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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIINFLAMATORIA DE EXTRACTOS Y
FRACCIONES DE MACROALGAS DE BAJA
CALIFORNIA SUR, MÉXICO.
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO DE RECURSOS MARINOS
PRESENTA
ELENA BERENICE GARCÍA LÓPEZ
LA PAZ, B.C.S., JULIO DEL 2016
No tengo miedo de perderlo todo — ya pasé por eso y la verdad no estuvo tan mal —
perder todo es mil veces peor en tu mente que en la realidad… tengo miedo de no
arriesgarme.
“Nadie puede salvarte sino tú mismo y mereces salvarte. No es
una guerra fácil de ganar, pero si algo merece la pena ganar es esto”.
C. Bukowski
“Detrás de este triste espectáculo de palabras, tiembla
indeciblemente la esperanza de que me leas, de que no haya muerto del
todo en tu memoria”.
J. Cortázar
I
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional por el financiamiento otorgado a los proyectos SIP
20150356, SIP 20150538, SIP 20160356 y SIP 20160656, a su programa de becas
BEIFI, y a CONACYT por la beca de manutención brindada, sin las cuales este trabajo
no hubiera sido posible. A COFAA por el apoyo otorgado para la asistencia a
congresos internacionales. Al personal administrativo y docente de CICIMAR,
especialmente a Humberto, César y Magda por su paciencia y buena disposición para
auxiliarme en todos los procesos administrativos. Así como el apoyo de SAE para
realizar las estancias de investigación.
Agradezco a mis directores de tesis: Dra. Claudia J. Hernández Guerrero y Dr. Mauricio
Muñoz Ochoa, por brindarme las herramientas y recursos necesarios para mi
formación profesional, por su tiempo y paciencia. Por enseñarme a trabajar en equipo
y a ver más allá de lo lógico y obvio. Sobretodo agradezco su amistad y apoyo
incondicional.
Agradezco al comité tutorial: Dra. Christine Band Schmidt, Dra. Bárbara González
Acosta y M. en C. Antonio Nieto Camacho, por sus comentarios y retroalimentación
continua a lo largo de estos dos años.
A mi mamá (Mi Nanito) por su amor y apoyo incondicional, por darme alas para volar,
por romper las cadenas y enseñarme a ser libre e independiente. A mis hermanos,
Julio y Pablo, los hombres de mi vida, sin esos momentos de risa, diversión y locura
no hubiera llegado hasta aquí. A mi familia por estar pendiente de mí, por cuidarme y
quererme a la distancia, pero siempre junto a mí. A los amigos que sin importar el
correr de los años y los kilómetros de distancia siempre han estado para mí: Tere,
Alma, Paco, Silvia, Ilse, Isaac, Christian, Pedro, Carlos.
Un agradecimiento especial al M. en C. Antonio Nieto Camacho, al laboratorio de
Pruebas Biológicas del Instituto de Química de la UNAM, por guiarme y enseñarme
durante las estancias realizadas bajo su dirección, así como por la grata compañía y
amenas conversaciones durante el tiempo que compartimos. De la misma manera,
agradezco a la M. en C. Y. Elizabeth Rodríguez Montesinos por su apoyo la obtención
de las muestras de sangre para realizar los ensayos in vitro.
Al Laboratorio de Química de Algas Marinas. Dora y Liz por su paciencia para soportar
nuestras risas, gritos y cantos al estar trabajando. A mis compañeros de laboratorio:
Ana, Araceli, Bernardo, Dania, Esme, Fanny, Josue, Miguel, Valerie e Ilse por
compartir los aprendizajes diarios y sobre todo las comidas, bebidas y platicas. A los
compañeros foráneos y tesistas que a lo largo del tiempo llegan con su buena vibra a
inyectarnos de energía: José (Pepe), Gaby, Eli. Así como a mis compañeros de
generación los cuales me brindaron grandes momentos de diversión y comprensión
en todo este camino. Y a las sonrisas discretas y miradas
II
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. I
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................. IV
ÍNDICE DE FIGURA .................................................................................................... V
GLOSARIO ................................................................................................................. VI
ABREVIATURAS ...................................................................................................... VIII
RESUMEN .................................................................................................................. X
ABSTRACT ................................................................................................................ XI
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES ................................................................................................. 3
2.1 Proceso inflamatorio y mecanismos de acción de medicamentos
antiinflamatorios. ...................................................................................................... 3
2.2 Productos naturales marinos con actividad antiinflamatoria. ............................. 4
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 9
4. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 10
5. OBJETIVO .......................................................................................................... 10
5.1 Objetivos Particulares ...................................................................................... 10
6. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 11
6.1 Recolecta e Identificación ................................................................................ 11
6.2 Obtención de Extractos Crudos ....................................................................... 11
6.3 Análisis fitoquímico .......................................................................................... 12
6.4 Determinación de la actividad antiinflamatoria. ................................................ 12
6.4.1 Ensayo in vitro de protección de la membrana de células sanguíneas ......... 13
6.4.2 Actividad antiinflamatoria mediante inhibición de la desnaturalización proteica
(antiartrítico). .......................................................................................................... 13
6.4.3 Actividad antiinflamatoria (in vivo) mediante edema inducido por TPA (13-
acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol) en oreja de ratón (in vivo). .......................... 14
6.4.4 Actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO) por el método de TMB (3,3’,
5,5’-tetrametilbenzidina) (in vitro). .......................................................................... 15
6.4.5 Análisis Estadísticos ..................................................................................... 16
6.5 Fraccionamiento ............................................................................................... 16
7.RESULTADOS ....................................................................................................... 17
III
7.1 Obtención de Extractos Crudos ....................................................................... 17
7.2 Análisis Fitoquímico ......................................................................................... 17
7.3 Ensayo Antiinflamatorio in vitro (HRBC) .......................................................... 19
7.4 Actividad antiinflamatoria mediante inhibición de la desnaturalización proteica
(antiartrítico). .......................................................................................................... 21
7.5 Actividad antiinflamatoria (in vivo) mediante edema inducido por TPA (13-acetato
de 12-O-tetradecanoil-forbol) en oreja de ratón. .................................................... 23
7.6 Actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO) por el método de TMB (3,3’, 5,5’-
tetrametilbenzidina) (in vitro). ................................................................................. 25
7.7 Fraccionamiento ............................................................................................... 28
7.8 Actividad Antiinflamatoria de Fracciones ......................................................... 30
8. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 32
9. CONCLUSIÓN ...................................................................................................... 41
10. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 42
REFERENCIAS ......................................................................................................... 43
IV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Reveladores para análisis fitoquímico. ......................................................... 12
Tabla II. Extractos crudos obtenidos a partir de diclorometano, etanol y agua. ........ 17
Tabla III. Análisis fitoquímico de los extractos diclorometanólicos. ........................... 18
Tabla IV. Análisis fitoquímico de los extractos etanólicos. ........................................ 18
Tabla V. Extractos con mayor potencial antiinflamatorio y perfil fitoquímico. ............ 27
Tabla VI. Fracciones obtenidas mediante cromatografía en columna a partir de los
extractos crudos con mayor potencial antiinflamatorio. ............................................. 28
Tabla VII. Fracciones con mayor potencial antiinflamatorio. ..................................... 30
V
ÍNDICE DE FIGURA
Figura 1. Fármacos antiinflamatorios de uso comercial. ............................................. 1
Figura 2. Compuestos con actividad antiinflamatoria aislados de diversas especies de
macroalgas. ................................................................................................................. 8
Figura 3. Porcentaje de protección de los extractos A) acuosos, B) diclorometanólicos
y C) etanólicos, sobre la membrana de eritrocitos humanos. .................................... 20
Figura 4. Inhibición de la desnaturalización de albúmina al 1 % por los extractos A)
acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos. ....................................................... 22
Figura 5. Porcentaje de inhibición del edema inducido con TPA en oreja de ratón por
los extractos: A) acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos.............................. 24
Figura 6. Porcentaje de inhibición de la enzima mieloperoxidasa por los extractos: A)
acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos. ....................................................... 26
Figura 7. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Gracilaria
vermiculophylla. ......................................................................................................... 28
Figura 8. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Laurencia
gardnerii. ................................................................................................................... 29
Figura 9. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Opuntiella
californica. ................................................................................................................. 29
Figura 10. Comparación estructural del fármaco indometacina (12) con la caulerpina
(13) aislada de algas verdes y rojas. ......................................................................... 37
Figura 11. Comparación estructural del fármaco paracetamol (14) con compuestos
sintetizados por macroalgas que presentan actividad antiinflamatoria. ..................... 38
Figura 12. Comparación estructural del diclofenaco (19) con compuestos derivados del
ácido acetico sintetizados por algas rojas. ................................................................ 39
VI
GLOSARIO
Aceite de Crotontiglio Líquido de color amarillo anaranjado proveniente de las
semillas de Croton tiglium.
Albúmina Proteína animal y vegetal, constituyente principal de la
clara de huevo, plasma sanguíneo y linfático.
Antiedematoso Ayuda a eliminar o reducir los síntomas del edema.
Antiinflamatorio Procedimiento para prevenir o disminuir la inflamación en
los tejidos.
Ciclooxigenasa Enzima precursora para la síntesis de prostaglandinas a
partir de ácido araquidónico.
Cumarinas Metabolito secundario perteneciente a la familia de las
benzopironas.
Desnaturalización Pérdida de la estructura terciaría y cuaternaria de las
proteínas por efecto térmico u otras causas.
Diclofenaco Medicamento antiinflamatorio no esteroideo, inhibidor no
selectivo de la ciclooxigenasa.
Edema Acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o
intersticial y también en cavidades del organismo.
Eicosanoide Moléculas de constitución lipídica, fisiológicamente activas
que actúan como reguladores intracelulares y participan en
distintos procesos biológicos.
Fenoles Metabolitos secundarios que tienen un anillo bencénico con
al menos un grupo hidroxilo.
VII
Glicoproteínas Moléculas compuestas por una proteína unida a uno o
varios glúcidos, simples o compuestos.
Hipotónica Solución que tiene menor concentración de soluto en el
medio externo en relación al medio citoplasmático de la
célula.
Hipotonicidad Disminución de la concentración de sales.
Indometacina Medicamento no esteroideo derivado del indol metilado,
que inhibe la producción de prostaglandina.
Interleucina Citocina sintetizada principalmente por leucocitos.
Isosalina Solución esterilizada de agua y cloruro de sodio (0.85 %,
pH 7.2).
Leucotrienos Ácidos grasos derivados del metabolismo oxidativo del
ácido araquidónico por la vía de la 5 lipoxigenasa.
Macrófagos Células mononucleares capaces de fagocitar y degradar
material particulado.
