Etude structurale et rhéologique des systèmes mixtes ... · Techniques de diffusion de la lumière ... Etude des mélanges homogènes ... Etude des mélanges de SC et de KC sous

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Etude structurale et rhéologique des systèmes mixtescaséinates/carraghénanes

Merveille Clay Nono Djamen

To cite this version:Merveille Clay Nono Djamen. Etude structurale et rhéologique des systèmes mixtes caséi-nates/carraghénanes. Autre. Université du Maine, 2011. Français. <NNT : 2011LEMA1012>.<tel-00652071>

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https://hal.archives-ouvertes.fr

Université du Maine

Faculté des Science

UMR CNRS

Polymères, Colloïdes, Interfaces

THESE

Présentée en vue de l’obtention du grade de

Docteur

Spécialité CHIMIE ET PHYSICO-CHIMIE DES POLYMERES

par

Merveille Clay NONO DJAMEN

Etude structurale et rhéologique des

systèmes mixtes caséinates/carraghénanes

Soutenue publiquement le 14 février 2011 devant le jury composé de :

Mme Camille MICHON SPAB-IPA, AgroParisTech, Paris Rapporteur

Mme Sylvie TURGEON STELA, Université de Laval, Québec Rapporteur

M. Alan PARKER FIRMENICH SA, Genève Président du jury

Mme Anne PITKOWSKI Groupe BEL, Vendôme Examinateur

M. Dominique DURAND CNRS- PCI, Université du Maine, Le Mans Examinateur

M. Taco NICOLAI CNRS- PCI, Université du Maine, Le Mans Examinateur

1

2

A ma famille,

A ma Clarice.

3

Avant-propos

Cette thèse, a été réalisée à l’université du Maine, au sein du laboratoire PCI

(Polymères, Colloïdes et Interfaces), sous la direction conjointe de M. Dominique DURAND

et de M. Taco NICOLAI. Je tiens particulièrement à les remercier pour la confiance et l’aide

qu’ils m’ont apporté au cours de ces trois dernières années. Je profite de cette occasion pour

souligner la chance qui m’a été offerte de pouvoir profiter de leur complémentarité tant d’un

point de vue scientifique qu’humain.

Ce travail a été rendu possible grâce à une collaboration, aussi bien scientifique que

financier, avec le Département de Recherche Appliqué du Groupe Bel. J’adresse mes sincères

remerciements à Marie-Hélène Chassagne, Benoît Goldschmidt et Anne Pitkowski pour avoir

suivi et encadré ce travail. Leur gentillesse et leur disponibilité ont permis de réaliser ce

travail dans les meilleures conditions. Je remercie également Guillaume Houze pour ces

conseils et sa gentillesse.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Mme Camille Michon, professeur à

AgroParisTech et Mme Sylvie Turgeon, professeur à l’université de Laval, pour avoir accepté

de juger ce travail de thèse et d’en être les rapporteurs. Je remercie également M. Alan Parker,

senior Scientist au centre de recherche Firmenich, pour avoir accepté de présider le jury.

J’exprime également mes sincères remerciements à tous les membres du laboratoire

PCI pour leur aide, leur conseil et leur disponibilité, et plus particulièrement mon Danie, très

chère à mon cœur. Un grand merci à Jean-lucounet pour sa disponibilité et son aide à toute

épreuve.

Enfin mes plus vifs et sincères remerciements vont à tous les thésards du laboratoire que j’ai

rencontré tout au long de ces trois années. Un merci particulier à mon Eliseounette de m’avoir

fait passer un séjour agréable et inoubliable au Mans.

Une très grande pensée et un grand merci à tous les membres de ma famille et mes

proches qui ont toujours été là à mes côtés, m’ont soutenue et encouragée pendant toutes mes

études.

4

Sommaire

5

Sommaire

Résumé

Liste des abréviations

Introduction générale ....................................................................... 20

Chapitre I: Etude bibliographique

A- Caséines et caséinates de sodium ............................................ 24

I.1. Les caséines ............................................................................. 24

I.2. Les micelles de caséines : la composition, la structure ........... 25

I.2.1. La composition .................................................................................................... 25

I.2.2. La structure ......................................................................................................... 25

I.3. Dissociation par précipitation acide ........................................ 28

I.4. Les caséinates de sodium ......................................................... 29

I.4.1. Caractérisation structurale ................................................................................. 29

I.4.2. Comportement en suspension ............................................................................. 29

I.4.3. Influence du pH et de la température ................................................................. 30

I.4.4. Influence de la force ionique ............................................................................... 30

B- Les carraghénanes .................................................................. 31

6

I.1. Structure chimique des différents types de carraghénane ...... 31

I.2. Les propriétés structurales et rhéologiques ............................. 32

I.2.1. Conformation en solution et transition pelote - hélice ....................................... 32

Influence des ions .............................................................................................. 35

I.2.2. Gélification .......................................................................................................... 37

I.2.2.1. Influence du temps et de la température ................................................ 37

I.2.2.2. Influence de la force ionique ................................................................. 38

I.2.2.3. Influence du pH .................................................................................... 39

I.2.2.4. Influence de la concentration et de la masse molaire ............................. 39

I.2.2.5. Modèles de gélification ......................................................................... 39

I.3. Les mélanges iota et kappa carraghénane .............................. 41

C- Mélange caséines et polysaccharides ...................................... 42

I.1. Comportement et structure des mélanges polysaccharides -

protéines ........................................................................................... 42

I.1.1. Nature des interactions dans les systèmes polysaccharides-protéines............... 42

I.1.2. Mécanismes ......................................................................................................... 42

I.1.2.1. Co-solubilité .................................................................................................. 43

I.1.2.2. Séparation de phase ségrégative..................................................................... 43

I.1.2.2.1. Incompatibilité thermodynamique ............................................................. 44

I.1.2.2.2. Phénomène de déplétion- floculation ......................................................... 44

I.1.2.2.3. Diagramme de phase ................................................................................. 45

7

I.1.2.3. Co-agrégation ................................................................................................ 46

I.2. Mélanges carraghénanes et caséines ...................................... 46

I.2.1. Travaux antérieurs.............................................................................................. 46

I.2.1.1. Co - agrégation .............................................................................................. 50

I.2.1.2. Séparation de phase ségrégative..................................................................... 51

I.2.2. Les propriétés rhéologiques des mélanges caséines et carraghénane ................ 52

References bibliographiques ............................................................ 56

Chapitre II: Matériels et méthodes

II.1. Matériels .................................................................................. 72

II.1.1. Préparation des échantillons ........................................................................... 72

II.1.1.1. Caséinate de sodium ...................................................................................... 72

II.1.1.2. Submicelles de caséines ................................................................................. 73

II.1.1.3. Carraghénanes ............................................................................................... 73

II.1.2. Préparation des mélanges caséines/ carraghénanes ....................................... 74

II.2. Méthodes.................................................................................. 75

II.2.1. Protocole .......................................................................................................... 75

II.2.1.1. Dosage des caséines ......................................................................................... 75

II.2.1.2. Dosage des carraghénanes ............................................................................. 75

I.2.1.3. Marquage des caséines .................................................................................. 76

8

II.2.1.4. Marquage des carraghénanes ......................................................................... 76

II.2.2. Techniques expérimentales ............................................................................. 77

II.2.2.1. Techniques de diffusion de la lumière............................................................ 77

II.2.2.1.1. Diffusion statique de la lumière classique .............................................. 77

II.2.2.1.2. Diffusion dynamique de la lumière ........................................................ 81

II.2.2.1.3. Diffusion statique de la lumière en milieu turbide (3DLS) ..................... 83

II.2.2.2. Microscopie confocale à balayage laser en mode fluorescence ....................... 84

II.2.2.3. Rhéologie ...................................................................................................... 86

II.2.2.3.1. Etude en régime permanent .................................................................... 86

II.2.2.3.2. Etude en régime oscillant ....................................................................... 87

II.2.2.3.3. Appareillage et protocole expérimental .................................................. 88

II.a. Influence de la géométrie et du gap ............................................................ 88

II.b. Influence de la vitesse de rampe ................................................................ 90

Références bibliographiques ............................................................ 91

Chapitre III: Etude des mélanges SC et KC sous forme pelote

III.1. Morphologie des mélanges ...................................................... 94

III.1.1. Observation des images prises immédiatement après mélange (t0) ............... 94

III.1.1.1. Système sans sel ou en présence de sel non spécifique (NaCl) et à pH 7 ........ 94

III.1.1.2. Etude du contraste ......................................................................................... 97

III.1.1.3. Système en présence de sel spécifique (KCl) et à pH 7 .................................. 98

9

III.1.2. Observation au cours du vieillissement .......................................................... 99

III.1.2.1. Domaine monophasique ................................................................................ 99

III.1.2.2. Domaine biphasique .................................................................................... 100

III.2. Analyse des agrégats ............................................................. 102

III.2.2. Influence du vieillissement ............................................................................ 104

III.2.3. Influence de la dilution .................................................................................. 105

III.2.4. Influence de la force ionique et du pH .......................................................... 106

III.3. Diagramme de phase ............................................................. 108

III.3.1. Système en présence de NaCl et pH 7 ........................................................... 109

III.3.2. Système sans sel et à pH 7 ............................................................................. 110

III.4. Conclusion ............................................................................. 111

Références bibliographiques .......................................................... 112

Chapitre IV: Gélification des mélanges monophasiques de SC et

de KC

IV.1. Système sans sel ..................................................................... 114

IV.1.1. Température critique de gélification ............................................................ 114

IV.1.2. Etude cinétique .............................................................................................. 116

IV.1.3. Température critique de fonte ...................................................................... 117

IV.1.4. Dépendance en fréquence des modules à 2°C............................................... 118

10

IV.2. Système avec un sel non spécifique du KC : sodium ............ 119

IV.2.1. Influence de la température et dépendance en fréquence des modules à

2°C.......... ....................................................................................................................... 119

IV.2.2. Influence de la concentration de SC et de KC .............................................. 121

IV.3. Système avec un sel spécifique du KC : le potassium ........... 122

IV.4. Système mixte en présence d’iodure de sodium .................... 123

IV.5. Structure du gel mixte ........................................................... 128

IV.6 Conclusion ............................................................................. 131


Chapitre V: Etude comparative des SC et des submicelles de

caséines

V.1. Etude des mélanges submicelles de caséines et KC sous forme

pelote .............................................................................................. 134

V.1.1. Morphologie .................................................................................................. 134

V.1.2. Séparation de phase ...................................................................................... 135

V.1.3. Formation des agrégats ................................................................................. 136

V.2. Gélification des mélanges submicelles de caséines et KC ..... 137

V.2.1. Etude de la solution de KC ........................................................................... 137

V.2.2. Etude des mélanges homogènes .................................................................... 139

11

V.2.2.1. Influence de la nature du sel ........................................................................ 139

V.2.2.2. Influence de la nature de la caséine .............................................................. 140

V.2.3. Systèmes submicelles de caséine et KC ......................................................... 141

V.3. Conclusion ............................................................................. 143

Propriétés structurales et rhéologiques des systèmes mixtes SC et

IC

VI.1. Etude d’une solution de IC pur ............................................. 145

VI.1.1. Etude cinétique .............................................................................................. 145

VI.1.2. Effet du type de sel ........................................................................................ 146

VI.1.3. Effet de la concentration de IC ..................................................................... 148

VI.1.4. Effet de la force ionique ................................................................................ 149

VI.1.5. Comparaison KC et IC ................................................................................. 150

VI.2 Etude des mélanges SC et IC sous forme pelote ................... 152

VI.2.1. Morphologie .................................................................................................. 152

VI.2.2. Diagramme de phase ..................................................................................... 153

VI.3. Gélification des mélanges monophasiques SC et IC ............. 154

VI.3.1. Influence de la concentration de SC ............................................................. 154

VI.3.2. Influence de la force ionique ......................................................................... 157

VI.4. Conclusion ............................................................................. 160

12


Conclusion générale ....................................................................... 164

Annexes

13

Résumé

14

RESUME

Les produits laitiers d’aujourd’hui contiennent souvent des polysaccharides qui permettent de les

texturer et de les stabiliser. La compréhension et le contrôle de ces mélanges sont essentiels pour la fabrication et le développement de nouveaux produits.

Le carraghénane est un polysaccharide sulfaté provenant des algues. Il existe principalement trois types de carraghénanes : le l-carraghénane, le k-carraghénane (KC) et l’i-carraghénane (IC). Les deux derniers sont ceux utilisés pour notre étude. Le KC et l’IC présentent une transition pelote-hélice en dessous d’une température critique qui dépend du type et de la concentration de cations. Dans l conformation hélice, les chaînes peuvent s’agréger, puis gélifier.

La caséine est la protéine majoritaire du lait. Dans le lait, elle est présente sous forme d’un complexe

stabilisé par le phosphate de calcium colloïdal (CCP). Le caséinate de sodium (SC) est obtenu à partir de la caséine native en enlevant le CCP par acidification, puis par addition de soude. Dans l’eau, les

particules de SC ont un rayon de 11nm et sont constituées d’environ 15 molécules de caséines. Les mêmes particules peuvent être formées par chélation du CCP par le triphosphate de sodium. Elles sont alors appelées submicelles de caséines.

Le projet de cette thèse vise à approfondir les connaissances sur la nature des interactions dans les systèmes mixtes caséinates/carraghénane. Ce mélange est un modèle pour certains produits laitiers.

Les principaux résultats de cette étude sont les suivants :

Etude des mélanges de SC et de KC sous forme pelote. Nous avons établi un diagramme de phase à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (MCBL), de la spectroscopie UV et de la rhéologie. Deux domaines ont été définis : un domaine biphasique aux fortes concentrations de SC où la séparation de phase est ségrégative et un domaine monophasique aux faibles concentrations des deux composés. Dans les mélanges monophasiques ou biphasiques, nous avons observé des agrégats riches en protéines qui sont irréversibles. Ces agrégats contiennent très peu de carraghénane et ont un impact sur la viscosité du mélange. La teneur en protéine dans ces agrégats augmente linéairement avec l’augmentation de la concentration de KC mais est indépendante de la concentration de SC. Cette

fraction est également influencée par le pH et la force ionique.

Gélification des mélanges monophasiques de SC et de KC. Les caséines n’influencent pas la

température critique de gélification, mais augmentent la température critique de fonte ainsi que le module du gel. Nous avons montré que le système forme un gel mixte. Ce gel mixte contient deux types de liaisons : des liaisons entre SC-KC et des liaisons entre KC-KC purs. La compétition entre ces deux types d’interactions dépend de la force ionique et de la nature du sel.

Etude comparative des SC et des submicelles de caséines. On n’observe aucune différence entre les

deux systèmes, à part la diminution de la température critique de gélification due au triphosphate de sodium.

Etude comparative de KC et d’IC en présence de SC. La séparation de phase ségrégative des mélanges d’IC est déplacée vers les hautes concentrations de SC. Le pourcentage d’agrégats dans le

mélange est négligeable. On observe également la présence d’un gel mixte, mais de module plus

faible.

En conclusion, cette thèse a permis de mieux comprendre le comportement complexe des carraghénanes dans les suspensions de caséines, ce qui devrait permettre le développement plus rationnel de certains produits laitiers.

Mots clés : caséinates, carraghénanes, gel mixte, interaction, séparation de phase, diagramme de phase, structure, agrégation, gélification, rhéologie, diffusion de la lumière, microscopie confocale.

15


16


SC : Caséinate de sodium

KC : Kappa carraghénane

IC : Iota carraghénane

LC : Lambda carraghénane

NaCl : Chlorure de sodium

[NaCl] : Concentration de chlorure de sodium

KCl : Chlorure de potassium

[KCl] : Concentration de chlorure de potassium

CCP : Phosphate de calcium colloïdal

NaTPP : Triphosphate de sodium

pH : Potentiel Hydrogène

pI : Potentiel Hydrogène

PPCN : Poudre de caséine micellaire

RITC : Marqueur Rhodamine B isothiocyanate

l : Longueur d’onde

e : Coefficient d’extinction molaire

A280nm : Absorbance à 280 nm

L : Largeur

PMT : Détecteur photomultiplicateur à tube

17

G’ : Module élastique

G’’ : Module visqueux

T : Température

Tc : Température critique de refroidissement

Th : Température critique de chauffage

G’ : Module élastique

G’’ : Module visqueux

C : Concentration

CSC : Concentration de SC

CKC : Concentration de KC

CT : Concentration totale

t0 : Temps initial

t : Temps

j : Jours

DTAF : Marqueur 5-(4,6-Dichloro-s-triazin-2-amino-fluorescein)

F : Teneur ou fraction en protéines dans les complexes

C0 : Contraste

MAT : Matière azotée totale

ES : Extrait sec

Ma : Masse apparente

Ra : Rayon apparent

18

q : Norme du vecteur de diffusion

Ir : Intensité relative diffusée

K : constante d’appareil

aC : Déplacements horizontaux

bC : Déplacements verticaux

Techniques

MCBL : Microscopie confocale à balayage laser

CLSM : Confocal laser scanning microscopy

DRX : Diffraction des rayons X

RMN : Rayonnement magnétique nucléaire

DSC : Calorimétrie différentielle à balayage

SEC : Chromatographie d’exclusion stérique

SLS : Diffusion statique de la lumière

DLS : Diffusion dynamique de la lumière

3DLS : Diffusion statique de la lumière en milieu turbide

UV : Spectroscopie à ultra-violet

19

Introduction générale

20

Introduction générale

Les produits alimentaires sont souvent composés d’ingrédients tels que les protéines et les

polysaccharides à cause de leurs propriétés épaississantes, gélifiantes, stabilisantes et

émulsifiantes.

Les paramètres qui influencent les propriétés de chacun de ces biopolymères sont la masse

molaire et la polymolécularité, la conformation chimique, la concentration, la densité de

charges, le pH, la force ionique, la température, la qualité du solvant, la nature et la force des

interactions intermoléculaires et intramoléculaires.

Lorsque ces 2 biopolymères sont mélangés, les propriétés physico-chimiques deviennent plus

complexes. La stabilité et la microstructure des produits ne dépendent plus seulement des

propriétés physico-chimiques des protéines ou des polysaccharides isolés mais aussi de la

nature et de la force des interactions entre les 2 constituants. Ces interactions affectent les

propriétés structurales, rhéologiques, physicochimiques et la stabilité des mélanges.

Généralement, les mélanges de protéines et de polysaccharides conduisent à un phénomène de

séparation de phase avec une phase riche en protéines et une phase riche en polysaccharides.

Deux mécanismes peuvent expliquer ce comportement : l’incompatibilité thermodynamique

ou le phénomène de déplétion-floculation. Dans ces systèmes mixtes, il peut aussi se produire

un phénomène de co-agrégation si les deux biopolymères portent des charges opposées.

Il est donc important de comprendre les mécanismes mis en jeu dans ces mélanges afin de les

maîtriser lors des processus de mise en œuvre.

Notre travail a eu pour objectif de contribuer à une meilleure compréhension de ces

mécanismes par l’étude structurale et rhéologique de systèmes modèles

caséinates/carraghénane. Cette étude s’inscrit également dans le cadre d’un projet de

recherche en collaboration avec les fromageries BEL qui a pour objet les « polysaccharides en

fonte ».

La stratégie d’étude adoptée a consisté à travailler sur des mélanges modèles

caséinate/carraghénanes. En effet, le carraghénane est un polysaccharide gélifiant qui a été

beaucoup étudié au laboratoire Polymères Colloïdes Interfaces. C’est un polysaccharide

sulfaté provenant des algues. Il existe 3 principaux types de carraghénanes : le kappa

21

carraghénane, le iota carraghénane et le lambda carraghénane. Le kappa et le iota

carraghénane montre une transition pelote-hélice en dessous d’une température critique qui

dépend du type et de la concentration en cations. Dans la conformation hélice, les chaînes de

kappa et de iota carraghénane peuvent s’agréger, puis conduire à un gel.

Ces systèmes mixtes caséinate /carraghénanes constituent un modèle pour certains produits

laitiers.

Ce manuscrit est composé de 6 chapitres :

Le premier chapitre recense les travaux antérieurs réalisés sur les caséinates, les

carraghénanes et les mélanges caséinates/carraghénanes. L’accent a été mis sur la co-

agrégation, la séparation de phase ségrégative et les propriétés rhéologiques de ces mélanges.

Le deuxième chapitre décrit la préparation des échantillons ainsi que les protocoles

expérimentaux et les différentes techniques utilisées au cours de ce travail.

Le troisième chapitre est consacré à l’étude des mélanges caséinates de sodium

(SC)/kappa carraghénane (KC). Nous présentons dans un premier temps la morphologie des

mélanges, puis l’analyse des agrégats formés entre le SC et le KC et enfin le diagramme de

phase.

Le quatrième chapitre traite de la gélification des mélanges monophasiques

caséinates de sodium/kappa carraghénane. Les influences de différents paramètres

(concentration en biopolymères, force ionique, nature du sel) sur les modules et les

températures critiques des systèmes mixtes sont étudiés. Puis, nous décrivons la structure du

gel mixte.

22

Le cinquième chapitre est consacré à la comparaison des systèmes mixtes caséinates

de sodium/kappa carraghénane, puis submicelles de caséines/kappa carraghénane. La

morphologie, l’agrégation et les propriétés rhéologiques ont été étudiés.

Le sixième chapitre est consacré à l’étude du système mixte caséinates de

sodium/iota carraghénane et à sa comparaison avec le kappa carraghénane.

23

Chapitre I : Etude bibliographique

24

A- Caséines et caséinates de sodium

I.1. Les caséines

Les caséines représentent 80% des protéines du lait de vache (Lucey, Johnson and Horne,

2003) .

Il existe 4 types de molécules de caséines as1, as2, b et k, dans les proportions 3 :1 :3 :1 (de

Kruif and Holt, 2003; Walstra and Jenness, 1984) . On retrouve également une petite quantité

de g-caséines qui proviennent essentiellement de la dégradation des b-caséines par l’action

des plasmines (Bastian and Brow, 1996). Ces différentes caséines ont des masses molaires

variant entre 20 et 25 kg/mol et des points isoélectriques situés entre 4.96 et 5.64. Les

caséines proviennent de la polycondensation de différents aminoacides dont essentiellement la

leucine, la proline, l’acide glutamique et la sérine. La composition en acides aminés leur

confère une certaine hydrophobicité ce qui leur permet de s’associer aisément. Les points de

ressemblance entre les caséines sont : leur faible solubilité à pH 4.6, l’absence de résidus

disulfures et de structures secondaires ainsi que la présence de groupements phosphates.

Cependant, elles se distinguent entre elles par leur hydrophobicité, leur sensibilité à la

précipitation du calcium et la distribution de leur charge.

- as1-caséine (Ginger and Grigor, 1999) (masse molaire 23Kg/mol, 199 résidus) : Elle

est constituée de 2 régions hydrophobes, séparées par une région hydrophile très chargée

contenant 8 groupes de phosphate, ce qui en fait la protéine la plus chargée du lait. Elle peut

être précipitée avec de très faibles quantités de calcium.

- as2-caséine (Brignon, Ribadeau-Dumas, Mercier, Pelissier and Das, 1977; Ginger et

al., 1999) (masse molaire 25 kg/mol, 207 résidus) : Les charges négatives sont concentrées

près de l’extrémité N-terminale et les charges positives près de l’extrémité C-terminale, ce qui

en fait la protéine la plus hydrophile. Elle peut également être précipitée avec de très faibles

quantités de calcium.

- b-caséine (Ginger et al., 1999; Rollema, 1992) (masse molaire 24Kg/mol, 209

résidus) : Elle est composée d’une région N-terminale hydrophile très chargée négativement

et d’une région C-terminale hydrophobe, ce qui lui donne une structure amphiphile. C’est la

plus hydrophobe des protéines. Elle est très sensible à la température mais moins au calcium.

25

- k-caséine (Ginger et al., 1999; Rollema, 1992) (masse molaire 19Kg/mol, 169

résidus) : Elle contient une région N-terminale hydrophobe et une région C-terminale

hydrophile faiblement chargée. C’est un copolymère amphiphile. La région comprise entre les

résidus peptidiques 20 et 115 est chargée positivement ; ces régions restent positives même à

des pH alcalins (Snoeren, 1975) . Elle diffère des autres caséines par sa faible sensibilité au

calcium car elle ne possède qu’un seul groupement phosphoséryl. Ainsi, elle permet de

stabiliser les autres caséines.

Dans le lait, ces molécules sont présentes sous forme de grandes particules qui sont

communément appelées micelles de caséines. Ces micelles de caséines coexistent à l’équilibre

avec des molécules libres de caséines. La structure exacte de ces agrégats de caséine n’a pas

encore été élucidée bien que divers modèles aient été proposés.

I.2. Les micelles de caséines : la composition, la structure

I.2.1. La composition

La micelle de caséines est formée par la combinaison d’environ 92% de protéines (as1, as2, b

et k), de quelques fragments peptidiques provenant de la protéolyse de la caséine b (Fox,

1989) et de 8% de produits minéraux dont les principaux sont les phosphates de calcium, plus

souvent appelés phosphates de calcium colloïdal (CCP) qui assurent en partie la cohésion

(Schmidt, 1980) . La micelle est une particule plus ou moins sphérique avec un aspect

granuleux ressemblant à une framboise. Dans le lait, il existe plusieurs types d’interactions

entre les caséines : les interactions électrostatiques, hydrophobes, les liaisons hydrogène et les

ponts disulfures (Schmidt, 1982) . Leur équilibre dépend de différents paramètres tels que le

pH, la température et la force ionique (Horne, 1998; Rollema, 1992)

I.2.2. La structure

Horne suggère qu’il existe 2 types de liaisons à l’intérieur de la micelle de caséines (Horne,

1998) : Les interactions hydrophobes et l’interaction entre le phosphate de calcium et les

résidus phosphorylés des molécules de caséines (Holt, 2004) Les caséines k seraient situées

26

en périphérie car elles ne peuvent se combiner que par des interactions hydrophobes. La

quantité de caséines k étant insuffisante pour recouvrir l’intégralité de la périphérie, la surface

serait également recouverte par la caséine b. Ainsi, la micelle ne serait perméable uniquement

qu’aux petites molécules.

Figure I. 1 : Liaisons à l’intérieur de la micelle de caséine, d’après Horne (1998)

Actuellement, 2 grands modèles se dégagent pour décrire la structure de la micelle de

caséines :

T Le premier modèle est basé sur des expériences de diffusion de neutrons aux petits angles

(SANS) (Walstra, 1999) . Celui-ci propose que la micelle serait constituée de submicelles

sphériques d’environ 10 nm de diamètre reliées entre elles par des phosphates de calcium

colloïdaux (CCP). Il existerait 2 types de submicelles dans la micelle : le premier, constitué de

caséines as1 et b, est situé essentiellement à l’intérieur de la micelle. Le second, composé de

caséines as1, as2 et k, est localisé à la périphérie de la micelle.

27

Figure I. 2: Modèle de la micelle de caséine, d’après Walstra (1999)

T D’après le deuxième modèle (Holt, 1992) , la micelle serait une sorte de gel minéralisé de

protéines associées entre elles par les nanoclusters de phosphate de calcium colloïdal. La

neutralisation des charges par le phosphate de calcium permettrait aux interactions

hydrophobes de maintenir la forme de la micelle. L’intérieur de la micelle serait hydrophobe

et l’extérieur hydrophile. Les expériences de diffusion de rayons X faites par Marchin et al.

montrent qu’il n’existerait pas de structure submicellaire à l’intérieur de la micelle et qu’il y

aurait des domaines denses correspondant aux particules de CCP (Marchin, Putaux, Pignon

and Léonil, 2007) .

Figure I. 3: Modèle de la micelle de caséine, d’après Holt (1992).

De tous ces modèles, il ressort que la micelle de caséines est une particule plus ou moins

sphérique, constituée d’un cœur hydrophobe et d’une couronne hydrophile composée de

28

caséines k et b. Cette couronne souvent appelée « couche chevelue », est négativement

chargée et a une épaisseur d’environ de 10 nm. Elle permet la stabilisation stérique et

électrostatique de la micelle (Dalgleish, 1998) .

La taille de ces micelles n’est pas monodisperse et a un diamètre allant de 50nm à 500nm (de

Kruif, 1998) , dont la valeur moyenne en z est de l’ordre de 150nm (Morris, Foster and

Harding, 2000) . Leurs masses sont également situées entre 2.105 et 2.106 Kg/mol (Holt, 1992)

et leur voluminosité est comprise entre 4 et 5 mL/g (Morris et al., 2000) . Cette grande valeur

est due à la présence d’eau au sein des micelles. La caséine k est surtout localisée en surface

et la partie hydrophile des ses chaînes peptidiques, d’environ 12 nm de longueur, permet de

stabiliser stériquement la micelle.

I.3. Dissociation par précipitation acide

Les micelles de caséines peuvent être dissociées de plusieurs façons : un traitement à haute

pression (De La Fuente, 1998) , un abaissement de la température (De La Fuente, 1998) , une

dialyse (Jang and Swaisgood, 1990) , une chélation du calcium (Panouillé, 2004; Pitkowski,

2007; Udabage, McKinnon and Augustin, 2000) ou une précipitation acide (Povey, Golding,

Higgs and Wang, 1999) . Cette dernière méthode est utilisée pour préparer industriellement

les caséinates.

Le caséinate est obtenu à partir des caséines du lait acidifié à pH 4.6, sous l’action des acides

(HCl ou H2SO4) ou des ferments lactiques (Kumosinski, Pessen, Farrell and Brumberger,

1988; Povey et al., 1999) . A ce pH, le complexe micellaire est détruit et les caséines

s’assemblent et précipitent sous la forme d’un coagulum. Le coagulum est séparé du

lactosérum acide par centrifugation. Il est lavé plusieurs fois à l’eau pour éliminer le lactose,

les sels et l’acide. La caséine acide obtenue contient environ 50% d’eau. A cette étape, pour

obtenir une poudre de caséine acide, on fait directement le séchage et le broyage. Mais, si on

veut extraire le caséinate, on solubilise la caséine dans de l’eau par addition d’une solution

alcaline qui dépendra du type de caséinate souhaité. Enfin, le séchage du caséinate est

effectué par atomisation ou sur un sécheur à cylindres. La qualité microbiologique, la

composition chimique des caséinates et les propriétés (la solubilité, la viscosité, la capacité

émulsifiante et moussante) détermineront le choix du caséinate à utiliser en fonction des

29

applications souhaitées. La structure micellaire de la caséine est détruite pendant l’élaboration

du caséinate de sodium.

I.4. Les caséinates de sodium

Ils sont obtenus par précipitation acide et neutralisation des caséinates acides par NaOH. Dans

une solution aqueuse et à force ionique suffisante, elles forment des petits agrégats d’environ

11 nm (HadjSadok, Pitkowski, Benyahia, Nicolai and Moulai-Mostefa, 2008) . Les particules

formées par les caséinates de sodium obtenues par la méthode de chélation ont à peu près la

même taille que celles obtenues par précipitation acide (Panouillé, Benyahia, Durand and

Nicolai, 2005a) .

I.4.1. Caractérisation structurale

Par des techniques de diffusion de la lumière à 20°C, des auteurs ont observé deux

populations distinctes dans une solution de caséinate de sodium : des petites particules de

caséinates de sodium contenant environ 15 molécules de caséines avec un rayon

hydrodynamique d’environ 11 nm et des grands agrégats d’une taille d’environ 60 nm (Chu,

Zhou, Wu and Farrell, 1995; HadjSadok et al., 2008; Nash, Pinder, Hemar and Singh, 2002) .

Bien que sa contribution à la diffusion de la lumière soit importante, la concentration

massique des grandes particules représente moins d’un pourcent (HadjSadok et al., 2008) .

Plusieurs auteurs ont montré que la taille des particules dépend du pH (O'Kennedy, Mounsey,

Murphy, Duggan and Kelly, 2006) , de la force ionique (Panouillé, Nicolai, Benyahia and

Durand, 2005b) et de la température (Panouillé et al., 2005b) .

I.4.2. Comportement en suspension

A faible concentration de protéines, à 20°C, à pH 7 et à 0.1M NaCl, la solution de caséinate

de sodium est transparente. Au dessus de 10 g/L, les solutions deviennent légèrement opaques

à cause de la présence des grandes particules qu’on ne peut pas complètement enlever par

centrifugation et filtration (HadjSadok et al., 2008) .

30

La viscosité des caséinates est très faible pour des concentrations inférieures à 100g/L. Au

delà de cette concentration, elle augmente fortement (Pitkowski, Durand and Nicolai, 2008) .

La viscosité diminue lorsque la température augmente. Les caséinates de sodium s’agrègent à

des températures supérieures à 135°C, ce qui peut entraîner une modification de leurs

propriétés fonctionnelles (Dalgleish, Pouliot and Paquin, 1987) .

I.4.3. Influence du pH et de la température

La gélification acide des caséinates de sodium se déroule entre les pH 5.2-4.7 et elle est très

sensible à l’environnement ionique (HadjSadok et al., 2008; Koh, Merino and Dickinson,

2002; O'Kennedy et al., 2006) . En présence de sel, la gélification commence à pH 5.

La viscosité diminue avec l’augmentation de la température (Guo, Fox, Flynn and

Mohammad, 1989) mais augmente avec la baisse du pH (Baretto et al., 2003; Carr, Munro

and Campanella, 2002) . A des hautes températures (supérieures à 135°C), les caséinates de

sodium peuvent s’agréger, ce qui peut entraîner une modification de leurs propriétés

fonctionnelles (Dalgleish et al., 1987; Guo, Fox, Flynn and Kindstedt, 1996) .

I.4.4. Influence de la force ionique

La présence de sels tels que NaCl ralentit la gélification acide du caséinate et diminue

également le pH auquel a lieu la gélification (O'Kennedy et al., 2006) . A 0.1M NaCl, la

gélification intervient à pH 5 alors qu’en absence de sel, elle a lieu à pH 4.75. Ceci peut

s’expliquer par l’écrantage des charges de la protéine par le sel qui induit une diminution des

interactions entre les particules. En présence de sel, le gel formé est faible et une très forte

concentration de sel peut même empêcher la gélification.

L’agrégation de caséinates de sodium peut être induite par l’addition du calcium. L’agrégation

rend la solution turbide. Avec le temps, les agrégats croissent et précipitent. La quantité de

caséines dans les agrégats augmente avec la concentration de calcium mais ne dépend pas de

la concentration de caséines. Il y a très peu de calcium qui participe à l’agrégation des

caséines (Dalgleish and Parker, 1980; Dalgleish, Paterson and Horne, 1981; Dickinson et al.,

2001; Pitkowski, Nicolai and Durand, 2009)

31

B- Les carraghénanes

I.1. Structure chimique des différents types de carraghénane

Les carraghénanes sont des polysaccharides linéaires constitués de molécules de galactoses et

d’anhydro-galactose plus ou moins sulfatés (Morris, 2007) . La chaîne est constituée de sous-

unités appelées carrabioses comprenant deux galactoses liés par une liaison b (1-3). Ces

carrabioses sont liés entre eux dans la chaîne par des liaisons a (1-4). Selon la position et le

nombre de groupements sulfates sur le cycle carboné, on distingue les kappa (k), les iota (i) et

les lambda (l) carraghénanes.

