Eukaryotic DNA replication origins:many choices for appropriate answers

Eukaryotic DNA replication origins:many choices for appropriate answers

Abstract En cada división celular en humanos, 30.000-50.000 orígenes de replicación son activados, y sigue sin estar claro como ellos son seleccionados y reconocidos por factores de replicación.

Los organismos multicelulares requieren mecanismos de replicación mas complejo que los unicelulares.

Abstract Hay distintos factores epigeneticos que influyen en la expresión de estos.

La similitud de los mecanismos de replicación entre las bacterias y organismos complejos es aun debatido.

Los organismos multicelulares requieren mecanismos de replicación mas complejos para adaptarse a un genoma amplio.

Un ejemplo de esto son las diferencias entre la replicación del DNA entre la Escherichia Coli y el genoma Humano.

Ensamblaje del complejo de replicación El proceso de fijación consta de tres pasos:

1) Reconocimiento de orígenes

2) Ensamblaje de un pre-RC durante la fase G1

3) Activación del pre-RC

Este procesos es controlado por diversas proteínas.

El principal factor de unión es el ORC.

ARS

ORC

MCM 2-7

CDT1 CDC6

Complejo pre-replicación (preRC)

Ensamblaje del complejo de replicaciónUna secuencia de replicación autónoma (ARS) contiene el origen de replicación en el levadura genoma.S. cerevisiae y D. melanogaster presentan similitudes entre ORC y la DnaA de la E. coli.ORC y DnaA son de la familia AAA+.Los demás factores de replicación dependen de ORC para sus uniones en los orígenes de replicaciónNo esta claro el como los orígenes de replicación son seleccionados en organismos eucarióticos multicelulares

Ensamblaje del complejo de replicaciónSe reconoce en S. cerevisiae una secuencia conceso formada por 12 pb (ACS).En metazoos y S.pombe no se ha encontrado una secuencia consenso, sin embargo los orígenes de replicación suelen presentar una riqueza en AT.Complejo de reconocimiento del origen (ORC): Complejo proteico hexamerico (ORC 1-6)ORC1: En metazoos es la principal unidad de selección del origenORC2: En S. cerevisiae posee un dominio AT-Hook putativo.ORC4: En S. pombe posee un dominio AT-Hook

Características de los orígenes de replicación del DNA Orígenes en el genoma de la levaduraDe los 12.000 sitios ACS en genoma de S. cerevisiae sólo 400 son funcionales. S. cerevisiae confirmaron que el elemento ACS era esencial.La especificidad de secuencia es esencial, pero no es el único determinante de la selección del origen , incluyendo la transcripción y/o el estatus de la cromatina

Características de los orígenes de replicación del DNAEn S. pombe, elementos ARS que permiten la replicación autónoma , no comparten una secuencia consenso como en S. cerevisiae.Los orígenes son caracterizados por islas ricas en AT, pueden reemplazar regiones importantes de elementos ARS en S. pombeSu principal característica es la presencia de islas ricas en AT que pueden ser blanco de la subunidad Orc4 de S. pombe, la cual contiene un dominio AT-hook no encontrado en proteínas ORC de otras especies

Características de los orígenes de replicación del DNA

Orígenes de MetazoosEn organismos multicelulares, ensayos sobre la actividad de ARS fueron infructuosos y fue difícil identificar características comunes de los orígenes de replicación.Además, solo una pequeña fracción de preRCs ensamblado es activada en cada ciclo celular, y, por lo tanto, se espera que los sitios de unión ORC superen en número a los sitios activos de iniciación. Datos recientes en D. melanogaster muestran que sólo el 30% de los sitios de unión ORC están asociados con orígenes de replicación temprana


Dos-tercios de los sitios de unión ORC están en regiones promotoras, y no existe una especificidad de secuencia clara, pero si fueron encontrados con localización preferencial en cromatina abierta y sitios cargamento de cohesina.

En los huevos de Xenopus laevis La iniciación ocurre en cualquier sitio, con cierta preferencia por las secuencias ricas en AT, pero esto no aumenta la eficiencia total de la replicación.


Embriones prematuros en X. laevis y D. melanogaster. Durante su desarrollo temprano, la transcripción está apagada y los orígenes de replicación están fijados al azar en cortos intervalos regulares. Una transición desde el azar a replicación del ADN sitio-específica ocurre cuando la transcripción comienza más tarde en el desarrollo, y, en células somáticas, los orígenes están localizados en sitios específicos en los cromosomas, aunque ninguna secuencia consenso es discernible.


