Evaluation of Factors Affecting the Survival of Escherichia Coli in 6

8/10/2019 Evaluation of Factors Affecting the Survival of Escherichia Coli in 6

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E v a l u a t i o no f F a c t o r sA f f e c t i n gt h eS u r v i v a lo f E s c h e r i c h i ac o l ii nS e a W a t e r

V I . C y s t e i n e

P . V . S C A R P I N O 2A N D D AV I D PRAMERD e p a r t m e n to f A g r i c u l t u r a lM i c r o b i o l o g y ,R u t g e r s , T h e S t a t e U n i v e r s i t y ,N ew B r u n s w i c k ,N ew J e r s e y

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n A p r i l 4 , 1 9 6 2

A B S T R A C T

S C A R P I N O ,P . V . R u t g e r s ,T h e S t a t e U n i v e r s i t y ,N e wB r u n s w i c k ,N . J . )A N DD A V I DP R A M E R .E v a l u a t i o no ff a c t o r sa f f e c t i n gs u r v i v a lo f E s c h e r i c h i ac o l ii n s e aw a t e r .V I . C y s t e i n e .A p p l . M i c r o b i o l .1 0 : 4 3 6 - 4 4 0 .1 9 6 2 . - T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n d e a t ho f c e l l so f E s c h e r i c h i ac o l ii na r t i f i c i a ls e a w a t e ra n d t i m e w a se s t a b l i s h e da s l i n e a r ,a n d

s t a t i s t i c a lt e s t s d e m o n s t r a t e dt h a t t h e m o s t s u i t a b l em e a s u r eo fs u r v i v a lw a sl o gp e r c e n t a f t e r2 4 h r .S u r v i v a lo fE . c o l i i n w a t e r s u p p l e m e n t e dw i t h c y s t e i n ea t l e v e l so f0 . 2 8 4 X 1 0 - 6t o 2 8 4 X 1 0 - 6 M w a s i n c r e a s e dg r e a t l yo v e rt h a t i n u n t r e a t e dw a t e r . T o p r o v i d ea n i n s i g h ti n t ot h em o d eo f a c t i o no f c y s t e i n e ,t h e e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no fv a r i o u ss u l f h y d r y la n d d i s u l f i d ec o m p o u n d sw a s m e a s -u r e d ,a n d t h ei n f l u e n c eo f s e v e r a lc o m p o u n d st h a t l a c kaf u n c t i o n a ls u l f u rg r o u pb u t w h i c ha r e c a p a b l eo f a f f e c t i n go x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a lw a s d e t e r m i n e d .M o r e o v e r ,a n u m b e ro f s u b s t a n c e sr e l a t e ds t r u c t u r a l l yt o c y s t e i n ew e r e t e s t e dt o a s c e r t a i nt h e i ri n f l u e n c eo n t h e s u r v i v a lo fc e l l so f E . c o l ii n a r t i f i c i a ls e a w a t e r . I t a p p e a r e dt h a tt h e

b e n e f i c i a le f f e c to f c y s t e i n ew a s n o t d u e t o t h e s u l f h y d r y lg r o u po f t h ea m i n oa c i do r t o t h e a b i l i t yo f t h e c o m p o u n dt o i n f l u e n c eo x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a l .S o m e s u l f -h y d r y l c o m p o u n d sh a d n o f a v o r a b l ee f f e c ta n d , i n g e n e r a l ,d i s u l f i d e sw e r e m o r e a c t i v et h a n t h e c o r r e s p o n d i n gs u l f -h y d r y lc o m p o u n d s .S u b s t a n c e st h a t l a c k a f u n c t i o n a ls u l f u rg r o u p b u t i n f l u e n c eo x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a lh a d n os i g n i f i c a n ta c t i v i t y .T h e b e n e f i c i a le f f e c to f a n u m b e ro fc o m p o u n d sr e l a t e ds t r u c t u r a l l yt o c y s t e i n ei n d i c a t e st h a tb o t h a n a m i n oa n d c a r b o x y lg r o u pa r e r e q u i r e df o ra c t i v -i t y. I t i s s u g g e s t e dt h a tc y s t e i n ea n d o t h e r a m i n oa c i d sa c t t o i n c r e a s es u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s e a w a t e rb y ac h e l a t i o nm e c h a n i s m .

J o h a n n e s s o n 1 9 5 7 )r e p o r t e dt h a t l o w l e v e l so f c y s t e i n eg r e a t l yi n c r e a s es u r v i v a lo f c e l l so f E s c h e r i c h i ac o l ii n s e aw a t e r . H e s u g g e s t e dt h a t i o d a t ei s r e s p o n s i b l ef o r t h er a p i dd e a t ho f b a c t e r i ai n a m a r i n ee n v i r o n m e n ta n d t h a t

1 P a p e ro f t h e J o u r n a lS e r i e s ,N e w J e r s e yA g r i c u l t u r a lE x p e r i -ment S t a t i o n ,N e w B r u n s w i c k ,N . J .