Rees et son équipe (Rees, 1969) ont déterminé les structures des carraghénanes. Ce sont des

copolymères alternés du type (AB) n (Anderson et al., 1968a) . Les structures du KC, du IC et

du LC sont représentées sur la figure I. 4 :

Figure I. 4: Structures du k, i et l carraghénane.

32

L’identification de la structure chimique des carraghénanes est réalisée suivant des méthodes

classiques : l’oxydation, la méthylation et l’hydrolyse partielle ou totale (Anderson, Dolan

and Rees, 1968b; Anderson, Dolan and Rees, 1973) . La structure conformationnelle est

déterminée par la diffraction des rayons X, la RMN, la spectrométrie de masse et la

spectrophotométrie infrarouge (Anderson, Campbell, Harding, Rees and Samuel, 1969;

Lowson and D.A. Rees, 1968; Lowson, Rees, Stancioff and Stanley, 1973) . Il est possible de

séparer les différentes formes structurales par électrophorèse ou perméation du gel (Roberts,

Zhong, Prodolliet and Goodall, 1998; Slootmaekers, Dijk, Varkevisser, Treslong and

Reynaers, 1991) .

Les différents types de carrabioses confèrent aux carraghénanes différentes propriétés

structurales et mécaniques. Au cours de cette étude, nous avons étudié l’impact du kappa

carraghénane et du iota carraghénane sur les propriétés des caséinates.

I.2. Les propriétés structurales et rhéologiques

Les propriétés du KC et IC ont été résumées par Morris et Piculell (Morris, 2007; Piculell,

2006) Elles dépendent à la fois de la température et de l’environnement ionique. Les

carraghénanes sont utilisés pour 3 propriétés principales : la formation d’un gel qui peut

gonfler en absorbant de l’eau, l’épaississement et la stabilisation des émulsions et des

dispersions.

I.2.1. Conformation en solution et transition pelote - hélice

En solution à chaud, les carraghénanes se comportent comme des pelotes statistiques dont le

degré d’expansion dépend du degré de sulfatation et de l’environnement ionique en raison de

leur caractère polyélectrolyte. La viscosité du KC dans 0.1M NaCl croît avec la concentration

de KC. Pour des fortes concentrations, on observe un comportement en loi de puissance

proche de celui des polymères enchevêtrés en bon solvant (Croguennoc, Meunier, Nicolai and

Durand, 2000) . Au refroidissement, ils adoptent une structure hélicoïdale plus ou moins

ordonnée. Ceci a été montré par des mesures de diffraction des rayons X des carraghénanes à

l’état solide (Millane, Chandrasekaran, Arnott and Dea, 1988) (figure I. 5). Cette transition

pelote – hélice dépend de la nature et de la concentration de cations (Rochas and Rinaudo,

33

1980) . L’absence du pont 3,6 anhydrogalactose dans la molécule de LC empêche son

changement conformationnel (Snoeren, 1976) .

Figure I. 5 : Structure en double hélice du k-carraghénane (KC) (a) et du i-carraghénane

(IC) (b) (Millane et al., 1988) .

Les études de polarimétrie (Meunier, 1999; Rees, Steele and Williamson, 1969; Snoeren,

1976) ont montré une augmentation du pouvoir rotatoire pendant le refroidissement d’une

solution de KC ou de IC ce qui manifeste une transition pelote - hélice (Figure I. 6).

34

Figure I. 6: Evolution du pouvoir rotatoire

en fonction de température pour une

solution de KC, IC et LC à 0.3M NaCl

(Snoeren, 1976) .

Cette transition a également été mise en évidence par diffusion de la lumière (Meunier,

Nicolai and Durand, 2000; Slootmaekers, Jonghe, Reynaers, Varkevisser and Treslong, 1988)

, par la calorimétrie (Rochas and Mazet, 1984a) , par la RMN (Rochas et al., 1980) et par

rhéologie (Baussay, 2005; Meunier, 1999; Parker, Brigand, Miniou, Trespoey and Vallée,

1993; Piculell, Nilsson and Muhrbeck, 1992b) .

La rhéologie a été utilisée dans notre étude afin de mettre en évidence le phénomène

d’agrégation et de gélification. Pendant le refroidissement, la transition se manifeste par une

augmentation brutale des modules à une certaine température qu’on appelle la température

critique de refroidissement Tc. Cette augmentation est due à la formation d’agrégats (voir

partie I.2.2) qui conduit à un liquide viscoélastique ou à un gel. Pendant le chauffage, la

transition se manifeste par une diminution brutale des modules à une température critique de

chauffage Th. C’est donc un processus thermoréversible. Les solutions de carraghénanes

peuvent parfois présenter une hystérèse. L’hystérèse entre les températures critiques Tc et Th

est généralement attribuée à une stabilisation de la conformation hélicoïdale par une

agrégation des doubles hélices (Millane et al., 1988; Rees, 1969) . L’hystérèse est observée

pour le KC (figure I. 7) (Borgstrom, Piculell, Viebke and Talmon, 1996) mais pas pour l’IC

(figure I. 8) (Michon, 1995) probablement parce que les liaisons entre les hélices de KC sont

plus fortes (Chronakis, Piculell and Borgström, 1996) .

35

Figure I. 7: Evolution de G’ et G’’ à 0.1

Hz en fonction de la température pendant

le refroidissement et la fonte (4g/L KC,

0.1M NaCl et 0.02M KCl) (Baussay, 2005)

.

Figure I. 8: Evolution de G’ en fonction de la température pendant le refroidissement (traits

continus) et le chauffage(traits pointillés) (25g/L IC, 0.25M NaCl et à 0.2, 0.5, 1 et 2 Hz)

(Piculell et al., 1992b) .

Influence des ions

La transition pelote – hélice ne dépend pas de la concentration de KC ou de IC, mais elle est

influencée par la quantité, la taille, la nature et la valence des ions.

36

La stabilité de la conformation hélicoïdale est renforcée par l’augmentation de la

concentration d’ions qui peut entraîner la gélification. L’IC et le KC ne se comportent pas de

la même façon vis-à-vis des ions (Nilsson and Piculell, 1991; Piculell, 1995) .

Rochas et al. (Rochas et al., 1980) ont déterminé par polarimétrie les températures de

transition pelote-hélice (Tc) du KC en fonction de la nature des ions et de leur concentration.

Ces résultats ont également été observés en rhéologie. Rochas et al. ont montré que l’inverse

de Tc varie linéairement avec le logarithme de la concentration en sel, voir figure I. 9.

Figure I. 9:Tc (obtenue par refroidissement) en fonction de la concentration totale CT en ions

libres pour le KC (Rochas et al., 1980) .

1 à 4=Rb+, K

+, Cs

+, NH4

+ 5 à 6= Ba

2+, Ca

2+, Sr

2+, Mg

2+, Zn

2+, Co

2+ 7 à 9= Na

+,

N(CH3)4+, Li

+

Ces auteurs ont également classifié les ions monovalents et divalents suivant leur capacité à

stabiliser la conformation hélicoïdale.

Par ordre d’efficacité décroissante, ils ont montré que l’on avait :

- pour les cations monovalents : Rb+> Cs+> K+> NH4+> N(CH3)4

+>Na+>Li+.

- pour les cations bivalents : Ba2+> Ca2+> Sr2+> Mg+> Zn2+>Co2+.

L’étude systématique de Rochas et al. montre que les cations divalents sont non spécifiques

sans doute à cause de leur taille et des pontages ioniques intermoléculaires. Par contre, les

Tm-1 .103

(°K-1)

2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6

CT (

mol

.l-1)

10-3

10-2

10-1

100

Tm (°C)

12,3

4 5 6 7,8 9

71.8 60.3 49.6 39.5 30.0 21.1 12.7 4.8

c

c

37

cations monovalents K+, Rb+, Cs+ ou NH4+sont spécifiques. Il semblerait qu’il existe des sites

spécifiques sur le KC, mais leur localisation n’est pas établie avec exactitude.

Certains anions tels que le I-, SCN-, NO3- peuvent aussi stabiliser les hélices de KC. Dans le

cas du KC, il a été montré que l’iodure la température de transition, stabilise la conformation

hélicoïdale et empêche l’agrégation en fagots donc la gélification (voir partie I.2.2)

(Slootmaekers et al., 1988)

Grâce à la RMN127I, Nerdal et al. (Nerdal, Haugen, Knutsen and Grasdalen, 1993) ont mis en

évidence des sites spécifiques de tailles suffisantes à l’intérieur de la double hélice pouvant

accueillir l’iodure. D’autres auteurs (Zhang and Furo, 1993; Zhang, Piculell and Nilsson,

1992) ont montré par des mesures de RMN127I, une forte corrélation entre l’apparition de

liaisons spécifiques iodure-carraghénane et la transconformation. La liaison iodure-

carraghénane semblerait stabiliser de façon particulière la conformation hélice.

L’IC possède une densité de charges supérieure au KC, ce qui le rend plus sensible à la

valence des contre-ions. De plus, la transition pelote-hélice de l’IC n’est pas sensible aux

anions des sels (Piculell, 1995) . Pour l’IC, il n’y a pas d’ions spécifiques.

En l’absence d’ions spécifiques, la stabilité des hélices d’IC nécessite une concentration en

sels moindre que celle pour KC (Piculell, 1995) .

I.2.2. Gélification

Comme dit précédemment, pendant le refroidissement, la solution de KC ou de IC gélifie, si

les concentrations en sel et en KC (ou en IC) sont suffisantes. Le module du gel dépend de la

concentration de KC ou de IC, du temps, de l’environnement ionique et de la nature des

contres-ions (Baussay, 2005) .

Les gels d’IC sont assez faibles (Michon, 1995; Michon, Cuvelier, Launay and Parker, 1996a;

Michon, Cuvelier, Launay and Parker, 1996b) , contrairement aux gels de KC qui sont

beaucoup plus cassants à cause de la forte association des chaînes (Chronakis et al., 1996) .

I.2.2.1. Influence du temps et de la température

38

Dans l’étude des propriétés mécaniques des gels de KC, le facteur cinétique est important

dans la formation du gel. Meunier et al. (Meunier, Nicolai, Durand and Parker, 1999)

montrent que le système s’équilibre lentement quand on est proche de la température critique

Tc qui est d’environ 25°C et qu’il faut attendre plus que 12Heures pour atteindre l’état final du

gel (figure I. 10). Ces observations ont également été faites sur des solutions de IC (Michon,

1995; Piculell, 1995; Piculell et al., 1992b) .

Figure I. 10 : Evolution des modules de conservation G’ en fonction du temps pour différentes

températures. 1g/L KC dans 0.1M NaCl et 0.01M KCl (Meunier, 1999) .

I.2.2.2. Influence de la force ionique

La force du gel augmente avec la force ionique jusqu’à atteindre un plateau, puis diminue

(Hermansson, Eriksson and Jordansson, 1991; MacArtain, Jacquier and Dawson, 2003;

Michel, Mestdagh and Axelos, 1997; Parker et al., 1993; Rochas, Rinaudo and Landry, 1990;

Thrimawithana, S. Young, Dunstan and Alany, 2010) .

Les propriétés rhéologiques du KC en présence d’anions ont également été étudiées (Piculell,

1998; Piculell, Borgström, Chronakis, Quist and Viebke, 1997) . Pour une solution de KC

supérieure à 0.9% et à 0.1M NaI, Chronakis et al.(Chronakis et al., 1996) observent la

formation de gels faibles, alors que l’iodure devrait empêcher la gélification. De plus, il n’y a

pas de phénomène d’hystérèse. Dans des mélanges de NaI et CsI, lorsque la fraction molaire

de Cs est supérieure à 0.4, les gels obtenus sont proches de ceux formés en présence de KCl et

lorsqu’elle est inférieure à 0.4 ils sont semblables à ceux formés en présence de NaI

(Chronakis, Doublier and Piculell, 2000) .

t (s)

102 103 104

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

xx

x

x

xx

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

5°C

15°C20°C

22°C

23°C24°C

25°Cx

39

I.2.2.3. Influence du pH

Le pH dans la gamme de 5.5 à 9 ne semble pas influencer les propriétés viscoélastiques des

gels d’IC pour une concentration de sel donnée. Pour des pH en dessous de 5.5, l’IC

s’hydrolyse et peut perdre sa capacité à gélifier (Michon, 1995) .

Plus le pH est acide, plus l’hydrolyse des chaînes KC et IC augmente avec le temps et la

masse moyenne du carraghénane diminue (Capron, Yvon and Muller, 1996) . De plus, la

dépolymérisation de KC est plus rapide à l’état liquide qu’à l’état gel (Capron et al., 1996) .

L’IC semble plus résistant à l’hydrolyse acide que le KC.

I.2.2.4. Influence de la concentration et de la masse molaire

Plusieurs auteurs ont montré que le module élastique des gels de KC varie avec le carré de la

concentration de KC (Baussay, 2005; Meunier et al., 1999) .

Michon trouve que le module G’ au plateau varie avec la concentration d’IC et suit une loi de

puissance avec un exposant de 2.4 (Michon, 1995) , ce qui est proche des résultats de Morris

et al qui trouve un exposant de 2 (Morris, Rees and Robinson, 1980) .

I.2.2.5. Modèles de gélification

Dans la littérature, il existe plusieurs modèles pour décrire le mécanisme de gélification du

carraghénane. Quelque soit le modèle proposé, les différents auteurs sont en accord sur

l’existence de 2 étapes dans le mécanisme de gélification (Meunier, 1999; Rochas and

Rinaudo, 1984b) : la première est la transition pelote-hélice (double ou simple) et la seconde

est l’agrégation des hélices qui conduit à la gélification.

Les deux principaux modèles sont :

- Le modèle de Morris et al. (Morris et al., 1980) donné dans la figure I. 11 montre que

le carraghénane à l’état ordonné a une conformation de double hélice (Dea, Mckinnon

and Rees, 1972) . Puis, ces doubles hélices s’associent entre elles par le biais des

cations spécifiques (Rees, 1969) .

40

Figure I. 11 : Modèle de gélification selon Morris

- Le modèle de Smidsrod (Smidsröd, Andressen, Grasdalen, Larsen and Painter, 1980)

donné dans la Figure I. 12 propose également une transition en structure ordonnée,

mais en simple hélice. La jonction entre les simples hélices se fait comme dans le

modèle précédent par les cations.

Figure I. 12 : Modèle de gélification selon Smidsrod

41

I.3. Les mélanges iota et kappa carraghénane

Plusieurs auteurs ont montré par DSC et rhéologie que dans les mélanges de KC et de IC les 2

polysaccharides forment 2 réseaux indépendants et interpénétrés (Parker et al., 1993; Ridout,

Garza, Brownsey and Morris, 1996) .

A cause de l’absence d’interactions électrostatiques entre eux, l’IC forme un gel à une

température plus haute que le KC, pour différentes conditions ioniques (Parker et al., 1993) .

Ces résultats ont également été observés par Piculell et al., en contaminant l’IC par une petite

quantité de KC (Piculell et al., 1992b) .

En règle générale, les 2 types de mécanisme ne sont jamais observés lorsqu’on a un système

pur sodium ou pur potassium. Dans les systèmes contenant le mélange de sodium et de

potassium avec le sodium en faible quantité, Parker et al. observent toujours 2 types de

mécanisme. Dans les systèmes purs sodium, le KC forme des gels à des températures critiques

très faibles alors que dans les systèmes purs potassium, le gel de KC est plus fort et se forme

en premier, ce qui masque la contribution du gel d’IC. Les comportements rhéologiques à

faible déformation et à la rupture confirment les 2 types de mécanisme de gélification (Parker

et al., 1993) .

42

C- Mélange caséines et polysaccharides

I.1. Comportement et structure des mélanges polysaccharides - protéines

I.1.1. Nature des interactions dans les systèmes polysaccharides-protéines

Les polysaccharides et les protéines peuvent interagir par l’intermédiaire d’interactions

répulsives ou attractives.

Les interactions répulsives résultent majoritairement des effets de volume exclu ou des

interactions électrostatiques.

Les interactions attractives peuvent être des interactions électrostatiques, hydrogènes,

hydrophobes ou de van der Waal (Dickinson, 1998; Schmitt, Sanchez, Desobry-Banon and

Hardy, 1998; Turgeon, Beaulieu, Schmitt and Sanchez, 2003)

En général, ce sont des interactions de types électrostatiques qui prédominent. Ces

interactions électrostatiques sont fortement affectées par les paramètres qui modifient la

densité de charge électrique et donc le pH, ainsi que la force ionique par écrantage des

charges.

I.1.2. Mécanismes

Dans l’eau, le mélange de protéines et de polysaccharides peut conduire à 3 situations : la co-

solubilité, l’incompatibilité thermodynamique et la co-agrégation (De Kruif, Weinbreck and

De Vries, 2004; Schmitt et al., 1998; Syrbe, Bauer and Klostermeyer, 1998; Tolstoguzov,

2003) . Ces différentes situations sont illustrées schématiquement dans la figure I. 13.

43

Figure I. 13 : Différentes situations de mélanges polysaccharides - protéines dans de l’eau.

I.1.2.1. Co-solubilité

Dans les solutions diluées et en absence d’interactions fortes, les biopolymères sont co-

solubles car cela augmente l’entropie (McClements, 2005; Tolstoguzov, 2007; Tolstoguzov,

2003) .

I.1.2.2. Séparation de phase ségrégative

La séparation de phase est due à la préférence de chaque biopolymère d’être entourée par des

molécules de même nature plutôt que par celles de l’autre biopolymère. Le mélange se sépare

alors en deux phases distinctes au-delà d’une concentration critique et chacune des deux

phases contient principalement un des deux biopolymères (Grinberg and Tolstoguzov, 1997;

Polyakov, Grinberg and Tolstoguzov, 1997; Schmitt et al., 1998; Tolstoguzov, 2003) La

séparation de phase ségrégative est due à une incompatibilité thermodynamique ou au

phénomène de déplétion – floculation.

44

La séparation de phase est fortement influencée par la force ionique, le pH, la concentration

des biopolymères, la viscosité et la gélification (Doublier, Garnier, Renard and Sanchez,

2000; Kim, Decker and McClements, 2006; McClements, 2005; Norton and Frith, 2001) .

I.1.2.2.1. Incompatibilité thermodynamique

La séparation de phase ségrégative due à l’incompatibilité thermodynamique se produit si les

interactions protéines-protéines (ou polysaccharides-polysaccharides) sont favorisées par

rapport aux interactions protéines-polysaccharides (Piculell and Lindman, 1992a) ,

conduisant ainsi à deux phases : une phase riche en protéine et une autre phase riche en

polysaccharide (Doublier et al., 2000) .

I.1.2.2.2. Phénomène de déplétion- floculation

Une autre origine de la séparation de phase ségrégative est le phénomène de déplétion –

floculation. Ce phénomène est dû au fait que le centre de masse des polymères est exclu de la

zone de déplétion (Figure I. 14). Quand deux particules s’approchent l’une de l’autre, leurs

couches de déplétion commencent à se chevaucher, ce qui permet aux polymères d’avoir plus

d’espace et donc de gagner de l’entropie, ce qui entraîne des interactions attractives entre

particules conduisant à une séparation de phase (De Bont, Van Kempen and Vreeker, 2002;

Doublier et al., 2000) .

Le phénomène de déplétion peut être influencé par le rapport entre les tailles des 2

biopolymères et leur concentration (Hemar, Tamehana, Munro and Singh, 2001b) . Il se

manifeste généralement dans les suspensions colloïdales en présence de polymères non

adsorbants.

45

Figure I. 14: Mécanisme de l’interaction de déplétion.

I.1.2.2.3. Diagramme de phase

Figure I. 15: Diagramme de phase montrant le comportement d’un mélange de 2 polymères

dans de l’eau à un pH fixe, à une température et une force ionique données.

Généralement, le comportement d’un mélange incompatible est représenté sous la forme d’un

diagramme de phase (Figure I. 15) (Bourriot, Garnier and Doublier, 1999a; Thaiudom and

Goff, 2003; Tolstoguzov, 2003) . La limite entre la zone monophasique et biphasique est

appelée binodale. Les lignes de conjugaisons permettent de connaître les compositions des 2

46

phases à l’équilibre. Tout mélange se trouvant sur cette droite est sujet à une séparation de

phase avec des compositions à l’équilibre identiques, seules les volumes des deux phases

diffèrent.

I.1.2.3. Co-agrégation

La co-agrégation se fait souvent dans un mélange de polymères de charges opposés. Les

agrégats formés restent en suspension dans la solution quand ils sont de petites tailles. Mais,

lorsqu’ils sont grands, ils peuvent précipiter et conduire au phénomène communément appelé

coacervation complexe (Schmitt et al., 1998; Turgeon et al., 2003; Turgeon and Laneuville,

2009) .

I.2. Mélanges carraghénanes et caséines

I.2.1. Travaux antérieurs

Le mélange de caséines et de polysaccharides à des pH plus grands que le pI des caséines

forme un système ternaire : caséine-carraghénane-eau. Les différentes forces impliquées dans

ces systèmes peuvent conduire soit à la formation d’agrégats, soit à la séparation de phase

(Doublier et al., 2000; Tolstoguzov, 2007) . La plupart des études faites sur les mélanges

caséines et polysaccharides ont été résumées dans le tableau I.1 suivant :

- Mélanges micelles de caséines et polysaccharides

N° Caséine-polysaccharide en milieu aqueux Conditions Origines Références

1 Protéines laitières (Micelles de caséine +

protéines sériques) + Pectine (Hautement

méthylé à 62.7%).

Protéines laitières (Micelles de caséine +

protéines sériques) + gomme arabique.

Protéines laitières (Micelles de caséine +

protéines sériques) + arabinogalactane.

20°C, pH 6.0-

10.5, NaCl 0-

0.5M

Incompatibilité

Thermodynamique

(Antonov,

Grinberg,

Zhuravskaya and

Tolstoguzov,

1982)

47

2 Micelles de caséines + Alginate

25°C, pH 7.2 Incompatibilité

Thermodynamique

(Suchkov,

Grinberg and

Tolstoguzov,

1981)

3 Micelles de caséines (2.5%) + Pectine

(faiblement méthylé : 35%, hautement

méthylé : 73%, mélange faiblement

méthylé à 35% et amidé à 20%)

(0.1-0.2%).

60°C, pH

6.7/5.3

Interaction de

déplétion.

(Ambjerg

Pedersen and

Jørgensen, 1991;

Maroziene and

De Kruif, 2000)

4

Micelles de caséines (0.8-4%) +

Galactomannes (gomme de guar, gomme

de caroube) (0.09-0.3%)

5/20°C, pH

6.8/7,

0.08/0.25M

NaCl, sucre

(10-40%)

Interaction de

déplétion.

(Bourriot et al.,

1999a; Bourriot,

Garnier and

Doublier, 1999c;

Schorsch, Jones

and Norton,

1999)

5

Micelles de caséines (1%) +

Carraghénanes (i-, k-, l-formes) (0.12%)

5/20/50/60°C,

pH6.7/7,

0.25M/0.05M

NaCl-0.01M

KCl

Interaction de

déplétion

(Bourriot,

Garnier and

Doublier, 1999b;

Dalgleish and

Morris, 1988;

Drohan,

Tziboula,

McNulty and

Horne, 1997;

Langendorff et

al., 1999;

Langendorff,

Cuvelier, Launay

and Parker,

48

1997;

Langendorff,

Cuvelier, Michon,

Parker and De

Kruif, 2000;

Schorsch, Jones

and Norton,

2000; Spagnuolo,

Dalgleish, Goff

and Morris,

2005)

6

Micelles de caséines (0.1%) +

exopolysaccharides (5%) (Acide lactique

B40)

25°C, pH 6.6

Interaction de

déplétion

(Tuinier and De

Kruif, 1999a;

Tuinier, Ten

Grotenhuis, Holt,

Timmins and De

Kruif, 1999b)

7

Micelles de caséines + Gomme de guar

dépolymérisée

25°C, pH7 Interaction de

déplétion

(Tuinier, Ten

Grotenhuis and

De Kruif, 2000)

8 Micelles de caséines + Carraghénanes Co - agrégation (Dalgleish et al.,

1988; Flett,

Corredig and

Goff, 2010; Ji,

Corredig and

Goff, 2008;

Martin, Goff,

Smith and

Dalgleish, 2006;

Spagnuolo et al.,

49

2005)

Tableau I. 1: Interactions micelles de caséines-polysaccharides en milieu aqueux.

- Mélanges caséinates de sodium et polysaccharides

N° Caséines-polysaccharides en milieu

aqueux

Conditions Origines Références

1 Caséines (k-, a- et b- formes) +

Carraghénanes (k-)

Co - agrégation (Payens, 1972;

Snoeren, 1975;

Snoeren, Both

and Schmitt,

1976)

2

Caséinates de sodium (0.1-0.5%) + gomme

arabique (0.01-5%)

20°C, pH 2-7,

0.5M NaCl,

acidification

lente avec le

GDL

Co - agrégation (Ye, Flanagan

and Singh, 2006)

3 Caséinates de sodium (2%) + Pectine

(0.01-0.08%)

pH 4 Co - agrégation (Matia-Merino,

Lau and

Dickinson, 2004)

4

Caséinates de sodium (6%) + Alginate de

sodium (1%)

23°C, pH 7 Incompatibilité

thermodynamique

(Guido, Simeone

and Alfani, 2002;

Simeone, Molè

and Guido, 2002)

50

5 Caséinates de sodium (2.5%) +

Carraghénanes (k-) (0.5-2%)

pH 7 Incompatibilité

thermodynamique

(Hemar, Hall,

Munro and Singh,

2002)

6 Caséinates de sodium (1 ou 3%) +

Xanthane

20°C Interaction de

déplétion

(Hemar,

Tamehana,

Munro and Singh,

2001a)

Tableau I. 2: Interactions caséinates de sodium-polysaccharides en milieu aqueux.

I.2.1.1. Co - agrégation

Payens (Payens, 1972) a montré par turbidimétrie la formation d’agrégats dans le lait ou les

solutions de caséines isolées, en présence de carraghénanes et à température ambiante.

Snoeren et al. ont confirmé ces résultats en montrant l’existence d’interactions

électrostatiques entre les groupements sulfates chargés négativement du kappa carraghénane

et les résidus peptidiques 97 et 112 chargés positivement de la k-caséine (Snoeren, 1975;

Snoeren et al., 1976) . Dans cette étude, ils ont également montré l’absence d’interaction entre

les fractions a-caséine ou b-caséine et le carraghénane en absence d’ions calcium. Ils ont

supposé que pour ces fractions, la répartition des charges le long des chaînes est beaucoup

plus uniforme, ce qui rend impossible toute interaction de nature électrostatique avec les

carraghénanes. Ils ont également supposé qu’étant donné que la k-caséine se situe

préférentiellement à la surface de la micelle, le même mécanisme d’interaction peut intervenir

entre la micelle de caséines et le kappa carraghénane (Snoeren, 1975; Snoeren et al., 1976) .

Les travaux de Dalgleish et Morris (Dalgleish et al., 1988) montrent que le potentiel zêta de

la micelle de caséines devient plus électronégatif quand la concentration de kappa

carraghénane augmente, ce qui se traduit par une interaction entre le kappa carraghénane

chargé négativement et la micelle de caséines. La présence de cette interaction a également

été montrée par une augmentation du diamètre des micelles de caséines en présence de kappa

carraghénane (Spagnuolo et al., 2005) . La microscopie électronique montre que le kappa

carraghénane se lie à plusieurs micelles de caséines (Martin et al., 2006) .

51

Plus récemment, Ji et al. (Ji et al., 2008) ont montré que sous cisaillement les caséines et les

kappa carraghénanes forment des agrégats dans le lait. Les 2 biopolymères forment des

agrégats suivant différents mécanismes qui dépendent de la concentration de kappa

carraghénane. Les agrégats peuvent être formés directement par la micelle de caséine et le

kappa carraghénane ou pendant la gélification du kappa carraghénane. Selon la concentration

de carraghénane, différentes structures peuvent être obtenues. La distribution des tailles des

particules dépend de la concentration de kappa carraghénane et de la vitesse de cisaillement.

Les propriétés rhéologiques des mélanges sont affectées par la concentration de kappa

carraghénane mais pas par la vitesse de cisaillement. Ces particules restent stables sous

cisaillement. Dès que ces particules sont formées, leurs tailles ne varient plus même si on

applique une déformation. La température initiale du mélange n’influence pas la distribution

de taille des particules. La taille des agrégats est facilement contrôlable quand le mélange est

fait à haute température.

A faible concentration de kappa carraghénane et en dessous de sa concentration de

gélification, des études montrent que les micelles de caséines interagissent avec le kappa

carraghénane à l’état hélice et forment des particules agrégées (Flett et al., 2010; Ji et al.,

2008) . Au dessus de cette concentration, les interactions kappa carraghénane/kappa

carraghénane dominent les interactions micelles de caséines/kappa carraghénane et il forme

un gel qui piège les micelles de caséines (Ji et al., 2008; Martin et al., 2006; Schorsch et al.,

2000) .

I.2.1.2. Séparation de phase ségrégative

Le phénomène de séparation de phase ségrégative entre les micelles de caséines et les

polysaccharides peut être attribué à un mécanisme de déplétion-floculation ou à une

incompatibilité thermodynamique, comme indiqué dans le tableau I. 1. La grande taille de la

micelle de caséines et sa nature colloïdale conduit à penser que ce phénomène est un

mécanisme de déplétion-floculation. En effet, les diagrammes de phase construits à partir de

la théorie de la déplétion-floculation sont cohérents avec les diagrammes de phase

expérimentaux (Tuinier et al., 2000; Tuinier et al., 1999b) . En outre, les différentes

techniques de diffusion montrent que les micelles de caséines deviennent très attractives avec

l’augmentation de la concentration de polysaccharide (Tuinier et al., 1999a) . L’augmentation

52

de la masse molaire du polysaccharide favorise également la démixtion du système (Bourriot

et al., 1999c; Tuinier et al., 2000) .

En travaillant avec le KC ou le IC à l’état désordonné, il a été montré un processus de

séparation de phase dû à la déplétion-floculation des micelles de caséines par les chaînes de

carraghénanes (Bourriot et al., 1999b; Langendorff et al., 2000; Schorsch et al., 2000) . Des

phénomènes de démixtion ont également été remarqués en présence du l-carraghénane qui

n’adopte jamais la conformation ordonnée (Langendorff et al., 1997; Langendorff et al., 2000)

A l’aide des techniques microscopiques (MBCL et MCP), il a été clairement mis en évidence

que le système est biphasique avec une phase riche en caséine et une autre riche en

carraghénane. Lorsque le carraghénane est en état ordonné : le kappa carraghénane ou l’iota

carraghénane s’absorbe sur la surface de la micelle de caséine et peut ainsi limiter la

séparation de phase. Il a été suggéré que les interactions entre la micelle de caséines et les

hélices de carraghénanes sont impliquées dans le gel (Langendorff et al., 2000) . Les résultats

obtenus par Tziboula et al. (Tziboula and Horne, 1999) à une très faible vitesse de

refroidissement (1°C/ 15min) pourraient être interprétés dans ce sens.

D’autres auteurs ont montré que bien qu’il existe des interactions spécifiques entre les

caséines et le carraghénane, l’essentiel des effets synergiques observées dans ces systèmes

proviendraient de séparations figées par la gélification avant que la séparation ne devienne

macroscopique (Garnier et al., 2003; Michon et al., 2003; Ribeiro, Rodrigues, Sabadini and

Cunha, 2004; Schorsch et al., 2000) . Par microscopie confocale, Hemar et al. ont également

mis en évidence ces différents phénomènes (Hemar et al., 2002) .

A notre connaissance, il n’y a pas d’études sur la co-agrégation ou la séparation de phase des

mélanges de caséinates de sodium et de carraghénane.

I.2.2. Les propriétés rhéologiques des mélanges caséines et carraghénane

Plusieurs recherches ont été effectuées sur la rhéologie des mélanges carraghénanes /

caséines.

Dans le lait, Langendorff et al. (Langendorff et al., 1999) ont montré que le carraghénane en

état ordonné interagit avec les micelles de caséines. La présence des micelles de caséines

induit une augmentation très sensible de la température de gélification et de la force du gel.

53

Selon la concentration de l’iota carraghénane différents types de réseaux gélifiés ont été mis

en évidence à partir des dépendances en fréquence. A faible concentration d’iota

carraghénane, il se forme un seul type de réseau pendant le refroidissement impliquant

probablement des ponts entre micelle de caséines et hélices de carraghénane. Ce réseau est

thermiquement plus stable comparé au gel de iota carraghénane pur. Cependant à une

concentration au dessus de 0.2%, Langendorff et al. observent 2 réseaux, un premier réseau

qui correspond à celui décrit plus haut et un deuxième réseau thermoréversible similaire au

gel de carraghénane sans protéine (Langendorff et al., 1999; Langendorff et al., 1997) .

Quand aux mélanges de micelles de caséines et de kappa carraghénane, plusieurs études

montrent que le kappa carraghénane se lie aux micelles de caséines et que le système peut

conduire à une gélification même si, dans ces conditions, le kappa carraghénane pur n’est pas

un gel. Les propriétés du gel dépendent alors très nettement de la force ionique et de la

concentration de carraghénane (Drohan et al., 1997; Langendorff et al., 2000; Puvanenthiran,

Goddard and McKinnon, 2003; Trcková, Stetina and Kánský, 2004) . Dans différents

mélanges, l’ajout de micelles de caséines augmente le module élastique. Les résultats trouvés

par Alexander et Dalgleish confirment les études précédentes à savoir que les carraghénanes

se lient aux micelles de caséines et qu’un gel mixte est formé (Alexander and Dalgleish,

2007) .

Il y a peu d’études faites sur les mélanges de caséinates de sodium et de carraghénane. Lynch

et al. ont étudié la gélification des mélanges de carraghénane avec des caséines individuelles

ou des caséinates de sodium (SC) (Lynch and Mulvihill, 1994a; Lynch and Mulvihill, 1994b;

Lynch and Mulvihill, 1996) . L’ajout de caséines au kappa carraghénane modifie très

nettement les propriétés rhéologiques des gels en absence et en présence de calcium. Lynch et

Mulvihill ont montré qu’en absence de calcium, la force du gel dépend du type de caséines :

k-caséine < b-caséine ~ SC < a-caséine. Le module élastique en présence de k-caséine

serait plus élevé parce que les hélices de carraghénanes s’associent ensemble via les caséines.