CpG pueden ser una señal de orígenes de replicación o de promotores asociados a transcripción, aunque algunos orígenes de replicación conocidos no tienen estrictamente islas CpG, tales como esas en el loci de β-globina y dihidrofolato reductasa (DHFR)

La metilación de la isla CpG regularía la sincronización de replicación de manera que orígenes en islas CpG no metiladas se replicarían más temprano que los que se encuentren en islas CpG metiladas.


En conclusión, las islas CpG y las extensiones ricas en AT parecen caracterizar los orígenes de replicación del DNA de metazoos, pero ninguna secuencia consenso ha sido revelada aún.

Una razón podría ser que los orígenes de los metazoos son modulares y son identificados y regulados por combinaciones definidas de elementos de secuencia, similarmente a promotores de transcripción


Es posible por lo tanto que los metazoos tengan diferentes clases de orígenes de replicación que usan diferentes módulos reconocidos por diferentes subconjuntos de proteínas.

Genomas eucariotas superiores están empaquetados en cromosomas que contienen regiones de secuencias no codificadas más largas que los genomas de levadura. Las regiones heterocromáticas pueden también requerir factores específicos para ser reconocidas y abiertas. Por tanto, una secuencia consenso universal de origen puede no ser compatible con la estructura del genoma y la plasticidad de expresión de organismos multicelulares.

Orígenes de replicación: Una opción múltiple Clases diferentes de orígenes Durante la fase G1 del ciclo celular, helicasas MCM inactivas son cargadas en los preRC. La activación de preRC es regulada en dos niveles.

Primero, los orígenes zona activados en diferentes momentos a lo largo de la fase S y son clasificados como orígenes activados temprano, medio o tarde. Segundo, solo una fracción de los orígenes potenciales es usada en cada ciclo celular, mientras que otros son “despertados” y usados sólo en condiciones que afectan la fase S, tales como daño de DNA o cambios en las condiciones de crecimiento.

Orígenes de replicación: Una opción múltiple

Según su uso, los orígenes de replicación del DNA pueden caer en tres clases: flexible, durmiente (o inactivo) y constitutivo Los orígenes constitutivos, los cuales son una minoría de los orígenes eucariotas, son usados todo el tiempo en cualquier ciclo celular o tipo de célula. Los orígenes flexibles son orígenes potenciales que pueden ser usados estocásticamente en diferentes células y explican el bajo uso de origen visto en células eucariotas. Si algunos orígenes son eliminados, otros cercanos comienzan a hacerse más activos o más eficientes, reflejando una amplia selección de orígenes.


La flexibilidad puede perderse de dos maneras. Primera, aumentando el uso del origen en casos de condiciones de crecimiento precarias o daño en el DNA. Segunda, disminuyendo el surtido de orígenes en dominios específicos en células comprometidas en programas específicos de diferenciación

Orígenes de replicación: Una opción múltipleLos orígenes inactivos o durmientes son orígenes potenciales que nunca son usados en el ciclo celular en condiciones normales, pero que pueden ser despertados en programas celulares específicos o en condiciones de estrés.

Análisis en cromatina mostraron que 70-90% de los orígenes activos fueron los mismos durante dos ciclos celulares consecutivos, sugiriendo que hay una memoria para la selección de orígenes en una célula dada


¿Por qué hay tantos orígenes potenciales de replicación? Primero, los orígenes flexibles pueden ser orígenes abortivos que en la activación fallaron al alargarse. Segundo, la eficiencia del encendimiento del origen de replicación del DNA puede ser regulada por un factor limitante, o factores, que no está presente en una cantidad suficiente para ser reclutado a todos los orígenes. Tercero, varios orígenes potenciales pueden proveen una opción para activar el origen más conveniente en un contexto de cromatina dada, el cual puede variar en diferentes células o tejidos.

Orígenes de replicación: Una opción múltiple Un enlace con el ciclo celular y sus puntos de control Una serie de elegantes experimentos mostraron que durante G1 hay un punto específico – el punto de la decisión del origen (ODP) – en el cual son seleccionados los orígenes de replicacióncon el ciclo celular y sus puntos de control.

La selección del origen parece ser relativamente independiente de la sincronización de replicación, la cual es definida en el ciclo celular antes de la selección del origen. Además, la sincronización de replicación parece ser determinada a nivel de clusters de orígenes o más aún dominios de replicación más largos en vez de orígenes individuales.


