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DEDICATÓRIA
A minha esposa Mônica
A meus filhos Gabriel e Matheus
A Meus Pais Francisco e Vera
A minha irmã Erica
DEDICO
ii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Rodrigo Rocha Latado pelo companheirismo e atenção em todos os pontos da
elaboração deste trabalho.
Ao Pesquisador e Professor Dr. Augusto Tulmann Neto por dividir o seu imenso conhecimento e pela
paciência na elaboração dos dados de irradiação.
Ao Instituto Agronômico (IAC) pela oportunidade para desenvolvimento desde projeto.
À empresa Terra Viva, na pessoa do Eng. Agr. Ronaldo Micoti da Glória, por permitir que esse
trabalho fosse realizado através da disponibilidade de todas as ferramentas necessárias e
disponibilidade do meu tempo.
Às colaboradoras Roseli Pires, Luana e Rosa Antunes, da área de Desenvolvimento e Laboratório da
empresa Terra Viva, pela ajuda em todas as fases de produção das Mandevillas.
Ao Mestre Luciano Delmondes de Alencar pelo fundamental auxílio nas análises estatísticas deste
trabalho.
À todos os docentes do Instituto Agronômico (IAC) que participaram da minha formação acadêmica
no decorrer destes anos.
Por fim, agradeço a DEUS por permitir que tudo isso fosse feito e a SÃO JOÃO BOSCO que, desde
o início de minha vida, é meu exemplo.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vi
LISTA DE TABELAS................................................................................................. vii
RESUMO .................................................................................................................... viii
ABSTRACT ................................................................................................................ ix
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................. 11
2.1 Família Apocynaceae e o gênero Mandevilla........................................................ 11
2.1.1 Mandevilla bahiensis.......................................................................................... 14
2.1.2 Mandevilla híbrida “Pretty Crimson”................................................................. 14
2.2 Melhoramento de ornamentais e de Mandevilla.................................................... 15
2.3 Cultura de tecidos de Mandevillas......................................................................... 17
2.4 Indução de poliploides em plantas......................................................................... 19
2.4.1 Técnica de citometria de fluxo............................................................................ 26
2.4.2 Número cromossômico de plantas de Mandevilla.............................................. 27
2.5 Mutagênese induzida com radiações ionizantes em plantas.................................. 27
3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 31
3.1 Material Vegetal..................................................................................................... 31
3.2 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”.............. 31
3.2.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama.. 31
3.2.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento................................................................................................................
33
3.3 Indução de plantas autotetraploides de Mandevilla............................................... 34
3.3.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro...............................................................................................................................
34
3.3.2 Identificação e caracterização de plantas autotetraploides de M. bahiensis........ 35
3.3.2.1 Análise morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis.......................................................................................................................
36
3.3.2.2 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides de M. bahienis....................................................................................
37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 38
4.1 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios gama................................................................................................................
38
4.1.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama.. 38
4.1.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento................................................................................................................
42
4.2 Indução de plantas autotetraploides........................................................................ 44
4.2.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro...............................................................................................................................
44
iv
4.2.2 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M.
bahiensis.......................................................................................................................
49
4.2.3 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides de M. bahiensis..................................................................................
55
5. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 58
6. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 58
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Planta de Mandevilla bahiensis em floração............................................ 14
Figura 2 - Planta de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”...................................... 15
Figura 3 - (A) Mudas enraizadas e mudas sem raiz; (B) Cilindro de proteção; (C) Fonte de raios gama; (D) Plantio de mudas enraizadas em potes com substrato e mudas sem raiz em túneis......................................................... 32
Figura 4 - Método das podas repetidas....................................................................... 33
Figura 5 - (A) Explantes de M. bahiensis e meio de cultura; (B) Preparação dos segmentos nodais; (5) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina; (E) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina em agitação; (F) Plantas tratadas com colchicina em rustificação............. 35
Figura 6 - Sobrevivência de estacas enraizadas e não-enraizadas de Mandevilla cultivar “Petty Crimson” com uso de diversas doses de mutagênico. Estacas enraizadas e não enraizadas, com proteção e sem proteção das bases das estacas....................................................................................... 41
Figura 7 - (A) Flor da cultivar comercial de Mandevilla “Pretty Crimson” (B) Efeito deletério e transitório nas folhas de plantas M1V1 após a irradiação; (C) Mutante com alteração na cor de pétalas (D) flores do mutante anão (M1) e do controle (Co)...................................................... 43
Figura 8 - Histogramas obtidos por meio da técnica de citometria de fluxo representando a ploidia de plantas diploide (A); mixoploide (B) e tetraploide (C) de M. bahiensis.................................................................. 47
Figura 9 - (A) Flor e folha de planta autotetraploide de Mandevilla bahiensis; (B) Flor e folha de planta diploide de M. bahiensis........................................ 49
Figura 10 - Secção transversal de um folíolo terminal de folha adulta de planta tetraploide de Mandevilla PP – Parênquima Paliçádico; PL – Parênquima Lacunoso; * – Câmara Subestomática; EAd – Epiderme adaxial; EAb – Epiderme abaxial; Setas brancas indicam estômatos. Barra 100µm....................................................................................................... 54
Figura 11 - Secções transversais do limbo foliar de Mandevilla tetraploide (a) e diploides (b). Secção transversal da folha na região da nervura central de Mandevilla tetraploide (c) e diploide (d) Barra 100 µm........................... 54
Figura 12 - A) estômatos de M. bahiensis de planta diploide; B) estômatos de M.
