apoptosis Initiating Factor ou AIF…). En effet,

divers travaux rapportent que Bcl-2, acteur anti-apoptotique mitochondrial, est un inhibiteur

efficace de l’apoptose induite par les céramides, en prévenant la MPT, la libération du

cytochrome c et l'activation de caspases effectrices (Zhang et al., 1996; Dbaibo et al., 1997).

Les céramides accumulés dans un compartiment subcellulaire distinct de la

mitochondrie semblent induire l’apoptose en activant des facteurs intermédiaires

cytoplasmiques. En effet, l’induction de la MPT par le TNF-α dans des cellules entières est

reproduite dans des mitochondries isolées, incubées avec la fraction cytoplasmique de

cellules traitées par les céramides (Castedo et al., 1996). Un des intermédiaires identifié est

la protéine pro-apoptotique Bad. Des travaux ont montré que les céramides, formés dans les

cavéoles, peuvent activer indirectement la protéine Bad, en inactivant la kinase Akt (Zundel

et Giaccia, 1998; Zundel et al., 2000) sous l’action de la phosphatase CAPP (Salinas et al.,

2000) (Figure 20). La protéine Bad déphosphorylée migre vers la mitochondrie.

Des travaux suggèrent que les céramides peuvent également avoir une action directe

sur les mitochondries (Figure 20). En effet, une accumulation de céramides mitochondriaux a

été observée dans des hépatocytes traités avec le TNF-α (Garcia-Ruiz et al., 1997). Par

ailleurs, les céramides, issus de sphingomyélines de la membrane mitochondriale, peuvent

induire le relargage du cytochrome c (Birbes et al., 2001). Les céramides mitochondriaux

pourraient initier le signal de mort en régulant l'activité des protéines de la famille des Bcl-2.

En effet, les céramides inhibent l’effet anti-apoptotique de Bcl-2 en activant une phosphatase

mitochondriale (PP2A) (Ruvolo et al., 1999), et en inhibant parallèlement la phosphorylation

de Bcl-2 par la PKCα (Lee et al., 1996; Ruvolo et al., 1998). Mais l'accumulation de

96

céramides dans la mitochondrie pourrait également induire un découplage de la chaîne

respiratoire menant à la formation de ROS (Garcia-Ruiz et al., 1997). En effet, les céramides

sont capables d'interagir directement avec des mitochondries isolées et de générer des ROS

(Garcia-Ruiz et al., 1997). Ils semblent agir au niveau du complexe III (Quillet-Mary et al.,

1997) et/ou du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (Di Paola et al., 2000).

Figure 20: Conséquences de la production des céramides sur l’apoptose

Indépendamment d'un effet direct sur les mitochondries, les céramides, précurseurs de

la synthèse de glycosphingolipides (Figure 19), peuvent également mener à l'accumulation

rapide d’un ganglioside, le GD3 (De Maria et al., 1997), dont le rôle pro-apoptotique a été

défini récemment (De Maria et al., 1997; Garcia-Ruiz et al., 2000; Rippo et al., 2000). Des

études conduites sur des mitochondries isolées ou des cellules entières ont montré en effet

que le GD3, capable de s'accumuler dans la mitochondrie (Rippo et al., 2000), induit, comme

les céramides, la surproduction de ROS par le complexe III de la chaîne respiratoire, la MPT,

le relargage du cytochrome c et l'activation de caspases effectrices (Garcia-Ruiz et al., 2000)

(Figure 20).

6-6- La régulation des niveaux endogènes de céramides: l’équilibre

survie/mort cellulaire

Les niveaux intracellulaires de céramides résultent d’un équilibre dynamique entre leur

formation et leur métabolisme par divers enzymes: les céramidases couplées à la sphingosine

kinase, la glucosylcéramide synthase et la SM synthase. La régulation de ces enzymes a pour

conséquence directe de moduler les niveaux intracellulaires de céramides, mais également de

générer des lipides mitogéniques (Figure 21).

Apoptose

Mitochondrie Caspases effectrices

Cytochrome C

Céramidesmembranes:-plasmiques-mitochondriales- ...

GD3Céramides

Gangliosides (GD3)

ROS

Synthèse des glycosphingolipides

e-

e- Chaîne respiratoire mitochondriale

Famille de Bcl-2

CA

PP /

CA

PK

C-junJNKs

CAPP

97

6-6-1-La voie de la sphingosine-1-phosphate

Les céramides peuvent être catabolisés en sphingosine (par une céramidase) puis en

sphingosine-1-phosphate (par une sphingosine kinase) (Figure 21). L’équilibre entre les taux

intracellulaires de céramides et de sphingosine-1-phosphate joue un rôle de rhéostat dans la

détermination du devenir cellulaire. En effet, la voie de la sphingosine-1-phosphate

représente un modulateur puissant des effets délétères des céramides, en convertissant les

céramides (médiateur apoptotique) en sphingosine-1-phosphate (médiateur mitogénique)

(Coroneos et al., 1995; Xia et al., 1999; Augé et al., 1999). La sphingosine-1-phosphate

exerce un effet mitogénique en agissant soit par l’intermédiaire de récepteurs membranaires,

nommés GPCR (G protein coupled receptor) selon un mode autocrine (Pynes, 2001), soit au

niveau intracellulaire en activant notamment la voie de signalisation des MAPK (Coroneos et

al., 1995; Cuvillier et al., 1996; Augé et al., 1998). Mais la sphingosine-1-phosphate contre

également l’effet apoptogène des céramides en inhibant la libération mitochondriale de

cytochrome c et de smac (Cuvillier et Levade, 2001) et l’activation consécutive des caspases

effectrices (Cuvillier et al., 1998).

L’activation de cette voie métabolique a été observée en réponse à des facteurs de

croissance, comme le PDGF (Coreneos, et al., 1995), aux LDL oxydées (Augé et al., 1998 et

1999) ou encore à des cytokines, telles que IL-1 (Franzen et al., 2001) ou le TNF-α (Xia et

Sphingosine Sphingosine-1-phosphateCéramidase SK

Céramide

Sphingomyéline

Glucosylcéramide GCS Lactosylcéramide LCS

DAG: diacylglycérolGCS: glucosylcéramide synthaseLCS: lactosylcéramide synthaseSK: sphingosine kinaseSMases: sphingomyélinases

Sphingomyélinesynthase DAG

Sphingomyéline

Palmitoyl CoA+ sérine

SMases

Synthèsede novo

Prolifération

Apoptose

Figure 21: Modulation des niveaux endogènes des céramides: la balance survie/mort cellulaire

98

al., 1999). L’activation séquentielle de céramidase et de sphingosine kinase est généralement

associée à celle de SMases (Coroneos et al., 1995; Xia et al., 1999; Augé et al., 1999;

Franzen et al., 2001) afin de fournir le substrat céramides. Le couplage de ces différentes

activités enzymatiques suggère par ailleurs la colocalisation des enzymes dans un même

compartiment subcellulaire. D’ailleurs, une activité céramidase neutre a été mise en évidence

dans les cavéoles (Romiti et al., 2001), compartiments également pourvus en N-SMase

(Veldman et al., 2001) et la mitochondrie possède une céramidase neutre-alcaline

mitochondriale (El Bawab et al., 2000) et une activité SMase (données non publiées du

groupe Hannun).

La régulation de ces enzymes semble consister essentiellement en des modifications

post-traductionnelles, bien qu’une activation de la synthèse protéique de la céramidase neutre

ait été montrée en réponse à l’IL-1 (Franzen et al., 2001). Les deux enzymes de la voie de la

sphingosine-1-phosphate peuvent être régulées par phosphorylation/déphosphorylation sous

le contrôle d’une PKC (Cuvillier et al., 1996). La sphingosine kinase peut également être

régulée par une interaction directe avec TRAF-2 (TNF receptor-associated factor-2) (Xia et

al., 2002). Une variation de pH intracellulaire, pourrait constituer un mode de régulation des

activités céramidases. Par exemple, la céramidase neutre-alcaline mitochondriale pourrait

être activée en réponse à des facteurs de croissance (induisant une alcalinisation du

cytoplasme). Inversement, il a été montré récemment que cette céramidase possède une

activité céramidase réverse, capable de générer du céramide à partir de la sphingosine (El

Bawab et al., 2001). Cette activité, détectée in vitro à pH acide, pourrait potentiellement être

stimulée au cours de l’apoptose, phénomène au cours duquel une acidification du cytoplasme

est observée, et mener ainsi à l’accumulation de céramides mitochondriaux.

6-6-2-La sphingomyéline synthase

Les céramides peuvent également être reconvertis en sphingomyélines sous l’action

d’une sphingomyéline synthase (Ullman et Radin, 1974). Cette réaction s’accompagne de la

formation de DAG, un puissant agent mitogénique. La sphingomyéline synthase possède la

caractéristique unique de réguler directement les niveaux intracellulaires de deux messagers

lipidiques, les céramides et les DAG, dont les effets sont antagonistes sur le devenir de la

cellule (Luberto et Hannun, 1998). Cet enzyme est vraisemblablement impliqué dans la

régénération de la sphingomyéline après l’activation du cycle sphingomyéline/céramide au

cours du processus apoptotique (Obeid et al., 1993). Cependant, quelques travaux suggèrent

une régulation de l’activité de la sphingomyéline synthase dans la modulation directe des

99

niveaux endogènes des céramides pro-apoptotiques et de leur fonction biologique. Par

exemple, dans une lignée cellulaire cancéreuse Kim-1 traitée avec le TNF-α, l’accumulation

des céramides intracellulaires résulte de l’activation de la N-SMase associée à l’inhibition de

la sphingomyéline synthase (Bourteele et al., 1998). Inversement, l’effet mitogénique du

bFGF (basic fibroblast growth factor) dans des astrocytes a été associé à l’activation de la

sphingomyéline synthase, métabolisant les céramides synthétisés par la voie de novo en

sphingomyélines et en DAG (Riboni et al., 2001). Les mécanismes de régulation de la

sphingomyéline synthase restent à ce jour indéfinis, bien qu’il semble s’agir d’une régulation

post-traductionnelle plutôt que transcriptionnelle (Riboni et al., 2001).

6-6-3-La glucosylcéramide synthase

Les céramides peuvent être glycosylés dans l’appareil de Golgi pour former

séquentiellement les glucosylcéramides (GlcCer) sous l’action de la glucosylcéramide

synthase puis les lactosylcéramides (LacCer) sous l’action de la lactosylcéramide synthase.

Des études récentes ont montré que la voie de conversion des céramides en GlcCer peut être

impliquée dans le contrôle de la réponse cellulaire. En effet, la régulation de la

glucosylcéramide synthase joue un rôle déterminant dans la modulation des niveaux

endogènes de céramides et l’orientation de la cellule vers l’apoptose ou la prolifération. Par

exemple, au cours du processus apoptotique, certaines études ont montré que l’accumulation

des céramides est potentialisée par une baisse parallèle de l’activité de la glucosylcéramide

synthase (Bourteele et al., 1998; Tepper et al., 2000), freinant ainsi sa conversion en GlcCer.

Inversement, l’activation de la glucosylcéramide synthase a été impliquée dans certains

mécanismes de protection contre l’apoptose, notamment dans la résistance aux drogues

cytotoxiques par la réponse MDR (multidrug resistance). En effet, la réponse MDR observée

dans certaines cellules cancéreuses a été associée à une augmentation de l’activité de la

glucosylcéramide synthase (Lucci et al., 1999) induisant la fuite du céramide pro-

apoptotique en GlcCer (Lavie et al., 1996; Lucci et al., 1998). L’implication de cette voie

dans la MDR a été confirmée par des expériences de transfection de l’ARN antisens de la

glucosylcéramide synthase. En effet, l’inhibition de l’expression de la glucosylcéramide

synthase restaure la sensibilité de cellules MCF-7 à l’adriamycine (Liu et al., 2000). Les

mécanismes de régulation de l’activité de la glucosylcéramide synthase dans la MDR, bien

que encore mal définis à l’heure actuelle, pourraient mettre en jeu une régulation

transcriptionnelle de la glucosylcéramide synthase par le céramide lui-même (Komori et al.,

2000).

100

Outre la régulation directe du niveau endogène des céramides, cette voie métabolique

mène à la formation des GlcCer, lipide mitogénique. Initialement identifié dans la maladie de

Gaucher, caractérisée par une altération de l’activité glucosylcéramide glucosidase menant à

l’accumulation du GlcCer (Maret et al., 1985), le rôle mitogénique des GlcCer a été montré

depuis par diverses études. L’utilisation d’activateurs pharmacologiques de la

glucosylcéramide synthase, menant à une accumulation du GlcCer, a permit de suggérer que

ce glycolipide induit l’activation conséquente de PKC membranaire(s) et cytosolique(s)

(Shayman et al., 1991). Il a été montré par ailleurs, que le GlcCer, synthétisé en réponse à

des facteurs de croissance, comme IGF-1 (insulin-like growth factor-1), induit la

prolifération en activant des kinases dépendantes de cyclines du cycle cellulaire (Rani et al.,

1995). Le GlcCer pourrait également induire la prolifération cellulaire en servant de

précurseur pour la synthèse de LacCer, glycolipide capable d’activer une cascade de kinases

intégrant les enzymes Ras, Raf, p44MAPK et menant à l’expression de c-fos (Bhunia et al.,

1996).

Cependant, des études ont montré que certains glycosphingolipides, comme le GD3,

peuvent être impliqués dans le processus apoptotique (De Maria et al., 1997), montrant toute

la complexité de la régulation de la réponse apoptotique par la voie des glycosphingolipides

101

101

MATERIEL ET METHODES

102

103

MATERIEL I- REACTIFS

Les produits pour la culture cellulaire provenaient de Sigma (France) exceptés le SVF

(Gibco, France) et la collagénase/dispase (Roche, France). La BSA (fraction V, délipidée de

tout acide gras), le méthylglyoxal, le DTPA, la résine chelex-100, la N-acétyl-L-cysteine, la

désipramine, l�acide lipoïque, l�ebselen, le PMSF, l�EDTA, la pepstatine A et la leupeptine

(L-2023) ont été fournis par Sigma (France). La zéaxanthine provenait d�Extrasynthèse

(France). Calbiochem (France) a fourni les inhibiteurs peptidiques de caspases, z-VAD-fmk,

z-DEVD-fmk, z-AEVD-fmk, z-IETD-fmk, z-LEHD-fmk. La fumonisine B1, le D609, la

DAG kinase d�Escherichia coli, les céramides et les DAG proviennent de Biomol (France).

Le [γ32P]adénosine-5�trisphosphate (6Ci/µmol) était de Dupont-NEN (France). Les solvants

utilisés pour l�extraction des lipides étaient de «qualité pur pour analyse» et provenaient de

Merck (Allemagne). Les plaques de CCM (silicagel 60 sans marqueur de fluorescence),

utilisées pour les dosages de lipides, étaient de Merck (France). Les kits de marquage à

l�annexine V et de dosage ELISA des oligonucléosomes ont été fournis par Roche (France).

Les colonnes de filtration PC-10 ont été achetées chez Pharmacia (Suède). Les gels

d�électrophorèse (ready gel Tris-HCl 12%), les membranes de nitrocellulose (porosité de 0,45

µm) pour les immunoempreintes et les marqueurs de masses moléculaires (protein precision

standards, broad range) étaient de Bio-Rad (France). Les différents anticorps primaires (0,2

mg/ml) dirigés contre les caspases-10 (sc-7955), -8 (sc-6134), -2 (sc-625) et RAGE (sc-

8230), leur peptide bloquant respectif, les caspases recombinantes humaines utilisées comme

contrôle positif et les anticorps secondaires anti-lapin (sc-2313) et anti-chèvre (sc-2020) ont

été fournis par Biomol (France). La BSA (Fraction V, 96% minimum) employée pour la

saturation des sites de liaisons non spécifiques de la membrane, l�anticorps primaire

monoclonal anti-α actine (A-7811) et l�anticorps secondaire anti-souris (A-0168) provenaient

de Sigma (France). Le lait écrémé en poudre à dissolution instantanée (Régilait), également

employé pour la saturation des sites de liaisons non spécifiques de la membrane, a été acheté

en grande surface. Les films pour autoradiographie (Hyperfilm) et les réactifs de révélation

ECL (Enhanced Chemiluminescence) étaient de Amersham (France). Les dosages de

protéines ont été réalisés à l�aide de membranes de nitrocellulose (porosité de 45µm)

provenant de Polylabo (France).

104

II- APPAREILS

Les dosages spectrophotométriques (dosages de protéines et quantification de

l�apoptose par ELISA) sont réalisés au moyen d�un lecteur de plaques 96 puits iEMS MF

(Labsystems, Finlande). Les cellules marquées à l�annexine V sont observées à l�aide d�un

microscope à fluorescence Axioplan de Carl Zeiss avec un filtre Zeiss IV, n°9 (450 nm <

��excitation < 500 nm and 515 nm < � detection < 565 nm). Pour l�électrophorèse et

l�électrotransfert des protéines, les systèmes Mini-Protean II et Mini-Trans Blot de Bio-Rad

ont été utilisés.

METHODES I- PREPARATIONS DES AGE-METHYLGLYOXAL (AGE-MGX)

Les AGE-MGX sont obtenus en incubant, dans des conditions stériles pendant 50

heures à 37°C, 7,2 mg/ml de BSA et 100 mM de méthylglyoxal (Westwood et al., 1994)

préparés dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,4. La BSA-contrôle est obtenue en

incubant de l�albumine dans les mêmes conditions mais sans méthylglyoxal. Les différentes

préparations sont ensuite dessalées sur des colonnes PD-10 (2,5 ml de préparation sont filtrés

et élués par 3,5 ml de DMEM), afin d�éliminer les sels et les carbonyles libres. Les solutions

dessalées sont alors stérilisées (Acrodisc, 0,2 µm), aliquotées et conservées à �20°C.

1-Préparation d'AGE-MGX dépourvus en ions métalliques

Les tampons phosphates contiennent à l�état de traces des ions métalliques (Fe3+,

Cu2+�), capables de lier les protéines natives (Hui et al., 2001; Qian et al., 1998) et les AGE

formant des "glycochélates" (Qian et al., 1998).

Afin d'éliminer les ions métalliques liés aux AGE-MGX préparés dans le tampon

phosphate, les AGE-MGX sont traités avec des chélateurs de métaux. Les AGE-MGX (ou la

BSA-contrôle) n'ont été traités avec des chélateurs qu'après leur préparation. En effet, la

formation de certains produits de glycation est catalysée par des ions métalliques (Sajithlal et

al., 1998). Le traitement avec des chélateurs durant la préparation des AGE-MGX pouvait

ainsi modifier le nombre et la nature des structures AGE formées sur la BSA.

105

Les AGE-MGX (et la BSA-contrôle) sont préparés selon le protocole mentionné ci-

dessus puis incubés dans des conditions stériles pendant 24 heures à 4°C avec a) 0,5 mM de

DTPA (Ka pour Fe3+: 1028 et pour Cu 2+: 1021.4) pour chélater les ions et les inactiver et b)

avec de la résine chelex-100 qui chélate les ions métalliques (4 mg/ml sous agitation

magnétique douce) (préalablement lavée dans de l'eau distillée ) afin d'éliminer les ions

métalliques des solutions protéiques par une simple décantation de la résine. Le DTPA

complexé ou non aux ions métalliques est éliminé en éluant les AGE-MGX (ou la BSA-

contrôle) sur colonne PD-10 avec du DMEM dépourvu en ions métalliques (DMEM incubé

au préalable avec 2 g/l de résine chelex-100 pendant 24 heures à 25 °C sous agitation

magnétique douce). Les préparations d'AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) traités avec la

résine chelex-100 sont simplement décantées. Les différentes préparations d'AGE sont

conservées dans des tubes de plastique préalablement lavés dans de l'eau distillée contenant

0,02 N de HCl. Ce procédé permet d'éviter une nouvelle contamination des solutions

protéiques par les ions métalliques adsorbés à la surface des plastiques (Buettner, 1988).

2-Dosage de l'acide ascorbique

Les ions métalliques adsorbés ou chélatés par les protéines conservent une activité

oxydante. Cette propriété est mise à profit pour mettre en évidence la présence d'ions sur les

différentes préparations d'AGE-MGX (ou de BSA-contrôle). L'élimination des ions

métalliques est estimée par une mesure de l'oxydation de l'acide ascorbique par les complexes

protéine:ion (Qian et al., 1998).

Les différentes solutions employées sont traitées au préalable avec de la résine chelex-

100 (2 g/l, 25 °C, 24 heures) et les consommables de plastiques sont lavés avec 0,02 N de

HCl préparé dans de l'eau distillée. Les préparations d'AGE-MGX (ou de BSA-contrôle)

traités ou non avec les chélateurs sont déposées sur un disque de membrane de PVDF (300

µg/cm2). Les membranes sont lavées trois fois dans 150 mM de NaCl puis incubées dans 1 ml

de 20 mM de tampon phosphate (pH 7,4) contenant 200 µM d'acide ascorbique. Au temps

désiré (15 ou 30 min), 0,4 ml de milieu réactionnel est prélevé et dilué dans 0,4 ml d'EDTA 2

mM. L'acide ascorbique non-oxydé résiduel est dosé par spectrophotométrie (266 nm). Une

solution contrôle d'acide ascorbique est réalisée en parallèle en incubant dans les mêmes

conditions une membrane de PVDF seule. L'absorbance de cette solution contrôle au temps

zéro permet de définir le coefficient d'absorption molaire (16.000 M-1cm-1) de l'acide

ascorbique non oxydé en solution et d'estimer la stabilité de celui-ci durant la période de

l'essai (0,6% d'acide ascorbique oxydé en 30 min).

106

II- CULTURE CELLULAIRE

1 Mise en culture primaire des péricytes rétiniens de bœuf

Les yeux de b�uf, fraîchement énucléés, sont transportés de l'abattoir (Corbas, Rhône)

sur un lit de glace, immédiatement nettoyés des tissus extraglobulaires puis rincés dans du

tampon PBS (4°C). Les manipulations ultérieures sont effectuées sous un poste

microbiologique de type II (hotte à flux laminaire vertical) en employant des solutions et du

matériel stériles. Le matériel biologique est maintenu à 4°C sauf indication contraire dans le

protocole.

Les yeux sont aseptisés dans de l'éthanol 70% puis rincés dans du HBSS (sans

Ca2+/Mg2+) avant d'être disséqués à 5 mm postérieur de la cornée. La cornée et le cristallin,

ainsi que l'humeur vitrée, sont retirés laissant apparaître la rétine neuronale. Elle est

délicatement décollée du globe oculaire et de l�épithélium pigmentaire, sectionnée au niveau

du nerf optique puis placée dans une boite de Petri (10 cm) contenant 10 ml de tampon HBSS

pH 7,4. Ce tampon préparé à partir de HBSS sans Ca2+/Mg2+ contient 10 mM de tampon

HEPES (pH 7,4), 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Après 10 min

d'oxygénation par un mélange O2/CO2 (95/5, v/v), de la BSA à 22% est ajoutée jusqu'à une

concentration finale de 0,5% et le pH est ajusté à 7,4 avec quelques gouttes de NaOH 1 N (en

suivant le virage de l'indicateur rouge phénol). La rétine est débarrassée des cellules

pigmentaires noires contaminantes.

Les rétines propres sont transférées par lot de deux dans 10 ml de tampon HBSS puis

découpées à l'aide de ciseaux en petits morceaux (de 2 mm environ), avant d'être

homogénéisées (Dounce 15 ml, piston A, grand espace cylindre-piston) afin de dissocier le

tissu neuronal des microvaisseaux. L'homogénat est centrifugé 5 min à 300 g et le culot est

repris dans 5 ml d'une solution enzymatique de collagénase/dispase (solution de

collagénase/dispase à 1 mg/ml dans du tampon HBSS contenant de l�HEPES et les

antibiotiques (cf. ci-dessus). Cette solution est oxygénée et son pH ajusté à 7,4 avant

l'addition de TLCK (147 ng/ml) et de DNase (200 U/ml). La digestion s�effectue à 37 °C

pendant 30 min et le culot tissulaire est resuspendu par retournement du tube toutes les 10

min, afin de disperser les agrégats.

La suspension est passée sur un filtre nylon de porosité de 70 µm. Les microvaisseaux

retenus sont récupérés dans du tampon HBSS, centrifugés (5 min, 300 g), puis resuspendus

dans 3 ml de milieu de culture (DMEM contenant 10% de SVF, 2 mM de glutamine, 100

107

µg/ml de streptomycine, 100 U/ml de pénicilline). Les fragments de microvaisseaux sont

ensemencés dans une boite de Petri de 6 cm de diamètre enduite avec de la fibronectine (4

µg/cm2). L'attachement des microvaisseaux rétiniens s'effectue dans un incubateur à 37°C

sous une atmosphère d'air humidifiée contenant 5% de CO2. Après 4 heures, les fragments

tissulaires n'ayant pas adhérés sont éliminés. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 48

heures jusqu'à ce que les péricytes forment un tapis cellulaire confluent.