La faible augmentation des modules élastiques en présence d’a-caséine ou de b-caséine

serait due au phénomène de séparation de phase. D’autre part en présence de calcium, ils

observent toujours une augmentation de module élastique en présence de k-caséine, mais une

diminution de la force du gel en présence d’a-caséine ou de b-caséine(Lynch et al., 1994b) .

En l’absence de caséinates de sodium, la température critique de la gélification du kappa

carraghénane est de 7°C, mais à 20g/L de caséinate de sodium, la température critique de

54

gélification du système augmente jusqu’à 12°C. Par contre, la concentration de protéine n’a

pas d’effet sur les modules élastiques. Ceci est dû à la grande affinité entre le calcium et les 2

fractions de caséines. Les mêmes résultats ont été obtenus en remplaçant le kappa

carraghénane par l’iota carraghénane (Lynch et al., 1994a; Lynch et al., 1996) .

Oakenfull et al. (Oakenfull, Miyoshi, Nishinari and Scott, 1999) ont étudié les mélanges de

kappa carraghénane et de caséinate de sodium en utilisant la rhéologie et la DSC. Ils ont fait

varier d’une part, la concentration de kappa carraghénane pour une concentration de

caséinates de sodium fixée (10g/L) ou d’autre part, la concentration de protéine en maintenant

fixée la concentration de kappa carraghénane (5g/L). Les températures critiques mesurées à

l’aide de la rhéologie ou de la DSC sont les mêmes et augmentent avec la concentration de

kappa carraghénane. On s’attend à cette augmentation parce que la poudre qu’ils ont utilisée

pour cette étude contenait des ions potassium, et que lorsque la concentration de kappa

carraghénane augmente en solution, la concentration de potassium augmente également.

L’ajout de caséinates de sodium jusqu’à 50g/L a peu d’effet sur la température critique : une

legère diminution de 24°C à 22°C jusqu’à 10g/L de caséinates de sodium, puis une légère

augmentation à 24°C pour 50g/L. Les mesures de DSC montrent également que l’enthalpie de

transition ne dépend pas du caséinate de sodium. Pendant la fonte, la transition s’étale sur une

large gamme de température ce qui est la signature d’un processus non coopératif. A une

concentration de caséinates de sodium donnée, le module élastique augmente avec la

concentration de kappa carraghénane. A une concentration de kappa carraghénane fixée, le

module élastique diminue légèrement jusqu’à 5g/L, puis augmente.

Pour un mélange à 5g/L de kappa carraghénane et 1g/L de caséinates de sodium, Oakenfull et

al. observent un processus à 2 étapes pendant la fonte et des températures critiques de fonte

d’environ 45°C peu dépendantes de la concentration de caséinates de sodium. Au vue de leurs

résultats, ils suggèrent que dans le mélange et au dessus de la transition pelote-hélice, une

fraction de kappa carraghénane se lie au caséinate de sodium pendant qu’une autre fraction

reste libre. En dessous de cette température critique, ils supposent qu’on a des hélices libres et

des hélices liées au caséinate de sodium. Ainsi pendant la gélification du système, il y aurait

formation de 2 réseaux interpénétrés : un réseau d’hélices de kappa carraghénane pur et un

autre réseau qui impliquerait des interactions entre les caséinates de sodium et les hélices de

kappa carraghénane, selon, le modèle suivant (Figure I. 16) (Oakenfull et al., 1999; Singh,

Tamehana, Hemar and Munro, 2003) .

55

Figure I. 16: Modèle de gélification des systèmes caséinate de sodium (SC) et kappa

carraghénane (KC) (Oakenfull et al., 1999) .

A : immédiatement après mélange de SC et de KC.

B : avec le temps, une co-agrégation entre le KC sous forme pelote et le SC.

C : pendant le refroidissement, le KC agrégé au SC et le KC libre passe de la conformation

pelote à hélice.

D : avec le temps, les hélices de KC libres et les hélices de KC agrégées au SC se lient entre

elles et forment un réseau mixte.

56

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Chapitre II : Matériels et méthodes

72

II.1 Matériels

II.1.1. Préparation des échantillons

II.1.1.1. Caséinate de sodium

La poudre de caséinate de sodium (SC) utilisée dans cette étude a été fournie par DMV

international-France. Le SC est d’abord mis en solution dans de l’eau Millipore ultra pure

contenant 200ppm d’azoture de sodium pour prévenir tout risque de contamination

bactériologique. Pour améliorer la solubilisation de la protéine, la solution est agitée et

chauffée à 70 °C pendant 2 heures. Ensuite, nous procédons à l’étape de purification

(HadjSadok, Pitkowski, Benyahia, Nicolai and Moulai-Mostefa, 2008) . La solution ainsi

obtenue est centrifugée pendant 3 heures à 50000g. A la fin de l’opération, il apparaît un

précipité au fond qui correspond à la matière insoluble, une couche surnageante riche en

matière grasse et entre ces deux phases se situe la phase riche en protéine. Cette phase

protéique est dialysée plusieurs fois contre de l’eau millipore ultra pure contenant 200ppm

d’azoture de sodium pour extraire les impuretés (sels). Puis, la solution obtenue est amenée à

la concentration en sel souhaitée. Ensuite, elle est chauffée à 70°C pendant 3 heures : il

apparaît au fond un sédiment qui contient moins de 5% de la protéine mise en solution. Puis,

cette solution est ultracentrifugée pendant 1 heure à 50000g et le surnageant est récupéré. Le

pH de la solution est réglé à 7 et la concentration en protéine est déterminée par spectroscopie

UV à 280nm, avec un coefficient d’extinction molaire de 0.81 mol.g-1.cm-1. Pour toutes les

analyses en diffusion de lumière, la solution est filtrée sur 0.45mm pour enlever les impuretés.

Poudre de SC

mg/100g ES (%) MAT (%)

Na Ca K

1500 56 10 93 88.6

Tableau II. 1 : Composition chimique de la poudre de caséinate de sodium

Les images confocales des solutions traitées et non traitées de SC sont données sur la figure

suivante (figure II.1) :

73

Figure II. 1 : Photographie en microscopie confocale des solutions de caséinate de sodium

respectivement non traitées et traitées. Taille des images 160mm.

II.1.1.2. Submicelles de caséines

La poudre de caséines micellaires a été fournie par l’INRA de Rennes. Elle a été dispersée

dans de l’eau Millipore ultrapure contenant 200 ppm d’azoture de sodium. Cette solution à pH

6 a ensuite été mélangée avec une solution concentrée de triphosphate de sodium à pH 6 dans

des quantités permettant d’obtenir les concentrations de caséines et de triphosphates de

sodium désirées. On obtient ainsi des submicelles de caséines qui peuvent s’agréger au cours

du temps. La vitesse d’agrégation augmente avec la température. A 20°C, elle est très lente

(Pitkowski, 2007). Cette agrégation est très dépendante de la température et de la

concentration en protéines et peut être considérée comme négligeable à température ambiante.

Poudre de caséine

micellaire

mg /100g ES (%) MAT (%)

Na Ca K

23 2773 69 96.5 88

Tableau II. 2: Composition chimique de la poudre de caséine micellaire

II.1.1.3. Carraghénanes

La poudre de kappa carraghénane (KC) a été fournie par Cargill (lot HMRXZ) ainsi que celle

de iota carraghénane (IC) (lot HMRXSI). La SEC montre que les 2 poudres contiennent entre

70-90% de carraghénane. La RMN du proton montre que la poudre HMRXZ contient environ

95% de kappa carraghénane et 5% d’iota carraghénane tandis que la poudre HMRXSI

contient 95% de iota et 5% kappa. Le carraghénane lyophilisé est sous une forme sodique

(KC) ou potassique (IC). Sa mise en solution n’est pas immédiate. Il faut tout d’abord le

74

mettre en suspension dans de l’eau Millipore ultra pure contenant 200ppm d’azoture de

sodium par simple agitation pendant 2 heures. Le pH de la solution est ensuite ajusté à 9 pour

empêcher tout risque d’hydrolyse pendant le traitement thermique. Puis, elle est chauffée

pendant 3 heures à 70 °C pour permettre la solubilisation complète du carraghénane. La

solution à 100mM NaCl et à pH 7 ou 6 est dialysée plusieurs fois contre de l’eau millipore

respectivement à pH 7 ou 6, contenant 200ppm d’azoture de sodium et 100mM NaCl, afin

d’éliminer toute trace de sels résiduels parasites (en particulier le potassium et le calcium).

Pour toutes les analyses en diffusion de lumière, la solution est filtrée sur 0.45mm.

Poudre de kappa

carraghénane

mg/100g ES (%)

Na Ca K

5500 71 300 90

Tableau II. 3: Composition chimique de la poudre de kappa carraghénane purifiée

Poudre de iota

carraghénane

mg/100g ES (%)

Na Ca K

3820 120 6480 73

Tableau II. 4: Composition chimique de la poudre de iota carraghénane purifiée

II.1.2. Préparation des mélanges caséines/ carraghénanes

Les caséines sont mélangées à température ambiante avec la solution de carraghénane de

sodium à la concentration de sel souhaitée (NaCl, KCl ou triphosphate de sodium (NaTPP)), à

pH 7 ou pH 6, dans le but de voir l’effet du sel ou du pH. Puis, le mélange est chauffé à 60 °C

(pour les solutions avec du NaCl) ou à 80°C (pour des solutions avec du KCl) pendant 5 min.

Les concentrations en caséines dans les mélanges finaux varient de 0 à 100g/L et celles en

carraghénane de 0 à 15 g/L. L’ordre d’addition des ingrédients n’influence pas les propriétés

fonctionnelles finales des produits.

75

II.2. Méthodes

Les propriétés structurales et mécaniques des systèmes mixtes ont été déterminées grâce à la

diffusion statique de la lumière en milieu turbide (Brown, 1996) , la microscopie confocale à

balayage laser et la rhéologie. Cette partie présente d’une part, les protocoles de mesure et

d’autre part les techniques de caractérisation sans exposer en détails les principes théoriques

de ces dernières, voir pour cela des ouvrages de référence : la diffusion de la lumière (Brown,

1996; Nicolai, 2007) , la microscopie confocale (Prasad, Semwogerere and Weeks, 2007;

Webb, 1996) et la rhéologie (Macosko and Mewis, 1994) .

II.2.1. Protocole

II.2.1.1. Dosage des caséines

Ces mesures ont été réalisées par Spectroscopie UV-visible (Unicam UV2 UV-Vis).

La concentration de caséines (C) a été déterminée à partir de l’absorbance mesurée à 280nm

(A280nm) dans une cuve de largeur (L) avec un coefficient d’extinction molaire (e) de 0.81

mL.mg-1.cm-1 (valeur déterminée par étalonnage et conforme à celle trouvée dans la

littérature) (Oliva, Llabres and Farina, 2001) . La loi de Beer-Lambert nous donne la

concentration selon l’équation (II.1) :

L

Ac nm

e280= II. 1

II.2.1.2. Dosage des carraghénanes

La concentration de carraghénane est déterminée par chromatographie d’exclusion stérique

(SEC) en prenant comme incrément d’indice de réfraction pour le KC 0.145mL/g et pour le

IC 0.127mL/g (Viebke, Borgström and Piculell, 1995) . On a la relation :

RD Minjectée II. 2

76

KRD : constante d’appareillage

Minjectée : masse injectée

: Incrément d’indice de réfraction

I.2.1.3. Marquage des caséines

La protéine est marquée de manière non covalente à pH 7 par la rhodamine B isothiocyanate

(RITC), dont les maxima d’excitation et d’émission se situent respectivement à l= 543 et 580

nm dans le méthanol. La RITC se fixe au moyen d’interactions hydrophobes sur les

groupements apolaires de la protéine. Le marquage s’effectue par ajout de la solution de RITC

directement dans le mélange de caséines et de KC de manière à ce que la concentration en

RITC soit à 5ppm dans l’échantillon. La concentration en rhodamine de la solution mère est

déterminée par spectroscopie UV-Visible à la longueur d’onde d’absorbance de 555nm en

utilisant un coefficient d’extinction molaire de 0.21 mol.g-1.cm-1.

II.2.1.4. Marquage des carraghénanes

Nous avons essayé différentes méthodes pour marquer le carraghénane : le dosage par la

méthode Dubois (Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers and Smith, 1956) , le marquage covalent

au DTAF (Helbert, Chanzy, Husum, Schülein and Ernst, 2003) et la réfractométrie. Ces

différentes méthodes n’ont pas été concluantes pour les raisons suivantes:

- par la méthode Dubois, en présence de protéines, le pic d’absorbance du carraghénane

marqué disparaissait, donc il devenait impossible de déterminer la concentration du

carraghénane dans le mélange.

- par le marquage covalent du carraghénane avec le DTAF, les mesures obtenues étaient

très aléatoires : un même mélange pouvait présenter un comportement associatif ou

ségrégatif.

- par la réfractométrie, l’incrément d’indice de réfraction du mélange était supérieur à la

somme des incréments d’indice des 2 solutions de départ qui étaient la solution de SC

77

et la solution de KC. Il y avait donc une contribution supplémentaire dans le mélange

qui augmentait la valeur de l’incrément d’indice totale, mais nous n’avons pas pu

déterminer cette contribution.

Aussi, pour déterminer la concentration du carraghénane dans le mélange, nous avons utilisé

les mesures viscosimétriques puisque la viscosité du carraghénane est directement corrélée à

sa concentration (Croguennoc, Meunier, Nicolai and Durand, 2000).

II.2.2. Techniques expérimentales

II.2.2.1. Techniques de diffusion de la lumière

La technique de diffusion de la lumière permet d’avoir des informations quantitatives tant du

point de vue statique que dynamique, telles que la masse molaire, la taille, la structure, les

interactions, la flexibilité et la diffusion des particules. C’est une méthode d’analyse non

destructive et bien adaptée à l’étude des systèmes colloïdaux et des phénomènes d’agrégation.

La diffusion de la lumière classique (diffusion statique et dynamique) exige que les

échantillons observés soient transparents pour éviter les phénomènes de diffusion multiple.

Dans le cas des échantillons turbides, nous avons utilisé un appareillage spécifique permettant

d’éliminer par corrélation croisée la diffusion multiple. Son principe sera détaillé par la suite.

II.2.2.1.1. Diffusion statique de la lumière classique

Le principe général consiste à envoyer une source lumineuse sur un échantillon de volume

diffusant V, placé dans une cellule contenant un fluide ayant le même indice de réfraction que

le verre (Figure II. 2).

78

Figure II. 2: Schéma du principe de la diffusion de la lumière

Le faisceau incident, de longueur d’onde l0 et de vecteur d’onde incidente rk i est diffusé par

l’échantillon. Le vecteur d’onde de la lumière diffusée dans la direction q (angle

d’observation), à la distance R de l’échantillon estrk s . Pour la diffusion élastique ou quasi-

élastique, la norme de ces vecteurs est pratiquement la même et vaut ki=ks=2πn/l0 où n est

l’indice de réfraction du milieu.

On définit le vecteur de diffusion comme :

II. 3

et sa norme vaut :

II. 4

Les fluctuations d’intensité de la lumière diffusée proviennent essentiellement des

fluctuations de densité et de température. Ces dernières souvent négligeables lorsqu’on est en

présence d’un liquide pur. Si on considère maintenant une solution, il faut ajouter les

fluctuations de concentration. Pour des concentrations suffisamment faibles, les fluctuations

de densité de la solution sont équivalentes à celles du solvant pur, l’excès d’intensité diffusée

n’est alors dû qu’aux fluctuations de concentration.

r r rq k ki s= -

qn

=4

20

pl

qsin( / )

79

En diffusion statique, on détermine l’intensité diffusée moyenne dans le temps. L’intensité

relative diffusée (Ir) par la solution est définie comme l’intensité diffusée moyennée (Im)

moins l’intensité diffusée par le solvant (Isol) divisée par l’intensité diffusée par une référence

(Iréf) (par exemple le toluène) :

)()( 1 qSC

KCRTI

III

réf

solmr

-

¶¶

=-

=p

II. 5

Avec réf

réf

a Rn

n

c

n

N

nK

1422

4

22

÷÷ø

öççè

æ÷ø

öçè

æ¶¶

=lp

Où

- K : constante d’appareil correspond au pouvoir de diffusion ou contraste des particules

- C : concentration de particules

- R : constante des gaz parfaits

- T : température absolue (K)

- C¶

¶p : compressibilité osmotique

- S(q) : facteur de structure, combinaison des facteurs de structure inter et intra moléculaire

des particules considérées

- n : indice de réfraction du milieu qui est proche de celui du solvant pour une solution diluée

- nréf : indice de réfraction de la référence

- C

n

¶¶

: incrément d’indice de réfraction

- Na : nombre d’Avogadro

- Rréf : rapport de Rayleigh de la référence qui permet d’obtenir des valeurs absolues

d’intensité diffusée.

Pour les solutions diluées, la compressibilité osmotique C¶

¶p peut être décrite sous la forme

d’un développement du viriel :

( )K++=¶¶

CMAM

RTC

w

w

2211p II. 6

Toujours pour les solutions diluées (C tendant vers 0), il est possible de négliger les

interactions entre particules et on obtient alors :

80

( )qSKCMI wr = II. 7

Le calcul de S(q) nécessite de connaître la fonction de corrélation de paire g(r) de l'agrégat.

Ceci est possible dans le cas d'agrégats avec des géométries simples et bien déterminées mais

la plupart du temps ce calcul est impossible. Des simplifications sont cependant possibles

dans certains cas limites en fonction de l’échelle sondée, comme le suggère la figure II.3 :

Figure II. 3: Schématisation de l’échelle spatiale sondée en fonction de q et de la taille des particules ou agrégats considérés

qRg < 1

On obtient par des développements limités la relation suivante :

31)(

22gRq

qS -= II. 8

qRg >> 1

Les processus d’agrégation en solution conduisent le plus souvent à la formation

d’objets ayant à la fois des structures et des distributions autosimilaires. On parle alors d’objet

fractal, caractérisé par une dimension fractale Df. La masse (M) varie alors avec la taille Rg

selon la relation :

( ) fD

gRM µ II. 9

Le facteur de structure suit aussi une loi de puissance :

fDqqS

-µ)( II. 10

avec 1 < Df < 3

Exemples :

- Pour une pelote de polymère linéaire gonflée en bon solvant : Df = 5/3.

- Pour une pelote gaussienne en solvant q, Df = 2

81

Dans le cas de solutions concentrées, on peut également utiliser les mêmes équations, mais on

détermine alors une masse apparente Ma et un rayon apparent Ra. Le facteur de structure

prend alors en compte les interactions entre les particules.

II.2.2.1.2. Diffusion dynamique de la lumière

Contrairement à la diffusion statique où l’on mesure la valeur moyenne de l’intensité en

fonction du temps, la diffusion dynamique est basée sur l’étude des fluctuations temporelles

d’intensité autour d’une valeur moyenne qui reflètent les fluctuations temporelles de

concentration et de densité des particules en solution.

En pratique, on peut mesurer avec un corrélateur la fonction d’autocorrélation (G2 (q, t))

associée aux fluctuations d’intensité diffusée au cours du temps t. Elle mesure la perte de

corrélation du signal avec le temps. Si les particules sont grandes, le signal change lentement

et la corrélation persiste longtemps. Dans le cas où les particules sont petites et bougent

rapidement, la corrélation est plus rapidement perdue.

Elle est définie par :

( ) ( ) ( )tI.0It,qG2 = II. 11

Après normalisation par l’intensité moyenne, on définit g2 (q, t) par :

( ) ( )( ) 22

2t,qI

t,qGt,qg = II. 12

On ne peut pas relier les fluctuations de l’intensité directement aux mouvements des unités de

diffusion. Celles-ci sont liées aux fluctuations du champ électrique diffusé. Lorsque la

distribution des fluctuations de l’intensité est gaussienne autour de sa valeur moyenne, la

fonction d’autocorrélation de l’intensité, g2(q, t), est reliée à la fonction d’autocorrélation du

champ électrique, g1(q, t), par la relation de Siegert :

( )212 )t,q(g.a1)t,q(g += II. 13

où a représente l’intercepte et dépend des caractéristiques internes de l’appareillage utilisé.

C’est une constante comprise entre 0 et 1.

82

La fonction g1 (q, t) est uniquement fonction de fluctuations de concentration qui sont liées à

différents phénomènes : le mouvement de diffusion, de rotation ou la dynamique interne.

Quand on sonde les objets à qRg ≤ 1 g1 (q, t) prend une forme très simple pour des solutions

monodisperses dilués :

÷ø

öçè

æ-=tt

tqg exp),(1 II. 14

Avec 21qD ´=

t

Sachant que pour une sphère de rayon R, le coefficient de friction à dilution infinie pour une

molécule de soluté est f0=6phsR, avec hs, la viscosité du solvant, on définit pour une

particule de forme quelconque, un rayon hydrodynamique effectif Rh comme le rayon d’une

sphère de même coefficient de diffusion D0 selon la formule de Stokes-Einstein :

hs

B

R

TkD

ph60 = II. 15

La diffusion dynamique permet d’accéder au rayon hydrodynamique des particules. Dans le

cas où les particules sont polydisperses ou s’il existe plusieurs populations de particules, les

fonctions de corrélation expérimentales peuvent être décrites par une distribution de temps de

relaxation :

ò -= tt

t dt

Atg )exp()()(1 II. 16

Des programmes d’analyse existent pour traiter ces distributions et déterminer A(t).

Le programme GEX permet d’ajuster les distributions larges et continues de temps de

relaxation que REPES a tendance à découper en plusieurs pics. L’expression de A(t) est la

suivante :

( )( )sp

s

A

s

a

p

a

p

G

÷÷

ø

ö

çç

è

æ÷÷ø

öççè

æ-

=

--

tt

tt

t

exp1

II. 17

où p, s et ta sont des paramètres ajustables, ta détermine la position de la distribution sur l’axe

des temps de relaxation, p et s déterminent la largeur de la distribution et l’asymétrie de la

courbe. G représente la fonction gamma.

83

II.2.2.1.3. Diffusion statique de la lumière en milieu turbide (3DLS)

La diffusion classique de la lumière nécessite que les échantillons soient transparents c’est-à-

dire que le phénomène de diffusion multiple n’existe pas : l’intensité collectée par le détecteur

n’a été diffusée que par une seule particule. Dans les solutions turbides, un photon diffusé de

façon multiple ne porte pas la même information qu’un photon diffusé une seule fois :

Imesurée = Idiffusion simple + Idiffusion multiple II. 18

Les techniques classiques qui permettent de lier l’intensité diffusée (diffusion simple) à la

structure des systèmes restent donc parfaitement valables pour le traitement de l’intensité

diffusée mesurée en 3DLS, une fois la diffusion multiple soustraite et la correction pour la

turbidité de l’échantillon prise en compte.

Pour obtenir des informations sur la structure d’une solution turbide, il faut donc soustraire les

photons diffusés de façon multiple.

Figure II. 4: Schéma du principe de la diffusion de lumière en milieu turbide

En pratique, comme le montre le schéma représenté sur la figure II. 4, deux faisceaux L1 et

L2 provenant de la même source traversent la solution et sont détectés par deux

photomultiplicateurs PM1 et PM2. La corrélation entre la lumière diffusée par les deux

faisceaux est :

G2(t) = <IL1(t).IL2(t)> II. 19

Si on a seulement de la diffusion simple de lumière, l’intensité mesurée par les deux PM sera

en phase. Par contre, quand le phénomène de diffusion multiple intervient, la phase mesurée

par les deux PM sera décorrélée pour les photons diffusés de multiple fois. L’intercepte

d L2 diffusion multiple

d L1 diffusion simple

d L2 diffusion simple

l=680nm

LASER

PM2

PM1

L1

L2

84

mesuré G2(t®0)mesuré sera alors inférieur à l’intercepte idéal mesuré pour une solution

transparente. La fraction de photons diffusés une fois s’écrit donc sous la forme :

5.0

0

5.0

2

2

)0(

)0(÷÷ø

öççè

æ=÷÷

ø

öççè

æ

®

®=

B

B

tG

tGF

idéal

mesurés

II. 20

où B est l’intercepte de la fonction de corrélation croisée de la solution étudiée et B0 celui

d’un échantillon référence transparent.

Les mesures de diffusion de la lumière réalisées au cours de cette étude ont été effectuées à

20°C en utilisant la technique de diffusion en milieu turbide. L’appareil utilisé est une version

commerciale de l’instrument de corrélation croisée 3D (LS Instrument, Fribourg, Suisse). La

source lumineuse est un laser diode de longueur d’onde 680 nm.

II.2.2.2. Microscopie confocale à balayage laser en mode fluorescence

En microscopie à fluorescence classique, on a une perte de résolution de l’image due à

l’excitation des fluorochromes se situant hors du plan focal. En effet, les fluorochromes sont

excités par le laser sur toute l’épaisseur de la préparation, ce qui se traduit par une image

contaminée par un bruit de fond. Le principe de la microscopie confocale à balayage laser

(MCBL en français et CLSM pour confocal laser scanning microscopy en anglais) est

d’éliminer la lumière provenant des plans défocalisés qui parasite le plan focal.

Le principe de l’appareil est donné sur la figure (figure II. 5) :

85

Figure II. 5: Schéma de principe du microscope confocal à balayage laser

Le rayon laser excitateur pénètre dans l’échantillon préalablement marqué par des

fluorochromes, auparavant choisis en fonction de leurs capacités à se fixer sur les sites

particulièrs d’une structure ou d’un objet d’intérêt. Lors de l’impact optique, il y a émission

des rayons lumineux provenant de différents plans de la préparation. Grâce à un diaphragme

variable (pinhole), il est possible de sélectionner les rayons émis par un seul plan de la

préparation et d’éliminer ainsi le signal provenant des autres plans. Ces rayons réfléchis sont

filtrés en fonction de leur longueur d’onde, puis détectés par des photomultiplicateurs. Le

signal reçu est enfin converti en signal numérique conduisant à la création d’une image.

La MCBL comprend donc des lasers, des éléments optiques, des dispositifs de balayage

rapide et des ordinateurs qui traitent numériquement les images.

En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans

l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut

reconstruire une représentation tridimensionnelle de l’objet.

Laser

Photomultiplicateur

Filtre d’émission

Pinhole de sortie

Miroir dichroïque

Objectif

Plan focal Échantillon

Pinhole d’entrée

Z

86

Les clichés de MCBL ont été réalisés avec un microscope inversé Leica TCS-SP2 (Leica

Microsystems Heidelberg, Allemagne) équipé de 3 lasers qui regroupent 6 raies : 458, 488,

514, 543 et 633 nm et en utilisant différents objectifs à immersion eau ou huile. Pour nos

observations, l’objectif à immersion huile n’est pas adéquat parce que la différence d’indice

de réfraction entre le milieu d’immersion et la préparation est trop grande. L’objectif HCx PL

APO 63x 1,2W à immersion eau a été utilisé, bien qu’il ait un champ d’observation réduit, car

il a une meilleure résolution.

La valeur du gain a été choisie dans un domaine où le bruit est négligeable et où il n’y a pas

de saturation. On est entre 560 et 580V pour 5 ppm de rhodamine RITC.

Le mode xyz a été choisi pour sonder l’échantillon dans les 3 dimensions. En général, pour

des mesures quantitatives, il faut se mettre en xyz de façon à éviter les effets interfaciaux sur

la structure (il faut regarder dans le cœur de l’échantillon).

La protéine marquée est observée en utilisant un laser à la longueur d’onde de 543nm (le

PMT : émission enregistrée entre 555 et 700 nm). Les solutions de référence ou les mélanges

préalablement chauffés à 60°C pendant 5 min sont placées dans les puits de labtek et

regardées immédiatement. Les observations sont ensuite faites à 20°C à différents endroits de

l’échantillon pour moyenner.

II.2.2.3. Rhéologie

Les produits peuvent être caractérisés rhéologiquement de différentes manières, notamment

en régime oscillant ou en régime permanent.

II.2.2.3.1. Etude en régime permanent

L’ensemble des forces (F) appliquées sur l’échantillon induit une contrainte de cisaillement

(s) qui est parallèle à la surface de la couche du produit (S). La variation de déplacement des

couches de matériau les unes sur les autres correspond à la déformation g. Sa dérivée par

rapport au temps est le gradient de vitesse, autrement appelé taux de cisaillement.

87

II.2.2.3.2. Etude en régime oscillant

Elle permet de déterminer les propriétés viscoélastiques d’un matériau (module de

conservation G’ et de perte G’’) en appliquant à l’échantillon une déformation sinusoïdale de

pulsation w (en rad.s-1), et donc, de fréquence (en Hz) :

g(t)=g0 sin(wt) II. 21

La contrainte associée est alors de la forme :

s(t)=s0 sin(wt+d) II. 22

où d désigne l’angle de déphasage entre la déformation et la contrainte et est appelé également

angle de perte. Pour une déformation imposée suffisamment faible (g0< 10-2), le module

complexe G*, défini comme le rapport entre la contrainte s(t) et la déformation maximale g0

comporte une partie réelle et une partie imaginaire.

La partie réelle représente le module de conservation G’ qui est en phase avec la déformation

et la partie imaginaire correspond au module de perte G’’ qui est en quadrature de phase avec

la déformation. Ce qui nous donne :

dgs

cos'0

0=G

II. 23

dgs

sin''0

0=G

II. 24

- Pour un solide parfaitement élastique : d et G’’ sont nuls.

- Pour un liquide visqueux idéal, d=p/2 et G’ est nul.

la tangente de l’angle de perte tand est reliée à G’ et G’’ par :

d′′

′ II. 25

Le comportement mécanique de l’échantillon peut être étudié en faisant varier la fréquence

des oscillations, ce qui permet d’observer les différents temps de relaxation. Cette technique

est particulièrement intéressante pour étudier des phénomènes d’agrégation et de gélification.

Pour sonder un matériau dans son état d’équilibre il faut rester dans le domaine linéaire,

domaine dans lequel la déformation ne modifie pas la structure.

88

II.2.2.3.3. Appareillage et protocole expérimental

Les rhéomètres à contrainte imposée qui ont été utilisés sont : AR2000 et ArG2 (TA,

instruments). Ils possèdent un système de régulation de température à effet Peltier. Afin

d’éviter les problèmes d’évaporation à haute température, de l’huile de paraffine est ajoutée

sur les échantillons aqueux et est maintenue en place grâce à un piège en silicone. La

principale différence entre ces 2 rhéomètres est un palier magnétique pour l’ArG2 au lieu

d’un palier à air pour AR2000, ce qui lui donne une sensibilité plus grande. Au préalable,

différents tests ont été effectués pour déterminer les conditions optimales de mesure des

échantillons. Nous avons ainsi regardé l’effet du type de géométrie, du gap et de la vitesse sur

la mesure.

II.a. Influence de la géométrie et du gap

Les tests sont faits à une concentration de 50g/L de SC et 1.5g/L de KC avec 0.1M de NaCl.

On effectue une rampe de température de 35 à 5°C dans les mêmes conditions de déformation

(1%), de fréquence (1Hz) et de vitesse (-1°C/min) et on suit l’évolution du module de

conservation G’ en fonction de la température.

89

T (°C)

5 10 15 20 25 30

G' (

Pa)

0.1

1

10

100

cône-plan,2°,40mm

cône-plan,2°,60mm

plan-plan, 40 mm

couette, 14-15mm

T (°C)

5 10 15 20 25 30

G' (

Pa)

0.1

1

10

100

gap 500mm

gap 1000mm

gap 1500mm

Figure II. 6: Evolution de G’ en fonction de la

température de refroidissement pour 4

géométries différentes.

Figure II. 7: Evolution de G’ en fonction de la

température de refroidissement dans la

géométrie plan-plan pour 3 gaps différents.

En comparant les évolutions de G’ obtenues pour chacune des géométries (cône-plan (27 mm),

plan-plan (gap de 1mm) et couette (gap de 10mm) (voir figure II.6), nous constatons que pour

la géométrie cône-plan, au lieu d’avoir une augmentation continue de G’, nous observons une

chute brutale de G’. L’effet est plus accentué avec le cône-plan car on a un petit entrefer de

27mm. Par contre, avec la géométrie plan-plan et le couette, le pic disparaît complètement car

l’entrefer est plus grand, ce qui permet de diminuer les effets d’interface.

Le même type de rampe de température est effectué sur le mélange avec la géométrie plan-

plan en choisissant des gaps différents. L’évolution de G’ obtenue est représentée sur la figure

II. 7. Nous n’observons pas de pic et le module augmente avec le gap puis se stabilise avec un

gap d’environ 1 mm. Donc, à cette valeur, le module ne dépend plus du gap.

Cette étude a permis de montrer que la géométrie optimale de mesure pour nos systèmes est

une géométrie plan-plan avec un gap de 1mm ou le couette avec un gap de 10 mm.

90

II.b. Influence de la vitesse de rampe

T°C

0 5 10 15 20 25 30

G'

(Pa

)

10-1

100

101

102

0.1°C/min

1°C/min

5°C/min

Figure II. 8: Evolution de G’ pendant la

gélification (rond) et la fonte (carré) à

différentes vitesses de rampe indiquées sur la

figure (SC 3 g/L, KC 10g/L, 0.1M NaCl et pH

7).

Les modules et les températures critiques de transitions ne peuvent être considérés comme

indépendants de la vitesse qu’à partir de 1°C/min. Nous voyons clairement que la vitesse de

5°C/min est trop rapide.

Aussi, nous avons décidé de travailler à 1°C/min.

En conclusion, toutes les mesures ont été effectuées soit avec une géométrie plan-plan de 40

mm et un gap de 1 mm, soit avec une géométrie couette et un gap de 10 mm, et avec une

vitesse de 1°C/min, en s’assurant au préalable qu’on était dans le domaine linéaire (à l’aide

des rampes en contrainte).

91

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93

Chapitre III : Etude des mélanges SC et KC sous forme pelote

94

III.1. Morphologie des mélanges

III.1.1. Observation des images prises immédiatement après mélange (t0)

Les mélanges sans ou avec 0.1M NaCl (ou 0.1M KCl) et à pH 7 sont observés par

microscopie confocale à balayage laser (MCBL). Les protéines sont marquées avec la

rhodamine RITC à 5ppm et sont colorées en blanc sur les photos. Les mélanges de KC et SC

ont été préparés pour des concentrations de SC allant jusqu’à 100g/L et des concentrations de

KC allant jusqu’à 15g/L. Les images prises immédiatement après mélange à 20°C sont

montrées dans les figures III. 1, 2, 4 et 7. Toutes les images confocales ont une taille de 160

mm, sauf indication contraire. Les clichés des mélanges obtenus en utilisant différents

protocoles d’agitation (manuelle ou vortex) et différentes températures de chauffage (50-

80°C) sont identiques.

III.1.1.1. Système sans sel ou en présence de sel non spécifique (NaCl) et à pH 7

Figure III. 1: Images confocales des mélanges SC/KC à des concentrations indiquées dans la

figure, en absence de sel et pH 7.