2 P r e s e n t a dd r e s s :F a i r l e i g h D i c k i n s o nC o l l e g e . R u t h e r f o r d ,N . J .

c y s t e i n ee x e r t sa p r o t e c t i v ei n f l u e n c e a sa r e s u l to f i t sr e a c t i v i t yw i t h h a l a t e s .S h a w a n d C o o p e r 1 9 5 7 )r e v i e w e dt h e m e c h a n i s mo f i o d i n eo x i d a t i o ni n s e aw a t e r a n d c o n -c l u d e dt h a t i o d a t ei s n o t a l i k e l yp r o d u c t .T h e ys u g g e s t e dt h a tt h e o x i d i z e df o r mo f i o d i n ep r e s e n t i n s e aw a t e ri s a ne q u i l i b r i u mm i x t u r eo f i o d i d ea n d h y p o i o d i o u sa c i d .T h i sv i e ww a s c h a l l e n g e db y S u g a w a r aa n d T e r a d a 1 9 5 8 )a n dJ o h a n n e s s o n 1 9 5 8 )a n d r e m a i n st o b e c l a r i f i e d .

T h e b e n e f i c i a le f f e c to f c y s t e i n eo n t h e s u r v i v a lo fE . c o l ii n n a t u r a l s e aw a t e rw a sc o n f i r m e db y C a r l u c c ia n dP r a m e r 1 9 6 0 b ) ,a n d t h e a m i n oa c i dw a s d e mo n s t r a t et o h a v e a s i m i l a re f f e c ti n a r t i f i c i a ls e aw a t e r C a r l u c cS c a r p i n o ,a n d P r a m e r , 1 9 6 1 ) .T h i s a c t i v i t yo f c y s t e i nw a so f s u f f i c i e n ti n t e r e s tt o w a r r a n tf u r t h e rs t u d y ,a n d t h ep r e s e n t r e p o r t s u m m a r i z e st h e r e s u l t so f a s e r i e so f i n -v e s t i g a t i o n su s i n ga r t i f i c i a ls e aw a t e rt o p r o v i d ea n i n s i g hi n t o t h e m e c h a n i s mb y w h i c h t h e a m i n oa c i da c t s t oi n c r e a s et h e s u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l i

M AT E R I A L SA ND M E T H O D S

D e t a i l e dd e s c r i p t i o n so f t h e m e t h o d se m p l o y e df o r t h ep r e p a r a t i o na n d u s e o f i n o c u l a ,t r e a t m e n ta n d s t o r a g eo fw a t e r s a m p l e s ,a n d o f t h e e n u m e r a t i o no f E . c o l ii n s e aw a t e r w e r e p r e s e n t e dp r e v i o u s l y C a r l u c c ia n d P r a m e r ,1 9 6 0 a ) .A r t i f i c i a ls e a w a t e r w a s p r e p a r e da c c o r d i n gt oM a c L e o da n d O n o f r e y 1 9 5 6 ) .T h i s f o r m u l a t i o nw a sd e m o n s t r a t e d C a r l u c c ie t a l 1 9 6 1 )t o e x e r t a m a r k e db a c t e r i c i d a la c t i o nt h a ti s o f f s e tb y c y s t e i n e .

C u r v e sd e p i c t i n gt h ed e a t h o f c e l l so f E . c o l ia d d e dt on a t u r a l s e a w a t e r c o l l e c t e do f f t h e N ew J e r s e y c o a s ts h o w e da n i n i t i a ll a g p h a s e o f a p p r o x i m a t e l y2 4 h r , ap e r i o do f l i n e a rd e c l i n eo r l o g a r i t h m i cd e a t h l a s t i n g4 8 t o7 2 h r , a n d ,f i n a l l y,a n e q u i l i b r i u mp h a s e i n w h i c h t h ec u r v e b e c a m ea s y m p t o t i c C a r l u c c ia n d P r a m e r , 1 9 6 0 aT h e r e f o r e ,p r e v i o u sp a p e r s o f t h i s s e ri esr e p o r t e ds u r v i vi n t e r m s o f p e r c e n t a f t e r4 8 h r . T h i s t e r m i n a lp e r i o dwa so n t h e l i n e a rp o r t i o no f t h e c u r v e s a n d p r o v i d e da c o n -v e n i e n tm e a s u r eo f t h e i n f l u e n c eo f v a r i o u sf a c t o r so n t h es u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l i i n s e a w a t e r C a r l u c c ia n dP r a m e r ,1 9 6 0 b ,c d ; C a r l u c c ie t a l 1 9 6 1 ) .C u r v e so b t a i n e db y t h e p e r i o d i ce n u m e r a t i o no f c e l l so f E . c o l ia d d e d t oa r t i f i c i a ls e a w a t e r d i f f e r e df r o m t h o s e o b t a i n e d w i t h

4 3 6


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S U RV I VA LO F E . COLI I N S E A WATER

n a t u r a l s e a w a t e r i n t h a t no l a g p e r i o d p r e c e de dl o g -a r i t h m i c d e a t h . S t a t i s t i c a la n a l y s e s u s i n gB a r t l e t t st e s t ,a s d e s c r i b e db y D i x o n a n dM a s s e y 1 9 5 7 ) ,d e m o n s t r a t e dt h a t t h e v a r i a n c e so f l o gpe r c e n t s u r v i v a lv a l u e s wereh o m o g e n e o u s ,w h e r e a st h o s e f o r p e r c e n t s u r v i v a l weren o t . A c c o r d i n g l y ,m e a s u r e m e n t so f s u r v i v a lo f E . c o l ii na r t i f i c i a ls ea w a t e r a re r e p o r t e d a n d c o m p a r e da s l o gp e rc e n t s u r v i v a l ,r a t h e r t h a n p e r c e n t s u r v i v a l ,a t t h e e n d o f2 4 h r . T h e s m a l l e ro r more n e g a t i v et h e v a l u e , t h e morer a p i d was t h e d e c r e a s ei n n u m b e ro f v i a b l ec e l l s .

