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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES
SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DEL CAFÉ DURANTE SU
PROCESO DE FERMENTACIÓN SECA
MARIA DEL MAR ENCISO MOLANO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2019
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES
SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DEL CAFÉ DURANTE SU
PROCESO DE FERMENTACIÓN SECA.
MARIA DEL MAR ENCISO MOLANO
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de
Microbióloga Industrial
Director de investigación
ANDREA JULIANA MANTILLA PAREDES
Codirector de investigación
BAYRON ENRIQUE AGUALIMPIA VALDERRAMA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, COLOMBIA
2019
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DEDICATORIA
Sin duda alguna este trabajo va especialmente dedicado a mi hijo, Lorenzo. Tu llegada a mi vida
solo ha dado fuerza a cada paso que doy, esto es por ti y para ti. Espero que cada logro que
consiga en mi vida lo sientas como tuyo.
A mis padres Gloria y Guillermo, por ser mi apoyo incondicional durante toda mi vida, son la
muestra de amor y dedicación verdadera, nada de lo alcanzado en mi vida sería posible sin
ustedes.
A mi compañero de vida, Ariel, por acompañarme en cada paso del camino que decidimos
recorrer juntos, solo puedo agradecer por el apoyo y amor que me entregas cada día.
A Dios, por hacer de cada momento el adecuado para todo lo vivido, por ser guía y luz en cada
etapa de mi vida.
En memoria del Doctor Jorge Luis Grosso Vargas (Q.E.P.D), quien creyó en mí y me dio el
valioso regalo del amor a la ciencia, gracias porque en tan corto paso me educó para la vida. Su
dedicación y entrega jamás serán olvidadas.
5
AGRADECIMIENTOS
Agradezco especialmente a los maestros que dirigieron el presente proyecto. Byron Agualimpia
y Andrea Mantilla, por su acompañamiento, asesoría y confianza. A ustedes les debo la
oportunidad de desarrollar todas mis competencias para ser una profesional excelente.
A todos los docentes que durante estos años aportaron con su conocimiento para convertirme en
una profesional integral, desarrollando al máximo mis habilidades.
A la Hacienda el Roble, especialmente al ingeniero José María, por su disponibilidad y ayuda
para el correcto desarrollo de este trabajo.
A mi familia, a ustedes gracias por ser mi fuerza en los momentos más difíciles y por su orgullo
en mis momentos de triunfos.
A mis compañeros, especialmente a Nathalia, Daniela R, Alejandra, Julián, Marithza gracias por
su apoyo durante estos años de estudio y formación profesional
A Sharon, Carolina, Ana y Daniela D, a ustedes les agradezco por brindarme una amistad sincera
e incondicional, siempre tuvieron palabras de aliento para mí.
6
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 13
2. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................................... 15
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................ 17
4. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................... 18
5. MARCO TEORICO ....................................................................................................................... 19
5.1. Generalidades del café ............................................................................................................ 19
5.2. Coffea arabica L ...................................................................................................................... 19
5.3. Variedad Caturra .................................................................................................................... 20
5.4. Composición del fruto ............................................................................................................. 21
5.5. Composición del mucilago ...................................................................................................... 23
5.6. Beneficio del café ..................................................................................................................... 23
5.7. Fermentación del café ............................................................................................................. 24
5.8. Microorganismos asociados a la fermentación del café ........................................................ 25
5.9. Calidad del café ....................................................................................................................... 26
5.10. Cafés especiales ................................................................................................................... 27
6. MARCO REFERENCIAL ............................................................................................................. 28
7. HIPÓTESIS ..................................................................................................................................... 30
7.1. Nula (Ho) ................................................................................................................................. 30
7.2. Alterna (Hi) ............................................................................................................................. 30
8. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 31
8.1. Objetivo general ...................................................................................................................... 31
8.2. Objetivos específicos ............................................................................................................... 31
9. METODOLOGÍA ........................................................................................................................... 32
9.1. Tipo de estudio ubicación ....................................................................................................... 32
9.2. Población y muestra ................................................................................................................ 32
9.3. Microorganismos utilizados como cultivos iniciadores ........................................................ 32
9.3.1. Determinación de la presencia de Leuconostoc mesenteroides ..................................... 33
9.3.2. Recuperación microorganismo conservado ................................................................... 34
9.4. Comportamiento cinético de los microorganismos ............................................................... 34
7
9.5. Pruebas de compatibilidad entre los microorganismos ........................................................ 34
9.7. Recolección del café despulpado ............................................................................................ 35
9.8. Fermentación seca del café ..................................................................................................... 35
9.9. Beneficio del café ..................................................................................................................... 36
9.10. Análisis sensorial del café ................................................................................................... 36
10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................. 38
10.1. Determinación presencia de Leuconostoc mesenteroides .................................................. 38
10.2. Comportamiento cinético de los microorganismos ........................................................... 40
10.3. Pruebas de compatibilidad entre los microorganismos .................................................... 45
10.4. Fermentación seca del café ................................................................................................. 46
10.5. Análisis sensorial del café ................................................................................................... 50
11. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 62
12. RECOMENDACIONES ............................................................................................................. 63
13. BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................... 64
14. ANEXOS ...................................................................................................................................... 69
8
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Caracterización de los estados de maduración del fruto de café (Coffea arabica). (Ramírez, 2016)
.................................................................................................................................................................. 23
Tabla 2 Comparación características bioquímicas reportadas en literatura para L. mesenteroides con el
aislado LM-3............................................................................................................................................. 39
Tabla 3 Parámetros cinéticos de Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides durante 24 horas
en medio MRS. ......................................................................................................................................... 44
Tabla 4 Resultados pruebas de antagonismo ............................................................................................ 45
Tabla 5 Parámetros cinéticos de las fermentaciones de los tratamientos durante 24 horas en el mucilago
de café a una temperatura promedio de 11.3°C. ........................................................................................ 49
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Composición del fruto del café (Adaptado de Federación Nacional de Cafeteros de Colombia,
2010) ......................................................................................................................................................... 22
Figura 2 Proceso del beneficio del café por vía húmeda y seca. (Tomado de Puerta, 2000) .................... 24
Figura 3 Segmentos en los que se divide los cafés especiales (Tomado de Arcila, 2007) ........................ 27
Figura 4 Aislado LM-3, colonia presuntiva Leuconostoc mesenteroides, formación de goma. ............... 38
Figura 5 Cinética de Lactobacillus plantarum en medio MRS y comportamiento de pH durante 24 horas.
.................................................................................................................................................................. 40
Figura 6 Cinética de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides durante 24 horas. ................................ 42
Figura 7 Fermentación seca del café de los diferentes tratamientos durante 24 horas. ............................. 46
Figura 8 Puntajes establecidos en la evaluación sensorial de los diferentes tratamientos para las
características aroma, fragancia y cuerpo según los parámetros establecidos por la SCA. ........................ 50
Figura 9 Puntajes establecidos en la evaluación sensorial de los diferentes tratamientos para las
características acidez, dulzor y residual según los parámetros establecidos por la SCA. .......................... 52
Figura 10 Análisis de variabilidad de las réplicas por tratamiento para cada característica evaluada. ..... 55
Figura 11 Puntajes totales establecidos en la clasificación sensorial de los diferentes tratamientos según
los parámetros establecidos por la SCA. ................................................................................................... 57
Figura 12 Análisis de comportamiento de las réplicas por tratamiento según puntaje global .................. 59
Figura 13 Clasificación de los promedios de las puntaciones globales obtenidas para cada tratamiento
según la SCA. ........................................................................................................................................... 61
10
RESUMEN
TÍTULO: EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE CULTIVOS
INICIADORES SOBRE LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DEL CAFÉ
DURANTE SU PROCESO DE FERMENTACIÓN SECA.
AUTOR: Maria del Mar Enciso Molano
PALABRAS CLAVE: Fermentación seca, cultivos iniciadores, Leuconostoc mesenteroides,
Lactobacillus plantarum, Características organolépticas
DESCRIPCIÓN
Mediante diferentes procesos bioquímicos, enzimas producidas por microorganismos propios del
café degradan los azucares, lípidos y proteínas del mucílago, esto es conocido como fermentación
natural; en este proceso estos compuestos son convertidos a alcoholes, ácidos, ésteres y cetonas
los cuales cambian las características organolépticas de la taza final. Por lo anterior, el presente
estudio pretendió evaluar los efectos de los cultivos iniciadores sobre las características
organolépticas del café (Coffea arábica) durante el proceso de fermentación seca bajo condiciones
ambientales controladas.
Para ello, se determinaron los parámetros cinéticos de crecimiento tanto en medio sintético como
en fermentación, obteniendo tiempos de generación para Lactobacillus plantarum de 4.07horas
(MRS) y 20.16h (Fermentación) y para Leuconostoc mesenteroides de 4.33h (MRS) y 20.86h
(Fermentación). Posteriormente, mediante un análisis sensorial se determinaron los perfiles de taza
para cada uno de los cultivos iniciadores y las diferentes horas de seguimiento.
Finalmente, correlacionar la inoculación de los cultivos iniciadores con las características
organolépticas finales en taza, en donde se determinó que el tratamiento de Leuconostoc
mesenteroides de la hora 24, obtuvo un puntaje superior, 84.8, con características sobresalientes,
lo que lo clasifica como un café de calidad de excelente, con notas finales en taza cítricas, florales
y dulces perfectamente balanceadas. Con lo anterior se llegó a la conclusión de que la inoculación
de cultivos iniciadores en la fermentación seca del café varía las características finales de taza.
11
ABSTRACT
TITLE: EVALUATION OF THE EFFECT OF THE INOCULATION OF STARTER
CULTURES ON THE ORGANOLÉPTIC CHARACTERISTICS OF THE COFFEE DURING
ITS PROCESS OF DRY FERMENTATION.
AUTHOR: Maria del Mar Enciso Molano
KEYWORDS: Dry fermentation, Starter cultures, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus
plantarum, Organoleptic characteristics.
Using different biochemical processes, enzymes produced by own coffee microorganisms
degrade the sugars, lipids and proteins of the mucilage, this is known as natural fermentation, in
this process they are compounds converted to alcohols, acids, esters and ketones which change
the organoleptic characteristics of the final cup. Therefore, the present study evaluated the effects
of starter cultures on the organoleptic characteristics of coffee (Coffea arabica) during the
fermentation process.