Mieloperoxidasa Proteína más abundante en los neutrófilos, potencializa la
conversión de peróxido de hidrogeno y cloruro a acido
hipocloroso.
Modelo murino Modelo experimental que se desarrolla sobre ratones.
Neutrófilos Glóbulos blancos de tipo granulocito más abundante en la
sangre del ser humano.
Prostaglandinas Eicosanoides derivados de lípidos de membrana que
actúan como mediadores celulares en procesos
inflamatorios.
Terpenos Metabolitos secundarios derivados del isopreno.
VIII
ABREVIATURAS
5-LOX 5-lipooxigenasa
AR Artritis reumatoide
CCF Cromatografía en capa fina
CH2Cl2 Diclorometano
DO Densidad Óptica
EIOR Edema inducido en oreja de ratón
EtOH Etanol
FLA2 Fosfolipasas 2
H2O2 Peróxido
Hex Hexano
HRBC Hemólisis inducida por hipotonicidad en glóbulos rojos
HTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio
IDP Inhibición de la desnaturalización de proteína
M Molar
MeOH Metanol
MPO Mieloperoxidasa
nm Nanómetro
PBS Buffer salino de fosfatos
pH Potencial de hidrógeno
rpm Revoluciones por minuto
IX
TMB Tetrametilbenzidina
TPA 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol
X
RESUMEN
La inflamación es la reacción de los tejidos vivos a lesiones, infección o irritación. Las
enzimas lisosomales liberadas durante el proceso inflamatorio producen una variedad
de trastornos que conducen a lesión tisular por macromoléculas y lipoperoxidación de
membranas, provocando patologías crónicas como ataques cardíacos, artritis
reumatoide, entre otras. En ese trabajo, se evaluó la actividad antiinflamatoria de 30
extractos crudos (10 acuosos, 10 etanólicos y 10 diclorometanólicos) de diez especies
de macroalgas. Con los resultados obtenidos se determinó que los extractos
diclorometanólicos de Gracilaria vermiculophylla (Gv-20), Laurencia gardnerii (Lg-20)
y Opuntiella californica (Oc-20) a una concentración de 10 μg mL-1 inhiben el 54, 49 y
30 % de la desnaturalización proteica respectivamente, lo que indica su potencial como
agentes antiartríticos. En un ensayo de estabilidad de glóbulos rojos humanos ante la
hemólisis de membrana inducida por hipotonicidad (HRBC) los mismos extractos
presentaron más del 95 % de actividad. En el ensayo in vivo de actividad
antiinflamatoria mediante edema inducido en oreja de ratón (EIOR), los extractos Gv-
20, Lg-20 y Oc-20 exhibieron los mayores porcentajes de inhibición (57, 42 y 56 %,
respectivamente) a una concentración de 1 mg extracto oreja-1, la indometacina tuvo
un efecto inhibitorio del 80 %, a la misma dosis. Adicionalmente, estas muestras
redujeron la actividad de la enzima mieloperoxidasa hasta en un 30 %. Se obtuvieron
26 fracciones de los extractos activos de estas tres algas. En general, las fracciones
más polares de Laurencia gardenrii (Lg-20) y Opuntiella californica (Oc-20)
presentaron una mejor actividad antiinflamatoria con respecto al extracto crudo. Esta
investigación, establece el primer precedente de la actividad antiinflamatoria del alga
Opuntiella californica. El perfil de compuestos determinó la presencia de gran variedad
de metabolitos secundarios como terpenos, flavonoides, cumarinas y fenoles; lo cual
sugiere que estos compuestos son los responsables de la actividad antiinflamatoria
mostrada.
XI
Palabras Clave: alga marina, actividad antiinflamatoria, extractos, perfil fitoquímico.
ABSTRACT
Inflammation is the reaction of living tissues to injury, infection or irritation. Lysosomal
enzymes released during inflammation produce a variety of disorders which lead to
tissue injury by damaging the macromolecules and lipid peroxidation of membranes
which are assumed to be responsible for certain pathological conditions as heart
attacks, rheumatoid arthritis, among others. In the present study, the anti-inflammatory
activity of 30 crude extracts (10 aqueous, 10 ethanolic and 10 dicloromethanolic) of ten
species of macroalgae were evaluated. The results showed that dicloromethanolic
extracts from Gracilaria vermiculophylla (Gv-20), Laurencia gardnerii (Lg-20) and
Opuntiella californica (Oc-20) inhibited protein denaturation with 54, 49 and 30 % at 10
μg mL-1, respectively. It shows its potential like anti-arthritic agents. In human red blood
cell membrane stabilization assay (HRBC) the same extracts showed more than 95 %
activity. In the induced edema assay Gv-20, Lg-20 and Oc-20 extracts exhibited the
highest percentages of inhibition (57, 42 and 56 %, respectively) at 1 mg extract ear-1.
Indomethacin showed an inhibitory effect of 80 % at the same dose. Additionaly, these
samples reduced the enzyme myeloperoxidase activity to 30 %. From chromatographic
fractionation of active extracts, 26 fractions were obtained. In general, the polar
fractions of Laurencia gardnerii (Lg-20) and Opuntiella californica (Oc-20) showed an
increase in anti-inflammatory activity compared to that exhibited the crude extracts.
This is the first research dealing about the anti-inflammatory activity of extracts from
the red algae Opuntiella californica. The compounds profile showed a variety of
secondary metabolites as terpenes, flavonoids, cumarins and phenols compounds. It
suggests that these compounds are the responsible for the anti-inflammatory activity.
Keywords: algae, anti-inflammatory activity, extracts, seaweeds, phytochemical
profile.
1
1. INTRODUCCIÓN
La inflamación es un mecanismo de defensa del organismo y se produce ante un
estímulo perjudicial; originada por factores externos o internos, como lesiones por
agentes físicos, químicos o inmunológicos. Durante la respuesta inflamatoria, se
desata una compleja cascada de eventos celulares: activación de enzimas, liberación
de mediadores químicos, extravasación de fluidos, migración celular, ruptura y
reparación tisular (Vane & Botting, 1995).
Las enzimas lisosomales liberadas durante el proceso inflamatorio producen
trastornos que conducen a lesión tisular por macromoléculas y lipoperoxidación de
membranas, provocando diversas patologías crónicas con significativos índices de
morbilidad y mortalidad (Robbins & Cotran, 2010).
En los últimos años, las enfermedades crónico-degenerativas como artritis reumatoide
y diabetes que involucran diversos procesos inflamatorios, han desplazado a las
enfermedades infecciosas como principales causas de mortandad (Robbins & Cotran,
2010).
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de fármacos de tipo esteroidal y no
esteroidal. Los glucocorticoides, cuya naturaleza es esteroidal (ej. Cortisol 1), inhiben
la transcripción de genes proinflamatorios y suprimen la respuesta inmune (Adcock,
2000). Por otro lado, los agentes no esteroidales (ej. Diclofenaco 2) suprimen la
actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) (Fig. 1). Sin embargo, la utilización de
estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo gastrointestinal e
insuficiencia renal (Espinós et al., 2004).
Figura 1. Fármacos antiinflamatorios de uso comercial.
1
2
2
La alta incidencia de enfermedades crónicas en las que está involucrada la inflamación
y la presencia de efectos adversos en muchos de los fármacos utilizados comúnmente,
ha orientado las investigaciones hacia la búsqueda de nuevos principios activos, con
el objetivo de encontrar estructuras que brinden mayor eficacia y seguridad para
controlar los efectos nocivos de la inflamación.
En las últimas décadas los productos naturales de origen marino han mostrado ser una
fuente de compuestos con actividad antiinflamatoria comparable e incluso superior a
la exhibida por los fármacos comerciales (De la Calle, 2007).
El ambiente marino contiene más de 80 % de especies de plantas y animales del
planeta, las cuales han desarrollado diversas habilidades y capacidades adaptativas
debido al estrés ambiental al cual están sometidos continuamente. Lo anterior ha
permitido encontrar en los organismos marinos una fuente inagotable para el desarrollo
de agentes con diversas aplicaciones biofarmacéuticas (El Gamal, 2010).
En ese sentido, se ha reportado que las macroalgas producen metabolitos secundarios
que pueden ser utilizados para prevenir los procesos o proteger a las células de daños
por reacciones de tipo inflamatorio. Las algas constituyen una fuente natural de
compuestos activos con características estructurales que les provee mayor efectividad
y propiedades farmacológicas. Las actividades biológicas de los extractos de algas
marinas tienen distintos mecanismos de acción, incluidos la capacidad secuestrante
de radicales libres, mecanismos de donación y aceptación de electrones (Vidal et al.,
2006), inhibición de la fosfolipasa A2 o la ADN polimerasa (Ahn et al., 2002), la
formación y/o liberación de prostaglandinas y leucotrienos (Llanio et al., 2003).
Por lo anterior, en el presente trabajo se realizó una evaluación de la actividad
antiinflamatoria de extractos y fracciones obtenidas a partir de diez algas marinas, para
establecer el potencial antiinflamatorio de este recurso marino.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Proceso inflamatorio y mecanismos de acción de medicamentos
antiinflamatorios.
La inflamación es una reacción fundamentalmente protectora, diseñada para librar al
organismo del agente originario de la lesión inicial (microorganismos, toxinas) y de las
secuelas de estas lesiones (células y tejidos necróticos). La respuesta inflamatoria
tiene lugar en el tejido conjuntivo vascularizado, e involucra al plasma, células
circulantes, vasos sanguíneos y constituyentes celulares y extracelulares del tejido
conjuntivo. Las células circulantes son los neutrófilos, monocitos, eosinófilos, linfocitos,
basófilos y plaquetas. Las células del tejido conjuntivo son los mastocitos, que se
sitúan alrededor de los vasos sanguíneos; los fibroblastos del propio tejido, y
ocasionalmente macrófagos y linfocitos residentes. La matriz extracelular está
constituida por proteínas de adhesión (fibronectina, laminina, colágeno no fibrilar,
tenascina y otras) y proteoglucanos. La membrana basal es un componente
especializado de la matriz extracelular, y está formada por glucoproteínas de adhesión
y proteoglucanos (Robbins y Cotran, 2010).
La inflamación presenta dos fases claramente diferenciadas: aguda y crónica. La
inflamación aguda tiene una evolución relativamente breve, con una duración de
minutos, horas y pocos días; sus características principales son la exudación de líquido
y proteínas plasmáticas (edema) y la migración de leucocitos (principalmente
neutrófilos). La inflamación crónica es de mayor duración y se caracteriza por la
presencia de linfocitos y macrófagos, proliferación de vasos sanguíneos, fibrosis y
necrosis tisular (Robbins & Cotran, 2010).