To e s t a b l i s ht h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt i m e a n d s u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n a r t i f i c i a ls ea w a t e r , 3 6 f l a s k s ,e a c h c o nt a i n i n g1 0 0 m l o f a r t i f i c i a ls ea w a t e r , were i n o c u l a t e de q u a l l y w i t h a s u s p e n s i o no f c e l l so f t h e t e s t o r g a n i s m .T h e f l a s k swere i n c u b a t e da t 2 8 C w i t h o u ta g i t a t i o n ,a n ds u r v i v a l was m e a s u r e di n t r i p l i c a t ea t 2 - h r i n t e r v a l sf o r2 4 h r , u s i n gs e p a r a t ef l a s k sa t e a c h t e s t p e r i o d .R e g r e s s i o na n a l y s i ss h o w e dt ha t t he l a c k o f f i t o f t h e d a t a t o a l i n e a rm o d e l was n o t s i g n i f i c a n ta t t h e 9 5 c o n f i d e n c el e v e l ,a n d i t was c o n c l u d e dt h a t a s t r a i g h tl i n ea d e q u a t e l yd e -

s c r i b e d t h e r e l a t i o nb e t w e e ns u r v i v a l o f c e l l so f E . c o l ii n a r t i f i c i a ls ea w a t e r a n d t i m e .The c a l c u l a t e dr e g r e s s i o ne q u a t i o nwas l o gy = 6 . 4 7 7 4 7 . 1 2 6 7 5x , w h e r ey i s t h en u m b e ro f v i a b l eb a c t e r i a / m la n d x i s t h e t i m e i n h r . T h ef i t o f t h i s l i n e t o t h e e x pe r i m e n t a l d a t ai s i l l u s t r a t e di nF i g .1

Th e t s t a t i s t i cwas u s e d t o c a l c u l a t ev a l u e s f o r t h er e q u i r e dd i f f e r e n c eb e t w e e nt w o means f o rs i g n i f i c a n c ea t ap r o b a b i l i t yl e v e lo f 9 5 . T h e e q u a t i o ne m p l o y e dw a s :

Xl X2 i t s 1

w h e r ex i i s t h emean

o f s a m p l e1 ; X 2 i S t h e mean o f s a m p l e2 ; n 1 i s t h e number o f o b s e r v a t i o n si n x 1 ; n 2 i s t h e numbero f o b s e r v a t i o n si n X 2 ; t i s t h e v a l u ea t t h e d e s i r e dc o n f i d e n c el e v e l ;a n d s i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . S i n c e t hep r e s e n ti n v e s t i g a t i o n se m p l o y e ds i n g l eo b s e r v a t i o n so n l y ,n i =n 2 = 1 a n d s o l u t i o n o f t h e a b o v ee x p r e s s i o ny i e l d e d av a l u e o f 0 . 6 2 2 f o r t h e m i n i m a ld i f f e r e n c et h a t h a d t o b eo b t a i n e db e t w e e nt w o l o gper c e n t v a l u e sf o r s i g n i f i c a n c ea t a c o n f i d e n c el e v e lo f 9 5 . I t was assumed t h a t t h ev a r i a n c e sd e t e r m i n e df o r t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ssum-m a r i z e di n F i g .1 a p p l i e dt h r o u g h o u tt h e s e i n v e s t i g a t i o n s ,a n d t h e c a l c u l a t e dd i f f e r e n c e b e t w e e nmeans 0 . 6 2 2l o gu n i t s )r e q u i r e df o r s i g n i f i c a n c ea t t h e 9 5 e v e lo f p r o b -

a b i l i t ywas a p p l i e dg e n e r a l l y .

RESULTS AND D I s c u s s I o N

Th e i n f l u e n c eo f c o n c e n t r a t i o no f c y s t e i n eon s u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n a r t i f i c i a ls ea w a t e r is e v i d e n tf rom t h er e s u l t sl i s t e di n T a b l e 1 . T h e b a c t e r i u mb e n e f i t e d s i g -n i f i c a n t l y P = 0 . 0 5 )f r o m0 . 2 8 4 X 1 0 - 6 M. G r e a t e r c o nc e n t r a t i o n s 2 . 8 4 - 2 8 4X 1 0 - 6 M ) were more f a v o r a b l eb u th a d e q u a la c t i v i t ya t t h e 9 5 c o n f i d e n c el e v e l .A c y s t e i n ec o n c e n t r a t i o no f 2 , 8 4 0 X 1 0 - 6 M d e c r e a s e dt h e r e a c t i o n

o f t h e s y s t e mf r o mpH 8 . 1 t o 3 . 8 ,a n d s u r v i v a lo f c e l l so fE . c o l iwas i n f l u e n c e d a d v e r s e l y .