2- Trypsination des péricytes rétiniens de bœuf

Lorsqu'une culture de péricytes est confluente, elle est rincée 3 fois avec 3 ml de PBS

(sans Ca2+/Mg2+) à 37 °C, puis incubée avec 1 ml d'une solution de trypsine à 0,5% et

d'EDTA à 0,2%, pendant 2 min à 37°C. Le détachement des cellules est ensuite suivi au

microscope à contraste de phase puis la trypsine est inactivée par addition de 4 ml de milieu

de culture contenant 10% de sérum. Les péricytes sont récupérés, centrifugés 5 min à 180 g et

repris dans 3 ml de milieu de culture frais. Les cellules, sous-cultivées dans un rapport 1:3,

sont alors réensemencées dans des boites enduites de fibronectine (4 µg/cm2). Après les avoir

laissés s'attacher pendant 4 heures à 37°C, le milieu et les débris cellulaires, qui n�ont pas

adhéré à la matrice, sont aspirés et 3 ml de milieu de culture (DMEM contenant 10% de SVF,

la glutamine et les antibiotiques) est ajouté.

3- Culture des péricytes rétiniens en présence de glucose et d’AGE-

méthylglyoxal (AGE-MGX)

Les effets du glucose et des AGE-méthylglyoxal sont testés sur une même sous-culture

de péricytes (cellules issues de la même culture primaire). Au terme du passage P0, les

péricytes, cultivés dans du milieu standard (DMEM-SVF 10%), sont trypsinés puis

réensemencés (1:3, P1) dans le même milieu, enrichi en DHA non-estérifié (10 µM). Cette

supplémentation permet de restaurer la proportion en DHA des cellules à celle observée dans

les microvaisseaux natifs (Lecomte et al., 1996). Les effets d�une forte concentration de

glucose sont testés sur des péricytes incubés avec trois milieux de culture: un milieu

contenant 5 mM de glucose (milieu témoin), un milieu contenant 25 mM de glucose total et

un milieu contenant 20 mM de mannitol + 5 mM de glucose (contrôle osmotique). Afin de

tester les effets d�AGE, une solution d�AGE-MGX (ou son contrôle) est ajoutée au milieu

jusqu�à une concentration finale de 20 µM. Les cellules sont cultivées de façon chronique

avec les différents agents pendant deux passages, soit 15 jours environ.

108

4- Culture des péricytes rétiniens en présence de divers agents

pharmacologiques

Les péricytes sont cultivés dans les mêmes conditions expérimentales que celles citées

ci-dessus, en présence d�AGE-méthylglyoxal (ou de BSA-contrôle) et de divers agents

pharmacologiques (des antioxydants et des inhibiteurs d�enzymes).

Préparation des solutions mères d’agents pharmacologiques:

Les solutions sont stérilisées au moyen d�un filtre Acrodisc stérile (0,2 µm). Les

solutions mères de 5 mM de N-acétyl-L-cystéine (dans le DMEM), de 100 mM de

désipramine (dans l�eau distillée), de 9,4 mM de D609 (dans l�eau distillée), de 2 M d�acide

lipoïque (dans l�éthanol), de 10 mM d�ebselen (dans l�éthanol), de 1,2 mM de zéaxanthine

(dans le DMSO) et de 1,2 mM de c�lentéramine (dans l�éthanol) sont préparées

extemporanément et filtrées avant leur utilisation.

La solution stock de 1 mM de fumonisine B1 (dans l�eau distillée) est filtrée, aliquotée

et conservée à �20°C alors que les solutions stocks de 30 mM de chaque inhibiteur peptidique

de caspases ne sont pas filtrées du fait de l�utilisation d'inhibiteurs et de DMSO stériles. Les

solutions sont aliquotées et congelées à �20°C.

III- DETECTION ET QUANTIFICATION DE L'APOPTOSE DES

PERICYTES RETINIENS

L�apoptose des péricytes est détectée et quantifiée par deux techniques: l�une est basée

sur une détection immunocytochimique par l�annexine V d�un marqueur membranaire

d'apoptose, la phosphatidylsérine, et la seconde permet, par un dosage ELISA, une

quantification de l�ADN nucléosomal libéré dans le cytoplasme de la cellule apoptotique.

1- Marquage à l’annexine V et à l’iodure de propidium

L�annexine V (marquée à la fluorescéine) est une protéine présentant une très forte

affinité pour la phosphatidylsérine, exposée sur le feuillet externe de la membrane des

cellules apoptotiques et nécrotiques. Les cellules mortes fluorescent en vert. L�iodure de

propidium est employé afin de différencier les cellules apoptotiques des cellules nécrotiques.

Cet agent est perméant aux noyaux des cellules nécrotiques uniquement et s�intercale dans

l�ADN, colorant ainsi leur noyau en rouge.

109

Les péricytes (cultivés dans une boite de 3,5 cm de diamètre) sont rincés délicatement

par 1 ml de PBS (37°C) puis incubés (10 min, 37°C) dans l�obscurité avec 500 µl de tampon

HEPES (37°C) contenant 10 µl d�annexine V marquée à la fluorescéine et 10 µl d�iodure de

propidium. Après incubation, la solution de marquage est remplacée par 1 ml de tampon

HEPES (37°C) et les cellules sont observées sous un microscope à fluorescence. Le

pourcentage de cellules nécrotiques et apoptotiques est déterminé sur 10 champs différents,

soit de 300 à 800 cellules au total.

2- Dosage ELISA des oligonucléosomes

Au cours du stade final de l'apoptose, l'ADN génomique subit un clivage

internucléosomal libérant des oligonucléosomes. Les oligonucléosomes libérés dans le

cytoplasme des péricytes apoptotiques sont quantifiés par un dosage immunologique de type

sandwich couplé à une détection enzymatique (Roche). Pour chaque échantillon, le dosage est

réalisé dans un puit enduit à la streptavidine. Cette protéine présente une forte affinité pour la

biotine fixée sur l'anticorps anti-histone qui reconnaît la partie protéique de

l'oligonucléosome. La partie ADN de l'oligonucléosome est reconnue par l'anticorps anti-

ADN couplé à la peroxydase. Après avoir éliminé les anticorps libres, le substrat de la

peroxydase (ABTS: 2,2'-azyno-di[3-éthylbenzthiazoline-sulfonate]) est ajouté ce qui permet

de déterminer la quantité d'oligonucléosomes présents dans l'échantillon (Figure 22).

Les péricytes (106 cellules), récupérés par trypsination puis rincés par du PBS (37°C),

sont comptés puis incubés avec un tampon de lyse (200 µl, 30 min, 25°C). Le lysat cellulaire

est centrifugé (10 min, 200 g), la fraction cytosolique, contenant les oligonucléosomes (20 µl

du surnageant par puit), est déposée dans la plaque de 96 puits puis les 2 anticorps marqués

sont ajoutés avec le milieu réactionnel (80 µl). Les réactions de reconnaissances spécifiques

s'effectuent durant une incubation de 2 heures sous une agitation douce (300 rpm, 25°C). Le

milieu réactionnel est retiré puis une étape de lavages est réalisée avant d'ajouter la solution

de substrat contenant l'ABTS (Table 1). L�expérience est validée au moyen d'une solution

contrôle d'oligonucléosomes, fournie dans le kit, dont l'absorbance corrigée doit être

supérieure à 3.

110

Figure 22: Représentation schématique du dosage des oligonucléosomes

Table 1: protocole du dosage des oligonucléosomes

Un facteur d'enrichissement spécifique en oligonucléosomes est calculé selon:

ABTS

1- puits enduits 2- réaction

3- lavages 4- révélation

streptavidine

anticorps anti-histone biotinylé

anticorps anti-ADN-peroxydase

oligonucléosomes

échantillons blanc contrôle positif

fraction cytosolique 20 µl

tampon d�incubation 20 µl

solution d�oligonucléosomes 20 µl

IMMUNOMIX 80 µl 80 µl 80 µl

- 1/20 anti-histone

- 1/20 anti-ADN

- 18/20 tampon d �incubation

Incubation 2 heures à 25°C (300 rpm)

3 lavages avec 300 µl de tampon d�incubation

Substrat ABTS 100 µl 100 µl 100 µl

Incubation pendant 10 à 20 min

Lecture de l�absorbance à 405 nm (contre le blanc à 495 nm)

∆DO de l'échantillon incubé avec l'agent apoptotique (AGE)

∆DO de l'échantillon incubé avec son contrôle (BSA-contrôle)R =

111

IV-DOSAGE DES CERAMIDES ET DES DIACYLGLYCEROLS (DAG)

DANS LES PERICYTES RETINIENS

Les céramides et les DAG dans les péricytes sont mesurés selon la méthode de Preiss et

al. (1986). Cette méthode est basée sur la phosphorylation des céramides et des DAG par la

DAG kinase, purifiée à partir d'Escherichia coli, en présence d'[γ32P]-ATP (Figure 23).

Figure 23: Marquage au phosphate radioactif des céramides et des DAG

Les péricytes (2 ou 3 boites de 6 cm de diamètre) sont rincés délicatement 3 fois sur

glace par 3 ml de PBS (4°C), puis récupérés par grattage au rubber policeman dans 0,5 ml

d'eau (4°C) et la boite est rincée par 0,5 ml d'eau (obtention de 1 ml de suspension cellulaire

par condition de culture).

1- Extraction des lipides

Les lipides totaux sont ensuite extraits par la méthode de Bligh et Dyer (1959). A cette

suspension cellulaire (1 ml d'eau) sont rajoutés 10 µl de [9,10-3H]-triacylglycérol à 0,5

µCi/ml (standard interne), 3,75 ml d'un mélange chloroforme:méthanol (2:1 v/v), 80 µl de

CH CH (CH2)12 CH3

NH CO R

CH2OH

CH

OH

CH2 O CO R1

CH O CO R2

CH2OH

céramides

diacylglycérols

CH CH (CH2)12 CH3

NH CO R

CH2O

CH

OH

P*

CH2 O CO R1

CH O CO R2

CH2O P*

phosphatidates

céramides-1-phosphateDAG kinase

[γ32P] ATP ADP

P*

R : groupements acyl

phosphate radioactif

112

BHT (5 mM préparé dans l'éthanol). Les solutions sont «vortexées» et maintenues au repos

30 min minimum (ou conservées à 4°C). La séparation des phases aqueuses et organiques est

induite par l'addition de 1,25 ml de NaCl 0.9% et 1,25 ml de chloroforme. Les solutions sont

de nouveau «vortexées» 30 sec puis centrifugées (700 g, 5 min). La phase organique

inférieure est prélevée et l'extraction de la phase aqueuse par 1,5 ml de chloroforme est

répétée 2 fois. Les extraits lipidiques ont été rassemblés, les solvants sont évaporés sous

atmosphère inerte (N2), les lipides sont repris dans un faible volume (1 ml) de mélange éther :

méthanol (9:1 v/v), transférés dans un tube Eppendorf, puis séchés sous azote.

La phase aqueuse, contenant les protéines précipitées, est de nouveau centrifugée.

L'excès de phase aqueuse est retiré et les protéines sont séchées en présence d'acétone sous un

flux d'azote, solubilisées dans du SDS 10%, puis dosées par la technique de coloration au noir

amide.

2- Phosphorylation par la DAG-kinase

2-1- Réactifs et solutions

Solution de détergents: n-octylglucopyranoside 7,5%

Cardiolipine 5 mM

DETAPAC 1 mM

Tampon de réaction: Imidazole 100mM

(pH 6,6) NaCl 100 mM

MgCl2 25 mM

EGTA 2 mM

Solution de DAG kinase: DAG kinase 4,86 mU

DTT 10 mM

Solution d'[γ32P]ATP: [γ32P]ATP 0,5 mCi/ml

(pH 6,6) ATP froid 10 mM

Imidazole 100 mM

DETAPAC 1 mM

113

Solution de glucose: HEPES 10 mM

(pH 7,4) NaCl 135 mM

CaCl2 1,5 mM

MgCl2 0,5 mM

Glucose 5,6 mM

2-2- Réaction de phosphorylation

Une gamme étalon de céramides (25 ng à 2500 ng) et de DAG (25 ng à 2500 ng )

contenant la même quantité de [3H]triacylglycérol est réalisée en parallèle au dosage des

échantillons. L'extrait lipidique sec est solubilisé dans 20 µl de la solution de détergents par 1

min de sonication douce (bain de sonication, 50% de la puissance maximale) suivie d'une

incubation de 15 min à 25°C. La réaction est démarrée par l'ajout de 50 µl de tampon de

réaction, 20 µl de la solution de DAG kinase et 10 µl de la solution d'[γ32P]ATP. La réaction

de phosphorylation est poursuivie pendant 1 heure à température ambiante puis arrêtée par

l'addition de 1 ml du mélange chloroforme:méthanol:HCl 1 N (100:100:1 v/v/v), 170 µl de la

solution de glucose et 30 µl d'EDTA 100 mM. Le mélange est «vortexé» 30 sec puis

centrifugé (10 000 g, 10 min) à température ambiante.

3-Quantification des produits phosphorylés

La phase organique acide (inférieure), contenant les lipides phosphorylés, est prélevée

et évaporée sous un courant d'azote. Les lipides sont repris dans 150 µl d'un mélange éther :

méthanol (9:1 v/v) puis les céramides-1-phosphate sont séparés des phosphatidates et du

triacylglycérol par CCM, développée par le mélange chloroforme:méthanol:acide acétique

(65:15:5 v/v/v).

L�exposition de la plaque de silice à un film autoradiographique (30 min, -80°C) permet

de visualiser les différents lipides phosphorylés. Les taches correspondant aux céramides-1-

phosphate et aux phosphatidates ainsi que les 3 derniers cm avant le front de migration

(contenant le triacylglycérol tritié) sont grattés puis la silice est récupérée dans des pots de

comptage, humidifiée avec 200 µl d�eau et 200 µl de méthanol. La radioactivité émise par le 32P et le 3H est mesurée en présence de 10 ml de liquide de scintillation (picofluor) dans un

compteur à scintillation. La radioactivité émise par le [9,10-3H]-triacylglycérol permet de

calculer le rendement du dosage pour chaque échantillon. Les quantités de céramides et de

114

DAG, présents dans les échantillons, sont alors déterminées après extrapolation à partir des

gammes étalons et rapportées à la quantité de protéines totales.

V- DOSAGE DES PROTEINES PAR COLORATION AU NOIR AMIDE

La technique utilisée a été développée par Schaffner et Weissmann (1973). Ce dosage

est fiable pour une gamme de protéines de 2 µg à 27 µg. Les protéines en solution sont

précipitées par de l'acide trichloroacétique (TCA) puis déposées sur une membrane de

nitrocellulose. Les protéines sont colorées par une solution de noir amide. Le colorant,

proportionnel à la quantité de protéines, est élué puis quantifié par spectrophotométrie.

Les échantillons sont complétés à 270 µl avec de l'eau distillée avant de recevoir 30 µl

de tampon Tris-HCl 1M pH 7,5, contenant 1% de SDS puis 60 µl de TCA 60%. Une gamme

étalon est réalisée en parallèle avec 2, 5, 10, 20 et 27 µg de BSA. Après 2 min d'incubation,

les solutions sont filtrées sur une membrane de nitrocellulose, préalablement mouillée par du

TCA 6%. Le filtre est immergé 2 à 3 min dans une solution de noir amide à 1% (w/v dans

méthanol : acide acétique : eau 45:10:45 v/v/v) puis la coloration non-spécifique de la

membrane sans protéines est éliminée dans des bains successifs d'eau et un bain de solution

de décoloration (méthanol : acide acétique : eau 45:10:45 v/v/v). Le filtre est séché, les taches

bleues sont découpées et éluées dans 1 ml de solution d'élution (NaOH 25 mM et EDTA 50

µM dans éthanol : eau 50:50 v/v). 300 µl de chaque éluat est déposé sur plaque de 96 puits.

L'absorbance est mesurée à 620 nm et la quantification est réalisée à l'aide du logiciel Biolise.

VI-IMMUNODETECTION DES CASPASES ET DE RAGE SUR

MEMBRANE DE NITROCELLULOSE (WESTERN BLOTTING)

1- Préparation des échantillons

Les péricytes (2 à 3 boites de 6 cm), cultivés pendant 15 jours en présence de 3 µM

d'AGE-méthyglyoxal (ou BSA-contrôle), sont déposés sur un lit de glace, lavés 3 fois par du

PBS (4°C) puis grattés à l'aide d'un rubber policeman dans 500 µl de tampon de récupération

(4°C) (Tris-HCl 0,1 M pH 8 contenant 4,4 µM de pepstatine A, 6 µM de leupeptine, 0,6 mM

de PMSF et 10 mM d'EDTA). Afin de limiter la perte de matériel cytoplasmique, la

suspension cellulaire est solubilisée directement dans la boite de Petri par addition de 100 µl

de tampon de lyse concentré 5x (Tris-HCl 0,15 M pH 6,8 contenant 5% de SDS, 12,5 % de

115

glycérol, 12,5% de β-mercaptoéthanol et 1% de bleu de bromophénol). Les pelotes d'ADN,

rendant la solution visqueuse, sont cassées mécaniquement à l'aide de va-et-vients énergiques

dans une seringue équipée d'une aiguille 30G½. Les échantillons protéiques sont alors

chauffés au bain-marie 3 min à 100°C avant d'être déposés sur le gel de polyacrylamide.

2- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-

PAGE) et coloration au bleu de Coomassie

L�électrophorèse est réalisée dans des conditions réductrices (β-mercaptoéthanol) et

dénaturantes (SDS) selon la technique de Laemmli (Laemmli U.K, 1970), à tampon

discontinu pour le gel de concentration et de séparation.

Des aliquotes de protéines totales de péricytes (20 µg) sont déposées sur un gel de

polyacrylamide (ready gel Tris-HCl de Bio-Rad), constitué d�un gel de concentration de 4%

d�acrylamide et d�un gel de séparation de 12% d�acrylamide. L�électrophorèse des protéines

est effectuée à 200 V (gel de concentration) puis 100 V (gel de séparation) dans le tampon de

migration (Tris 25 mM, glycine 0,192 M, pH 8,3, SDS 0,1%), jusqu�à ce que le bleu de

bromophénol (repérant le front de migration) atteigne le bas du gel. Des standards protéiques

de masse moléculaire connue (MM) (250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10 kDa) sont

également déposés (1 µl) afin d�étalonner la migration des protéines et d�estimer leur masse

moléculaire selon la formule:

Le gel est alors utilisé pour un électrotransfert des protéines puis coloré au bleu de

Coomassie, afin de contrôler la qualité de l�électrotransfert. Cette coloration permet une

sensibilité de 0,5 µg de protéines/mm2. Le gel est incubé pendant 15 min avec une solution de

bleu de Coomassie à 0,1 % (w/v dans du méthanol: eau 40:60 v/v) puis la coloration non

(cm)

log (MM)

x

y

log (MM) = mobilité relative (cm)

116

spécifique est éliminée par des lavages successifs dans un mélange méthanol : acide acétique:

eau (40:10:50 v/v/v) jusqu�à laisser apparaître les protéines colorées en bleu. Le gel est séché

sous vide à 80°C.

3- Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose

En fin d'électrophorèse, la membrane, les feuilles de papier Whatman et les éponges de

mousse sont équilibrés pendant 10 min dans le tampon de transfert à 4°C (Tris 25 mM,

glycine192 mM, pH 8,3, méthanol 20% (v/v)). Le sandwich est réalisé en semi-immersion: la

membrane et le gel sont superposés et encadrés de part et d'autre d'un papier et d'une éponge.

L'ensemble, disposé dans une cassette et placé dans la cuve, est immergé dans le tampon de

transfert et les protéines sont transférées du gel (cathode) vers la membrane de nitrocellulose

(anode) électrophorétiquement à 100 V pendant 45 min, à 4°C et sous agitation magnétique.

4- Immunodétection des protéines transférées

Le matériel antigénique utilisé dans notre étude est de source bovine. Ne disposant pas

d�anticorps primaires dirigés contre du matériel bovin, notre choix s�est porté sur des

anticorps polyclonaux présentant une immunoréactivité croisée avec différentes espèces

(Homme, souris et rat).

4-1- Tampons utilisés

Tampon TBS (Tris Buffer Saline): Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 150 mM

Tampon TTBS (Tween TBS): 0.105% de Tween 20 dans du TBS

Tampon de dilution des anticorps: BSA 1% dans du TTBS

Tampon de saturation des membranes : sa composition est adaptée selon l'anticorps

secondaire employé lors de la révélation.

- pour les anticorps secondaires anti-lapin et anti-souris : lait 10% dans du

TTBS

- pour l'anticorps secondaire anti-chèvre : lait 5% / BSA 5% dans du TTBS

4-2- Révélation des protéines

Après séparation électrophorétique des protéines et électrotransfert, la membrane de

nitrocellulose est colorée au rouge ponceau (3 min dans une solution à 0,2% (w/v dans de

117

l'acide acétique 0,3% (v/v) pour repérer les pistes de migration des protéines) puis décolorée

(bains prolongés dans de l'eau distillée). Les sites de liaisons non spécifiques de la membrane

sont saturés par une incubation dans le tampon de saturation adéquat (cf. chapire 4-1-)

pendant 60 min à température ambiante sous agitation douce (ou alternativement à 4°C

pendant la nuit). La membrane est lavée trois fois (15 min puis 2x5 min) dans du tampon

TTBS avant d�être incubée pendant 120 min avec l�anticorps primaire (Table 2) dilué dans le

tampon de dilution. Une seconde série de lavages dans du TTBS (comme ci-dessus) précède

la deuxième incubation (90 min) avec l�anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort

(Table 2). La membrane est de nouveau lavée dans du TTBS puis rincée 5 min dans du TBS

avant d�être révélée à l�ECL.

La membrane est séchée rapidement sur du papier absorbant, incubée avec la solution

de détection pour chimioluminescence du kit ECL pendant 1 min puis enveloppée dans du

papier film transparent. Elle est alors exposée à un film autoradiographique "pré-flashé"

pendant une durée allant de 15 sec à 8 min (Table 2) et les films sont développés.

Table 2: paramètres expérimentaux des immunodétections

Les films photographiques ainsi obtenus sont numérisés par un scanner de type GS-700

Imaging Densitometer (Bio-Rad). L�intensité du signal du film pour chaque bande,

correspondant à l'intensité du signal de luminescence émise, est quantifiée par densitométrie

grâce au logiciel Molecular Analyst de Bio-Rad.

4-3- Spécificité de la reconnaissance antigénique

Des peptides bloquants sont commercialisés pour les anticorps primaires anti-caspase-2

et anti-caspase-8. Une pré-absorption de l'anticorps primaire avec son peptide neutralise la

caspase-10 1/2000 1/6000 8 min

caspase-8 1/1000 1/4000 2 min

caspase-2 1/1000 1/3000 1 min

RAGE 1/2000 1/6000 1 min

α-actine 1/10 000 1/16000 15 sec

Ac 1aire Ac 2aire

anti-lapinAc 2aire

anti-sourisAc 2aire

anti-chèvreAntigène Temps

d�exposition

118

reconnaissance de l'antigène par l'anticorps primaire. Cette approche permet ainsi de mettre

en évidence la spécificité de l'immunodétection.

Les anticorps primaires anti-caspase-2 et anti-caspase-8 sont pré-incubés en présence

d'un excès de peptide bloquant (5 fois plus que l'anticorps w/w) dans un faible volume de

PBS (≈ 50 µl), pendant 2 heures à température ambiante (ou la nuit à 4°C). Les membranes

sont révélées selon le protocole décrit ci-dessus en utilisant le complexe peptide-anticorps

primaire au lieu de l'anticorps primaire seul.

4-4- Standardisation des signaux par rapport à l'actine

Afin de standardiser les signaux ECL par rapport aux quantités de protéines déposées

sur les gels, les protéines sont dénudées des complexes anticorps primaires et secondaires

puis révélées avec l�anticorps anti-α-actine. Les membranes sont incubées pendant 30 min à

50°C dans une solution de lavage (0,7% de β-mercaptoéthanol, 10 % de SDS, 62,5mM Tris-

HCl pH 6,8), afin d�éliminer les complexes d�anticorps primaire/secondaire. Au terme de

l�incubation, les membranes sont rincées trois fois dans du tampon TTBS. Puis un nouveau

cycle de révélation avec l'anticorps anti-α-actine est réalisé après saturation de la membrane.

VI- TRAITEMENT STATISTIQUE DES RESULTATS

Les valeurs présentées dans les figures correspondent aux moyennes ± SD de n

expériences indépendantes.

Les effets des AGE-méthylglyoxal sur l'apoptose des péricytes et sur le taux

intracellulaire des céramides et des DAG sont définis comme significatifs par le test des rangs

signés de Wilcoxon. Ce même test a été utilisé pour comparer les différences entre les

moyennes des pourcentages d'inhibition calculées pour chaque agent pharmacologique testé

comparées aux moyennes des groupes contrôle sans agents (0% d'inhibition). Les résultats ont

été jugés statistiquement significatifs si p<0,05

119

119

RESULTATS

120

121

122

L�objectif de ce travail de thèse a consisté dans un premier temps à tester l�hypothèse

que les produits avancés de glycation (AGE) peuvent induire l�apoptose des péricytes

rétiniens en culture et dans l�affirmative à explorer la voie de signalisation intracellulaire mise

en jeu au cours de ce processus apoptotique.