Las respuestas vascular y celular de las etapas aguda y crónica están mediadas por
factores químicos procedentes del plasma o de las células y son activados por el propio
estímulo inflamatorio. Estos mediadores actúan de forma aislada, secuencial o en
combinación y en procesos posteriores potencian la respuesta inflamatoria e influyen
en su evolución. Las células y tejidos necróticos también pueden activar la producción
de mediadores de la inflamación. La inflamación termina cuando se elimina el estímulo
4
lesivo y desaparece o quedan inhibidos los mediadores de la misma (Robbins &
Cotran, 2010).
La inflamación puede resultar lesiva en algunas situaciones. Los mecanismos
diseñados para destruir a los agentes invasores y los tejidos necróticos tienen la
capacidad intrínseca de lesionar los tejidos sanos. Cuando el proceso inflamatorio se
desarrolla de forma inadecuada frente a los tejidos propios y no se controla de forma
apropiada, se convierte en la causa de diversas lesiones y enfermedades. Las
reacciones inflamatorias son la base de enfermedades crónicas frecuentes, como
artritis reumatoide, aterosclerosis o fibrosis pulmonar, así como de las reacciones de
hipersensibilidad por fármacos, toxinas y picaduras de insectos (Espinós et al., 2004).
Los medicamentos antiinflamatorios ayudan a controlar las complicaciones del
proceso de inflamación y las enfermedades que se derivan de ellas. Podemos
encontrar dos grupos de agentes antiinflamatorios: los antiinflamatorios no esteroideos
(AINES) y los antiinflamatorios esteroideos. Los AINES, constituyen un grupo muy
heterogéneo que tienen como mecanismo de acción, la inhibición de la síntesis de
prostaglandinas que son liberadas cuando hay daño tisular, presentes en exudados
inflamatorios, promueven la sensibilización de los noniceptores, así como la mediación
de procesos de inflamación, fiebre e interferencia en los mecanismos de agregación
plaquetaria (Adcock, 2000).
Los agentes antiinflamatorios esteroideos inhiben la producción de moléculas
proinflamatorias, derivadas del ácido araquidónico vía la inhibición de la fosfolipasa A2,
inhiben la activación de moléculas de adhesión ICAM-1. ELAM-1, diversas citosinas,
TNFα, ϒ-interferón, entre otros (Adcock, 2000).
2.2 Productos naturales marinos con actividad antiinflamatoria.
La literatura describe a microalgas y macroalgas marinas como una fuente promisoria
de estructuras químicas novedosas con diferentes actividades biológicas. La revisión
demuestra que dentro de los metabolitos secundarios producidos por macroalgas de
los diferentes grupos (pardas, rojas y verdes) destacan polisacáridos, glicoproteínas,
fenoles, terpenos, cumarinas, entre otros; los cuales ofrecen un amplio espectro de
5
actividades biológicas, entre ellas destacan actividades analgésicas y
antiinflamatorias, convirtiéndolas en una fuente potencial de este tipo de compuestos.
Dentro de los estudios con microalgas se encuentran los realizados con la diatomea
Pseudonitzschia multiseries, de la cual se aisló un nuevo compuesto de tipo
eicosanoide cíclico denominado bacillariolide, con actividad inhibidora de la fosfolipasa
A2 (Shimizu, 1996). Se han encontrado propiedades antiinflamatorias y analgésicas en
extractos acuosos y metanólicos obtenidos de Chlorella stigmatophora y
Phaeodactylum tricornutum (Guzmán et al., 2001), así como en sus respectivas
fracciones con alto contenido de polisacáridos (Guzmán et al., 2003). El extracto
lipídico del alga verde-azul Nostoc commune inhibió la expresión de genes
proinflamatorios en macrófagos (Park et al., 2008).
Se ha descrito la actividad antiinflamatoria de un extracto acuoso proveniente de la
mezcla de dos algas Cystosina barbata, Ulva lactuca y el pasto marino Zostera nona
(Ganovski et al., 1979). A su vez, extractos metanólicos y diclorometanólicos de
Corallina elongata, Galaxaura oblongata, Laurencia obtusa y Udotea petiolata
mostraron un pronunciado efecto antiinflamatorio sobre el edema inducido en oreja de
ratón (Payá et al., 1993). Extractos acuosos de Dictyopteris justii y Dyctiota dentata
presentaron actividad antiinflamatoria y analgésica, inhibiendo la actividad de FLA2
(Llanio et al., 1998). El extracto etanólico de Acantophora sp. disminuyó el edema de
oreja de ratón inducido con aceite de crotontiglio a través de la inhibición de la
ciclooxigenasa (Llanio et al., 2003).
Durante 2007, Dar y colaboradores puntualizaron la variación estacional de la actividad
antiinflamatoria de extractos butanólicos, metanólicos y de n-hexano provenientes de
Sargassum wightii sobre el modelo de edema en pata inducido por carragenina,
observando que los extractos de algas recolectadas durante el invierno presentaron
mayores índices de actividad que los recolectados en el verano. Estudios en Laurencia
undulata mostraron propiedades antiinflamatorias de un extracto polifenólico en un
modelo murino de asma, el cual inhibió la actividad de algunas interleucinas (Jung et
al., 2009). Se ha descrito que tanto el extracto metanólico del alga Porphyra dentata,
6
como dos compuestos fenólicos aislados de esta, presentaron actividad
antiinflamatoria al suprimir la síntesis de mediadores inflamatorios y del estrés
oxidativo en macrófagos estimulados con LPS (Kazlowska et al., 2010). De las algas
rojas Galaxaura rugosa y Dichotomaria obtusata se obtuvieron extractos acuosos
sobre inflamación intraperitoneal (Frías et al., 2011).
Se ha descrito la actividad antiinflamatoria de una fracción obtenida de Himanthalia
elongata, empleando el ensayo “hot plates” sobre ratones (Anca et al., 1993). Estudios
realizados con fracciones ricas en lectinas y carbohidratos sulfatados provenientes de
las algas Bryothamnion seaforthii y B. triquetrum, mostraron actividad analgésica y
antiinflamatoria de los extractos y fracciones semipurificadas después de ser
administrados por vía oral e intraperitoneal (Viana et al., 2002).
Más adelante, se describe la actividad antiinflamatoria de polisacáridos aislados de
Turbinaria ornata, tras su administración oral, empleando el modelo de edema inducido
por carragenina y el modelo de permeabilidad vascular en ratones (Ananthi et al.,
2010).
Se han aislado a partir de algas marinas diversos compuestos con actividad
antiinflamatoria, algunos de ellos se muestran en la Figura 2. El compuesto difenil-eter
(3), aislado de Cladophora fascicularis, inhibió la inflamación inducida sobre ratones
de acuerdo a Higa en 1989. El ptilodene (4), un ácido graso aislado del alga roja
Ptilotafilicina sp. (López y Gerwick, 1988); así como tres compuestos aislados de
Farlowia mollis que fueron capaces de inhibir la biosíntesis de leucotrienos por su
efecto sobre la 5-LOX (Solem et al., 1989). Del alga roja Vidalia obtusaloba se aislaron
dos bromofenoles con efectos antiinflamatorios inhibidores de la FLA2 (Wiemer et al.,
1991).
El rhiphocephalin (5), un sesquiterpenoide lineal obtenido del alga verde
Rhiphocephalus phoenix, el caulerpin (6), sesquiterpenoide monocíclico aislado de
Caulerpa prolifera, un derivado de ácidos grasos obtenido de Liagora farinosa, un
enoléter macrocíclico purificado de Phacelocarpus labillardieri, dos
bromohidroquinonas preniladas procedentes de Cymopolia barbata y el stipoldion (7),
7
una ortoquinona de Stypopodium zonale; fueron descritos como compuestos con
actividad antiinflamatoria, ya que inhibieron la actividad de la enzima FLA2, enzima
involucrada en el metabolismo del ácido araquidónico (Mayer et al., 1993).
De la misma forma, se aisló el epitaondiol (8) proveniente de extractos de Stypopodium
flabelliforme, que inhibió la liberación de leucotrienos y tromboxanos (Alcaraz y Paya,
1994) y el pacifenol (9), aislado de Laurencia claviformis, presentó actividad
antiinflamatoria al actuar como inhibidor de la formación y/o liberación de
prostanglandinas y leucotrienos, así como regulador de especies reactivas de oxígeno
(Wylie et al., 1997).
Se reporta el aislamiento e identificación de un compuesto glicoesterol del alga Ulva
lactuca, con actividad antiedematosa después de ser administrado tópicamente en el
modelo de edema en oreja de ratón inducido por éster de forbol (Awad, 2000).
Posteriormente, se aisló la sargaquinona (10), compuesto proveniente del alga parda
Taonia atomaria exhibiendo una alta actividad antiinflamatoria a través de la inhibición
de la biosíntesis de leucotrienos (Tziveleka et al., 2005). Asimismo, el fluorotanino
denominado fluorofucofuroeckol-B (11), aislado de Eisenia arborea, inhibió la
producción de histamina, mediador involucrado en las etapas iniciales de la
inflamación (Sugiura et al., 2006).
8
3
4
5 6
7
8
9
10
11
Figura 2. Compuestos con actividad antiinflamatoria aislados de diversas especies de macroalgas.
9
3. JUSTIFICACIÓN
En las últimas décadas la población mexicana ha manifestado una transición
epidemiológica. Las enfermedades crónico-degenerativas han desplazado a las
infecciosas como principales causas de mortandad (Robbins & Cotran, 2010).
La importancia de controlar la respuesta inflamatoria radica en que la activación
inadecuada o el control erróneo de esta causa lesiones tisulares en diversos procesos.
Los mecanismos diseñados para destruir a los invasores extraños y los tejidos
necróticos tienen una capacidad intrínseca de lesionar los tejidos sanos. Cuando se
dirige de forma inadecuada, se convierte en la causa de lesiones y enfermedades.
Las reacciones inflamatorias son la base de enfermedades crónicas frecuentes, como
artritis reumatoide y también de reacciones de hipersensibilidad que ponen en riesgo
la vida frente a picaduras de insectos, fármacos y toxinas. Por este motivo, se ha
desarrollado una amplia gama de antiinflamatorios, que deberían controlar las
secuelas perniciosas de la inflamación, si es posible sin interferir con sus efectos
benéficos (Robbins & Cotran, 2010).
Sin embargo, una de las desventajas del uso de los medicamentos antiinflamatorios
implica la presencia de efectos secundarios tales como: ulceración, perforación,
insuficiencia renal, necrosis papilar, hipertensión arterial, hemorragias, asma, rinitis,
angioedemas y fotosensibilidad, entre otras.