95

Figure III. 2: Images confocales des mélanges SC/KC à des concentrations indiquées dans la

figure, à 0.1M NaCl et pH 7.

Dans les systèmes en absence ou en présence de sel (figures III. 1 et 2), on observe 2

situations :

- A faible concentration de SC et de KC, le système est homogène (Figure III. 3a) mais

évolue avec le temps comme nous le verrons dans la suite du chapitre.

- A haute concentration de SC, on observe une microséparation de phase ségrégative

(incompatibilité thermodynamique). Avec le temps, la séparation de phase ségrégative

peut devenir macroscopique avec une phase supérieure riche en KC et une phase

inférieure riche en SC (Figure III. 3b).

96

Figure III. 3: Systèmes homogènes (a) et systèmes hétérogènes (b) à 0.1 M NaCl et pH 7.

A haute concentration de SC, on trouve des inclusions riches en KC dans une matrice

continue riche en SC. A haute concentration de KC, on a une inversion de phases, avec des

inclusions riches en SC dans une matrice continue riche en KC. Pour des concentrations

intermédiaires, on observe une décomposition de type spinodale avec la formation rapide de 2

domaines bicontinus (figure III. 4).

Figure III. 4: Evolution cinétique d’un système hétérogène sans sel, à pH 7 et avec une

hauteur relative proche de 50/50. SC 60g/L et KC 3g/L. La hauteur relative est le rapport

entre le volume des 2 phases. Durée= 2 min.

Juste après le mélange à 60°C, le système est homogène et instable (hors équilibre). Puis

rapidement, il y a une décomposition spinodale (processus brusque et rapide) qui se traduit

dans un premier temps par la formation de microdomaines riches en SC dans un réseau

continu riche en KC (figure III. 4). Ensuite, on observe des domaines bicontinus et enfin, une

séparation de phase macroscopique.

Les différents états observés à un instant t que ce soit dans un mélange sans ou avec sel

dépendent de la concentration des biopolymères et donc, de leur viscosité.

97

Nous observons par ailleurs, à la fois dans les mélanges homogènes et hétérogènes, des

agrégats irréversibles riches en protéines. Le SC forme des agrégats avec le KC (coloration

rouge), voir figure III. 5 et paragraphe 2.

Figure III. 5: Profil d’intensité des agrégats pour un mélange contenant 3g/L de SC et 4g/L de

KC (100mM NaCl et à pH 7).

Comme nous l’avons dit dans le chapitre bibliographique, l’agrégation et la séparation de

phase dans les mélanges SC et KC n’avaient pas été étudiés systématiquement, bien que

certains auteurs avaient montré une séparation de phase pour des mélanges de micelle de

caséines natives et de kappa carraghénane sous forme hélice (Bourriot, Garnier and Doublier,

1999b; Langendorff, Cuvelier, Michon, Parker and De Kruif, 2000; Schorsch, Jones and

Norton, 2000). Dans ces systèmes, quelques grammes par litre de KC étaient suffisants pour

induire une séparation de phase. La séparation de phase dans ces systèmes avait été attribuée

soit à un phénomène de déplétion, soit à un phénomène d’incompatibilité thermodynamique.

Ces auteurs n’avaient pas observé de précipitation car la micelle de caséine était

complètement recouverte de KC, ce qui peut expliquer l’absence d’agrégation entre les

micelles de caséines et le kappa carraghénane.

III.1.1.2. Etude du contraste

Le contraste est défini comme le rapport du signal lumineux de la phase riche en SC sur le

signal de la phase pauvre en SC. La figure III. 6 donne l’évolution du contraste en fonction de

la concentration en caséinates de sodium et de la concentration en kappa carraghénane sans ou

avec sel et à pH 7.

40µm

Inte

nsit

é

~5µm

98

Figure III. 6: Evolution du contraste en fonction de la concentration en protéines à différentes

concentrations en KC indiquées sur les figures, en absence de sel (a) et en présence de 0.1M NaCl

(b), à pH 7.

Le contraste augmente systématiquement avec la concentration de SC. Pour une concentration

donnée en SC, le contraste augmente avec l’augmentation de la concentration en KC. On

observe également que le contraste est plus élevé pour un système mixte en présence de NaCl

que pour un système mixte sans sel. La séparation de phase est donc favorisée en présence de

NaCl et à hautes concentrations en biopolymères, comme, l’a été décrit dans la littérature pour

des mélanges de micelle de caséines et de polysaccharides.

III.1.1.3. Système en présence de sel spécifique (KCl) et à pH 7

Dans cette partie, on utilise un sel spécifique de KC : le KCl à 0.1M pour que la gélification

se fasse immédiatement pendant le refroidissement à 20°C car à 0.1M KCl, le KC gélifie vers

50°C. On observe une micro séparation de phase autour des mêmes concentrations de protéine

que pour les systèmes à 0.1M NaCl.

99

Figure III. 7: Morphologie des systèmes gélifiés pour des mélanges à 0.1 M KCl ou 0.1M

NaCl, à 4g/L de KC et à différentes concentrations de SC indiquées sur la figure.

En présence de potassium, on n’observe jamais une séparation de phase complète à 20°C car

les hélices de KC s’agrègent et gélifient. Le système est figé dans son évolution et le contraste

est faible.

III.1.2. Observation au cours du vieillissement

L’étude du vieillissement a été effectuée sur des systèmes homogènes et séparés à 20°C.

III.1.2.1. Domaine monophasique

Pour de faibles concentrations de SC (coloration rouge), nous n’observons pas de séparation

de phase ségrégative mais la formation d’agrégats irréversibles, voir la figure III. 8.

0.1M NaCl

0.1M KCl

30 g/L 60 g/L50 g/L40 g/L

100

Figure III. 8: Observation de l’effet du vieillissement et du chauffage sur des systèmes mixtes

homogènes SC 10 g/L et KC 4g/L dans l’état sol, à 20°C, à 0.1M NaCl et à pH 7.

Si dans un premier temps, nous n’observons pas la présence d’agrégats (à l’échelle du

microscope), ils apparaissent après 24h. Le système continue ensuite d’évoluer ; ces agrégats

se collent entre eux (formation de clusters), puis floculent. Une courte période de chauffage

et d’agitation permet de casser les clusters et de rajeunir le système. Puis, au bout de 24h, ces

clusters se reforment. Par la suite, nous désignerons par le terme « clusters réversibles » ce

type de structures, pour les différencier des agrégats irréversibles.

Le vieillissement d’un système mixte avec plus de 4 g/L de KC présente le même

comportement.

En conclusion, il y a une première étape de formation des agrégats, puis ultérieurement

association des agrégats au cours du temps. Les interactions qui forment ces agrégats sont

sans doute de nature ionique et ne sont pas détruites par chauffage et agitation. En revanche,

le vieillissement des agrégats conduit à leur association en clusters réversibles via des

interactions faibles qui sont détruites par chauffage et agitation.

III.1.2.2. Domaine biphasique

La séparation de phase est observée à des grandes concentrations en SC. Comme, nous

l’avons dit plus haut, il existe 3 phases dans le système séparé selon la concentration des 2

espèces. On donnera comme exemple ici, le système à 11g/L de KC et 20g/L de SC

(coloration rouge).

101

Figure III. 9: Observation de l’effet du vieillissement et du chauffage sur des systèmes mixtes

hétérogènes SC 20 g/L et KC 11g/L dans l’état sol, à 20°C, à 0.1M NaCl et à pH 7.

La présence des agrégats dans la phase continue riche en KC est déterminante sur le

vieillissement du système. En effet avec le temps, les agrégats s’agrègent (floculation) et

forment de gros clusters qui peuvent alors interagir avec les inclusions ou les microdomaines

riches en SC. Ces interactions sont faibles car une étape de chauffage et d’agitation permet de

rompre à nouveau ces liens et de revenir à l’état initial, comme le montre la photo la plus à

droite (figure III. 9).

Lorsqu’on attend suffisamment longtemps (plus de 24H) sans rajeunir le système, on observe

la formation de 3 domaines dans le tube, comme on l’a décrit précédemment. La phase

surnageante riche en KC comporte des inclusions de SC et des agrégats. La deuxième phase,

dite intermédiaire est composée de clusters. Enfin dans le fond du tube, on observe une phase

riche en SC avec des inclusions de KC d’une dizaine de microns.

Dans les systèmes homogènes ou hétérogènes, on observe des agrégats à haute concentration

de KC. Ces agrégats sont très riches en protéines et sont formés par l’association entre les SC

et les KC, même si les 2 biopolymères ont des charges nettes négatives. Ces interactions sont

possibles parce que la répartition des charges le long de la chaîne des k-caséines n’est pas

uniforme. En effet, il existe des régions positives entre les résidus peptidiques 20 et 115. Des

auteurs (Snoeren, 1975; Snoeren, Both and Schmitt, 1976) ont proposé l’existence

d’interactions électrostatiques entre les régions positives des k-caséines et les groupements

sulfates des carraghénanes. Ils ont également fait les mêmes hypothèses pour les liaisons

formées entre les micelles de caséines et les carraghénanes car les caséines a et b sont

stabilisées à l’intérieur de la micelle par la k-caséine localisée en périphérie (Payens, 1972)

102

III.2. Analyse des agrégats

Les systèmes monophasiques ont été étudiés par diffusion de la lumière et par spectroscopie

UV. En diffusion, les données de l’intensité diffusée ont été analysées à partir de l’équation.

où Ma et Ra représentent respectivement la masse et le rayon apparent des agrégats.

Cette méthodologie d’analyse permet de bien décrire les agrégats protéiques (Nicolai, 2007) .

III.2.1. Influence de la concentration de SC ou de KC

Nous avons suivi l’intensité diffusée à t=0 en fonction du vecteur de diffusion pour différents

mélanges à 0.1M de NaCl, à pH 7. Nous avons 2 cas de figures :

- Une concentration de SC fixée à 0.5g/L et différentes concentrations de KC (figure III.

10a).

- Une concentration de SC fixée à 10g/L et différentes concentrations de KC (figure III.

10b).

103

Figure III. 10: Evolution de Ma en fonction du vecteur d’onde q pour des mélanges à 1.5 g/L

(a) et à 10 g/L (b) de SC pour différentes concentrations en KC indiquées dans les figures en

présence de 100mM NaCl, à pH 7.

Dans les 2 cas, nous constatons que la taille et la masse apparentes des objets augmentent

lorsque la concentration de KC augmente. A partir d’une certaine concentration en KC, on

observe le caractère fractal des objets dans la fenêtre spatiale de la diffusion de la lumière.

On a laissé mûrir la solution. Puis, la fraction des SC dans les agrégats (F) a été déterminée au

bout de 4 jours pour les systèmes homogènes après centrifugation à 20000g, à 40°C et

pendant 1 h. Cette fraction correspond à la différence entre la concentration totale de caséinate

de sodium et la concentration de caséinate de sodium dans le surnageant, divisée par la

concentration totale de SC.

Ctot= concentration totale de SC

Cs= concentration de SC dans la phase surnageante.

q (nm-1)

10-2

Ma

(g

/mo

l)

106

107

108

109

0g/L

1g/L

2 g/L

3g/l

5g/L

7g/L

10g/L

(a)

q (nm-1)

10-3 10-2

Ma

(g/m

ol)

106

107

108

109

1g/L

2g/L

3g/l

0 g/L

(b)

104

Figure III. 11 : Fraction de SC dans les agrégats

en fonction de la concentration de KC pour

différentes concentrations totales en SC, à

0.1M NaCl et pH 7.

Figure III. 12: Evolution de la viscosité en

fonction de la température à 0.1M NaCl et

pH 7.

Cette fraction augmente linéairement avec l’augmentation de la concentration de KC, mais ne

dépend pas de la concentration totale de SC (figure III. 11). Des résultats similaires ont été

rapportés dans la littérature pour des solutions de SC en présence de calcium. En effet,

Pitkowski et al. ont observé que la fraction de SC dans les agrégats augmente avec la

concentration de calcium, mais ne dépend pas de la concentration de SC (Pitkowski, Nicolai

and Durand, 2009) .

Les viscosités du surnageant et de la solution de KC pur sont identiques pour une même

concentration totale de KC. Cela montre que les agrégats contiennent très peu de KC, moins

de 5% de KC dans les agrégats (figure III. 12). De plus, on observe qu’en présence

d’agrégats, on a des viscosités plus élevées. La viscosité en présence des agrégats dépend du

temps de murissement des agrégats (c'est-à-dire de leur degré d’agrégation).

III.2.2. Influence du vieillissement

Nous avons également observé l’impact du vieillissement sur les systèmes homogènes.

T°C

20 30 40 50 60 70

Vis

co

sité

(P

a.s

)

10-1

SC10KC10 non centrifugé

Surnageant de SC10KC10

SC0KC10

105

Figure III. 13: Evolution de Ma en fonction de q à t=0h (jaune) et à t=24h (vert) pour SC à

1.5g/L et différentes concentrations de KC, dans 100mM NaCl, à pH 7 (a).

Figure III. 14: Effet du vieillissement pour un système comportant 1.5 g/L de SC et 3g/L de

KC (b).

Nous avons ainsi noté que les agrégats se formaient au cours du temps et que la vitesse de leur

formation était d’autant plus rapide que la concentration de KC était élevée (figure III.13). Au

bout de 24H, les agrégats deviennent stables (figure III. 14).

III.2.3. Influence de la dilution

L’impact de la dilution a également été étudié sur les mélanges homogènes.

q (nm-1)

10-3 10-2

Ma (

g/m

ol)

106

107

108

0 g/L1 g/L2 g/L 3 g/L

(a)

q (nm-1

)

10-2

Ma (

g/m

ol)

107

108

t=0h

t=24h

t=48h

t=72h

q (nm-1

)

10-2

Ma (

g/m

ol)

107

108

t=0h

t=24h

t=48h

t=72h

(b)

106

q (nm-1)

10-3 10-2

Ma (

g/m

ol)

106

107

108

109

0 g/L dilué 1/10

1 g/L

2g/L

3g/L

0g/L non dilué

1g/L

2g/L

3g/L

Figure III. 15: Comparaison de l’évolution des masses apparentes en fonction du vecteur

d’onde q des systèmes dilués et non dilués à différentes concentrations de KC et une

concentration fixe de SC 1.5g/L dans 100mM NaCl, à pH 7.

On n’observe pas d’effet de la dilution. Les agrégats restent stables, donc les liaisons sont

fortes contrairement aux interactions entre les agrégats qui forment les flocs. Cependant, la

dilution permet de diminuer les interactions entre les particules, ce qui entraîne une

augmentation de la taille et de la masse des particules parce qu’on mesure leurs vraies tailles

et masses molaires (figure III. 15).

III.2.4. Influence de la force ionique et du pH

L’évolution de la fraction de SC dans les agrégats a été mesurée en fonction de la force

ionique (figure III. 16) et en fonction du pH (figure III. 17).

La fraction augmente avec l’augmentation de la concentration de NaCl jusqu’à 0.2M, puis,

diminue brusquement jusqu’à 20% et reste à cette valeur même à des hautes concentrations de

NaCl. Des observations similaires ont été rapportées par Snoeren pour les mélanges de

k-caséine pur et de KC (Snoeren, 1975) . Cette augmentation peut être expliquée par

l’écrantage de charges. La diminution peut être attribuée au fait que l’on écrante aussi les

charges positives des protéines diminuant ainsi les liaisons entre les protéines et le KC (figure

III.16).

107

Figure III. 16: Fraction de SC dans les

agrégats en fonction de la concentration de

NaCl, à pH 7. SC 10g/L et KC 6g/L.

Figure III. 17 : Fraction de SC dans les

agrégats en fonction du pH, à 0.1M NaCl. SC

10g/L et KC 6g/L.

La fraction augmente avec la diminution du pH spécialement à pH 6 où elle augmente

fortement. Ceci s’explique par la diminution des charges négatives sur les protéines quand on

s’approche du point isoélectrique (figure III. 17).

Ce tableau récapitule les valeurs de la masse et de la taille apparentes des agrégats pour des

mélanges KC et SC pris dans ces gammes de concentrations : de 1 à 2 g/L KC et de 1.5 à 10

g/L SC, à 0.1M NaCl et pH 7.

MaX10-6

(g/mol) :

CSC

CKC

1.5 g/L

3 g/L

10 g/L

1 g/L 3.2 2.9 1.7

2 g/L 6 8 7

Ra (nm)

CSC

CKC

1.5 g/L

3 g/L

10 g/L

1 g/L 83 89 82

2 g/L 112 125 149

Tableau III. 1 : Influence de la concentration en KC sur la masse et de la taille des agrégats à

t=24h pour différentes concentrations en SC (0.1M NaCl, pH7).

108

En conclusion, les agrégats ont un impact sur les propriétés rhéologiques du système quand le

KC est en état pelote. De plus, en jouant sur différents paramètres tels que la force ionique, le

pH et la concentration de KC, on peut faire varier la taille des agrégats et la teneur en

protéines dans ces agrégats.

III.3. Diagramme de phase

Comme expliqué dans le chapitre II, nous avons utilisé les mesures de viscosité pour

déterminer la concentration de KC dans chaque phase et la spectroscopie UV à 280 nm pour

déterminer la concentration de SC.

Après séparation complète du mélange, le tube contient 3 phases. Les compositions de la

phase supérieure riche en KC et de la phase inférieure riche en SC ont été déterminées. Dans

un premier temps, on a regardé les 2 phases par MCBL pour être sûr que la séparation soit

terminée. Puis, à l’aide de la Spectroscopie UV, on a mesuré la concentration de caséine dans

les 2 phases (C1 et C2). A partir de ces concentrations et des hauteurs relatives des deux

phases (h1 et h2) nous avons déterminé la vraie concentration dans les mélanges (sans

comptabiliser la concentration des caséines dans les agrégats).

On a Cvraie = h1C1 + h2C2

Le diagramme de phase a été déterminé pour les systèmes en absence et en présence de 0.1M

NaCl.

109

III.3.1. Système en présence de NaCl et pH 7

Figure III. 18: Diagramme de phase des mélanges SC/KC à 0.1M NaCl et à pH 7.

-La binodale sépare la région où les systèmes sont homogènes (cercles fermés) de la région où

les systèmes sont hétérogènes (cercles ouverts).

-La ligne en pointillée représente les mélanges dont les 2 phases (supérieure et inférieure) ont

même volume. Au dessus de cette ligne, on obtient des phases riches en KC et en dessous de

cette ligne, des phases riches en SC.

-Les lignes de conjugaison donnent la composition de chaque phase. La phase riche en

protéine contient très peu de KC. Toutes les lignes de conjugaison sont parallèles entre elles.

110

Nous observons donc une phase riche en KC dans le haut du tube et une phase riche en SC

dans le bas du tube avec la présence d’une phase intermédiaire correspondant aux agrégats

irréversibles entre KC et SC.

III.3.2. Système sans sel et à pH 7

Les diagrammes de phase des systèmes en absence et en présence de 0.1M NaCl ont été

comparés.

Figure III. 19: Comparaison des diagrammes de phase des mélanges SC/KC à pH 7, en

absence et en présence de 0.1M NaCl.

En absence de sel, la binodale est déplacée vers les hautes concentrations de SC et de KC,

voir figure III.19. La séparation de phase se déplace vers les hautes concentrations de SC

parce que les répulsions électrostatiques sont plus importantes sans sel ajouté.

111

III.4. Conclusion

Nous avons étudié systématiquement dans ce travail la morphologie et les propriétés

structurales des systèmes caséinates de sodium / kappa carraghénane. Les principaux résultats

sont les suivants :

2 situations : des mélanges homogènes avec la présence d’agrégats irréversibles de petite

taille et des mélanges hétérogènes (incompatibilité thermodynamique).

Les agrégats irréversibles riches en SC peuvent influencer la viscosité du système mixte.

Avec le temps, ces agrégats irréversibles s’associent et forment des clusters réversibles.

La teneur en protéines dans les agrégats est influencée par le pH, la force ionique et la

concentration de KC, mais ne dépend pas de la concentration totale de protéines. La masse et

le rayon apparents des agrégats augmentent avec le temps et avec l’augmentation de la

concentration de KC, mais ne dépendent pas de la dilution. Ils sont stables après 24H.

KC SC

Séparation de phase ségrégative+ agrégats

irréversibles SC-KC

La séparation de phase peut être microscopique ou

macroscopique en jouant sur la concentration des

biopolymères ou du sel.

chauffage

agitation

Miscibilité : agrégats irréversibles SC-KC

Formation

des agrégats

avec le temps

Clusters

réversibles

Rajeunissement

des agrégats

112


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113

Chapitre IV: Gélification des mélanges monophasiques de SC et de

KC

114

IV.1. Système sans sel

Les systèmes analysés dans ce paragraphe sont dans la région où les mélanges sont

homogènes. Les systèmes mixtes étudiés sont à 2g/L de KC et à différentes concentrations de

SC, à pH 7 et sans sel (à part les 3mM d’agent bactéricide).

IV.1.1. Température critique de gélification

La figure IV. 1 montre l’évolution de G’ et G’’ à 1 Hz pendant le refroidissement à une

vitesse de 1°C/min. Pour des concentrations CSC< 30 g/L, on n’a pas d’effet des caséinates de

sodium sur les propriétés rhéologiques des mélanges. Les résultats sont identiques à ceux

d’une solution de KC pur.

A haute concentration de SC, G’’ augmente fortement durant le refroidissement à partir d’une

température critique de refroidissement Tc. Ici Tc est définie comme la température à laquelle

G’’ augmente brusquement pour une vitesse de refroidissement de 1°C/min. La vitesse

d’augmentation est lente proche de Tc et la mesure de Tc dépend de la vitesse de

refroidissement comme l’avaient déjà montré Tziboula and Horne (Tziboula and Horne,

1999) . Cependant, la vitesse augmente rapidement avec la diminution de la température,

l’effet n’est donc pas très important. La forte augmentation de G’ est causée par la transition

pelote–hélice qui est suivie par une agrégation des hélices de KC pouvant conduire à une

gélification.

115

Figure IV. 1: Evolution des modules G’ (symboles fermés) et G’’ (symboles ouverts) à 1 Hz

pendant le refroidissement d’un système à 2 g/L de KC pour différentes concentrations de SC,

indiquées sur la figure. La flèche indique Tc à 60 g/L de SC.

La température critique Tc est à 4°C pour 30 g/L et monte à 8°C pour 60 g/L. Pour CSC< 35

g/L, les modules G’ sont négligeables, mais à haute concentration de SC, ils augmentent

fortement pour T<Tc (figure IV. 1).

Ces températures critiques sont compatibles avec celles trouvées par Rochas et Rinaudo

(Rochas and Rinaudo, 1980) :

T (°C) = 64.44 x [NaCl] + 4.65

SC (g/L) 10 20 30 35 40 50 60

102 x NaCl (M) 0.65 1.3 2 2.27 2.6 3.25 4

T (°C) 5.1 5.5 5.9 6.1 6.3 6.74 7.2

Tableau IV. 1 : Corrélation entre la concentration en sodium provenant des caséines et la

température critique de refroidissement correspondante (Rochas et al., 1980)

T (°C)

0 2 4 6 8 10 12 14

G',

G"(

Pa)

10-1

100

101

102

103

20 g/L30 g/L 35 g/L40 g/L60 g/L

T (°C)

0 2 4 6 8 10 12 14

G',

G"(

Pa)

10-1

100

101

102

103

20 g/L30 g/L 35 g/L40 g/L60 g/L

116

Figure IV. 2: Evolution de la concentration en sel en fonction de la concentration de SC.

La transition pelote – hélice est causée par les sels provenant de la poudre de SC. Les

pourcentages de potassium et de calcium dans la poudre de SC sont insuffisants pour

expliquer cette transition. Mais le pourcentage de contre – ions sodium peut expliquer les

valeurs de Tc (figure IV. 2 et Tableau IV. 1).

IV.1.2. Etude cinétique

Les systèmes mixtes à 2°C ont été étudiés en fonction du temps. La valeur de G’ à 2°C

augmente avec l’augmentation de la concentration de protéines. Le système continue à

évoluer après que la température se soit stabilisée à 2°C (figure IV. 3).

CSC

(g/L)

20 30 40 50 6010

CSe

l (m

ol/L

)

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

NaCaK

117

Figure IV. 3: Evolution de G’ à 2°C et à 1 Hz en fonction du temps pour des systèmes à 2

g/L de KC et à différentes concentrations de SC indiquées sur la figure.

Le module G’ atteint approximativement la même valeur de 103 Pa pour tous les systèmes

dont la concentration de SC est comprise entre 35 et 60 g/L.

Après 103s, l’augmentation de G’ avec le temps devient très lente, excepté pour les systèmes à

20 g/L et 30 g/L de SC qui sont loin de leur état final après 2.5 103s.

IV.1.3. Température critique de fonte

t (s)

1 10 100 1000

G' (

Pa)

10-2

10-1

100

101

102

1033g/L

20 g/L

35 g/L

30 g/L

40 g/L

60 g/L

118

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

103 RefroidissementChauffage

(a)

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

103 RefroidissementChauffage

(a)

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

10320 g/L30 g/L35 g/L40 g/L60 g/L

(b)

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

10320 g/L30 g/L35 g/L40 g/L60 g/L

(b)

Figure IV. 4: Observation de l’hystérèse pour une solution de 2g/L KC et 40 g/L de SC (a).

Evolution des modules G’ à 1 Hz au cours du chauffage d’un système à 2 g/L de KC et

différentes concentrations de SC indiquées sur la figure (b).

Un écart est observé entre la température critique où le gel se forme pendant le

refroidissement (Tc) et la température critique où le gel fond pendant le chauffage (Th). Cet

écart correspond à un phénomène d’hystérèse et implique que la cassure des liaisons nécessite

le passage d’une barrière d’énergie.

Pour CSC 35 g/L, la température critique Th de chauffage est d’environ 31°C et pour CSC

35 g/L, la température critique Th est inférieure de seulement quelques degrés (figure IV. 4b).

IV.1.4. Dépendance en fréquence des modules à 2°C

Les dépendances en fréquence des modules ont été mesurées après 2.5 103s à 2°C.

119

Figure IV. 5: Dépendance en fréquence des modules G’ à 2°C pour des systèmes à 2 g/L de

KC et à différentes concentrations de SC indiquées sur la figure.

Pour CSC 30 g/L, G’ est indépendant de la fréquence et est 10 fois plus grand que G’’

(figure IV. 5b). G’’ montre un très faible minimum entre 0.1 Hz et 1 Hz, similaire aux

observations de Lynch et al. (Lynch and Mulvihill, 1994b) .

Pour CSC 20 g/L, la dépendance en fréquence montre que les systèmes sont des liquides

viscoélastiques (figure IV. 5a).

IV.2. Système avec un sel non spécifique du KC : sodium

Nous avons étudié l’effet de l’ajout de SC sur le KC à 0.1M NaCl sur les températures

critiques (Tc et Th) et le module du gel. 0.1M NaCl est suffisant pour écranter

significativement les interactions électrostatiques. Des mélanges monophasiques de KC

(1.5g/L, 4g/L et 7g/L) à différentes concentrations de SC sont préparés en présence de 0.1M

NaCl et à pH 7. En présence de 0.1M NaCl et à 2°C, les systèmes n’évoluent que très peu

après 20 min.

IV.2.1. Influence de la température et dépendance en fréquence des modules à 2°C

f (Hz)10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-3

10-2

10-1

100

101

20 g/L

(a)

f (Hz)

10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-1

100

101

102

103

30 g/L

(b)

f (Hz)10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-3

10-2

10-1

100

101

20 g/L

(a)

f (Hz)10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-3

10-2

10-1

100

101

20 g/L

(a)

f (Hz)

10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-1

100

101

102

103

30 g/L

(b)

f (Hz)

10-2 10-1 100

G'(p

lein

), G

'' (o

uver

t) (

Pa)

10-1

100

101

102

103

30 g/L

(b)

120

Pour le mélange à 4 g/L de KC et différentes concentrations de SC, 0.1 M NaCl et à pH 7,

nous avons suivi l’évolution de G’ en fonction de la température.

Figure IV. 6: Evolution de G’ à 1 Hz mesuré pendant le refroidissement (cercles) et le

chauffage (triangles) des mélanges à 4 g/L de KC dans 0.1 M NaCl et différentes

concentrations de SC indiquées sur la figure.

Comme nous l’avons dit précédemment, nous constatons une forte augmentation de G’ quand

nous baissons la température à partir d’une température critique Tc. Dans le système mixte, Tc

vaut environ 12- 15°C et la dépendance de la température en fonction de la concentration en

SC est faible, quelques degrés seulement (figure IV. 6). On remarque également que la fonte

se produit pour des températures critiques de chauffage plus élevées que celles de

refroidissement. A 20g/L, un écart de 15°C est observé entre Th (30°C) et Tc (15°C).

A faible quantité de SC, la fonte se déroule en 2 étapes. La première est la cassure des liaisons

entre les hélices de KC similaire à celle observée avec le KC pur. La seconde est la fonte du

gel mixte qui nécessite la cassure des liaisons qui impliquent les protéines (figure IV. 6b). En

121

excès de SC, on ne voit que la 2ème étape. Ceci indique que les interactions mixtes SC/KC

dominent dans le mélange (figure IV. 6d).

Figure IV. 7: Evolution de G’ et de G’’ à 2°C en fonction de la fréquence pour une solution

de KC pur à 4 g/L (a) et un système mixte à 3 g/L de SC et 4 g/L de KC (b) à 0.1M NaCl et à

pH 7.

La dépendance en fréquence des modules montre que le KC pur dans ces conditions ne forme

pas de gel à 2°C mais un liquide visqueux (figure IV. 7a). Cependant, à partir de 3 g/L ou plus

de SC, le système forme un gel (figure IV. 7b). La force du gel augmente avec la

concentration de SC dans les mélanges avec 0.1 M NaCl, comme nous l’avons observé pour

les mélanges sans sel.

IV.2.2. Influence de la concentration de SC et de KC

f (Hz)10-2 10-1 100 101

G'(n

oir)

, G''

(rou

ge)

(Pa)

10-2

10-1

100

101

(a)

f (Hz)

10-2 10-1 100

G' (

noir

), G

'' (r

ouge

) (P

a)

100

101

102

(b)

122

Figure IV. 8: Evolution du module élastique

G’ à 2°C en fonction de la concentration en

SC (100mM NaCl et à pH 7).

Figure IV. 9: Evolution des températures

critiques de refroidissement (symboles bleus)

et de chauffage (symboles rouges) en

fonction de la concentration en SC (100mM

NaCl et à pH 7).

Pour toutes les concentrations de KC (1.5 g/L, 4 g/L et 7 g/L), le module élastique à 2°C

augmente avec l’augmentation de la concentration de SC. Pour une concentration de SC

donnée, il augmente avec l’augmentation de la concentration de KC (figure IV. 8). La

température critique de gélification augmente faiblement avec la concentration de SC. La

température critique de fonte augmente brusquement lorsqu’on ajoute une petite quantité de

SC et reste à cette valeur à des plus hautes concentrations de SC. Ces températures critiques

ne dépendent pas de la concentration de KC (figure IV. 9).

IV.3. Système avec un sel spécifique du KC : le potassium

Nous avons étudié l’effet du KCl sur les systèmes mixtes SC 20g/L et KC 4 g/L dans lesquels

on suppose que toutes les protéines forment un gel mixte avec le KC afin de déterminer

l’impact du SC en présence d’un ion spécifique du KC : le potassium. Nous avons également

fait varier la concentration de potassium.

123

Figure IV. 10: Influence de la concentration

de KCl sur les températures critiques pendant

le refroidissement (bleu) et le chauffage

(rouge) du KC pur (cercles) et du mélange

SC 20g/L et KC 2g/L (triangles).

Figure IV. 11: Influence de la concentration

de KCl sur les modules élastiques à 2°C de

KC pur (cercles) et du mélange SC 20g/L et

KC 2g/L (triangles).

A faible concentration de KCl, la température critique de gélification est influencée par les

cations contenus dans la poudre de SC. La température critique de fonte est déterminée par la

présence de protéines et la force du gel dépend des protéines (figure IV 10 et 11).

Au dessus d’une concentration critique d’environ 0.02M KCl, les températures critiques du

KC pur et des mélanges sont identiques car l’effet des protéines et des cations contenus dans

les protéines devient négligeable. Le gel de KC pur et le gel du système mixte ont alors les

mêmes modules (figure IV 10 et 11).

En conclusion, dans le système mixte on a 2 types de liaisons : des liaisons mixtes KC-SC et

des liaisons purement KC-KC. Quand on se trouve au dessus de la concentration critique de

potassium, les liaisons induites par le potassium dominent.

IV.4. Système mixte en présence d’iodure de sodium

Des mélanges à 4 g/L de KC avec différentes concentrations en SC sont préparés à chaud

(60°C) en présence de NaI qui induit la transition pelote-hélice, mais bloque la formation

d’un gel de KC. Le but est de voir si les protéines peuvent provoquer la gélification du KC.

124

Figure IV. 12: Evolution de G’ à 1 Hz mesuré pendant le refroidissement (cercles rouges) et

le chauffage (triangles noirs) des mélanges à 4 g/L de KC dans 0.1 M NaI et différentes


On constate que la solution de KC à 0.1M NaI présente une transition pelote – hélice vers

39°C et qu’il n’existe pas d’hystérèse (figure IV. 12a). En présence de SC, la température de

transition pelote–hélice augmente de quelques degrés et on n’observe toujours pas d’hystérèse

(les températures critiques de refroidissement et de chauffage sont identiques) (figure IV. 12b,

12c, 12d). Dans ces conditions (0.1M NaI et pH 7), la cassure des liaisons de SC et de KC

n’est pas observée parce que le KC pur fond à des températures plus élevées que le gel mixte.

On se trouve dans la même situation qu’en excès de potassium où ce sont les interactions des

hélices libres de KC qui dominent.

125

Pour chacun des mélanges, la dépendance en fréquence des modules à 2°C a été effectuée.

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure IV. 13.

Figure IV. 13: Evolution de G’ et de G’’ à 2°C en fonction de la fréquence pour des

mélanges à 4 g/L de KC dans 0.1 M NaI et différentes concentrations de SC indiquées sur les

figures.

La dépendance en fréquence des modules montre que le KC pur en présence de 0.1 M NaI ne

forme pas de gel à 2°C mais un liquide visqueux (figure IV. 13a). Cependant, à partir de 10

g/L ou plus de SC, G’>G’’ et on observe une dépendance en fréquence des modules à 2°C sur

la gamme de fréquence explorée (figure IV. 13b, 13c, 13d). Les mélanges avec NaI ont des

comportements rhéologiques différents des mélanges avec 0.1M NaCl.