Nous avons ainsi utilisé des cultures primaires de péricytes rétiniens purifiés à partir de

microvaisseaux de b�uf. Nous avons utilisés des cultures primaires et non des lignées

cellulaires afin de conserver la morphologie et la fonction des cellules natives. Pour les

mêmes raisons, les péricytes ont été utilisés jusqu�au deuxième passage seulement. En effet, à

partir du troisième passage, des changements morphologiques (cellules géantes) et un

ralentissement de la prolifération ont été observés.

Nous avons analysé les effets cellulaires d�AGE préparés à partir d�albumine de sérum

de b�uf modifiée par le méthylglyoxal. La concentration de méthylglyoxal utilisée pour la

réaction de glycation de l�albumine a été choisie de sorte à induire des modifications sur les

(des) résidus arginine et lysine, menant à la formation de divers adduits d�AGE, comme

argpyrimidine, des imidazolones, la CEL et MOLD (Westwood et al., 1994; Shiponava et al.,

1997). Ces différents AGE dérivant du méthylglyoxal ont été décrits comme les modifications

chimiques majeures observées dans les protéines tissulaires chez le diabétique (Degenhardt et

al., 1998; Shamsi et al., 1998). Au cours de ce travail, nous avons donc utilisé des AGE-

MGX représentatifs d�AGE qui s�accumulent in vivo au cours du diabète.

Les effets des AGE-MGX ont été testés sur des cellules en prolifération pendant deux

passages, soit environ 15 jours. Une limitation de notre modèle de culture est que le

renouvellement des péricytes dans les microvaisseaux rétiniens est très faible (Engerman et

al., 1967). Néanmoins ce modèle, déjà utilisé par nous-même (Paget et al., 1998) et d�autres

(Porta et al., 1994), été choisi afin de reproduire une certaine chronicité de l�environnement

diabétique des péricytes rétiniens.

123

CHAPITRE I

EFFETS D'AGENTS IMPLIQUES DANS LE

DIABETE (AGE ET GLUCOSE) SUR L’APOPTOSE

DES PERICYTES RETINIENS

L�une des premières altérations structurales observées au cours de la rétinopathie

diabétique est la disparition sélective des péricytes. Les travaux réalisés à partir de rétines

humaines prélevées post-mortem chez des diabétiques ont permis de montrer que les péricytes

mourraient par apoptose (Mizutani et al., 1996, Li W. et al., 1997, Podesta et al., 2000), mais

les agents inducteurs d�un tel mécanisme n�ont pas été clairement identifiés in vivo. De

nombreux travaux ont mis en évidence la toxicité des AGE sur les péricytes in vitro

(Yamagishi et al., 1995; Chibber et al., 1997; Ruggiero-Lopez et al., 1997) et in vivo

(Hammes et al., 1991). L�objectif de l�étude a été de tester dans un premier temps si les AGE-

MGX induisent l�apoptose des péricytes en culture et si ce phénomène est associé à une

production accrue de diacylglycérols (DAG) et de céramides.

I- EFFETS DES AGE-MGX SUR LES PERICYTES RETINIENS

1- L'apoptose des péricytes

Les péricytes rétiniens ont été cultivés de façon chronique durant deux passages

(environ 15 jours) en présence de 3µM d�AGE-MGX et de son contrôle. L�apoptose des

péricytes a été détectée et quantifiée selon deux méthodes.

Dans un premier temps, nous avons observé et quantifié les cellules apoptotiques par un

marquage à l�annexine V et à l�iodure de propidium. Cette technique met en évidence la

translocation de la phosphatidylsérine du feuillet interne vers le feuillet externe de la

membrane plasmique, phénomène biochimique observé au cours de la nécrose et de

l�apoptose. L�annexine V, marquée à la fluorescéine, colore ainsi en vert les membranes

plasmiques des cellules nécrotiques et apoptotiques, mais seules les cellules nécrotiques, dont

la membrane plasmique a perdu son intégrité, sont perméables à l�iodure de propidium

colorant ainsi leur noyau en rouge (Figure 24-A). La proportion des cellules apoptotiques

124

représente 8,9 ± 1,1% (n = 10) du total des péricytes cultivés avec 3 µM d�AGE-MGX contre

2,9 ± 0,34% des cellules cultivées avec la BSA-contrôle (Figure 24-B). Ainsi, les AGE-MGX

induisent une augmentation d�un facteur 3 du taux d�apoptose dans les péricytes. Aucune

cellule nécrotique n�a été observée (<0,1%).

Figure 24: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur l�apoptose des péricytes, détectée par un marquage à l�annexine V. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX, ajoutés directement dans le milieu de culture. L�apoptose des péricytes a été détectée A) et quantifiée B) par un marquage à l�annexine V, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques et sont la moyenne ± SD de 10 expériences indépendantes. * p<0,05.

L�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX a également été évaluée

qualitativement par un dosage ELISA des oligonucléosomes cytoplasmiques. Au cours de la

phase finale du processus apoptotique, l�ADN génomique subit un clivage internucléosomal,

générant des complexes ADN-histones de taille variable, nommés oligonucléosomes, qui

migrent du noyau vers le cytoplasme. La quantité de complexes ADN-histones, libérés dans

le cytoplasme des péricytes cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX, est

supérieure à celle détectée dans les cellules contrôles. Dans ces conditions, l�enrichissement

spécifique en oligonucléosomes cytoplasmiques (R) est de 2,53 ± 0,59 (n = 4) (Figure 25).

L�effet dose-dépendant des AGE-MGX sur l�apoptose des péricytes a également été

examiné. Les péricytes ont été ainsi cultivés pendant deux passages avec les AGE-MGX (ou

son contrôle) aux concentrations de 1, 3, 10 et 20 µM. L�apoptose des péricytes a été détectée

et quantifiée par une coloration à l�annexine V. Les résultats montrent une réponse

apoptotique dose-dépendante des péricytes aux AGE-MGX (n = 3) (Figure 26). Le facteur 3

0

2

4

6

8

10

12

BSA-contrôle AGE-MGX % d

e ce

llule

s ap

opto

tique

s

*

B)A)

10 µM

125

d�augmentation de l�apoptose dans les péricytes cultivés avec 3µM d�AGE-MGX est

reproduit au cours de cette expérience, bien que les taux d�apoptose soient plus faibles (BSA-

contrôle: 2,5 ± 0,2% et AGE-MGX: 7,4 ± 0,3%) que ceux observés dans la figure 24. Pour

chacune des concentrations testées, aucune cellule nécrotique n�a été observée (<0,1%).

Figure 25: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur l�apoptose des péricytes, évaluée par un dosage des oligonucléosomes cytoplasmiques. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX, ajoutés directement dans le milieu. L�apoptose a été évaluée par un dosage ELISA des oligonucléosomes (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % du contrôle, sont la moyenne ± SD de 4 expériences indépendantes.

Figure 26: Effet concentration-dépendant des AGE-MGX sur l�apoptose des péricytes rétiniens. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec des AGE-méthylgloxal (1, 3, 10 et 20 µM). L�apoptose a été détectée et mesurée par un marquage à l�annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % de cellules apoptotiques, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes.

050

100150200250300350

BSA-contrôle AGE-MGX

% d

e B

SA-c

ontr

ôle

0

3

6

9

12

15

18

21

0 5 10 15 20 25

concentration (µM)

% d

e ce

llule

s ap

opto

tique

s

BSA-contrôleAGE-MGx

126

2- La production de DAG et de céramides dans les péricytes

Afin de déterminer si les DAG et les céramides pouvaient être impliqués dans le signal

de transduction menant à l�apoptose, ces deux composés ont été dosés dans les péricytes

incubés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX ou son contrôle. La technique de

dosage employée est basée sur la phosphorylation des DAG et des céramides par la DAG-

kinase d�Escherichia coli en présence de [γP32]ATP. Nous avons pu mettre en évidence une

stimulation de la production des DAG (+ 94 ± 9%, n = 10) et des céramides (+ 85 ± 12 %, n =

10) dans les péricytes rétiniens en réponse aux AGE-MGX (Figure 27).

Figure 27: Effet des AGE-MGX (3 µM) sur la production des céramides et des DAG dans les péricytes. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX. Les céramides et les DAG ont été mesurés par la méthode enzymatique de la DAG-kinase, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et sont la moyenne ± SD de 10 expériences indépendantes. La quantité de céramides mesurées dans les cellules contrôles (100 %) est de 704 ± 170 ng de céramides/mg de protéines. La quantité de DAG mesurée dans les cellules contrôles (100 %) est de 618 ± 141 µg de DAG/mg de protéines. * p<0,05.

II- EFFETS DU GLUCOSE SUR LES PERICYTES RETINIENS

Afin de vérifier si de fortes concentrations de glucose induisent également l�apoptose

des péricytes, les cellules ont été cultivées pendant deux passages dans un «milieu contrôle»

(contenant 5 mM de glucose), un milieu contenant 25 mM de glucose total ou 20 mM de

mannitol (control osmotique). L�apoptose a été mesurée par un marquage à l�annexine V.

Cette méthode, fiable et quantitative, fournit une mesure de l�apoptose comparable au dosage

des oligonucléosomes (Figures 24 et 25). Un traitement des péricytes n�a pas altéré le taux

basal d�apoptose observé dans le «milieu contrôle» (Figure 28-A). La proportion de cellules

0

40

80

120

160

200

240

% d

e BS

A-c

ontr

ôle

BSA-contrôleAGE-MGX

céramides

*

DAG

*

127

apoptotiques dans les péricytes incubés avec le glucose (2,7 ± 0,25%, n=3) ou le mannitol

(2,4 ± 0,13%, n=3), est en effet comparable à celle mesurée dans les péricytes cultivés avec le

«milieu contrôle» (2,3 ± 0,1%, n=3). Le dosage des DAG et des céramides a permis de mettre

en évidence que le niveau endogène de ces deux médiateurs lipidiques n�a également pas été

affecté. Les quantités de DAG et de céramides mesurées dans les péricytes cultivés avec le

glucose (108 ± 7,4% et 102 ± 4,7% respectivement) et avec le mannitol (102 ± 1,5% et 98 ±

4,4%) ne sont pas différentes de celles dosées dans les cellules contrôles (Figure 28-B).

Figure 28: Effets d�une forte concentration de glucose sur l�apoptose et la production de céramides et de DAG dans les péricytes. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages (15 jours environ) avec 5 mM de glucose (contrôle 5mM), 25 mM de glucose total (glucose 25 mM) ou 20 mM de mannitol (Mannitol 20 mM). A) L�apoptose a été détectée et mesurée par un marquage à l�annexine V, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats, exprimés en % de cellules apoptotiques, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. B) Les céramides et les DAG ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % de variation du contrôle, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. La quantité de céramides mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 690 ± 110 ng de céramides/mg de protéines. La quantité de DAG mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 640 ± 126 µg de DAG/mg de protéines.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Glucose25 mM

Mannitol20 mM

% d

e ce

llule

s ap

opto

tique

s

Contrôle5 mM

A)

0

20

40

60

80

100

120

140

Contrôle5 mM

Glucose25 mM

Mannitol20 mM

% D

MEM

-con

trôl

e

CERAMIDES

DAG

B)

128

III- IMMUNODETECTION DU RECEPTEUR AUX AGE, RAGE, SUR

LES PERICYTES RETINIENS

Nous avons examiné par immunodétection si le récepteur aux AGE, RAGE, est bien

présent dans les péricytes rétiniens bovins et si son niveau d�expression est modifié en

présence des AGE-MGX. Des protéines de lysats cellulaires de péricytes traités par les AGE-

MGX (ou son contrôle) ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis

transférées sur membrane de nitrocellulose. Celle-ci a été révélée à l�aide d�un anticorps anti-

RAGE, préincubé ou non avec son peptide bloquant, afin de mettre en évidence une

reconnaissance antigénique spécifique. L�intensité des bandes a été standardisée en

quantifiant l�α-actine contenue dans chaque piste. L�utilisation de cette protéine comme

standard interne est fiable, puisqu�elle n�est pas clivée par des caspases dans les péricytes

apoptotiques (Shojaee et al., 1999), comme c'est le cas dans d'autres types cellulaires

(Mashima et al., 1997).

Les résultats montrent la détection de trois bandes dans les pistes 1 et 2, une bande

migrant comme une protéine de masse apparente de 50 kDa de forte intensité et deux bandes

de plus faible intensité migrant comme des protéines de masses apparentes de 36 et 37 kDa

(Figure 29), reconnues spécifiquement. En effet, la pré-incubation de l�anticorps anti-RAGE

avec son peptide bloquant abolit la reconnaissance antigénique (pistes 4 et 5) de ces trois

protéines. L�intensité des bandes de 36 et 37 kDa (piste 2), ramenée à la quantité protéique

déposée (α-actine) pour chaque échantillon, est augmentée de 30% par rapport à celle des

bandes dans la piste 1. En revanche, le niveau de révélation de la protéine de 50 kDa reste

inchangé lorsque les péricytes sont soumis aux AGE-MGX.

129

Figure 29: Immunodétection de RAGE des péricytes rétiniens

Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (pistes 3 et 5) ou son contrôle (pistes 2 et 4). Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases (voir Matériel et Méthodes). Les standards de masse moléculaire (MM) (1 µl) (piste 1), les protéines de lysats cellulaires (20 µg) (pistes 2, 3, 4, 5) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). La membrane de nitrocellulose a été révélée à l�aide d�un anticorps primaire polyclonal de chèvre anti-RAGE humain, préincubé ou non avec le peptide bloquant, et un anticorps secondaire anti-chèvre de singe couplé à la peroxydase de raifort et révélée par chimioluminescence (voir Matériel et Méthodes). Puis la membrane a été lavée et de nouveau révélée à l�aide de l�anticorps anti-α-actine de souris et un anticorps anti-souris couplé à la peroxydase de raifort (voir Matériel et Méthodes). Les masses moléculaires des protéines sont estimées à l�aide d'un mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). L�immunodétection présentée ici est représentative de 2 expériences indépendantes.

IV- DISCUSSION

Nous avons analysé les effets des AGE-MGX sur l�apoptose des péricytes au moyen de

deux techniques mettant en évidence des altérations biochimiques induites au cours du

processus apoptotique: l�expression de la phosphatidylsérine (PS) à la surface externe de la

membrane plasmique (Bratton et al., 1997) et la dégradation de l�ADN génomique générant

des fragments d�oligonucléosomes de tailles variables (Wyllie, 1980).

α-actine

Peptide bloquant

13090

43

34

55 p50

RAGE (p37 et p36)

MMBSA-co

ntrôle

AGE-MGX

BSA-contrô

le

AGE-MGX

- - - + +

1 2 3 4 5

kDa

42

130

La présence de PS a été détectée par l'annexine V dans 8,9% de péricytes rétiniens

cultivés de façon chronique avec 3 µM d�AGE-MGX, représentant une augmentation d�un

facteur 3 du taux d�apoptose. Cet effet des AGE-MGX a été confirmé par une seconde

technique, qui a mis en évidence un enrichissement en oligonucléosomes cytoplasmiques

dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Nous avons également examiné les effets de

différentes concentrations d�AGE-MGX sur l�apoptose des péricytes rétiniens. Les résultats

ont montré que l�induction de l�apoptose par les AGE-MGX est dose-dépendante. L�analyse

de l�apoptose par un marquage à l�annexine-V et de l�iodure de propidium (nécrose) a montré

par ailleurs que les AGE-MGX, (de 1µM à 20 µM) n�induisent pas de nécrose dans notre

modèle de culture de péricytes rétiniens. Aux concentrations testées, les AGE-MGX ne

semblent pas induire d�effet cytotoxique dans les péricytes. Une étude récente montre que les

AGE employés à des concentration plus élevées (5 mg/ml ou 70 µM) induisent également

l�apoptose dans les péricytes rétiniens, visualisée par un marquage à l�annexine-V et à

l�acridine orange, associée à une altération mitochondriale, atteinte biochimique

caractéristique de l�apoptose (Kim et al., 2002).

Nos résultats suggèrent ainsi que les AGE-MGX induisent l�apoptose des péricytes en

culture. L�apoptose a été proposée comme le mécanisme responsable de la disparition

sélective des péricytes observée au cours du stade précoce de la rétinopathie diabétique. La

présence de péricytes apoptotiques a en effet été mise en évidence ex vivo dans les rétines

prélevées post-mortem de patients diabétiques, par une méthode de marquage de la

fragmentation de l�ADN (méthode TUNEL) (Mizutani et al. 1996; Li W. et al., 1997).

Venant à l�appui de cette hypothèse, d�autres équipes ont montré par la suite ex vivo dans des

péricytes rétiniens de patients diabétiques, l�induction de la transcription du gène de la

caspase-3, protéase de l�apoptose (Li W. et al., 1999) ou la surexpression de la protéine Bax,

protéine pro-apoptotique de la famille des Bcl-2 (Podesta et al., 2000). Plusieurs études ont

montré que les AGE étaient toxiques pour les péricytes rétiniens ou qu�ils réduisaient leur

croissance (Yamagishi et al., 1995; Chibber et al., 1997; Ruggiero-Loppez et al., 1997). Mais

l�induction de l�apoptose des péricytes par des AGE n�était, à ce jour, pas encore rapportée

(Lecomte et al., 2000, INPI). Nos résultats sont confirmés aujourd�hui par une étude toute

récente, menée in vitro, montrant que d�autres AGE, préparés à partir de glucose, de

glycéraldéhyde ou de glycoaldéhyde, sont également capables d�induire l�apoptose des

péricytes rétiniens, bien que les AGE-glucose soient moins pro-apoptotiques que les autres

AGE testés (Yamagishi et al., 2002a).

Divers travaux suggèrent que les AGE formés in vivo au cours du diabète peuvent jouer

un rôle dans l�apoptose des péricytes de microvaisseaux rétiniens. Dans un modèle de rat

131

diabétique, il a été montré que l�hyperglycémie mène à la formation d�AGE dans l�arbre

vasculaire rétinien, de manière précoce, avant l�apparition de lésions histologiques comme les

capillaires acellulaires et que ces AGE s�accumulent progressivement dans la membrane

basale des microvaisseaux (Stitt et al., 1997). En effet, les protéines de la matrice

extracellulaire sont des cibles privilégiées de la glycation en partie par leur faible taux de

renouvellement. Leur glycation induit par ailleurs une baisse de leur protéolyse (Mott et al.,

1997), phénomène contribuant à l�accumulation accrue d�AGE sur ces protéines. De plus, la

perte de la perméabilité de la barrière hémato-rétinienne est un phénomène très précoce dans

la rétinopathie diabétique. Les AGE circulants peuvent passer l�endothélium par transcytose

et être déposés dans la matrice subendothéliale, au niveau des péricytes rétiniens, qui sont

alors capables d�internaliser les AGE (Stitt et al., 1997 et 2000). Au cours du diabète, les

péricytes rétiniens sont ainsi progressivement exposés à des quantités d�AGE croissantes. Les

travaux publiés de Hammes et al. (1991) avec l�aminoguanidine comme anti-glyquant ou les

travaux préliminaires de Yatoh et al. (2000) suggèrent un rôle direct des AGE formés dans la

disparition des péricytes par apoptose. L�administration à des rats diabétiques Goto-Kakizaki

d�un nouvel inhibiteur de la glycation non enzymatique (OPB-9195) a en effet

considérablement réduit le nombre de péricytes rétiniens apoptotiques (Yatoh et al., 2000).

Dans notre modèle cellulaire, l�apoptose des péricytes est induite par des concentrations

d�AGE-MGX allant de 1 µM à 20 µM (soit une concentration protéique allant de 66 µg/ml à

1,5 mg/ml). Les concentrations protéiques d�AGE circulants dans le plasma ont été estimées

de l�ordre de 50 µg/ml (Takeuchi et Makita, 2001). Bien que la concentration d�AGE dans les

tissus ne soit pas directement mesurable, il est probable que le taux d�AGE tissulaire soit du

même ordre de grandeur, du fait de l�accumulation d�AGE sur les protéines de structure et de

la fuite d�AGE circulants vers la matrice extracellulaire. La concentration d�AGE-MGX

utilisée tout au long de ce travail de thèse est de 3 µM (200 µg/ml) et est supérieure à la

concentration plasmatique circulante.

Nous avons pu montrer que l�apoptose des péricytes est associée à une augmentation

des niveaux intracellulaires de DAG et de céramides. Le dosage de ces deux composés

lipidiques a été réalisé par la méthode de phosphorylation par la DAG-kinase. La fiabilité de

cette technique de dosage a été un sujet de controverse. Certains auteurs ont montré que la

formation de céramides, mesurée par la DAG-kinase, n�est pas observée lors d�un dosage par

une technique de spectrométrie de masse (Watts et al., 1997), alors que d�autres ont mis en

évidence une corrélation directe des quantités de céramides mesurées par les deux méthodes

(Grullich et al., 2000). Ici, l�augmentation des niveaux de céramides dans les péricytes

132

soumis aux AGE-MGX pendant deux passages, a été confirmée par une autre technique

appliquée au laboratoire, consistant en une séparation des céramides sur HPTLC suivie d�un

dosage colorimétrique. Ainsi les mesures des quantités de DAG et de céramides dans les

péricytes, à partir de la technique de la DAG kinase, sont fiables. Nos résultats suggèrent

donc, pour la première fois, que les DAG et les céramides pourraient être des médiateurs

intracellulaires impliqués dans l�apoptose des péricytes, induite par les AGE-MGX.

Nous nous sommes alors posé la question de savoir si des conditions hyperglycémiques

pouvaient également affecter l�apoptose des péricytes ainsi que la formation intracellulaire de

DAG et de céramides. Une incubation chronique des péricytes avec de fortes concentrations

de glucose (25 mM) ou de son contrôle osmotique n�a induit aucun effet sur les deux

paramètres mesurés, suggérant qu'il n�y a pas d'effet direct du glucose ou d'hyperosmolarité

provoquée par celui-ci sur l'apoptose ou la production de DAG dans les péricytes cultivés

pendant deux passages (2 semaines). D�autres auteurs ont montré que des fluctuations

abruptes de glucose pouvaient induire l�apoptose des péricytes (Li W. et al., 1996). Par

ailleurs, il a été montré qu�une forte concentration de glucose (30 mM) peut induire

l�apoptose des péricytes rétiniens in vitro, mais seulement après un temps long d�exposition

de minimum de 3 semaines (Cai et al., 1998; Podesta et al. 2000). Dans nos conditions de

culture, le glucose n�a pas montré d�effet pro-apoptotique après 2 semaines d�incubation, ce

qui est en accord avec les travaux cités précédemment. Ces différents résultats suggèrent que

les péricytes sont plus particulièrement sensibles aux AGE, puisque ceux-ci induisent

l�apoptose plus rapidement que le glucose dans notre modèle. Bien que le glucose puisse

avoir des conséquences directes sur l�apoptose des péricytes in vivo, nos résultats seraient en

accord avec la situation pathologique observée au cours du diabète. Les péricytes sont en effet

enfouis dans la membrane basale des microvaisseaux, constituée de protéines comme le

collagène ou la fibronectine qui forment des AGE (Stitt et al., 1997) et ils ne sont pas en

contact direct avec le glucose sanguin, contrairement aux cellules endothéliales.

Les AGE sont connus pour interagir avec des récepteurs spécifiques, comme AGE-R,

constitué de p60, p90 et la galectine-3 (Stitt et al., 1999) ou RAGE (Neeper et al., 1992). Ces

récepteurs ont été identifiés sur plusieurs types cellulaires, dont les péricytes rétiniens (p60,

p90: Stitt et al., 1997; RAGE: Yamagishi et al., 1995). Afin de vérifier la présence de RAGE

dans nos péricytes rétiniens, nous avons réalisé des immunodétections de ce récepteur sur des

protéines de lysats de péricytes soumis aux AGE-MGX (ou son contrôle). L�utilisation du

133

peptide bloquant de l�anticorps anti-RAGE a permis de mettre en évidence la détection

spécifique de trois protéines d�environ 36, 37 et 50 kDa.

La détermination de la séquence peptidique de RAGE (humain ou bovin), à partir de

l�ADNc, a permis d�identifier deux sites potentiels de N-glycosylation (Neeper et al., 1992).

Ces modifications post-traductionnelles peuvent induire, lors d�une séparation par SDS-

PAGE, une migration d�une protéine sous la forme de doublets (Ramanathan et al., 1989).

Les deux protéines de 36 et 37 kDa, observées dans les péricytes rétiniens, pourraient être la

même protéine RAGE migrant sous la forme de double bande, du fait d�une N-glycosylation.