Organismos sésiles como las macroalgas se encuentran en un ambiente exigente,
competitivo y agresivo, por lo que se ven obligados a producir moléculas activas,
potentes y específicas para defenderse de sus depredadores (Jha & Zi-Rong, 2004).
Derivado de lo anterior, en la actualidad se siguen descubriendo novedosas y
prometedoras estructuras de compuestos de origen marino que han abierto nuevas
líneas de investigación en el campo médico-farmacéutico. Específicamente, algunos
estudios han reportado que los productos naturales marinos provenientes de
macroalgas tienen efectos positivos contra padecimientos inflamatorios, sin efectos
secundarios, en comparación con otros tratamientos (Pérez, 2012).
10
4. HIPÓTESIS
Las macroalgas son un recurso potencial para el aislamiento de agentes
antiinflamatorios y dentro de su perfil de compuestos químicos, los responsables de la
actividad serán del tipo fenol, flavonoides y esteroles.
5. OBJETIVO
Evaluar la actividad antiinflamatoria de extractos crudos y fracciones provenientes de
macroalgas recolectadas en costas de Baja California Sur.
5.1 Objetivos Particulares
Evaluar la actividad antiinflamatoria de los extractos algales por diversos
ensayos in vitro e in vivo.
Seleccionar las algas con los mejores resultados de actividad antinflamatoria,
para su posterior fraccionamiento.
Analizar el perfil fitoquímico de extractos y fracciones con mayor potencial
antiinflamatorio.
11
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Recolecta e Identificación
El material algal se recolectó en la zona submareal de la localidad de San Juan de la
Costa (24°22'15.00"N, 110°41'22.00"O), así como de la localidad de Punta Roca
Caimancito (24°12'10.84"N, 110°17'57.96"O), La Paz, Baja California Sur. Las
muestras se lavaron con agua dulce para retirar epífitos conspicuos, las algas se
secaron al sol, se molieron y se almacenaron a -20° C hasta el momento de su uso.
Un espécimen fresco se preservó en una solución de formaldehido al 4 % para su
identificación taxonómica en el Laboratorio de Ficología de la UABCS. En el caso de
los extractos de Sargassum sinicola y S. horridum si bien estas dos especies presentan
sinonimia taxonómica, para este trabajo se mantuvieron como dos especies debido a
que fueron recolectadas en diferentes localidades y épocas del año.
6.2 Obtención de Extractos Crudos
Para obtener los extractos crudos en seco, 300 g del algal seca y molida se maceraron
con 800 mL diclorometano destilado al 100 % hasta cubrir totalmente el tejido. Se
dejaron macerar durante nueve días, realizando recambios de disolvente cada tercer
día. Posteriormente, se realizó una segunda maceración con 750 mL de etanol al 96
% y nuevamente se realizan los recambios de disolvente cada tercer día. En cada
recambio se recolectó el extracto y el total (V =2 L) se secó a 40° C en rotavapor a
presión reducida y el extracto crudo obtenido se almacenó a -20° C hasta el momento
de su evaluación.
Para la obtención de los extractos acuosos, 100 g de cada alga seca y molida fueron
extraídos con 800 mL de agua destilada con agitación continua por 4 h a 25° C; se
incrementó la temperatura a 80° C y se aplicó agitación continua por 2 h. El extracto
acuoso obtenido se centrifugó hasta obtener soluciones clarificadas. Cada extracto se
precipitó por adición de 3 volúmenes de etanol. Finalmente, el precipitado se recuperó
por centrifugación y se secó en estufa eléctrica a 50° C. Cada extracto fue etiquetado
y almacenado a -20° C.
12
6.3 Análisis fitoquímico
Se evaluó el perfil de compuestos de cada extracto crudo por cromatografía en capa
fina (CCF) empleando placas de sílica gel de vidrio de fase normal. Se empleó un
sistema eluyente de CH2Cl2: MeOH (90:10). Las muestras se depositaron en una placa
cromatográfica, las placas se eluyeron, se secaron para eliminar el exceso de solvente.
Posteriormente, se rociaron con los reveladores (Tabla I) para identificar la presencia
de los compuestos principales (Harborne, 1998).
Tabla I. Reveladores para análisis fitoquímico.
6.4 Determinación de la actividad antiinflamatoria.
Para determinar la actividad antiinflamatoria se utilizaron tres métodos indirectos in
vitro y uno In vivo. Los métodos in vitro consistieron en: 1) protección de membrana de
glóbulos rojos ante la hemólisis inducida por hipotonicidad (HRBC), 2) la inhibición de
la desnaturalización proteica inducida por calor (IDP) y 3) la inhibición del contenido
de la enzima mieloperoxidasa (MPO). El método in vivo consistió en la administración
tópica de TPA (éster de forbol) provocando un edema agudo con infiltración
leucocitaria.
Núcleo Fitoquímico Revelador
Alcaloides Dragendorff
Triterpenos y /o esteroles Lieberman-Burchard
Fenoles y taninos FeCl3 al 5 % en HCl 0.5 N
Flavonoides AlCl3 al 1 % en EtOH
Cumarinas KOH al 10 % en EtOH
Saponinas H2SO4 al 10 % en EtOH + vainillina 8 %
13
6.4.1 Ensayo in vitro de protección de la membrana de células sanguíneas
Preparación de Suspensión de Glóbulos Rojos Humanos (HRBC)
Una muestra de sangre fresca se mezcló con un volumen igual de solución Alsever
esterilizada (2 % de dextrosa, 0.8 % de citrato sódico, 0.05 % de ácido cítrico y 0.42 %
de cloruro de sodio en agua). La mezcla se centrifugó a 3000 rpm por 10 min y el
paquete celular se recuperó por decantación y se lavó tres veces con solución isosalina
(0.85 %, pH 7.2). Con el paquete celular se preparó una suspensión al 10 % v/v con
solución isosalina (Chippada et al., 2011).
Hemólisis Inducida
La mezcla de ensayo contenía buffer de fosfato 1 mL [pH 7.4, 0.15 M], 2 mL de solución
salina hipotónica [0.36 %], 0.5 mL de suspensión HRBC [10 % v/v] con 0.5 mL de
extractos de algas a 10 μg mL-1. Como control positivo se empleó diclofenaco sódico
(10 μg mL-1) y como blanco se utilizó agua destilada. Posteriormente se incubaron a
37º C durante 30 min y se centrifugaron. Se estimó el contenido de hemoglobina en
un espectrofotómetro a 560 nm (Chippada et al., 2011).
% Hemólisis = (𝐷𝑂𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐷𝑂𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙) ∗ 100
El porcentaje de estabilización de la membrana HRBC se calculó con la siguiente
fórmula (Chippada et al., 2011):
% Protección = 100 − % hemólisis
Todas las determinaciones se realizaron por duplicado midiendo la densidad óptica a
520 nm en un espectrofotómetro Milton Roy modelo spectronic 20D.
6.4.2 Actividad antiinflamatoria mediante inhibición de la desnaturalización
proteica (antiartrítico).
La solución de ensayo (1 mL) consistió en 0.90 mL de albúmina de huevo (solución
acuosa al 1 % p/v) y 0.1 mL del extracto de prueba (10 μg mL-1). El control negativo (1
mL) consistió en 0.90 mL de albúmina de huevo (solución acuosa al 1 % p/v) y 0.1 mL
14
de agua destilada. El control positivo (1 mL) se preparó con 0.90 mL de agua destilada
y 0.1 mL de diclofenaco sódico a una concentración de 10 μg mL-1. Todas las
soluciones anteriores se ajustaron a pH 6.3 usando HCl 1N. Las muestras se incubaron
a 37° C durante 20 min, posteriormente la temperatura se incrementó a 57° C durante
30 min. Después de enfriar, se añadió 2.5 mL de buffer de fosfato a las soluciones
anteriores. La absorbancia se midió utilizando un espectrofotómetro UV-Visible a 416
nm. El porcentaje de inhibición de desnaturalización de la proteína se calculó de
acuerdo a siguiente fórmula:
% Inhibición = [100 −(DO𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜−DO𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)
DO𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙] 100.
El control negativo represento el 100 % de la desnaturalización de las proteínas
(Lavanya et. al., 2010).
6.4.3 Actividad antiinflamatoria (in vivo) mediante edema inducido por TPA (13-
acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol) en oreja de ratón (in vivo).
Para el bioensayo se utilizaron ratones machos de la cepa CD-1 de 25 a 30 g, entre
siete a diez semanas (n = 3 ratones por extracto), mantenidos en condiciones estándar
de acuerdo con las regulaciones establecidas en la NOM-062-ZOO-1999. En ambos
lados de la oreja derecha, se administró el irritante 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol
(TPA, 2.5 μg mL-1 en etanol). Los extractos (1 mg 20μL-1) y el fármaco de referencia
(indometacina) fueron diluidos en disolventes adecuados y se administraron después
de la aplicación de TPA. Por otra parte, la oreja izquierda se empleó como control.
Transcurridas 4 h se sacrificaron los animales en cámara de CO2 para posteriormente
obtener muestra de cada pabellón auricular mediante un sacabocado (7 mm de
diámetro). Se calculó la diferencia de peso entre oreja tratada y no tratada:
[𝐃𝐞𝐥𝐭𝐚 𝐝𝐞 𝐩𝐞𝐬𝐨 (mg) = ∆peso = Pesooreja tratada − Pesooreja no tratada]
Finalmente se expresaron los resultados como porcentaje de inhibición del edema
calculado con la siguiente fórmula:
15
% inhibición: 100 (∆Pesocontrol−∆Pesotratamiento
∆Pesocontrol) (González et al., 2011).
La actividad antinflamatoria se consideró como moderada si la inhibición del edema es
del 35 al 65 % y como efecto antinflamatorio significativo con un valor mayor al 65 %
(Tincani et al., 2007).
6.4.4 Actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO) por el método de TMB (3,3’,
5,5’-tetrametilbenzidina) (in vitro).
La evaluación de la actividad de los extractos y fracciones sobre la enzima MPO se
llevó a cabo siguiendo los métodos descritos por Bradley et al. (1982) y Suzuki et al.