T h e f a v o r a b l ee f f e c to fc y s t e i n emay r e s u l tf r o mr e a c t i o no f t h e s u l f h y d r y lgroup w i t h t o x i ch a l a t e s ,a s s u g g e s t e db y J o h a n n e s s o n 1 9 5 7 ) ,b u t t h e r ea re o t h e r p o s s i b i l i t i e sw o r t h y o f c o n s i d e r a t i o n .T h e a b i l i t yo f a m i n oa c i d st oc h e l a t em e t a l s i s w e l le s t a b l i s h e d M a r t e l l a n d C a l v i n ,1 9 5 2 ; G r e e n s t e i na n d W i n i t z , 1 9 6 1 ) ;c y s t e i n emay e x e r t af a v o r a b l ee f f e c tb y r e m o v a lo f m e t a l sp r e s e n t i n s ea w a t e ra t t o x i cl e v e l s ,o r b y s o l u b i l i z i n ga n d t h e r e b y r e n d e r i n g

7 . 0 1

-i

C

w

w

5 :

0 i4 i

14

C, )

6 . 0

5.0

4 . 0

3 . 0

LOG Y 6 . 4 7 7 4 7 - O 0 . 1 2 67 X

4 8 1 2 1 6 20 24

H O U R SF I G . 1 . R e l a t i o n s h i pb e t w e e ns u r v i v a lo f c e l l so f E s c h e r i c h i ac o l i

i n a r t i f i c i a ls ea w a t e ra n d t i m e .

TA B L E 1 . I n f l u e n c eo f c o n c e n t r a t i o no f c y s t e i n eo n s u r v i v a lo fE s c h e r i c h i ac o l ii n s e a w a t e r

C y s t e i n ea d d e d S u r v i v a la f t e r2 4 h r

M X 1 J O l o g

0 2 .4560 . 2 8 4 - 0 . 8 7 62 . 8 4 1 . 2 5 0

2 8 . 4 1 . 0 4 12 8 4 . 0 0 . 7 9 8

2 , 8 4 0 . 0 - 2 . 3 0 1

1 9 6 2 ] 4 3 7


3/5

S C A R P I N OAND PRAMER

r e q u i r e dt r a c e m e t a l smore a v a i l a b l et o c e l l s .I t i s f e a s i b l ea l s ot h a t c y s t e i n ea c t s b y m o d i f y i n gt h e o x i d a t i o n - r e d u c -t i o np o t e n t i a lo f s e a w a t e r , w h i c h i s p o o r l y p o i s e d .T od e t e r m i n ew h i c hi f any o f t h e s ep o s s i b i l i t i e swas t h e morep r o b a b l e ,t h e i n f l u e n c eo f v a r i o u ss u l f h y d r y la n d d i s u l f i d ec o m p o u n d son t h e s u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s e a w a t e rwas m e a s u r e d .M o r e o v e r ,t h e e f f e c to f c o m p o u n d sw h i c hl a c ka f u n c t i o n a ls u l f u rgroup b u t a re c a p a b l eo f a f f e c t i n go x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a lwas d e t e r m i n e d .

S u l f h y d r y lc o m p o u n d s .E a c ho f t h e f o l l o w i n g s u l f h y d r y lc o m p o u n d swas t e s t e da t c o n c e n t r a t i o n so f 0 . 0 2 8 4 - 2 8 . 4X1 0 - 6M f o r i t s e f f e c ton s u r v i v a lo f E . c o l ii n s ea w a t e r :c y s t e i n e ,c y s t e a m i n e ,B r i t i s h A n t i - L e w i s i t e B A L ) ,g l u t a -t h i o n e , t h i o g l y c o l a t e ,a n d t h i o s u l f a t e .T h e i n o r g a n i ccom-p o u n d , s o d i u mt h i o s u l f a t e ,was r e p o r t e d b y N o b l ea n dG u l l a n s 1 9 5 5 t o i n c r e a s et h e s u r v i v a lt i m e o f c e l l so fc o l i f o r mo r g a n i s m si n l a k e w a t e r . E a c h o f t h e s i x com-p o u n d si s a b l e t o i n f l u e n c eo x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a l ,c h e l a t eh e a v ym e t a l s , a n d r e a c t w i t h h a l a t e s .

T h e s u r v i v a lt i m e o f c e l l s was s h o r t e ri n w a t e r t h a t

r e c e i v e dc y s t e a m i n et h a n i n u n t r e a t e dw a t e r . B y a p p l y i n gt h e v a l u e o f 0 . 6 2 2 l o g u n i t s a s t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nmeans r e q u i r e d f o r s i g n i f i c a n c e ,i t was c o n c l u d e dt h a tB A La n d g l u t a t h i o n e ,a t a c o n c e n t r a t i o no f 2 8 . 4X 1 0 - 6 Mo n l y ,i n c re a s e d s u rv i v a lo f t h e t e s t o r g a n i s mi n s ea w a t e r .T h i o g l y c o l a t ea n d t h i o s u l f a t eh a d no e f f e c t .S u r v i v a lo fc e l l so f E . c o l iwas b e n e f i t e dc o n s i s t e n t l y ,a n d t h e e f f e c twas a f u n c t i o no f c o n c e n t r a t i o no n l y i n t h e c a s e o f cyst e i n e ;i t a p p e a r e dt h a t t h e a b i l i t yo f t h i sc o m p o u n dt oi n c r e a s es u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s ea w a t e rwas n o t d u es o l e l yt o t h e s u l f h y d r y lgroup.

D i s u l f i d ec o m p o u n d s .T h e i n f l u e n c e o ft h e f o l l o w i n gd i s u l f i d ec o m p o u n d son s u r v i v a l o f c e l l so f E . c o l ii n s ea

w a t e rwas m e a s u r e d :c y s t a m i n e ,c y s t i n e ,a n d h y d r o s u l f i t e .E a c hwas t e s t e d a t f o u r l e v e l s ,v a r y i n gf r o m0 . 0 2 8 4 - 2 8 . 4X1 0 - 6 M. A l l h a v e b e e n r e p o r t e d t o p r o t e c t c e l l sf r o m t h ed a m a g i n ge f f e c to f i o n i z i n gr a d i a t i o n K e l n e re t a l 1 9 5 5 ) .