D�ailleurs, bien que les auteurs (Neeper et al., 1992) n�aient pas soulevé cet aspect au cours

de leur étude, la protéine RAGE humaine, surexprimée dans des cellules 293 transfectées

avec l�ADNc de RAGE, purifiée, séparée par SDS-PAGE, puis visualisée par une coloration

au bleu de Coomassie, semble également apparaître sous forme de doublet. De plus, le

traitement de RAGE avec la N-glycosidase F (NPGase) réduit sa masse moléculaire de 4.5

kDa, renforçant considérablement l�hypothèse que RAGE est une glycoprotéine (Srikrishna et

al., 2002). Les masses moléculaires apparentes des deux protéines RAGE (36 et 37 kDa),

détectées dans les péricytes bovins, sont légèrement supérieures, à celles décrites pour le

RAGE humain (35 kDa). Cela pourrait être simplement dû aux erreurs expérimentales

d�évaluation de la masse moléculaire. Néanmoins, le clonage de RAGE à partir de tissu bovin

a montré la présence de quelques résidus acides aminés supplémentaires par rapport au

RAGE humain (12 aa), pouvant expliquer cette différence (Neeper et al., 1992). Dans les

cellules transfectées avec l�ADNc de RAGE, les auteurs ont également montré la présence

d�une protéine majoritaire de ≈ 50 kDa, spécifiquement reconnue par l�anticorps anti-RAGE.

Ils suggèrent que RAGE (35 kDa) résulte en fait d�un clivage du coté C-terminal de la

protéine de 50 kD au cours d�un processus de maturation post-traductionnelle. Dans les

péricytes rétiniens de b�uf, il semble que cette protéine soit également présente et de façon

majoritaire du fait d�une immunoréactivité supérieure à celles des protéines de masse

moléculaire apparente de 36 et 37 kDa. Les péricytes rétiniens de b�uf, utilisés au cours de

nos travaux, semblent donc exprimer les différentes formes de RAGE.

Le rôle direct de ce récepteur dans les effets inhibiteurs des AGE sur la prolifération des

péricytes a été démontré, en bloquant l�expression de RAGE au moyen d�ARN antisens

(Yamagishi et al., 1995). Westwood et al. (1994) ont par ailleurs montré que les protéines

modifiées avec le méthylglyoxal sont des ligands pour ce récepteur. Ainsi, l�interaction des

AGE-MGX avec RAGE pourrait être responsable de l�induction de l�apoptose dans les

péricytes rétiniens et de la production des DAG et des céramides. L�analyse quantitative des

bandes de 36 et 37 kDa a montré une augmentation de 30 % de ces protéines lorsque les

134

péricytes sont soumis aux AGE-MGX. Ce résultat suggère que l�expression de RAGE

pourrait être stimulée par les AGE. En effet, un tel phénomène a été décrit in vitro dans des

cellules endothéliales microvasculaires humaines pour RAGE (Tanaka et al., 2000) mais

également in vivo dans les glomérules de rats diabétiques pour les protéines p90 et la

galectine-3 du complexe AGE-R (Pugliese et al., 2000), montrant une adaptation de la cellule

à un environnement diabétique. Dans les péricytes, si la régulation de l�expression de RAGE

par les AGE-MGX se vérifiait, cela viendrait étayer l�hypothèse d�une liaison AGE-récepteur.

Au cours de cette étude, nous avons montré pour la première fois que les AGE induisent

des modifications biochimiques typiques de l�apoptose dans les péricytes rétiniens.

L�apoptose des péricytes induite par les AGE a été associée à une élévation des niveaux

endogènes de DAG et de céramides, suggérant que ces deux lipides soient impliqués dans la

transduction intracellulaire du message apoptotique. RAGE, un des récepteurs aux AGE, est

présent dans nos péricytes rétiniens et pourrait être le récepteur transmembranaire par lequel

les AGE induisent la réponse apoptotique.

135

CHAPITRE II

IDENTIFICATION DES VOIES DE PRODUCTION

DE CERAMIDES ET DE DAG INDUITES PAR LES

AGE-MGX DANS LES PERICYTES RETINIENS

Les céramides sont connus depuis longtemps comme des acteurs moléculaires impliqués

dans la régulation de réponses cellulaires variées comme la prolifération ou la différentiation.

Leur participation dans la transduction d�un signal apoptotique, aujourd�hui établie, est

proposée dans différents types cellulaires, en réponse à un grand nombre de stimuli, comme

le TNF-α, le ligand de FAS, des radiations ionisantes ou encore différentes drogues

chimiques (Mathias et al., 1998). Les diacylglycérols (DAG) sont des médiateurs lipidiques

impliqués dans des réponses cellulaires totalement opposées, suivant le type cellulaire et /ou

le stimulus. Largement connus comme lipides mitogéniques, les DAG peuvent orienter la

cellule vers la prolifération par l�activation de la PKC (Kishimoto et al., 1980) mais ils ont

également été décrits dans des processus apoptotiques en activant la sphingomyélinase acide

(Kolesnick, 1987; Schütze et al., 1992; Liu et Anderson, 1995; Genestier et al., 1998).

L�objectif de la deuxième partie des travaux a consisté à définir les voies métaboliques

impliquées dans la formation intracellulaire des céramides et des DAG et de vérifier si ces

deux composés lipidiques sont impliqués dans la transduction du message menant à

l�apoptose des péricytes. Dans ce but, nous avons simultanément analysé les effets de

différents agents pharmacologiques sur l�apoptose et sur les niveaux de production des deux

lipides.

I- VOIES DE PRODUCTION DES CERAMIDES ACTIVEES DANS LES

PERICYTES

Au cours du processus apoptotique, les céramides intracellulaires peuvent être générés

par différentes voies métaboliques. Ils peuvent être issus de la voie de biosynthèse de novo.

La sphinganine, un intermédiaire métabolique, est acylée par une céramide synthase (ou

sphinganine-acyl-transférase) pour former du dihydrocéramide, alors converti en céramide

sous l�action d�une désaturase. Mais les céramides peuvent également être le produit

d'hydrolyse enzymatique: ils peuvent en effet être formés à partir de sphingomyélines sous

l'action de sphingomyélinases (Mathias et al., 1998).

136

1- Implication d'une céramide synthase (ou sphinganine-acyl-

transférase) ?

Afin de vérifier si la voie de biosynthèse de novo des céramides est activée en réponse

aux AGE-MGX, nous avons testé un inhibiteur spécifique de la céramide synthase sur

l'apoptose des péricytes, la fumonisine B1 (Wang et al., 1991). L'apoptose des péricytes,

cultivés avec 3 µM d'AGE-MGX (ou son contrôle) pendant deux passages en présence de

0,01 ou 0,1µM de fumonisine B1, a été analysée par un marquage à l'annexine-V (Figure 30).

L'ajout de 0,01 µM de fumonisine B1 dans le milieu de culture n'a induit qu'une

inhibition partielle et non significative de l'apoptose (�20 %, n = 3). A la concentration de

0.1µM, la fumonisine B1 est pro-apoptotique, puisqu'elle affecte le taux basal de l'apoptose

des péricytes cultivés avec la BSA-contrôle (8,1 ± 1,7 % de cellules apoptotiques contre 4 ±

0,7 % dans les cellules cultivées en présence de BSA-contrôle seule, n = 3).

Figure 30: Effet de la fumonisine B1 sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) et 0,01 µM de fumonisine B1. L�apoptose a été détectée par un marquage à l�annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés A- en % de cellules apoptotiques et B- en % d�inhibition par la fumonisine B1 de l�apoptose induite par les AGE-MGX, sont la moyenne ± SD de 3 expériences indépendantes.

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,23 ± 0,17

6,49 ± 0,96

2,29 ± 0, 11

5,69 ± 1,18

fumonisine B1

- 0,01 µM

A-

-120

-100-80

-60

-40-20

0

inhi

bitio

n d

e l'a

popt

ose

indu

ite p

ar le

s AG

E(%

)

fumonisine B10,01 µM

B-

137

2- Implication d’une sphingomyélinase acide?

Au vu des résultats négatifs obtenus avec la fumonisine B1 sur l'apoptose des péricytes

induite par les AGE-MGX, nous nous sommes intéressés à la voie catabolique de formation

des céramides, qui implique l'action de sphingomyélinases. Il existe différentes isoformes de

sphingomyélinases, qui se distinguent principalement par leur pH optimum d'activité. Il s'agit

des sphingomyélinases acide, neutre et basique.

L'implication d'une sphingomyélinase acide (SMase) a été vérifiée en analysant les

effets d'un inhibiteur de cet enzyme, la désipramine (Hurvitz et al., 1994; Andrieu et al.,

1994; Jaffrezou et al., 1995), sur l'apoptose induite des cellules et sur la production stimulée

des DAG et des céramides dans les péricytes cultivés avec les AGE-MGX. Les péricytes ont

été cultivés de façon chronique avec 3 µM d'AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) et de la

désipramine aux concentrations de 0,1, 0,3 ou 1 µM.

Le traitement des péricytes avec 0,1 et 0,3 µM de désipramine a permis d'inhiber, de

façon significative, de plus de 35 % l'apoptose induite par les AGE-MGX (Figure 32-B). A

ces concentrations, le niveau basal de l'apoptose dans les péricytes cultivés avec la BSA-

contrôle n'a pas été affecté (Figure 32-A). Il a été en revanche augmenté avec la désipramine

à 1 µM (8 ± 3,5 % de cellules apoptotiques contre 2,6 ± 1,2 % dans les cellules cultivées avec

la BSA-contrôle seule, n = 6).

A la plus faible concentration (0,1 µM), la désipramine est capable d'inhiber la majorité

des céramides (-80 %, n = 5, p<0,05) produits dans les péricytes mais n'a présenté qu'un effet

inhibiteur mineur et non-significatif sur la production des DAG (-20 %). A la concentration

de 0,3 µM, la désipramine inhibe presque totalement la production des céramides (-97 %, n =

3). La production des DAG n'a été réduite que de 15 % à cette concentration (Figure 33).

138

Figure 32: Effet de la désipramine sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) et 0,1 µM ou 0,3 µM de désipramine. L�apoptose a été détectée par un marquage à l�annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats sont la moyenne ± SD de 7 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,1 µM et de 4 expériences indépendantes pour la désipramine à 0,3 µM. A- Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques. B- Les résultats représentent les % d�inhibition par la désipramine de l�apoptose induite par les AGE-MGX � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d'inhibition).

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Inhi

bitio

n de

l'ap

opto

se

indu

ite p

ar le

s A

GE(

%)

désipramine0,1 µM

désipramine0,3 µM

* *

B-

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,90 ± 0,45

9,17 ± 0,62 (�)

-

2,79 ± 0,51

6,70 ± 0,66 (*)

A-désipramine 0,1 µM

3,07 ± 0,39

6,85 ± 0,33 (*)

désipramine 0,3 µM

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,96 ± 0,31

9,24 ± 0,52 (�)

-

139

Figure 33: Effet de la désipramine sur la production stimulée des DAG et des céramides dans les péricytes traités par les AGE-MGX. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d'AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et 0,1 µM ou 0,3 µM de désipramine. Les céramides et les DAG ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont la moyenne ± SD de 5 expériences indépendantes pour la désipramine 0,1µM et de 3 expériences indépendantes pour la désipramine 0,3µM. A- Les résultats sont exprimés en % de BSA-contrôle. Les quantités de DAG et de céramides mesurés dans les cellules contrôles (100 %) sont de 720 ± 140 ng de céramides/mg de protéines et de 632± 114 µg de DAG/mg de protéines pour 0,1 µM de désipramine et de 703 ± 125 ng de céramides/mg de protéines et de 621± 111 µg de DAG/mg de protéines pour 0,3 µM de désipramine. B- Les résultats sont exprimés en % d'inhibition par la désipramine de la production stimulée de DAG et de céramides � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d'inhibition).

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Inhi

bitio

n de

s ni

veau

xst

imul

és p

ar le

s A

GE

(%)

DAGCéramides

désipramine0,1 µM

désipramine0,3 µM

*

B-

Contrôle-BSA

AGE-MGX

désipramine 0,1µM

102 ± 4

115 ± 9 (*)

CéramidesDAG

104 ± 5

169 ± 17

A-

DAG

102 ± 5

173 ± 9

Céramides

96 ± 10

98 ± 14

désipramine 0,3µM

-

100

182 ± 15 (�)

DAG Céramides

100

171 ± 14 (�)

Contrôle-BSA

AGE-MGX

-

100

185 ± 15 (�)

DAG Céramides

100

167 ± 14 (�)

140

II- VOIE DE PRODUCTION DES DIACYLGLYCEROLS DANS LES

PERICYTES : implication d�une phosphatidylcholine-phospholipase C?

Les voies de production des DAG sont de deux types. Ils peuvent provenir d'une

activation de la voie de biosynthèse de novo ou alors être formés par l'hydrolyse de

phospholipides par des phospholipases C (PLC): les DAG peuvent être libérés à partir de

phosphoinositides ou de phosphatidylcholines par des PLC spécifiques.

Nous avons analysé par la suite les effets du D609, un inhibiteur de la

phosphatidylcholine phospholipase C (PC-PLC) (Müller-Decker, 1989; Wiegmann et al.,

1994) sur l'apoptose et la formation des DAG et des céramides, observées dans les péricytes

en réponse aux AGE-MGX. Le D609 (9,4, 30 et 94 µM) a été ajouté directement dans le

milieu de culture des péricytes, cultivés pendant deux passages avec 3 µM d'AGE-MGX (ou

de BSA-contrôle).

L'apoptose induite par les AGE-MGX a été réduite de façon significative de 40 % (n =

6) et 47 % (n = 5) dans les péricytes traités avec respectivement 9,4 µM et 30 µM de D609

(Figure 34-B). A ces concentrations, le D609 n'a pas présenté d'effet pro-apoptotique (Figure

34-A), alors qu'un traitement des péricytes avec 94 µM de D609 a affecté le niveau basal de

l'apoptose dans les cellules cultivées avec la BSA-contrôle (6 % de cellules apoptotiques

contre 2,3 % dans les cellules cultivées avec la BSA-contrôle seule, n = 2).

Dans les péricytes traités avec 9,4 µM de D609, la formation des DAG et des

céramides a été inhibée de manière presque totale (respectivement de 86 % et 98 % n = 4). A

la concentration de 30 µM, le D609 a permis une inhibition complète de la formation des

céramides et une réduction de 75 % des niveaux de DAG (n = 3) (Figure 35).

Mais nous avons également testé la combinaison 0,1 µM de désipramine/9,4 µM de

D609 dans l'hypothèse d'agir simultanément sur les deux cibles enzymatiques, la SMase et la

PC-PLC. Le traitement des péricytes avec ces deux agents combinés n'a induit qu'un effet

équivalent à ceux observés avec le D609 (30 µM): l'apoptose dans les péricytes a été inhibée

de 53 % (n = 4, p<0,05), les niveaux de DAG ont été réduits de 80 % et la production de

céramides a été totalement bloquée (n = 3) (Figures 34 et 35).

141

Figure 34: Effet du D609, en combinaison ou non avec la désipramine, sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) et 9,4 µM ou 30 µM de D609 seul ou 9,4 µM de D609 + 0,1 µM de désipramine. L�apoptose a été détectée par un marquage à l�annexine V comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont la moyenne ± SD de 6 expériences indépendantes pour le D609 à 9,4 µM, et de 4 expériences indépendantes pour le D609 à 30 µM et la combinaison D609 9,4 µM + désipramine 0,1 µM. A- Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques. B- Les résultats représentent le % d�inhibition par les agents pharmacologiques de l�apoptose induite par les AGE-MGX, � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d'inhibition).

Inhi

bitio

n de

l'ap

opto

se in

duite

par

les

AG

E (%

)

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

D6099,4 µM

D60930 µM

D609 9,4 µMdésipramine 0,1 µM

B-

* **

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,30 ± 0,45

6,80 ± 0,49 (�)

2,57 ± 0, 46

5,27 ± 0,43 (*)

D609 9,4 µM-

2,26 ± 0,50

4,60 ± 0,33 (*)

D609 30 µMA-

2,42 ± 0,41

4,51 ± 0,32 (*)

D609 9,4 µM + désipramine 0,1 µM

-

2,29 ± 0,2

6,78 ± 0,35 (�)

2,32 ± 0,31

6,84 ± 0,29 (�)

-

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

142

Figure 35: Effet du D609, en combinaison ou non avec la désipramine, sur la production stimulée des DAG et des céramides dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d'AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et 9,4 µM ou 30 µM de D609 seul ou 9,4 µM de D609 + 0,1 µM de désipramine. Les DAG et les céramides ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase (Matériel et Méthodes). Les résultats sont la moyenne ± SD de 4 expériences indépendantes pour le D609 à 9,4 µM et de 3 expériences indépendantes pour le D609 à 30 µM et la combinaison désipramine 0,1 µM + D609 9,4 µM. A- Les résultats sont exprimés en % de BSA-contrôle. Les quantités de DAG et de céramides mesurés dans les cellules contrôles (100 %) sont de 735± 159 ng de céramides/mg de protéines et de 632± 114 µg de DAG/mg de protéines pour 9,4 µM de D609, de 703 ± 125 ng de céramides/mg de protéines et de 629± 135 µg de DAG/mg de protéines pour 30 µM de D609 et de 721 ± 133 ng de céramides/mg de protéines et de 619± 115 µg de DAG/mg de protéines pour la combinaison D609/désipramine. B- Les résultats sont exprimés en % d'inhibition par les agents pharmacologiques de la production stimulée de DAG et de céramides. � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); * p< 0,05 (% d'inhibition).

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

DAG

céramides

D6099,4 µM

D60930 µM

D609 9,4 µMdésipramine 0,1 µM

Inhi

bitio

n de

s ni

veau

xst

imul

és p

ar le

s A

GE

(%)

**

B-

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

182 ± 12 (�)

DAG

D609 9,4 µM

111 ± 8

112 ± 15 (*)

CéramidesDAG

108 ± 5

119 ± 8 (*)

A-

Contrôle-BSA:

AGE-MGX :

DAG

103 ± 7

124 ± 6

Céramides

106 ± 4

105 ± 12

D609 30 µM

DAG Céramides

Céramides

100

175 ± 14 (�)

Contrôle-BSA:

AGE-MGX :

DAG Céramides

- D609 9,4 µM + désipramine 0,1µM

DAG

104 ± 5

120 ± 7

Céramides

101 ± 7

102 ± 11

-

100

185 ± 9

100

181 ±11

100

180 ± 19

100

172 ±12

143

III- DISCUSSION

L�induction de l�apoptose dans les péricytes par les AGE-MGX a été associée à une

stimulation de la production de deux messagers lipidiques intracellulaires, les céramides et les

DAG. Les voies de production de ces deux intermédiaires métaboliques ont alors été

explorées selon une approche pharmacologique. Les cellules ont été cultivées en présence de

différents inhibiteurs enzymatiques, dont les effets ont été analysés d'une part sur l'apoptose

induite et d'autre part sur la production stimulée de céramides et de DAG en réponse aux

AGE-méthylglyoxal.

Dans certains modèles cellulaires, les céramides, synthétisés de novo, ont été impliqués

dans la transduction du signal apoptotique (Xu et al., 1998; Kroesen et al., 2001). Nous avons

examiné dans un premier temps si les céramides intracellulaires formés dans les péricytes

cultivés à long terme avec les AGE-MGX résultaient de l�activation de la voie de biosynthèse

de novo. L�apoptose des péricytes, cultivés de façon chronique en présence de 0,01 µM de

fumonisine B1 (concentration non cytotoxique) n�a pas été affectée de façon significative. Ce

résultat suggère que les AGE-MGX n�ont pas induit l�activation de la biosynthèse de novo

des céramides, puisque l'apoptose n'a pas été affectée par la fumonisine B1 qui bloque cette

voie. L�utilisation d�une concentration plus élevée de fumonisine B1 (0,1 µM) s�est avérée

cytotoxique.

Dans d�autres modèles de culture, la fumonisine B1 est testée à des concentrations

supérieures à celles utilisées dans nos expériences (jusqu�à 50 µM) (Kroesen et al., 2001).

L�effet toxique de la fumonisine B1 à 0,1 µM dans les péricytes peut être lié à la durée du

traitement des cellules. Dans notre modèle de culture, les péricytes, cultivés de façon

chronique, sont en effet exposés pendant des temps longs à la fumonisine B1 (15 jours

environ), alors que dans les autres modèles cellulaires, les cellules ne sont incubées que

quelques heures (jusqu�à 24 heures) avec cet agent. Bien que la concentration de fumonisine

B1 testée sur les péricytes (0,01 µM) soit faible en regard de celle utilisée habituellement,

l�équipe de Hsu a montré que 0,01 µM de fumonisine B1 était capable de bloquer

simultanément de 50 % l�apoptose induite par le TNFα combiné au cycloheximide et

d�atténuer les niveaux de céramides intracellulaires produits dans ces conditions (Xu et al.,

1998). Cette concentration a été suffisante pour mettre en évidence l�implication de la

synthèse de novo des céramides dans leur modèle. Dans les péricytes cultivés avec les AGE-

MGX, l�absence d�un effet inhibiteur de la fumonisine B1 (0,01µM) sur l�apoptose suggère

144

donc bien que la formation des céramides ne résulte pas de l�activation de la voie de synthèse

de novo.

Nous avons alors examiné l�implication éventuelle de la sphingomyélinase acide (A-

SMase) dans le processus apoptotique en testant la désipramine, agent décrit comme un

inhibiteur de cet enzyme (Andrieu et al., 1994; Jaffrezou et al., 1995). Le traitement des

péricytes avec la désipramine (notamment à 0,3 µM) inhibe la production des céramides sans

affecter celle des DAG. Ce résultat suggère que

- les AGE-MGX n�activent que l�A-SMase, puisque la désipramine bloque totalement la

production des céramides,

- l�A-SMase est activée séquentiellement par des DAG générés sous l�action d�une PC-PLC

(Kolesnick, 1987; Schütze et al., 1992; Genestier et al., 1998), processus enzymatique non

affecté par la désipramine.

L�inhibition totale des céramides, observée avec la désipramine, confirme par ailleurs

que la voie de biosynthèse de novo des céramides n�est pas activée en réponse aux AGE-

MGX.

Afin de valider ou non l'hypothèse proposée pour le couplage entre la production des

DAG et des céramides par l'activation séquentielle de la PC-PLC et de l'A-SMase, nous avons

analysé les effets d'un inhibiteur de la PC-PLC, le D609 (Müller-Decker, 1989), sur

l'apoptose et sur la production des DAG et des céramides dans les péricytes cultivés avec 3

µM d�AGE-MGX. L�incubation des péricytes traités aux AGE-MGX en présence de D609 a

induit une inhibition parallèle de la production stimulée des DAG et des céramides. Ce

résultat permet raisonnablement de conclure que la formation des DAG est bien liée à

l'activation d'une PC-PLC couplée à une A-SMase: l'hypothèse du couplage entre la

production des DAG et des céramides est validée. Un effet inhibiteur du D609 sur d'autres

enzymes que la PC-PLC, comme la sphingomyéline synthase, a été décrit dans des

fibroblastes humains de poumon transformés par le virus SV40. Mais lorsque ces cellules

sont traitées par le D609, les niveaux endogènes de céramides et de DAG évoluent dans des

sens opposés (Figure 36) (Luberto et Hannun, 1998). Dans notre modèle de péricytes traités

aux AGE-MGX, les résultats obtenus avec le D609 sont clairement différents puisqu�une

inhibition parallèle des DAG et des céramides est observée, semblant ainsi écarter un effet

éventuel du D609 sur la sphingomyéline synthase.

145

Figure 36: Le cycle de la sphingomyéline (SM)

Malgré l�inhibition complète des DAG et des céramides, les cellules ne sont que

partiellement protégées de l'apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal. Ce résultat ne remet

pas en question le rôle des céramides dans la médiation de l�apoptose mais suggère plutôt

l'existence d'une seconde voie de signalisation menant à l'apoptose des péricytes,

indépendante de la production de DAG et de céramides. En effet, dans certains modèles

cellulaires, il a été montré que l�apoptose pouvait être induite indépendamment de la

production de céramides (Watts et al., 1997). Par ailleurs, certains travaux ont montré que

l�inhibition des céramides, formés en réponse à des signaux de mort, ne protégeait pas les

cellules contre l�apoptose, mettant en évidence que les céramides produits n�étaient pas

impliqués dans le processus apoptotique (Escargueil-Blanc et al., 1998; Gamen et al., 1998).

En revanche, dans les péricytes rétiniens, l�inhibition de la formation des deux médiateurs

lipidiques par le D609 est associée à une baisse de l�apoptose, suggérant bien la contribution

des céramides (et des DAG) dans la transduction du signal apoptotique.

En conclusion, nous avons pu identifier les acteurs enzymatiques responsables de la

formation des DAG et des céramides dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Mais nous

avons également montré l�existence de deux voies de signalisation menant à l�apoptose des

péricytes, l�une dépendante, la seconde indépendante de la génération des DAG et des

céramides (Figure 37). Nos travaux ont donc consisté par la suite à identifier une cible

enzymatique, située en amont des deux médiateurs lipidiques, et qui pourrait également se

trouver au carrefour des deux voies de signalisation.