For this, the kinetic parameters were determined both in the synthetic medium and in the
fermentation, to obtain generation times for Lactobacillus plantarum of 4.07 hours (MRS) and
20.16h (Fermentation) and for Leuconostoc mesenteroides of 4.33h (MRS) and 20.86h
(Fermentation)). Subsequently, by means of a sensory analysis, cup profiles were determined for
each of the activity crops and the different monitoring hours.
To finally correlate the inoculation of the starter cultures with the final organoleptic
characteristics in the cup, where the treatment of Leuconostoc mesenteroides was determined at
24 o'clock, it obtained a superior score, 84.8, with outstanding characteristics, which qualifies as
a quality coffee excellent, with final notes in citrus, floral and sweet perfectly balanced cup. With
12
the above, it was concluded that the inoculation of the starter cultures in the dry fermentation of
the coffee the final characteristics of the cup.
13
1. INTRODUCCIÓN
La remoción del mucílago o fermentación natural se considera una de las etapas de mayor
cuidado del proceso de producción de café, por lo cual se ha venido controlando en factores
como tiempo y temperatura, pero no se ha estudiado a fondo el papel de los microorganismos en
la remoción del mucilago, puesto que en última medida son ellos los encargados de transformar
los azúcares y compuestos pécticos en ácidos orgánicos y alcoholes y estos se presumen
responsables de las variaciones en las notas distintivas en taza, otorgando atributos o defectos.
(Peñuela et al., 2010)
En búsqueda de mejorar la calidad del café, se ha hecho evidente la necesidad de realizar
cambios a muchos de los procesos de producción, es decir, cambiar lo que tradicionalmente se
venía llevando a cabo e implementar nuevas medidas como sería la posibilidad de incluir
microorganismos especialmente organizados para aportar características organolépticas finales a
la taza como son la fragancia, acidez, aroma, dulzor, sabor residual.
Mediante técnicas moleculares Ochoa (2017) confirmó la predominancia de Leuconostoc
mesenteroides y Lactobacillus plantarum durante la fermentación seca del café y su presencia ha
sido relacionada con las características organolépticas finales de taza, es decir que existe
incidencia en la calidad del café con su abundancia en el medio. Esto sumado a las pocas
investigaciones sobre este tema puntual en la región hacen que el presente estudio cobre
relevancia y tenga como propósito contribuir con una valoración de cómo la bioaumentación de
microorganismos varía los perfiles del sabor en la taza final en el café producido por la Hacienda
14
El Roble, dándole una alternativa en la obtención de un producto con calidad sobresaliente y
mejores competencias en el mercado cafetero.
15
2. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA
Uno de los pilares de la economía de Colombia y de la mayoría de los países tropicales de
América Latina es la caficultura (Quintero y Rosales, 2014). Según las más recientes
publicaciones de la Federación Nacional de Cafeteros se afirma que, a pesar de ocupar el tercer
lugar en el sector económico del país, el aumento en el ingreso del sector cafetero es de 43pb
sobre el PIB esto implica que alrededor del 56% del crecimiento del PIB corresponde al café
producido y comercializado. (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 2018)
Actualmente, el mercado internacional del café se ha tornado cada vez más exigente. No
solamente se requiere cumplir con la alta demanda de producto, sino que también se espera que
éste sea de la mejor calidad, lo que ha motivado a los caficultores a incursionar en la mejora de
cultivos para tener granos con las características deseadas en el comercio cafetero. Es de esta
manera que Colombia ha logrado tener una participación del 35% en exportaciones de cafés
especiales en el mundo, posicionándolo como uno de los mejores. (Cárdenas, 2000)
La primera marca colombiana de café especial y orgánico es producida por la Hacienda El Roble
ubicada en el municipio de La Mesa de los Santos, y se caracteriza por notas particulares de
acidez y suavidad. Esto le permitió al Café Mesa de los Santos no solo posicionarse sino
mantenerse en el mercado nacional e internacional, al punto de exportar el 95% de la producción
total a varios países de Europa, Estados Unidos y Japón. Según Vera (2017), los genes
encargados de la degradación de ciertos aminoácidos, así como en la presencia de ciertos
microorganismos y su función metabólica son los responsables de los aspectos diferenciales en el
aroma y sabor característicos de este café.
16
En la búsqueda de sabores específicos de origen natural, para lograr dar un valor agregado a la
marca, se hace necesario realizar investigaciones en la influencia que pueden tener la adición
microorganismos identificados en el grano producido por la hacienda en el proceso de
fermentación seca del café sobre sus notas finales de taza, lo que a futuro puede llegar a perfilar
este café como un líder en el mercado, mediante la formulación de cultivos iniciadores.
17
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Qué efecto tiene la inoculación de cultivos iniciadores sobre las características organolépticas
del café durante el proceso de fermentación seca?
18
4. JUSTIFICACIÓN
Se presume que el proceso de la fermentación del café tiene efecto directo sobre la calidad final
del mismo, esto al parecer debido a las muchas comunidades microbianas que intervienen en la
transformación del grano, donde las bacterias ácido-lácticas y las levaduras las protagonistas en
este proceso biológico, siendo estas las encargadas de dar características particulares al sabor al
final de todo el proceso de beneficio. (Puerta, 2015).
Al establecer perfiles característicos para los microorganismos (Leuconostoc mesenteroides y
Lactobacillus plantarum), es posible fijar los parámetros de inoculación de estos como cultivos
iniciadores, dándole la capacidad al caficultor de controlar y predecir los resultados del productor
y así evitar granos con condiciones no aptas para comercializarse y en última medida tener
pérdidas económicas.
Los resultados de esta investigación pueden ofrecer mejoras o cambios novedosos en busca de la
optimización de diferentes procesos en la Hacienda El Roble, para así conseguir cafés con
atributos diferenciados, lo que a futuro puede además de ser el inicio de investigaciones futuras a
gran escala, la posible apertura a nuevos mercados mediante el uso de la biotecnología industrial.
19
5. MARCO TEORICO
5.1. Generalidades del café
El café es el segundo producto comercializado a nivel mundial después del petróleo, esto
demuestra su importancia no solo cultural si no económica. (Ramírez, 2016) Según el reporte de
la ANIF para el final del 2018 se obtuvo un incremento en las cifras de producción y consumo
con respecto al año inmediatamente anterior, 5.7% y 1.8% respectivamente.
Este grano procede de un árbol llamado cafeto, su origen se remonta a Asia Oriental,
específicamente a un territorio llamado “Kaffa”, actualmente Etiopia. En la edad media el fruto
de este árbol era una semilla aromática que fue llevada por marineros africanos hasta arabia,
donde finalmente fue cultivada y consumida como se hace en la actualidad, centrando su mayor
producción en Brasil, seguida por Vietnam y Colombia, lo cual demuestra cómo ha migrado el
cultivo y se ha posicionado en diversos territorios del mundo. (Invitado, 2005).
Taxonómicamente clasificado en la familia Rubiaceae y al género Coffea, se destacan dos
especies Coffea arabica Linneo y C. canephora Pierre ex Froehner por su protagonismo
económico, conocidas coloquialmente en el mercado como cafés arábicos y robustas. (Puerta,
2010).
5.2. Coffea arabica L
Esta especie de café fue descrita por Linneo en 1953, por su origen, Arabia, recibiendo su
nombre Coffea arabica L. Morfológicamente se caracteriza porque alcanza una altura de hasta
10 metros si se deja crecer libremente, sin embargo, bajo podas constantes en plantaciones se
mantiene entre 2 - 2,5 metros, esto facilita la recolección de frutos. Las hojas varían en su forma
de ovaladas a elípticas, con un ancho de alrededor de 6 cm y un largo entre 12 – 15 cm. Las
20
flores brotan alrededor del tercer año de vida del cafeto, se caracterizan por tonos de blanco a
crema y aromas dulces, tras su marchitez, los ovarios se convierten en drupas de forma ovalada,
que serán los futuros frutos o granos de café. (Temis et al., 2011)
En Colombia particularmente, solo se han desarrollado especies de Coffea arabica L, variando
con el paso de los años, adaptándose a las necesidades y la optimización del cultivo como tal.
(Vera, 2017). Hacia 1810, cuando inició como tal la producción a nivel comercial del café en el
país, predominaron variedades de porte alto (variedad Típica) durante un largo periodo, donde
variedades como Borbón rojo y amarillo intentaron tomar protagonismo sin éxito. Fue hasta
1990 que se posicionó la variedad Colombia, por su resistencia a la Roya, lo cual era de los
factores más buscados en los caficultores nacionales. Recientemente variedades como Tabi y
Castillo están siendo sembrados según la finalidad que el caficultor requiera, en cuanto a
resistencia a plagas, altura del cultivo y características del fruto. (Arcila et al, 2007)
5.3. Variedad Caturra
El café de variedad Caturra fue descubierto entre 1915 y 1918 en Minas Gerais (Brasil) como
una mutación del café derivada de la variedad Borbón, debido a sus entrenudos cortos en tallo y
ramas se caracteriza por su porte bajo y aspecto compacto. Su siembra en Colombia inició
alrededor de 1952 con resultados muy positivos por su alto rango de adaptabilidad y producción,
esto fue hasta 1983 cuando la roya del café (Hemileia vastatrix) ataco esta variedad,
demostrando su susceptibilidad al hongo. Esto impulsó a nuevos cruces logrando tener hoy en
día variedades resistentes a la roya como la Colombia o Castillo. (Arcila et al, 2007).
Este tipo cafeto en condiciones de libre crecimiento durante el primer año produce ramas y entre
los seis y ocho años alcanza su máxima producción, este arbusto, continua con su ciclo de vida
21
alcanzando hasta veinticinco años, dándole condiciones apropiadas al sistema de cultivo, sin
embargo, con niveles productivos mucho menores. Alrededor de treinta y dos semanas separan la
floración de la maduración del fruto, proceso que dura en promedio entre doscientos veinte a
doscientos cuarenta días, dependiendo exclusivamente de las condiciones del cultivo. (Arcila et
al., 2007)
5.4. Composición del fruto
En la madurez el fruto de café, es una drupa (Figura 1), en la cual los tejidos externos son
separados por una capa mucilaginosa (pergamino) del endocarpio. La cereza madura está
formada por el exocarpio o epidermis, que en base húmeda representa el 43,2% del fruto total.