The r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t b o t h c y s t a mi n ea n dc y s t i n es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d s u rv i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s ea w a t e r . C y s t a m i n ewas e f f e c t i v ea t 0 . 2 8 a n d 2 . 8 4 X1 0 - 6 M o n l y ,w h e r e a sc y s t i n ewas b e n e f i c i a lt h r o u g h o u tt h e c o n c e n t r a t i o nr a n g e t e s t e d a nd s u r v i v a l o f t h e t e s to r g a n i s mi n c r e a s e dw i t h e a c hi n c r e a s e i n c y s t i n el e v e l .I n w a t e r c o n t a i n i n g2 . 8 4 a n d 2 8 . 4 X 1 0 - 6 M c y s t i n e ,s u rv i v a l o f t h e t e s tb a c t e r i u mwas a p p r o x i m a t e l y4 , 0 0 0t i m e s

g r e a t e r t h a n i n u n t r e a t e dw a t e r . T h e i n o r g a n i cd i s u l f i d e ,s o d i u mh y d r o s u l f i t e ,was i n e f f e c t i v e a t a l l c o n c e n t r a t i o n st e s t e d .

C o m p o u n d sa f f e c t i n go x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a l .Measu r e m e n t swere m a d e t o d e t e r m i n ew h e t h e r c o m p o u n d st h a t l a c k e d f u n c t i o n a ls u l f u r groups b u t w e r e c a p a b l eo f

i n f l u e n c i n go x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a lh a d a n y e f f e c ton s u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s ea w a t e r . T h e s u b s t a n c e st e s t e d w e r e a l p h a - t o c o p h e r o l ,a s c o r b i c a c i d ,m e n a d i o n e ,a n d r i b o f l a v i n e .Each compound was t e s t e d a t f o u r c o n

c e n t r a t i o n s ,r a n g i n gf r o m 0 . 0 2 8 t o 2 8 . 4 X 1 0 - 6M ; i n nc a s ew a sa s i g n i f i c a n te f f e c to b s e r v e d .

T h e r e s u l t so f t h e f o r e g o i n gs t u d i e ss u g g e s t e dt ha t t ha b i l i t y o ft h e c y s t e i n em o l e c u l et o i n c r e a s et h e s u r v it i m e o fc e l l so fE . c o l ii n s e a w a t e ri n v o l v e dm o r et h a n t hp r e s e n c et h e r e i no f a s u l f h y d r y lg r o u p o r t h e a b i l i t yti n f l u e n c eo x i d a t i o n - r e d u c t i o np o t e n t i a l .I n a f u r t he f f or t t oc l a r i f yt h e m o d e o f a c t i o n o f c y s t e i n e ,a s e r i e sos t u d i e sw a s p e r f o r m e dt o r e l a t em o l e c u l a rc o n f i g u r aa n d a c t i v i t y .

C o m p o u n d sr e l a t e ds t r u c t u r a l l yt o c y s t e i n e .T a b l e 2 s u mm a r i z e st h e r e s u l t so f s i x s e p a r a t e e x p e r i m e n t si n w h it h e e f f e c t so f c y s t e i n ea n d 1 8 o t h e r c o m p o u n d so n s u r v io fE . c o l ii n a r t i f i c i a ls e aw a t e r w e r ec o m p a r e da t a c o n c et r a t i o no f 2 8 . 4X 1 0 - 6 M .

I t i s a p p a r e n t t h a t s o m e c o m p o u n d sd e m o n s t r aa c t i v i t yt h a t w a s a s g r e a ta s o r g r e a t e rt h a n t h a t o f c yt e i n e .T h i s w a s t r u eo f s e r i n e ,m e t h i o n i n e ,g l u t a m i ca c ir e d u c e da n d o x i d i z e d g l u t a t h i o n e ,c y s t i n e ,h o m o c y s t e i

T A B L E2 . I n f l u e n c eo f c y s t e i n ea n d r e l a t e dc o m p o u n d so n s u r v io f E s c h e r i c h i ac o l i i n s e a w a t e r

C o m p o u n da d d e d S u r v i v a la f t e r2 4

2 8 . 4X 1 0 - 6M l o g

E x p e r i m e n tI .N o n e ....................................... - 1 . 1 4 9C y s t e i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 4 4 4S e r i n e.. .... . . . . . . . . . . . 1 . 3 1 2M e t h i o n i n e. . . . . . . . . . . . . . . ........... 1 . 0 6 5N a - p y r u v a t e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 0 . 7 7 5G l u t a m i ca c i d m o n o h y d r a t e. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 0 0 4

E x p e r i m e n tI IN o n e .............. - 1 . 2 2 2C y s t e i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 3 9 1

A l a n i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 0 . 1 4 3N a - p r o p i o n a t e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 2 . 5 5 3G l y c i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 3 9 5N a - a c e t a t e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 3 . 1 5 5