Los orígenes inactivos podrían ser orígenes de repuesto que rescatan la réplica cuando la progresión de la horquilla es perturbada durante el estrés de la replicación.

Generalmente, los inhibidores de daño al DNA o síntesis de DNA activan el punto de control de la fase S, el cual previene el encendimiento de orígenes tardíos, permitiendo reparar el DNA antes de que la fase S continúe progresando. En condiciones de reducida concentración de precursor de nucleótido, orígenes tardíos son inhibidos por la acción del punto de control, mientras que los orígenes durmientes son activados. Similarmente, una ruptura de la doble hebra de DNA realza el uso de orígenes proximales a la ruptura.

Por lo tanto, la respuesta del punto de control a condiciones precarias de crecimiento previene la progresión de la fase S, pero también podría incrementar el uso de orígenes flexibles o activar orígenes durmientes para rescatar dominios mal replicados.

Esto sugiere que el exceso de orígenes potenciales en G1 representa un salvavidas eficiente en contra de problemas posibles en la fase S. Los orígenes de repuesto deben ser “puestos en stand-by” antes de la fase S porque durante la fase S, la formación de nuevos preRC (por reacción licensing) no es posible en orden para evitar estrictamente la re-replicación.


Los ATR se activan por el estancamiento de la horquilla de replicación, y otras dos kinasas checkpoint – CHK1 (o CHEK1) and CHK2 (o CHEK2) – son blancos que están involucrados en la inhibición del origen tardío de la replicación. El estrés replicativo activa los ATR, causando la fosforilación de CHK1, la inhibición del origen tardío de la replicación y la estabilización de bifurcaciones de replicación estancadas.


El movimiento de las horquillas de replicación también puede ser obstaculizado por constricciones fisiológicas del genoma. Primero, algunas secuencias de ADN pueden ser más difíciles de duplicar que otras. Segundo, factores asociados a cromatina, elementos aislantes y estructuras nucleares específicas pueden enlentecer u obstaculizar una horquilla de replicación sin estrés replicativo.

De hecho, en X. laevis, el tratamiento con cafeína, un inhibidor del checkpoint ATM y ATR, ralentiza las bifurcaciones de replicación y aumenta el número de orígenes. Similarmente, en células empobrecidas de CHK1, la velocidad de las horquillas de replicación está disminuida y más orígenes son activados.


¿Por qué se inhiben los orígenes tardíos y por qué el uso de orígenes tempranos aumenta luego del estrés replicativo?

El primero es un camino general ATR-dependiente que inhibe el comienzo tardío y limita el uso de orígenes en clusters de orígenes tempranos, y la actividad del cual está aumentada por daño en el ADN.

El segundo camino es especialmente inducido durante el estrés replicativo y anula la inhibición por ATR de orígenes inactivos. Entonces, cuando los ATR son inhibidos por cafeína, tanto los orígenes tardíos como los inactivos son activados. Cuando los niveles de ATR aumentan por estrés replicativo, se suprimen los orígenes tardíos, mientras que el uso de orígenes tempranos aumenta al anular el efecto inhibitorio de los ATR en orígenes tempranos.

También es posible que en algunas regiones, participe un mecanismo pasivo, en que al ralentizar una bifurcación de replicación se da tiempo para que un origen potencial se active antes de que la bifurcación pase a través de éste.

Características epigenéticas y organización nuclear

Dentro de los variados factores que regulan la selección del origen de replicación es posible distinguir dos primordiales:

1) Estructura local de la cromatina

2) Epigenética

Regulación por la Estructura de la cromatinaPara que un origen de replicación sea eficiente la cromatina debe estar relativamente abierta.Sin embargo en S. cerevisiae se ha observado que la presencia de un solo nucleosoma en la secuencia ACS bloquea su respectivo origen.Las secuencias de origen son suficientes para mantener un origen libre de nucleosoma; sin embargo, ORC se requiere para la colocación precisa de los nucleosomas que flanquean el origen.22Así el ordenamiento de la cromatina parece crucial para la selección y función de los origenes

Estudio en S. cerevisiae: mostro que hay relación Entre cromatina abierta y orígenes mas activos. Acetilaciones (HATs): Asociado a aumento de Replicación – Acetilaciones en H3 y H4 realza la síntesis de DNA en plásmidos

Regulación por la Estructura de la cromatina

Regulación por la Estructura de la cromatina

Descubrimiento inesperado: relación ORC-heterocromatina

Se observó que en S. cerevisiae y en Eucariontes ORC interactua con elementos silenciadores – Sir(1 y 3) y HP1 respectivamente – involucrándose procesos de silenciamiento independiente de su rol en la replicación.