En la epidermis se va a dar el color característico que tendrá el fruto según corresponda tanto a
su variedad como al grado de madurez en el que se encuentre, y puede darse desde tonos verdes
o amarillos hasta rojo y en otras ocasiones no muy frecuentes violeta o negro. El mesocarpio se
encuentra recubierto por la epidermis, este constituye un tejido esponjoso y grueso de 5mm de
espesor generalmente, rico en azucares y mucilagos, que a su vez recubren los dos granos, unidos
por sus caras planas. Una doble membrana revierte los granos, la primera de tonalidad amarilla
pálida es el endocarpio o también conocido como pergamino, este representa el 6,1% del fruto en
base húmeda. La segunda está adherida al grano como tal y es mucho más fina se denomina
tegumento seminal o película plateada, representando únicamente el 0,2% del fruto en base
húmeda. Finalmente, el endospermo o café verde representa entre el 38,9% del fruto en base
húmeda y el 55,4% en base seca. (Arcila et al, 2007)
22
Figura 1 Composición del fruto del café (Adaptado de Federación Nacional de Cafeteros de
Colombia, 2010)
En la maduración del fruto del café se encuentran ocho estados (Tabla 1), donde se determinan
cuatro tipos de cerezas según sus tonalidades y estas a su vez, se relacionan estrechamente con la
calidad final de la taza. Los frutos verdes aparecen entre los 182 y 203 días después de la
floración (ddf), posee beneficios pobres, por tanto, los resultados en la calidad de la bebida y el
rendimiento es bajo, los frutos en estado pintón (a partir de los 210 ddf), poseen beneficios,
calidad de taza y rendimiento de bajo a aceptable y los frutos maduros y sobremaduros entre los
días 217 y 224 ddf, cuentan con condiciones óptimas de beneficio y alta calidad de taza. El
rendimiento es alto para los frutos maduros y bajo para los sobremaduros debido a la alta
incidencia de broca. A partir de los 231 ddf se observan los frutos secos, estos se caracterizan por
defectos como almendra pelada y abrasiones típicas en los granos lo que representa bajos
rendimientos en todos los aspectos. (Marín et al., 2003).
23
Tabla 1 Caracterización de los estados de maduración del fruto de café (Coffea arabica).
(Ramírez, 2016)
5.5. Composición del mucilago
Según Puerta y Ríos (2011) el mucilago se genera de forma discontinua y en cantidades que
dependen de diversos factores como la variedad de café, la zona donde se encuentre el cultivo y
el estado de la cereza. Aproximadamente el 11,8% del fruto en base húmeda corresponde al
mucilago, esta capa del fruto del café está compuesto por un coloide compuesto principalmente
de elementos como el potasio, calcio, fosforo, azufre y trazas de manganeso, hierro y cobre
además de aproximadamente 84,2% de agua, 8,9% de proteínas, 4,1% de azúcar, 0,91% de
sustancias pécticas y 0,7% de cenizas. (Puerta, 2010)
5.6. Beneficio del café
El tratamiento postcosecha es tan importante como la época de cultivo del cafeto, todo este
proceso se conoce como beneficio del café (Figura 2), el cual tiene como propósito transformar
el grano de café cereza a pergamino seco, mediante la separación de las partes del fruto. El
beneficio puede llevarse a cabo por vía seca o húmeda, en el método seco como su nombre lo
indica, no se agrega agua en el proceso, obteniendo gran cuerpo y notas amargas muy marcadas,
24
por otro lado, el método húmedo, se agrega agua, alrededor de un 50% del peso del café, en
donde se obtienen notas suaves. (Puerta, 2000)
En Colombia es utilizado este último, siendo la remoción del mucilago el único que varía entre
los cultivadores, esta puede ser mecánica o por medio de fermentación, esta también puede
hacerse por vía seca o húmeda y se caracteriza por su estrecha relación con los sabores finales de
taza. (Arcila et al, 2007)
Figura 2 Proceso del beneficio del café por vía húmeda y seca. (Tomado de Puerta, 2000)
5.7. Fermentación del café
Durante todo el proceso de beneficio se debe tener mucho cuidado ya que se pueden tener hasta
veinticinco defectos en todo el proceso, por ejemplo, stinker, fenólicos o incluso mohosos que
25
hasta el momento no se conoce ningún método para revertir dichos errores, es decir, no es
posible recuperar el grano de café ya beneficiado. (Puerta, 2000)
La fermentación de café como la de otros alimentos se basa en una reacción catabólica donde
microorganismos se encargan de transformar los azucares y demás nutrientes presentes en el
mucilago que se encuentra en el grano despulpado o café en baba, produciendo principalmente
ácidos y en menor cantidad otros compuestos como alcoholes y sustancias volátiles. (Puerta,
2010)
La mezcla entre estos compuestos y los microorganismos que predominen en la fermentación,
determinan la calidad que tendrá el grano de café tipo almendra al final de todo su proceso de
beneficio. (Puerta, 2015)
Adicional a lo anterior, el proceso de fermentación se fija por cada caficultor y por tanto no
cuenta con un tiempo estándar, ya que tanto las condiciones del cultivo, como las del tanque
donde se realiza el proceso, son diferentes, en otras palabras, dependiendo de variables como
capacidad, temperatura, aireación, humedad, entre otras, se consigue un tiempo óptimo para
obtener un café con un sabor agradable al consumidor. (Puerta, 2012)
5.8. Microorganismos asociados a la fermentación del café
En el café despulpado se tienen diversos microorganismos, en fermentación húmeda (50% agua)
se encuentran en una cantidad entre 1,5 y 4,9 millones por cada mililitro de mucilago, en una
seca o de sustrato sólido, la cantidad aumenta pues es posible encontrar entre 5 a 9 millones.
(Puerta, 2010)
En la etapa de fermentación del café, es común encontrar levaduras como Saccharomyces
cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus terreus, Rhodotorula rubra, bacterias ácido lácticas
26
como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Leuconostoc messenteroides,
bacterias anaerobias facultativas como Enterobacter sp, Enterobacter agglomerans, Erwinia Sp,
bacterias aerobias como Staphylococcus, actinobacterias como Streptomyces sp y bacterias
anaerobias facultativas como Clostridium butyricum y hongos de los géneros Trichoderma y
Alternaria. (Ramírez, 2016)
Se presume que, debido a la drástica disminución del pH en medio del proceso, donde alcanza
valores entre 3,5 y 4,0 es inhibido el crecimiento de ciertos microorganismos y favorece el
desarrollo de levaduras y bacterias ácido-lácticas (Puerta, 2010)
Según Puerta 2011, durante la fermentación de mucilago de cafés seleccionados, las bacterias del
género Enterobacter tiende a disminuir al punto de no ser detectadas después de la hora veinte.
Comportamiento contrario al que tiene el género Lactobacillus y las levaduras del género
Saccharomyces que desde las horas iniciales tienen un crecimiento constante hasta lograr ser
predominantes.
5.9. Calidad del café
La calidad de los alimentos generalmente se ha basado en su valor nutricional, sin embargo, en
casos como el café ésta se mide por sus características sensoriales. El sabor particular del café es
aportado por más de cuatrocientos compuestos orgánicos e inorgánicos mientras que su olor se
da por acetonas, aldehídos y ésteres en su mayoría. (Puerta, 2012)
El análisis sensorial es entonces la manera más adecuada hasta el momento de evaluar la calidad
del café, no solo en taza si no en grano; esto se hace por medio de paneles de catación, en donde
los participantes han entrenado sus sentidos para así emitir un juicio valorativo sobre el producto.
(Puerta, 2012)
27
En Colombia se tiene cafés con calidad alta, se considera uno de los mejores cafés arábigos
producidos en el mundo, esto influenciado por diversos factores, como genética, tipo de suelos,
clima y en especial la forma en que es beneficiado. Como se menciona en el numeral 2.6, el
beneficio utilizado en Colombia es por vía húmeda teniendo como resultados cafés denominados
suaves lavados, amargor y cuerpo moderado y acidez y aroma pronunciado. En cafés procesados
por vía seca, como en Brasil, se obtiene amargor y cuerpo pronunciado y acidez moderada.
(Puerta et al., 2012)
Los compuestos pécticos y azucares presentes en el mucilago que recubre el grano, son
fermentados naturalmente principalmente por bacterias y levaduras que los transforman en
alcoholes y diferentes ácidos, estos son los responsables de los sabores finales en taza.
(Evangelista et al., 2014)
5.10. Cafés especiales
La Asociación de cafés especiales, SCA siglas por su nombre en inglés, Specialty Coffee
Association, fue creada en el año 1982, y es la autoridad en cuanto a los cafés especiales a nivel
mundial. Dicha organización definió un café especial como “un café de buena preparación, de un
origen único y sabor distintivo”, y se dividen en cinco segmentos (Figura 3). (SCA, 2013)
Figura 3 Segmentos en los que se divide los cafés especiales (Tomado de Arcila et al.,
2007)
28
6. MARCO REFERENCIAL
El café colombiano actualmente ha ganado reconocimiento en el mercado mundial por sus
atributos de calidad superiores a los comercializados por otras potencias cafeteras, lo que
Cárdenas y Pardo (2014) atribuyen al proceso de fermentación realizado en el país y a la
naturaleza de las condiciones del territorio como son las temperaturas de crecimiento óptimas
para el cultivo y suelos con sustratos ricos y abundantes que permiten asociaciones microbianas
únicas.
En el 2016, Ramírez, estudio la dinámica poblacional de los microorganismos en fermentación
seca del café, proveniente de la Hacienda El Roble, en condiciones variadas de temperaturas
(fermentación natural con un promedio de temperatura de 25°C y fermentación prototipo
temperatura promedio de 11°C), donde encontró que las variaciones de temperatura entre la
fermentación natural y el prototipo afectaron en mayor medida a los microorganismos mesófilos,
mientras que las comunidades de las bacterias ácido-lácticas (BAL) tuvieron mayores recuentos
en la fermentación prototipo, no exactamente por la temperatura sino debido al ambiente
microaerófilo, y finalmente los hongos filamentosos fueron los que obtuvieron los menores
registros, esto debido a que sus tiempos de crecimiento superan las 24 horas de seguimiento
realizadas en el estudio.
A partir de lo concluido por Ramírez (2016), se realizó un análisis metagenómico funcional de
las comunidades microbiana involucradas en la fermentación seca del café, por Vera (2017) el
cual además de ser el primer estudio de este tipo, se determinó que los perfiles funcionales
tuvieron cambios apreciables al variar la temperatura de fermentación, específicamente todos los
procesos asociados al metabolismos de los carbohidratos. Esto se relacionó con los resultados de
29
un análisis sensorial donde se concluyó la importancia de los microorganismos y los atributos en
su sabor.