(1983). Las muestras de oreja (biopsias) se trituraron con ayuda de un
homogeneizador metálico durante 30 s en 1 mL de HTAB 0.5 % (bromuro de
hexadeciltrimetilamonio). Posteriormente se congelaron y descongelaron 3 veces,
para la ruptura de los gránulos azurófilos. Al término de este paso se centrifugaron
durante 5 min a 12,000 rpm a 4° C. Se tomaron por cuadruplicado 10 µL del
sobrenadante y se colocaron en una placa de 96 pozos. Como blanco se utilizaron 10
µL de HTAB 0.5 %. A cada pozo se le adicionaron 180 µL de buffer de fosfatos (PBS)
sin HTAB, posteriormente la placa se calentó a 37° C y se mantuvo a esta temperatura
el resto del ensayo. Se agregaron 20 µL de H2SO4 al 0.017 %. Una vez hecho esto se
inició la reacción adicionando 20 µL de 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbenzidina (TMB) y se
incubó durante 5 min a 37° C con agitación suave. Una vez transcurrido este tiempo
se detuvo la reacción agregando 20 µL de H2SO4 2M. La actividad enzimática se
determinó colorimétricamente empleando un lector de placas, midiendo la absorbancia
a 450 nm.
% inhibición MPO = (AbsTPA − Absmuestra
AbsTPA) 100
16
6.4.5 Análisis Estadísticos
Los resultados se expresan como la media ± SD (desviación estándar de las medias).
La desviación típica y el error tipo de cada una de las medias obtenidas, así como la
significación estadística de las diferencias, se determinarán utilizando un análisis
ANOVA seguida de la prueba de Dunnett, para comparaciones múltiples.
6.5 Fraccionamiento
Doscientos miligramos de los extractos crudos que resultaron activos en los
bioensayos, fueron fraccionados mediante columna cromatográfica. Se utilizó sílica gel
fase normal (marca Whatman) en una proporción 1:100 muestra/sílica. Cada muestra
se disolvió en CH2Cl2 y fue eluída con el sistema Hex:CH2Cl2:MeOH en gradiente de
polaridad establecido por cromatografía en capa fina. Las fracciones obtenidas se
analizaron por cromatografía en capa fina y se unieron por similitud en cuanto al factor
de retención de los compuestos. Las fracciones se almacenaron a -10° C.
17
7. RESULTADOS
7.1 Obtención de Extractos Crudos
Se obtuvieron tres extractos (diclorometanólico, etanólico y acuoso) de cada especie
de macroalgas, asignándoles las claves de identificación descritas en la Tabla II.
Tabla II. Extractos crudos obtenidos a partir de diclorometano, etanol y agua.
Especie Extracto CH2Cl2 Extracto EtOH Extracto H2O
Opuntiella califórnica Oc-20 Oc-40 Oc-60
Laurencia gardnerii Lg-20 Lg-40 Lg-60
Laurencia lajolla Ll-20 Ll-40 Ll-60
Gracilaria vermiculophylla Gv-20 Gv-40 Gv-60
Ulva lactuca Uv-20 Uv-40 Uv-60
Codium fragile Cf-20 Cf-40 Cf-60
Sargassum horridum Sh-20 Sh-40 Sh-60
Sargassum sinicola Ss-20 Ss-40 Ss-60
Colpomenia tuberculata Ct-20 Ct-40 Ct-60
Padina sp. Psp-20 Psp-40 Psp-60
7.2 Análisis Fitoquímico
En el análisis fitoquímico de los extractos diclorometanólicos las cumarinas,
flavonoides y fenoles estuvieron presentes de manera abundante (Tabla III), seguido
de saponinas y los compuestos tipo terpeno. Mientras que los alcaloides solo fueron
identificados en los extractos de Laurencia gardnerii, Sargassum horridum y
Colpomenia tuberculata.
18
Tabla III. Análisis fitoquímico de los extractos diclorometanólicos. ++ Abundante, + moderado, - ausencia.
Extracto Saponinas Cumarinas Flavonoides Alcaloides Triterpenos Fenoles
O. californica - ++ + + + -
L. gardnerii + ++ ++ - + ++
L. lajolla ++ ++ ++ ++ ++ ++
G. vermiculophylla - ++ + - + +
U. lactuca ++ ++ ++ - + +
C. fragile ++ ++ ++ - + ++
S. horridum ++ ++ ++ ++ ++ ++
S. sinicola ++ + ++ - ++ ++
C. tuberculata - ++ ++ ++ - -
P. sp. ++ + ++ + ++ +
En los extractos etanólicos (Tabla IV) se determinó la presencia abundante de
alcaloides y saponinas. Flavonoides y cumarinas sólo dieron positivo para Laurencia
gardnerii, L. lajolla, Sargassum horridum y Colpomenia tuberculata. Mientras que los
compuestos terpenoides estuvieron presentes en todas las muestras excepto para
Ulva lactuca.
Tabla IV. Análisis fitoquímico de los extractos etanólicos. ++ Abundante, + moderado, - ausencia.
Extracto Saponinas Cumarinas Flavonoides Alcaloides Triterpenos Fenoles
O. califórnica - - + ++ + -
L. gardneri ++ ++ ++ + + ++
L. lajolla ++ + ++ ++ + ++
G. vermiculophylla + - - ++ + +
U. lactuca ++ - - ++ - +
C. fragile ++ - - ++ + +
S. horridum ++ ++ ++ ++ + +
S. sinicola ++ ++ + - ++ ++
C. tuberculata + ++ ++ ++ + +
P sp. ++ - + + + ++
19
7.3 Ensayo Antiinflamatorio in vitro (HRBC)
La estabilización de la membrana lisosomal es relevante para limitar la respuesta
inflamatoria por inhibición de la liberación de constituyentes lisosomales de neutrófilos
activados tales como enzimas o proteasas; causando inflamación en el tejido tisular y
dañando la liberación extracelular o mediante la estabilización de la membrana
lisosomal. La membrana eritrocitaria es análoga a la membrana lisosomal. Por lo tanto,
la estabilización de la membrana celular de glóbulos rojos humanos por hipotonicidad
induciendo la lisis de membrana puede considerarse como una medida in vitro de la
actividad antiinflamatoria de compuestos orgánicos.
En el ensayo de hemólisis inducida, la mayoría de los extractos acuosos mostraron un
porcentaje de protección de la membrana de glóbulos rojos superior al 90 %, salvo los
extractos de Padina sp., Laurencia gardnerii y Ulva lactuca los cuales tuvieron una
actividad antiinflamatoria menor al 60 % (Fig. 3A).
Los extractos diclorometanólicos provenientes de macroalgas rojas presentaron los
mayores porcentajes de protección; especificamente Opuntiella californica, Laurencia
gardnerii y Gracilaria vermiculophylla exhibieron más del 90 % de protección de la
membrana; valores semejantes se obtuvieron con el diclofenaco sódico (96 %) que fue
empleado como control positivo. Contrario a los extractos de algas verdes y pardas los
cuales en general no superaron el 30 % de protección de membrana (Fig. 3B).
Finalmente, los extractos etanólicos de las algas rojas Laurencia lajolla y Gracilaria
vermiculophylla presentaron porcentajes de actividad superiores al 70 %; valores
semejantes a los determinados para las algas pardas del género Sargassum, los
cuales mostraron una actividad de protección de membrana del 77 %. En contraste
con los extractos de Opuntiella californica y Colpomenia fragile que permitieron la lisis
total de la membrana (Fig. 3C).
20
A
B
C
Figura 3. Porcentaje de protección de los extractos A) acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos, sobre la membrana de eritrocitos humanos. DCF: Diclofenaco, Oc: Opuntiella californica, Lg: Laurencia gardnerii, Ll: Laurencia lajolla, Gv: Gracilaria
vermiculophylla, Ul: Ulva lactuca, Cf: Codium fragile, Sh: Sargassum horridum, Ss: Sargassum sinicola,
Ct: Colpomenia tuberculata, Psp: Padina sp.
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s (
%)
21
7.4 Actividad antiinflamatoria mediante inhibición de la desnaturalización
proteica (antiartrítico).
La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica y sistémica que
predominantemente afecta las articulaciones y tejidos periarticulares; causando
deformaciones incapacitantes y discapacidades funcionales. La AR es clasificada
como una artritis inflamatoria. La enfermedad comprende tres procesos básicos
interrelacionados: inflamación, proliferación sinovial y destrucción del tejido articular.
La desnaturalización de proteínas es un proceso que implica la pérdida de la estructura
terciaría y cuaternaria de las proteínas por estrés, la aplicación de compuestos como
ácidos o bases fuertes, solventes orgánicos o calor. Muchas proteínas pierden su
función biológica cuando se desnaturalizan, por lo tanto, la desnaturalización es una
causa bien fundamentada de inflamación.
Los resultados mostraron que únicamente el extracto acuoso de Gracilaria
vermiculophylla tiene un efecto de inhibición de la desnaturalización proteica,
alcanzando un 85 % de actividad (Fig. 4A) a una concentración de 10 μg mL-1. Así
mismo, Padina sp. logró un efecto del 31 %, Colpomenia tuberculata el 17 % y
Laurencia gardnerii apenas alcanzó el 10 % de actividad. Mientras que el diclofenaco
sódico (control positivo), a la misma concentración, obtuvo el 96 % de inhibición.
Únicamente los extractos de diclorometano de algas rojas lograron la inhibición de la
desnaturalización proteica; específicamente Gracilaria vermiculophylla, Laurencia
gardnerii y Opuntiella californica que presentaron un 54, 49 y 30 % de protección de
las estructuras proteicas, respectivamente; en contraste con el diclofenaco sódico (10
μg mL-1) con 96 %, usado como control positivo (Fig. 4B). Con el resto de los extractos
no se logró la inhibición de la desnaturalización.
En general, los extractos etanólicos evaluados no superaron el 50 % de protección de
la estructura proteica, observando que Laurencia gardneri, Codium fragile y Padina sp.
mostraron la mayor inhibición de desnaturalización con el 47, 30 y 28 %,
respectivamente (Figura 4C).
22
A
B
C
Figura 4. Inhibición de la desnaturalización de albúmina al 1 % por los extractos A) acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos. DCF: Diclofenaco, Oc: Opuntiella californica, Lg: Laurenica gardnerii, Ll: Laurenica lajolla, Gv: Gracilaria vermiculophylla, Ul: Ulva lactuca, Cf: Codium fragile, Sh: Sargassum horridum, Ss: Sargassum sinicola, Ct: Colpomenia tuberculata, Psp: Padina sp.
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%)
23
7.5 Actividad antiinflamatoria (in vivo) mediante edema inducido por TPA (13-
acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol) en oreja de ratón.
El modelo de inflamación aguda de inducción de edema auricular es comúnmente
utilizado para la búsqueda de compuestos con actividad antiinflamatoria, así como
para evaluar la actividad de mediadores como los leucotrienos, prostaglandinas,
enzimas lisosomales y la migración-degranulación leucocitaria a través de la liberación
de diversas enzimas como la mieloperoxidasa (Ospina, 2000).