126

Chronakis et al. ont construit pour des solutions de KC pur une courbe maitresse

concentration – fréquence pour des concentrations en KC inférieures à 1.5% et à 0.2M

NaI.(Chronakis, Doublier and Piculell, 2000). Dans cette gamme de concentration, KC est un

liquide viscoélastique bien que visuellement KC se comporte comme un gel pour des

concentrations au dessus de 0.8%. Ils trouvent également que pour des concentrations

supérieures à 0.8%, la vitesse de relaxation des gels est lente ce qui pourrait être dû à la

rigidité des hélices de KC. En présence d’iodure, l’augmentation de KC a pour effet de

ralentir la relaxation sans modifier le module élastique.

Figure IV. 14: Evolution des constantes de normalisation aC et bC en fonction de la

concentration de SC.

CSC (g/L)100 101 102

a C (

Sym

bole

ble

u)

101

102

103

104

105

106

107

b C (

Sym

bole

rou

ge)

10-1

100

127

Figure IV. 15 : courbes maitresses de G’, G’’ obtenues par normalisation de la fréquence et

des modules respectivement par les constantes aC et bC.

En présence d’iodure, l’effet de SC est également de ralentir la relaxation sans modifier

significativement le module élastique. En effet, une bonne superposition est obtenue en

appliquant des déplacements horizontaux et verticaux, voir la figure IV. 15. Les déplacements

horizontaux sont importants tandis que les déplacements verticaux sont relativement faibles,

voir la figure IV. 14.

Le ralentissement de la relaxation est très important et peut être décrit par une loi de

puissance, ac , au moins entre 1.5 g/L et 40g/L (figure IV. 14).

La conclusion de cette étude en présence d’iodure est que le système mixte en présence de

NaI ne forme pas de gel et que la formation d’un gel par KC est nécessaire pour former des

gels mixtes avec SC. Néanmoins, il est évident que le SC s’associe également avec les hélices

de KC en présence de NaI, ce qui conduit à une très forte augmentation de la viscosité.

aCf (Hz)

10-2 10-1 100 101 102 103 104 105 106 107 108

Tan

Tan

(tri

angl

e)

10-1

100

101

b CG

' (ro

nd),

bCG

'' (c

arré

) (P

a)

10-2

10-1

100

101

102

103

0 g/L1.5 g/L3 g/L5 g/L7.5 g/L10 g/L20 g/L30 g/L40 g/L

128

IV.5. Structure du gel mixte

La figure IV. 16 montre les images confocales des systèmes mixtes contenant 3 g/L de SC et

différentes concentrations de KC. Les systèmes ont été stockés à 5°C pendant une nuit et les

images ont été prises à 20°C à l’état gélifié. On visualise le réseau de KC en MCBL par les

protéines associées avec les KC.

Figure IV. 16: Evolution de la structure des gels en MCBL après 24heures à 5°C pour des

mélanges à différentes concentrations en KC indiquées sur la figure et à une concentration en

SC fixée à 3g/L (0.1M NaCl, pH7). Taille des images 40mm.

Le réseau devient dense et le contraste diminue avec l’augmentation de la concentration de

KC. A 3 g/L de KC, les images apparaissent homogènes, excepté la présence de clusters

riches en SC qui se forment à haute concentration de KC lorsque le KC est sous forme pelote.

Nous avons également varié la concentration de SC en gardant la concentration de KC fixée à

1 g/L, comme le montre la figure IV. 17.

A 3 g/L de SC, le système est gélifié à 2°C et devient un liquide homogène à 20°C. A partir

de 1.5 g/L de SC, les images montrent un réseau mixte qui devient plus homogène avec

l’augmentation de la concentration de SC.

L’augmentation de la concentration de SC et de la concentration de KC conduit à des gels

plus homogènes. Des structures similaires ont été montrées par Schorsch et al. pour des

mélanges de KC et de caséine micellaire native (Schorsch, Jones and Norton, 2000) .

0.1g/L 0.5g/L 1g/L 2g/L 3g/L

129

Figure IV. 17: Evolution de la structure des gels en MCBL après 24heures à 5°C pour des

mélanges à différentes concentrations en SC indiquées sur la figure et à une concentration en

KC fixée à 1g/L (0.1M NaCl, pH7). Taille des images 160mm.

L’effet de la gélification sur la structure a également été étudié par diffusion de la lumière.

Pour un mélange de 1g/L de KC et 3 g/L de SC, le phénomène de gélification cause une forte

augmentation de l’intensité (figure IV. 18). L’intensité de la lumière diffusée par un gel de

KC pur est négligeable par rapport au gel mixte.

Figure IV. 18: Dépendance de la masse apparente (proportionnelle à l’intensité diffusée)

avec le vecteur d’onde pour un mélange comportant 3g/l de SC et 1g/l de KC (100mM NaCl

et à pH7) à l’état sol et à l’état gel. Taille des images 40 mm.

Des résultats similaires ont été obtenus pour d’autres systèmes mixtes SC et KC .

0.5g/L 1.5g/L 3g/L 10g/L

Cooling 15h

q (nm-1)

10-2

Ma (

g/m

ol)

106

107

108 solgel

sol

gel

130

Dans chaque cas, le gel montre une forte dépendance de l’intensité avec le vecteur d’onde qui

peut être décrit par une loi de puissance I q-df, ce qui montre que la structure locale du gel

est auto – similaire avec une dimension fractale df qui est pour tous les mélanges étudiés

comprise entre 1.5 et 2.

131

IV.6 Conclusion

Le schéma ci-dessous représente un système mixte monophasique de KC et de SC gélifié :

[2] : Liaisons de KC pur.

[3] : Liaisons mixtes entre les hélices de KC et les SC. Cependant, la nature moléculaire de

ces liaisons n’est pas encore connue.

En plus le système contient des grands agrégats de SC contenant peu de KC qui sont liés

irréversiblement, mais qui n’ont pas d’impact sur les systèmes gélifiés.

Dans le système gélifié, il existe 2 types de liaisons : des liaisons formées par le KC pur induit

par les sels présents et des liaisons mixtes protéines-KC. D’autres auteurs avaient déjà montré

la présence de ces deux types de liaisons dans les mélanges de SC et de KC (Oakenfull,

Miyoshi, Nishinari and Scott, 1999). Les deux types de liaisons sont thermoréversibles. Les

liaisons où sont impliquées les protéines renforcent les gels faibles de KC. La compétition

entre ces deux types de liaisons dépend de la nature du sel et de la force ionique. Si la

concentration d’ions spécifiques (par exemple le potassium) est supérieure à 0.02M, le gel de

KC pur induit par ces ions domine le système. Cependant, en présence de NaI, le système

mixte ne forme pas de gel car l’iodure bloque la gélification, comme montré dans la littérature

pour les solutions de KC pur (Piculell, Nilsson and Muhrbeck, 1992; Slootmaekers, Jonghe,

Reynaers, Varkevisser and Treslong, 1988) .

En présence de NaCl ou de KCl, l’augmentation de SC ou de KC conduit à des gels plus

homogènes.

1

3

2

agrégats irréversibles SC-KC

Liaisons pures entre hélices

de KC via les cations (K, Na)

Liaisons mixtes entre les hélices de

KC via les caséinates de sodium

Refroidissement

132


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Biological Macromolecules, 10 160.

Tziboula, A. & Horne, D. S. (1999), Influence of milk proteins on κ-carrageenan gelation,


133

Chapitre V : Etude comparative des SC et des submicelles de

caséines

134

V.1. Etude des mélanges submicelles de caséines et KC sous forme pelote

Les submicelles de caséines sont des particules obtenues après la dissociation de la micelle de

caséines par la chélation du CCP par les sels de fonte (triphosphate de sodium (NaTPP)). Ces

particules ont presque la même taille que celles de SC, soit environ 11 nm, et sont composées

également d’environ 15 molécules de caséines. Contrairement aux SC, les suspensions des

submicelles obtenues sont instables, elles s’agrègent et peuvent gélifier au cours du temps si

la concentration de caséines est suffisante. Dans l’industrie, les submicelles de caséines sont

utilisées pour certains produits laitiers. C’est pourquoi nous avons comparé les submicelles de

caséines et les Caséinates de sodium. De plus, du point de vue scientifique, nous voulons

étudier les comportements structuraux et rhéologiques de ces protéines face au kappa

carraghénane. Et nous voulons étudier l’effet de la gélification des protéines sur les propriétés

rhéologiques du kappa carraghénane.

V.1.1. Morphologie

Deux mélanges mixtes à une même concentration de kappa carraghénane (KC) 4g /L et à

différentes concentrations de protéine ont été comparés : l’un avec des caséinates de sodium

(SC) en présence de 0.1M NaCl et l’autre avec des submicelles de caséines en présence de

0.1M de tripolyphosphate de sodium (NaTPP).

80 g/L50 g/L 60 g/L 70 g/L30 g/L 40 g/L10 g/L 20 g/L

Submicelles de caséine + 0.1M de NaTPP

SC + 0.1M NaCl

135

Figure V. 1: Comparaison des comportements de phase des caséinates de sodium (SC) et des

submicelles de caséines à 4 g/L de KC et à différentes concentrations de SC indiquées sur la

figure. Taille des images sur la figure 160mm.

Pour ces conditions, la séparation de phase des systèmes arrive au même moment et conduit à

une phase riche en protéine et une phase riche en kappa carraghénane (figure V. 1).

Cependant, le système avec SC reste plus longtemps co-continu que celui avec les

submicelles de caséines pour lequel on bascule rapidement vers un milieu protéique continu.

V.1.2. Séparation de phase

Le contraste est défini comme le rapport du signal de la phase riche en SC sur le signal de la

phase pauvre en SC. La figure V.2 montre l’évolution du contraste pour les différents

systèmes étudiés.

Figure V. 2: Comparaison des contrastes entre les submicelles de caséines et les SC à 0.1 M

NaCl.

Le contraste augmente avec la concentration de protéine qui favorise la séparation de phase.

CSC (g/L)

0 20 40 60 80 100

cont

rast

e

1

2

3

4

5

6

7

8

Submicelles de caséines

SC

136

Le contraste évolue linéairement et de façon identique pour les deux types de systèmes ce qui

indique que la séparation de phase se déroule de façon identique pour les deux systèmes.

V.1.3. Formation des agrégats

Les mélanges dilués de SC et de submicelles de caséines ont été étudiés à différentes

concentrations de KC, à 0.1M Na+ à pH 7 pour SC et à pH 6 pour les submicelles de caséines.

Pour ces conditions, on se trouve dans la région monophasique (figure V. 3).

Figure V. 3: Comparaison entre les submicelles de caséines à pH 6 et le SC à pH 7 (0.1 M

Na+) : Evolution de la fraction de protéines F(%) dans les agrégats en fonction de la

concentration de KC.

Dans les deux cas, la fraction des caséines dans les agrégats augmente avec la concentration

de KC. Cependant, la fraction des caséines dans les agrégats formés dans les mélanges de

submicelles de caséine est légèrement supérieure à celle des agrégats formés avec les

caséinates de sodium puisque dans le mélange avec les submicelles de caséines on est à pH 6

parce qu’en abaissant le pH, on augmente les charges positives sur la protéine.

CKC (g/L)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

F (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70SCsubmicelles de caséines

137

V.2. Gélification des mélanges submicelles de caséines et KC

V.2.1. Etude de la solution de KC

La solution de KC en présence de NaTPP a été comparée avec la solution de KC en présence

de NaCl, afin d’étudier l’effet du co-ion sur les propriétés rhéologiques du KC. On a effectué

un balayage en température et en fréquence. On a travaillé sur des solutions à 4g/L de KC et

0.5M de Na+ pour avoir une transition plus marquée.

Figure V. 4: Refroidissement (gauche) et chauffage (droite) d’une solution de 4g/L de KC pur, à

0.5M d’ions Na+ et à pH6. NaCl (cercle) et NaTPP (triangle).

Les températures critiques de fonte et de gélification du KC pur en présence d’ions sodium

sont plus faibles avec le TPP qu’avec le Cl-. On a un écart de 5°C pour 0.1M Na+ et de 10°C

pour 0.5M Na+ (Figure V. 4).

En revanche, les dépendances en fréquence des modules élastiques des gels à 2°C sont très

voisines (Figure V. 5).

T (°C)

10 20 30 40 50 60

G' (

Pa)

101

102

NaClNaTPP

T (°C)20 40 60 80

G' (

Pa)

101

102

NaCl NaTPP

138

Figure V. 5: Evolution de G’ et de G’’ à 2°C en fonction de la fréquence, à 0.5M d’ions Na+,

4g/L de KC et pH 6. NaCl (cercle) et NaTPP (triangle).

Le suivi de la dépendance en température au cours du refroidissement et du chauffage, des

modules des solutions de KC à 0.1 M KCl, pH 6, sans ou avec NaTPP (0.1M) montre que les

températures critiques de gélification et de fonte sont identiques pour des solutions de KC pur

en présence de KCl, sans ou avec NaTPP (Figure V. 6). On a donc un effet dominant du KCl.

Figure V. 6: Refroidissement (gauche) et chauffage (droite) de 4g/L de KC pur en présence de

KCl (0.1M), avec et sans NaTPP (0.1M) et à pH 6. KCl+NaTPP (cercle) et KCl (triangle).

f (Hz)

10-2 10-1 100

G' (

noir

),G

'' (r

ouge

) (P

a)10-1

100

101

102

103

NaClNaTPP

T (°C)

20 40 60 80

G' (

Pa)

101

102

103

104

KCl

KCL + NaTPP

T (°C)20 40 60 80

G' (

Pa)

101

102

103

104

KCl

KCl + NaTPP

139

Toutefois, les modules sont deux fois plus faibles en présence de TPP. Cette diminution du

module peut être un artefact de mesure, comme par exemple une cassure du gel ou un

détachement du produit à l’interface avec l’outil. Pour étudier correctement l’effet du co-ion

provenant des sels spécifiques, on devrait comparer KCl et KPO4 (phosphate de potassium).

V.2.2. Etude des mélanges homogènes

V.2.2.1. Influence de la nature du sel

Avant de comparer les systèmes SC et submicelles de caséine, nous étudierons l’influence des

2 types de sels utilisés (NaCl et NaTPP) sur les modules et les températures critiques du

système idéal SC / KC.

Les mélanges de 30g/L de SC et de 4g/L de KC en présence de NaTPP ou de NaCl à 0.1M

Na+ et à pH 6 ont été comparés.

Figure V. 7: Refroidissement (gauche) et chauffage (droite) respectivement d’un mélange de

30g/L de SC et de 4 g/L de KC, à 0.1M Na+ et à pH 6. NaCl (symbole plein) et NaTPP (symbole

ouvert).

Les températures critiques de gélification du mélange en présence de sodium sont plus faibles

avec le TPP qu’avec Cl- (figure V. 7), on a un écart de 3°C. Cette différence est due à la

nature du co-ion. En revanche, les températures critiques de fonte en présence de NaCl ou de

NaTPP sont identiques. Elles correspondent à la fonte du gel mixte (cassure des liaisons

T (°C)

0 10 20 30 40

G'(n

oir)

, G''

(rou

ge)

(Pa)

10-1

100

101

102

103

104

NaCl

NaTPP

T (°C)

0 10 20 30 40

G'(n

oir)

, G''

(rou

ge)

(Pa)

10-1

100

101

102

103

104

NaCl

NaTPP

140

protéines-KC). En effet, on est en excès de protéines 30g/L et en présence d’un ion non

spécifique du KC, c’est le gel induit par les protéines qui domine.

La dépendance en fréquence des modules des gels à 2 °C a été mesurée au bout de 103 s.

Figure V. 8: Evolution de G’ et G’’ à 2°C en fonction du temps (gauche) et de la fréquence

(droite) pour 30g/L de SC et 4g/L de KC à pH 6 et à 0.1M Na+.

Les modules évoluent très peu à 2°C avec le temps (figure V. 8). Les fluctuations de G’’ sont

dues au fait que l’écart entre les modules élastiques et visqueux est très élevée et donc le

déphasage très faible, ce qui empêche de mesurer correctement G’’. Les dépendances en

fréquence des modules élastiques des gels à 2°C sont pratiquement identiques (figure V. 8).

En effet, dans ces conditions, le module est apporté essentiellement par le gel mixte SC-KC,

le co-ion n’a pas d’effet.

V.2.2.2. Influence de la nature de la caséine

Deux mélanges mixtes à 4g /L de KC et à 30g/L de protéine ont été comparés : le système

avec SC et KC en présence de 0.1M NaCl et le système avec submicelles de caséines et KC

en présence de 0.1M de tripolyphosphate de sodium.

t (s)

100 101 102 103

G'(n

oir)

, G''

(rou

ge)

(Pa)

101

102

103

104

NaCl

NaTPP

f (Hz)

0.01 0.1 1 10

G'(n

oir)

, G''

(rou

ge)

(Pa)

101

102

103

104

NaCl

NaTPP

141

Figure V. 9: Refroidissement (gauche) et chauffage (droite) respectivement d’un mélange de

30g/L de protéine et de 4 g/L de KC, à 0.1M Na+ et à pH 6. Submicelles de caséines (triangle) et

SC (cercle).

La figure V. 9 montre que la température critique de gélification est plus forte de 3°C pour les

mélanges en présence de NaCl, effet du co-ion. Mais, les températures critiques de fonte

restent identiques car c’est la fonte du gel mixte qui gouverne. Les modules sont également

identiques. A partir de ces observations, on peut conclure que les deux systèmes ont le même

comportement rhéologique et que l’on observe également la présence d’un gel mixte dans les

mélanges submicelles de caséines et kappa carraghénane et qu’en excès de protéines, le gel

induit par les protéines est favorisé.

V.2.3. Systèmes submicelles de caséine et KC

Les systèmes à différentes concentrations de submicelles de caséines (0-40g/L) et à 4g/L de

KC, 0.5% de tripolyphosphate (conditions limites de dissociation) et à pH 6 ont été étudiés.

On a regardé l’effet de la concentration en submicelles de caséines sur les températures

critiques et les modules des gels.

T (°c)

10 20 30 40 50 60

G' (

noir

), G

'' (r

ouge

) (P

a)

10-1

100

101

102

103SC 30g/LSubmicelles 30 g/L

T (°c)

10 20 30 40 50 60

G' (

noir

), G

'' (r

ouge

) (P

a)

10-1

100

101

102

103SC 30g/LSubmicelles 30g/L

142

Figure V. 10: Evolution de G’ pendant le refroidissement (gauche) et le chauffage (droite) à

différentes concentrations de submicelles de caséines indiquées dans la figure, à 4 g/L de KC,

0.5% de NaTPP et pH 6.

Les températures critiques de gélification augmentent seulement faiblement avec la

concentration de submicelles de caséines car elles sont légèrement influencées par les cations

contenus dans la poudre de micelles de caséines. Par contre, les températures critiques de

fonte augmentent brusquement lorsqu’on ajoute les submicelles de caséines (figure V. 10) car

dans le mélange, la température critique de fonte est déterminée par les protéines. De plus, on

observe une hystérèse plus importante. On retrouve les résultats obtenus pour les systèmes

mixtes KC et SC.

T (°C)

10 20 30 40

G' (P

a)

10-1

100

101

102

103

104

0 g/L

10 g/L

40 g/L

T (°C)

10 20 30 40

G' (P

a)

10-1

100

101

102

103

104

0 g/L

10 g/L

40 g/L

143

Figure V. 11: Evolution de G’ et G’’ en fonction de la fréquence à différentes concentrations de

submicelles de caséines indiquées sur la figure, à 2°C, à 0.5% de NaTPP et pH 6.

La dépendance en fréquence des modules montre que dans ces conditions le KC pur ne forme

pas de gel à 2°C mais seulement un liquide visqueux. Cependant, en présence de submicelles

de caséines, le système forme un gel. La force du gel augmente avec la concentration en

submicelles de caséines (figure V. 11). On note qu’on retrouve les mêmes comportements que

pour les systèmes mixtes SC / KC. Ces résultats montrent que le système mixte avec les SC et

le système mixte avec les submicelles non agrégées ont des comportements identiques.

V.3. Conclusion

En général, on ne trouve aucune différence entre les deux systèmes, à part un abaissement de

la température critique de gélification en présence du co-ion triphosphate. Les modules à froid

et les températures critiques de fonte restent identiques, car ce sont les liaisons caséines/KC

qui dominent. En excès de potassium, ce sont les liaisons KC/KC qui gouvernent le système

mixte.

f (Hz)

10-2 10-1 100 101

G'(

marro

n),

G''

(oran

ge)

(Pa

)

10-4

10-3

10-2

10-1

100

101

102

103

104

0g/L10g/L40g/L

144

Chapitre VI : Propriétés structurales et rhéologiques des systèmes

mixtes SC et IC

145

Dans l’industrie, le kappa carraghénane (KC) et le iota carraghénane (IC) sont fréquemment

utilisés dans les produits laitiers. C’est pourquoi, nous avons étudié la structure et les

propriétés rhéologiques des systèmes mixtes SC/IC et nous les avons comparées avec les

systèmes SC/KC.

VI.1. Etude d’une solution de IC pur

Des solutions à 2 g/L de IC sont préparées à 60°C et à pH 7 avec différents types et

concentrations de sel. Les propriétés rhéologiques des solutions sont mesurées avec la

géométrie couette dans les conditions optimales suivantes : une déformation de 1%, une

fréquence de 1 Hz et une vitesse de 1°C/min.

VI.1.1. Etude cinétique

La figure VI. 1 montre l’évolution des modules de conservation G’ en fonction du temps à

différentes températures pendant le refroidissement et le chauffage.

Figure VI. 1: Cinétique de gélification (a) et de fonte (b) à différentes températures pour une

solution à 2 g/L IC, à 0.1 M NaCl et à pH 7.

t(s)102 103

G' (

Pa)

10-1

100

1012 °C

10 °C

20°C

30°C

35°C

40 °C

(a)

t(s)102 103

G' (

Pa)

10-1

100

101

(b)

146

A température donnée, le module G’ évolue beaucoup au début, puis lentement après sans

atteindre un équilibre. Les cinétiques de gélification et de fonte sont très dépendantes de la

température. Plus on se situe loin en-dessous de Tc, plus la vitesse de formation du gel est

importante. Plus on se situe loin au-dessus de Th, plus la vitesse de fonte du gel est

importante. Toutefois, quelle que soit la température, les modules se rapprochent à temps

long. Le ralentissement de la gélification proche de Tc est similaire à celui observé dans la

littérature par Meunier et al. pour les solutions de KC pur (Meunier, Nicolai, Durand and

Parker, 1999) .

VI.1.2. Effet du type de sel

A la fin de chaque mesure de cinétique de gélification ou de fonte, les dépendances en

température et la dépendance en fréquence des modules ont été mesurées. Les résultats

obtenus sont montrés respectivement sur les figures VI. 2 et VI. 3.

Figure VI. 2: Evolution de G’ à 1 Hz pendant le refroidissement (symboles noirs) et

chauffage (symboles rouges) pour une solution à 2 g/L de IC pur, à pH 7, à 0.1M NaCl

(triangles) et à 0.1 M KCl (cercles).

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

10-1

100

101NaCl 0.1MKCl 0.1M

147

Pendant le refroidissement, le IC pur en présence de NaCl ou de KCl montre une transition

sol-gel à Tc. Cette transition est thermoréversible et pendant le chauffage, on observe la

transition gel-sol à une température critique Th voisine de Tc, il n’existe pas donc d’hystérèse.

Figure VI. 3: Evolution de G’ et G’’ en fonction de la fréquence à 2°C pour une solution à

2g/L de IC, à pH 7, à 0.1M NaCl (triangles) et à 0.1 KCl (cercles).

Pour T<Tc, le module G’ est pratiquement indépendant de la fréquence dans la gamme allant

de 10-2 à 10 Hz, et est supérieur à G’’ ce qui indique que le IC à 0.1 M NaCl ou à 0.1 M KCl

et à pH 7 forme un gel. Comme pour KC, l’origine de la gélification est la transition pelote-

hélice.

En présence de KCl, les températures critiques sont légèrement décalées vers les hautes

températures et les modules légèrement plus élevés. KCl n’est donc pas un ion spécifique

pour le IC.

Ces résultats confirment les observations trouvées dans la littérature (Nilsson and Piculell,

1991; Piculell, 1991; Piculell, Nilsson and Muhrbeck, 1992; Piculell, Nilsson and Ström,

1989)

f (Hz)

10-2 10-1 100 101

G' (

noir

), G

'' (r

ouge

) (P

a)

10-2

10-1

100

101

NaCl 0.1MKCl 0.1M

148

VI.1.3. Effet de la concentration de IC

L’effet de la concentration de IC sur l’évolution du module G’ en fonction de la température a

été étudié pendant le refroidissement et le chauffage.

Figure VI. 4: Evolution de G’ à 1 Hz pendant le refroidissement (symboles noirs) et

chauffage (symboles rouges) pour des solutions à 2 g/L et 10 g/L de IC pur, à pH 7, à 0.1M

NaCl (a) et à 0.25 M NaCl (b).

On constate que pour une température donnée, le module élastique est d’autant plus élevé que

la concentration est importante. Cette augmentation est en accord avec la littérature (Morris

and Belton, 1980; Morris and Chilvers, 1981)

Les températures critiques augmentent aussi avec la concentration parce qu’on ajoute du sel

en augmentant la concentration en IC. Il en est de même quand on augmente la force ionique,

voir figure VI. 4a et 4b. Ces observations rejoignent celles de Michon et al. (Michon,

Cuvelier, Launay and Parker, 1996b)

T (°C)

0 10 20 30 40 50 60

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

2 g/L10g/L

(a)

T (°C)

0 20 40 60 80

G' (

Pa)

10-1

100

101

102

2 g/L10 g/L

(b)

149

VI.1.4. Effet de la force ionique

Nous avons fait varier la concentration en NaCl de 0 à 0.5 M. Les températures critiques et les

modules élastiques G’ ont été déterminés en fonction de la concentration totale en NaCl dans

la solution qui résulte de l’addition du NaCl provenant des contre-ions de IC, du NaCl ajouté

et de l’agent bactéricide (NaN3).

Figure VI. 5: Températures critiques d’une solution de IC à 2 g/L en fonction de la

concentration totale en NaCl. Tc (cercles noirs) et Th (triangles rouges).

La figure VI. 5 montre que les températures critiques de refroidissement (Tc) et de chauffage

(Th) augmentent avec la concentration totale en NaCl. Ces résultats sont similaires à ceux

trouvés par Parker et al. (Parker, Brigand, Miniou, Trespoey and Vallée, 1993). Les

températures critiques sont voisines de celles obtenues par Rochas et al. (Rochas, Rinaudo

and Landry, 1989) . Il n’existe pas d’hystérèse, ce qui confirme les observations de Picullel

(Piculell et al., 1992) . Ceci peut être attribué à une faible association des hélices de IC.

[NaCl]total (M)

10-2 10-1 100

T(°

C)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

150

Figure VI. 6: Modules de conservation à 2°C et à 1 Hz d’une solution de IC à 2 g/L en fonction

de la concentration totale en NaCl.

A 2°C, le IC pur forme un gel vers 5mM NaCl et le module élastique du gel augmente avec

l’augmentation de la concentration en NaCl jusqu’à environ 0.25M pour atteindre 7.6 Pa,

puis, diminue brusquement (Figure VI. 6). Des observations similaires ont été rapportées dans

la littérature (Parker et al., 1993; Rochas, Rinaudo and Landry, 1990; Thrimawithana, S.

Young, Dunstan and Alany, 2010)

VI.1.5. Comparaison KC et IC

Les solutions de IC et de KC ont été comparées en présence de 0.1 M NaCl ou KCl, à pH 7.

L’évolution des températures critiques en fonction de la force ionique pour une solution de IC

ou de KC à 2 g/L est donnée sur la figure VI. 7.

[NaCl]total (M)

10-2 10-1 100

G' (

Pa)

2

3

4

5

6

7

89

10

151

Figure VI. 7: Températures critiques des solutions de IC (symboles pleins) et de KC (symboles

ouverts) à 2 g/L en fonction de la concentration totale en NaCl. Tc (cercles noirs) et Th

(triangles rouges).

Comme montré précédemment, les températures critiques pour IC et KC augmentent avec

l’augmentation de la force ionique. Mais, les températures critiques de IC restent supérieures

aux températures critiques de KC. De plus, on observe une hystérèse pour KC, mais pas pour

IC.

On observe qu’en présence de 0.1 M KCl, les températures critiques de la solution de KC à 2

g/L (Tc =50°C et Th =70°C) sont plus élevées que les températures critiques de la solution de

IC à 2 g/L (Tc=Th=43°C).

Pour chacune des solutions de KC et de IC à 2 g/L, en présence de 0.1 M NaCl ou KCl, à pH

7, nous avons mesuré la dépendance en fréquence des modules à 2°C, figure VI .8.

[NaCl]total (M)

10-2 10-1 100

T (

°C)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

IC 2 g/LKC 2 g/L

152

Figure VI. 8: Evolution de G’ et de G’’ à 2°C en fonction de la fréquence pour des solutions à 2

g/L de KC ou de IC dans 0.1 M NaCl (a) ou KCl (b).

Comme nous l’avons dit dans le chapitre IV, la dépendance en fréquence des modules montre

que le KC à 0.1 M NaCl et pH 7 ne forme pas de gel à 2°C mais un liquide visqueux. Par

contre dans les mêmes conditions, IC a un comportement de gel (figure VI. 8a). En présence

de 0.1 M KCl, la dépendance en fréquence des modules élastiques à 2°C montre que les 2

solutions forment des gels et que le module du gel de KC est 104 fois plus élevé que celui de

IC (figure VI. 8b).

En conclusion, l’élasticité des gels est plus forte avec NaCl pour le IC et avec KCl pour le

KC.

VI.2 Etude des mélanges SC et IC sous forme pelote

VI.2.1. Morphologie

Les mélanges à 0.1M NaCl, pH 7 sont observés par MCBL. Les protéines sont marquées avec

la rhodamine RITC à 5ppm et sont colorées en blanc sur les photos. Les mélanges de KC et

SC ont été préparés à différentes concentrations de SC et de IC. Nous montrons ici deux

images prises immédiatement après mélange à 20°C.

f (Hz)10-2 10-1 100 101

G' (

noir

), G

'' (r

ouge

) (P

a)

10-2

10-1

100

101

102

103

104

105

KCIC

(a)

f (Hz)10-2 10-1 100 101

G' (

noir

), G

''(ro

uge)

(Pa

)

10-2

10-1

100

101

102

103

104

105

(b)

(b)

153

Figure VI. 9: Images confocales d’un mélange homogène à 70 g/L de SC et 1 g/L de IC (a) et

d’un mélange hétérogène à 50 g/L de SC et 9 g/L de IC (b) à 0.1 M NaCl, pH 7. Taille des

images 160 mm.

On observe deux types de mélanges : un mélange homogène (figure VI. 9a) et un mélange

hétérogène (figure VI. 9b). La séparation de phase se fait plus rapidement en présence de IC

qu’en présence de KC, cette différence entre le KC et l’IC peut être due au nombre de charges

sur les chaînes, mais, pas à la conformation car à cette température, le KC et L’IC sont sous

forme pelote. Avec le temps, la séparation de phase ségrégative peut devenir macroscopique

avec une phase supérieure riche en IC et une phase inférieure riche en SC. La séparation de

phase complète des deux biopolymères dépend de la viscosité du milieu.

Dans les systèmes homogènes ou hétérogènes, on observe très peu d’agrégats et la fraction de

SC ou de IC dans les agrégats est négligeable, environ 5%. L’absence d’agrégation dans le

système mixte SC/IC peut être expliquée par la densité de charge de IC qui est plus grande

que celle de KC.

VI.2.2. Diagramme de phase

(a) (b)

154

Les compositions de la phase supérieure riche en IC et de la phase inférieure riche en SC ont

été déterminées de la même façon que pour le mélange KC/SC (voir le chapitre III-3).

Figure VI. 10: Comparaison des diagrammes de phase des mélanges SC/KC et SC/IC à pH

7et 0.1M NaCl. Les deux lignes sont les binodales.

En présence de IC, la binodale est déplacée vers les hautes concentrations de SC, voir figure

VI. 10. La séparation de phase se déplace vers les hautes concentrations de SC parce que la

chaîne de IC est plus chargée que celle de KC. Des auteurs ont montré une séparation de

phase ségrégative par déplétion-floculation pour des systèmes mixtes lait/carraghénane à

60°C et des diagrammes de phase identiques pour KC et IC (Langendorff, Cuvelier, Michon,

Parker and De Kruif, 2000) .

VI.3. Gélification des mélanges monophasiques SC et IC

VI.3.1. Influence de la concentration de SC

CSC (g/L)

0 20 40 60 80 100

Cca

rrag

hén

ane (

g/L

)

0

2

4

6

8

10

12

14KCIC

155

Nous avons étudié l’effet de l’ajout de SC à IC, 0.1M NaCl sur les températures critiques (Tc

et Th) et le module du gel. 0.1M NaCl est suffisant pour écranter significativement les

interactions électrostatiques. Des mélanges monophasiques de IC à 2 g/L et à différentes

concentrations de SC (0 à 60 g/L) ont été préparés en présence de 0.1M NaCl et à pH 7. Les

valeurs des modules G’ pendant le refroidissement et la fonte ont été mesurées après avoir

laissé le système mixte au repos pendant une heure à la temperature voulue.

Les modules G’ en fonction de la température pendant le refroidissement et la fonte sont

donnés sur la figure VI. 11.

T (°C)

10 20 30 40 50

G' (

Pa)

0.1

1

10 60g/L

T (°C)

10 20 30 40 50

G' (

Pa)

0.1

1

10 0 g/L

T (°C)

10 20 30 40 50

G' (

Pa)

0,1

1

10 20g/L

T (°C)

10 20 30 40 50

G' (

Pa)

0,1

1

10 40g/L

(c)

(a) (b)

(d)

156

Figure VI. 11: Evolution de G’ à 1 Hz mesuré pendant le refroidissement (symboles noirs) et

le chauffage (symboles rouges) des mélanges à 2 g/L de IC dans 0.1 M NaCl et différentes


Comme nous l’avons dit précédemment, on constate une augmentation de G’ quand on baisse

la température à partir d’une température critique Tc et une diminution de G’ quand on

augmente la température à partir d’une température critique Th. Dans le système mixte, les

températures Tc et Th sont très voisines et dépendent très peu de la concentration en SC

(figure VI. 11). On n’observe pas 2 étapes pendant la fonte comme pour le KC. Les liaisons

entre IC pur se casseraient à des températures plus élevées que les liaisons entre IC et SC.

Les systèmes mixtes IC et SC comme les solutions de IC pur forment des gels à 2°C dans ces

conditions et les modules des gels varient faiblement avec la concentration de SC.

Les modules de conservation G’ à 1 Hz et 2°C ainsi que les températures critiques ont été

mesurés en fonction de la concentration de SC pour 2 g/L de IC. Ces valeurs ont été

comparées à celles de KC dans les mêmes conditions (figure VI. 12 et 13).