Los anteriores proyectos estaban correlacionados con la investigación desarrollada por Ochoa en
el 2017 titulada “Estudio del efecto de la temperatura sobre la diversidad microbiana asociada al
proceso de la fermentación seca del café” en donde mediante la técnica Shotgun (Full Genome
Shotgun Sequencing) se evaluaron los diferentes perfiles taxonómicos de las comunidades
predominantes en el proceso determinando que la temperatura tuvo efecto de estimulación en el
crecimiento de las comunidades de Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides, lo
que lo llevó a recomendar estos microorganismos como cultivos iniciadores para el proceso de
fermentación seca del café y así alcanzar características organolépticas deseadas.
Evangelista et al.,(2014) empleó cultivos iniciadores en el proceso de fermentación semiseca del
café, usando levaduras : Saccharomyces cerevisiae UFLA YCN727, Saccharomyces cerevisiae
UFLA YCN724, Candida parapsilosis UFLA YCN448 y Pichia guilliermondii UFLA YCN731.
Por medio de HPLC and HS-SPME/GC fueron cuantificados los ácidos orgánicos y compuestos
volátiles respectivamente, determinando que los cafés inoculados con los cultivos iniciadores
obtuvieron notas distintivas a caramelo, sabor no identificado en los controles, afirmando la
viabilidad del uso de cultivos iniciadores para aumentar la calidad organoléptica del café.
Sabiendo que los microorganismos son en gran medida responsables por los sabores finales de
taza, el uso de cultivos iniciadores en el café actualmente es una alternativa predictiva de los
resultados a obtener. Por tal motivo deMelo et al., (2015) realizó una revisión con el objetivo de
aumentar el conocimiento y comprender la función de la inoculación de cultivos starter sobre la
ecología, bioquímica y biología molecular en el proceso de fermentación semiseca del café.
30
7. HIPÓTESIS
7.1. Nula (Ho)
La inoculación de cultivos iniciadores durante el proceso de fermentación seca no tiene efecto
sobre las características organolépticas del café.
7.2. Alterna (Hi)
La inoculación de cultivos iniciadores durante el proceso de fermentación seca tiene efecto sobre
las características organolépticas del café.
31
8. OBJETIVOS
8.1. Objetivo general
Evaluar el efecto de los cultivos iniciadores sobre las características organolépticas del café
(Coffea arabica) durante el proceso de fermentación seca bajo condiciones ambientales
controladas.
8.2. Objetivos específicos
Establecer la compatibilidad y comportamiento cinético de los microorganismos
seleccionados como cultivos iniciadores.
Determinar los perfiles de los análisis organolépticos del café bajo los diferentes cultivos
iniciadores.
Correlacionar el efecto de la inoculación de los cultivos iniciadores con las características
organolépticas finales de taza.
32
9. METODOLOGÍA
9.1. Tipo de estudio ubicación
El presente es un estudio descriptivo de corte transversal, debido a que la recolección de
información se realizó analizando variables en un periodo de tiempo determinado a lo largo de la
fermentación del café. Esta investigación se llevó a cabo en el laboratorio de Biología Molecular
y Genética de la Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias de la Universidad de
Santander, Bucaramanga y la hacienda El Roble, finca cafetera ubicada en el municipio de Los
Santos, Santander.
9.2. Población y muestra
Para la realización de este trabajo se utilizaron frutos de café de la especie Coffea arábica L,
variedad Caturra. Este café fue cultivado bajo sombra en la hacienda cafetera El Roble ubicada
en el Municipio de Los Santos, en el Departamento de Santander (06.8628260°, -073.0450050°),
a una altura de 1500 m.s.n.m., con una temperatura promedio de 15 ºC a 18 ºC durante el día y
en las noches la temperatura puede descender hasta los 12 ºC. El tamaño de la población
consistió en aproximadamente 13 toneladas de café cereza que posteriormente fue despulpado
mecánicamente mediante el uso de despulpadora vertical industrial (Modelo UDT4 Penagos,
Hermanos), donde resultaron aproximadamente 6 toneladas de grano despulpado y a partir de
este se tomaron aleatoriamente 12 kilogramos con los cuales se conformaron 32 muestras.
9.3. Microorganismos utilizados como cultivos iniciadores
Los aislados microbiano que se utilizaron como cultivos iniciadores para fermentación seca del
café, fueron Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides; estos fueron seleccionados
según estudios previos realizados en la Universidad de Santander UDES, por el grupo de
33
investigación CIBAS. Es importante aclarar que Lactobacillus plantarum se encuentra
conservado en el laboratorio de biotecnología de la UDES, mientras que Leuconostoc
mesenteroides se caracterizó a partir del mucilago del café del presente estudio.
Según Evangelista et al., 2014, los microorganismos mencionados anteriormente producen tazas
de alta calidad, con aromas y notas finales acarameladas, herbales o frutales.
9.3.1. Determinación de la presencia de Leuconostoc mesenteroides
Se pesaron 10 gr de mucílago del café despulpado y se agregaron a 90 mL de agua peptona
estéril (g/L: 1 peptona bacteriológica) mezclando durante 15 minutos; a partir de esta solución se
realizaron diluciones seriadas hasta 10-5 con agua peptona estéril, y se realizó siembra por
agotamiento en agar MRS (g/L: 10 proteosa peptona; 8 extracto de carne; 4 extracto de levadura;
20 glucosa; 5 acetato de sodio; 2 citrato de triamonio; 0.2 sulfato de magnesio; 0.05 sulfato de
manganeso; 2 fosfato dipotásico; 1 polisorbato 80; 15 agar. Scharlau) suplementado con 0,01%
de cicloheximida (Zamudio, 2005) estéril y 10 mL/L de solución stock azul de anilina como
indicador con el fin de diferenciar colonias de bacterias ácido-lácticas. Los medios de cultivo se
incubaron durante 24 horas a 30ºC en jarras de anaerobiosis utilizando un sobre de anaerobiosis
(AnaeroGenTM 3.5 L. Thermo scientific). Las colonias presuntivas fueron purificadas en el
mismo agar y posteriormente se caracterizaron macroscópicamente según criterios de forma,
borde, elevación, superficie, determinación de la actividad catalasa, microscópicamente
utilizando tinción de Gram y mediante pruebas bioquímicas (api 50 CHL).
Estas colonias se repicaron a agar MSE (g/L: 10 triptona; 2,5 gelatina; 5 extracto de levadura;
100 sacarosa; 5 glucosa; 1 citrato de sodio; 0,075 azida sódica; 15 agar) y fueron incubadas
34
durante 24 horas a 28°C en condiciones de microaerofilia, para verificar la formación de las
colonias con aspecto mucoide características del microorganismo.
9.3.2. Recuperación microorganismo conservado
Lactobacillus plantarum se encontraba conservado por congelación con glicerol al 25%. Fue
reactivado en caldo MRS (g/L: 10 proteosa peptona; 8 extracto de carne; 4 extracto de levadura;
20 glucosa; 5 acetato de sodio; 2 citrato de triamonio; 0.2 sulfato de magnesio; 0.05 sulfato de
manganeso; 2 fosfato dipotásico; 1 polisorbato 80) y cultivado durante 48h a 28°C. (Ramírez,
2016).
9.4. Comportamiento cinético de los microorganismos
Se tomaron de 5 a 10 colonias de cada microorganismo (Lactobacillus plantarum y Leuconostoc
mesenteroides) en 5mL de caldo MRS durante 24 horas a 30°C en agitación de 120 rpm.
Posteriormente a esto, los 5mL fueron transferidos a 45mL de caldo bajo las condiciones
descritas anteriormente. Transcurrido este paso, se tomaron 30mL de caldo y se transfirieron a un
último volumen de 270mL de caldo en las mismas condiciones que se han manejado durante
todo el proceso. La cinética fue desarrollada de forma destructiva para evitar posibles
contaminaciones, por lo tanto, se tomó una alícuota de 1mL y esta se transfirió finalmente a un
tubo que contenía 9 mL de medio, estos tubos fueron sometidos a agitación y temperatura
establecida en pasos anteriores. Se realizó seguimiento a las horas 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24
mediante densidad óptica, pH y recuento de viables hasta la hora 24. (Jurado et al., 2013)
9.5. Pruebas de compatibilidad entre los microorganismos
Se realizaron en agar MRS pruebas de antagonismo siguiendo la metodología propuesta por
Zafra et al (2017), en donde se indica: 10uL con una concentración de 6x107 UFC de cada
35
microorganismo (Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides) por siembra masiva en
superficie en el medio de cultivo, se dejó secar durante 15 minutos, seguido a esto se sembraron
gotas de 5uL con una concentración de 6 x106 UFC del otro microorganismo sobre la placa. Se
incubaron a 30°C durante 24 horas y se verificó su actividad.
9.6. Preparación cultivo iniciador
Se realizó el mismo proceso de bioaumentación utilizado en el numeral 5.8 hasta conseguir el
volumen final de 300mL de caldo MRS de cada uno de los microorganismos, estos se incubaron
en agitación a 150rpm y 30°C, hasta conseguir una concentración de 107 células/mL.
(Evangelista et al., 2014).
Finalmente, este preparado se llevó al 10% de volumen final (250mL) que se trabajó por pila de
café a fermentar, este se centrifugó y finalmente se resuspendió en 2mL de agua destilada estéril,
el cual fue aplicado al proceso de fermentación seca del café.
9.7. Recolección del café despulpado
Se recolectó el café despulpado de forma aleatoria de tal manera se conformó una muestra
compuesta de al rededor 2kg, para inmediatamente después conformar pilas de fermentación de
250g.
9.8. Fermentación seca del café
La fermentación seca del café se llevó a cabo en frascos schott de 500mL estériles. Se realizó por
duplicado para cada cultivo iniciador (Leuconostoc messenteroides, Lactobacillus plantarum), el
consorcio microbiano y para la fermentación bajo las condiciones usuales en la hacienda
(control).
36
La inoculación de los cultivos iniciadores se realizó al mismo tiempo para todos los
fermentadores y posteriormente fueron incubados a una temperatura promedio de 11°C.