El porcentaje de inhibición del edema se calcula con respecto al grupo control, el cual
recibe TPA y el vehículo de los tratamientos. Del total de extractos acuosos solamente
se evaluaron cuatro de los diez extractos disponibles, ya que no todos se disolvieron
en los vehículos dispuestos para el ensayo.
Para el caso de los extractos acuosos (Fig. 5A), se logró un efecto poco significativo
en la reducción del edema en oreja de ratón; ya que únicamente el extracto de
Colpomenia tuberculata apenas superó el 10 % de inhibición.
En general, se considera que los extractos diclorometanólicos (Fig. 5B) tienen una
actividad antiinflamatoria moderada, ya que los valores de inhibición del edema se
encuentran entre el 35 y 65 % de actividad. Específicamente, los extractos
pertenecientes a las rodofitas que exhibieron los mayores porcentajes de inhibición del
edema fueron los de Gracilaria vermiculophylla y Opuntiella californica con un 52 % de
actividad. Además, en el grupo de las algas pardas destaca Colpomenia tuberculata y
en las verdes Codium fragile con un 56 % de efecto antiedematoso.
Adicionalmente, la actividad antiinflamatoria de los extractos etanólicos evaluados
(Fig. 5C) se considera baja ya que es menor al 35 %. Laurencia lajolla, Codium fragile
y Padina sp., alcanzaron valores de 20, 22 y 18 % respectivamente, de actividad
antiinflamatoria siendo estos los mayores índices determinados para los extractos
etanólicos.
24
A
B
C
Figura 5. Porcentaje de inhibición del edema inducido con TPA en oreja de ratón por los extractos: A) acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos. TPA: 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol IMC: Indometacina. Oc: Opuntiella californica, Lg: Laurencia gardnerii, Ll: Laurencia lajolla, Gv: Gracilaria vermiculophylla, Ul: Ulva lactuca, Cf: Codium fragile, Sh: Sargassum horridum, Ss: Sargassum sinicola, Ct: Colpomenia tuberculata, Psp: Padina sp.
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TPA IMC Oc Lg Ll Gv Ul Cf Sh Ss Ct Psp
Inh
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(%)
25
7.6 Actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO) por el método de TMB (3,3’,
5,5’-tetrametilbenzidina) (in vitro).
La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima lisosomal que se almacena principalmente
en los gránulos azurófilos de los neutrófilos polimorfonucleares humanos. La MPO se
libera en vacuolas fagocíticas durante la activación celular y su grado de actividad está
directamente relacionado con la concentración de neutrófilos en el tejido inflamado;
por lo que la medición de esta actividad enzimática ha sido considerada un sensible
marcador cuantitativo de la quimiotaxis y de la infiltración de neutrófilos en el proceso
inflamatorio (Cheng et al., 2006).
Tomando en consideración que la actividad de la enzima mieloperoxidasa del grupo
de TPA es de 100 %, se determinó el porcentaje de actividad en el grupo control (13.80
%) y respecto a él se calculó el porcentaje de actividad para cada muestra. Además,
en el grupo tratado con el fármaco de referencia, indometacina, se estableció un
porcentaje de actividad enzimática del 7.47 % (Fig. 6).
El extracto acuoso de Colpomenia tuberculata, redujó la actividad de la enzima MPO
hasta el 47 % mientras que Laurencia lajolla únicamente la disminuyó al 82 % (Fig.
6A).
Los extractos diclorometanólicos de algas rojas mostraron los mayores efectos de
reducción de actividad sobre la MPO, así Gracilaria vermiculophylla y Opuntiella
tuberculata minimizaron la actividad enzimática hasta un 30 y 43 %, respectivamente,
seguidos de Laurencia gardnerii logrando reducir el contenido enzimático hasta el 53
%. Adicionalmente, destaca el efecto expuesto por Colpomenia tuberculata lograron la
reducción de la actividad de MPO hasta el 30 % (Fig. 6B).
Finalmente, para el caso de los extractos etanólicos (Fig. 6C) el grupo de extractos
que destaca por lograr la menor actividad de MPO, fue el de las clorofitas, donde
encontramos que Ulva lactuca logró reducir el contenido enzimático hasta un 43 %.
Contrario a lo mostrado por los extractos de las rodofitas y feofitas, para los cuales se
determinaron valores superiores al 75 y 55 %, respectivamente.
26
A
B
C
Figura 6. Porcentaje de inhibición de la enzima mieloperoxidasa por los extractos: A) acuosos, B) diclorometanólicos y C) etanólicos. TPA: 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol IMC: Indometacina. Oc: Opuntiella californica, Lg: Laurencia gardnerii, Ll: Laurencia lajolla, Gv: Gracilaria vermiculophylla, Ul: Ulva lactuca, Cf: Codium fragile, Sh: Sargassum horridum, Ss: Sargassum sinicola, Ct: Colpomenia tuberculata, Psp: Padina sp.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
basal TPA IMC Ct Gv Cf Ll
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
basal TPA IMC Oc Lg Ll Gv Ul Cf Sh Ss Ct Psp
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
basal TPA IMC Oc Lg Ll Gv Ul Cf Sh Ss Ct Psp
Activid
ad
de
la
en
zim
a M
ielo
pe
roxid
asa
(%
)
27
De acuerdo a lo descrito anteriormente y considerando los índices de actividad
obtenidos en cada ensayo; se determinó que los extractos crudos con mayor potencial
antiinflamatorio (Tabla V) son los extractos diclorometanólicos elaborados con algas
rojas; específicamente Gracilaria vermiculophylla (Gv-20), Laurencia gardnerii (Lg-20)
y Opuntiella californica (Oc-20), los cuales, de acuerdo al análisis fitoquímico, dentro
de su perfil de compuestos principalmente se encuentran cumarinas, saponinas,
flavonoides y alcaloides, siendo estos los posibles responsables de la actividad
antiinflamatoria.
Tabla V. Extractos con mayor potencial antiinflamatorio y perfil fitoquímico. HRBC: Estabilidad de glóbulos rojos humanos ante la hemólisis de membrana inducida por hipotonicidad, IDP: Inhibición de la desnaturalización de proteínas, IEOR: Inducción de edema en oreja de ratón, MPO: Actividad enzima mieloperoxidasa.
Extracto HRBC (%) IDP (%) IEOR (%) MPO (%) Perfil de Compuestos
Gv-20 95 54 56 30 Cumarinas, Flavonoides, Triterpenos
Lg-20 96 49 42 53 Saponinas, Flavonoides, Fenoles
Oc-20 95 30 56 44 Flavonoides, Triterpenos, Alcaloides
Ct-20 0 — 52 31 Cumarinas, Flavonoides, Alcaloides
Ll-40 72 47 20 78 Saponinas, Flavonoides, Alcaloides
Cf-40 — 30 22 62 Saponinas, Alcaloides, Triterpenos
Psp-40 22 28 18 53 Saponinas, Flavonoides, Fenoles
28
7.7 Fraccionamiento
Se llevó a cabo el fraccionamiento mediante columna cromatográfica de los tres
extractos que resultaron con los mayores índices de actividad antiinflamatoria
obteniendo 10 fracciones para Gracilaria vermiculophylla (Gv-20), nueve para
Laurencia gardnerii (Lg-20) y ocho para Opuntiella califórnica (Oc-20) (Tabla VI).
Tabla VI. Fracciones obtenidas mediante cromatografía en columna a partir de los extractos crudos con mayor potencial antiinflamatorio.
Gv-20 (mg) Lg-20 (mg) Oc-20 (mg)
Gv-20-FA (7.80) Lg-20-F1 (48.8) Oc-20-F1 (14.72) Gv-20-F1 (2.30) Lg-20-F2 (37.9) Oc-20-F2 (16.85) Gv-20-F2 (43.8) Lg-20-F3 (1.10) Oc-20-F3 (13.09) Gv-20-F3 (10.6) Lg-20-F4 (3.40) Oc-20-F4 (18.28) Gv-20-F4 (6.70) Lg-20-F5 (20.0) Oc-20-F5 (20.80) Gv-20-F5 (1.30) Lg-20-F6 (49.9) Oc-20-F6 (15.77) Gv-20-F6 (3.40) Lg-20-F7 (6.40) Oc-20-F7 (20.18) Gv-20-F7 (50.2) Lg-20-F8(10.4) Gv-20-F8 (62.5) Lg-20-F9 (2.00) Gv-20-F9 (25.6)
Figura 7. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Gracilaria
vermiculophylla.
29
Figura 8. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Laurencia gardnerii.
Figura 9. Proceso de fraccionamiento del extracto diclorometanólico de Opuntiella californica.
30
7.8 Actividad Antiinflamatoria de Fracciones
Del total de fracciones obtenidas (26) se evaluaron únicamente aquellas que tuvieron
un peso seco mayor a 5 mg, mediante los ensayos in vitro e in vivo empleados para
los extractos crudos.
En la tabla VII se describen las fracciones que resultaron más activas, así como los
porcentajes de actividad obtenidos en cada ensayo.
Tabla VII. Fracciones con mayor potencial antiinflamatorio. HRBC: estabilidad de glóbulos rojos humanos ante la hemólisis de membrana inducida por hipotonicidad, IDP: Inhibición de la desnaturalización de proteínas, IEOR: Inducción de edema en oreja de ratón, MPO: Actividad enzima mieloperoxidasa. —: sin actividad.
Fracciones HRBC (%) IDP (%) IEOR (%) MPO (%) Perfil de Compuestos
Diclofenaco 96.43 96 — —
Indometacina — — 80.19 7.47
Gv-20 95 54 56 30 Alcaloides Flavonoides Cumarinas
Gv-F3 66 92 41 90 Alcaloides Triterpenos
Gv-F7 70 78 55 — Alcaloides Triterpenos Cumarinas
Gv-F8 54 81 51 97 Alcaloides Flavonoides
Gv-F9 90 95 55 80 Alcaloides Flavonoides
Lg-20 96 49 42 53 Alcaloides Triterpenos Flavonoides
Lg-F5 30 90 43 30 Triterpenos Fenoles Flavonoides
Lg-F6 38 95 61 52 Alcaloides Triterpenos Fenoles
Lg-F7 52 95 44 32 Alcaloides Triterpenos
Oc-20 95 30 56 44 Alcaloides Fenoles Flavonoides
Oc-F5 95 87 42 — Triterpenos Fenoles Flavonoides
Oc-F6 88 88 59 47 Alcaloides Flavonoides
Oc-F7 52 95 45 48 Alcaloides Flavonoides
31
En las fracciones de Gracilaria vermiculophylla se incrementó la actividad
antiinflamatoria en los ensayos de protección de membrana y de inhibición de la
desnaturalización proteica comparada con la obtenida con el extracto crudo Gv-20. Sin
embargo, en el ensayo antiedematoso (IEOR) y de inhibición de la enzima
mieloperoxidasa esta disminuyó considerablemente.
