Evaluacion de Cultivos Lacticos

5/27/2018 Evaluacion de Cultivos Lacticos

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EVALUACION DE CULTIVOS LACTICOS

LACTIC CULTURE ASSESSMENT

Carmen L. Espinosa Araujo, Uriel F. Orozco Suarez.

RESUMEN

El Lactococcus lactis subsp. Lactis y cremoris es un microorganismo mesofilo,

capaz de fermentar la lactosa produciendo acido lctico en gran cantidad, de la

misma forma es capaz de producir algunas substancias antibacterianas conocidas

en forma generica como bacteriocinas, entre las cuales destacan la nisina y la

diplococcina. Esta bacteria cido-lctica es muy utilizada como cultivo iniciador

principalmente en quesos madurados y en kumis. En el siguiente trabajo se evaluo

un cultivo lctico de Lactococcus lactis subsp. Lactis y cremoris, empleados en laindustria del kumis a travez del seguimiento en el comportamiento de la acidez y el

pH, encontrando que a mayor tiempo de incubacin del cultivo este presenta

mayor acidez y por consiguiente menor pH debido a la acumulacin de acido

lctico producido por la fermentacin lctica realizada por las bacterias en la

lactosa de la leche (sustrato). Tambin se encontr que a mayor porcentaje de

slidos (leche en polvo) en el cultivo tambin va a ser mayor la acidez producida

ya que los microorganismos al tener mayor cantidad de sustrato se acelera su

crecimiento y reproduccin generando consigo un aumento de los productos

resultado de la actividad metablica de dichos microorganismos ya que entre

mayor cantidad de microorganismos vamos a tener mayor cantidad de producto(acido lctico). Tambin se realizo la evaluacin del crecimiento del

microorganismo haciendo una siembra en profundidad, empleando para ello tres

diluciones (10-1,10-2y10-3), este procedimiento tambin se llevo a cabo a diferentes

tiempos de incubacin pero los resultados obtenidos no fueron los esperados ya

que al cabo de 48 horas de incubacin no se observo crecimiento del

microorganismo.

PALABRAS CLAVES: Bacterias acido lcticas, kumis, Lactococcus lactis subsp.

Lactis y cremoris, fermentacin, acidez, pH, acido lctico, % de slidos,

crecimiento microbiano.

ABSTRACT

The Lactococcus lactis subsp. Lactis and cremoris is a mesophile microorganism

able to ferment lactose to produce lactic acid in large quantity, just as it is capable

of producing some antibacterial substances known generically as bacteriocins,


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among which nisin and diplococcina. This lactic acid bacteria is widely used as

starter culture for ripened cheese and buttermilk. In this paper, we evaluated a

lactic culture of Lactococcus lactis subsp. Lactis and cremoris, used in the

manufacture of buttermilk to travez monitoring the behavior of the acidity and pH,

and found that the longer the incubation of the culture that has more acidity and

consequently lower pH due to accumulation of lactic acid produced by the lactic

fermentation by bacteria in the milk lactose (substrate). We also found that a higher

percentage of solids (powdered milk) in the culture will also be greater the acidity

produced as the organisms to have greater amount of substrate is accelerating its

growth and reproduction results in an increase generating products result the

metabolic activity of these microorganisms and that the greater number of

microorganisms are going to have as much product (lactic acid). Also evaluated

with the growth of the organism making a planting depth, employing three dilutions

(10-1,10-2 and 10-3), this procedure is also conducted at different times of

incubation, but the results were not as expected after 48 hours of incubation nogrowth of microorganism was observed.

KEY WORDS:lactic acid bacteria, buttermilk, Lactococcus lactis subsp. Lactis and

cremoris, fermentation, acidity, pH, lactic acid, % solids, microbial growth.

INTRODUCCION

La fermentacin cido lctica es aquella que se lleva a cabo por las bacterias

cido lctica cuya actividad se desarrolla en ausencia deoxgeno (anaerobiosis), y

se manifiesta en la transformacin de los azcares presentes en el alimento , encido lctico, etanol y dixido de carbono. La accin de estas bacterias

desencadena un proceso microbiano por el cual la lactosa (el azcar de la leche)

se transforma en cido lctico. A medida que el cido se acumula, la estructura de

las protenas de la leche va modificndose (van cuajando), y lo mismo ocurre con

la textura del producto. Existen otras variables, como la temperatura y la

composicin de la leche, que influyen en las cualidades particulares de los

distintos productos resultantes.