Se tomaron muestras a la hora 0, 14, 18 y 24, de las cuales se hicieron mediciones de pH y
recuento de células viables por medio de siembra en superficie en agar MRS, durante 24 horas a
28°C. (Ramírez, 2016)
Las condiciones ambientales y las horas de seguimiento fueron establecidos según lo reportado
por Ochoa (2017), quien concluyo que estos parámetros otorgan mejores resultados a la calidad
del café.
9.9. Beneficio del café
Las muestras se lavaron y se secaron en las condiciones estipuladas dentro de sus procesos por
parte de la Hacienda El Roble, debidamente rotuladas para evitar mezcla entre las muestras.
9.10. Análisis sensorial del café
Esta se realizó según los estándares de calidad propuestos por la SCA. Después del tostado, el
café se molió inmediatamente antes de ser catado, de esta manera se evaluó la fragancia de las
diferentes muestras.
Para continuar con el proceso se pesaron 8,25g del café molido y se le adiciono 150mL de agua a
las tazas con una temperatura entre los 92,2°C y 94,4°C. En este punto contabilizaron 4 minutos,
tiempo que permite liberar aromas del café ya preparado, lo que se logró al romper la capa
superior que se forma en la taza.
Tras esto, se esperó alrededor de 15 minutos para que la temperatura de la taza descendiera hasta
al menos 75°C para iniciar el análisis del sabor de taza, el catador probó varias veces el café
37
mientras éste se enfrió de tal manera que se evaluaron los cambios del sabor asociados a la
temperatura y extracción. Los puntajes fueron anotados por cada uno de los asistentes a la cata y
finalmente fueron socializados.
38
10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10.1. Determinación presencia de Leuconostoc mesenteroides
Mediante la metodología planteada en el numeral 8.3.1, se hizo selección de cinco colonias
presuntivas que a través de características y criterios de evaluación propuestos por el sistema de
clasificación de bacterias. (Brenner et al., 2005) se determinó un único aislado como
Leuconostoc mesenteroides.
Figura 4 Aislado LM-3, colonia presuntiva Leuconostoc mesenteroides, formación de goma.
Estas características fueron similares a las halladas por Cuervo et al., (2010) quien identificó a
Leuconostoc mesenteroides. Entre otros aspectos se evaluó el crecimiento y producción de goma
(dextrano) en el medio MSE, como criterio determinante (figura 4). Este polisacárido de alto peso
molecular y estructura variable es producido por ciertas bacterias acido lácticas, entre ellas
Leuconostoc mesenteroides, que al tener disponible un exceso de sacarosa en el medio, activa la
enzima dextransacarasa, que se encarga de sintetizar los glucanos presentes por medio de una
polimerización enzimática. Este proceso se lleva a cabo por dos actividades propias de esta enzima:
39
actividad de transferencia, que consiste en transferir a la molécula aceptora (glucosa) los diversos
grupos glucosil sintetizando el polímero y la otra es la actividad hidrolítica, que genera una
molécula de fructosa libre por medio de hidrolisis del enlace glicosídico del sustrato (sacarosa).
(Flórez, 2014)
Tabla 2 Comparación características bioquímicas reportadas en literatura para L.
mesenteroides con el aislado LM-3
Pruebas
bioquímicas
L.mesenteroides AISLADO: LM-
3
Microscopia Cb Cb
Gram + +
Esporas - -
Capsula + +
Agrupación Ca Ca
Dextrana + +
Hidrolisis de
almidón D -
Arabinosa + +
Fructosa + +
Glucosa + +
Lactosa D +
Maltosa + +
Manitol D +
Sacarosa + +
Degradación
citrato
- -
Catalasa - -
Oxidasa - -
Movilidad - -
Indol - -
Reducción
de nitratos
- -
CRECIMIENTO EN:
Agar
nutritivo
- -
Agar MSE + +
15°C + +
30°C + +
40°C - +
40
+: Positivo; -: Negativo; D: débil; Ca: Cadenas
10.2. Comportamiento cinético de los microorganismos
En la Figura 5 se reporta el crecimiento de Lactobacillus plantarum durante 24 horas, donde se
ve un crecimiento que se ajusta a un comportamiento de tipo lineal, que se corrobora con un
R2=0,84 alcanzando un máximo de 3,9x109 ufc/mL, y que contrasta con un descenso en el pH
hasta de 3.82 durante el mismo periodo de tiempo.
Figura 5 Cinética de Lactobacillus plantarum en medio MRS y comportamiento de pH durante
24 horas.
Los anteriores resultados concuerdan con los reportes de Gupta et al (2010), Lactobacillus
plantarum presenta crecimiento exponencial desde la hora 9 hasta la 16. Sin embargo, en el caso
de estudio, el comportamiento muestra únicamente crecimiento lineal, concordante con fase de
adaptación prolongada del microorganismo, esto podría deberse a que la actividad metabólica de
microorganismo se pudo afectar durante su periodo de conservación, fenómeno evidenciado
y = 5E+08x - 2E+08R² = 0,8454
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0,0E+00
1,0E+09
2,0E+09
3,0E+09
4,0E+09
5,0E+09
0 1 2 4 6 8 10 12 24
pH
UFC
/mL
Tiempo en Horas
Comportamiento cinético de Lactobacillus plantarum
UFC/mL pH Lineal (UFC/mL)
41
previamente por Sarmiento et al (2013) en donde no solo afirma que genéticamente pueden
afectarse las cepas, también se pueden presentar variaciones en sus actividades metabólicas
iniciales.
Lo anterior puede explicar la actividad de pH, ya que bajo en previos reportes con condiciones
muy similares a las del presente estudio para realizar la cinética de crecimiento de Lactobacillus
plantarum, en donde alcanzó valores de pH hasta de 3.10 a las 24 horas, este descenso de pH
marcado es explicado por diversos autores debido a la producción de ácido láctico como
metabolito por el microorganismo, producción que no se visualizada en la cinética de la cepa de
Lactobacillus plantarum. (Jurado et al., 2013)
Los resultados obtenidos en la cinética registrada en la figura 5, no fueron los esperados, ya que
al desarrollarse en un medio comercial que posee sustratos más sencillos que los del mucilago de
café, se esperaba alcanzar un crecimiento de tipo exponencial, lo que demuestra un periodo de
latencia de algunas de las características metabólicas del microorganismo, porque aunque se
confirma la viabilidad del mismo al evidenciar el descenso de pH como resultado de la
producción de ácido láctico, se confirma la necesidad de sales de manganeso, fosfatos y
concentración adecuada de fuente de carbono como parámetros fundamentales en producción de
ácido láctico.
En la figura 6, se observa la curva de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides durante 24
horas, en donde nuevamente se observa como crecimiento un comportamiento lineal que alcanzó
un máximo de 3,6x109 ufc/mL y la actividad de pH que alcanzó un mínimo de 5.94.
42
Figura 6 Cinética de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides durante 24 horas.
Durante 24 horas de monitorear el crecimiento de Leuconostoc mesenteroides y el pH en el
medio MRS, es notorio el contraste con los resultados descritos por Rodríguez y Hanssen (2007),
que registraron la fase de adaptación hasta la hora 7 y la estacionaria inicia alrededor de la hora
14, dándole al microrganismo el periodo de tiempo restante como fase exponencial. En el caso de
estudio solo se observa fase de adaptación, es decir que no es posible si quiera percibir el inicio
de la fase exponencial hasta la hora 24 a partir de una concentración inicial de 107 ufc/mL,
último registro tomado.
La cepa evaluada es nativa del mucílago del café de la hacienda, por tanto, existe la posibilidad
de que su fase de adaptación se prolongara debido a que, a pesar de tener un sustrato más
sencillo en el medio, Marín et al., (2009), afirma que las condiciones propias del medio pueden
afectar el desarrollo los microorganismos, como lo son las posibles relaciones sinérgicas
existentes.
y = 5E+08x - 2E+08R² = 0,9435
5,40
5,60
5,80
6,00
6,20
6,40
6,60
6,80
7,00
0,0E+00
1,0E+09
2,0E+09
3,0E+09
4,0E+09
5,0E+09
0 1 2 4 6 8 10 12 24
pH
UFC
/mL
Tiempo en Horas
Comportamiento cinético de Leuconostoc mesenteroides
UFC/mL pH Lineal (UFC/mL)
43
La producción de ácido láctico como resultado de la asimilación del sustrato en el medio se
demuestra mediante la disminución del pH que va de 6.87 a 5.94, teniendo un descenso no muy
marcado, esto implica que al no ser capaz de adaptarse al medio la actividad metabólica no
funciona correctamente, como lo afirma Sánchez (2005) quien menciona que para activar la
fermentación por la vía heterofermentativa es necesario que el microorganismo no se encuentre
bajo condiciones de estrés.
Dada la procedencia del microorganismo, se esperaba evidenciar un ciclo de crecimiento de tipo
exponencial, sin embargo, nuevamente se confirma la necesidad de monitorear variables propias
del medio en que se desarrolla naturalmente el microorganismo, esto se confirma según los
resultados presentados por Hernández (2013) donde las cinéticas de cepas nativas de
Leuconostoc mesenteroides fueron registradas en un medio comercial, en donde presentaron
bajas tasas de crecimiento y en un medio modificado al que se agregó ácido glutámico y valina,
indispensables para su correcto crecimiento y desarrollo demostrando mejoras notarias en su
crecimiento.
Los parámetros cinéticos de los microorganismos durante un periodo de 24 horas en medio MRS
se encuentran en la tabla 3, en donde se puede observar la similitud de comportamiento entre
ambas bacterias.
44
Tabla 3 Parámetros cinéticos de Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides durante
24 horas en medio MRS.
Ecuación
Velocidad
específica de
crecimiento (µ)
Número de
generaciones
(n)
Tiempo de
generación (t)
Lactobacillus
plantarum y = 5E+08x - 2E+08 0,17h-1 5,9 4,07 h
Leuconostoc
mesenteroides y = 5E+08x - 2E+08 0,16 h-1 5,58 4,33h
Los resultados contrastan con lo reportado según Agudelo et al., (2010), en donde para
Lactobacillus plantarum, reporta velocidad especifica de crecimiento de 0,5h-1 un tiempo de
generación de 1,1 a 1,98 horas, y para Leuconostoc mesenteroides, Rodríguez y Hanssen, (2007)
reportan una velocidad especifica de crecimiento de 0,56 h-1 y un tiempo de generación de 1,22h-
1, lo que demuestra que los microorganismos presentan un comportamiento tardío.