Al realizar el fraccionamiento de Laurencia gardnerii se logró el incremento de la
inhibición de la desnaturalización proteica en las fracciones más polares. Así como un
mayor porcentaje de reducción del peso del edema en oreja de ratón. No obstante, la
capacidad de protección de membrana de eritrocitos (HRBC) disminuyó ampliamente
ya que el extracto crudo Lg-20 alcanzó valores del 96 % y las fracciones polares
mostraron porcentajes de actividad entre el 30 y 52 %. Para el ensayo de inhibición
enzimática las fracciones mostraron valores semejantes a los exhibidos por el extracto
crudo.
Las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo de Opuntiella californica mostraron
prácticamente la misma capacidad protectora de la membrana, a excepción de la
fracción Oc-F7 la cual tuvo un decremento del 52 %. La capacidad protectora de
estructuras proteicas incrementó considerablemente alcanzó valores alrededor de 90
%, comparados con el 30 % de actividad antiinflamatoria mostrada por el extracto
crudo. En cuanto al ensayo in vivo las fracciones más polares exhibieron un ligero
incremento en el efecto antiedematoso que el extracto crudo, alcanzando valores de
hasta el 59 %. De la misma forma, estas fracciones lograron reducir la actividad de la
mieloperoxidasa similares a los determinados para el extracto crudo.
32
8. DISCUSIÓN
Las macroalgas contienen una gran cantidad de elementos, desde altos contenidos de
fibra, minerales, lípidos, proteínas, ácidos grasos, aminoácidos esenciales,
polisacáridos, vitaminas y diversos y novedosos metabolitos secundarios. Estudios de
bioactividad de este recurso han demostrado que estos compuestos pueden tener
efecto antioxidante, antibacteriano, antitumoral y antiinflamatorio (Lee et al., 2013).
En este trabajo se determinó la actividad antiinflamatoria de extractos y fracciones de
macroalgas. La efectividad de esta actividad biológica se relacionó con el perfil de
compuestos químicos de cada especie evaluada, lo cual logró establecerse de manera
indirecta mediante ensayos fitoquímicos.
En general, los diferentes grupos algales evaluados en este trabajo, presentaron
actividad antiinflamatoria en diferente medida. Para el caso del grupo de las algas
pardas (Phaeophytas), los extractos acuosos estabilizaron la membrana de los
eritrocitos a través de la alteración de las cargas de la superficie (Hess & Milloning,
1972) con un efecto superior al 95 % y cerca del 70 % para los extractos etanólicos.
Respecto al ensayo in vivo los extractos diclorometanólicos lograron reducir el tamaño
del edema por debajo del 50 % (Sargassum horridum y Padina sp.).
La actividad protectora de membrana exhibida por los extractos de algas pardas
evaluadas en este trabajo resulta bastante prometedora ya que al comparar con otros
estudios en extractos metanólicos y de hexano de Sargassum wigthii a una
concentración de 50 μg mL-1, sólo se logró inhibir entre un 54.3 y 52.2 % (Pramitha &
Kumari, 2016). Respecto a la actividad antiedematosa, los resultados concuerdan con
lo descrito por Khan y colaboradores (2008), quienes evaluaron extractos metanólicos
de 37 especies de macroalgas prácticamente a la misma concentración (0.4 μg 10 mL-
1); entre las cuales destacan los extractos de Colpomenia bullosa y C. sinuosa que
exhibieron actividad antiinflamatoria al inhibir el edema inducido en oreja de ratón
hasta en un 52 y 72 %, respectivamente. Además, supera los resultados descritos para
las fracciones ricas en polisacáridos obtenidas a partir de Lobophora variegata al
inhibir el edema inducido en pata de rata hasta en un 44 % a una concentración de 12
33
μg g-1 (Siqueira et al., 2010). Así como a la actividad antiinflamatoria reportada para la
porción rica en polisacáridos sulfatados de Sargassum vulgare que logró disminuir
significativamente la infiltración celular en la región plantar de las ratas en las cuales
se indujo el edema a una concentración máxima de 50 mg kg-1 (Dore et al., 2013).
El análisis fitoquímico permite conocer las principales familias de metabolitos
secundarios con diversas actividades biológicas de importancia biotecnológica y
farmacéutica. En el grupo de algas pardas se identificaron principalmente compuestos
de tipo flavonoide.
Los flavonoides están ampliamente distribuidos entre los organismos de origen
terrestre (plantas superiores) y marino (macroalgas, esponjas, tunicados) (López,
2002). Todos los flavonoides se originan por ruta biosintética mixta a través de la vía
del ácido shikímico y la de los policétidos (Drago, 2007). Se sintetizan a partir de
flavononas derivadas a su vez de chalconas provenientes de la vía fenilpropanoide.
Su formación tiene lugar a partir de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y
también de unidades de acetato (Paredes & Clemente, 2005; Seigler, 1998).
Este grupo de compuestos han sido ampliamente estudiados y se les atribuyen
propiedades farmacológicas diversas: antiviral (Baalen et al., 1998), antibacteriana
(Ferry et al., 1996), neuroprotectora (Honda et al., 2001) y antiinflamatoria (Kim et al,
1998). Entre los mecanismos propuestos para explicar las actividades biológicas de
estos compuestos, se encuentra el efecto antioxidante, la quelación de metales,
inhibición enzimática y regulación génica (Elejalde, 2001). Específicamente, la
actividad antiinflamatoria de los flavonoides resulta de la combinación de sus
propiedades quelantes de hierro y secuestradoras de radicales libres; así como la
inhibición de oxidasas tales como lipoxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa,
NADPH oxidasa y xantina oxidasa. Otros mecanismos podrían incluir la inhibición de
enzimas involucradas en los procesos oxidativos, como la fosfolipasa A2 y la
estimulación de otras con propiedades antioxidantes como la catalasa y la superóxido
dismutasa (Pérez & Martínez, 2001).
34
Con respecto a las algas verdes (Chlorophytas), los extractos presentaron una baja
actividad antiinflamatoria, ya que únicamente el extracto acuoso de Codium fragile (Cf-
60) logró proteger la membrana de los eritrocitos ante la hemólisis inducida. En el
ensayo in vivo, únicamente el extracto diclorometanólico de C. fragile (Cf-20) logró
inhibir el edema auricular hasta un 52 %, así como inhibir la actividad de la enzima
mieloperoxidasa al 50 %.
En la literatura, los trabajos que describen la actividad antiinflamatoria en algas verdes
únicamente evalúan la capacidad de inhibir el edema auricular o plantar. De acuerdo
a nuestros resultados, la actividad del extracto Cf-20 es superior a lo descrito
previamente para el extracto metanólico de Codium fragile, el cual apenas superó el
30 % (Khan et al., 2008). Incluso es comparable con lo descrito para el extracto
metanólico de Ulva lactuca ya que este logró una reducción del edema hasta del 80 %
a una concentración de 500 mg kg-1 (Margret et al., 2009).
De acuerdo al análisis fitoquímico los principales grupos de compuestos en los
extractos de las clorofitas fueron las cumarinas. Las cumarinas son otro tipo de
metabolitos secundarios descritos en extractos de algas. Estas se encuentran, desde
el punto de vista químico, altamente relacionadas con los flavonoides. Por lo tanto, la
actividad antiinflamatoria de estos compuestos pudiera deberse a mecanismos de
acción similar al descrito para los flavonoides (Oliveros et al., 2011).
Los mejores resultados se obtuvieron con el grupo de las algas rojas (Rhodophytas),
donde se observó que los extractos crudos de Gracilaria vermiculophylla Gv-20,
Laurencia gardnerii Lg-20 y Opuntiella californica Oc-20 mostraron un porcentaje de
actividad superior al 95 % a una concentración de 10 μg mL-1. Si bien, no existen
reportes de estabilización de membrana eritrocitaria por hipotonicidad, en extractos
orgánicos de rodofitas, los resultados obtenidos son comparables con lo establecido
para extractos provenientes de plantas superiores. En nuestro caso, valores similares
de actividad se obtuvieron con menores concentraciones empleadas. Por ejemplo, el
extracto metanólico de Anisomeles malabarica Linn, mostró un efecto máximo de
estabilización de la membrana (98.34 %) semejante al de nuestros extractos más
35
activos, pero a una concentración de 2 mg mL-1 (Lavanya et al., 2010). Asimismo, el
extracto metanólico de Michelia champaca, evaluado a concentraciones de entre 100
a 300 μg mL-1, logró un valor máximo de estabilización de membrana del 57.4 %
(Ananthi et al., 2013). Otros trabajos describen la actividad antiinflamatoria de
extractos a base de mezclas de plantas (Deattu et al., 2012) alcanzando valores
máximos de protección de membrana del 63.76 %, en ambos casos el efecto fue menor
al mostrado por los extractos Gv-20, Lg-20 y Oc-20.
Específicamente, en este trabajo se observó que los extractos orgánicos de rodofitas
inhibieron el proceso de desnaturalización de la albúmina, resaltando los extractos
provenientes de Gracilaria vermiculophylla, siendo el extracto acuoso (Gv-60) el que
presentó mayor actividad con 85 %, seguido del extracto diclorometanólico (Gv-20)
con un 54 % a una concentración de 10 μg mL-1. Asimismo, destaca el efecto del
extracto de Laurencia gardnerii con 49 % de inhibición. Al comparar estos resultados
con la literatura, se determina que el extracto Gv-60 posee una potencial actividad
antiartrítica, ya que a una menor concentración se obtuvieron efectos similares a los
descritos para un extracto poliherbal que inhibió en un 72.79 % (Deattu, 2012), o el
extracto etanólico de Oryza sativa, arroz de origen indio, que presentó un efecto
inhibitorio del 84.15 % de a una concentración de 500 μg mL-1 (Rahman et al., 2015).
En cuanto a la actividad antiedematosa, los extractos que exhibieron el mayor efecto
fueron los de G. vermiculophylla, Laurencia gardnerii y Opuntiella californica (50 %).
Trabajos similares con Gracilaria verrucosa lograron una mayor actividad, la cual fue
del 79 % (Khan et al. 2008). En el análisis fitoquímico, se observó que los principales
compuestos de las algas rojas utilizadas en este estudio fueron del tipo de los
flavonoides, cumarinas y fenoles. Además de la inhibición de la liberación de
histamina, inhibición de la migración celular, actividad secuestrante de radicales libres,
así como el efecto protector vascular, se sabe que muchos flavonoides y fenoles
actúan de manera sinérgica para potenciar el efecto antiinflamatorio; un posible
mecanismo de acción sería la actividad inhibidora que ejercen sobre la prostaglandina
sintetasa, impidiendo la síntesis de prostaglandinas (Shigeoka et al., 2002; Ferrándiz
& Alcaraz, 1991).