Céramides SM

DAGPtdCho

Choline-PSMases

SM synthase

D609

146

Figure 37: Hypothèse de la voie de signalisation menant à l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX

PC DAG

PC-PLC

SM Céramides

A-SMase

AGE-MGX (/récepteur aux AGE?)

Apoptose

147

CHAPITRE III

IMPLICATION DE CASPASES DANS L'APOPTOSE

DES PERICYTES RETINIENS INDUITE PAR LES

AGE-MGX

Des études récentes ont mis en évidence qu�une série de protéases de la famille des ICE

(Interleukin-1 Converting Enzyme) renommées caspases (Cystein Aspartate-specific

proteases) jouaient un rôle clef dans la transduction des signaux apoptotiques. Différentes

classifications des caspases ont pu être proposées selon le critère de comparaison. Le temps

d�implication et le mode d�activation ont permis de distinguer les caspases initiatrices

(caspase-2, 8, 9 et 10) des caspases effectrices (caspase-3, 6 et 7) (Alnemri et al., 1999). De

l�analyse phylogénétique des caspases, trois groupes ont été définis, dont la famille de la

caspase-3 regroupant les caspase-3, 6, 7, 8 et 10 (Alnemri et al., 1996). Enfin, une

différentiation des caspases a également été établie en fonction de leur spécificité de substrat

(Thornberry et al., 1997). Caspases et céramides sont des médiateurs étroitement associés

dans la transduction du message apoptotique. La génération de céramides sous le contrôle de

caspases initiatrices a en effet été décrite dans divers modèles cellulaires (Brenner et al.,

1998), alors que l�activation de caspases effectrices, conséquente à la génération de

céramides, a également été rapportée (Genestier et al., 1998).

L�objectif de cette étude a été de définir au moyen d�inhibiteurs peptidiques si

l�apoptose des péricytes est sous le contrôle de l�activation de caspases (initiatrices et

effectrices) et d�identifier par immunodétection la caspase initiatrice activée en amont dans la

cascade de signalisation intracellulaire menant à l�apoptose.

I-EFFETS D’INHIBITEURS PEPTIDIQUES DES CASPASES

Les caspases sont inhibées de façon spécifique in vitro et in vivo par des peptides

synthétiques, rendus perméables aux cellules par des groupements chimiques bloquant les

fonctions NH2 et COOH terminales, et mimant le site de clivage de leur substrat respectif.

148

Différents inhibiteurs peptidiques synthétiques ont été testés afin de vérifier si des caspases

initiatrices et/ou effectrices étaient impliquées dans l'apoptose des péricytes induite par les

AGE- MGX. Les cellules ont donc été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-

MGX (ou de BSA-contrôle) et 50 µM de chacun des inhibiteurs peptidiques, dont les effets

ont été analysés simultanément sur l�apoptose et sur la formation intracellulaire des DAG et

des céramides.

1-Les inhibiteurs peptidiques

Nous avons testé toute une batterie d�inhibiteurs peptidiques, plus ou moins spécifiques

d�une caspase:

-le peptide z-VDVAD-fmk est inhibiteur de la caspase-2, mais également de la caspase-

3 (Talanian et al., 1997).

-le peptide z-IETD-fmk est un inhibiteur puissant de la caspase-8 (Thornberry et al.,

1997; Garcia-Calvo et al., 1998) pouvant secondairement inhiber la caspase-10 (Garcia-Calvo

et al., 1998).

-le peptide z-LEHD-fmk est le substrat privilégié de la caspase-9 pouvant également

être reconnu de façon moins spécifique par les caspases-2, 8 et10 (Thornberry et al., 2000).

-le peptide z-AEVD-fmk est un inhibiteur de la caspase-10 et de façon moins spécifique

des caspases-8, 9 (Calbiochem; Garcia-Calvo et al., 1998).

-le peptide z-VAD-fmk inhibe un large spectre de caspases, incluant ainsi les caspases

initiatrices et les caspases effectrices, présentant toutefois une efficacité d�inhibition faible

pour la caspase-2 (Garcia-Calvo et al., 1998).

-le peptide z-DEVD-fmk présente un effet inhibiteur de la famille de la caspase-3,

agissant principalement sur les caspase-3 et 7 effectrices et de façon moins spécifique sur les

caspases-6, 8 et 10 (Garcia-Calvo et al., 1998)

2-Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur l'apoptose des

péricytes induite par les AGE-MGX

L'ajout de 50 µM de z-VAD-fmk, de z-DEVD-fmk et de z-AEVD-fmk dans le milieu

de culture permet une inhibition totale de l'apoptose des péricytes soumis aux AGE-MGX.

Alors que les peptides z-VDVAD-fmk (-40 %, n = 3) et z-LEHD-fmk (-75 %, n = 5)

protègent partiellement les péricytes de l'apoptose induite par les AGE-MGX, le peptide z-

IETD-fmk n'a pas d'effet sur la mort cellulaire (Figure 38). Des 5 expériences réalisées avec

149

z-LEHD-fmk, seules quatre ont montré une inhibition importante de l�apoptose (-85,3%, -

93%, -88,5% et -95%) et une un effet très modéré (-34,5%). C�est pour cette raison que

l�inhibition de l�apoptose induite par les AGE-MGX, bien que significative, n�est pas totale.

Figure 38: Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases (50 µM) sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) et 50 µM de chacun des inhibiteurs peptidiques. L�apoptose a été détectée par un marquage à l�annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % d�inhibition de l�apoptose induite par les AGE-MGX, sont la moyenne ± SD de 6 expériences indépendantes pour les peptides z-VAD-fmk, z-AEVD-fmk et z-DEVD-fmk, de 5 expériences indépendantes pour le peptide z-LEHD-fmk et de 3 expériences indépendantes pour les peptides z-IETD-fmk et z-VDVAD-fmk A- Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques. B- Les résultats représentent les % d�inhibition, par les différents inhibiteurs peptidiques, de l�apoptose induite par les AGE-MGX Les caspases citées entre parenthèse sont celles inhibées préférentiellement par le peptide testé. � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d'inhibition).

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

A-

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,64 ± 0,60

7,4 ± 0,62 (�)

2,66 ± 0,81

2,65 ± 0,66 (*)

- z-VAD-fmk

2,57 ± 0,39

2,51 ± 0,44 (*)

z-AEVD-fmk-

2,51 ± 0,39

6,65 ± 0,78 (�)

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

2,90 ± 0,14

5,41 ± 0,45

z-VDVAD-fmk

3,11 ± 0,22

7,41 ± 0,62 (�)

-

2,38 ± 0,21

7,17 ± 1,01

z-IETD-fmk

2,32 ± 0,21

6,94 ± 0,80(�)

-

2,36 ± 0,31

3,59 ± 1,15 (*)

z-LEHD-fmk

2,31 ± 0,37

7,23 ± 0,92 (�)

-z-DEVD-fmk

2,42 ± 0,31

2,39 ± 0,25 (*)

2,2 ± 0,37

7,21 ± 0,92 (�)

-

B-

-140-120-100

-80-60-40-20

020

Inhi

bitio

n de

l’ap

opto

se

indu

ite p

ar e

ls A

GE

(%)

*

z-VAD-fmk(toutes)

*

z-AEVD-fmk(casp-10)

z-VDVAD-fmk(casp-2)

z-LEHD-fmk(casp-9)

*

z-DEVD-fmk(casp-3 like)

Z-IETD-fmk(casp-8)

*

Caspases cibles:

150

3-Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur la production des

DAG et des céramides induite par les AGE-MGX Nous avons également dosé les DAG et les céramides dans les péricytes incubés de

façon chronique (deux passages) avec les AGE-MGX et les différents inhibiteurs peptidiques

(Figure 39-A). Les effets des inhibiteurs peptidiques sur la production stimulée des DAG et

les céramides par les AGE-MGX diffèrent: alors que la production des deux intermédiaires

métaboliques n'est pas affectée dans les péricytes traités avec 50 µM de z-LEHD-fmk et z-

DEVD-fmk, la production des DAG et des céramides est inhibée de plus de 90 % par le

peptide z-VAD-fmk (n = 5), de 85 % et 95 % respectivement par le peptide z-AEVD-fmk (n

= 6) et de -70 % et �75 % respectivement par le peptide z-VDVAD-fmk (n = 2) (Figure 39-

B). Comme le peptide inhibiteur de la caspase-8, z-IETD-fmk, n�a pas inhibé l�apoptose des

péricytes (Figure 37-B), nous n�avons pas analysé les effets de ce peptide sur la formation des

DAG et des céramides.

Pour chacun des inhibiteurs peptidiques testés, nous avons contrôlé que le véhicule seul

(DMSO) n�avait pas d�effet. Dans chacune des expériences, le DMSO (< 0.2% v/v) n�a induit

aucune modification de l�apoptose et des niveaux de DAG et de céramides dans les péricytes,

traités aussi bien avec la BSA-contrôle que les AGE-MGX (résultats non montrés).

151

Figure 39: Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases (50 µM) sur la production des DAG et des céramides dans les péricytes stimulée par les AGE-MGX. Légende, voir Figure 39-B

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

135 ± 7

DAG98 ± 5

102 ± 6

CéramidesDAG103 ± 8

104 ± 8

A-Céramides100

145 ± 11

z-VAD-fmk

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

138 ± 7 (�)

DAG101 ± 8

102 ± 15 (*)

CéramidesDAG99 ± 11

104 ± 4 (*)

Céramides100

145 ± 14 (�)

z-AEVD-fmk

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

150

DAG94

111

CéramidesDAG99

116

Céramides100

157

z-VDVAD-fmk

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

137 ± 8

DAG90 ± 13

126 ± 23

CéramidesDAG93 ± 11

125 ± 3

Céramides100

138 ± 12

z-LEHD-fmk

Contrôle-BSA:

AGE-MGX:

-

100

132 ± 12

DAG98 ± 10

140 ± 10

CéramidesDAG101 ± 5

124 ± 25

Céramides100

136 ± 4

z-DEVD-fmk

152

Figure 39: Effet des inhibiteurs peptidiques de caspases sur la production des DAG et des céramides dans les péricytes stimulée par les AGE-MGX.

Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d'AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et 50 µM de chacun des inhibiteurs peptidiques. Les céramides et les DAG ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase (voir Matériel et Méhodes). Les résultats, exprimés en % d'inhibition de la production stimulée de céramides et de DAG, sont la moyenne ± SD de 5 et 6 expériences indépendantes pour les peptides z-VAD-fmk et z-AEVD-fmk, respectivement, de 3 expériences indépendantes pour les peptides z-LEHD-fmk et z-DEVD-fmk et de 2 expériences indépendantes pour z-VDVAD-fmk A- Les résultats sont exprimés en % de BSA-contrôle. Les quantités de céramides et de DAG mesurés dans les cellules contrôles (100 %) sont:

z-VAD-fmk: 720 ± 140 ng de céramides/mg de protéines et 632± 114 µg de DAG/mg de protéines. z-AEVD-fmk: 712 ± 132 ng de céramides/mg de protéines et 604± 95 µg de DAG/mg de protéines. z-VDVAD-fmk: 741 ± 149 ng de céramides/mg de protéines et 625± 121 µg de DAG/mg de protéines. z-LEHD-fmk: 689 ± 99 ng de céramides/mg de protéines et 616± 108µg de DAG/mg de protéines. z-DEVD-fmk: 725 ± 114 ng de céramides/mg de protéines et 642± 104 µg de DAG/mg de protéines.

B- Pour chaque inhibiteur peptidique, les résultats sont exprimés en % d'inhibition de la production stimulée de DAG et de céramides par les AGE-MGX. � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d'inhibition).

II-IMMUNODETECTIONS DES CASPASES-2, 8 et 10 DANS LES

PERICYTES SOUMIS AUX AGE-MGX

Afin de confirmer les résultats obtenus à partir des inhibiteurs peptidiques, nous avons

réalisé des immunodétections des caspases-2, 8, et 10 à l�aide d�anticorps spécifiques. Le

matériel antigénique utilisé dans notre étude est de source bovine. Ne disposant pas

d�anticorps primaires dirigés contre du matériel bovin, notre choix s�est porté sur des

anticorps polyclonaux présentant une immunoréactivité croisée avec différentes espèces

(Homme, souris et rat).

Les anticorps primaires employés sont dirigés contre une séquence peptidique plus ou

moins longue de la grande sous-unité (caspase-8 et 10) ou de la petite sous-unité (caspase-2)

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

Inhi

bitio

n de

s ni

veau

x st

imul

és p

ar le

s A

GE

(%)

DAG

Céramides

*

*

z-VAD-fmk(toutes)

z-AEVD-fmk(casp-10)

z-VDVAD-fmk(casp-2)

z-LEHD-fmk(casp-9)

z-DEVD-fmk(casp-3 like)

B-Caspases cibles:

153

de la caspase recherchée. Compte tenu de la séquence antigénique reconnue par les anticorps,

l�immunodétection permet de visualiser la procaspase inactive et non clivée ainsi que la

sous-unité (petite ou grande) libérée après le clivage protéolytique, qui démontre l'activation

des caspases. D�autre part, les peptides bloquants, disponibles uniquement pour les anticorps

anti-caspases-2 et 8, ont été employés afin de vérifier la spécificité de la reconnaissance

antigénique.

Les immunodétections des caspases, contenues dans les lysats cellulaires de péricytes

incubés avec des AGE-MGX, ont donc été réalisées dans le but de vérifier la présence des

caspases-2,-8 et -10 et aussi de mettre en évidence leur activation en sous-unités actives. Les

péricytes, cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de son contrôle), ont

été lysés et les protéines ont été séparées par SDS-PAGE. Après transfert sur membrane de

nitrocellulose, les caspases ont été révélées au moyen d�anticorps spécifiques.

1-Immunodétection de la caspase-8

Le peptide z-IETD-fmk n�a pas affecté l�apoptose des péricytes induite par les AGE-

MGX, suggérant que la caspase-8 n�est pas impliquée dans ce phénomène. Nous avons donc

vérifié, par immunodétection, si cette caspase est présente dans les péricytes mais pas activée

en réponse aux AGE-MGX ou si elle est simplement absente de ces cellules. Des protéines

de lysats de péricytes, ainsi que la caspase-8 humaine recombinante active (p18 et p12) ont

été révélées avec un anticorps polyclonal anti-caspase-8 humaine. L'anticorps a été

préalablement incubé (pistes 5, 6, 7) ou non (pistes 2, 3, 4) avec le peptide bloquant (Figure

40).

La piste correspondant à l'étalon de caspase-8 humaine, révélée par l�anticorps seul

(piste 4), fait apparaître trois bandes correspondant aux peptides contenant les deux sous-

unités non clivées (p30), la grande sous-unité (entière ou fragmentée) et la petite sous-unité

(p12). La pré-incubation de l�anticorps avec le peptide bloquant (piste 5) abolit le signal pour

les bandes p30 et p12 ou le réduit fortement pour les bandes p18 et le fragment de p18,

démontrant l�efficacité du peptide à bloquer la reconnaissance antigénique de l'anticorps

anti-caspase-8 (Figure 40).

Une bande de masse apparente d'environ 45 kDa est détectée à la fois dans les pistes

BSA et AGE révélées avec l�anticorps seul (pistes 2 et 3) et dans les pistes révélées avec

l�anticorps préincubé avec le peptide bloquant (pistes 6 et 7). Ce résultat suggère que la

protéine reconnue résulte d�une reconnaissance non spécifique (Figure 40).

154

Figure 40: Immunodétection de la caspase-8 bovine dans les péricytes traités ou non par les AGE-MGX. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou son contrôle). Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases. Les standards de masse moléculaire (1 µl) (piste 1), les protéines de lysats cellulaires (20 µg) (pistes 2, 3, 6, 7) et la caspase-8 recombinante humaine (1 µg) (pistes 4, 5) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférées sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). La membrane de nitrocellulose a été révélée à l�aide d�un anticorps primaire polyclonal de chèvre anti-caspase-8 humaine, préincubé ou non avec le peptide bloquant (5 fois plus que l'anticorps w/w), et un anticorps secondaire anti-chèvre de singe couplé à la peroxydase de raifort et révélée par chimioluminescence (voir Matériel et Méthodes). Les masses moléculaires des protéines sont estimées à l�aide du mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). L�immuno-empreinte présentée ici est représentative de 4 expériences indépendantes.

2-Immunodétection de la caspase-10 Le peptide z-AEVD-fmk, employé pour inhiber la caspase-10, inhibe l�apoptose et la

formation des DAG et des céramides, suggérant la présence de la caspase-10 dans les

péricytes et son activation en réponse aux AGE-MGX. Pour la mettre en évidence de

manière directe, nous avons réalisé une immunodétection de la caspase-10, a l�aide d�un

anticorps anticaspase-10 dirigé contre la grande sous-unité.

non spécifique

2 3 4 5 6 7

p30

p18

p12

p18 fragment (?)

37

25

5075

100

1

15

Peptide bloquantBSA-co

ntrôle

AGE-MGX

Casp-8

Casp-8

AGE-MGX

MM

- - - + + +-BSA-co

ntrôle

kDa

155

Les résultats montrent la présence d�une bande migrant comme une protéine de masse

moléculaire apparente de 64 kDa (le précurseur) d�intensité plus faible dans la piste AGE

(piste 3) par rapport à celle de la BSA (piste 2) et une bande de 27 kDa (la grande sous-unité)

d�intensité plus forte dans la piste AGE (piste 3) que celle de la BSA (piste 2) (Figure 41).

La détermination des masses moléculaires apparentes a été effectuée à partir de l�analyse de

7 immunodétections, selon la représentation logarithmique de la masse moléculaire en

fonction de la mobilité relative (cm) sur le gel (voir Matériel et Méthodes-IV-2). Il faut

toutefois considérer que l�utilisation de mini-gels en SDS-PAGE ne permet qu�une

estimation et non une détermination exacte des masses moléculaires apparentes, du fait d�une

résolution modérée notamment pour les protéines de masse moléculaire élevée ayant une

faible migration dans le gel.

La différence d�intensité des bandes p64 et p27 entre les pistes BSA et AGE, retrouvée

lors des autres immunoempreintes réalisées, a été quantifiée. Dans la piste AGE, l�intensité

de la bande p64 est diminuée de 40 ± 13% alors que celle de la bande p27 est augmentée de

54 ± 30% (Figure 42).

Comme contrôle positif, nous avons également déposé la caspase-10/a humaine

recombinante, disponible sous la forme clivée. La grande sous-unité de masse moléculaire

connue de 17 kDa a été détectée (Figure 41). L�estimation de sa masse moléculaire apparente

à partir de la migration des standards de masse moléculaire est de 18 kDa, montrant une

bonne concordance entre la masse moléculaire déterminée expérimentalement et la valeur

théorique dans les petites masses moléculaires.

De plus, dans la piste contenant les protéines de lysats de péricytes cultivés avec la

BSA-contrôle, nous remarquons la présence d�une faible quantité de caspase-10 activée,

comme en témoigne la détection de la grande sous-unité dans ces conditions. Cette

observation peut être expliquée par un faible taux basal d�apoptose dans les péricytes cultivés

avec la BSA-contrôle (2,9 ± 0,34%) (Chapitre I).

156

Figure 41: Immunodétection de la caspase-10 bovine dans les péricytes traités ou non par les AGE-MGX. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (piste 3) ou son contrôle (piste 2). Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases (voir Matériel et Méthodes). Les standards de masse moléculaire (MM) (1 µl) (piste 1), les protéines de lysats cellulaires (20 µg) (piste 2 et 3) et la caspase-10/a humaine recombinante (1 µg) (piste 4) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférées sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). La caspase-10 bovine a été détectée à l�aide d�un anticorps polyclonal de lapin anti-caspase-10 humaine et un anticorps anti-lapin de singe couplé à la peroxydase de raifort et révélée par chimioluminescence (voir Matériel et Méthodes). Les masses moléculaires des protéines sont estimées à l�aide du mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). L�immuno-empreinte présentée ici est représentative de 7 expériences indépendantes.

Figure 42: Quantification densitométrique après immunodétection de la caspase-10 bovine dans les péricytes rétiniens soumis aux AGE-MGX Les bandes p64 et p27, détectées par immunoempreinte dans les pistes BSA-contrôle et AGE-MGX, ont été quantifiées par une analyse densitométrique (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en pourcentage de variation de BSA-contrôle, sont la moyenne ± SD de 7 expériences indépendantes, * p<0,05.

0

4 0

8 0

12 0

16 0

20 0

B S A -con trô le A G E -M G X

% d

e BS

A-co

ntôl

e

P ré cu rseu r (p6 4 )*

*

G ra nde sou s-u n ité (p2 7 )

1 2 3 4

MM BSA-contrô

le

AGE-MGX

casp-10

37

25

50

75100

15

p64

p27

p17

kDa

157

3-Immunodétection de la caspase-2

Le peptide z-VDVAD-fmk a altéré l�apoptose et la formation des DAG et des

céramides induites par les AGE-MGX, suggérant l�implication de la caspase-2 dans la voie

de signalisation menant à l�apoptose des péricytes. Nous avons alors examiné par

immunodétection si cette caspase est présente et activée par clivage dans les péricytes soumis

aux AGE-MGX. L�épitope de l�anticorps utilisé est dirigé contre un «segment peptidique du

coté C-terminal», reconnaissant probablement la petite sous-unité. Nous avons déposé la

caspase-2L humaine recombinante comme contrôle, commercialisée sous sa forme active et

donc clivée. D�autre part, nous avons utilisé le peptide bloquant de l�anticorps afin de

vérifier si la reconnaissance de l�anticorps était spécifique (Figure 43).

Le zymogène de la caspase-2L, isoforme longue impliquée dans l�apoptose, est une

protéine de masse 47 kDa. Li H. et al. (1997) ont proposé un mécanisme d�activation de la

caspase-2L. Le clivage protéolytique de cette caspase s�opère en deux étapes successives:

dans un premier temps un fragment court (14 kD) contenant la petite sous-unité et un

fragment long (33 kDa) contenant le prodomaine et la grande sous-unité sont libérés. Un

clivage secondaire libère la grande sous-unité (18 kDa) à partir du grand fragment (33 kDa).

Un autre clivage secondaire se produit aussi sur le petit fragment de 14 kDa pour libérer la

petite sous-unité (12 kDa) (Figure 44-B, discussion).

La révélation de la caspase 2L humaine (piste 4) met en évidence la présence

majoritaire des deux peptides contenant la petite sous-unité (p12 et p14), alors que la grande

sous-unité (p18) n�est pas détectée (Figure 43). L�anticorps anti-caspase-2L employé est bien

dirigé contre la petite sous-unité. Des fragments de tailles intermédiaires (de p25 à p35) sont

également repérés dans la piste 5. Li H. et al. (1997) ont décrit que le fragment de 33 kDa

contient le prodomaine (p15) et la grande sous-unité (p18), mais l�anticorps employé ici ne

reconnaît que la petite sous-unité. Ces fragments intermédiaires contiendraient donc la petite

sous-unité de la caspase-2 et seraient donc différents de ceux décrits par Li H. et al. (1997)

(Figure 44-B, discussion). La reconnaissance de ces différentes protéines par l�anticorps

n�est que partiellement abolie en présence du peptide bloquant (piste 5), notamment pour les

peptides p12 et p14, suggérant une efficacité modérée du peptide à bloquer la reconnaissance

antigénique de cet anticorps.

158

Figure 43: Immunodétection de la caspase-2L bovine dans les péricytes traités ou non par les AGE-MGX. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou son contrôle). Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases (voir Matériel et Méthodes). Les standards de masse moléculaire (MM) (1 µl) (piste 1), les protéines de lysats cellulaires (20 µg) (pistes 2, 3, 6, 7) et la caspase-2L recombinante humaine (1 µg) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). Les protéines ont été détectées à l�aide d�un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-caspase-2L humaine, préincubé ou non avec le peptide bloquant (5 fois plus que l'anticorps w/w), et un anticorps secondaire anti-lapin de singe couplé à la peroxydase de raifort puis révélées par chimioluminescence (voir Matériel et Méthodes). Les masses moléculaires des protéines sont estimées à l�aide du mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). L�immunoempreinte est représentative de 2 expériences indépendantes.

Dans les échantillons protéiques de péricytes (pistes 2 et 3) (Figure 44), une bande de

masse moléculaire apparente inférieure à 50 kDa est détectée, de plus faible intensité dans la

piste AGE (piste 3) en comparaison à la piste BSA (piste 2). Il pourrait s�agir du précurseur

de la caspase-2L (47 kDa), clivé dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Deux bandes, de

plus forte intensité dans la piste AGE (piste 3), sont également visualisées: l�une de masse

moléculaire apparente d�environ 30 kDa (p32 ?), la seconde inférieure à 15 kDa (p14 ?). Le

précurseur subirait donc un clivage entre le prodomaine et la grande sous-unité entraînant la

libération d�un fragment intermédiaire (contenant la grande p18 et la petite sous-unité p14).