Los productos fermentados de la leche, denominados tambin lcteos

fermentados, son productos lcteos procedentes de loscultivos lcticos debido ala accin de las bacterias del cido lctico (Lactobacillales) tales como los

Lactobacillus, Lactococcus, y el Leuconostoc. El proceso de fermentacin

incrementa la vida til y de consumo del lcteo, mejorando la digestibilidad del

mismo frente a laleche.
http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/falta-oxigeno/falta-oxigeno.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/ciclos-quimicos/ciclos-quimicos.shtml#carhttp://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1cteohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cultivos_l%C3%A1cticoshttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacterias_del_%C3%A1cido_l%C3%A1ctico&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillushttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillushttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactococcushttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactococcushttp://es.wikipedia.org/wiki/Leuconostochttp://es.wikipedia.org/wiki/Leuconostochttp://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1cteohttp://es.wikipedia.org/wiki/Lechehttp://es.wikipedia.org/wiki/Lechehttp://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1cteohttp://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Leuconostochttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactococcushttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillushttp://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillaleshttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacterias_del_%C3%A1cido_l%C3%A1ctico&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivos_l%C3%A1cticoshttp://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1cteohttp://www.monografias.com/trabajos14/ciclos-quimicos/ciclos-quimicos.shtml#carhttp://www.monografias.com/trabajos14/falta-oxigeno/falta-oxigeno.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml


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Las bacterias del cido lctico (BAL), o tambin bacterias cido lcticas y cultivos

lcticos (por razn de sus caractersticas al ser procesadas y multiplicadas para su

utilizacin como grupo) comprenden un lado de bacterias fermentadoras y

productoras de cido lctico, funcin por la que son usadas en la industria para

darle ciertas cualidades a los alimentos y protegerlos contra la accin de otros

organismos dainos. Uno de ellos pueden ser los lactobacillus los cuales aportan

al producto un buen cuidado.

El kumis (tambin llamado koumiss, kumys o kymys). Es un producto de

tradicional consumo desde hace cientos de aos en muchas partes del mundo, es

una leche fermentada similar al yogurt de color blanco natural y de consistencia

ms lquida y suave. Es un producto de sabor y olor caracterstico, mas cido que

el yogurt, y ms importante para las personas que les hace dao la leche cruda o

pasterizada y otros productos no fermentados. Es elaborado con leche

semidescremada pasteurizada y homogenizada con cultivos probiticos que

contribuyen en la digestin y regeneracin de la flora intestinal..

El proceso de fermentacin de este producto es llevado a cabo especficamente

por el grupo de bacterias Lactococcus Lactis subs. cremoris y Lactococcus Lactis

subs. Lactis, las cuales transforman la lactosa contenida en la leche en acido

lctico. En la siguiente practica evaluaremos la fabricacin de cultivos lcticos

utilizados en la industria del kumis a travs de un seguimiento en el

comportamiento de la acidez, el pH y los rendimientos (YP/S, YX/S) a intervalos

regulares de tiempo.

MATERIALES Y METODOS

Preparacin del cultivo para un volumen total de 200 ml

En tres frascos de 250 ml con tapa rosca se reconstituyeron 170 ml de leche en

polvo descremada (8%, 12% y16%), luego se pasteurizaron en bao mara a 80C

por 20 minutos, posteriormente se dejaron enfriar a 43C y se procedi a realizar

la inoculacin de cada concentracin con 30 ml del cultivo iniciador de kumis, se

agito y se llevo a incubacin a 43C por 2 horas.

Actividad del cultivo madre

Se tomo una muestra de 10 ml de cada uno de los frascos que contenan el cultivo

con una concentracin de slidos del 8%, 12% y 16% y cada una se deposito en

un beaker para realizar la medicin de pH con ayuda del pHmetro, posteriormente

se realizo la medicin de la acidez titulable tomando los mismos 10 ml del cultivo,

adicionando 2 gotas de fenolftalena al 2% y titulando con NaOH 0,1N hasta que
http://es.wikipedia.org/wiki/Cladohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_l%C3%A1cticohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_l%C3%A1cticohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Clado


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tomo una coloracin rosa palido (que persistia por 30 segundos). Esta acidez fue

expresada en % de acido lctico.

Este mismo procedimiento se llevo a cabo al cabo de 30 min y 1 hora.

Tambin se efectuaron estas mediciones con el inoculo empleado para lapreparacin del cultivo (kumis), para esto se tomo una muestra de 10 ml la cual se

deposito en un beaker, se le hizo la medicin del pH con la ayuda del pHmetro y

luego se le determino la acidez titulable mediante la titulacin con NaOH 0,1N,

empleando como indicador 2 gotas de fenolftalena al 2%

Recuento de BAL por conteo directo en placa

Procedimiento de las diluciones

En un frasco tapa rosca se adicionaron 90 ml de agua peptonada al 0,1% y se

marco como dilucin 10-1

, posteriormente se adicionaron 10 ml del cultivo (con unaconcentracin al 16% de slidos) al cabo de una hora de incubacin a 43C.