36
El grupo de algas rojas, que comprende alrededor de 80,000 organismos, es
considerado una de las fuentes más importante de compuestos biológicamente activos
en comparación con las algas pardas y verdes (El Gamal, 2010). Específicamente, en
este trabajo encontramos que la mayoría de los extractos provenientes de rodofitas
exhibieron actividad antiinflamatoria en alguna media tanto en los ensayos in vitro
como in vivo. Siendo las especies Gracilaria vermicullophyla, Laurencia gardnerii y
Opuntiella californica las que presentaron el mayor potencial, por lo tanto, se realizó
un fraccionamiento mediante columna cromatográfica de cada una de ellas.
En las fracciones de Gracilaria vermiculophylla se incrementó la actividad
antiinflamatoria en los ensayos de protección de membrana y de inhibición de la
desnaturalización proteica comparada con la obtenida con el extracto crudo Gv-20.
Al realizar el fraccionamiento de Laurencia gardnerii se logró el incremento de la
inhibición de la desnaturalización proteica en las fracciones más polares. Así como un
mayor porcentaje de reducción del peso del edema en oreja de ratón. Para el ensayo
de inhibición enzimática las fracciones mostraron valores semejantes a los exhibidos
por el extracto crudo.
Las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo de Opuntiella californica mostraron
prácticamente la misma capacidad protectora de la membrana. La capacidad
protectora de estructuras proteicas se incrementó considerablemente alcanzando
valores alrededor de 90 %, comparados con 30 % de actividad antiinflamatoria
mostrada por el extracto crudo. En cuanto al ensayo in vivo las fracciones más polares
exhibieron un ligero incremento en el efecto antiedematoso que el extracto crudo
alcanzando valores hasta 59 %. De la misma forma, estas fracciones lograron reducir
la actividad de la mieloperoxidasa de manera semejante a la determinada para el
extracto crudo.
A partir de rodofitas se han aislado metabolitos secundarios de distinta naturaleza
química con actividad antiinflamatoria basados en diversos modelos experimentales;
cabe destacar entre los principales compuestos: aminoácidos, péptidos y proteínas
37
estereoidales (Bitencourt et al., 2008; Shin et al, 2011), terpenos (Chatter et al., 2011),
lípidos y fenoles (Lim et al., 2006; Calvancante-Silva et al., 2012).
El análisis fitoquímico determinó que en los extractos crudos con los mejores
resultados de actividad antiinflamatoria del grupo de las rodofitas, se observa la
presencia de compuestos de tipo alcaloides, cumarinas, flavonoides y fenoles.
Específicamente, en las fracciones que resultaron más activas destacan compuestos
de tipo alcaloide, terpénico y flavonoides.
En esta investigación no se llegó al aislamiento de los compuestos responsables de la
actividad, pero estudios previos han reportado que las algas marinas se caracterizan
por llevar a cabo la biosíntesis de alcaloides, fenoles y flavonoides que guardan mucha
similitud estructural con fármacos antiinflamatorios. Tal es el caso de la la caulerpina
(13) (De Souza et al., 2009); un alcaloide bisindólico, ya que contiene 2 grupos de indol
(benzilpirroles derivados de triptófano) unidos entre sí por un anillo cíclico de 8
carbones con dos grupos carboxilo (Kasim et al, 2010) que presenta actividad
antiinflamatoria. La caulerpina ha sido aislada de varias especies de algas rojas y
verdes (Aguilar-Santos, 1970) y presenta similitud estructural con la indometacina (12)
que es uno de los fármacos más utilizados para el tratamiento de la inflamación; y su
estructura consta de un núcleo alcaloide indólico (Fig. 10).
12
13
Figura 10. Comparación estructural del fármaco indometacina (12) con la caulerpina (13) aislada de algas verdes y rojas.
El paracetamol (14) es un compuesto para-aminofenólico, empleado como analgésico
y antiinflamatorio. Este compuesto es estructuralmente análogo a las amidas
38
sintetizadas por algunas algas rojas como la benzamida (15) y la bencenoacetamida
(16) (Leandrini de Oliveira et al., 2012). Por otro lado, es conocida la capacidad de las
rodofitas para sintetizar compuestos fenólicos como el viadol A (17) y viadol B (18),
bromofenoles aisladas de Vidalia obtusaloba, con actividad antiinflamatoria a través
de la inhibición de la FLA2 y de la reducción del edema auricular inducido por TPA
(Wiemer et al., 1991) (Fig. 11).
14
15
16
17
18
Figura 11. Comparación estructural del fármaco paracetamol (14) con compuestos sintetizados por macroalgas que presentan actividad antiinflamatoria.
Otro de los fármacos más empleados para controlar los procesos inflamatorios es el
diclofenaco sódico (19), un derivado del ácido fenilacético. Las rodofitas son capaces
de sintetizar compuestos derivados del ácido acético como el ácido indolacético (20) y
el ácido indocarboxílico (21) (Piotrowska y Bajguz, 2014); los cuales poseen similitudes
estructurales al diclofenaco (Fig. 12).
39
19
20
21
Figura 12. Comparación estructural del diclofenaco (19) con compuestos derivados del ácido acetico sintetizados por algas rojas.
Lo anterior sugiere que para el caso de los extractos y fracciones que presentaron
actividad antiinflamatoria en este estudio, los compuestos responsables pueden tener
similitud estructural con alguno de los anteriormente descritos.
Las fracciones más polares de Gracilaria vermiculophylla, Laurencia gardnerii y
Opuntiella californica, fueron las que presentaron los resultados antiinflamatorios más
prometedores. En el caso de las fracciones de O. californica presentaron un
incremento de efecto antiinflamatorio respecto al extracto crudo; destacando por
encima de algunos extractos y compuestos aislados de rodofitas descritos previamente
(Khan et al., 2008; Chatter et al., 2011; Coura et al., 2012). Lo anterior, permite
establecer a O. californica como una nueva fuente de metabolitos secundarios con
actividad antiinflamatoria; ya que no se tenía precedente de actividad antiinflamatoria
para ningún extracto o fracción de organismos pertenecientes a este género ni familias
cercanas.
El descubrimiento de fármacos sigue siendo un reto científico y de desarrollo, así como
una necesidad de primer orden, con una labor intensa y extensa al tratar de combatir
los padecimientos y las consecuencias que repercuten en la sociedad. Para alcanzar
este objetivo es necesaria la aportación de grupos de trabajo con una formación sólida
e interdisciplinaria.
40
El empleo de ensayos biológicos in vitro, hace posible en muchos casos y en poco
tiempo, el estudio de la actividad de centenares o millares de compuestos químicos.
Esta metodología de trabajo permite dejar para estadios más avanzados, es decir,
cuando ya se han seleccionado los productos denominados “cabezas de serie”, la
investigación con modelos in vivo. Lo anterior debido, básicamente a reducir costos y
tiempos, además de las múltiples consideraciones bioéticas (Messeguer, 2010).
Nuestros resultados aportan suficiente evidencia para continuar con el estudio en
busca de los compuestos responsables de la actividad antiinflamatoria mostrada por
los extractos algales, esto con el propósito de ofrecer fármacos alternativos a los ya
existentes. Sin embargo, todavía falta mucho recorrido para poder alcanzar ésta última
meta.
La etapa preclínica permite estudiar con detalle las transformaciones que experimenta
un posible fármaco en el organismo a causa de su metabolismo; aportando información
relacionada con el tiempo que el compuesto está en el organismo, los productos que
ofrece al metabolizarse, cómo se llega a eliminar, las consecuencias de posibles
efectos tóxicos de este proceso, entre otros (Messeguer, 2010).
La carrera de obstáculos que constituye el recorrido realizado por un grupo de
investigación, desde que surge una idea para atacar determinado padecimiento hasta
que el compuesto (fármaco) pueda estar a disposición del enfermo, puede alargarse
hasta 10 o 15 años con inversiones del orden de 600 a 800 millones de euros. El
elevado grado de exigencia, en términos de eficacia terapéutica y de seguridad
ejercido por las agencias gubernamentales al momento de autorizar un nuevo fármaco,
justifica en buena parte este periodo de tiempo y la cantidad de dinero necesaria para
superar las fases preclínicas y clínicas indispensables para obtener dicha autorización
(Messeguer, 2010).
41
9. CONCLUSIÓN
Se determinó que existen diferencias en la actividad antiinflamatoria presentada de
acuerdo al grupo de alga estudiado. Así, las algas verdes (Chlorophytas) mostraron
una menor actividad antiinflamatoria en comparación con los otros grupos, siendo las
algas rojas (Rhodophytas), las que muestran en mayor potencial antiinflamatorio.
El perfil fitoquímico de los extractos también mostró diferencias, indicando la presencia
de compuestos de tipo flavonoide para las algas pardas, mientras que para las algas
rojas los compuestos presentes son del tipo de las cumarinas, fenoles y se observa al
igual que en las algas pardas la presencia de flavonoides.
En la evaluación de la actividad antiinflamatoria in vitro e in vivo de los extractos crudos
de las algas rojas, destacaron los extractos diclorometanólicos de Gracilaria
vermiculophylla, Laurencia gardenrii y Opuntiella californica.
Las fracciones más polares de Laurencia gardenrii y Opuntiella californica
incrementaron la actividad antiinflamatoria respecto al extracto crudo. El perfil de
compuestos de estas fracciones determinó la presencia de una gran variedad de
metabolitos secundarios del tipo de los terpenos, flavonoides y alcaloides. Por lo que
se considera que este tipo de compuestos podría ser responsable del efecto
antiinflamatorio mostrado.
En este trabajo se establece el primer precedente de la actividad antiinflamatoria de
Opuntiella californica. De acuerdo a la notable actividad que presenta, se considera
una nueva fuente de metabolitos secundarios con potencial antiinflamatorio.
42
10. RECOMENDACIONES
Para futuros trabajos se recomienda evaluar los extractos y fracciones a diferentes
concentraciones. Así como incrementar el número de organismos empleado en el
ensayo in vivo con el fin de disminuir el margen de error. Se propone llevar a cabo un
análisis espectroscópico y cromatográfico para determinar un perfil de compuestos
más específico de los extractos y las fracciones que resulten activas. Aislar y purificar
el o los compuestos responsables de la actividad antiinflamatoria exhibida por los
extractos y fracciones. Incrementar la batería de ensayos in vitro que permitan evaluar
otros mecanismos de acción de los compuestos con actividad antiinflamatoria.
43
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