CSC(g/L)

0 10 20 30 40 50 60

G'(P

a)

101

102

103

104KC 2 g/LIC 2 g/L

157

Figure VI. 12: Evolution des modules de conservation G’ à 2°C en fonction de la

concentration en SC (100mM NaCl et à pH 7) pour des systèmes mixtes avec IC ou KC.

Les modules évoluent peu avec la concentration de SC. Le module du mélange KC/SC est

100 fois supérieur au module du mélange IC/SC. Les gels du mélange de IC et de SC sont

assez faibles, ce qui rejoint les résultats trouvés dans la littérature pour les systèmes

lait/carraghénanes (Langendorff et al., 1999)

Figure VI. 13: Evolution des températures critiques de refroidissement (symboles rouges) et

de chauffage (symboles noirs) en fonction de la concentration en SC (100mM NaCl et à pH

7) pour les systèmes mixtes avec IC ou KC.

Les températures critiques du mélange avec IC sont supérieures aux températures critiques du

mélange avec KC en présence de NaCl parce que dans ces conditions expérimentales les

températures critiques sont gouvernés par les liaisons purement IC. Par contre, en excès de

KCl, les températures critiques du mélange avec KC sont supérieures aux températures

critiques du mélange avec IC parce que dans ces conditions expérimentales les températures

critiques sont gouvernés par les liaisons purement KC, on est en effet en présence d’un ion

spécifique du KC.

VI.3.2. Influence de la force ionique

CSC(g/L)

0 10 20 30 40 50 60

T(°

C)

10

20

30

40

50

60KC 2 g/LIC 2 g/L

158

On a regardé l’effet de la force ionique sur les systèmes mixtes SC 60g/L et IC 2 g/L dans

lesquels on suppose que toutes les protéines forment un gel mixte avec le IC. On a étudié

l’impact du SC en faisant varier la quantité de sodium. On a également fait varier la

concentration de NaCl, pour voir s’il existe une concentration critique de NaCl au-delà de

laquelle l’effet de SC sur le gel mixte devient négligeable.

Figure VI. 14: Températures critiques en fonction de la concentration totale en NaCl (a) et de

la concentration ajoutée en NaCl (b) pendant le refroidissement (noir) et le chauffage (rouge)

du IC pur (cercles) et du mélange SC 60g/L et IC 2g/L (triangles).

La figure VI. 14a montre qu’à faible concentration totale en NaCl, la température critique de

gélification du mélange est identique à la température critique de la solution de IC pur. Ces

températures sont influencées par les cations présents dans la solution ou le mélange. La

température critique de fonte est supérieure à la température critique de gélification et on

observe une hystérèse. Dans cette gamme de concentration totale en NaCl, la température

critique de fonte est déterminée par la présence de protéines.

Au dessus d’une concentration critique en NaCl, les températures critiques de IC pur et des

mélanges sont identiques et on n’observe plus d’hystérèse car l’effet des protéines devient

négligeable.

La comparaison de la figure VI. 14b (en fonction de la concentration ajoutée en NaCl) avec la

figure VI. 14a (en fonction de la concentration totale en NaCl) montre clairement qu’à faible

concentration en NaCl, la température critique de gélification est déterminée par les cations

[NaCl]total (M)

10-2 10-1 100

T (

°C)

0

20

40

60

80

100

IC + SCIC

(a)

[NaCl]ajoutés (M)

10-3 10-2 10-1 100

T (

°C)

0

20

40

60

80

100IC + SCIC

(b)

159

contenus dans la poudre de SC et la température critique de fonte est influencée par la

présence des protéines.

Figure VI. 15: Modules de conservation à 2°C et à 1 Hz en fonction de la concentration totale

en NaCl (a) et de la concentration ajoutée en NaCl (b) pour le IC pur (cercles) et du mélange

SC 60g/L et IC 2g/L (triangles).

Les modules élastiques des systèmes mixtes IC/SC ou de IC pur augmentent avec

l’augmentation de la concentration de NaCl jusqu’à un maximum, puis diminuent (figure VI.

15). On note également qu’à faible concentration en NaCl, les systèmes mixtes ont des

modules à 2°C et à 1 Hz légèrement supérieurs aux modules des gels de IC pur. En présence

de NaCl, les protéines influencent peu les modules des gels de IC contrairement aux gels de

KC. Ces résultats confirment ceux de Lynch et al. qui montrent qu’en absence de calcium,

l’ajout de SC modifie peu les propriétés rhéologiques des gels de IC (Lynch and Mulvihill,

1996)

Puisque NaCl et KCl agissent de la même manière sur le gel de IC, on suppose qu’en

présence de KCl, nous aurons aussi un effet similaire des protéines sur le gel de IC.

Des auteurs ont montré la présence d’un gel mixte pour le système lait/carraghénane. La

présence de micelles de caséines induit une augmentation très sensible des températures

critiques de gélification et des modules de conservation G’ des gels. Selon la concentration de

[NaCl]total (M)

10-2 10-1 100

G' (

Pa)

101

ICIC + SC

(a)

[NaCl]ajoutés (M)

10-3 10-2 10-1 100

G' (

Pa)

101

ICIC + SC

(b)

160

IC, différents types de réseaux ont été mis en évidence dans le gel. A 0.2% de IC, ils

observent 2 réseaux : un réseau similaire au gel de IC pur et un autre réseau impliquant

probablement des ponts entre micelles de caséines et hélices de IC (Langendorff et al., 1999;

Langendorff, Cuvelier, Launay and Parker, 1997) .

VI.4. Conclusion

L’étude des solutions de IC pur a montré qu’il y a pas de différence entre NaCl et KCl sur les

comportements rhéologiques de IC. Les températures critiques dépendent de la concentration

de IC à travers les ions présents dans le IC. La comparaison entre le IC et le KC montre qu’en

présence de NaCl, le IC forme un gel à 2°C contrairement à KC qui forme une solution visco-

élastique. En présence de KCl, les deux solutions forment un gel à 2°C et les modules

élastiques de KC sont 103 fois supérieurs aux modules élastiques de IC.

La comparaison entre KC et IC dans le système mixte montre que :

- La séparation de phase est déplacée vers les hautes concentrations de SC en présence

de IC. Il n’y a pas de phénomène d’agrégation dans le système mixte SC/IC, parce que

le IC a une densité de charges plus élevée.

- Le système SC/IC forme un gel mixte à T<Tc avec un module élastique 100 fois plus

faible que le module élastique du gel mixte SC/KC. Ce gel contient deux types de

liaisons : des liaisons mixtes IC-SC et des liaisons purement IC-IC. La fonte du gel

mixte SC/IC n’est pas détectée en rhéologie car dans nos conditions expérimentales le

gel mixte fond à des températures critiques inférieures au gel de IC pur. Les caséinates

de sodium influencent peu les modules élastiques à 2°C et les températures critiques.

On n’observe pas d’hystérèse pour la solution de IC en présence ou en absence de

caséinates de sodium.

161


Langendorff, V., Cuvelier, G., Launay, B., Michon, C., Parker, A. & De Kruif, C. G. (1999),

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163

Conclusion générale

164

Conclusion générale

L’objectif de cette thèse consistait à comprendre les mécanismes qui contrôlent la structure et

les propriétés rhéologiques des systèmes mixtes caséinates/carraghénane grâce à l’étude de

l’influence de différents paramètres tels que la force ionique, le pH, la concentration en

biopolymères et la nature du sel.

Pour ce faire, des études expérimentales ont été réalisées principalement en rhéologie, en

microscopie confocale à balayage laser et en diffusion de la lumière en milieu turbide. Afin de

comprendre les interactions mises en jeu dans les systèmes mixtes, nous avons comparé leurs

comportements à ceux des systèmes purs, les caséinates d’une part et les carraghénanes

d’autre part.

Dans un premier temps, nous avons étudié les mélanges caséinates de sodium/kappa

carraghénane. Le diagramme de phase présente 2 domaines : un domaine monophasique aux

faibles concentrations en caséinates de sodium et en kappa carraghénane et un domaine

biphasique dû à une incompatibilité thermodynamique aux hautes concentrations en protéines.

Dans les 2 domaines, nous observons également la présence d’agrégats irréversibles riches en

protéines et pauvres en kappa carraghénane dont la taille et la masse molaire dépendent de la

concentration en caséinates de sodium et en kappa carraghénane. Avec le temps, ces agrégats

floculent et précipitent, mais peuvent être redispersés en solution par chauffage et agitation.

Ces agrégats influencent la viscosité du mélange. La teneur en caséinates de sodium dans les

agrégats dépend de la concentration en kappa carraghénane, de la force ionique et du pH, mais

ne dépend pas de la concentration en caséinates de sodium.

Ensuite, nous avons étudié la gélification des mélanges monophasiques caséinates de

sodium/kappa carraghénane. En présence d’un sel non spécifique du kappa carraghénane

(NaCl), les protéines n’influencent pas la température critique de gélification, mais augmente

la température critique de fonte ainsi que le module élastique des gels mixtes.

165

Ces résultats ont été attribués à la présence d’un gel mixte. Ce gel mixte contient deux types

de liaisons : des liaisons purement KC/KC et des liaisons KC/SC. L’importance relative des

deux types de liaisons dépend de la concentration en caséinates de sodium.

En présence d’un ion spécifique du kappa carraghénane, KCl, et en excès de protéines, on

forme le gel mixte. A faible concentration en KCl, la température de gélification dépend des

sels apportés par la poudre de protéines tandis que la température de fonte et le module

élastique dépendent des liaisons KC/SC. En excès de KCl, les températures critiques et les

modules élastiques dépendent essentiellement des liaisons KC/KC.

En présence d’un sel qui bloque la gélification de kappa carraghénane, NaI, on n’observe pas

de gel, mais un liquide viscoélastique. Dans ces conditions, les caséinates de sodium

augmentent fortement la viscosité du système puisqu’ils s’associent aux hélices de kappa

carraghénane, ce qui se manifeste par le ralentissement de la relaxation.

Dans un deuxième temps, nous avons comparé les caséinates de sodium et les submicelles de

caséines parce que les submicelles de caséines sont très utilisées dans la fabrication de

certains produits laitiers. Nous avons montré que si la morphologie des mélanges,

l’agrégation, les modules élastiques à 2°C et les températures critiques de fonte sont très

voisins pour les deux systèmes mixtes, les températures critiques de gélification qui sont

toujours inférieures pour les systèmes mixtes avec submicelles de caséines. Ceci s’explique

par le fait que la température critique de gélification dépend essentiellement de la nature et de

la concentration du sel dans le mélange alors que la température critique de fonte est associée

à la cassure des liaisons SC/KC.

Enfin, nous avons comparé le iota carraghénane et le kappa carraghénane dans les mélanges

car le iota carraghénane est également beaucoup utilisé dans l’industrie alimentaire. Les

systèmes mixtes avec le iota carraghénane conduisent à une séparation de phase ségrégative

pour des concentrations plus hautes que pour le kappa carraghénane. Il n’y a pas d’agrégation

entre les caséinates de sodium et le iota carraghénane car le iota carraghénane est plus

électronégatif que le kappa carraghénane. Le mélange caséinate de sodium/iota carraghénane

forme également un gel mixte pendant le refroidissement, mais sa fonte n’est pas détectée en

rhéologie car dans nos conditions expérimentales le gel mixte fond à des températures

166

critiques inférieures au gel de IC pur. Les caséinates de sodium influencent faiblement les

modules élastiques à 2°C et les températures critiques. On n’observe pas d’hystérèse avec le

iota carraghénane.

Le comportement du gel mixte caséinate de sodium/iota carraghénane est identique à celui du

gel caséinate de sodium/kappa carraghénane : les liaisons caséinates de sodium/carraghénane

domine à faible concentration en sel, mais à haute concentration en sel, ce sont les liaisons

carraghénane/carraghénane qui gouvernent le système mixte. Cependant, le module du gel

mixte induit par le iota carraghénane est 100 fois inférieur au module du gel induit par le

kappa carraghénane.

Les mélanges kappa carraghénane/iota carraghénane étant généralement utilisés dans les

produits laitiers, il serait intéressant par la suite d’étudier les propriétés structurales et

rhéologiques de ces mélanges, puis leurs propriétés physico-chimiques en présence de

caséinates de sodium en fonction de la force ionique, du pH, des concentrations en

biopolymères et du rapport iota/kappa.

167

Annexe

Cluster formation and phase separation in mixtures of sodiumk-carrageenan and sodium caseinate

Merveille Nono, Lucie Lalouette, Dominique Durand, Taco Nicolai*

Polymères, Colloïdes, Interfaces, UMR-CNRS, Université du Maine, 72085 Le Mans Cedex 9, France

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 10 February 2010

Accepted 23 August 2010

Keywords:

Casein

Carrageenan

Phase separation

Protein

Polysaccharide

a b s t r a c t

Mixtures of the polysaccharide k-carrageenan (KC) and caseinate proteins (SC) from milk were investi-

gated at pH 7 in aqueous solution using confocal scanning laser microscopy and light scattering. Phase

separation was observed at higher concentrations and the phase diagram was established. In the

mixtures SC was observed to form large aggregates mediated by a relatively small amount of KC. At small

KC concentrations the aggregates were initially relatively small and could be characterized by light

scattering. At higher KC concentrations or on longer storage at 20 !C, dense clusters with a radius of a few

microns were formed that slowly precipitated. The fraction of precipitated protein increased linearly

with increasing KC concentration, but was independent of the protein concentration. It increased with

decreasing pH from about 20% at pH 8 to 100% at pH 5.

! 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

k-Carrageenan (KC) is an anionic polysaccharidewhich is widely

used to improve textural properties of dairy products. In order to

control these properties it is important to understand the interac-

tion of KC with milk proteins, notably casein. Casein is the main

protein component of milk and consists mainly of four different

kinds of amino acid chains (as1, as2, b and k) eachwith amolarmass

of approximately 2"104 g/mol (Fox, 2003). In milk, casein is

present in the form of spherical complexes called micelles with

a radius of about 100 nm containing so-called colloidal calcium

phosphate (CCP) which is necessary for its integrity. Casein

precipitates at pH 4 and the CCP dissolves. The precipitated casein

can be redissolved in the form of sodium caseinate (SC) free of

CPP by raising the pH with NaOH. SC forms small particles with

a radius of about 11 nm and consists of approximately 15 casein

molecules at 20 !C, increasing somewhat with increasing temper-

ature (HadjSadok, Pitkowski, Benyahia, Nicolai, & Moulai-Mostefa,

2007).

k-Carrageenan is one of a family of sulphonated polysaccharides

extracted from seaweed (Piculell, 2006). In aqueous solution, KC

has a random coil conformation at high temperatures, but a tran-

sition to a helix conformation occurs after cooling below a critical

temperature. The transition temperature increases with increasing

salt concentration and is strongly dependent on the type of ions.

Generally, in the helix conformation KC aggregates and forms a gel.

Sodium is not very effective and induces gelation at room

temperature only above 0.2 M, whereas potassium is very effective

as 0.01 M causes gelation at room temperature (Rochas & Rinaudo,

1980).When gels are heated, theymelt and the KC chains go back to

the random coil conformation, but this occurs at a significantly

higher temperature.

Mixtures of KC and casein have been investigated extensively,

motivated in part by their application in the food industry. Most

often, the interaction of KC with native casein micelles has been

studied both in milk (Arltoft, Ipsen, Madsen, & De Vries, 2007;

Drohan, Tziboula, McNulty, & Horne, 1997; Hemar, Hall, Munro, &

Singh, 2002; Ji, Corredig, & Goff, 2008; Langendorff et al., 2000;

Puvanenthiran, Goddard, McKinnon, & Augustin, 2003; Rodd,

Davis, Dunstan, Forrest, & Boger, 2000; Trckova, Stetina, & Kansky,

2004) and in salt solutions (Bourriot, Garnier, & Doublier, 1999;

Dalgleish & Morris, 1988; Schorsch, Jones, & Norton, 2000). Light

scattering and electron microscopy showed that KC in the helical

conformation binds to casein and may bridge different casein

micelles (Dalgleish &Morris, 1988; Langendorff et al., 2000; Martin,

Goff, Smith, & Dalgleish, 2006; Schorsch et al., 2000; Spagnuolo,

Dalgleish, Goff, & Morris, 2005). Casein micelles crosslinked by

bridging KC may form a system spanning network. Often an

increase of the storage shear modulus (G0) is reported after addition

of casein at KC concentrations (CKC) larger than 1 g/L (Hemar et al.,

2002; Puvanenthiran et al., 2003; Trckova et al., 2004), but Drohan

et al. (1997) observed little effect. At very low KC concentrations* Corresponding author.

E-mail address: [email protected] (T. Nicolai).

Contents lists available at ScienceDirect

Food Hydrocolloids

journal homepage: www.elsevier .com/locate/ foodhyd

0268-005X/$ e see front matter ! 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

doi:10.1016/j.foodhyd.2010.08.017

Food Hydrocolloids 25 (2011) 743e749

(0.2 g/L), Drohan et al. found that the presence of casein micelles

could inhibit gelation of KC, while Schorsch et al. (2000) found that

it reinforced the gel. The latter observed that gelation was induced

by addition of casein to dilute KC solutions (0.2 g/L) that did not gel

in the absence of casein.

Strong heterogeneity was observed in gelled systems, perhaps

due to partial phase separation frozen-in by gelation (Arltoft et al.,

2007; Bourriot et al., 1999; Hemar et al., 2002; Schorsch et al.,

2000). Phase separation between casein and KC can be expected

since proteins and polysaccharides are thermodynamically

incompatible unless they are oppositely charged (Semenova &

Dickinson, 2010; Tolstoguzov, 2003). If they have the same net

charge, which is the case for KC and casein at pH> 5, segregative

phase separation is the rule rather than the exception. Gels were

not observed when KC had the random coil conformation, but at

high concentrations macroscopic phase separation was observed

(Bourriot et al., 1999; Langendorff et al., 2000; Schorsch et al.,

2000). Depletion flocculation was suggested as the driving force

for phase separation in addition to thermodynamic incompatibility.

It is well established that in order to induce co-aggregation and

gelation of KC/casein mixtures, KC needs to have a helix confor-

mation. It is not entirely clear, however, whether KC in the helical

conformation binds to casein micelles.

Interaction of KC with individual casein molecules or SC has

beenmuch less studied. It has been known for quite some time that

in the absence of calcium ions KC co-aggregates with k-casein, but

not with a1- and b-casein (Payens, 1972; Snoeren, Both, & Schmidt,

1976; Snoeren, Payens, Jeunink, & Both, 1975) even at values of the

pH where the net charge of both polymers is negative. It was

suggested that k-casein chains contain a distinct positively charged

section that can bind the negatively charged KC. Lynch et al.

(Lynch & Mulvihill, 1994) found almost no effect on G0 for KC gels

after adding SC, while Hemar et al. (2002) reported an increasewith

increasing SC concentration. Oakenfull, Miyoshi, Nishinari, and

Scott (1999) observed a decrease of G0 when small amounts of SC

(CSC< 5 g/L) were present and an increase at higher SC concen-

trations. Macroscopic phase separation has so far not been reported

for mixtures of KC and individual caseins or SC, but Hemar et al.

(2002) observed with confocal laser scanning microscopy (CLSM)

heterogeneity on length scales of several microns in mixed gels.

The KC solutions used in these earlier studies on mixtures

with SC contained ions (Kþ, Ca2þ) that induced the coilehelix

transition and gelation of KC. For the present studywe used KCwith

sodium counter-ions. We present the results of our investigation in

two parts. Elsewhere, we discuss the influence of caseinate on the

gelation of KC after it has undergone a coilehelix transition (Nono,

Nicolai, & Durand, 2011). Here we will discuss the behaviour SC/KC

mixtures at conditions where KC has a random coil conformation.

2. Materials and methods

The sodium caseinate powder, provided by DMV International

(Veghel, Netherlands), was dissolved in deionised water (Millipore)

containing 3 mM sodium azide as a bacteriostatic agent. The pH

was adjusted by slow addition of 0.01 M HCl or 0.01 M NaOH under

continuous stirring and was set at 7 unless otherwise indicated.

About 100 mL solution was dialysed against about 4 L solvent for

a period of 24 h renewing the solvent several times. The solution

was then centrifuged (Beckman Coulter, Allegra 64R Centrifuge) at

6"104 g for 2 h after which we observed a sediment at the bottom,

a turbid layer at the top, and a clear supernatant in themiddle. After

removal of the turbid layer the clear supernatant was collected and

filtered through 0.45 mm pore size filters. The SC concentration

(CSC) was determined after filtration using UV absorption with an

extinction coefficient of 0.81 L g%1 cm%1. The amount of protein that

was eliminated by this purification method is less than 5%. The

residual amount of calcium in the sample was less than 0.01%

(w/w).

The sodium k-carrageenan used for this study is an alkali treated

extract from Eucheuma cottonii andwas a gift from SKWBiosystems

(Baupte, France). Using NMR it was found that the sample con-

tained less than 5% i-carrageenan (Meunier, 1999). A freeze-dried

sample of KC was dissolved by stirring for a few hours in Milli-Q

water (70 !C) with 3 mM sodium azide added as a bacteriostatic

agent. The solution was extensively dialysed against Milli-Q water

at pH7 and subsequently filtered through 0.45 mmpore size Anatop

filters. The KC concentration (CKC) was determined by measuring

the refractive index using refractive index increment 0.145 g/mL.

The weight average molar mass was determined by light scattering

using the methodology described elsewhere (Meunier, Nicolai,

Durand, & Parker, 1999): Mw¼ 2.1"105 g/mol.

Confocal laser scanning microscopy was used in the fluorescence

mode. Observations were made with a Leica TCS-SP2 (Leica

Microsystems Heidelberg, Germany). A water immersion objective

lens was used HCx PL APO 63" NA¼ 1.2 with theoretical resolution

0.3 mm in the xey plane. SC was labelled with the fluorochrome

rhodamine B isothiocyanate (Rho), by adding a small amount of

a concentrated rhodamine solution to the SC solutions before heat

treatment. Rho was exited using a heliumeneon laser with wave-

length 543 nm and the fluorescence was detected with a photo-

multiplier. Care was taken not to saturate the fluorescence signal

and it was verified that the amplitude of the signal was propor-

tional to the polymer concentration in pure solutions.

Light scattering measurements were done at 20 !C using a so-

called 3D cross-correlation instrument (LS Instruments, Fribourg,

Switzerland). The light source was a diode laser with wavelength

l¼ 680 nm. The temperature was controlled by a thermostat bath

to within '0.1 !C. The relative excess scattering intensity (Ir) was

calculated as the intensity minus the solvent scattering divided by

the scattering intensity of toluene. In dilute solutions Ir is related to

the weight average molar mass (Mw) and the structure factor (S(q))

of the solute (Brown, 1996; Nicolai, 2007a):

Ir ¼ KCMwS ðqÞ (1)

with K a constant that depends on the refractive index increment of

the solute. The z-average radius of gyration (Rgz) can be calculated

from the initial q-dependence of S(q):

S ðqÞ ¼h

1þ"

q$Rgz#2=3

i%1(2)

3. Results and discussion

The behaviour of KC/SC mixtures was studied at pH7 in the

absence of added salt and in 0.1 M NaCl. Pure KC solutions were

transparent over the whole concentration range investigated

(CKC¼ 0e15 g/L). The viscosity at 20 !C increased strongly above the

overlap concentration (C*z 0.5 g/L) in a manner expected for

flexible polymers as was reported in detail elsewhere (Croguennoc,

Meunier, Durand, & Nicolai, 2000). Pure SC solutions at the same

conditions were transparent at low concentrations, but they were

weakly opalescent at concentration above 10 g/L, because they

contained a very small weight fraction of large particles that could

not be completely removed by centrifugation and filtration

(HadjSadok et al., 2007). The viscosity of SC solutions was low for

CSC< 100 g/L, but increased rapidly at higher concentrations

(Pitkowski, Nicolai, & Durand, 2007).

M. Nono et al. / Food Hydrocolloids 25 (2011) 743e749744

Mixtures of KC and SC solutions were prepared containing KC up

to 15 g/L and SC up to 100 g/L. The solutions were thoroughlymixed

at 60 !C for 5 min after which theywere observed by CLSM at 20 !C.

Images taken immediately after cooling are shown in Fig. 1.

Repeating the measurement with different mixing protocols

(manual or vortex) or longer heating gave the same results. At high

concentrations of KC and SC the systems phase separated. The

protein rich phase formed the continuous phase at relatively high

SC concentrations, while at relatively high KC concentrations the

inverse was found. At intermediate concentrations bicontinuous

phase separation was observed. With time the systems coarsened

and macroscopic phase separation occurred after some time with

a KC rich top phase and SC rich bottom phase. Macroscopic phase

separation was fast when a bicontinuous phase structure was

formed initially. This is illustrated in Fig. 2 where a time series is

shown of the phase separation at CSC¼ 40 g/L and CKC¼ 3 g/L. In

some images in Figs. 1 and 2 protein rich phases surrounded by

protein poor phases and the inverse can be observed in the same

image. At high SC or KC concentrations the systems were viscous

and macroscopic phase separation was very slow. In some cases

gelation was observed while standing at 20 !C, but moderate

heating (40 !C) was enough to melt the gels. An investigation of the

gelation of SC/KC mixtures will be reported elsewhere.

At CKC¼ 3 g/L or lower the transition from a homogeneous

mixture to a phase separatingmixture is well defined at a critical SC

concentration. However, at higher KC concentrations, dense protein

clusters with a radius of a few microns could be seen in the CLSM

images, see Fig. 3, even at SC concentrations as low as 0.5 g/L. The

formation of these clusters should not be confused with the protein

rich domains formed in the initial stages of the phase separation.

Cluster formation was observed both in mixtures that phase

separated and in mixtures that remained homogeneous. The

mechanism that drives formation of clusters is thus different from

the one that drives segregative phase separation. As will be shown

below the clusters can be removed from the solution by centrifu-

gation and they are stable against dilution in water. The amount of

clusters increased with increasing KC concentration and decreasing

pH, but their size remained approximately the same. The clusters

were formed by aggregation of SC probably involving some KC as

will be discussed in more detail below. The presence of a large

amount of these clusters at higher KC concentrations makes it more

difficult to determine the critical SC concentration where phase

separation occurs. Before discussing in more detail the phase

separation driven by thermodynamic incompatibility we will first

investigate the aggregation of SC induced by KC.

3.1. Cluster formation

Above about 3 g/L of carrageenan, large clusters were formed

immediately and could be visualized with CLSM see Fig. 3a. With

increasing storage time more clusters were formed and they were

formed also at lower KC concentrations. The clusters associated into

larger flocs without merging and precipitated slowly, see Fig. 3b.

When the system phase separated macroscopically we observed

the clusters only in the protein poor top phase. Flocculated clusters

precipitated on top of the protein rich bottom phase, but did not

merge with this phase. In Fig. 3c the protein rich phase is present in

the form of spherical domains that are larger than the clusters.

With time the clusters associated into larger flocs and even stuck to

the protein rich phasewithout merging with each other or with the

protein rich phase, see Fig. 3d. The clusters could be easily redis-

persed by shaking, but they did not disintegrate after dilution in

water implying that the bonds in the clusters were strong. This

observation implies that while the bonds within the clusters are

strong, the ones between the clusters are relatively weak.

The fraction of SC that formed clusters (F) was determined for

systems that did not phase separate. The clusters were precipitated

by centrifugation and the SC concentration of the supernatant was

determined by UV adsorption. The fraction of proteins that

precipitated increased with time, but stabilized a few days after

preparation of the mixtures. Remarkably, F increased linearly with

increasing KC concentration, see Fig. 4a, but showed no systematic

dependence on the SC concentration. This can be explained if it is

assumed that the small micellar particles formed by SC do not have

the same composition of the different types of casein molecules.

The tendency of the particles to form clusters at a given KC

concentration could vary depending on their composition. If the

composition varies continuously, the fraction of SC particles that

aggregates will increase continuously. A similar observation was

reported earlier for the precipitation of SC upon addition of calcium

Fig. 1. CLSM images of SC/KC mixtures at 0.1 M NaCl at concentrations (g/L) indicated in the figure. The samples were mixed and heated at 60 !C for 5 min and observed

immediately at 20 !C. The light areas are rich in protein. The images represent 160" 160 mm.

M. Nono et al. / Food Hydrocolloids 25 (2011) 743e749 745

ions (Pitkowski, Nicolai, & Durand, 2009). In this case the fraction of

SC that precipitated increased continuously with the CaCl2concentration, independent of the SC concentrations.

We deduced from viscosity measurements that the fraction of

KC involved in the formation of the clusters was very small. The

viscosity of the mixtures was dominated by the contribution of KC

once the complexes are removed and is a strong function of CKC. We

found no significant decrease of the viscosity of the supernatant

even if more than 50% of the SC was precipitated. From this

observation we may conclude that less than 5% KC precipitated.

As mentioned in the introduction, cross-linking between indi-

vidual caseins and KC has been reported before, but it was found to

be limited to k-casein in the absence of Ca2þ. It was suggested that

bonds were formed between positively charged groups on the net

negative SC chains and the sulphate groups of the KC chains. To

investigate whether electrostatic interactions were important we

repeated the measurement without added salt. In this case clusters

appeared more slowly and F was slightly smaller, but it was still

proportional to CKC independent of CSC, see Fig. 4a. With increasing

NaCl concentration the amount of precipitated proteins increased,

but it dropped abruptly above 0.2 M NaCl, see Fig. 4b. Repeated

measurements showed that the peculiar response at this salt

concentration dependence was reproducible. A similar abrupt

decrease above 0.2 M NaCl was reported for mixtures of k-casein

and KC by by Snoeren et al. (1975) who attributed it to strong

screening of electrostatic interactions. The fraction of SC in the

clusters varied weakly with the pH between 7 and 9, but it

increased strongly at lower pH until at pH 5 almost all proteins

precipitated, see Fig. 4c. We note that in the absence of KC no

protein precipitated at these conditions.

The reported observation that cross-linking was limited to

k-casein appears in contradiction to the present finding that more

than half of the SC could be involved in the aggregation, while

k-casein represents only about 10% of casein. However, SC is

present in the form of small agglomerates of about 15 casein

molecules. It is possible that KC cross-links these SC particles by

forming bonds exclusivelywith k-caseinwithout breaking them up.

A single KC chain could bridge between several SC particles in this

way, which would explain why only relatively little KC is involved.

A further assumption that the SC particles contain varying amounts

of KC, could explain the increase of F with increasing KC

concentration.

3.2. Aggregate structure

At low KC and SC concentrations the turbidity of the mixtures

was small so that they could be investigated using light scattering.

We verified that the effect of multiple scattering was negligible. As

was shown elsewhere, pure SC contained particles with a radius

close to 60 nm (HadjSadok et al., 2007). Their weight fraction is

very small, but their contribution to the scattering intensity

remains significant even after centrifugation and filtration. In all

cases the contribution from these spurious particles to the scat-

tering intensity was subtracted. The scattering intensity of pure KC

solutions was negligible compared to that of pure SC solutions at all

concentrations used in the mixtures.

Immediately after mixing the scattering intensity increased

rapidlywith time, but after about an hour or so the increase became

slow andwas insignificant for the duration of the experiment. Fig. 5

shows the q-dependence of Ir/KC for mixtures containing 1.5 g/L SC

and 1, 2 and 3 g/L KC. Both the scattering intensity and the

q-dependence increased with increasing amount of KC. We have

seen a significant increase of the scattering even when adding as

little as 0.1 g/L KC. The data could be fitted to a relatively simple

equation: Ir/KC¼Ma/(1þ q2$Ra2/3), where Ma and Ra represent an

apparent molar mass and radius that are equal to the weight

average molar mass (Mw) and the z-average radius of gyration (Rgz)

of the aggregates if interactions are negligible. Aggregates formed

by a variety of proteins have been found to bewell described by this

equation (Nicolai, 2007b).

The solutions were measured again 24 h later, see Fig. 5b. Only

a small increase of the aggregate size was found at 1 and 2 g/L KC.

However, the solution with 3 g/L KC now showed power law

dependence over the whole q-range with a slope of %2. Measure-

ments after 48 h gave very similar results. CLSM showed that

clusters with a diameter of a few microns had formed in this

solution. The power law dependence indicates that the clusters

have a self similar structure. From the slope the so-called fractal

Fig. 2. CLSM images of a mixture at CSC¼ 40 g/L and CKC¼ 3 g/L during phase separation. The evolution of the system from left to right took less than 1 min. The light areas are rich

in protein. The images represent 160" 160 mm.

Fig. 3. CLSM images of clusters in homogeneous (a, b: 20 g/L SC, 9 g/L KC) and phase separating mixtures (c, d: 20 g/L SC, 11 g/L KC) shortly after mixing (a, c) and 24 h later (b, d).

The light areas are rich in protein. The images represent 160"160 mm.


dimension (df) could be derived: Irfq%df , yielding df¼ 2. These

large clusters were formed rapidly after mixing if they contained

5 g/L or more KC (results not shown). We have some indication

from CLSMmeasurements that the density of the clusters increases

with increasing KC concentration.

The measurements were repeated after dilution with KC free

solvent. They showed a weak increase of Ir/KC implying that the

aggregates were connected by strong bonds and that the effect of

interaction between the aggregates on Ir was small for these

mixtures. Similar measurements were done at CSC¼ 0.5 g/L, 3 g/L

and 10 g/L. In each case aggregates were formed in the mixtures

with an average size that increased with increasing KC concentra-

tion, but varied little with the protein concentration. The average

radius of gyration can be calculated using eq. (2). We found

Rgz¼ 80e90 nm at CKC¼ 1 g/L and Rgz¼ 110e150 nm at CKC¼ 2 g/L.

For the calculation of Mw one needs to know the refractive index

increment and the concentration of the aggregates. We ignore the

relatively small contribution of KC and use the refractive index

increment of the proteins (0.185 L/g). A lower estimate of Mw

can be obtained by assuming that all caseinate aggregated:

Mw¼ 2e3"106 g/mol at CKC¼ 1 g/L and Mw¼ 6e8" 106 g/mol at

CKC¼ 2 g/L. If the true aggregate concentration is smaller, then Mw

is larger. Notice that the molar mass of individual caseinate parti-

cles is about 105 g/mol (HadjSadok et al., 2007).

Whatever is the exact mechanism that drives KC mediated

aggregation of the SC particles, the process itself appears to be

initially a random aggregation process leading to self similar

structures. A similar aggregation process has also been observed

for aggregates of SC particles that were formed after removing

CCP from native casein by adding polyphosphate (Panouillé,

Durand, Nicolai, Larquet, & Boisset, 2005). A fraction of the aggre-

gates transforms more or less rapidly into dense clusters with

a radius of a few mm, especially at higher KC concentrations.

However, self similar aggregates were always still observed in light

scattering experiments after removal of the dense clusters by

centrifugation.