Posteriormente se tomaron 2 tubos de ensayo tapa rosca y se les adicionaron 9

ml de agua peptonada al 0,1% a cada uno, luego se rotularon como dilucin 10 -2y

10-3

respectivamente. Luego se tomo una muestra de 1 ml del frasco que contena

la dilucin 10-1previamente preparada y agitada y se deposito en el tubo rotulado

como dilucin 10-2, se agito bien el tubo y se tomo un ml de esta dilucin (10 -2)

para depositarla en el tubo rotulado como dilucin 10-3

, el cual tambien fue agitado

posteriormente hasta homogenizar.

Este mismo procedimiento se llevo a cabo al cabo de 1 hora de incubacion.

Dilucin del inoculo

Tambin se preparo una dilucin del inoculo, para lo cual se tomaron 10 ml de

kumis y se agregaron en un frasco tapa rosca que contena 90 ml de agua

peptonada al 0,1% y se marco como inoculo 10 -1, posteriormente se adicionaron.

Posteriormente se tomaron 2 tubos de ensayo tapa rosca y se les adicionaron 9

ml de agua peptonada al 0,1% a cada uno, luego se rotularon como inoculo 10-2

e

inoculo 10-3

respectivamente. Luego se tomo una muestra de 1 ml del frasco que

contena el inoculo 10-1 previamente agitado y se deposito en el tubo rotulado

como inoculo 10-2, se agito bien el tubo y se tomo un ml de esta dilucin (10 -2)

para depositarla en el tubo rotulado como inoculo 10-3

, el cual tambien fue agitado

posteriormente hasta homogenizar.


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Procedimiento de siembra en profundidad

Se tomaron 5 cajas de petri estriles y se rotularon como dilucin 10 -1, 10-2, 10-3,

control del medio y control del diluyente. Luego se agito el frasco etiquetado como

10-1

, se agito y se tomo 1ml de la dilucin, la cual se deposito en la caja de petri

marcada como 10-1

, a continuacin se agito el tubo etiquetado como 10-2

, se agitoy se tomo 1ml de dilucin, la cual se deposito en la caja de petri marcada como 10 -

2, luego se agito el tubo etiquetado como 10

-3, se agito y se tomo 1ml de dilucin,

la cual se deposito en la caja de petri marcada como 10 -3; a continuacin se

adiciono 1ml de agua peptonada al 0,1% a la caja marcada como control del

diluyente. Posteriormente se adicionaron aproximadamente 15 ml del agar MRS

fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las cajas marcadas como

control del medio y del diluyente. Por ltimo se llevaron las cajas a incubacin a

43C por 48 horas.

Este mismo procedimiento se llevo a cabo con las diluciones preparadas al cabode 1 hora de incubacin.

Siembra del inoculo

Se tomaron 3 cajas de petri estriles y se rotularon como inoculo 10-1, 10-2, 10-3,

Luego se agito el frasco etiquetado como inoculo 10-1

, se agito y se tomo 1ml de

la dilucin, la cual se deposito en la caja de petri marcada como inoculo 10 -1, a

continuacin se agito el tubo etiquetado como inoculo 10-2, se agito y se tomo 1ml

de dilucin, la cual se deposito en la caja de petri marcada como inoculo 10-2,

luego se agito el tubo etiquetado como inoculo 10

-3

, se agito y se tomo 1ml dedilucin, la cual se deposito en la caja de petri marcada como inoculo 10-3.

Posteriormente se adicionaron aproximadamente 15 ml del agar MRS fundido a

45C a cada una de las cajas. Por ltimo se llevaron las cajas a incubacin a 43C

por 48 horas.

Interpretacin y reporte

Al cabo de 48 horas se sacaron las muestras de la incubadora y se evalu el

crecimiento en cada caja, procediendo al recuento de las unidades formadoras decolonias (UFC) en cada caja.


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RESULTADOS Y DISCUSION

Muchos procesos cambian la cidez de la leche, entre ellos tenemos la

temperatura, proceso fermentativo con microorganismos acidificantes, lipolisis que

da lugar a una disminucin del pH y aumento en la cidez titulable, entre otros.