Mais il pourrait également subir un clivage entre les deux sous-unités libérant le peptide p14

(contenant la petite sous-unité p12). Cependant, l�utilisation du peptide bloquant pour

p47

p14p12

MM BSA-cont

rôle

BSA-cont

rôle

AGE-MGX

AGE-MGX

Casp-

2Cas

p-2

- - +- +- + Peptide bloquant

fragmentsintermédiaires

5037

25

75100

15

kDa

1 2 3 4 5 6 7

159

l�anticorps anti-caspase-2L n�a pas aboli la détection de ces trois protéines (de 47, 32 et 14

kDa) (pistes 6 et 7), ne permettant pas de mettre en évidence la spécificité de la

reconnaissance antigénique. Les paramètres expérimentaux de l�immunodétection de la

caspase-2L pourraient probablement être améliorés (choix de l�anticorps, signal non

spécifique).

III-DISCUSSION

A partir des travaux précédents décrits dans cette thèse (chapitre II), portant sur

l�identification de la voie de production des DAG et des céramides, nous avons montré que

les AGE-MGX induisent l�apoptose des péricytes par deux voies métaboliques, l�une

dépendante de la formation de DAG et de céramides, la seconde indépendante de la

production de ces deux médiateurs lipidiques. La deuxième partie du travail a consisté à

définir si l�apoptose des péricytes dépend de l�activation de caspases initiatrices et/ou

effectrices, et plus particulièrement à identifier la (ou les) caspase(s) impliquées en amont

des DAG et des céramides. Nous avons d�abord étudié les effets de différents inhibiteurs

peptidiques (50 µM) sur l�apoptose et la production des DAG et des céramides dans les

péricytes. En raison du manque de spécificité ou d�une spécificité parfois discutée de certains

inhibiteurs (comme le peptide z-AEVD-fmk) mais également par le choix de ne tester qu�une

concentration, nous avons tenté de confirmer les résultats par la mise en évidence directe des

caspases initiatrices par immunodétection après électrophorèse sur gel.

L'effet protecteur du peptide z-VAD-fmk (inhibiteur non spécifique de caspases) sur

l'apoptose des péricytes met en évidence l'activation de caspases initiatrices et/ou effectrices

dans la voie de transduction des signaux apoptotiques. L�inhibition complète de la production

de DAG et de céramides dans les péricytes cultivés avec ce peptide suggère l'implication

d'une caspase initiatrice (caspase-2, 8, et/ou 10) située en amont de la génération des DAG et

des céramides.

Nous nous sommes d�abord intéressés à la caspase-8 initiatrice. L�incubation des

péricytes avec son inhibiteur spécifique z-IETD-fmk n�a pas affecté l'apoptose induite par les

AGE-MGX. Ceci suggère que la caspase-8 n�est pas impliquée dans l'apoptose des péricytes.

L�immunoempreinte de la caspase-8 semble soutenir cette conclusion. L�utilisation du

peptide bloquant de l�anticorps anti-caspase-8 a permis de mettre en évidence que la seule

protéine détectée (45 kDa) dans les péricytes soumis ou non aux AGE-MGX n�est pas

160

reconnue de façon spécifique par l�anticorps. Le fait que cette protéine soit la seule détectée et

de façon non spécifique suggère que la caspase-8 est absente des péricytes rétiniens. Il faut

néanmoins considérer que l�anticorps, dirigé contre la caspase-8 humaine (de souris ou de

rat), est utilisé ici pour la recherche d�un antigène d�origine bovine. L�hypothèse existe que

cette caspase soit présente dans les péricytes mais non reconnue. Cependant, les résultats

obtenus avec z-IETD-fmk suggèrent fortement que la caspase-8, si elle était présente, n�est

pas activée.

Nous avons ensuite examiné l�implication d�une autre caspase initiatrice, la caspase-10,

dans l�apoptose des péricytes. L�effet protecteur du peptide z-AEVD-fmk sur l'apoptose,

décrit comme un inhibiteur de la caspase-10, suggère l'activation de la caspase-10 au cours

du processus apoptotique. Cette hypothèse est soutenue par les résultats obtenus avec les

expériences d�immunodétection de cette caspase. Bien que nous ne disposions pas de peptide

bloquant de l�anticorps anti-caspase-10 pour vérifier la spécificité de la reconnaissance

antigénique, les bandes détectées semblent bien correspondre au précurseur (p64) et à la

grande sous-unité (p27) de la caspase-10. Dans les péricytes apoptotiques traités avec les

AGE-MGX, la procaspase-10 est clivée (l�intensité de la bande p64 diminue) libérant la

grande sous-unité (l�intensité de la bande p27 augmente). Le profil observé correspond bien

à ce qui est attendu lors d�un clivage protéolytique d�une caspase dans des cellules

apoptotiques. Les différents résultats, obtenus au cours de ce travail, suggèrent donc bien la

présence de la caspase-10 et son activation dans les péricytes soumis aux AGE-MGX.

L�apoptose des péricytes rétiniens dépendrait ainsi de l�activation de la caspase-10 et non de

la caspase-8, comme cela a été montré dans d�autres types cellulaires, dépourvus en caspase-

8 (Kischkel et al., 2001).

Les masses moléculaires du précurseur (p64) et de la grande sous-unité (p27), définies

ici, sont supérieures à celles décrites pour les isoformes humaines, la caspase-10/a (p53 et

p17) (Fernandes-Alnemry et al., 1996), la caspase-10/b (p59 et p23) (Vincenz et al., 1997) et

la caspase-10/d (p59 et p23) (Ng et al., 1999). Cette différence de masse moléculaire pourrait

être d�ordre expérimental et liée à une erreur d�estimation de la masse moléculaire.

Néanmoins, l�estimation de la masse de la grande sous-unité de la caspase-10/a humaine

recombinante (p17) à partir de la migration des standards de masses moléculaires à donné 18

kDa, une valeur proche de la masse théorique de cette sous-unité. La caspase-10 bovine

pourrait donc être plus longue que les caspases-10 humaines. Elle possèderait un fragment

peptidique supplémentaire localisé dans la grande sous-unité, puisque la différence de masse

est observée à la fois sur le précurseur et la grande sous-unité. L�anticorps polyclonal utilisé

161

ici est dirigé contre une séquence peptidique de 150 résidus aminés, localisée sur les grandes

sous-unités des isoformes longues des caspase10/b et 10/d humaines, suggérant que la

caspase-10 détectée dans nos péricytes rétiniens de b�uf est un variant de quelques kilo-

Daltons.

L�inhibition de l�apoptose des péricytes par z-AEVD-fmk est associée à un blocage

complet de la formation des DAG et des céramides. L�activation de la caspase-10 serait donc

située en amont de la production de ces deux composés lipidiques. D�ailleurs, l�activation de

la PC-PLC couplée à l�A-SMase, dépendante d�une caspase initiatrice, a été décrite dans des

lymphocytes T traités avec FasL (Genestier et al., 1998). L�activation constitutive,

dépendante de caspases, de protéines impliquées dans la transduction du signal apoptotique a

déjà été décrite. Par exemple, le clivage protéolytique de protéines kinases, comme la PKCδ

(Emoto et al., 1995) ou d�une phospholipase, la PLA2 (Wissing et al., 1997) par la caspase-3

produit des formes tronquées constitutivement actives. On pourrait proposer l�hypothèse que,

dans les péricytes soumis aux AGE-MGX, une autre phospholipase comme la PC-PLC soit

activée de façon similaire par la caspase-10.

Les travaux de Garcia-Calvo et al (1998) ont montré que le peptide z-AEVD-fmk peut

également inhiber l�activité enzymatique des caspases-8 et 9. Nous venons de montrer que la

caspase-8 est probablement absente des péricytes rétiniens et n�est pas impliquée dans la

transduction du message menant à l�apoptose. En revanche, nous ne pouvons pas exclure un

effet inhibiteur de z-AEVD-fmk sur la caspase-9 (activée dans les péricytes apoptotiques, cf

ci-dessous). Ainsi, l�inhibition de la formation des DAG et des céramides observée dans les

péricytes incubés avec z-AEVD-fmk suggère que cet effet résulte bien de l�inhibition de la

caspase-10 initiatrice. En revanche, l�inhibition complète de l�apoptose observée avec z-

AEVD-fmk pourrait résulter de l�inhibition simultanée des deux caspases (Figure 45).

Le peptide z-VDVAD-fmk induit une inhibition partielle de l�apoptose induite par les

AGE-MGX, associée à une réduction de la production des DAG et des céramides, suggérant

l�implication de la caspase-2L dans la transduction du signal apoptotique. Nous avons tenté

de confirmer ces données par des expériences d�immunodétection de la caspase-2L. Bien que

le peptide bloquant utilisé n�ait pas éteint le signal observé avec l�étalon de la caspase-2L, les

immunodétections semblent suggérer la présence de la caspase-2L dans les péricytes et son

activation par un clivage protéolytique lorsque les cellules sont traitées avec les AGE-MGX.

Nous avons observé une baisse de la quantité de la protéine de 47 kDa (probablement le

précurseur) au profit de deux intermédiaires, un peptide long (probablement constitué de la

162

grande p18 et de la petite sous-unité p14) et un peptide court (p14 contenant la petite sous-

unité p12). La formation des ces deux fragments résulterait de clivages du précurseur en deux

sites distincts: un clivage entre le prodomaine et la grande sous-unité entraînant la libération

du peptide long p32 (Figure 44-A, étape 1-), un second clivage entre les deux sous-unités

libérant le peptide p14 (Figure 44-A, étape 1-). Ce résultat suggère que, dans les péricytes

rétiniens soumis aux AGE-MGX, la procaspase-2L puisse être activée selon un clivage

séquentiel. Cependant, les peptides détectés par immunodétection correspondent à une forme

inactive de la caspase-2L. Un second clivage des deux peptides intermédiaires visualisés (p32

et p14) serait en effet nécessaire pour libérer la grande et la petite sous-unité (p18 et p12) et

mener à la forme active de la caspase-2L (Figure 45-A, étape 2-). De plus, le mécanisme

d�activation de la caspase-2L proposé dans les péricytes diffère de celui préalablement

identifié (Figure 44-B) (Li H. et al., 1997). De part les effets modérés de z-VDVAD-fmk et

les données non convaincantes obtenues par les expériences d�immunodétection

(reconnaissance spécifique?, caspase active?), il est difficile de conclure si la caspase-2L est

présente et participe dans la voie de signalisation menant à l�apoptose des péricytes.

Figure 44: Clivage séquentiel de la procaspase-2L proposé A- dans les péricytes rétiniens

et B- dans les lymphocytes (Li H. et al., 1997)

La caspase-2L est présentée aujourd�hui comme une caspase aussi bien initiatrice

qu�effectrice. La caspase-2L, dont le clivage protéolytique est associé à l�activation de

récepteurs de mort (Hsu et al., 1995; Duan et Dixit, 1997), peut être impliquée dans la phase

d�induction de l�apoptose. Mais sa participation dans la phase d�exécution de l�apoptose a

également été rapportée. La transactivation de la caspase-2L par des caspases effectrices a en

effet été observée (Li H. et al., 1997), processus intervenant après l�altération mitochondriale

(Haviv et al., 1998). Dans notre modèle apoptotique, si la caspase-2L était présente et activée

dans les péricytes traités aux AGE-MGX, elle interviendrait dans la phase d�induction de

p47p15 p18 p2 et p12

p32

p14+1-

2- p18 et p12

A-p15 p18 p2 et p12

p47

1- p33 et p14

2- p18 et p12

B-

163

l�apoptose des péricytes, puisqu�elle semble contrôler la formation des DAG et des

céramides. La production de ces deux médiateurs lipidiques pourrait donc être régulée par

deux caspases initiatrices. Des travaux tout récents ont montré que la caspase-2L peut

intervenir dans le processus d�activation de la caspase-8 dans des cellules traitées par le

ligand Fas. Elle optimise en effet la formation du complexe sous membranaire apoptotique

DISC (voir Etude bibliographique, chapitre Apoptose, III-3-3), en activant c-FLIP, inhibiteur

endogène de l�assemblage du DISC (Droin et al., 2001). Dans les péricytes cultivés avec les

AGE-MGX, nous pourrions éventuellement imaginer un mécanisme similaire, dans lequel la

caspase-2L contribuerait à l�activation de la caspase-10.

Le clivage des caspases initiatrices nécessite l�activation et l�oligomérisation de

récepteurs membranaires, comme le TNF-R ou Fas, et le couplage de molécules adaptatrices

(TRADD, RAIDD ou FADD) à la partie cytoplasmique des récepteurs (Hsu et al., 1995;

Kischkel et al., 2001). L�activation de la caspase-10 (et de la caspase-2?) dans les péricytes

suggère donc l'implication d'un récepteur transmembranaire dans l'induction du signal de

mort par les AGE-MGX. Les effets des AGE-MGX sur l'apoptose des péricytes rétiniens

pourraient être médiés par un des récepteurs aux AGE. En effet, ces différents récepteurs aux

AGE semblent pouvoir se comporter comme des récepteurs de mort: former un complexe

protéique transmembranaire. Le récepteur RAGE, associé à une protéine homologue de la

lactoferrine (Schmidt et al., 1992), forme un complexe dimérique. De plus, les protéines p60,

p90 et galectine-3, localisés dans les microdomaines membranaires (les cavéoles) s'associent

pour former le complexe trimérique AGE-R lors de la liaison aux AGE (Stitt et al., 2000b).

Le peptide z-LEHD-fmk, qui inhibe spécifiquement la caspase-9 et les caspases

initiatrices (2, 8 et 10) de façon moins spécifique (Thornberry et al., 2000), est capable de

protéger les péricytes de l�apoptose induite par les AGE-MGX mais sans affecter la

production des DAG et des céramides. Ces résultats suggèrent que la protection contre

l�apoptose des péricytes par le peptide z-LEHD-fmk n�est pas lié à l'inhibition d�une caspase

initiatrice puisque les niveaux des deux médiateurs lipidiques ne sont pas affectés par ce

peptide. Ceci suggère que la caspase-9 semble la seule à être inhibée par z-LEHD-fmk et

qu�elle intervient en aval des DAG et des céramides. De plus, l'effet protecteur de z-LEHD-

fmk sur l'apoptose des péricytes suggère que les deux voies de signalisation initiées par les

AGE-MGX convergent vers la caspase-9.

Le peptide z-DEVD-fmk a induit les mêmes effets que z-LEHD-fmk. Les péricytes

sont protégés complètement contre l'apoptose induite par les AGE-MGX, alors que la

164

formation des DAG et des céramides n�est pas affectée. Ceci suggère que la (ou les)

caspase(s) inhibées par z-DEVD-fmk ne sont pas des caspases initiatrices (caspases-2 et 10)

mais certainement des caspases effectrices (caspases-3, 6 et/ou 7?) de la famille de la caspase-

3, qui interviennent aussi en aval des DAG et des céramides. Les résultats obtenus avec les

peptides z-LEHD-fmk et z-DEVD-fmk suggèrent fortement que les deux voies de

signalisation convergent vers la caspase-9 et les caspases effectrices (caspase-3, 6, 7?),

caspases décrites comme étant les acteurs moléculaires de la phase d'exécution de l'apoptose.

Les caspases effectrices sont activées par un mécanisme de transactivation. Elles

peuvent être protéolysées directement par les caspases initiatrices-8, 9 et 10 (Nagata, 1997;

Srinivasula et al., 1998). Dans les péricytes, le clivage protéolytique des caspases effectrices

serait sous le contrôle unique de la caspase-9, puisque son inhibition abolit complètement

l�apoptose induite par les AGE-MGX

Le clivage de la caspase-9 requiert la formation d�un complexe multiprotéique,

l�apoptosome, dépendante de la libération mitochondriale du cytochrome c (Li P. et al.,

1997). L�activation de la caspase-9 dans les péricytes soumis aux AGE-MGX suggère donc

qu�une atteinte mitochondriale puisse se produire au cours de l�apoptose. Les voies de

signalisation activées dans les péricytes soumis aux AGE-MGX conduiraient ainsi à un

dysfonctionnement mitochondrial, associé à la MPT (transition de perméabilité

mitochondriale), entraînant la libération du cytochrome c et l�activation de la caspase-9. Cette

dernière activerait ensuite en cascade la (ou les) caspase(s) effectrice(s) de la famille de la

caspase-3 (Figure 45). Une étude toute récente, menée sur un autre type cellulaire, des

cellules mésangiales, permettrait de proposer un mécanisme par lequel les AGE-MGX

mènent à une altération mitochondriale dans les péricytes rétiniens apoptotiques. Yamagishi

et al. (2002b) ont montré que d�autres AGE (préparés avec du glucose, du glycéraldéhyde ou

du glycoaldéhyde) induisent l�apoptose des cellules mésangiales par la surexpression de Bax,

protéine qui induit la MPT et la libération de cytochrome c (Pastorino et al., 1998), la

surexpression de cette protéine serait sous le contrôle de la protéine p53 (suppresseur de

tumeur). Dans la rétinopathie diabétique, l'altération de la mitochondrie dans les péricytes

apoptotiques a d'ailleurs été suggérée par les travaux de Podesta et al. (2000). Ces auteurs ont

montré la surexpression de Bax dans les péricytes apoptotiques de rétines, prélevées post-

mortem chez des patients diabétiques.

Les céramides ont été décrits comme un des nombreux facteurs capables d�induire la

MPT (Dbaibo et al., 1997). La propagation d�un signal de mort par les céramides met en jeu

des phosphatases et des kinases pouvant permettent de réguler, entres autres, les niveaux de

phosphorylation des protéines de la famille des Bcl-2, qui sont les principaux régulateurs de

165

l�apoptose. Les céramides peuvent ainsi potentialiser la fonction pro-apoptotique de la

protéine Bax (Zundel et al., 1998) et abolir en même temps l�effet anti-apoptotique de Bcl-2

(Ruvolo et al., 1999). Les céramides générés dans les péricytes par les AGE-MGX pourraient

altérer la perméabilité de la membrane mitochondriale par ce mécanisme. Mais les céramides

pourraient être produits directement dans la mitochondrie. Une étude récente montre que les

céramides formés dans la membrane mitochondriale sont capables d�induire directement la

libération de cytochrome c et que ceci mène à l�apoptose (Birbes et al., 2001).

Au cours de cette étude, nous avons montré que l�apoptose des péricytes induite par les

AGE-MGX est gouvernée par l�activation de différentes caspases. Nous avons pu définir les

caspases initiatrices impliquées. Alors que la caspase-8 ne semble pas être présente dans les

péricytes rétiniens de b�uf, la caspase-10 (et la caspase-2?) participe(nt) à la transduction du

message apoptotique en générant les DAG et les céramides. Les deux voies de signalisation

activées par les AGE-MGX semblent induire une altération de la perméabilité de la

membrane mitochondriale, caractérisée par l'activation de la caspase-9. Cette dernière

activerait alors en cascade les caspases effectrices, impliquées dans la phase d'exécution de

l'apoptose (Figure 45).

166

Figure 45: Hypothèse de la voie de signalisation menant à l�apoptose des péricytes induite

par les AGE-MGX

AGE-MGX (/récepteur aux AGE?)

PC DAG

PC-PLC

SM Céramides

A-SMase

Caspase(s) initiatrice(s)caspase-10 (et 2 ?)

Mitochondrie

Caspase-9

Caspases effectrices(caspases-3, 6 et 7?)

Apoptose

?

Z-DEVD-fmk

Z-LEHD-fmk (z-AEVD-fmk ?)

Z-AEVD-fmk / z-VDVAD-fmk

167

CHAPITRE IV

INDUCTION D’UN STRESS OXYDANT DANS LES

PERICYTES RETINIENS TRAITES PAR LES AGE-

MGX

Le stress oxydant, qui est défini comme la situation du déséquilibre entre la

production de radicaux libres dérivés de l�oxygène (ROS) et leur élimination par les défenses

antioxydantes, est aujourd�hui décrit comme un médiateur de l�apoptose (pour revue, Chandra

et al., 2000). Les ROS sont très réactifs et peuvent réagir, s�ils ne sont pas rapidement

détruits, avec différentes cibles, comme les protéines, l�ADN ou les lipides. Par leur forte

teneur en acides gras polyinsaturés (AGPI) (Lecomte et al., 1996), les cellules

microvasculaires rétiniennes pourraient être particulièrement sensibles aux attaques

radicalaires et constitueraient une cible idéale pour la peroxydation lipidique. Afin de vérifier

l'implication éventuelle d'un stress oxydant dans la voie de signalisation menant à l'apoptose

par les AGE-MGX, nous avons analysé les effets de différentes classes d'antioxydants sur

celle-ci et la production des DAG et des céramides dans les péricytes. L�effet d�un

antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, a également été examiné sur le clivage protéolytique de

la caspase-10 initiatrice.

I- LES DIFFERENTES CLASSES D’ANTIOXYDANTS TESTES

Sur la base de leur structure moléculaire et de leur mode d'action, les antioxydants

testés au cours de cette étude peuvent être classés en 3 groupes.

Le premier groupe comprend des composés hydrosolubles possédant une fonction

thiol qui a la capacité de fournir un atome d�hydrogène: il s'agit de la N-acétyl-L-cystéine

(NAC) et de l'acide lipoïque. Ces deux antioxydants maintiennent un état redox du

cytoplasme de la cellule vers la forme réduite. Mais ils peuvent également piéger les radicaux

libres et protéger des attaques radicalaires.

Le deuxième type d'antioxydant testé est l'ebselen, une molécule synthétique

contenant un atome de sélénium. Ce composé présente la particularité de mimer l'activité

168

glutathion-peroxydase sélénium dépendante. Il peut réagir avec les peroxydes organiques et

les détoxifier, protégeant les membranes des atteintes de la peroxydation lipidique.

Le 3ème groupe est constitué de composés liposolubles riches en doubles liaisons

conjuguées qui présentent une haute réactivité vis-à-vis des radicaux libres de l�oxygène. Ces

agents possèdent un effet protecteur ciblé contre la peroxydation lipidique des membranes. Il

s'agit de la zéaxanthine, un caroténoïde, et de la c�lentéramine, un substrat de la luciférase

chez les c�lentérés.

II-EFFETS DE LA N-ACETYL-L-CYSTEINE (NAC)

Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages (environ 15 jours) en présence de 3

µM d�AGE-MGX (ou de la BSA-contrôle) et de différentes concentrations de NAC : 10 µM,

50 µM, 500 µM ou 5 mM.

L�incubation des péricytes avec 10 µM ou 50 µM de NAC protégent les cellules de

l�apoptose induite par les AGE-MGX (Figure 46). Cette expérience montre que l�apoptose est

inhibée de 93 % dans les péricytes cultivés en présence de 10 µM de NAC et de 100 % dans

les cellules traitées par 50 µM de NAC.

Nous avons également quantifié les DAG et les céramides dans les péricytes cultivés

avec les AGE-MGX et la NAC. L�addition de 10 µM de NAC dans le milieu de culture a

induit une inhibition complète des DAG et des céramides produits en réponse aux AGE-MGX

(n = 4) (Figure 47). En revanche, un traitement des cellules avec 50 µM de NAC (n= 3) n�a

induit qu�une inhibition partielle des DAG (-78 %) et des céramides (-72 %) (Figure 47). Sur

trois expériences réalisées, seules deux ont montré une inhibition complète de la formation

des DAG (-98 et 99 %) et des céramides (-102 et 97 %), la troisième ayant fourni une

inhibition de 37 % des DAG et de 17 % des céramides. Mais ce dernier résultat est

probablement lié à un problème expérimental survenu au cours du dosage enzymatique par la

DAG-kinase. En effet, alors que le dosage des DAG et des céramides n�a pas permis de

mettre en évidence une inhibition des niveaux intracellulaires de ces deux lipides, l�analyse

de l�apoptose dans la même population de péricytes a montré une protection complète des

cellules contre l�apoptose par 50 µM de NAC.

Des concentrations plus élevées de NAC ont également été testées. L�addition de 500

µM de NAC dans le milieu de culture affecte le taux basal de l�apoptose dans les cellules

169

cultivées en présence de BSA-contrôle (6,1 ± 1,8 % de cellules apoptotiques en présence de

NAC 500 µM contre 3,3 ± 1,1 % dans les cellules cultivées avec la BSA-contrôle seulement,

n = 3). Nous avons aussi traité les péricytes avec 5 mM de NAC mais cette concentration

s�est avérée cytotoxique. A cette concentration, l�observation au microscope à contrast de

phase a montré que la NAC induit la mort des péricytes au bout de 48 heures.

Figure 46: Effets de la N-acétyl-L-cystéine (NAC) sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX Les péricytes ont été incubé en présence de 3 µM d�AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et de 10 µM ou 50 µM de NAC. L�apoptose des péricytes a été mesurée par un marquage à l�Annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats sont la moyenne ± SD de 5 expériences indépendantes. A- Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques B- Les résultats sont exprimés en % d�inhibition par la NAC de l�apoptose induite par les AGE-MGX : � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); * p< 0,05 (% d�inhibition).