Según lo anteriormente descrito por los autores, quienes determinaron los parámetros cinéticos
de los microorganismos en medio MRS en condiciones similares a las del presente estudio, se
podría aseverar que hubo un posible retraso en las actividades metabólicas de los
microorganismos debido a la imposibilidad de adaptarse por completo al medio de cultivo en el
que se utilizó para su crecimiento, evitando su desarrollo a cabalidad. Esto lo prueba Rushing et
al., (1955), quien evalúa el crecimiento de algunos géneros representativos de bacterias ácido-
lácticas entre ellas Lactobacillus plantarum y Leuconostoc mesenteroides en donde puntualmente
se varía la concentración del sustrato, pH, temperatura y agitación obteniendo velocidades
específicas de hasta 12.5 horas para Lactobacillus plantarum y de 13.1 horas para Leuconostoc
mesenteroides.
45
Esto lleva intuir que las condiciones del medio no fueron las adecuadas para ninguna de los dos
microorganismos para desarrollar su actividad metabólica, o se hace necesario vigilar de cerca
otras variables que puedan influir directamente sobre el microorganismo como por ejemplo las
posibles relaciones sinérgicas existentes en su medio nativo.
10.3. Pruebas de compatibilidad entre los microorganismos
En la tabla 4 se observa los resultados de las pruebas de antagonismo realizadas a los
microorganismos seleccionados a diferentes concentraciones celulares, en donde no hay
evidencia de competencia entre los mismos.
Tabla 4 Resultados pruebas de antagonismo
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum 10^7
UFC/mL 10^6
UFC/mL 10^5
UFC/mL
10^7 UFC/mL - - -
10^6 UFC/mL - - -
10^5 UFC/mL - - -
(-) no presenta inhibición
Lo resultados obtenidos en la tabla 4 demuestran que sin importar las diferentes mezclas
realizadas en las diferentes concentraciones celulares para los microorganismos en ninguno de
los ensayos se presentó inhibición por lo cual se descarta competencia entre ellos.
Al ser microorganismos aislados de la misma fuente hacen que los resultados obtenidos fueron
los previstos, lo que concuerda con lo afirmado por Puerta (2000) en donde confirma la presencia
de Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus Plantarum como microbiota natural del mucilago
46
del café. Lo anterior hizo posible formular un consorcio entre ellos como cultivo iniciador,
estableciéndolo como un tratamiento viable para el presente estudio.
10.4. Fermentación seca del café
En la Figura 7, se observa la fermentación seca del café de los diferentes tratamientos utilizados
en el presente estudio durante 24 horas a 150rpm con una temperatura promedio de 11.3°C. En
donde se observa que Lactobacillus plantarum mostró un comportamiento superior a los demás
tratamientos y el control.
Figura 7 Fermentación seca del café de los diferentes tratamientos durante 24 horas.
Durante las 24 horas de seguimiento, es claro ver que el control comprende un ascenso desde la
hora 0 hasta la hora 14 donde se encuentra por encima de todos los tratamientos evaluados, para
0,0E+00
2,0E+08
4,0E+08
6,0E+08
8,0E+08
1,0E+09
1,2E+09
0 14 18 24
ufc
/ml
Tiempo en horas
Fermentación Ctrl Fermentación Mix
Fementeación Lp Fermentación Lm
47
luego presentar una actividad decreciente hasta la hora 24 donde se registra conteos por debajo
de los demás. Por otro lado, la fermentación de Lactobacillus plantarum muestra un ascenso de
manera constante durante las 24 horas, teniendo los mayores recuentos excepto en la hora 14.
Finalmente, el comportamiento de las fermentaciones del consorcio microbiano (Mix) y de
Leuconostoc mesenteroides tienen comportamientos prácticamente iguales hasta la hora 18, a
partir de entonces hasta la hora 24 los recuentos de Leuconostoc mesenteroides son mayores a los
del consorcio.
El comportamiento descrito por el control se ajusta a lo referenciado por Velmourougane (2013)
donde afirma que la remoción del mucilago del grano de café (fermentación natural) toma
alrededor de 13 horas, y a partir de entonces la concentración del sustrato disminuye haciendo
que el desarrollo celular se vea afectado y sus metabolismos disminuyan sus actividades.
La fermentación de Lactobacillus plantarum se observa por encima de las demás,
comportamiento que según Salazar (2017) se da porque este microorganismo es capaz de
consumir el citrato en las primera etapas de la fermentación, por lo tanto, evita competencia por
los azucares con las levaduras que según Puerta (2010) son los microorganismos que inician la
degradación de los azucares más simples (monosacáridos y disacáridos) en las primeras horas de
la fermentación de café. Después de conocer el comportamiento cinético del microorganismo se
esperaba un comportamiento superior, sin embargo, la concentración alcanzada al final de la
fermentación se encuentra muy por debajo de lo alcanzado en el mismo periodo de tiempo en el
medio comercial (MRS). (Puerta y Ríos, 2011).
En el caso de Leuconostoc mesenteroides, se registró una actividad completamente diferente a la
del control, teniendo un comportamiento relativamente lento, esto concuerda con lo registrado
por Ochoa (2017) donde las lecturas de las secuencias de Leuconostoc mesenteroides en la hora
48
24 de fermentación corresponden a cerda del 50% de la cantidad registrada para Lactobacillus
plantarum. A pesar de conocer que el desarrollo del microorganismo era tardío no se esperaba
una diferencia marcada entre las fermentaciones de los dos microorganismos, lo que implica que
Leuconostoc mesenteroides no es un microorganismo predomínate durante la fermentación del
café como lo afirmó deMelo et al.,(2015).
El comportamiento presentado por la fermentación de café inoculada con el consorcio
microbiano deja en evidencia la marcada diferencia con el tratamiento control, mientras que
registra similitud con la fermentación de Leuconostoc mesenteroides, quienes varían únicamente
en la última hora de seguimiento. Si bien, se descartó la competencia entre los microorganismos
del cultivo iniciador, la actividad registrada para el mix según la figura 7, se puede explicar en el
estudio realizo por McDonald et al.,(1990) donde Leuconostoc mesenteroides presenta
incapacidad para mantener su gradiente de pH, contrario a Lactobacillus plantarum, según el
autor, las altas concentraciones de ácido láctico son el principal factor que contribuye a la
eliminación temprana de Leuconostoc mesenteroides en fermentaciones
En la tabla 5 se muestran los parámetros cinéticos de los microorganismos durante un periodo de
24 horas en mucilago de café en donde se observa que Lactobacillus plantarum tuvo el mejor
desarrollo siendo protagonistas en tres de los cuatro tiempos registrados.
49
Tabla 5 Parámetros cinéticos de las fermentaciones de los tratamientos durante 24 horas en el
mucilago de café a una temperatura promedio de 11.3°C.
Ecuación Velocidad
específica de
crecimiento (µ)
Número de
generaciones
(n)
Tiempo de
generación (t)
Control y = 4E+07x + 5E+08 R² = 0,0513
0.017 h-1 0.59 40.67h
Lactobacillus
plantarum
y = 2E+08x + 3E+08 R² = 0,9462
0.034 h-1 1.19 20.16h
Leuconostoc
mesenteroides
y = 1E+08x + 2E+08 R² = 0,9898
0.033 h-1 1.15 20.86h
Consorcio
microbiano
y = 8E+07x + 3E+08 R² = 0,9423
0.022 h-1 0.78 30.76h
El crecimiento de los dos microorganismos evaluados previamente mediante el comportamiento
cinético, muestran variaciones, esto confirma el hecho de que el medio en donde se desarrollen y
las condiciones propias del mismo (sustrato, sinergias microbiana, temperatura) tienen efecto
directo sobre el desarrollo de los microorganismos.(Herrera, 2008) Si bien el sustrato es uno de
los factores determinantes para el crecimiento de un microorganismo, se esperaba que los
comportamientos de los cultivos estuvieran por debajo de los obtenidos en las cinéticas
microbianas realizadas, debido a los carbohidratos en el medio comercial, son azucares simples
por lo que su metabolismo es más rápido, mientras que en el mucilago de café, tenemos
moléculas mucho más compuestas, que requieren de más tiempo y energía para metabolizarlos,
esto lo confirmó Puerta (2011), en donde afirma que en casos puntuales, incluso los
carbohidratos simples no son degradados por completo por interferencias entre microorganismos
(posibles sucesiones microbianas).
Otro de los factores controlados en el ensayo fue la temperatura, con una media de 11.3°C, esta
fue seleccionada según lo establecido por Ochoa, (2017), encontrando estas comunidades
50
(Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus plantarum) como predominantes en la fermentación
seca del café, sin embargo, esto podría interferir directamente en su desarrollo metabólico, pues
estos microorganismo al ser nativos, muy posiblemente requieran de la sucesiones microbiana
propias de su ambiente para poder desarrollarse correctamente.
10.5. Análisis sensorial del café
En la figura 8 se evidencia la acción de la inoculación de microorganismos sobre las variables
aroma, fragancia y cuerpo del café. Donde el tratamiento inoculado con Leuconostoc
mesenteroides con una media de 8.48 puntos obtuvo los mejores resultados.
Figura 8 Puntajes establecidos en la evaluación sensorial de los diferentes tratamientos para
las características aroma, fragancia y cuerpo según los parámetros establecidos por la SCA.
El tratamiento control muestra que el mejor puntaje en las características definidas se presentó a
la hora 14, eso abre la posibilidad a que otra comunidad microbiana propia del ambiente se la
0 14 18 24
8,15
8,20
8,25
8,30
8,35
8,40
8,45
8,50
Tiempo en horas
Cal
ific
ació
n (
0-1
0)
Calificación Parcial vs Tiempo
Control L. plantarum L. messenteroides Consorcio
51
responsable de dar compuesto que realcen el aroma, fragancia y cuerpo. Como Puerta (2012)
afirma predominancia de levaduras como Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans al ser
las encargas de realizar las fermentación de los azucares más simples durante las primeras horas
de proceso.