Este cambio en la acidez de la leche se evidencio en los resultados obtenidos dela practica realizada ya que las bacterias lcticas (que para el caso del yogurt

utilizado en la prctica son Lactococcus Lactis subs. cremoris y Lactococcus Lactis

subs. Lactis) mediante la fermentacin convierten la lactosa de la leche en acido

lctico, el cual, al ir aumentando su concentracin en la leche iba acidificando la

leche y a la vez produciendo un descenso del pH. Se pudo observar que a medida

que aumentaba el tiempo de incubacin de la leche tambin aumentaba su acidez,

y el pH de la muestras iba disminuyendo de forma progresiva.

En la tabla 1 se puede observar que al aumentar el % de slidos de la leche

disminua el pH, esto tambin se evidencio a medida que fue transcurriendo eltiempo de incubacin, esto se da debido a que los microorganismos (bacterias

acido lcticas) al encontrar mayor cantidad de sustrato y nutrientes se van a

reproducir con mayor rapidez lo cual va a generar un aumento del nmero de

microorganismos que a su vez se ver reflejado en el descenso del pH, producido

por la conversin de lactosa en acido lctico producto del metabolismo

fermentativo de los lactococcus y por la acumulacin de este acido lctico en la

muestra. El comportamiento del pH a travs del tiempo a las diferentes

concentraciones de slidos en la leche se evidencia en el grafico1.

En la tabla 2 se puede observar que al aumentar el % de slidos de la lecheaumentaba su acidez, la cual se acidificaba mas a medida que iba transcurriendo

el tiempo de incubacin, la explicacin a esto es la misma dicha anteriormente

que las bacterias acido lcticas al encontrar mayor cantidad de sustrato aceleran

su crecimiento y reproduccin generando un aumento sustancial del nmero de

microorganismos que se ve evidenciado en el aumento de la acidez de la muestra

debido a la acumulacin del acido lctico producido por la fermentacin de la

lactosa. El comportamiento de la acidez a travs del tiempo a las diferentes

concentraciones de slidos en la leche se evidencia en el grafico2.

En cuanto al recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) luego de lasiembra en profundidad no se obtuvieron los resultados esperados, ya que al

cabo de 48 horas de incubacin no hubo ninguna evidencia de crecimiento del

microorganismo (Lactococcus Lactis subs. cremoris y Lactococcus Lactis subs.

Lactis), esto pudo ser debido a la inhibicin del microorganismo debido a una

temperatura de incubacin inadecuada, ya que como sabemos lactococcus es

una bacteria mesofila que necesita de temperaturas entre los 25 y 30C para su


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optimo crecimiento y la temperatura de incubacin fue de 43C debido a que los

otros grupos estaban trabajando la practica con microoganismos termfilos y la

incubadora era la misma para todos los grupos de trabajo, o tambin pudo ser

causado debido a una mala preparacin del medio de cultivo. Este resultado no

puede ser atribuido a la viabilidad del inoculo ya que el inoculo era viable lo cual

se confirmo debido al cambio de pH y de la acidez en la leche al igual que la

consistencia del cultivo ya que al cabo de 2 horas de incubacin se torno mas

viscoso y presento un cambio en el olor, lo cual indica que los micoorganismos

estaban viables y estaba realizando todas sus actividades metabolicas, as como

tampoco se le puede atribuir este resultado a la inhibicin de los lactococcus por la

competencia con otros microorganismos porque no hubo crecimiento de ningn

tipo de microorganismo. Estos resultados son evidenciados en la figura 2, 3 y 4.

En el control del medio tampoco se presento crecimiento de ningn tipo de

microorganismo lo cual refleja que hubo un buen manejo de las muestras

(esterilidad) en la siembra.

En un medio lacteo debido a la presencia y desarrollo de ciertos microorganismos

que atacan a la lactosa produciendo cido lctico, se produce un aumento de a la

acidez titulable y por consiguiente una variacin del pH del medio. Es entonces

que a pH de 4.6 las micelas de casenas coalescen en forma de cadenas o

conglomerados para formar estructuras tridimensionales en la cual queda

atrapado el suero, cuando el pH es mayor de 5.4 las micelas de casena

mantienen su estado(100 - 200nm) y cuando el pH alcanza valores 4.8-4.3 las

partculas de casena forman grandes conglomerados que atrapan la grasa y el

suero, debido a la asociacin de la kapacaseina y -lactoglobulina y la -

lactoalbuminas lo que aumenta la capacidad de retencin de agua y favorece el

aumento de slido y la alta viscosidad en el cultivo. Es entonces como a mayor

acidez se disminuye el pH y se da el aumento de solidos.

Uno de los problemas principales que podemos encontrar en un producto lcteo

como el yogurt o el kumis es la presencia de levaduras en altos porcentajes.