Contrôle-BSA 2,45 ± 0,34

AGE-MGX 7,21 ± 1,05 (�)

NAC 10µM

2,24 ± 0,41

2,57 ± 0,60 (*)

2,31 ± 0,51

2,29 ± 0,75 (*)

NAC 50 µM-

A-

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Inhi

bitio

n de

l'ap

opto

se

indu

ite p

ar le

s A

GE

(%)

NAC 10 µM

NAC 50 µM

**

B-

170

Figure 47: Effet de la N-acétyl-L-cystéine (NAC) sur la production des DAG et des céramides induite par les AGE-MGX dans les péricytes. Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d'AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et 10 µM ou 50 µM de NAC. Les céramides et les DAG ont été dosés par la méthode de la DAG-kinase (voir Matériel et Méthodes). Les résultats sont la moyenne ± SD de 4 expériences indépendantes pour la NAC 10 µM et de 3 expériences indépendantes pour la NAC 50 µM. A- Les résultats sont exprimés en % de BSA-contrôle. La quantité de céramides mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 689 ± 120 ng de céramides/mg de protéines. La quantité de DAG mesurés dans les cellules contrôles (100 %) est de 607± 101 µg de DAG/mg de protéines. B- Les résultats sont exprimés en % d'inhibition de la production stimulée de céramides et de DAG. � p<0,05 (vs. BSA-contrôle); *p< 0,05 (% d�inhibition).

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Inhi

bitio

n de

s ni

veau

x st

imul

és p

ar le

s A

GE

(%)

CéramidesDAG

NAC 10 µM

NAC 50 µM

**

B-

Contrôle-BSA

AGE-MGX

NAC 10µM

105 ± 9

103 ± 8 (*)

CéramidesDAG

104 ± 13

108 ± 10 (*)

NAC 50 µM

DAG

94,4 ± 7

113 ± 42

Céramides

95 ± 4

117 ± 39

A--

100

192 ± 21 (�)

DAG Céramides

100

191 ± 22 (�)

-

100

188 ± 25

DAG Céramides

100

181 ± 24

Contrôle-BSA

AGE-MGX

171

III- EFFETS DES AUTRES ANTIOXYDANTS SUR L’APOPTOSE DES

PERICYTES INDUITE PAR LES AGE-MGX

L�effet protecteur de la N-acétyl-L-cystéine sur la disparition des péricytes en réponse

aux AGE-MGX a été reproduit en testant d�autres antioxydants.

L�ajout dans le milieu de culture d�acide lipoïque aux concentrations de 7 et 14 µM

inhibe l�apoptose des péricytes respectivement de 88 % et 78 % (n = 3). De même,

l�incubation des péricytes avec l�ebselen (5 et 10 µM) a permis de réduire respectivement de

95 et 90 % (n = 3) l�apoptose dans les péricytes cultivés avec les AGE-MGX (Figure 48). Des

concentrations plus élevées d�acide lipoïque (21 µM) et d�ebselen (20 µM) ont également été

testées mais ont montré un effet pro-apoptotique. Dans ces conditions, le taux basal

d�apoptose est en effet de 4,9 ± 1,4% et 5,4 ± 1,5 % respectivement contre 1,9 ± 0,5 % et 2,4

± 0,3 % dans les cellules cultivées avec la BSA-contrôle.

Enfin, l�utilisation d�autres antioxydants liposolubles, la zéaxanthine (2 µM) et la

c�lentéramine (2 µM), a permis d�inhiber l�apoptose des péricytes de 60 % (n = 3) et de 50

% (n = 2) respectivement (Figure 48). L�effet partiel de ces deux antioxydants peut être

expliqué par leur faible solubilité. Nous n�avons pas pu les tester à une concentration plus

élevée, parce que solubilisés à saturation dans la solution stock. En effet, l�utilisation de

volumes plus importants de véhicule (le DMSO) a induit un effet protecteur contre l�apoptose

des péricytes.

172

Figure 48: Effets des antioxydants sur l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Les péricytes ont été incubé en présence de 3 µM d�AGE-MGX (ou BSA-contrôle) et d�acide lipoïque (7 µM ou 14 µM), d�ebselen (5 µM ou 10 µM), de zéaxanthine (2 µM) et de c�lentéramine (2 µM). L�apoptose des péricytes a été mesurée par un marquage à l�Annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes pour l�acide lipoïque, l�ebselen et la zéaxanthine et de deux expériences indépendantes pour la c�lentéramine. A- Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques. B- Les résultats représentent le % d�inhibition, par les différents antioxydants, de l�apoptose induite par les AGE-MGX.

IV- TRAITEMENT DES AGE-MGX PAR DES CHELATEURS DE

METAUX ET LEUR EFFET SUR L’APOPTOSE DES PERICYTES

RETINIENS

Les protéines glyquées acquièrent une affinité pour les ions de métaux de transition,

notamment le fer et le cuivre. Ces complexes «ions-protéine glyquée», également nommés

«glycochélates», sont pourvus d�une activité oxydante (Qian et al., 1998). D�autre part, une

étude récente suggère que les ions métalliques, naturellement présents à l�état de trace dans

les tampons phosphate utilisés pour la préparation des AGE, jouent un rôle dans les effets

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Inhi

bitio

n de

l'ap

opto

se in

duite

par

les

AG

E (%

)

Acide lipoïque7 µM 14 µM

Ebselen5 µM 10 µM

Zéa2 µM 2 µM

CœlB-

Zeaxanthine

- 2 µM

2,25 ± 0,52

9,05 ± 0,98

2,42 ± 0,21

5,08 ± 0,73

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

Coelentéramine

- 2 µM

2,2

8,86

2,24

5,43

BSA-contrôle :

AGE-MGX:

Ebselen

2,12 ± 0,50

7,43 ± 0,96

2,11 ± 0,41

2,75 ± 0,88

1,86 ± 0,41

2,98 ± 0,61

Acide lipoïque

- 7 µM 14 µM

2,32 ± 0,30

7,11 ± 0,78

2,32 ± 0,25

2,54 ± 0,49

2,09 ± 0,17

2,53 ± 0,42

- 5 µM 10 µM

A-

173

observés avec les AGEs et ceci indépendamment de la protéine AGE. Les ions métalliques

liés aux AGE sont capables d�induire un stress oxydant intracellulaire dans des systèmes de

culture sans sérum (Hui et al., 2001). Les AGE-MGX utilisés au cours de notre travail ont été

préparés dans un tampon phosphate. Ils étaient donc susceptibles d'être contaminés par des

ions métalliques. L�effet protecteur des différents antioxydants sur l�apoptose des péricytes

induite par les AGE-MGX suggère l�induction d�un stress oxydant au cours du processus

apoptotique. Nous avons alors examiné si ce stress oxydant résultait de la présence d�ions

métalliques liés aux AGE-MGX. Nous avons analysé l�effet d�AGE-MGX (et de BSA-

contrôle), traités au préalable avec des chélateurs d�ions divalents, sur l'apoptose des péricytes

et l�avons comparé à celui observé avec les AGE-MGX non traités par les chélateurs.

Nous avons testé le DTPA, un chélateur puissant des ions métalliques tels que le Fe3+

(Ka de 1028) et le Cu2+ (Ka de 1021.4), et une résine échangeuse d�ions très affine pour les ions

métalliques et utilisée pour purifier des effluents contaminés par les métaux. Ainsi, les

préparations d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) ont été incubées avec du DTPA (0,5 mM)

ou de la résine chelex-100 (4 mg/ml). La présence d'ions métalliques dans les différentes

préparations a été détectée en évaluant la perte de l�acide ascorbique par oxydation, processus

catalysé par les ions métalliques et donc indicateur de leur présence. Après 30 min d'essai, les

AGE-MGX non-traités avec les chélateurs de métaux induisent une oxydation de 6,2%

d�acide ascorbique contre 3,6 % par la BSA-contrôle. En revanche, après un traitement avec

le DTPA ou la résine chelex-100, les AGE-MGX (et la BSA-contrôle) n�induisent qu�une

oxydation mineure de l�acide ascorbique d�environ 0,5 %, comparable à celle observée dans

la solution d'acide ascorbique incubé pour le même temps (0,6%) (Figure 49).

Nous avons ensuite analysé les effets des différentes préparations d'AGE-MGX sur

l�apoptose des péricytes. Les cellules ont été cultivées pendant 15 jours avec les AGE-MGX

(ou les BSA-contrôle) à la concentration de 3 µM. L�augmentation de l�apoptose d�un facteur

3 dans les péricytes incubés avec les AGE-MGX non-traités est reproduite aussi bien avec les

AGE-MGX traités avec le DTPA que ceux traités avec la résine chelex-100 (Figure 50).

174

Figure 49: Oxydation de l�acide ascorbique par les AGE-MGX traités ou non par les chélateurs de métaux. Les AGE-MGX (et leur contrôle) ont été traités ou non avec du DTPA (0,5 mM) ou de la résine chelex-100 (4 mg/ml) pendant 24 heures à 4°C. Les protéines ont été déposées sur membrane de PVDF (300 µg/cm2) puis incubées dans un tampon phosphate contenant 100 µM d�acide ascorbique et 1 mM d'EDTA (voir Matériel et Méthodes). L'oxydation de l'acide ascorbique est suivie pendant 30 min en dosant l'acide ascorbique résiduel par spectrophotométrie (266 nm).

Figure 50: Effets des AGE-MGX traités ou non avec des chélateurs de métaux sur l�apoptose des péricytes. Les cellules ont été cultivées pendant 15 jours en présence de 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-contrôle) non-traités avec les chélateurs (non-traités) ou traités soit par le DTPA (0,5 mM) (+DTPA) soit par la résine chelex-100 (4 mg/ml) (+ chelex). L�apoptose a été détectée et mesurée par un marquage à l�annexine V (voir Matériel et Méthodes). Les résultats, exprimés en % de cellules apoptotiques, sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes.

0

2

4

6

8

10

12

+ DTPA + Chelex-100

cellu

les

apop

totiq

ues

(%) AGE-BSA

BSA-contrôle

non-traités

01234567

Temps (min)

Oxy

datio

n de

l'ac

ide

asco

rbiq

ue (%

)

BSA-contrôle

AGE-MGX

BSA + DTPA 0,5 mMAGE + DTPA 0,5 mMBSA + chelex-100

AGE + chelex-100

0 20 4010 30acide ascorbique

( )

175

V- IMMUNODETECTION DE LA CASPASE-10 DANS LES PERICYTES

CULTIVES AVEC LES AGE-MGX ET LA NAC (10 µM)

Les résultats obtenus avec 10 µM de N-acétyl-L-cystéine (NAC) ont montré une

inhibition complète de la production des DAG et des céramides dans les péricytes soumis aux

AGE-MGX. Ceci suggère qu�un stress oxydant pourrait intervenir en amont de la formation

de ces deux composés lipidiques dans la signalisation induite par les AGE-MGX. Nos

résultats suggèrent que la caspase-10 contrôle la génération des DAG et des céramides (voir

chapitre III-1-3). Afin de définir si le stress oxydant pourrait réguler l�activation de cette

caspase, nous avons analysé les effets de la NAC (10 µM) sur le clivage protéolytique de la

caspase-10, observée dans les péricytes soumis aux AGE-MGX (voir chapitre III-2-2). Les

cellules ont été cultivées pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou de BSA-

contrôle) et 10 µM de NAC. Au terme de la culture, les protéines contenues dans les lysats

cellulaires ont été séparées par électrophorèse, transférés sur membrane de nitrocellulose, puis

la caspase-10 a été détectée au moyen de son anticorps spécifique.

La figure 51 montre que le clivage de la caspase-10, observé dans les péricytes incubés

avec les AGE-MGX (piste 3) n�est pas aboli en présence de la NAC (piste 5). Ce résultat a été

reproduit lors de deux expériences supplémentaires. Les intensités des bandes du précurseur

(p64) et de la sous-unité large (p27) dans les pistes BSA et AGE, avec ou sans NAC (10 µM),

ont été déterminées par densitométrie pour chaque condition et exprimées en % relatif de

BSA-contrôle (Figure 52). Les intensités des bandes p27 (161 ± 17%) et p64 (43 ± 18%) dans

les péricytes cultivés avec les AGE-MGX seuls sont retrouvées lorsque la NAC est ajoutée

(p64: 163 ± 7%; p27: 40 ± 18%).

176

Figure 51: Immunodétection de la caspase-10 des péricytes cultivés avec les AGE-MGx et la N-acétyl-L-cystéine (NAC) Les péricytes ont été cultivés pendant deux passages avec 3 µM d�AGE-MGX (ou son contrôle) et 10 µM de NAC. Les cellules ont été lysées dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de protéases (voir Matériel et Méthodes). Les standards de masse moléculaire (MM) (1 µl) (piste 1) et les protéines de lysats de péricytes (20 µg) (pistes 2, 3, 4, 5) ont été séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide de 12% et transférées sur une membrane de nitrocellulose (voir Matériel et Méthodes). La caspase-10 bovine a été détectée à l�aide d�un anticorps polyclonal de lapin anti-caspase-10 humaine et un anticorps anti-lapin de chèvre couplé à la peroxydase de raifort et révélée par chimioluminescence comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les masses moléculaires des protéines sont estimées à l�aide du mélange de protéines de masse moléculaire connue (MM). L�immuno-empreinte présentée ici est représentative de 3 expériences indépendantes.

Figure 52: Analyse densitométrique de l�effet de la NAC sur le clivage protéolytique de la caspase-10 bovine Les bandes p64 et p27, détectées par immunoempreinte dans les pistes BSA-contrôle et AGE-MGX en présence ou non de NAC à 10 µM, ont été quantifiées par une analyse densitométrique (voir Matériel et Méthodes). Les résultats représentent l�intensité des bandes p64 et p27, exprimée en pourcentage de variation de BSA-contrôle, et sont la moyenne ± SED de 3 expériences indépendantes.

37

25

5075

100250150

15

p64

1 2 3 4

BSA-contrô

le

AGE-MGX

AGE-MGX

MM BSA-contrô

le

NAC 10 µM- - + +

p27kD

a

5

Précurseur p64

Grande sous-unité p27

% d

e B

SA-c

ontr

ôle

0306090

120150180210

BSA-contrôle AGE-MGX BSA-contrôle AGE-MGX

NAC 10 µM

177

VI- DISCUSSION

Un grand nombre de travaux ont permis de mettre en évidence l�implication du stress

oxydant dans le processus apoptotique, généré par différents stimuli. Des travaux antérieurs

au sein de l'équipe ont démontré une atteinte des capacités antioxydantes des péricytes

rétiniens de b�uf en réponse aux AGE-Glucose, comme une augmentation des activités de la

catalase et de la superoxyde dismutase (Paget et al., 1998). Nous avons donc examiné un rôle

éventuel du stress oxydant dans la voie de signalisation induite par les AGE-MGX menant à

l�apoptose des péricytes.

Tous les antioxydants testés ont induit une protection des péricytes contre l�apoptose

induite par les AGE-MGX, suggérant fortement une production intracellulaire de radicaux

libres ou un changement du statut redox au cours du processus apoptotique. Nos résultats sont

soutenus par des travaux récents qui montrent que le traitement de péricytes rétiniens en

culture avec des antioxydants protègent partiellement de l�apoptose induite par l�albumine

glyquée à forte concentration (5 mg/ml) (Kim et al., 2002).

Le rôle critique du stress oxydant dans la disparition par apoptose des péricytes a été

souligné par d�autres travaux in vivo. L�altération de l�expression des enzymes antioxydantes

(la GPX, la catalase et la SOD) a été mise en évidence dans des péricytes rétiniens

apoptotiques, prélevés post-mortem sur des patients diabétiques de longue durée (Li W. et al.,

1999). L�administration d�antioxydants, comme la vitamine E associée à la vitamine C

(Yatoh et al., 2000) à des rats diabétiques a permis par ailleurs de réduire le nombre de

cellules microvasculaires rétiniennes apoptotiques.

Des études récentes ont montré que les ions métalliques sont capables de lier les

protéines glyquées. Ces protéines modifiées acquièrent une affinité de liaison pour les ions

métalliques, comme le Fe3+ ou le Cu2+ (Qian et al., 1998), suite à la formation de certaines

structures avancées de glycation (AGE), comme la (carboxyméthyl)lysine qui présente des

propriétés de chélation (Saxena et al., 1999). Les ions métalliques, chélatés par les AGE,

conservent leur capacité à catalyser des réactions redox (Qian et al., 1998; Saxena et al.,

1999). Une étude récente a révélé que les ions métalliques présents à l'état de trace dans les

tampons phosphates contaminent les AGE-BSA (préparés avec du glucose comme agent

glycant) et sont capables d'induire un stress oxydant intracellulaire dans des cultures

cellulaires sans sérum (Hui et al., 2001).

178

Dans notre étude, des ions métalliques liés aux AGE-MGX pouvaient participer à

l'induction du stress oxydant mis en évidence dans les péricytes apoptotiques. Afin d'exclure

une telle possibilité, nous avons examiné les effets apoptotiques d'AGE-MGX traités avec des

chélateurs de métaux. Les AGE-MGX non-traités avec des chélateurs présentent bien une

activité oxydante supérieure à celle de la BSA-contrôle. Les AGE-MGX, que nous avons

utilisés tout au long de ce travail, semblent comporter des structures capables de chélater les

ions métalliques formant ainsi des "glycochélates" actifs dans les réactions redox. Toutefois,

les AGE-MGX, traités avec les chélateurs et que nous avons montré être dépourvus en

activité oxydante, sont également capables d�induire l�apoptose des péricytes. L�apoptose des

péricytes ainsi que le stress oxydant qui en résulte, ne semblent donc pas liés à la présence

d�ions métalliques liés aux AGE-MGX. Le fait que l'apoptose des péricytes induite par les

AGE-MGX soit identique avec ou sans traitement par des chélateurs pourrait s'expliquer par

l'utilisation de 10% de SVF. L�étude de Hui et al (2001) a montré que les effets délétères des

ions métalliques contaminant les AGE ne sont observés que pour des systèmes cellulaires

dépourvus en sérum. Ce résultat pourrait s�expliquer par le fait que l�apport exogène de

protéines permettrait la chélation des ions métalliques contenus sur les AGE et neutraliserait

leurs effets oxydants. Dans notre étude, les effets apoptotiques des AGE-MGX sont observés

dans les péricytes cultivés avec 10% de sérum de veau f�tal, concentration montrée comme

suffisante pour abolir l�induction d�un stress oxydant intracellulaire par les ions métalliques

liés aux AGE (Hui et al., 2001). Nos résultats suggèrent ainsi un effet spécifique des AGE-

MGX, et pas des ions métalliques chélatés par ceux-ci, dans l�induction du stress oxydant

intracellulaire menant à l�apoptose des péricytes, après liaison à un récepteur par exemple.

En effet, les AGE peuvent interagir avec différents récepteurs aux AGE, comme p60,

p90 (Li Y.M. et al., 1996) ou RAGE (Yan et al., 1994) et induire des réponses cellulaires

variées. Bien que la cascade exacte des événements intracellulaires mis en jeu lors de la

liaison AGE/récepteur reste mal définie, il a été montré que la fixation d�un AGE à RAGE

diminuait les quantités d�antioxydants non enzymatiques (Bierhaus et al., 1997) ou induisait

la production intracellulaire de ROS (Yan et al., 1994), comme probablement l�anion

superoxyde produit par l�activation d�une NAD(P)H oxydase (Wautier et al., 2001). Au cours

de ce travail, nous avons montré la présence de RAGE dans nos péricytes rétiniens bovins en

culture (voir chapitre I-3). Les AGE-MGX, après liaison à RAGE (Westwood et al., 1994),

pourraient ainsi induire la formation de ROS par l�activation d�une NAD(P)H oxydase

intracellulaire produisant l�anion superoxyde, alors dismuté en peroxyde d�hydrogène (H2O2),

menant à l�apoptose des péricytes.

179

La détermination du profil antioxydant des péricytes rétiniens de b�uf a montré une

activité faible en glutathion peroxydase dépendante du sélénium (Se-GPX) (Paget et al.,

1998). Cet enzyme réduit une variété d'hydroperoxydes chimiquement différents allant du

peroxyde d�hydrogène aux peroxydes lipidiques. Les péricytes rétiniens, dépourvus en cet

enzyme, pourraient être plus particulièrement sensibles aux dommages cellulaires causés par

des hydroperoxydes. La réponse apoptotique des péricytes aux AGE-MGX pourrait ainsi

intégrer la formation de peroxydes lipidiques formés dans les membranes (mitochondriales)

et/ou de peroxyde d'hydrogène cytosolique (H2O2). Des travaux menés au sein de l'équipe ont

montré la formation de H2O2 par la méthode de la dichlorofluorescéine dans les péricytes

traités par les AGE-MGX. Ces différentes considérations soutiendraient l'hypothèse formulée

précédemment, postulant l'activation d'une NAD(P)H oxydase conduisant à la formation

d�anion superoxyde puis de H2O2 dans les péricytes apoptotiques.

L�effet protecteur de la NAC (10 µM) est associé à une inhibition complète de

l�accumulation des deux médiateurs lipidiques, suggérant que le stress oxydant intervienne en

amont des enzymes PC-PLC et A-SMase. Au cours de ce travail, nous avons montré que la

génération des DAG et des céramides était sous le contrôle de caspases initiatrices,

notamment la caspase-10. Nous avons examiné si les ROS pouvaient induire l�activation de

cette caspase. Le clivage protéolytique de la caspase-10 n�a pas été affecté dans les péricytes

traités avec la NAC, suggérant que le statut redox ou les ROS n�induisent pas ou ne

potentialisent pas le clivage protéolytique de cette caspase. Les ROS ont d�ailleurs été décrits

comme des inhibiteurs de l�activation protéolytique et de l�activité enzymatique des caspases

(Hampton et Orrenius, 1997; Fadeel et al., 1998). Ces dernières, contenant une cystéine dans

leur site actif, requièrent la présence du groupement thiol sous forme réduite pour être actives

(Nobel et al., 1997). Les ROS produits ou les modifications du statut redox cellulaire induites

dans les péricytes soumis aux AGE-MGX interviendraient ainsi en aval de la caspase

initiatrice.

Le stress oxydant régulerait directement (ou indirectement) l�activation de la PC-PLC,

puisque la NAC bloque la génération des DAG et des céramides. La régulation redox de cet

enzyme n�a pas été rapportée à ce jour. Un effet inhibiteur direct de la NAC sur l�activité

enzymatique de la caspase-10 pourrait être écarté. Effectivement, par son pouvoir réducteur

des fonctions thiols, la NAC potentialiserait plutôt l�activité enzymatique de la caspase-10, en

maintenant la cystéine du site actif sous sa forme réduite. L�inhibition de la formation des

180

DAG et des céramides par la NAC pourrait suggérer l�existence d�un intermédiaire entre la

caspase-10 et la PC-PLC. La PC-PLC, inhibée spécifiquement par le D609, est un enzyme

dont l�activation dépend d�une PKC, stimulée expérimentalement par l�ester de phorbol TPA

(12-O-tétradécanoylphorbol-13-ester), nommé également PMA (phorbol 12-myristate 13-

acétate) (Muir et Murray, 1987; Müller-Decker, 1989). Des travaux plus récents ont montré

que les PKCα et ε peuvent être activées par des espèces radicalaires dérivées des ROS (H2O2)

(Chen et al., 1996). Enfin, Simizu et al (1998) ont mis en évidence la génération de H2O2

dépendante de l�activation de caspases de la famille de la caspase-3, probablement par

l�intermédiaire d�une NAD(P)H oxydase. Dans les péricytes soumis aux AGE-MGX, la

caspase-10 (caspase de la famille de la caspase-3) pourrait ainsi engendrer la formation de

H2O2 par l�intermédiaire d�une NAD(P)H oxydase, dont l�activation a d�ailleurs été montrée

lors de la liaison des AGE à leur récepteur RAGE (Wautier et al., 2001). Les ROS générés

activeraient une PKC puis la PC-PLC (Figure 53). Le traitement des péricytes avec un

antioxydant, comme la NAC, inhiberait cette cascade enzymatique en bloquant l�activation

redox-dépendante d�une PKC, sans affecter le clivage protéolytique de la caspase-10.

La protection totale des péricytes contre l�apoptose par les antioxydants (la NAC,

l�acide lipoïque et l�ebselen notamment) suggère un rôle central du stress oxydant dans la

réponse apoptotique induite par les AGE-MGX. Les dérivés actifs de l�oxygène peuvent être

produits dans la cellule par un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale

(Kane et al., 1993; Ghafourifar et al., 1999) ou provenir d'activités enzymatiques comme les

NAD(P)H oxydases membranaires (Suzuki et al., 1998; Wautier et al., 2001) ou les

lipoxygénases (O'Donnell et al., 1995). La mitochondrie apparaît de plus en plus impliquée

dans l�intégration, la régulation et l�amplification de la réponse apoptotique. Le découplage

de la chaîne respiratoire mitochondriale est en effet observé en réponse à divers stimuli,

comme les radicaux libres eux-mêmes (Chen et al., 1998; Yamakawa et al., 2000), les

céramides exogènes (Quillet-Mary et al., 1997) ou le TNFα (Schulze-Osthoff et al., 1992) et

induit une génération accrue de ROS ainsi que la libération de facteurs apoptotiques

mitochondriaux comme le cytochrome c (Ghafourifar et al., 1999), entraînant l�activation des

caspases effectrices. La protection des péricytes rétiniens contre l�apoptose, observée en

présence de différents antioxydants, pourrait résulter d�une inhibition de la formation de ROS

et/ou d�une protection de la mitochondrie contre les radicaux libres cytosoliques et les

céramides. Le rôle central de la mitochondrie dans la transduction du message apoptotique est

181

d�ailleurs souligné par les résultats obtenus avec l�inhibiteur peptidique de la caspase-9,

exposés dans le chapitre précédent (chapitre III).