Según Cicotello (2016) la capacidad de Leuconostoc mesenteroides de solubilizar sustancias
pécticas y metabolizar compuestos complejos en diacetilo, alcoholes y acetoína, lo hacen
precursor del aroma y fragancia del café, esto explicaría el por qué a pesar de no registrar
recuentos altos durante las primeras 18 horas de fermentación, por debajo de 83,5, las
características que otorga al café en la hora 24 son apreciables en comparación a los demás
cultivos iniciadores y al control, 84.8, siendo el puntaje mayor en todos los tratamientos
evaluados. La característica cuerpo, se define como la sensación del café en la boca, su
viscosidad, peso y grosor percibido por el catador, el puntaje para Leuconostoc mesenteroides fue
el mayor obtenido entre todos los tratamiento, esto es explicado por Bhavani y Nisha (2010) que
mediante un estudio detallado del metabolismo del microorganismo este es capaz de aumentar la
suavidad, textura, volumen, de diferentes alimentos lo que en el caso particular del registro a la
hora 24 del análisis sensorial del café inoculado con Leuconostoc mesenteroides resulta como el
tratamiento sobresaliente.
En el caso de los puntajes obtenidos en la cata del café bioaumentado con Lactobacillus
plantarum, demuestra que su capacidad como heterofermentador es inhibida por factores propios
del medio, lo que impide la producción de acetaldehído y diacetilo, compuestos que se han
reportado como influyentes de manera positiva en el aroma y fragancia de alimentos
fermentados. (Herrera, 2008)
52
Respecto al consorcio, su capacidad se prueba en la hora 0, donde obtiene puntajes de 8.4, sin
embargo, sus puntajes a lo largo de los demás tiempos tienden a fluctuar lo que evidencia que a
pesar de que se confirmó que no hay competencia con lo reportado en el numeral 9.1, factores
propios del medio pueden incidir sobre el desarrollo en conjunto de los microorganismos si estos
no se encuentran con todos los aspectos de crecimiento óptimos, como pH de 6,5, temperatura
entre 20 y 30°C, entre otros (Ochoa y Montoya, 2010)
En la figura 9 se encuentran los resultados para las características acidez, dulzor y residual para
cada uno de los tratamientos evaluados. Siendo Leuconostoc mesenteroides quien tuvo tanto el
puntaje más bajo 8.2 en la hora 18 y el más alto 8.48 en la hora 24.
Figura 9 Puntajes establecidos en la evaluación sensorial de los diferentes tratamientos para
las características acidez, dulzor y residual según los parámetros establecidos por la SCA.
El comportamiento reportado en la figura 9 es el mismo que se observa para las características en
la figura 8, esto implica que al manifestarse una característica como predominante las demás
0 14 18 24
8,15
8,20
8,25
8,30
8,35
8,40
8,45
8,50
Tiempo en horas
Cal
ific
ació
n (
0-1
0)
Calificación Parcial vs Tiempo
Control L. plantarum L. messenteroides Consorcio
53
también, esto lo explica la guía de catación de la SCA (2013) afirma que en un buen café (Café
especial) se debe tener un buen balance entre todas sus características, es decir, encontrarse en
condiciones relativamente similares para no cansar el paladar del consumidor, por lo que todos
los puntajes parciales deben tener cierta correlación y aumentar o disminuir de manera
relativamente similar, evitando variaciones entre las misma, aun punto máximo aceptado de 0.3
puntos.
La actividad de Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus plantarum tuvieron protagonismo en
los cultivos iniciadores individuales durante la última hora de registro, resultado similar a lo que
concluyó de Melo et al., (2015) en su estudio Microbial ecology and starter culture technology
in coffee processing, donde afirma que estas son comunidades predominantes en todo el proceso
de fermentación de café. Estos microorganismos son capaces de producir diacetilo, alcoholes y
acetoína, que no solo aportan características al aroma, también otorga sabores particulares
durante el tueste del café (Herrera, 2008) Lo anterior implica que los microorganismos en el
consorcio tienen una interacción diferente a la presentada en las pruebas de antagonismo
realizada, es decir, que si bien no hay competencia entre ellos en medio formulado, esto coincide
con lo reportado por Fanegas et al., (2071) que afirman que la variación de condiciones de
crecimiento de un microorganismo puede ser la causa de la producción de antimicrobianos que
pueden llegar a inhibir incluso a bacterias del mismo grupo de las bacterias ácido lácticas,
también se refuerza la posibilidad de que en cambio haya un relación sinérgica por medio de
sucesiones microbianas en donde el crecimiento de alguno de los microorganismos dependa de
los productos de la fermentación de su microbiota acompañante.
La abundancia de Lactobacillus plantarum parece ser muy alta en las horas 18 y 24 según la
Figura 7, sin embargo, esta diferencia no parece tener influencia en las características sensoriales
54
evaluada, donde registra puntajes de 8.43 para los dos tiempos, lo que implica que a pesar de el
microorganismo siguiera en crecimiento, su aporte en cuanto a las características organolépticas
de la taza final no es significativo (Anexo). Según Puerta (2010) afirma que la producción de
ácido láctico da características de acidez sobresalientes al café. Sin embargo, su sobreproducción
en la fermentación puede disminuir seriamente la calidad de la taza, lo que puede implicar que
metabólicamente el microorganismo se vio afectado (vía heterofermentativa) disminuyendo la
producción de este ácido.
En la figura 10 se observan los resultados del análisis de variabilidad de las réplicas realizadas
durante el presente estudió que no demuestran diferencias significativas P > 0.05 (Anexo) en
donde se observa que independientemente los tratamientos control hora 0 y consorcio hora 24
fueron los más estables, por tanto al tener un rango entre sus réplicas tan cercanas, hace mucho
más sencillo predecir sus resultados a futuro, comportamiento contrario a los correspondientes a
Lactobacillus plantarum hora 0 y 14.
55
Figura 10 Análisis de variabilidad de las réplicas por tratamiento para cada característica
evaluada.
La variabilidad de los puntajes obtenidos para el tratamiento control aumentan a medida que
trascurre el tiempo, lo que implica que la calidad de taza es menos predecible y es necesario
controlar variables que en este estudio no fueron controladas y pueden influenciar directamente
sobre la calidad del café después de la fermentación, esto lo explica Puerta (2015) donde recalca
la importancia de las buenas prácticas de lavado, secado, almacenamiento y tostado para
conservar las características obtenidas durante la fermentación.
Caso contrario al revisar de cerca el comportamiento de los puntajes obtenidos por el tratamiento
inoculado con Leuconostoc mesenteroides, donde se observa puntuaciones extremas en las
Plot of Means
Muestra
mean o
f A
cid
ez
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
Plot of Means
Muestra
mean o
f A
rom
a
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
Plot of Means
Muestra
mean o
f C
uerpo
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
Plot of Means
Muestra
mean o
f D
ulz
or
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
Plot of Means
Muestra
mean o
f F
ragancia
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
Plot of Means
Muestra
mean o
f R
esid
ual
78
910
Ctrl H0 Ctrl H14 Ctrl H18 Ctrl H24 LM H0 LM H14 LM H18 LM H24 LP H0 LP H14 LP H18 LP H24 MIX H0 MIX H14 MIX H18 MIX H24
56
primeras 18 horas de fermentación, pero finaliza con puntajes altos y con un rango de diferencia
mínima en la hora 24, esto hace que sea el tratamiento que otorga mejores resultados con una
media de 8.48 puntos en el último tiempo de registro.
Por su parte las características evaluadas para los tratamientos inoculados con Lactobacillus
plantarum permiten apreciar la similitud con el comportamiento de los puntajes obtenidos por
los tratamientos inoculados con Leuconostoc mesenteroides, en este caso el microorganismo
también parece tener cambios en su actividad antes de la hora 18 donde finalmente se evidencian
puntajes altos con rangos mucho menores.
El caso del consorcio microbiano muestra un comportamiento en sus valores bastante estables,
sin embargo, las características otorgados no son las más sobresalientes de todo el ensayo, lo que
lo hace un tratamiento viable en cuanto a balance, pero no mejoras considerables en las
características respecto al tratamiento control.
En la figura 11 se observa el puntaje total obtenido por cada uno de los tratamientos a través de
las 24 horas de seguimiento arrojado por el análisis sensorial del café, la cual fue realizado por
un catador certificado por la Sociedad de Cafés Especiales, SCA., registra que para cada uno de
ellos se existe un tiempo con calificación superior a los demás, en la hora 0 el café inoculado con
el consorcio microbiano obtuvo un puntaje de 84, en la hora 14 el tratamiento control con 84
puntos, en la hora 18 Lactobacillus plantarum obtuvo 84.3 como puntaje global y finalmente el
café inoculado con Leuconostoc mesenteroides fue el mejor calificado con 84.8 puntos.
57
Figura 11 Puntajes totales establecidos en la clasificación sensorial de los diferentes
tratamientos según los parámetros establecidos por la SCA.
El comportamiento de los puntaje del análisis sensorial presentado por el control concuerda con
lo establecido por Velmourougane (2013), donde establece que la remoción de mucilago se logra
en 13 horas, esto se refleja en el aumento de puntuación durante las primeras 14 horas de
registro, lo que implica la posibilidad de que, al verse reducido el sustrato en el medio, los
microorganismos presentes en la fermentación disminuyan su actividad metabólica, dejando de
producir compuestos que pueden interferir en las características del café. Esto concuerda con lo
reportado por Puerta y Ríos (2011) quienes afirmas que en el proceso de fermentación se inicia
con una disminución de los azucares, seguido de producción de ácidos y etanol y finalmente la
degradación de lípidos.
Mediante técnicas moleculares Ochoa reportó en el 2017 que la cantidad de secuencias génicas
de Leuconostoc mesenteroides durante las primeras 18 horas de fermentación fueron muy bajas,
lo que concuerda con el puntaje registrado en este periodo manteniéndose por debajo de los 83.2
0 14 18 24
81,5
82
82,5
83
83,5
84
84,5
85
Tiempo en horas
Pu
nta
je (
0-10
0)
CLASIFICACIÓN SENSORIAL
Control L. plantarum L. messenteroides Consorcio
58
puntos. Lo que vario abruptamente en la hora 24 con 84.8 puntos obtuvo la mejor calificación de
todos los tratamientos, clasificándolo según la SCA como un café especial, esto concuerda con el
aumento presentado en el conteo registrado para esa misma hora en la fermentación (Figura 7),
lo que relaciona directamente la concentración microbiana y la calidad de taza, lo anterior
refuerza la opción de que la existencia de unas relaciones sinérgicas mediadas por sucesiones
microbianas pueden ser fundamentales para el desarrollo metabólico del microorganismo para así
otorgar características distintivas al café por medio de sus producto metabólicos.