Cuando la poblacin de levaduras alcanza poblaciones entre 100000 y 1 millon de

UFC/ml dentro de un producto puede generar un exceso de gas lo cual ocaciona

la deformacin de los envases donde estn contenidos o incluso la explosin de

los mismo debido a la rpida transformacin de los azucares fermentables.

Adems el metabolismo de un alto contenido de levaduras produce la aparicin

de olores y sabores desagradables, los sabores se deben al exceso de etanol

generado y los malos aromas y olores estn asociados a la produccin de

acetaldehdos, acido actico, etil acetato o acetoina. Por otro lado se puede

generar clulas que formen colonias en la superficie del producto lo cual puede

producir la decoloracin o la formacin de capas mucosas o turbidez en este.


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Loshongos y levaduras solo son convenientes en cantidad limitada en la primera

fase de la fermentacin. Cantidades mayores de levaduras y de hongos, por su

intensometabolismo aerobio destruyen en breve tiempo cantidades relativamente

grandes de hidratos de carbono que sern necesario para la formacin de cido

lctico, y adems ciertas levaduras y hongos consumen el cido lctico,

resultando la elevacin del pH y la aparicin de bacterias proteolticas que pueden

causar alteraciones.

CONCLUSIONES

Cuando hay un aumento en el tiempo de incubacin de los microorganismos

acido lacticos se realiza en mayor proporcin el metabolismo de estos sobre

la lactosa lo que produce un aumento considerable de la acidez debido a la

relativa conversin a acido lctico y obliga al posterior descenso del pH.

Los microorganismos Lactococcus Lactis subs. cremoris y Lactococcus Lactis

subs. Lactis presentes en el kumis se desarrollan fcilmente dentro de cultivos

donde se mantienen adecuadas las temperaturas de crecimiento y resultan en

gran proporcin cuando las concentraciones de solidos son mayores ya que

dichos microorganismos necesitan de gran cantidad de sustrato para

incrementar la velocidad de crecimiento.

Despus de la experiencia se puede notar que los distintos microorganismos

presentes en los kumis y yogurt se comportan de formas distintas en cuanto asu metabolismo sobre los medios lcticos desarrollando diferentes grados de

acidez debido a las variaciones en el crecimiento de estos microorganismos

de acuerdo a su tiempo y temperatura de incubacin.

A mayor produccin de acido lctico hay un descenso de potencial de iones de

hidrgenos libres los que lo que estimula la coagulacin de protenas debido al

aumento de retencin de suero, esto se ve reflejado en incremento de la

viscosidad.
http://www.monografias.com/trabajos10/hongo/hongo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/metabolismo/metabolismo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/metabolismo/metabolismo.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos10/hongo/hongo.shtml


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%slidos

pH (0 min) pH (30 min) pH (60 min)

8 6,23 6,11 6,02

12 6,19 6,09 6

16 6,03 5,94 5,89

Tabla 1: variacin del pH respecto al % de slidos y al tiempo de incubacin

Grafica 1: incremento de slidos Vs pH en el tiempo

%slidos

Acidez (0min)

Acidez (30min)

Acidez(60min)

8 0,972 0,981 1,044

12 1,26 1,323 1,395

16 1,575 1,611 1,665

Tabla 2: variacin de la acidez respecto al % de slidos y al tiempo de

incubacin

5.85

5.9

5.95

6

6.05

6.1

6.15

6.2

6.25

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Tiempo (min)

Incremento de solidos Vs pH

8%

12%

16%


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Grafica 2: incremento de slidos Vs Acidez en el tiempo

Figura 1: cultivos lcticos con 8%, 12% y 16% de slidos

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 10 20 30 40 50 60 70

Acidez(%

deacidolactico)

Tiempo (min)

Incremento de solidos Vs Acidez

8%

12%

16%


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Figura 2: resultados siembra en profundidad en tiempo 0, para las diluciones

(10-1,10-2y 10-3) del cultivo lctico al 16% de slidos

Figura 3: resultados siembra en profundidad en tiempo 1 (60 min), para las

diluciones (10-1,10-2y 10-3) del cultivo lctico al 16% de slidos


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Figura 4: resultados siembra en profundidad en tiempo 2 (120 min), para las

diluciones (10-1,10-2y 10-3) del cultivo lctico al 16% de slidos

Figura 5: resultados control del medio


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EVALUACION DE CULTIVOS LACTICOS

URIEL FELIPE OROZCO SUAREZ

CARMEN LUCIA ESPINOSA ARAUJO

MARCELA VILLALBA CADAVID

MSc Biotecnologia

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS

PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

SEDE BERASTEGUI

2011-02-26


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Evaluacion de Cultivos Lacticos