E x p e r i m e n tI I IN o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .................... - 0 . 3 1 0C y s t e i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 6 8 0C y s t a m i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 1 . 5 2 3C y s t e a m i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 2 . 6 9 9G l u t a t h i o n e o x i d i z e d )...................... 1 . 9 2 7G l u t a t h i o n e r e d u c e d )........................ 1 . 5 4 8

E x p e r i m e n tI VN o n e ....................................... - 1 . 1 5 5C y s t e i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 7 1 3C y s t i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 4 1 7H o m o c y s t e i n et h i o l a c t o n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 1 2 1H o m o c y s t i n e. ................................ 1 . 1 5 8S e r i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 7 4 0

E x p e r i m e n tVN o n e ....................................... - 1 . 5 8 5C y s t e i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 4 0 7C y s t e i ca c i d .................................. 1 . 4 9 1T a u r i n e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 1 . 5 5 3

E x p e r i m e n tV IN o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 2 . 7 9 5C y s t e i n e...................................... 1 . 1 8 2A s p a r t i ca c i d ................................. 0 . 9 9 0

4 3 8 [ V O L 1


4/5

S U RV I VA LO F E . COLI I N S E A WATER

h o m o c y s t i n e ,c y s t e i ca c i d ,a n d a s p a r t i ca c i d .A l a n i n ea n dg l y c i n e i n c r e a s e dt h e s u r v i v a lt i m e o f c e l l so f t h e t e s tb a c -t e r i u mi n s e aw a t e r , b u t t h e m a g n i t u d eo f t h e e f f e c tw a sl e s s t h a n t h a t o b t a i n e d w i t h c y s t e i n e .P y r u v a t e a n dt a u r i n eh a d n o s i g n i f i c a n te f f e c t ,a n d t h e f o l l o w i n gc o m -p o u n d s w e r e d e t r i m e n t a lr a t h e r t h a n b e n e f i c i a l :p r o -p i o n a t e ,a c e t a t e ,c y s t a m i n e ,a n d c y s t e a m i n e .

I n g e n e r a l ,d i s u l f i d e sw e r e m o r e a c t i v et h a n t h e c o r -r e s p o n d i n gs u l f h y d r y lc o m p o u n d s .A t e q u a l m o l a r c o n -c e n t r a t i o n s ,c y s t i n ew a s m o r eb e n e f i c i a lt h a n c y s t e i n e ,h o -m o c y s t i n ew a s m o r e f a v o r a b l e t h a n h o m o c y s t e i n e ,b u to x i d i z e da n d r e d u c e dg l u t a t h i o n eh a d e q u a la c t i v i t y .E a c ho f t h et h r e ea m i n oa c i dm o i e t i e s c y s t e i n e ,g l u t a m i ca c i d ,a n d g l y c i n e )o f t h e g l u t a t h i o n em o l e c u l ew a s i n i t s e l fc a p a b l eo f e x e r t i n ga f a v o r a b l ei n f l u e n c eo n s u r v i v a lo fE . c o l i

T h e a b i l i t yo fa n a l o g u e so f c y s t e i n e s e r i n e ,t h e h y d r o x ya n a l o g u e ;c y s t e i ca c i d ,t h e s u l f o n i ca c i da n a l o g u e ;a n da s p a r t i ca c i d ,t he c a r b o x y la n a l o g u e )t o i n c r e a s et h e s u r -v i v a lt i m e o f c e l l so f E . c o l i i n s e aw a t e r i n d i c a t e st h a t

a c t i v i t yw a s n o t d e p e n d e n ts o l e l yo n t h e p r e s e n c ei n t h em o l e c u l eo fa s u l f h y d r y l g r o u p .A n a d d i t i o n a lc a r b o na t o mc a n b e a d d e d t o c y s t i n e h o m o c y s t i n e )a n d c y s t e i n e h o m o c y s t e i n e )w i t h o u tl o s so f a c t i v i t y .C o m p o u n d s m e -t h i o n i n ea n d g l u t a m i ca c i d )r e l a t e ds t r u c t u r a l l y t oh o m o -c y s t e i n eh a d a c t i v i t ye q u a l t o t h a to f c y s t e i n e .

D e c a r b o x y l a t i o no f c y s t e i n ey i e l d sc y s t e a m i n e ,w h i c hh a d n o b e n e f i c i a la c t i o n .T h e d i s u l f i d ec y s t a m i n ew a sa l s oi n a c t i v e .C y s t e i ca c i d ,t h e s u l f o n i ca c i da n a l o g u eo f c y s -t e i n e ,w a s e q u a l i n a c t i v i t yt o c y s t e i n e ,b u t t a u r i n e ,t h ec o m p o u n dt h a t r e s u l t sf r o m d e c a r b o x y l a t i o no f c y s t e i ca c i d ,w a s i n e f f e c t i v e .T h u s , i t a p p e a r s t h a tt h e c a r b o x y lg r o u p w a s f u n c t i o n a la n d o f s i g n i f i c a n c e .S e r i n ed e m o n -s t r a t e da c t i v i t ye q u a l t o t h a to f c y s t e i n e ,b u t r e d u c t i o no f t h eh y d r o x yg r o u p a l a n i n e ) r e s u l t e di n a m a r k e dd e -c r e a s e b u t n o t c o m p l e t el o s so fa c t i v i t y .