Tres posibles explicaciones

1. HP1 actúa junto a ORC para favorecer el ensamblaje de preRC a la heterocromatina.

2. Que HP1 participe en el ensamblaje de preRC tanto en Hetero como en Eucromatina.

3. En S. pombe, Swi6 (homologo de HP1) activa orígenes de replicación en heterocromatina al permitir el ensamblaje de Sld3. (Recluta Kinasa DDK y Cdc7).

Organización de los orígenes de replicación en el núcleo

La replicación toma lugar en estructuras discretas, formadas por hasta 1000 focos de replicación por núcleo

10-100 replicones por foco Dominio de replicación

Los focos de replicación forman loops (bucles) de cromatina que están anclados a una estructura matriz.

Se postula que los replicones de cada foco son activados sincronizadamente.

Distribution of BLM induced-γH2AX foci revealed by immunolabelling (Cy3; red) in early (top) or late (bottom) S-phase CHO9 nuclei. Replicating patterns were obtained by EdU incorporation and chemical detection (azide-Alexa Fluor 488; green). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Early S (a-c) and late S replicating nuclei are shown. Panels (a, d) and (d, e) contain DAPI/γH2AX/EdU and γH2AX/EdU merged images, respectively. Panels (c) and (f) illustrate binary masks of red (γH2AX) and green (EdU) channels overlaying the respective DAPI image

Estudios en X. laevis sugieren que los preRC ya están ensamblados en focos nucleares realizados antes de que inicie la síntesis de DNA (Replication Protein A detected before S phase initiation).Propuesta cuestionada por falta de una téctina que detecte al preRC antes del inicio de la síntesis de DNA.Cohesina Estudios apuntan nuevas funciones de ORC, el cual recluta cohesina para dar estructura al cromosoma en la fase S y la fusión entre cromátidas hermanas.

¿El mecanismo de selección de clusters de replicación es independiente del mecanismo para seleccionar orígenes individuales?


Mecanismos de interferencia de origen puede inhibir la activación de orígenes adyacentes. Este mecanismo escoge un origen flexible, sin embargo no a clusters ni dominios ya que no son flexibles. Pero elementos de control ubicados distantes al cluster o en el dominio podrían controlar la activación de un cluster completo.


Mecanismo Checkpoint: es capaz de activar orígenes de replicación inhibidos en caso de algún tipo de falla en el proceso.


Dominios de replicación200kb – 2 megabases en mamíferos (más cortos en D. melanogaster y S. pombe)No presentan una distribución global uniforme entre cromosomas. Sin embargo los dominios tempranos y tardíos están intercalados.Dominios tempranos: ricos en orígenesDominios tardíos: pobres en orígenesEstudios sugieren que la localización de estos dominios en el núcleo puede guardar relación con la sincronización de su replicación.


Regulación por RNAs no codificantesRNAs Y: ha sido propuesto a estar implicado en el inicio de la replicación en vertebrados, aunque hasta el momento no se ha detectado ninguna interacción con proteínas de replicación.Unión ORC-ARN 26S en T. thermophilaamplificación del DNA.Virus Epstein-Barr: requiere una interacción RNA-dependiente con un antígeno nuclear especifico (EBNA1) para lograr reclutar a ORC para la replicación del origen.Sin embargo no existe evidencia suficiente para determinar su función como reguladores.

Transcripción y orígenes de la replicación del DNAEl tipo de regulación depende de la interacción que se lleve a cabo entre la transcripción y la replicación de un gen dado.En genomas virales se ha visto que la proteína de inicio de replicación puede activar tanto la transcripción como la replicación.

Selección de origen de replicación en metazoosPrimero: Orígenes de replicación activos tempranamente asociados a genes transcritos activamente y Orígenes tardíos asociados a regiones no transcritas.Segundo: La transcripción en un gen silencia los orígenes de replicación dentro del gen o reduce la zona de iniciación. Si la transcripción ocurre cuando el origen del gen se activa puede resultar afectado.