En conclusion, nous avons montré l�induction d�un stress oxydant dans la voie de

signalisation menant à l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX. Bien que les

mécanismes moléculaires exacts n�aient pas été définis, les AGE-MGX, en se liant par

exemple au récepteur RAGE, induisent une production de ROS ou modifient le statut redox

intracellulaire, ce qui contrôlerait la génération de DAG et de céramides et qui finalement

altérerait la fonction mitochondriale.

Figure 53: Hypothèse de la voie de signalisation menant à l�apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX

AGE-MGX (/récepteur aux AGE?)

Mitochondrie

Caspase-9

Caspases effectrices(caspases-3, 6 et 7?)

Apoptose

ROS

PC DAG

PC-PLC

SM Céramides

A-SMase

PKC

N-acétyl-L-cystéine (Acide lipoïque Ebselen Zéaxanthine Coelentéramine)

statut redox / ROS

?

Caspase(s) initiatrice(s) caspase-10 (et 2 ?)

NAD(P)H oxydase? ?

182

183

CONCLUSIONS / PERSPECTIVES

184

185

Une des altérations caractéristiques de la rétinopathie diabétique est la disparition

précoce des péricytes, massivement présents dans les microvaisseaux rétiniens. Plusieurs

études suggèrent aujourd�hui que les péricytes disparaissent par un phénomène d�apoptose.

Mais les agents inducteurs d�un tel processus ainsi que les voies intracellulaires sous-jacentes

n�ont pas été clairement identifiés in vivo. Ce travail de thèse a permis de montrer d�une part

que les produits avancés de glycation, dérivés du méthylglyoxal, induisent in vitro l�apoptose

des péricytes et d�autre part d�identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la

transduction du message apoptotique. Nous avons mis en évidence que l�apoptose des

péricytes rétiniens induite par les AGE-MGX, est gouvernée par l�activation de différentes

caspases, la production de diacylglycérols (DAG) et de céramides, et l�induction d�un stress

oxydant. Dans nos conditions de culture, ces modifications biochimiques ne sont induites que

par les AGE dans les péricytes rétiniens puisque de fortes concentrations en glucose n�ont

affecté ni la mort cellulaire, ni les niveaux endogènes des DAG et des céramides. Les

péricytes semblent être plus sensibles aux AGE qu�à une forte concentration en glucose, pour

une même durée de traitement.

L�induction de l�apoptose par les AGE dans les péricytes rétiniens pourrait être reliée à

la situation pathologique observée in vivo. Les péricytes sont enfouis dans la membrane

basale, constituée de protéines de structures comme le collagène IV et la fibronectine,

capables de générer des AGE très tôt au cours du diabète, avant même la formation de

capillaires acellulaires, et qui s�accumulent progressivement pendant la maladie (Stitt et al.,

1997). Les AGE circulants transportés vers l�espace subendothélial à travers l�endothélium

contribuent également à l�accumulation d�AGE dans la membrane basale et dans les péricytes

rétiniens (Sttit et al., 1997 et 2000a). Par ailleurs des agents anti-glyquants comme

l�aminoguanidine ou l�OPB-9195 préviennent la disparition des péricytes (Hammes et al.,

1991; Yatoh et al., 2001) et l�accumulation d�AGE dans la rétine (Hammes et al., 1991) de

rats diabétiques. L�effet des AGE sur les péricytes rétiniens et leur mécanisme d�action

décrits in vitro, pourraient être examinés in vivo en administrant des AGE par voie

intraveineuse à des rats normo-glycémiques, selon le protocole proposé par Stitt et al (2000b),

en purifiant ensuite les microvaisseaux rétiniens (par un choc osmotique, par exemple) et en

observant l�apoptose dans les péricytes rétiniens ex vivo ainsi que l�induction des différents

médiateurs intracellulaires identifiés. L�implication réelle des acteurs moléculaires décrits

dans l�apoptose des péricytes bovins, notamment la caspase-10, pourrait également être

examinée ex vivo dans des péricytes de rétines humaines, prélevées post-mortem sur des

patients diabétiques et à partir desquelles l�arbre vasculaire est purifié. La présence et

l�activation de caspases, comme la caspase-10, pourrait être mise en évidence, par exemple,

186

par des techniques d�immunoempreintes (Western Blot), permettant de visualiser la protéine

clivée, ou d�ELISA de capture au moyen d�anticorps spécifiques, permettant de purifier la

caspase active et de mesurer l�activité enzymatique.

Après avoir mis en évidence que les AGE peuvent induire spécifiquement l'apoptose

dans les péricytes rétiniens, nous avons entrepris d�étudier la voie de signalisation

intracellulaire menant à l�apoptose. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux

voies de formation des DAG et des céramides. L�utilisation d�inhibiteurs enzymatiques nous

a permis d�une part d�exclure l�implication de la voie de biosynthèse de novo des céramides

et d�autre part de montrer que les DAG sont produits par la PC-PLC et sont couplés à

l�activation séquentielle de l�A-SMase pour générer les céramides. Afin de confirmer

l�activation de ces enzymes, nous aurions pu réaliser différents contrôles, comme un dosage

des substrats à partir desquels sont produits les DAG et les céramides (respectivement les

phosphatidylcholines et les sphingomyélines) par des méthodes de marquages métaboliques

et/ou mesurer les activités des enzymes produisant ces médiateurs lipidiques dans les

péricytes soumis aux AGE-MGX. Une autre approche serait de réprimer l�expression des

deux enzymes au moyen d�ARN-antisens et d�évaluer l�apoptose ainsi que la production des

deux médiateurs lipidiques dans les péricytes transfectés soumis aux AGE-MGX. L�inhibition

complète de la production des DAG et des céramides n�a été associée qu�à une protection

partielle des péricytes contre l�apoptose. Ces résultats nous ont amenés à proposer l�existence

d�une seconde voie de signalisation, indépendante de ces deux médiateurs lipidiques.

L�activité sphingomyélinase acide a été décrite initialement dans les lysosomes et les

endosomes (Kanfer et al., 1966), mais également dans les cavéoles de la membrane

plasmique (Liu et Anderson, 1995; Zundel et al., 2000; Grassmé et al., 2001). Le rôle des

céramides dans un processus apoptotique, générés dans les compartiments acides par l�A-

SMase lysosomale, est aujourd�hui controversé (Chatelut et al., 1998; Ségui et al., 2000). Il

apparaît en fait que l�A-SMase, responsable de la production de céramides pro-apoptotiques,

serait localisée au niveau de la membrane plasmique, notamment dans les cavéoles (Zundel et

al., 2000; Grassmé et al., 2001). De façon intéressante, la formation de DAG par la PC-PLC,

couplée à l�activation de l�A-SMase, a également été montrée dans les cavéoles (Liu et

Anderson, 1995). Mais la génération de céramides directement dans la mitochondrie est

également capable d�induire l�apoptose (Birbes et al., 2001). Ainsi, il serait intéressant

d�identifier le compartiment subcellulaire de production des DAG et des céramides dans les

péricytes apoptotiques, d�établir s�il existe des intermédiaires métaboliques entre les

céramides et la mitochondrie (hypothèse d�une production lysosomale ou cavéolaire) ou non

187

(hypothèse d�une production mitochondriale uniquement) et enfin d�identifier les voies de

signalisation activées par les céramides.

Au moyen d�inhibiteurs peptidiques spécifiques de caspases et d�immunoempreintes,

nous avons montré l�activation de différentes caspases (initiatrices et effectrices) dans les

péricytes rétiniens soumis aux AGE-MGX. Nous avons notamment identifié les caspases

initiatrices engagées dans la transduction du message apoptotique. La caspase-8 ne semble

pas être impliquée dans l�apoptose des péricytes. D�après les immunodétections, elle serait

même probablement absente de ce type cellulaire. En revanche, dans les péricytes rétiniens

bovins soumis aux AGE-MGX, la caspase-10 est présente et activée et semble contrôler la

formation des DAG et des céramides. La caspase-10 bovine identifiée présenterait une

séquence peptidique supplémentaire (≈ 4 kDa) par rapport aux isoformes longues des

caspases humaines 10/b (Vincenz et al., 1997) et 10/d (Hg et al., 1999). Cette variation de

quelques kilodaltons pourrait être liée à l�imprécision faite sur la mesure. Une différence de

masse moléculaire entre la forme humaine et bovine est néanmoins plausible et a d�ailleurs

été observée pour une autre protéine, comme le récepteur aux AGE, RAGE (Neeper et al.,

1992). Mais la production des céramides et des DAG pourrait également dépendre de

l�activation de la caspase-2L. En se basant sur le modèle d�activation de la caspase-8 proposé

dans différentes lignées cellulaires de lymphocytes (Droin et al., 2001), nous pourrions

imaginer que la caspase-2L interviendrait dans le processus d�activation de la caspase-10.

Cette hypothèse pourrait être confirmée en examinant par immunoempreinte si le peptide z-

VDVAD-fmk (inhibiteur de la caspase-2) inhibe le clivage protéolytique de la caspase-10.

Une autre approche serait d�observer les effets des AGE sur l�apoptose, le clivage de la

caspase-10 et la production des DAG et des céramides dans les péricytes n�exprimant plus la

caspase-2L par une technique de transfection des cellules avec un ARN anti-sens. Une des

limitations de notre étude est que les immunodétections des ces 3 caspases bovines ont été

réalisées au moyen d'anticorps dirigés contre des antigènes humains. La réalisation

d�expériences supplémentaires, comme des dosages d'activités enzymatiques après ELISA de

capture avec des anticorps spécifiques et/ou des expériences d'amplification de gènes (RT-

PCR), nous permettraient ainsi de confirmer l'expression de ces caspases et leur activation

dans les péricytes soumis aux AGE-MGX. Le clonage de l'ADNc de la caspase-10 bovine, à

partir d'une librairie d'ADNc de tissu bovin, comme cela a été effectué pour le clonage de

RAGE (Neeper et al., 1992), permettrait d'accéder à la séquence peptidique et de confirmer

éventuellement la différence de masse moléculaire suggérée entre la caspase-10 bovine et

humaine.

188

Nous avons également examiné l�implication d�un stress oxydant dans la transduction

du message menant à l�apoptose des péricytes. L�utilisation de différents antioxydants a

montré une protection totale des péricytes contre l�apoptose induite par les AGE associée à

une inhibition complète de la formation des DAG et des céramides, suggérant un rôle critique

du stress oxydant dans l'apoptose des péricytes rétiniens. Ce stress oxydant n�est pas dû à des

réactions de type Fenton liées aux ions métalliques qui sont chélatés par les AGE-MGX,

comme le montrent nos expériences où les AGE-MGX traités par des chélateurs de métaux

(EDTA et résine chelex-100) ont les même effets que les AGE-MGX natifs. Ceci suggère que

les effets des AGE-MGX observés dans cette étude sont dûs à la structure peptidique des

AGE et pas aux ions métalliques éventuellement liés. Ces expériences renforcent aussi la

notion que les AGE-MGX induisent un stress oxydant non pas par un phénomène artéfactuel

mais bien après liaison à un récepteur membranaire.

Nos résultats viennent également conforter d�autres études in vivo montrant le rôle du

stress oxydant dans la disparition des péricytes par apoptose, que ce soit chez l�Homme dans

des péricytes rétiniens apoptotiques prélevés post-mortem sur des patients diabétiques (Li W.

et al., 1999) ou chez le rat lors de l�administration d�antioxydants, comme le trolox (Ansari et

al., 1998) ou un mélange d�antioxydants (Yatoh et al., 2000; Kowluru et al., 2001) à des rats

diabétiques.

La production accrue de ROS, générant un stress oxydant, peut résulter d'un

dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale (Zamzami et al., 1995) ou

d'activités enzymatiques, telles que des NADPH oxydases (Khwaja et Tatton, 1999), des

lipoxygénases (O'Donnell et al., 1995), des NO synthases (Binder et al., 1999). Par ailleurs, la

liaison des AGE à leur récepteur RAGE induit la formation intracellulaire de ROS (Yan et al.,

1994) et l'activation de NADPH oxydase (Wautier et al., 2001). Ainsi, les sources de

production intracellulaire de ROS dans les péricytes soumis aux AGE-MGX pourraient être

examinées en analysant les effets d'inhibiteurs de certaines de ces voies de formation de ROS

sur l'apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX et la production des DAG et des

céramides qui en résulte. Par exemple, l'implication d'une NADPH oxydase (Wautier et al.,

2001) dans les péricytes pourrait être mise en évidence au moyen d'iodure de diphelylène

alors que la production de ROS mitochondriaux pourrait être examinée au moyen

d'inhibiteurs de la chaîne respiratoire, comme la roténone ou la TTFA

(thenoyltrifluoroacétone).

189

La deuxième voie de signalisation apoptotique activée par les AGE-MGX dans les

péricytes, indépendante des deux médiateurs lipidiques, semble converger vers la

mitochondrie et induire, de concert avec les céramides générés, l�activation de la caspase-9 et

des caspases effectrices. Néanmoins, nous n�avons pas pu déterminer si la caspase-10

(initiatrice) est située au carrefour des deux voies de signalisation. Le rôle de la caspase-10

pourrait être examiné en réprimant son expression par un ARN antisens ou en transfectant les

péricytes avec une forme inactive de la caspase-10 et en analysant les effets des AGE sur

l�apoptose des péricytes rétiniens.

Des études ont montré que l�apoptose peut être induite indépendamment de la

génération de céramides et associée à une atteinte mitochondriale. Les caspases initiatrices

semblent contrôler certaines de ces voies de signalisation impliquant les protéines régulatrices

de l�apoptose de la famille des Bcl-2 ou des kinases comme les JNKs (c-JUN-terminal

kinases). C�est ainsi que la caspase-8 peut induire la protéolyse de Bid, membre de la famille

des Bcl-2, générant un fragment pro-apoptotique qui entraîne la libération mitochondriale de

cytochrome c et l�activation séquentielle de caspases effectrices (Li H. et al., 1998). D�autre

part, les caspases initiatrices, notamment les caspase-8 et 10, par leurs domaines DED

(localisés dans le prodomaine), peuvent également induire, indépendamment de leur fonction

catalytique, l�activation de la voie des JNKs (Chaudhary et al., 1999), décrite dans les

processus apoptotiques. Ces mécanismes pourraient jouer un rôle dans la voie de signalisation

de l�apoptose activée par les AGE-MGX dans les péricytes.

D�autre part, l�action des AGE sur leur récepteur, notamment RAGE, celui dont la

cascade de signalisation est la mieux connue, met en jeu l�induction d�un stress oxydant et

l'activation d'une cascade de kinases (p21ras/PI3K/Akt/MAP kinases) qui active finalement le

facteur de transcription NF-κB (Yan et al., 1994; Lander et al., 1997; Deora et al., 1998). Ce

facteur de transcription est impliqué dans diverses réponses cellulaires, dont l'apoptose. Par

exemple, la surexpression de RelA (sous-unité de NF-κB) induit l'arrêt du cycle cellulaire et

l'apoptose dans des cellules B (Sheehy et Schlissel, 1999). NF-κB peut également réguler

l�expresion de protéines pro-apoptotiques, comme p53 (suppresseur de tumeur) (Nakai et al.,

2000), protéine contrôlant elle-même l'expression de Bax (Miyashita et Reed, 1995).

D�ailleurs, une étude toute récente vient de montrer que les AGE peuvent induire l�apoptose

des cellules mésangiales en activant p53 qui induit la surexpression de Bax, et que cette

apoptose est inhibée par un traitement des cellules avec un antioxydant, la N-acétyl-L-

cystéine (Yamagishi et al., 2002b). Ces différents travaux permettraient de proposer

l�hypothèse que les AGE, en se liant à RAGE, peuvent induire un stress oxydant

190

intracellulaire qui active NF-kB, celui-ci contrôlerait l�activation de p53 et la surexpression

de Bax, protéine altérant la fonction mitochondriale. Dans les péricytes rétiniens, la

participation éventuelle de ces différents acteurs moléculaires activés par la liaison des AGE à

leur récepteur, indépendants des céramides, reste à définir.

Les AGE sont décrits pour interagir avec des récepteurs spécifiques et induire des

réponses cellulaires. Nos expériences avec les chélateurs de métaux suggèrent que les effets

observés dans notre étude sont bien dus à la protéine glyquée AGE et non aux ions

métalliques liés dessus. Les effets des AGE-MGX sur l'apoptose des péricytes rétiniens sont

certainement médiés par un de ces récepteurs, capables d�induire un signal intracellulaire:

RAGE, ou AGE-R (p60, p90 et la galectine-3). En effet, le clivage protéolytique et

l�activation de la caspase-10 initiatrice (et de la caspase-2?) dans les péricytes rétiniens

suggère l�activation d�un récepteur transmembranaire, comme un récepteur aux AGE, dans

l'induction du signal de mort par les AGE-MGX. Nous avons montré, dans nos péricytes

rétiniens, la présence d�un récepteur spécifique aux AGE, RAGE, dont l�expression est

stimulée en présence des AGE-MGX (voir résultats, chapitre I). Par ailleurs, RAGE, dont le

domaine cytoplasmique est décrit comme essentiel dans la signalisation intracellulaire

(Huttunen et al., 1999), est capable de lier les AGE-MGX (Westwood et al., 1994) et

d'induire un stress oxydant intracellulaire (Yan et al., 1994; Wautier et al., 2001), ce qui est

conforme aux résultats décrits au cours de ce travail (cf. chapitre 4). Ces différentes données

permettent de proposer RAGE comme un candidat potentiel dans l'activation de la caspase-

10 (et de la caspase-2?) et la transduction du signal apoptotique dans les péricytes soumis

aux AGE-MGX. D�ailleurs, Yamagishi et al. (2002a) ont montré récemment que la

surexpression de RAGE augmente la réponse apoptotique des péricytes rétiniens soumis à

différents AGE.

Les mécanismes moléculaires d'activation des caspases initiatrices impliquent la

formation d'un complexe protéique transmembranaire, qui consiste en l'oligomérisation des

récepteurs de morts. Bien qu'un tel phénomène n'ait pas été décrit pour RAGE, ce récepteur

aux AGE est associé à une protéine homologue de la lactoferrine (Schmidt et al., 1992). En

plus de RAGE qui est un dimère, le récepteur AGE-R formé par p60, p90 et galectine-3,

localisé dans les cavéoles et qui est présent sur les péricytes (Stitt et al., 1997; Chibber et al.,

1997), forme un complexe trimérique lors de la liaison aux AGE (Stitt et al., 2000b). RAGE

et/ou d�autres récepteurs présents sur les péricytes, activés par la liaison d�un AGE,

pourraient ainsi se comporter comme des récepteurs de mort et former un complexe

transmembranaire, activant les caspases initiatrices. Cependant, l�activation des caspases

191

initiatrices nécessite leur recrutement aux récepteurs de mort par des molécules adaptatrices

(TRADD, RAIDD ou FADD) au niveau d�un domaine de mort (DD) de la partie

cytoplasmique des récepteurs (Kischkel et al., 1995 et 2001). Une comparaison de séquence

de ce DD avec le domaine cytosolique de RAGE par le logiciel BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) indique que ce dernier ne contient pas d�homologie

de séquence avec DD. En revanche, le fragment C terminal cytoplasmique de RAGE est

riche en résidus glutamates chargés négativement qui pourraient être impliqués dans une

reconnaissance protéine-protéine (Neeper et al., 1992). A ce jour, aucune étude n�a été

réalisée en vue d�identifier l�acteur moléculaire directement couplé à la partie cytoplasmique

de RAGE. Quant au complexe AGE-R, la protéine intracellulaire directement activée lors de

la liaison d�AGE à AGE-R apparaît être p90, interagissant avec la partie cytoplasmique de

p60 (Stitt et al., 1999). La signalisation intracellulaire induite semble intégrer une cascade de

phosphorylations par des kinases (Cai et al., 2000). De plus, nous ne pouvons pas exclure

l�hypothèse d�un recrutement d�une autre protéine que p90 au niveau du domaine

cytoplasmique de p60. Ceci a été décrit, par exemple, pour le récepteur du TNFα qui peut

recruter, au niveau de deux domaines distincts, les protéines FAN (Adam-Klages et al.,

1996) et TRADD (Wiegmann et al., 1999) induisant deux voies de signalisations

intracellulaires différentes.

Nous pourrions rechercher in vitro si un récepteur aux AGE est impliqué dans la

réponse apoptotique en surexprimant un récepteur aux AGE, comme RAGE (Yamagishi et

al., 2002a) ou bien en analysant les effets d�inhibiteurs de la liaison AGE/récepteur, comme

l�anticorps anti-RAGE (Yan et al., 1994), l'anticorps anti-p60 (Chibber et al., 1997) ou le

RAGE soluble (Wautier et al., 1996), sur l�apoptose et la formation de DAG et de céramides

et/ou l�activation de caspases dans les péricytes rétiniens. Une approche in vivo de cette

question pourrait également être envisagée par surexpression transgénique de récepteurs aux

AGE, comme cela a été fait pour RAGE. Ainsi, l'apoptose de péricytes rétiniens pourrait être

évaluée dans les souris transgéniques surexprimant RAGE (Yamamoto et al., 2001) en

comparaison aux animaux contrôles. Dans l�éventualité de l�identification d�un récepteur aux

AGE impliqué dans l�induction de l�apoptose des péricytes, le mécanisme de couplage de ce

récepteur à l�activation de la caspase-10 initiatrice mérite d�être investi.

En conclusion, ces travaux proposent un nouveau mécanisme moléculaire responsable

de la disparition par apoptose des péricytes rétiniens en réponse aux AGE accumulés au cours

192

du diabète. La perte par apoptose des péricytes induite par les AGE-MGX a été associée à

l'activation de la caspase-10 initiatrice. Celle-ci contrôlerait la formation des médiateurs

lipidiques impliqués dans l�apoptose: les DAG et les céramides. Les deux voies métaboliques,

dépendantes ou non des céramides, semblent converger vers la mitochondrie et induire

l'activation de la caspase-9 ainsi que des caspases effectrices pour orienter la cellule dans la

phase terminale de l�apoptose.

La disparition des péricytes au cours de la phase précoce de la rétinopathie est

considérée comme une des altérations initiales précédant l�apparition de lésions vasculaires

caractéristiques de la rétinopathie, comme la formation de capillaires acellulaires (Mizutani et

al., 1996). La perte des péricytes rétiniens pourrait ainsi contribuer au développement de la

maladie. Leur disparition, associée à celle des cellules endothéliales par apoptose dans

certains capillaires, semblent mener à la formation de capillaires acellulaires (Engerman et

al., 1989; Mizutani et al., 1996), phénomène pouvant contribuer à l�hyperperméabilité

vasculaire. Avec les cellules de Müller et les cellules endothéliales, les péricytes constituent

la barrière hémato-rétinienne. Leur disparition pourrait conduire à un dysfonctionnement des

cellules voisines, comme les cellules endothéliales. Les péricytes contrôlent en effet leur

prolifération (Orlidge et D�amore, 1987) et leur métabolisme cellulaire (Yamagishi et al.,

1993). Par ailleurs, il a été montré récemment in vitro que l�apoptose des péricytes induite par

des AGE est associée à une production accrue du facteur perméabilisant VEGF (Yamagishi et

al., 2000a). VEGF est en effet augmenté dans la rétine de patients diabétiques au cours de la

phase précoce de la maladie (Mathews et al., 1997). Ce facteur pourrait intervenir dans la

perte de la perméabilité de la barrière hémato-rétinienne, observée dans la phase pré-clinique

de la rétinopathie diabétique, en stimulant les processus de transcytose des constituants

plasmatiques à travers l�endothélium (Feng et al., 1999). La perte précoce des péricytes dans

les microvaisseaux rétiniens pourrait ainsi contribuer au développement de la rétinopathie, en

participant notamment à la déstructuration de la barrière hémato-rétinienne et

l�hyperperméabilité vasculaire. La prévention ou le ralentissement de la disparition des

péricytes par une approche pharmacologique contre une des cibles enzymatiques identifiées

au cours de ce travail, constitue donc une nouvelle perspective de traitement de la rétinopathie

diabétique.

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ANNEXES

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LECOMTE MARC, DENIS ULRICHE, PAGET CLARISSE, WIERNSPERGER NICOLAS et LAGARDE MICHEL. (Inventeurs). Utilisation d'inhibiteurs de l'apoptose des péricytes pour le traitement et/ou la prévention de la rétinopathie diabétique (demande de brevet d'invention du 24/10/2001).