El mismo autor reporta una tendencia creciente en las lecturas de secuencias génicas de
Lactobacillus plantarum durante todo el proceso de fermentación, comportamiento similar que
se observa en los resultados del presente estudio hasta la hora 18, sin embargo, no todos los
puntajes no presentan variación desde este registro hasta la hora 24, lo que implica que a pesar de
que su crecimiento continúe, su efecto en la calidad de taza no influye, esto demuestra que si el
microorganismos se somete a estrés metabólicamente, afectando la vía heterofermentativa lo que
puede disminuir la producción de compuestos como ácido láctico.
Finalmente, el consorcio microbiano alcanzó un puntaje alto en la hora 0 y 24 con 84 puntos, el
resultado obtenido de la primera hora de seguimiento evidencia que las características
organolépticas se deben a metabolitos producidos durante la bioaumentación realizada al
microorganismos, no específicamente por la degradación del sustrato, por otro lado, durante los
tiempos intermedios de registro valores por debajo al del control lo que indica la posible
sucesión durante la fermentación de los microorganismos utilizados como cultivos iniciadores,
como lo afirma Lee et al.,(2015) en donde estudia el comportamiento de bacterias acido lácticas
en productos fermentados encontrando, que Leuconostoc mesenteroides es predominante
durante periodos tempranos de las fermentaciones esto debido que su acido tolerancia no se
59
compara a la de otras bacterias acido lácticas como Lactobacillus plantarum que son las
responsables de disminuir el pH, haciendo que su abundancia en el medio descienda.
Figura 12 Análisis de comportamiento de las réplicas por tratamiento según puntaje global
Los resultados de los puntajes obtenidos por el control demuestran que es uno de los tratamientos
más estables, pero no muy sobresaliente, en este caso en particular, obtuvo notas agradables pero
muy suaves, situación similar a la que presenta el consorcio microbiano en comportamiento y notas
finales de taza, quien incluso parece tener menos variaciones, pero al tiempo menores puntajes, lo
que lo hace que no sea el mejor tratamiento ya que las características otorgadas respecto a la del
café control no representa una mejoría evidente.
60
Por su parte Lactobacillus plantarum demuestra ser un microorganismo muy variable, ya que las
características que puede otorgar durante las primeras 14 horas de fermentación abarcan un rango
entre los 82 hasta los 85 puntos, con sabores desde chocolate astringente hasta cítricos florales,
esto lo hace inviable para el gremio cafetero, ya que al tener puntajes por encima de 80 se
consideran cafés especiales muy buenos según los establecido por la SCA, pero obtener puntajes
por encima de 85 lo hace cafés especiales excelentes, lo que es más rentable para el productor, ya
que esto implica según la sociedad de cafés especiales al menos $1,5 dólares por encima del
precio del café estándar en el mercado internacional, sin embargo, en el caso de este cultivo
iniciador, su inestabilidad no lo hace viable para ser dirigido a un mercado tan exigente debido a
las posibles fluctuaciones de las características en la taza final.
Al hacer seguimiento de las puntuaciones conseguidas por Leuconostoc mesenteroides durante
las 24 horas de fermentación, es evidente que durante el último registro alcanzó el mejor puntaje
global, lo que resulta en el único café especial considerado excelente con notas finales en taza
distintivas (frutales, cítricas y dulces de buen balance y cuerpo) con puntajes entre 84.5 y 85
puntos, lo que lo hace viable para el productor, puesto que será posible para él conocer el
momento en el que debe terminar la fermentación para así conseguir cafés de alta calidad, con
características sobresalientes en el mercado.
En la figura 13 se muestra los tratamientos ordenados de forma descendente según su puntaje
global obtenido en el análisis sensorial.
61
SCA: Speciality Coffee Association; ER: Hacienda el Roble
Figura 13 Clasificación de los promedios de las puntaciones globales obtenidas para cada
tratamiento según la SCA.
Según los parámetros establecidos por la SCA un café con un puntaje total o global por encima
de 80 se considera un café especial de calidad muy buena, por lo que se puede afirmar que todos
los tratamientos se encuentran dentro de esta denominación, la misma organización resalta que
sobre 84.5 los cafés especiales son de calidad excelente, por lo que el tratamiento inoculado con
Leuconostoc mesenteroides es el único que entra en esta clasificación, sin embargo, para la
Hacienda el Roble, los cafés por debajo de 83 son considerados buenos, pero no sobresalientes
por los estándares de calidad impuestos a la fecha por la compañía.
84,8
84,3 84,3
84 84 84 84
83,8 83,8
83,5 83,5
83,3 83,3
83 83
82,8
81,5
82
82,5
83
83,5
84
84,5
85
LMH24
LPH18
LPH24
CTRLH14
CTRLH18
MICH0
MIXH24
CTRLH24
MIXH14
LP H0 LPH14
LMH0
MIXH18
CTRLH0
LMH14
LMH18
Pu
nta
je t
ota
l
Tratamiento
SCA
ER
62
11. CONCLUSIONES
Se estableció que los microorganismos utilizados como cultivos iniciadores (Lactobacillus
plantarum y Leuconostoc messenteriodes) presentaron comportamiento de tipo lineal durante 24
horas en medio MRS bajo condiciones controladas, en donde su fase exponencial se encuentra
por encima de las 24 horas, con velocidades específicas de crecimiento (µ) de 0.27h-1 y 0.26h-1
y tiempos de generación (t) de 4.07h y 4.33h respectivamente.
Por otro lado, se conformó un consorcio microbiano debido a que se demostró que no existe
antagonismo entre ellos, adicional a esto, se presume una relación sinérgica entre los mismos.
Se determino que los perfiles de sabor presentan variaciones a través del tiempo al ser
bioaumentados con los microorganismos de interés, obteniendo notas desde chocolate hasta
frutales.
A través de un análisis sensorial según lo indicado por la Speciality Coffee Association (SCA),
se demostró que la inoculación de cultivos iniciadores varia las características organolépticas del
café esto por medio de la comparación de los puntajes globales obtenidos por los tratamientos y
el control.
63
12. RECOMENDACIONES
Realizar seguimiento al comportamiento cinético de los microorganismos por encima de la hora
24 para así garantizar que el inoculo inicial se encuentre en fase exponencial, para nuevamente
formular los cultivos iniciadores y realizar nuevamente un análisis sensorial.
Evaluar la relación que exista entre Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus plantarum, de
tal manera determinar si existe una sucesión microbiana a través del tiempo y como son sus
comportamientos metabólicos, de tal manera encontrar los tiempos y orden de inoculación
durante la fermentación
Determinar si variar las temperaturas de fermentación es un factor que estimule metabólicamente
la producción de compuestos que sean los responsables de acentuar características distintivas en
el café.
64
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69
14. ANEXOS
Análisis de la varianza
Fragancia
Variable N R² R² Aj CV
Fragancia 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
Aroma
Variable N R² R² Aj CV
Aroma 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Fragancia
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Mean
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
70
Cuerpo
Variable N R² R² Aj CV
Cuerpo 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Aroma
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Mean
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Cuerpo
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Me
an
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
71
Acidez
Variable N R² R² Aj CV
Acidez 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
Dulzor
Variable N R² R² Aj CV
Dulzor 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Acidez
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Me
an
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
72
Residual
Variable N R² R² Aj CV
Residual 32 0,35 0,00 1,41
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Muestra 0,12 15 0,01 0,58 0,8513
Error 0,23 16 0,01
Total 0,35 31
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Dulzor
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Me
an
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Residual
With 95% Decision Limits
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
Me
an
UDL=8,67
CL=8,39
LDL=8,11
73
Puntaje
Variable N R² R² Aj CV
Puntaje 32 0,31 0,00 1,32
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 8,88 15 0,59 0,49 0,9153
Muestra 8,88 15 0,59 0,49 0,9153
Error 19,50 16 1,22
Total 28,38 31
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Fragancia Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Muestra
Analysis of Means Plot for Puntaje
With 95% Decision Limits
81
82
83
84
85
86
87
Me
an
UDL=86,26
CL=83,69
LDL=81,12
74
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Aroma Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Cuerpo Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
75
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Acidez Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Dulzor Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
76
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Residual Ctrl H0 2 8,3 0 0 8,3 * 8,3 * 8,3
Ctrl H14 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H18 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
Ctrl H24 2 8,375 0,075 0,1061 8,3 * 8,375 * 8,45
LM H0 2 8,325 0,125 0,177 8,2 * 8,325 * 8,45
LM H14 2 8,3 0,1 0,141 8,2 * 8,3 * 8,4
LM H18 2 8,275 0,075 0,1061 8,2 * 8,275 * 8,35
LM H24 2 8,475 0,025 0,0354 8,45 * 8,475 * 8,5
LP H0 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H14 2 8,35 0,15 0,212 8,2 * 8,35 * 8,5
LP H18 2 8,425 0,025 0,0354 8,4 * 8,425 * 8,45
LP H24 2 8,425 0,075 0,1061 8,35 * 8,425 * 8,5
MIX H0 2 8,4 0,05 0,0707 8,35 * 8,4 * 8,45
MIX H14 2 8,375 0,025 0,0354 8,35 * 8,375 * 8,4
MIX H18 2 8,325 0,025 0,0354 8,3 * 8,325 * 8,35
MIX H24 2 8,4 0 0 8,4 * 8,4 * 8,4
Variable Muestra N Media
Error
Desv.Est. Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
estándar de
la media
Puntaje Ctrl H0 2 83 0 0 83 * 83 * 83
Ctrl H14 2 84 0,5 0,707 83,5 * 84 * 84,5
Ctrl H18 2 84 0,5 0,707 83,5 * 84 * 84,5
Ctrl H24 2 83,75 0,75 1,061 83 * 83,75 * 84,5
LM H0 2 83,25 1,25 1,77 82 * 83,25 * 84,5
LM H14 2 83 1 1,41 82 * 83 * 84
LM H18 2 82,75 0,75 1,061 82 * 82,75 * 83,5
LM H24 2 84,75 0,25 0,354 84,5 * 84,75 * 85
LP H0 2 83,5 1,5 2,12 82 * 83,5 * 85
LP H14 2 83,5 1,5 2,12 82 * 83,5 * 85
LP H18 2 84,25 0,25 0,354 84 * 84,25 * 84,5
77
LP H24 2 84,25 0,75 1,061 83,5 * 84,25 * 85
MIX H0 2 84 0,5 0,707 83,5 * 84 * 84,5
MIX H14 2 83,75 0,25 0,354 83,5 * 83,75 * 84
MIX H18 2 83,25 0,25 0,354 83 * 83,25 * 83,5
MIX H24 2 84 0 0 84 * 84 * 84