3.3. Phase diagram

We investigated the composition of the two phases for mixtures

after complete phase separation. Flocculated clusters precipitated

from the KC rich top phase and accumulated at the interface

between the two phases. We verified with CLSM that the

phases were homogeneous. The SC concentration of each phase

was determined by UV absorbance, while the KC concentrationwas

determined by rheology. The viscosity of the top phase was

dominated by the contribution of KC, while that of the bottom

phase was dominated by that of SC. By comparing the viscosity of

the top phase with that of pure KC solutions it was found that

almost all KC was present in the top phase. The phase diagram

shown in Fig. 6a was established on the basis of these measure-

ments and CLSM observations. The dotted line in Fig. 6a indicates

where the volume fractions are approximately equal. At higher

KC concentrations phase separation occurs above about 10 g/L

caseinate, while at higher caseinate concentrations very little KC

(<0.1 g/L) is needed to induce phase separation.

As mentioned above, a difficulty for the establishment of the

phase diagram is that a significant fraction of SC aggregates and

precipitates in the form of large flocs. This means that the effective

SC concentration in the mixtures is lower. However, tie lines can be

drawn properly if one considers the concentration of only soluble

SC. The tie lines are approximately parallel to each other, except at

high initial SC concentrations (CSC> 80 g/L) which led to more

horizontal tie lines. CLSM showed that in these cases phase sepa-

ration was not complete after centrifugation. It is important to

realize that only the caseinate that is not involved in large clusters

contributes. This means that at higher KC concentrations up to

twice as much caseinate is needed to induce phase separation than

indicated by the binodal, because up to half of the caseinate is

removed from the solution in the form of clusters.

In the absence of added salt similar features were observed by

CLSM results not shown. However, the phase boundary shifted to

higher SC concentrations, see Fig. 6b. A few tests were done in the

CKC

(g/L)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

)%(

F

0

10

20

30

40

50

60

70a

[NaCl] (M)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

)%(

F

10

20

30

40

50

60b

pH

5 6 7 8 9

)%(

F

20

40

60

80

100c

Fig. 4. (a) Fraction of precipitated SC (F) as a function of the KC concentration in

mixtures at pH 7 without added salt (triangles) and at 0.1 M NaCl (circles). The SC

concentration was 10 g/L. (b) Fraction of precipitated SC as a function of the NaCl

concentration in mixtures at pH 7 with CSC¼ 10 g/L and CKC¼ 6 g/L. (c) Fraction of

precipitated SC as a function of the pH in mixtures at 0.1 M NaCl with CSC¼ 10 g/L and

CKC¼ 6 g/L.


presence of 0.1 M KCl, because Kþ is a widely used cation to induce

the coilehelix of KC at low concentrations. Mixtures were prepared

at 60 !C, i.e. above the transition temperature. No significant

difference was observed between mixtures containing 0.1 M NaCl

or 0.1 M KCl.

As far as we know phase separation inmixtures of KC and SC has

not been reported earlier, but it has already been reported for

mixtures of KC in the helical conformation and native casein

micelles (Bourriot et al., 1999; Langendorff et al., 2000; Schorsch

et al., 2000). For this system a few gram per litre of KC was

needed to induce phase separation even at high casein concen-

trations, while the critical casein concentration at large CKC was

very small. Phase separation was attributed to depletion of free KC

chains between the casein micelles, but thermodynamic incom-

patibility could very well be the main driving force. No precipita-

tion was observed implying that KC did not bridge between casein

micelles, which would lead to aggregation. It was not clear whether

the absence of bridging is because KC does not adhere to casein

micelles in the coil conformation or because KC completely covers

the surface. Complete coverage of the casein micelles with KC

would render them compatible with excess free KC and in this case

only depletion would remain as a possible cause of the observed

phase separation. Incompatibility due to the different chemical

structure of the two biopolymers is probably the main driving force

of phase separation between KC and SC, but we do not exclude that

depletion interaction also plays a role. The general features of the

phase diagram are similar to those observed for other pro-

teinepolysaccharide mixtures. However, in view of the complexity

of the system it is in our view not possible to give a quantitative

analysis of the phase diagram in terms of existing theories on phase

separation of macromolecules in solution.

4. Summary

Aggregation of sodium caseinate was observed in mixtures

with k-carrageenan at all concentrations. Most likely the strong

bonds between SC were mediated by a small amount of k-carra-

geenan. The aggregates were initially formed by a random

aggregation process, but with increasing storage time dense

clusters were formed with a diameter of a few mm. The clusters

flocculated and precipitated. The fraction of SC involved in the

clusters increased linearly with the KC concentration, but did not

depend on the SC concentrations. It increased when electrostatic

interactions were screened by adding salt up to 0.2 M NaCl, but

q (nm-1)

10-3 10-2

I rC

K/)l

om/

g(

106

107

0 g/L

1 g/L

2 g/L

3 g/L

a

q (nm-1)

10-3 10-2

I rC

K/)l

om/

g(

106

107

108

b

Fig. 5. Dependence of Ir/KC on the scattering wave vector for mixtures containing 1.5 g/L SC and varying amounts of KC indicated in the figure. Fig. 5a shows the results a few hours

after preparation, while Fig. 5b shows the results after 24 h. The straight line in Fig. 5b has slope %2.

CSC

(g/L)

0 20 40 60 80 100 120

CC

K)

L/g(

0

2

4

6

8

10

12

14

16a

CSC

(g/L)

0 20 40 60 80 100 120

CC

K)

L/g(

0

2

4

6

8

10

12

14b

Fig. 6. (a) Phase diagram of SCeKC mixtures at 0.1 M NaCl. The solid line represents the binodal. Circles indicate systems close to the binodal where phase separation was observed

(open) or not (filled). Coloured symbols indicated the composition of various mixtures with the corresponding composition of the equilibrium phases. Tie lines are shown as dashed

lines. The dotted line indicates where the volume fraction of the two phases was equal. (b) Comparison of the binodal for SCeKC mixtures at 0.1 M NaCl (dashed) and without added

salt (solid). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)


decreased at higher salt concentrations. The fraction increased

strongly when the charge density of SC was decreased by lowering

the pH.

Mixtures showed segregative phase separation driven by ther-

modynamic incompatibility between the remaining soluble SC and

KC. At 0.1 M NaCl the critical SC concentration was about 10 g/L at

high KC concentrations, while at high SC concentrations less than

0.1 g/L KC was needed to induce phase separation. In salt free

solutions the phase boundary was shifted to slightly higher SC

concentrations.

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Gel formation of mixtures of k-carrageenan and sodium caseinate

Merveille Nono, Taco Nicolai*, Dominique Durand

Polymères, Colloïdes, Interfaces, UMR CNRS, Université du Maine, 72085 le Mans Cedex 9, France


Article history:

Received 17 March 2010

Accepted 19 July 2010

Keywords:

Caseinate

Carrageenan

Rheology

Gel

Protein

Polysaccharide

a b s t r a c t

Gelation of sodium k-carrageenan (KC) in the presence of sodium caseinate (SC) was investigated by

oscillating shear rheology. The effect of adding NaCl and KCl was investigated. Temperature ramps

showed that SC had no influence on the critical gelation temperature, but increased the melting

temperature when that of the pure gels was less than about 30 !C. The presence of SC also increased the

gel strength of weak KC gels. Light scattering and confocal laser scanning microscopy showed that

the proteins associated with the KC network. The rheology of the gels indicated that the mixed gels

contained bonds involving both SC and KC in addition to pure KC bonds. At relatively high SC content the

former type of bonds dominated.

! 2010 Published by Elsevier Ltd.

1. Introduction

In a previous publication (Nono, Lalouette, Durand, & Nicolai,

2011) we reported on the phase behaviour of aqueous solutions

containing sodium caseinate (SC) and sodium k-carrageenan (KC)

at neutral pH. Here we present results on the rheology of these

systems. Casein is the main protein component of milk and is

composed of mainly four different kinds of amino acid chains (as1,

as2, b and k) eachwith amolarmass of approximately 2"104 g/mol

(Fox, 2003). Inmilk, casein is present in the form of large complexes,

often called casein micelles, containing so-called colloidal calcium

phosphate (CCP). When CCP is removed the micelles fall apart

and the different casein molecules regroup into small particles

with a hydrodynamic radius (Rh) of about 11 nm and containing

approximately 15 chains at 20 !C (HadjSadok, Pitkowski, Benyahia,

Nicolai, & Moulai-Mostefa, 2007). KC is a sulphated polysaccharide

extracted from seaweed. In aqueous solution k-carrageenan has

a randomcoil conformation at high temperatures, but a transition to

a helix conformation occurs after cooling below a critical tempera-

ture (Tc) leading in most cases to aggregation and gelation (Piculell,

2006). Tc decreases with increasing salt concentration and is

strongly dependent on the type of ions. Potassium ions are espe-

cially effective in inducing the transition, contrary to sodium ions.

The transition can be reversed by heating, but often at a significantly

higher temperature (Th).

In a previous publication (Nono et al., 2011) we showed that SC/

KC mixtures phase separate above a critical concentration of either

SC or KC and a phase diagram was established. Light scattering

experiments showed that even at very low SC and KC concentra-

tions (<1 g/L) aggregates were formed that had a self-similar

structure. The aggregates contained both SC and KC, but the weight

fraction of KC was small. The bonds between the proteins were

strong as the aggregates did not break-up when dispersed in pure

water. Covalent bonds are highly unlikely, but electrostatic inter-

action is important since ionic strength and pH play an important

role in their formation.

The average size of the aggregates grew with increasing KC

concentration, but was not very sensitive to the SC concentration.

When more than about 3 g/L of KC was present, dense clusters

with a radius of a few microns could be observed with CLSM. The

clusters associated over a period of hours to days into even larger

agglomerates that precipitated. However, the precipitate could be

easily redispersed by shaking implying that the bonds between the

clusters were weak, contrary to the bonds within the clusters.

In this earlier studywe focused onmixtures containing KC in the

coil conformation. Here we report on the gelation process of the

mixtures initiated by the coilehelix transition of KC. A number of

investigations have been done of the rheology ofmixtures of KC and

native casein micelles (Drohan, Tziboula, McNulty, & Horne, 1997;

Ji, Corredig, & Goff, 2008; Langendorff et al., 2000; Puvanenthiran,

Goddard, McKinnon, & Augustin, 2003; Rodd, Davis, Dunstan,

Forrest, & Boger, 2000; Schorsch, Jones, & Norton, 2000; Trckova,

Stetina, & Kansky, 2004). These experiments showed that in the

helical conformation KC binds to casein micelles, which can lead

to gelation even when pure KC does not gel. Addition of casein

micelles was also found in most cases to increase the storage shear

modulus (G0).* Corresponding author.



Food Hydrocolloids


0268-005X/$ e see front matter ! 2010 Published by Elsevier Ltd.

doi:10.1016/j.foodhyd.2010.07.014

Food Hydrocolloids 25 (2011) 750e757

Studies of the rheology of SC/KC mixtures are rare. Lynch and

Mulvihill (1994) studied the gelation of mixtures of 10 g/L KC and

20 g/L of individual caseins or SC. 0.02 M CaCl2 was added because

pure a and b casein only interacted with KC in presence of Ca2þ.

In the absence of SC the gelation temperature was about 7 !C. They

observed an increase of the gelation temperature of KC solutions

after addition of 20 g/L SC. The gelation temperaturewas larger after

addition of k-casein (14 !C) than for a-casein (10 !C), b-casein (12 !C)

or sodium caseinate (12 !C). Addition of pure k-casein led to a larger

elastic shear modulus, while adding pure a- or b-casein decreased

the elastic modulus. Adding sodium caseinate had little effect.

Oakenfull, Miyoshi, Nishinari, and Scott (1999) studied mixtures

of KC and SC using rheology and differential scanning calorimetry

(DSC). They varied the SC concentration for a fixed KC concentration

(CKC ¼ 5 g/L) and the KC concentration for a fixed SC concentration

(CSC ¼ 10 g/L). Tc measured with rheology or with DSC was the

same and increased with increasing KC concentration. The increase

is expected, because the KC sample used for this study contained

potassium so that the Kþ concentration of the solutions increased

together with the KC concentration. The addition of SC up till 50 g/L

had almost no effect on Tc: a small decrease from 24 !C to 22 !C up to

CSC ¼ 10 g/L and a small increase back to 24 !C at CSC ¼ 50 g/L. The

enthalpy of the transition was also found to be almost independent

of the SC concentration. As expected G0 increasedwith increasing KC

concentration at constant SC concentration. At fixed KC concentra-

tion, G0 decreased initially with increasing SC concentration up

CSC ¼ 5 g/L and then increased again at higher concentrations. DSC

during melting showed broad multiple peaks indicating that the

break-up of the gel and the helixecoil transition was not coopera-

tive. The decrease of G0 was more progressive when SC was present

and in one case (CKC ¼ 5 g/L, CSC ¼ 1 g/L) two steps could be

distinguished. The melting temperature was about 45 !C indepen-

dent of the SC concentration.

Based on these results Oakenfull et al. suggested that in mixtures

a fraction of KC was bound to SC, while the rest remained free. Both

free and bound KC were supposed to form helices at temperatures

below Tc that aggregated and formed a gel. The presence of SC was

supposed to cause an increase of the variety of bond energies

leading to a more gradual decrease of G0 and a less distinct DSC

pattern during melting. In order to explain the dependence of G0 on

the SC concentration they assumed that free and bound KC aggre-

gated and gelled independently. They proposed a model that could

describe the experimental results semi-quantitatively, see discus-

sion below.

Here we present an extension of these earlier studies with

a systematic investigation of the effect of adding SC to KC in the

sodium form. In potential applications of SC/KC mixtures, salt will

most likely be present so that it is important to investigate the

influence of SC on the salt induced aggregation and gelation of KC.

We have studied the effect of 2 different types of salt: NaCl and KCl.

NaCl can be added to screen electrostatic interactions without

inducing gelation at room temperature. Here we have used 0.1 M

NaCl which induces the transition at about 12 !C. As mentioned

earlier, KC is muchmore sensitive to Kþ and 10&2MKCl is enough to

induce the coilehelix transition of KC at room temperature.

We have varied the amounts of KCl between 10&3 M and 0.1 M.


2.1. Materials


(Veghel, Netherlands), was dissolved in deionised water (Millipore)

containing 3mM sodium azide as a bacteriostatic agent. The pHwas

adjusted by slow addition of 0.01 M HCl or 0.01 M NaOH under

continuous stirring and was set at 7 unless otherwise indicated.

About 100 ml solution was dialysed against about 4 L solvent for

a period of 24 h renewing the solvent several times. The solution

was then centrifuged (Beckman Coulter, Allegra 64R Centrifuge) at

6 " 104 g for 2 h after which both a sediment and a turbid top layer

appeared. After removal of the turbid layer the clear supernatant

was collected and filtered through 0.45 mm pore size filters. The

SC concentration (CSC) was determined after filtration using UV

absorption with an extinction coefficient of 0.81 L g&1 cm&1. The

amount of protein thatwas eliminated by this purificationmethod is

less than 5%. The sample contained 1500 mg/100 g Na, 56 mg/100 g

Ca and 10 mg/100 g K.

The sodium k-carrageenan used for this study is an alkali treated

extract from Eucheuma cottonii and was a gift from SKW Biosystems

(batch HMRXZ) (Baupte, France). Using NMR it was found that the

sample contained less than 5% i-carrageenan (Meunier, 1999).

A freeze-dried sample of KCwas dissolvedwhile stirring a few hours

in Mili-Q water (70 !C) with 3 mM sodium azide added as a bacte-

riostatic agent. The solutionwas extensively dialysed against Mili-Q

water at pH 7 and subsequently filtered through 0.45 mm pore size

Anatop filters. The KC concentration (CKC) was determined by

measuring the refractive index using refractive index increment

0.145 g/ml. Theweight average molar mass was determined by light

scattering using the methodology described elsewhere (Meunier,

Nicolai, Durand, & Parker, 1999): Mw ¼ 2.1 " 105 g/mol. The

sample contained 5500 mg/100 g Na, 56 mg/100 g Ca and 300 mg/

100 g K.

2.2. Rheology

Oscillatory shear measurements were done using a stress

controlled rheometer (AR2000, TA Instruments). Both parallel plates

and cone and plate geometries were used. The applied stress was

varied and the results shown here were obtained with low enough

stresses so that the responsewas linear. After loading the sample the

geometry was covered with a thin layer of mineral oil in order to

avoid evaporation. The system was presheared in the liquid state at

80 !C at a shear rate of 100 s&1 for a few minutes. Subsequently,

the system was cooled and reheated at a rate of 1 !C/min while the

oscillatory shear moduli were measured at a frequency of 1 Hz.

In general, the shear moduli measured during cooling increased

sharply at Tc followed by a weak increase at lower temperatures.

However, sometimes the sharp increase was followed by a more or

less important decrease before stabilising or weakly increasing

again at lower temperature. This effect was never completely

reproducible even when repeated at exactly the same conditions

after reheating. It depended on the applied stress and the geometry

and often lowering the stress or increasing the distance between

parallel plates could strongly reduce or even eliminate the effect.

This feature is a recurrent problem for oscillatory shear measure-

ments of gelling KC solutions and is especially problematic in

mixtures with proteins. In this paper we only discuss values of G0

where such effects were not observed.

2.3. Confocal scanning laser microscopy

Confocal Scanning Laser Microscopy was used in the fluores-

cence mode. Observations were made with a Leica TCS-SP2 (Leica

Microsystems Heidelberg, Germany). A water immersion objective

lens was used (HCx PL APO 63x NA ¼ 1.2) with theoretical resolu-

tion 0.3 mm in the xey plane. SCwas labelledwith the fluorochrome

rhodamine B isothiocyanate (Rho), by adding a small amount of

a concentrated rhodamine solution 5 ppm to the SC solutions

before heat treatment. Rho was exited using a heliumeneon laser

with wavelength 543 nm and the fluorescence was detected with


a photomultiplier. Care was taken not to saturate the fluorescence

signal and it was verified that the amplitude of the signal was

proportional to the polymer concentration in pure solutions.

The protein density of the gel and the pores was determined by

comparing the signal from these areas with the average signal.

2.4. Light scattering

Light scattering measurements were done at 20 !C using a so-

called 3D cross-correlation instrument (LS Instruments, Fribourg,

Switzerland). The light source was a diode laser with wavelength

l ¼ 680 nm. The temperature was controlled by a thermostat bath

to within '0.1 !C.

3. Results

3.1. Rheology

3.1.1. Without addition of salt

Mixtures of 2 g/L KC and various concentrations of SC up to 60 g/L

were studied at pH 7 in the absence of added salt apart from

the 3 mM NaN3 used as a bacteriostatic agent. At higher SC

concentrations the system phase separated as discussed by Nono

et al. (2011). Fig. 1 shows the storage and loss moduli at 1 Hz as

a function of the temperature during a cooling ramp at a rate of 1 !C/

min. For CSC < 30 g/L, the results are the same as for pure KC solu-

tions, and no effect of SC was observed. G00 increased weakly with

decreasing temperature, which is typical for solutions of KC in the

coil conformation. At higher SC concentrations G00 showed the same

weak increase during cooling, but at a critical temperature (Tc) the

increase became much stronger. The strong increase was caused by

the coilehelix transition leading to aggregation of KC chains and

eventually to gelation. Tc increased from about 4 !C at 30 g/L to 8 !C

at 60 g/L. G0 was negligible over the whole temperature range for

CSC < 35 g/L, but at higher SC concentrations it increased steeply

upon cooling below Tc.

The coilehelix transition of KC is induced by the addition

salt that is present in the SC powder. Rochas and Rinaudo (1980)

determined the coilehelix transition temperatures as a function

of the mineral concentration for different types of ions. The amount

of K and Ca in the SC powder is too small to explain the transition.

However, the amount of Na counterions can explain the values of Tc.

The value of the shear modulus reached after cooling to 2 !C

increased with increasing SC concentration, but the systems

continued to evolve after the temperature was stabilized at 2 !C see

Fig. 2. G0 reached approximately the same value for systems at SC

concentrations between 35 and 60 g/L (103 Pa). The increase of

G0 with time became very weak for these systems after 103 s, but at

CSC¼ 30 and 20 g/L the systemswere still far from their steady state

values after 2500 s. As mentioned in Introduction, the increase of

the shear moduli is caused by aggregation and gelation of KC

chains in the helix conformation. The fraction of chains in the helix

conformation obtained from optical rotation measurements starts

to increase at the critical temperature, but is complete only several

degrees lower. Meunier et al. (1999) determined the temperature

dependence of the gelation rate of pure KC solutions with a given

Tc set by the addition of KCl. They found that the gelation rate

decreased strongly as T approached Tc within a few degrees. The

steady state values of G0 were found to be almost independent of

the temperature except very close to Tc where they decreased.

Notice that here, gelation is measured at a given temperature

(T ¼ 2 !C), but for different conditions and thus different Tc.

The effect is, of course, the same because the aggregation process is

controlled by the difference between T and Tc.

The divergence of the aggregation rate with decreasing tempera-

ture means that the critical temperature depends on the cooling rate

as was already discussed inmore detail by Tziboula andHorne (1998).

However, the aggregation rate increased rapidly with decreasing

temperature, so that the ambiguity is limited to a few degrees if the

cooling ramp is 1 !C/min. As mentioned above, we defined Tc as the

temperature where G00 deviated upward during a cooling ramp using

a rate of 1 !C/min. It should be realized though that gels can be formed

very slowly even at temperatures slightly above Tc as defined here.

The frequency dependence was determined at the end of the

waiting time. At CSC> 30 g/L where the systems had reached steady

state, G0 was independent of the frequency and about a factor of

10 larger than G00, while G00 showed a very weak minimum between

0.1 and 1 Hz similar to the results shown by Lynch and Mulvihill

(1994), data not shown. At CSC ¼ 20 and 30 g/L the systems were

still visco-elastic andG0 andG00 increasedwith increasing frequency.

The gels melted during the subsequent heating ramp of the

systems. The critical melting temperature (Th) was defined as the

highest temperature where G00 no longer deviated upward from

the weak dependence at high temperatures. We found Th ¼ 31 !C

for CKC ¼ 35 g/L and higher, i.e. for all systems where the gel was

fully developed. At CKC ¼ 20 g/L and CKC ¼ 30 g/L, Th was a few

degrees lower.

T (°C)

0 2 4 6 8 10 12 14

)aP("

G,'

G

10-1

100

101

102

103

20 g/L

30 g/L

35 g/L

40 g/L

60 g/L

Fig. 1. The storage (filled symbols) and loss (open symbols) shear moduli at 1 Hz

during a cooling ramp of KC solutions at 2 g/L with different amounts of SC as indicated

in the figure. The arrow indicates Tc at CSC ¼ 60 g/L.

t (s)

1 10 100 1000

)aP('

G

10-2

10-1

100

101

102

103

3g/L

20 g/L

35 g/L

30 g/L

40 g/L

60 g/L

Fig. 2. Time dependence of G0 at T ¼ 2 !C for KC solutions at 2 g/L with different

amounts of SC as indicated in the figure.


3.1.2. Addition of KCl

For comparisonwe studied gelation of pure KC solutions at 2 g/L

with different amounts of KCl up to [KCl] ¼ 0.1 M. The effect of

the coilehelix transition on the rheology was observed above

2.5 " 10&3 M KCl. Fig. 3a shows that both Tc and Th increased

exponentially with [KCl], but the increase of Th was steeper

entailing that the hysteresis between gel formation and melting

increased. Similar results were reported for the coilehelix transi-

tion determined by optical rotation (Rochas & Rinaudo, 1980).

The viscosity of the systems at 2 !C increased with increasing KCl

concentration and waiting time. However, gels were only formed

within 2000 s above 7 " 10&3 M. At higher KCl concentrations the

shear modulus of the gels increased strongly, see Fig. 3b.

We repeated the measurements after adding 20 g/L SC, see

Fig. 3. Without KCl this mixture does not show an effect of the

coilehelix transition during the cooling ramp and the gel is formed

very slowly, see Fig. 2. But, when only 1"10&3MKCl was added the

transition was observed at Tc ¼ 6 !C and the gel was formed at 2 !C

within 2000 s. As mentioned above, the minerals added together

with the 20 g/L SC explains the increase of Tc. However, it does not

explain the large shear modulus and the hysteresis between gelling

and melting in the presence of SC. Whereas Th is close to Tc in pure

KC solutions if Tc ¼ 6 !C, in the mixture Th was about 30 !C, i.e. very

close to that of mixtures without added salt. Clearly, the presence of

SC renders the system more difficult to melt and causes hysteresis

between gelation and melting.

Fig. 3 shows that the effect of adding SC decreased with

increasing KCl concentration. When the effect of the co-ions added

together with SC is negligible compared to the amount of added

KCl, Tc is determined by the latter. Nevertheless, Th was still influ-

enced by the presence of SC up till much higher KCl concentrations.

Only when Th of the pure KC solutions became larger than 30 !C did

the effect of SC on Th disappear. Comparison of the shear moduli as

a function of the KCl concentrationwith and without SC shows that

at low KCl concentrations the effect of SC on the gel is strong while

at higher KCl concentrations the effect becomes negligible. Thus SC

has a reinforcing effect on the KC networks only when the pure KC

gel is weak. We will discuss this point in more detail below.

3.1.3. Addition of NaCl

We have studied the effect of screening the electrostatic inter-

actions by adding 0.1 M NaCl. As mentioned above, sodium ions can

induce the coilehelix transition of KC, but only at high concentra-

tions. Fig. 4 shows G0 during a cooling and a heating cycle for KC

solutions at 4 g/L in the presence of different SC concentrations.

The effect of varying the KC concentration will be discussed below.

After cooling, the systems were kept during 20 min at 2 !C before

reheating, but the increase of G0 with time at 2 !C was relatively

weak for these systems, because TeTc was in all cases larger than

10 !C. In pure KC solutions, G0 increased sharply upon cooling below

11 !C and decreased again when heated with almost no hysteresis.

The frequency dependence of G0 and G00 showed that the system

was still a viscous liquid at 2 !C.

The shear moduli at 2 !C increased strongly with increasing SC

concentration and measurements of the frequency dependence of

G0 and G00 showed that the systems were gels when the amount

of added SC was 3 g/L or more. Adding SC had little influence on Tc,

but led to a large increase of Th. One can clearly observe a two step

melting process in Fig. 4 at 3 g/L SC: an abrupt process at temper-

atures a little higher than Tc and a second more progressive process

that was completed only at about 30 !C. Notice that when the

network is broken up and G0 has decreased below the noise level,

the system can still contain aggregates that influence G00. This is the

reason why Tc and Th are more accurately determined from G00.

The relative amplitude of the second melting process increased

with increasing SC concentration.

Measurements were also done at two other concentrations of

KC: 1.5 and 7 g/L, with similar results. At all 3 concentrations

the systemswere viscous liquids at 2 !C if 1 g/L or less SCwas added

and gels in the presence of 3 g/L SC or more. The values of Tc and Thdepended only weakly on CKC and are plotted as a function of CSC in

Fig. 5. For each KC concentration Tc was close to Th if less than 1 g/L

SC was added. Tc increased only weakly with increasing CSC from

12 !C up to at most 18 !C, while Th increased strongly when as

little as 3 g/L was added, but levelled off at approximately 30 !C for

higher SC concentrations. Interestingly, the value of Th was the

same as for systems without added salt containing larger SC

concentrations. The maximum SC concentration added to solutions

containing 7 g/L KC was 30 g/L because this mixture phase sepa-

rated at CSC ¼ 40 g/L.

The dependence of G0 on the SC concentration of the systems at

2 !C is shown in Fig. 6. Initially G0 increased sharply with increasing

SC followed by a much weaker increase at higher concentrations.

For a given SC concentration G0 increased with increasing KC

concentration, as might be expected. Meunier et al. (1999) showed

earlier that G0fC2KC for pure KC gels formed in the presence of KCl.

3.2. Gel structure

The structure of the gels was studied using CLSM and

light scattering, see Nono et al. (2011) for experimental details.

[KCl] (M)

10-3 10-2 10-1

)C°(

T

0

10

20

30

40

50

60

70

80a

[KCl] (M)10-3 10-2 10-1

)aP('

G

100

101

102

103

104

105

b

Fig. 3. a. Critical temperatures obtained during cooling (Tc, open symbols) and heating

(Th, closed symbols) ramps as a function of the KCl concentration for KC solutions at

2 g/L with (triangles) and without (circles) 20 g/L SC. Solid lines are guides to the eye.

b. Storage shear moduli at 1 Hz of KC solutions at 2 g/L with (triangles) and without

20 g/L (circles) SC. Solid lines are guides to the eye.


The CLSM images show the distribution of the labelled proteins. We

showed elsewhere (Nono et al., 2011) that homogeneous mixtures

in the liquid state were featureless at KC concentrations below 3 g/

L, but contained protein rich clusters with diameters of a few

microns at higher concentrations. CLSM experiments were done in

a thermostated room at 20 !C. Therefore, we used mixtures con-

taining 0.1 M NaCl that can be investigated at 20 !C both in the

gelled state and in the liquid state depending on whether this

temperature was reached by cooling or heating (Tc < 20 !C < Th).

Fig. 7 shows CLSM images of mixtures containing 3 g/L SC and

various concentrations of KC. The systems were cooled overnight at

5 !C and images were taken at 20 !C in the gelled state. An inho-

mogeneous network of proteins can be clearly observed especially

at lower KC concentrations. When the same samples were heated

and subsequently studied at 20 !C in the liquid state the images

were featureless. The structure of pure KC gels was studied by Loren

T (°C)

0 5 10 15 20 25 30

)aP('

G

10-1

100

101

102

103

T (°C)

0 5 10 15 20 25 30

)aP('

G

10-1

100

101

102

1035g/L 20g/L

T (°C)

0 5 10 15 20 25 30

)aP('

G

10-1

100

101

0g/L

T (°C)

0 5 10 15 20 25 30

)aP('

G

10-1

100

101

102

3g/L

Fig. 4. G0 at 1 Hz during a cooling (circles) and heating (triangles) cycle of KC solutions at 4 g/L in 0.1 M NaCl with different amounts of SC as indicated in the figure.

CSC

(g/L)

0 10 20 30 40 50

)C°(

T

0

10

20

30

40

1.5g/L

4g/L

7g/L

Fig. 5. Critical temperatures obtained during cooling (Tc, open symbols) and heating

ramps (Th, closed symbols) of KC solutions at different concentrations indicated in the

figure as a function of the SC concentration in the presence of 0.1 M NaCl.

CSC

(g/L)

0 10 20 30 40 50

)aP('

G

101

102

103

104

Fig. 6. Storage shear moduli of gels at 2 !C formed at different KC concentrations as

a function of the SC concentration in the presence of 0.1 M NaCl. Symbols as in Fig. 5.


et al. (2009) using electron microscopy. KC forms a network with

pore sizes that decrease with increasing concentration. We believe

that we visualize the KC network in CLSM because SC was bound to

KC. With increasing KC concentration the network became denser

and the contrast decreased. At CKC ¼ 3 g/L the image appeared

homogeneous except for the protein clusters that are present at

higher KC concentrations both in the liquid and the gelled state.

We determined the protein concentrations in the strands of the

network and in the pores bymeasuring the fluorescence intensities.

The SC concentration remained constant in the pores at 2.4 g/L, but

decreased in the network from about 4.8 g/L at CKC ¼ 0.1 g/L

to 3.4 g/L at CKC ¼ 3 g/L. We also varied the SC concentration at

a constant KC concentration of 1 g/L. When only 0.5 g/L SC was

added, the system that was a gel at 2 !C became a homogeneous

liquid at 20 !C. At CSC ¼ 1.5 g/L and higher the images showed

a network that appeared more homogeneous with increasing

protein concentration. Thus both an increase of the KC and of the SC

concentration led to more homogeneous gels. More homogeneous

gels with increasing casein concentration were also reported by

Schorsch et al. (2000) for mixtures of KC and native casein micelles.

We also investigated the effect of gelation using light scattering.

It was shown in Nono et al. (2011) that aggregates are formed in the

single phase liquid state that increase in size with increasing KC

concentration. At lower KC concentrations, gelation caused

a dramatic increase of the scattering intensity. This is shown in

Fig. 8 for a mixture of 1.5 g/L KC and 2 g/L SC. Similar results were

obtained at other KC and SC concentrations. We note that the

scattering intensity of pure KC gels is much smaller. In each case the

gel showed a strong dependence of the intensity (I) on the

scattering wave vector that could be described by a power law,

which shows that the local structure of the gel is self-similar. The

slope is determined by the so-called fractal dimension (df): Ifq&df .

For the different systems that we investigated we found a fractal

dimension between 1.5 and 2.

4. Discussion

Gelation of KC is induced by the coilehelix transition, which in

turn is controlled by the amount and the type of salt present in the

solution. The transition is not influenced by the presence of SC, but

minerals are added together with SC in form of sodium counterions

and trace amounts of calcium and potassium. For this reason

addition of SC can induce the transition even if no salt is added.

The effect of adding SC on Tc depends on the relative contribution of

salt added together with SC to the total salt composition of the

mixtures. This explains the different results reported by Lynch et al.

(1994) and by Oakenfull et al. (1999). Lynch et al. found a small

increase of Tc in the presence of 0.02 M CaCl2 when 20 g/L SC was

added to KC with sodium counterions. Thus the amount of salt

added together with SC was not negligible in their case. However,

Oakenfull et al. observed almost no variation of Tc up to Csc¼ 50 g/L,

because in this case Tcwas controlled by the potassium counterions

of KC (about 1.4 " 10&2 M).

Even if the coilehelix transition is not influenced much by

adding SC, the ensuing aggregation process of KC in the helix

configuration is strongly influenced. Relatively strong mixed gels

were formed even at low salt concentrations where in the absence

of SC only viscous solutions or weak gels were obtained. The CLSM

images show that SC forms a network and the rheology shows that

it contributes to the shear modulus. We believe that SC is bound

to the KC network. The alternative would be that gelation of KC

drives the formation of the observed SC structure by a process of

segregative phase separation. We consider this unlikely, because 1)

the concentrations are very low; 2) the heterogeneity decreases

with increasing KC concentration and 3) it would not influence the

melting temperature of the KC network. We reported elsewhere

that SC also binds to KC in the coil conformation when no gels are

formed (Nono et al., 2011).

We observed a very weak increase of Tc with increasing SC

concentration at 0.1MNaCl, but a strong increase of G0. The increase

of the gel strength is probably caused by the fact that an increasing

amount of SC is involved in the network. The effect appears to

saturate at high SC/KC ratios, see Fig. 6.