D e a m i n a t i o no f a l a n i n ey i e l d sp r o p i o n a t eo r p y r u v a t e ,a n d d e a m i n a t i o no f g l y c i n ey i e l d sa c e t a t e .T h e s eo r g a n i ca c i d sw e r e c o m p l e t e l yl a c k i n gi n a c t i v i t y ,w h e r e a st h ea m i n o a c i d ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s es u r v i v a lo f t h e t e s to r g a n i s mi n s e a w a t e r . I t i s o f i n t e r e s tt h a tt h i o g l y c o l a t e ,w h i c hp o s s e s s e sa s u l f h y d r y la n d c a r b o x y lg r o u pb u t l a c k sa n a m i n og r o u p , w a s f o u n dt o h a v e l i t t l eo r n o b e n e f i c i a le f f e c t .

From t h e f o r e g o i n gs t u d i e s ,i t a p p e a r s t h a t d i s u l f i d e

c o m p o u n d sa r e g e n e r a l l ymore a c t i v et h a n t h e i rs u l f h y d r y lc o u n t e r p a r t s ,b u t a s u l f u r - c o n t a i n i n gf u n c t i o n a lg r o u pi sn o t i n d i s p e n s i b l e .M o r e o v e r ,t h ea b i l i t yo f a c o m p o u n dt oi n c r e a s et h e s u r v i v a lt i m e o f c e l l so f E . c o l ii n s e a w a t e rd o e s n o t d e p e n do n t h e e a s e w i t h w h i c ht h e m o l e c u l ei so x i d i z e do r r e d u c e d .I t i s e v i d e n tt h a ts u b s t a n c e sw h i c hd on o t p o s s e s sb o t h a n a m i n oa n d c a r b o x y lg r o u ph a v e l i t t l eo r n o a c t i v i t y.B o t h s u b s t i t u e n t swere p r e s e n ti n e v e r yc o m p o u n dt h a te x e r t e da c o n s i s t e n ta n d s i g n i f i c a n tb e n e -f i c i a le f f e c t .T h e s e o b s e r v a t i o n sa r e n o t c o n s i s t e n tw i t ht h es u g g e s t i o no fJ o h a n n e s s o n 1 9 5 7 )t h a tc y s t e i n er e n d e r s

s e a w a t e rm o r ef a v o r a b l ef o rs u r v i v a lo fE . c o l ib y r e a c t i oo f t h e s u l f h y d r y lg r o u po f t h ea m i n oa c i dw i t h i o d a t e ,b u tt h e y a r ec o n s i s t e n tw i t h t h e p o s s i b i l i t yt h a t c y s t e i n ea c t st o f a v o rs u r v i v a lo f c e l l so f E . c o l ii n s e aw a t e rb y a c h e l at i o nm e c h a n i s m .

T h e a b i l i t y o fa m i n oa c i d st o c h e l a t em e t a l s i s w e l le s t a b l i s h e d ;t h e g r o u p sd e s c r i b e db y M a r t e l l a n d C a l v i n

1 9 5 2 )a n d G r e e n s t e i na n d W i n i t z 1 9 6 1 a s m o s t f u n c -t i o n a li n t h e r e a c t i o ni n c l u d eR-NH2 p r i m a r y a m i n o ) ,R-OH h y d r o x y l ) ,R-SH s u l f h y d r y l ) ,R-COOH

0

c a r b o x y l ) ,a n d R-S-OH s u l f o n i c ) .T h e s ea r e t h e v e r y 0

s u b s t i t u e n t sp r e s e n t i n t h e c o m p o u n d sc a p a b l eo f i n c r e a si n g t h es u r v i v a lt i m e o f c e l l so f E . c o l ii n s e aw a t e r . S e r i n eh a d a c t i v i t ys i m i l a rt o t h a t o f c y s t e i n e ,i n d i c a t i n gt h es u l f h y d r y lg r o u po f t h e l a t t e rc o m p o u n dw a s r e p l a c e a bb y a h y d r o x y lg r o u p . M o r e o v e r ,t h e b e n e f i c i a le f f e c t s oc y s t e i ca n d a s p a r t i ca c i dd e m o n s t r a t e dt h a t i t i s p o s s i b lt o s u b s t i t u t ea s u l f o n i co r c a r b o x y lf o r t h e s u l f h y d rg r o u p o f c y s t e i n ew i t h o u ts i g n i f i c a n tl o s so f a c t i v i t y .I nt h ec a s eo f a l a n i n e ,w h i c hd i f f e r sf r o mc y s t e i n ei n t h a ti tc o n t a i n sa h y d r o g e na t o mi n p l a c eo f t h es u l f h y d r y lg r o u p ,a c t i v i t yw a s d e c r e a s e dg r e a t l yf r o m t h a t o f c o m p o u n dh a v i n gs u b s t i t u e n t sm o r ee f f e c t i v ea s e l e c t r o nd o n o r s i nc h e l a t i o nr e a c t i o n s .O n t h e b a s i so f t h ef o r e g o i n gs t u d i e si t i s s u g g e s t e dt h a t c y s t e i n ea c t st o i n c r e a s e s u r v i v ao fc e l l so fE . c o l ii n s e aw a t e rb y v i r t u eo f i t sa b i l i t yt o c h e l a tm e t a l i o n s .H o w e v e r ,f u r t h e rs t u d y i s r e q u i r e d b e f o r et h i sp o s s i b i l i t yi s e s t a b l i s h e da s f a c t .

ACKNOWLEDGMENTST h e a u t h o r sw i s h t o e x p r e s st h e i ra p p r e c i a t i o nt o C . L .