Transcripción y orígenes de la replicación del DNA

Relación entre replicación y transcripción en D.M

Factor de replicación

Factor de transcripción

Inconsistencia

D. Melanogaster ORC RNA pol II No hay relación entre preRC y factores de transcripción.

D. Melanogaster Elementos de control de amplificación del locus Chorion y ORC

MYB, E2F1 y RB Relaciones tales no hay descritas para orígenes estándar.

Tercero: La presencia de un promotor de transcripción puede ayudar a la selección de un origen activo. Ya que:

1. En la región promotora la cromatina es asequible.2. Existe una relación entre proteínas de iniciación de la replicación y factores

de transcripción.

Desarrollo, transcripción y orígenes de replicación

Las aun discutidas relaciones establecidas entre replicación y transcripción puede revelar un vínculo de influencia en la diferenciación e identidad celular.

Embriones de X. leavis y D. melanogaster se encontró que:1. Transcripción “apagada”activación de orígenes a intervalos más cercanos (10-

20kb)/ Embriones de desarrollo temprano2. Transcripción activaactivación de orígenes sitio-específicos (a intervalos

mayores)/ Embriones de desarrollo tardío

Vínculo entre bucles de cromatina y tamaño del replicón

Análisis en células madres humanas y células germinales en desarrollo de ratón evidencian que el vínculo replicación-desarrollo está más establecido a nivel de sincronización de la replicación.

Se observaron cambios en la sincronización de replicación durante la diferenciación celular.

Desarrollo, transcripción y orígenes de replicación

Relación entre replicación y diferenciación celular

Factor Función en replicación Función en desarrollo (o diferenciación)

D. Melanogaster • Proteina Latheo• Geminin

(GMNN)

• Interacción con ORC• Desactivación del preRC

• Diferenciación neural• Diferenciación neural relacionada con el

control transcripcional de genes Hox y de la remodelación de la cromatina.

A. thaliana • Gem • Interactúa con CDT1 • Involucrada en patrón de epidermis de la raíz

Humanos • HOX13 • Hayada en 3 orígenes de replicación

• Proteína involucrada en Morfogenesis

PerspectivasSolo una porción de los orígenes de replicación participan en cada ciclo celular y su uso es altamente flexible.

Dicha flexibilidad posiblemente se trata de un mecanismo de adaptación a condiciones ambientales, a errores en la maquinaria de replicación, condiciones de crecimiento, etc.

Los orígenes son probablemente multi-modulares y su uso podría depender de la combinación de módulos y de la concentración y afinidad de las proteínas que los unen.

Esto explicaría la dificultad para hallar un patrón común a los orígenes de replicación.

La flexibilidad no es totalmente azarosa, más bien responde a un conjunto de condiciones de activación e inhibición de orígenes de replicación.

Procesos checkpoint, mecanismos de transcripción, ARNs no codificantes, entre otros, podrían participar en la regulación de orígenes sin embargo son insuficientes para establecer o predecir exactamente los mecanismos regulatorios específicos.

Perspectivas El uso flexible de orígenes en células somáticas y el uso extremo de orígenes en embriones transcripcionalmente inactivos, sugiere fuertemente que no se requiere un posicionamiento estricto de los orígenes en el genoma de metazoos para una síntesis regulada.

La presencia de promotores de la transcripción no parece ser un determinante general para los orígenes, y viceversa, mas bien específico. Posiblemente una estructura cromosomal diferente regule a ambos.

Las características de la cromatina siguiere no ser concluyente para la regulación de orígenes de replicación.

Podría discutirse que las reglas de la fase S se establecen de hecho durante la formación de cromosomas mitóticos en el ciclo celular anterior.

I. La mitosis podría ser un importante primer paso para re-establecer el código de origen de una célula.

II. Durante G1 se activen los orígenes de replicación y adaptados para el programa de la expresión génica.

◦ La posibilidad de que organismos multicelulares reprogramen sus orígenes en cada ciclo celular podría contribuir a organizar cromosomas para diferentes programas de transcripción en diferentes linajes de células durante el desarrollo y la diferenciación.

◦ Los orígenes de replicación del DNA podrían ser mucho más que sólo sitios de entrada para fábricas de replicación; podrían ser elementos regulatorios esenciales que organizan el genoma de acuerdo al destino de la célula.

Perspectivas

Bibliografía Eaton, M. L., Galani, K., Kang, S., Bell, S. P. & MacAlpine, D. M. Conserved nucleosome positioning defines replication origins. Genes Dev. 24, 748–753 (2010).

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