Fig. 3b shows that adding a small amount of KCl had little effect

on the shear modulus of the mixed gels and that G0 wasmuch larger

than that of the pure KC solutions. At high KCl concentrations G0

increased and became comparable with that of pure KC gels. The

effect of incorporating SC in theKC network is thus dependent on the

strength of the latter. If the pure KC network is weak, SC strengthens

it, while if the pure network is strong adding SC has little effect. This

Fig. 7. CLSM images of gelled mixtures at 0.1 M NaCl containing 3 g/L SC and different concentrations of KC indicated in the figure. The light areas are rich in SC. The width of the

images represents 40 mm.

q (nm-1

)

0.001 0.01

)stin

uyrarti

bra(ytis

netnI

10

100

Fig. 8. Dependence of the scattered light intensity on the scattering wave vector (q) for

amixture of 1.5 g/L KC and2 g/L SC at 0.1MNaCl. The systemwasmeasured at 20 !C in the

liquid (open symbols) and in the gel (closed symbols) state. The solid line has slope &1.7.


may explain the small effect of adding SC on G0 reported by Lynch

et al. (1994) and by Oakenfull et al. (1999).

The association between KC and SC in the network can have

important consequences for the melting process as demonstrated

for mixtures in the presence of 0.1MNaCl in Fig. 4. In the absence of

SC, the system melted at temperatures that were only slightly

higher than Tc. In the presence of 3 g/L SC, G0 still started to decrease

at temperatures that were only slightly higher than Tc. However,

this relatively well defined initial melting process was not enough

to completely melt the system. It was followed by a second melting

process over a broad range of temperatures. In the presence of 20 g/

L SC, only a monotonous decrease of G0 over a broad temperature

range was observed and the well defined initial melting process

was not seen. The relative amplitude of the first step of the melting

process decreased with increasing ratio of CSC to CKC.

The relative amplitude of the two melting processes can also be

varied by varying the KC concentration at fixed SC concentration. In

Fig. 9 we plotted the values of G0 during heating for mixtures

containing 3 g/L SC and varying amounts of KC at 0.1 M NaCl. This

figure complements the dependence on the SC concentration at

fixed KC concentration shown in Fig. 4. At 2 !C, G0 was approxi-

mately proportional to CKC2 as was already reported for pure KC

solutions byMeunier et al. (1999). Tc increased very weakly from 12

to 14 !C in this range of KC concentrations. The temperature

dependence of G00 showed that themelting process was complete at

28 !C for all KC concentrations. However, with increasing KC

concentration an increasing part of the melting occurred during the

first step just above Tc.

The results presented here support the basic tenets of the model

proposed by Oakenfull et al. (1999), i.e. the formation of two types

of crosslinks: one involving only KC helices and one involving both

KC and SC. The suggestion is that the initial decrease of G0 with

increasing temperature is caused by break-up of junctions between

KC chains, while the decrease at higher temperatures is due to

break-up of bonds that involve both SC and KC. The latter process is

characterized by a broad distribution of activation energies so

that the melting process occurs progressively over a broad range

of temperatures. In order to observe clearly the two step

melting process, melting of the KC/SC bonds should occur at higher

temperatures than melting of pure KC gels. In addition, the ratio of

SC to KC should be less than unity, so that the second melting step

does not completely dominate.

For a more quantitative description of the shear modulus of

mixed KC/SC gels, Oakenfull et al. (1999) assumed that free KC and

KC with bound SC form two independent interpenetrating

networks with elastic moduli that have the same dependence on

CKC. In addition, they assumed that the interaction between SC and

KC is controlled by a single association constant and that SC binds

KC up to a maximum of 0.2 g/g. It is clear from the results of the

present more extensive investigation that these assumptions are

not justified. Most importantly, the model does not explain the

continuous strong increase of G0 with increasing CSC when

the corresponding pure KC gels are weak. Only when pure KC gels

are strong does SC not have much influence on G0, which was

the situation studied by Oakenfull et al. (1999). We have found

no indication for the existence of two distinct interpenetrating

networks, andwe believe that it is more likely that a single network

is formed with different types of crosslinks. A schematic drawing of

the mixed gel is shown in Fig. 10. When drawing the cartoon we

have assumed that the SC involved in the mixed network is in the

form of the same small aggregates as it is in the absence of KC.

Hysteresis between gel formation and gel break-down is also

observed for pure KC solutions in the presence of KCl. Adding KCl

results in an increase both of Tc and of (TheTc). Thus the presence of

more Kþ ions leads to more crosslinks and a greater difficulty to

break them down. The effect of adding SC is different. While the

increase of Th with increasing KCl is progressive, adding SC causes

a jump of Th to about 30 !C independent of CSC as soon as its effect

can be measured. Approximately the same value on Thwas found in

solutions without added salt, at 0.1 M NaCl and at less than 10 mM

KCl.Wemay conclude that the crosslinks involving SCmelt at about

30 !C. This means that if Th of the pure KC gels is larger than

about 30 !C the systems fully melt at the same Th as pure KC gels.

This explains why Th is the same with and without SC at KCl

concentrations above 20 mM.

5. Conclusion

Caseinate associates with k-carrageenan leading to the forma-

tion of mixed gels. Bonds involving SC are formed that reinforce

weak KC gels. At low SC content the gels contain pure KC bonds

in addition to bonds involving SC, but at high SC content the

latter type of bonds dominates. The gelation temperature of mixed

systems is the same as that of pure KC solutions. However, the

melting temperature is shifted to 30 !C if the pure KC gel melts at

lower temperatures. In this case a two step melting process is

T (°C)

0 5 10 15 20 25

)aP('

G

10-1

100

101

1020.5 g/L

1 g/L

3 g/L

5 g/L

8 g/L

Fig. 9. Temperature dependence of the storage shear modulus at 1 Hz during melting

for solutions at 0.1 M NaCl containing 3 g/L SC and varying amounts of KC indicated in

the figure.

Fig. 10. Schematic drawing of the gel formed in mixtures of KC and SC. The circles

represent the small SC aggregates, while the lines indicate the KC chains in the helix

conformation. Junctions between KC chains are formed by parallel stacking of the KC

helices. Bonds involving SC aggregates are also shown, but the molecular structure of

these bonds is as yet unknown.


observed at low SC content: one of the pure KC bonds at lower

temperatures and one of the mixed bonds at higher temperatures.

If the melting temperature of the corresponding pure KC solution

is higher than 30 !C it is not influenced by SC. Melting of bonds

involving SC occurs over a broad range of temperatures.

References

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Tziboula, A., & Horne, D. S. (1998). Influence of milk proteins on the gel transitiontemperature and the mechanical properties of weak k-carrageenan gels. InG. O. Phillips, P. A. Williams, & D. J. Wedlock (Eds.), Gums and stabilisers for thefood industry (pp. 202e211). Oxford IRL Press.


Rheology and structure of mixtures of i-carrageenan and sodium caseinate

Merveille Nono, Dominique Durand, Taco Nicolai*

Polymères, Colloïdes, Interfaces, UMR-CNRS, Université du Maine, 72085 le Mans Cedex 9, France


Article history:

Received 17 April 2011

Accepted 5 July 2011

Keywords:

Carrageenan

Casein

Gel

Phase separation

a b s t r a c t

Mixtures of i-carrageenan (IC) and sodium caseinate (SC) were investigated and the results are compared

with a similar study of mixtures of k-carrageenan (KC) and SC. Segregative phase separation was

observed at high biopolymer concentrations and the binodal was determined. At low IC concentrations,

SC formed aggregates involving a very small amount of IC that were characterized with light scattering.

The influence of adding SC on the gelation of IC during cooling and the shear modulus of the gels was

studied in the presence of NaCl or KCl. The main conclusion of this work is that SC binds to both IC and

KC, in the coil conformation as well as in the helix conformation, but that its effect on the rheology is

much weaker for IC than for KC.

! 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Carrageenan is a food grade polysaccharide derived from algae

and is used as a texturing agent in processed food among which

dairy products (Piculell, 2006; Therkelsen, 1993). For this reason

the influence of adding carrageenan on the behavior of aqueous

solutions of milk proteins has beenwidely investigated. There exists

a variety of carrageenans with slightly different structures, the most

common of which are k- and i-carrageenan. The difference between

these variants is that k-carrageenan (KC) contains one sulfate

groups per sugar unit and i-carrageenan (IC) two. Both variants

showa coilehelix transitionwhen the temperature is reduced below

a critical temperature (Tc). Tc decreases with increasing ionic

strength, and for KC also depends strongly on the type of salt (Rochas

& Rinaudo, 1980). For pure IC, Tc depends on the valence, but little

on the type of ion (Piculell, Nilsson, & Muhrbeck, 1992). In the helix

conformation the carrageenan chains have a tendency to aggregate

and gel. The elastic modulus of the gel increases with increasing

polymer concentration. It depends on the salt concentration and,

especially for KC, on the type of salt. The coilehelix transition can be

reversed by heating and leads to melting of the gels. The tempera-

ture atwhich this happens (Th) ismost often larger thanTc for KC, but

Tc and Th are almost the same for IC.

Casein is themain protein component of milk and is a mixture of

mainly four types of caseins (a1-, a2-, b- and k-casein) (Fox, 2003).

Inmilk it is present in the form of spherical complexes with a radius

of approximately 100 nm that are called casein micelles. Casein

micelles are stabilized by colloidal calcium phosphate (CCP), which

can be removed by precipitation and washing at pH 4. The

precipitate can be redissolved in the form of sodium caseinate (SC)

by adding NaOH (Mulvihill & Fox, 1989). SC associates into small

particles with a hydrodynamic radius (Rh) that depends somewhat

on the temperature, the ionic strength and the pH (Rh¼ 11 nm at

20 "C, 0.1 M NaCl and pH 7) (HadjSadok, Pitkowski, Benyahia,

Nicolai, & Moulai-Mostefa, 2007).

The effect of adding KC or IC on skimmed milk or casein micelle

solutions has been studied quite extensively (Arltoft, Ipsen, Madsen,

& De Vries, 2007; Bourriot, Garnier, & Doublier, 1999; Dalgleish &

Morris, 1988; Drohan, Tziboula, McNulty, & Horne, 1997; Hemar,

Hall, Munro, & Singh, 2002; Ji, Corredig, & Goff, 2008; Langendorff

et al., 1999, 2000; Puvanenthiran, Goddard, McKinnon, & Augustin,

2003; Rodd, Davis, Dunstan, Forrest, & Boger, 2000; Schorsch,

Jones, & Norton, 2000; Spagnuolo, Dalgleish, Goff, & Morris,

2005; Trckova, Stetina, & Kansky, 2004; Tziboula & Horne, 1998). It

appears that both carrageenans have a specific interaction with

caseinwhich leads to the formation of weak gels at low carrageenan

concentrations at which pure carrageenan solutions remain liquid.

On the basis of investigations of mixtures with individual caseins

it was concluded that k-casein binds specifically to the carrageenans

(Lynch & Mulvihill, 1994a, 1994b, 1996; Snoeren, Both, & Schmidt,

1976; Snoeren, Payens, Jeunink, & Both, 1975). In comparison,

mixtures with sodium caseinate have attracted relatively little

attention in the past (Lynch & Mulvihill, 1994a, 1994b, 1996;

Oakenfull, Miyoshi, Nishinari, & Scott, 1999).

Recently, we reported on a study of the structure and the

rheology of mixtures of KC and SC at pH 7 (Nono, Lalouette, Durand,

& Nicolai, 2011; Nono, Nicolai, & Durand, 2011). For KC in the coil

conformation,macroscopic phase separationwas observed at higher

polymer concentrations between a phase rich in protein and a phase* Corresponding author.



Food Hydrocolloids


0268-005X/$ e see front matter ! 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

doi:10.1016/j.foodhyd.2011.07.002

Food Hydrocolloids xxx (2011) 1e7

Please cite this article in press as: Nono, M., et al., Rheology and structure of mixtures of i-carrageenan and sodium caseinate, Food Hydrocolloids(2011), doi:10.1016/j.foodhyd.2011.07.002

rich in polysaccharides. In homogeneous mixtures caseinate aggre-

gates were formed that contained a very small amount of KC. With

increasing KC concentration an increasing fraction of these aggre-

gates formedmicron size particles. These particles could be observed

with confocal laser scanningmicroscopy (CLSM) and had a tendency

to associate into large flocs that precipitated. The fraction of proteins

that precipitated increased with increasing KC concentration, but

was independent of the SC concentration. It increased strongly with

decreasing pH and at pH 5.0 almost all proteins precipitated in 6 g/L

KC.Weak gels formed by KC in the helix conformationwere strongly

reinforced by the presence of SC. It was concluded that a mixed

network was formed in the mixtures with both pure KC junctions

and bonds that involved KC as well as SC.

Here we complement this investigation of KC/SC mixtures with

a study of IC/SCmixtures andwe compare the results obtained with

the two types of carrageenan. We will show that even though SC

binds to both KC and IC, the effect of SC on the rheology is much

weaker for IC than for KC.


2.1. Materials


(Veghel, Netherlands), was dissolved in deionized water (Millipore)

containing 3 mM sodium azide as a bacteriostatic agent. The

sample contained 1.5 g/100 g Na, 56 mg/100 g Ca and 10 mg/100 g

K. The pH was adjusted by slow addition of 0.01 M HCl or 0.01 M

NaOH under continuous stirring and was set at 7 unless otherwise

indicated. About 100 mL solution was dialyzed against about 4 L

of solvent for a period of 24 h renewing the solvent several times.

The solution was then centrifuged (Beckman Coulter, Allegra

64R Centrifuge) at 6#104g for 2 h after which both a sediment and

a turbid top layer appeared. After removal of the turbid layer, the

clear supernatant was collected and filtered through 0.45 mm

pore size filters. The SC concentration (CSC) was determined

after filtration using UV absorptionwith an extinction coefficient of

0.81 L/g cm. The amount of protein that was eliminated by this

purification method was less than 5%.

The sodium i-carrageenan used for this study was an alkali

treated extract from Eucheuma cottonii and was kindly provided by

Cargill (Baupte, France). The sample contained 5.5 g/100 g Na,

56 mg/100 g Ca and 300 mg/100 g K. NMR showed that it contained

about 5% KC. The IC powder was dissolved in Milli-Q water

containing 3 mM sodium azide by stirring a few hours at 70 "C.

The solution was extensively dialyzed against the solvent at pH7

and subsequently filtered through 0.45 mm pore size Anatope

filters. The concentration (CIC) was determined by measuring the

refractive index using refractive index increment 0.145 g/mL.

2.2. Rheology

Rheology oscillatory shear measurements were done using

a stress controlled rheometer (AR2000, TA Instruments). Both

parallel plates and cone andplate geometrieswere used. The applied

stresswas varied and the results shownherewere obtainedwith low

enough stresses so that the response was linear. After loading the

sample the geometry was covered with a thin layer of mineral oil in

order to avoid evaporation. The systemwas presheared in the liquid

state at 80 "C at a shear rate of 100 s$1 for a few minutes.

2.3. Confocal scanning laser microscopy

Confocal scanning laser microscopy was used in the fluores-

cence mode. Observations were made with a Leica TCS-SP2

(Leica Microsystems Heidelberg, Germany). A water immersion

objective lens was used (HCx PL APO 63#NA¼ 1.2) with theoretical

resolution 0.3 mm in the xey plane. SC was labeled with the

fluorochrome rhodamine B isothiocyanate (Rho), by adding a small

amount of a concentrated rhodamine solution to the SC solutions

before heat treatment. Rho was exited using a heliumeneon laser

with wavelength 543 nm and the fluorescence was detected with

a photomultiplier.

2.4. Light scattering

Light scattering measurements were done using commercial

static and dynamic light scattering equipment (ALV-Langen,

Germany) equipped with an HeeNe laser emitting vertically

polarized light at l¼ 632 nm. The temperature was set at 20 "C and

controlled by a thermo-stat bath to within %0.1 "C. Measurements

were made at angles of observation (q) between 12 and 150

degrees. The relative excess scattering intensity (Ir) was calculated

as the intensity minus the solvent scattering divided by the

scattering intensity of toluene. In dilute solutions Ir is related to

the weight average molar mass (Mw) and the structure factor (S(q))

of the solute (Brown, 1996; Nicolai, 2007):

Ir ¼ KCMwSðqÞ (1)

with K a constant that depends on the refractive index increment

of the solute. S(q) is a function of the scattering wave vector:

q¼ 4pn$sin(q/2)/l, with n the refractive index of the solution.

3. Results

3.1. Pure IC solutions

The gelation of pure IC has already been investigated before

(Hossain,Miyanaga,Maeda, &Nemoto, 2001; Piculell, 2006) and here

we only show a fewmeasurements that are pertinent for the present

investigation on the effect of adding SC. It was shown elsewhere that

gelation of KC canbevery slowclose toTc (Meunier, Nicolai, Durand,&

Parker, 1999) and it was found here that gelation of IC is even slower

than that of KC at the same value of Tc$ T. This is shown for a solution

of 2 g/L IC at 0.1 M NaCl in Fig. 1a where G0 at 1 Hz is plotted as

a function of time after cooling the system to different temperatures

starting from 80 "C. This system gelled between 40 and 35 "C, but it

took considerable time to approach the steady state values of G0 and

G00 even at 20 "C. We note that true steady state was not observed at

any temperature within a period of 1.5 h, but the evolution was very

slow after this delay unless T was within a few degrees of Tc. Equili-

bration during heating was also slow. Fig. 1b shows the evolution of

G0 after heating the system in steps starting from 2 "C. The gel fully

disintegrated between 35 and 40 "C.

The implication is that for IC cooling and heating ramps need

to be done at prohibitively slow rates in order to be representative

of the steady state. For KC, results obtained at a rate of 1 "C/min

were the same as those obtained at even slower rates for (Tc$ T)>

3 "C, but for IC this was not the case and therefore we opted for

a different approach. We rapidly cooled the system from 80 "C to

a given temperature or heated it from 2 "C. Subsequently, we let the

sample evolve for 90 min as is illustrated in Fig. 1. For this particular

system a slow increase of G0 was observed during cooling at 35 "C,

while a gel formed at 2 "C melted within a few minutes at 40 "C.

The frequency (f) dependence of G0 and G00 was determined

90 min after heating or cooling. G0 was independent of f and larger

than G00 indicative of gels, except very close to Tc where the

systems behaved like viscoelastic liquids. Thus, except close to Tc, G0

obtained at 1 Hz may be taken as the elastic modulus of the gels.

M. Nono et al. / Food Hydrocolloids xxx (2011) 1e72


The values of G0 are plotted as a function of T in Fig. 2 for solutions

containing 2 g/L IC in 0.1 M NaCl or 0.1 M KCl. These two types of

cations were chosen because they lead to strongly different gela-

tion of KC and are much used in applications. The values obtained

during cooling were somewhat larger than those obtained during

heating, which we attribute to the fact that steady state was not yet

obtained after 90 min. The true values of G0 are thus intermediate.

The shear modulus in 0.1 M KCl was slightly larger than in 0.01 M

NaCl and Tc was about 5 "C larger in KCl, which confirms results

obtained by Piculell et al. on 10 g/L IC in 0.1 M NaCl and 0.1 M KCl

(Piculell et al., 1992). There was no significant difference between

the critical temperature to form a gel during cooling (Tc) and tomelt

a gel during heating (Th), as was already noted in the literature

(Michon, Cuvelier, Launay, & Parker, 1996; Piculell et al., 1992).

The effect of the ionic strength was studied in more detail by

varying the NaCl concentration ([NaCl]). As for IC the dependence on

the KCl concentration is very close to that on the NaCl concentration

it was not investigated further. The contribution of counterions to

the ionic strength was negligible at the polysaccharide concentra-

tion used for this study. Tc was within the experimental error equal

to Th and increased approximately linearly with log([NaCl]), see

Fig. 3. For comparisonwe show in the same figure the dependence of

Tc and Th on [NaCl] and [KCl] for KC. Over the whole range of ionic

strengths investigated, the critical temperatures are larger for KC

than for IC in the presence of KCl and smaller in the presence of NaCl.

For IC the difference betweenTc and Thwas negligible, while for KC it

increased with increasing salt concentration.

The effect of the NaCl concentration on the elastic shear

modulus of IC gels at 2 "C is shown in Fig. 4. At this temperature,

gels are formed by IC at CIC¼ 2 g/L for [NaCl]) 0.06 M. With

increasing salt concentration G0 increased from about 2 Pa at

0.06 M NaCl to a maximum of about 7 Pa at 0.25 M NaCl and then

decreased. For comparison, KC does not form a gel yet at 0.1 MNaCl,

but at 0.5 M NaCl the elastic modulus of the gel was about 150 Pa.

As mentioned above, for IC gels the shear modulus in NaCl and KCl

is close and a maximum of G0 as a function of the KCl concentration

was reported at about 0.2 M KCl by Hossain et al. (2001). However,

KC forms much stronger gels in the presence of KCl with a strong

salt concentration dependence (Nono, Nicolai, et al., 2011), see

Fig. 4.

A few measurements were done for IC at CIC¼ 10 g/L that

showed larger values of G0 (220 Pa and 110 Pa at 0.1 M and 0.25 M

NaCl, respectively), but also higher critical temperatures (50 "C

and 70 "C, respectively). The increase of G0 with increasing polymer

concentration was expected, but the increase of Tc was more

surprising as for pure KC solutions we did not observe a significant

effect of the polymer concentration on Tc. An increase of Tc with

T (°C)

0 10 20 30 40 50

G' (

Pa)

0.1

1

10

0.1M NaCl

0.1M KCl

Fig. 2. Temperature dependence of the storage shear modulus of IC gels at CIC¼ 2 g/L

in 0.1 M NaCl or KCl. The open symbols represent results obtained after cooling from

80 "C and the filled symbols those obtained after heating from 2 "C, see text.

salt concentration (M)

10-3 10-2 10-1 100

T (

°C)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Fig. 3. Critical temperatures of gel formation of KC and IC at 2 g/L during cooling

(open symbols) and melting during heating (filled symbols) as a function of the salt

concentration. Squares and circles indicate the values for KC in KCl and NaCl, respec-

tively. Triangles indicate the values for IC in NaCl. For IC the difference between Tc and

Th was negligible.

t(s)102 103

G' (

Pa)

10-1

100

101

t(s)102 103

G' (

Pa)

10-2

10-1

100

101

10°C

20°C

30°C

35°C

40°C

a

b

Fig. 1. Time dependence of the storage shear modulus at 1 Hz after reducing the

temperature from 80 "C (a) or after increasing the temperature in steps starting from

2 "C (b). The final temperatures are indicated in Fig. 1b. It took about 300 s to cool the

system from 80 "C to 40 "C, where gelation started and it took about 100 s to heat the

system from 2 "C to the chosen temperatures.

M. Nono et al. / Food Hydrocolloids xxx (2011) 1e7 3


increasing IC concentration was earlier reported by Michon et al.

(1996) and by Hossain et al. (2001).

In summary, IC forms gels with higher Tc than KC in NaCl, but

forms much weaker gels with lower Tc than KC in KCl. Contrary to

KC, gelation of IC occurs without hysteresis and is almost the same

in NaCl and KCl.

3.2. Structure of mixed IC/SC solutions

Mixtures of IC and SC were prepared in 0.1 M NaCl and kept

at temperatures above Tc. Phase separation was observed at high

concentrations of IC or SC. The binodal was determined by

a combination of direct observation using CLSM and analysis of

the two phases after macroscopic phase separation as explained in

detail by Nono, Lalouette, et al. (2011). Fig. 5 shows that compared to

KC the binodal of IC is shifted to somewhat larger SC concentrations,

which is probably caused by the higher charge density of IC. A

similar shift to larger SC concentrationwas found for KC/SCmixtures

in the absence of added salt (Nono, Lalouette, et al., 2011). For

T> Tc the effect of the temperature on the binodal was negligible.

When the systems were mixed in the biphasic regime at T> Tc and

subsequently rapidly cooled below Tc, microphase separation was

seen in CSLM.

As was mentioned in the introduction, a striking feature of

KC/SC mixtures was the formation of rather dense protein clusters

with a diameter of a few microns. Though such protein clusters

could also be seen in CLSM images of IC/SC mixtures, see Fig. 6, the

amount was much smaller and less than 5% proteins precipitated

even at pH 5.0 where almost all proteins precipitated in KC/SC

mixtures. Note, however, that the fact that almost no precipitation

was observed for IC/SC mixtures does not imply that interaction

between IC and SC is weaker than between KC and SC. It onlymeans

that the IC/SC co-aggregates have a much weaker tendency to form

large dense clusters than the KI/SC co-aggregates.

At lowKC concentrations (CKC< 3 g/L) the fraction of the proteins

that formed micron particles in KC/SC mixtures was small and their

formation was very slow. However, light scattering showed that

even in this case smaller aggregates were formed immediately after

mixing. The size of these aggregates increased with increasing

KC concentration, but varied littlewith the SC concentration. In IC/SC

mixtures we also observed aggregates using light scattering.

At a fixed SC concentration of 10 g/L, the size of the aggregates grew

strongly with increasing IC concentration between 1 and 4 g/L, see

Fig. 7a, and at CIC¼ 5 g/L protein particles could be seen in CLSM

images, see Fig. 6. Keeping the IC concentrationfixed at 1 g/L, amuch

weaker increase of the aggregate size was found with increasing SC

concentration between 1 and 10 g/L, see Fig. 7b. The structure factor

of the aggregates formed in mixtures with KC could be described by

the following simple equation:

SðqÞ ¼h

1þ"

q$Rgz#2=3

i$1(2)

with Rgz the z-average radius of gyration. The same equation

described approximately the structure factor of aggregates formed

in mixtures with IC. The only difference is that the local structure of

the aggregates is denser in mixtures with IC so that Mw of aggre-

gates with the same Rgz are about 50% larger. Here we assume, as

we did for KC/SCmixtures, that all proteins form aggregates in IC/SC

mixtures and that the fraction of polysaccharide in the aggregates is

very small.

salt concentration (M)

10-2 10-1 100

G' (

Pa)

100

101

102

103

104

Fig. 4. Shear modulus of KC gels (circles) and IC gels (triangles) at 2 "C as a function of

the KCl or NaCl concentration, respectively. The results for KC were taken from Nono,

Nicolai, et al. (2011).

CSC

(g/L)

0 20 40 60 80 100

CIC

,KC (

g/L

)

0

2

4

6

8

10

12

14

Fig. 5. Phase diagram of mixtures of carrageenan and sodium caseinate in 0.1 M NaCl

at T> Tc. The solid and the dashed lines indicate the binodal for IC/SC and KC/SC

mixtures, respectively.

Fig. 6. CSLM image of a mixture of 5 g/L IC and 10 g/L SC in 0.1 M NaCl. The white spots

indicate protein rich clusters. The image represents 160#160 mm.



3.3. Rheology of mixed IC/SC solutions

The effect of adding SC on the rheology of IC solutions was

investigated at 0.1 M NaCl for homogeneous mixtures containing

CIC¼ 2 g/L and various concentrations of SC. Again G0 was deter-

mined 90 min after cooling or heating to different temperatures.

As for pure IC solutions, we observed a small difference between

cooling and heating, which may be attributed to the slow kinetics,

but the difference was smaller than for pure IC. In Fig. 8, we plotted

average values of G0 as a function of T for systems with different SC

concentrations between 0 and 60 g/L. It is clear that adding SC has

very little effect on the gelation of IC. This is strikingly different

from the effect of SC on KC in the presence of 0.1 M NaCl. In

the latter case, no gels are formed at 2 "C if CSC+ 3 g/L, but at higher

SC concentrations G0 increases strongly and becomes orders of

magnitude larger than in the corresponding IC/SC mixtures, see

Fig. 8. The highest SC concentration used in mixtures with KC

was 40 g/L, because at higher concentrations the system phase

separated. Replacing NaCl by KCl does not have a significant effect

on IC/SC mixtures, but it makes a big difference for KC/SC mixture.

In the presence of 0.1 M KCl, pure KC already forms a strong gel at

2 "C (G0 ¼ 104 Pa) and adding SC has almost no effect. If anything it

slightly weakens the gels.

In the presence of 0.1 MNaCl, adding SC to IC has little effect onTcand Th which remain the same within the experimental error, see

Fig. 9. The small effect on Tc of adding SC to IC is compared to the

effect of adding SC to KC on Tc and Th in Fig. 9. For KC/SC mixtures at

the same conditions, Tc also increased only weakly with increasing

SC concentration, but was systematically smaller than for IC/SC

mixtures. Tc was almost the same as Th in the absence of SC, but

adding 5 g/L SC to the KC solution led to an abrupt increase of Th by

more than 10 degrees. Adding more than 5 g/L SC did not further

increase Th significantly. A detailed study of the shear modulus of

KC/SCmixtures duringmelting showed thatmixed gelswere formed

with two types of crosslinks: pure KC crosslinks and crosslinks that

involved both proteins and KC (Nono, Nicolai, et al., 2011). The latter

melted at about 31 "C, which explains the jump of Th when SC was

added, see Fig. 9. For KC/SC mixtures in the presence of 0.1 M KCl,

Tcz 50 "C and Thz 70 "C were not influenced by adding SC.

It appears that at 0.1 M NaCl or KCl adding SC has very little

influence on the rheology of IC solutions similarly to what was

observed for KC at 0.1 KCl. However, in the latter case an effect of

adding SC was observed at low KCl concentrations. It was concluded

that if pure KC gels were strong with high Tc, the bonds formed

between the KC helices dominated the rheology and that therefore

the contribution of the crosslinks involving SC could only be

observed for weaker gels with lower Tc. In order to see if the same

was the case for IC/SC mixtures, we varied the NaCl concentration

q (nm-1

)

107

I r/K

C (

g/m

ol)

107

108

109

1 g/L

2 g/L

3 g/L

4 g/L

q (nm-1

)

107

I r/K

C (

g/m

ol)

107

108

109

1 g/L

3 g/L

10 g/L

a

b

Fig. 7. Dependence of Ir/KC on the scattering wave vector for IC/SC mixtures with CSCfixed at 10 g/L and varying CIC (a) or with CIC fixed at 1 g/L and varying CSC (b). The solid

lines represent fits to eq. (1) using eq. (2) for the structure factor.

CSC(g/L)

0 10 20 30 40 50 60

G'(P

a)

100

101

102

103

104

Fig. 8. Storage shear modulus of mixed KC/SC (spheres) or IC/SC (triangles) gels at

0.1 M NaCl and 2 "C containing 2 g/L carrageenan as a function of the SC concentration.

KC does not form a gel for CSC< 3 g/L. The solid lines are guides to the eye.

CSC(g/L)

0 10 20 30 40 50 60

T(°

C)

10

20

30

40

50

60

Fig. 9. Critical temperatures of gel formation during cooling (open symbols) and

melting during heating (filled symbols) as a function of the SC concentration for

mixtures with 2 g/L KC (circles) or IC (triangles) at 0.1 M NaCl. For IC/SC mixtures Th is

the same as Tc within the experimental error and is not indicated by separate symbols.

The solid lines are guides to the eye.



for a mixture containing 2 g/L IC and 60 g/L SC. Fig. 10 shows the

dependence of Tc and Th on the total Naþ concentration ([Na%]) that

includes the contribution of the SC counterions ([Naþ]¼ 0.04 M). Tcis close to that of pure IC solutions, but Th is significantly larger at

lower ionic strengths. The effect is smaller than for KC/SC mixtures,

see Fig. 3a in Nono, Nicolai, et al. (2011), but it nevertheless suggests

that bonds involving SC are also formed in IC/SC mixtures.

The effect of SC on the elastic shearmodulus was relatively small

for IC compared to KC over the range of ionic strengths investigated.

Fig. 11 compares the dependence of the shear moduli at 2 "C on the

Naþ concentration for IC in the presence and absence of 60 g/L SC.

In the presence of SC, G0 reached amaximumof 20 Pa at about 0.1 M

Naþ compared to 7 Pa at about 0.2 M Naþin the absence of SC. In

comparison, pure KC at 2 g/L did not gel at 0.1 M Naþ, but had

a shearmodulus ofmore than 103 Pawhen 40 g/L SCwas added, see

Fig. 8. Clearly, the structure of the mixed IC/SC gel is different from

that of the mixed KC/SC gel.

The only previous investigation of the rheology of IC/SCmixtures

was reported by Lynch and Mulvihill (1994b, 1996). However, in

most of the mixtures that they investigated, Ca2þ ions were present

that are known to interact specifically with casein. A few

measurements were done for a system containing about 10 g/L IC in

20 mMKCl and 10 mM imidazoleeHCl buffer and different amounts

of SC up to about 40 g/L. A moderate increase of the storage shear

modulus was observed from about 40 Pa to about 150 Pa. The

absolute values are, of course, larger than for the solutions at 2 g/L IC

studied here, but the relative increase is comparable. Lynch et al.

also studied the effect of adding pure casein fractions. Interestingly,

they found a stronger effect on G0 for pure k-casein than for the

other caseins and for SC. They concluded that only for k-casein

the reinforcement of the gel was caused by interactions between the

casein and IC and that for the other caseins it was due to excluded

volume effects. However, the light scattering results shown here

suggest that in mixtures with SC all caseins interact with IC,

but perhaps this happens because the mixed caseins form small

aggregates that contain k-casein together with the other proteins. It

is possible that only k-casein interacts directly with IC, and that the

other caseins associate to IC via k-casein.

4. Conclusion

The comparison between mixtures of sodium caseinate with

either i- or k-carrageenan has shown that SC binds to both types of

carrageenans, but with different consequences. Macroscopic phase

separation occurs in mixtures of SC with either IC or KC in the coil

conformation, but the binodal was shifted to higher SC concentra-

tions for IC. In the one phase regime small aggregates are formed

immediately after mixing that probably involve most of the proteins

both for IC and for KC, but only a very small fraction of the carra-

geenan. At higher carrageenan concentrations a fraction of these

aggregates assembles into denser micro particles which themselves

slowly flocculate and precipitate. In KC/SC mixtures this fraction can

be almost unity, but in IC/SC mixtures it was limited to less than 5%.

The effect of adding SC on the rheological properties of carra-

geenan in the helix conformation is much weaker for IC than for KC.

The shear modulus of weak KC gels can be increased by orders of

magnitude by adding a few percent SC, while the increase for IC was

at best about a factor of 4. Adding SC did not influence the coilehelix

transition temperature and thus the temperature below which the

systemgels, but it did increase themelting temperature if it is low for

pure carrageenan solutions. The increase of themelting temperature

is due to the formation of crosslinks that involve proteins and that

melt at about 30 "C for KC/SC mixtures and about 40 "C for IC/SC

mixtures.

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[Na+] (M)

0.1 1

Tc,

Th

(°C

)

0

20

40

60

80

100

Fig. 10. Critical temperatures of gel formation during cooling (open symbols) and

melting during heating (filled symbols) as a function of the total Naþ concentration for

pure IC solutions at CIC¼ 2 g/L (triangles) and for mixtures with 60 g/L SC (circles).

For pure IC solutions Tc and Th were the same within the experimental error. The solid

lines are guides to the eye.

[Na+] (M)

0.1 1

G' (

Pa)

1

10

Fig. 11. Dependence of the storage shear modulus on the total Naþ concentration for

pure IC gels at 2 g/L (triangles) and in mixtures with 60 g/L SC (spheres) at 2 "C.



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