G r a n t ,E n g i n e e r i n gE x p e r i m e n tS t a t i o n ,U n i v e r s i t yo fN ew H a m p s h i r e ,w h oa s s i s t e di n t h ed e s i g no fe x p e r i m ea n d p e r f o r m e dt h e s t a t i s t i c a la n a l y s e s .

T h i s i n v e s t i g a t i o nw a s s u p p o r t e di n p a r t b y r e s e a r cg r a n t E 1 4 3 7f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t eo f A l l e r g ya n dI n f e c t i o u sD i s e a s e s ,U . S . P u b l i cH e a l t hS e r v i c e .

L I T E R ATU R E C IT E D

C A R L U C C I ,A . F . , A N DD . PRAMER.1 9 6 0 a .A n e v a l u a t i o no f f a c t o r sa f f e c t i n gt h e s u r v i v a lo f E s c h e r i c h i ac o l ii n s e a w a t e r . I E x -p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s .A p p l .M i c r o b i o l .8 : 2 4 3 - 2 4 7 .

C A R L U C C I ,A . F . , A N DD . PRAMER.1 9 6 0 b .A n e v a l u a t i o no f f a c t o r sa f f e c t i n gt h e s u r v i v a l o f E s c h e r i c h i ac o l i i n s e a w a t e r . I I .S a l i n i t y ,p H , a nd n u t r i e n t s . A p p l .M i c r o b i o l .8 : 2 4 7 - 2 5 0 .

C A R L U C C I ,A . F . , A N DD . P R A M E R .1 9 6 0 c .A n e v a l u a t i o no f f a c t o r sa f f e c t i n gt h e s u r v i v a l o f E s c h e r i c h i ac o l i i n s e a w a t e r . I I I .A n t i b i o t i c s .A p p l . M i c r o b i o l .8 : 2 5 1 - 2 5 4 .

C A R L U C C I ,A . F . , A N DD . P R A M E R .1 9 6 0 d .A n e v a l u a t i o no f f a c t o r sa f f e c t i n gt he s u r v i v a lo f E s c h e r i c h i ac o l i i n s e a w a t e r . I V .B a c t e r i o p h a g e s .A p p l . M i c r o b i o l .8 : 2 5 4 - 2 5 6 .

C A R L U C C I ,A . F . , P . V . S C A R P I N O ,A N DD . P R A M E R .1 9 6 1 .E v a l u a -t i o n o f f a c t o r s a f f e c t i n g t h e s u r v i v a l o f E s c h e r i c h i ac o l i i ns e a w a t e r . V . S t u d i e sw i t hh e a t - a n d f i l t e r - s t e r i l i z e ds e a w a t e r .A p pl . M i cr ob i o l .9 : 4 0 0 - 4 0 4 .

1 9 6 2 ] 4 3 9


5/5

S C A R P I N OAND PRAMER

DIXON W . J . , AND F . J . M A S S E Y .1 9 5 7 .I n t r o d u c t i o nt o s t a t i s t i c a la n a l y s i s .M c G r a w - H i l lB o o k C o . , N ew Yo r k .

G R E E N S T E I N ,J . P . , AND D . M . W I N I T Z .1 9 6 1 .C h e m i s t r yo f t h eamino acids vol . 1. John Wiley S o n s Inc . New Yo r k .

JOHANNESSON J . K. 1 9 5 7 . Nature o f t h e bac t e r i c ida l a g e n t in

s ea w a t e r . N a t u r e1 8 0 : 2 8 5 - 2 8 6 .JOHANNESSON J . K. 1 9 58 . O x i d i z e d i o d i n e in s ea w a t e r. Nature

1 8 2 : 2 5 1 .K E L N E R ,A . ,W . D . B E L L A M Y,G . E . S T A P L E T O N ,AND M. R . Z E L L E .

1 955 . Symposium on r a d i a t i o n effects on c e l l s and bac t e r i a .

Bacter iol . R e v . 19:22 44.

MACLEODR . A . ,AND E . O N O F R E Y.1 9 5 6 .N u t r i t i o na n d m e t a b o -

l i s m o f m a r i n eb a c t e r i a . I I . O b s e r v a t i o n son t h e r e l a t i o n os ea w a t e r t o t h e growth of marine bac t e r i a . J . Bac t e r i o l .

7 1 : 6 6 1 - 6 6 7 .M A R T E L L ,A . E . , AND M . C A L V I N .1 9 5 2 .C h e m i s t r yo f t h e m e t a

che l a t e compounds. Pren t i ce Ha l l Inc . New York.

NOBLE E. AND 0. GULLANS. 1955 . I n f l u e n c e o f sodium t h i o

s u l f a t e on t h e s u rv i v al of c o l i f o r m o r g a n i s m s i n s t o r e d s a m p l e s

o f u n t r e a t e dl a k e w a t e r . J . B a c t e r i o l .7 0 : 2 4 9 - 2 5 0 .S H A W ,T . I . , AND L . H . N . C O O P E R .1 9 5 7 .S t a t e o f i o d i n e i n s ea

w a t e r . N a t u r e 1 8 0 : 2 5 0 .SUGAWARA K . AND K. TERADA. 1 9 5 8 . O x i d i z e d i o d i n e i n s e a w a te r.

N a t u r e 1 8 2 : 2 5 0 - 2 5 1 .

4 4 0 [ V O L .1 0

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Evaluation of Factors Affecting the Survival of Escherichia Coli in 6