bahiensis de planta tetraploide. Barra = 0,03 mm..................................... 55
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Melhoramento de ornamentais pelo mundo. Os países estão apresentados por continente. A importância está indicada através de uma até cinco X (Van Tuyl, 2012)........................................................ 16
Tabela 2 - Taxas de sobrevivência (em %) de estacas enraizadas e não enraizadas de Mandevilla após uso de diferentes doses de raios gama, com e sem proteção da base..................................................................................... 39
Tabela 3 - Taxa de mortalidade, após cultivo temporário de explantes de M.
bahiensis em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina.............................................................................................. 45
Tabela 4 - Taxa de sobrevivência, após cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina. Plantas mantidas em substrato de Pinus, em vasos de 1,5 L e em estufa climatizada............................................................................................ 46
Tabela 5 - Determinação da ploidia em plantas de M. bahiensis rustificadas, provenientes de explantes previamente submetidos à cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina e diferentes tempos de exposição........................................ 48
Tabela 6 - Características morfológicas de folhas de plantas de M. bahiensis com
diferentes ploidias.................................................................................. 50
Tabela 7 - Diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre nós (DE) de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.............................. 51
Tabela 8 - Largura, comprimento e espessura das flores de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias......................................................... 52
Tabela 9 - Características anatômicas das terceiras folhas completamente expandidas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias........... 53
Tabela 10 - Caracterização de estômatos de secções paradérmicas da superfície abaxial da terceira folha a partir do ápice, com diâmetro polar dos estômatos (DPE), diâmetro equatorial dos estômatos (DEE) e área dos estômatos de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.............. 56
Tabela 11 - ICF – Índices de Clorofila Falker a e b de plantas de Mandevilla com diferentes ploidias................................................................................. 57
viii
Indução de mutantes em Mandevilla ssp. visando o melhoramento genético
RESUMO
As Mandevillas são plantas ornamentais com grande aceitação no mercado ornamental mundial, mas com baixa variabilidade de cores e formas nas cultivares comerciais. Desta forma, uma alternativa para o aumento da diversidade seria a utilização de técnicas de mutagênese induzida, com uso de mutagênicos físicos (raios gama, por exemplo) ou agentes antimitóticos (colchicina, por exemplo) para induzir alterações. Os agentes mutagênicos físicos têm a capacidade de induzir quebras cromossômicas no DNA das plantas e causar mutações somáticas, enquanto a colchicina possui a capacidade de induzir a produção de plantas autopoliploides. Assim, os objetivos deste estudo foram estabelecer dois métodos de mutagênese induzida em plantas de Mandevilla, um com uso de raios gama e, outro, com uso de colchicina como mutagênicos, de forma a ampliar a variabilidade de plantas desta espécie para fins de melhoramento. Outro objetivo foi a caracterização fenotípica de plantas autotetraploides de Mandevilla. No experimento de mutagênese induzida com uso de raios gama, estabeleceu-se a radiossensibilidade de estacas enraizadas e não enraizadas, além do tratamento mutagênico de estacas com as bases protegidas ou não, utilizando-se cilindros de chumbo. Determinou-se as doses letais para 30 e 50% (DL30 e DL50) dos tipos distintos de estacas. Em seguida, foram irradiadas 2.000 estacas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” e realizou-se o método de podas repetidas. Durante o período de florescimento das plantas realizou-se a seleção de dois mutantes, uma planta anã e outro mutante com flores com coloração distinta. No experimento de indução de poliploides não foi observada nenhuma associação entre a taxa de mortalidade de plantas in vitro e o uso de concentrações crescentes de colchicina e nem com o aumento do tempo de exposição ao alcaloide. O total de 12 plantas tetraploides e 54 mixoploides foi obtido nos diversos tratamentos, mas com maior porcentagem de tetraploides induzidos no tratamento de cultivo em meio contendo 0,05% de colchicina, durante 24 horas. As plantas autotetraploides de M. bahiensis
apresentaram efeito giga em relação às plantas controle, com a presença de órgãos maiores: folhas mais largas, mais espessas, com maior área foliar; flores maiores e com pétalas mais espessas; folhas com maiores estômatos, maiores índices de clorofila Falker a e b (ICFa e ICFb), mas menores relações ICFa/ICFb. Os resultados obtidos indicaram que as técnicas de mutagênese induzida com uso de raios gama ou de colchicina, em Mandevilla, foram viáveis para obtenção de mutantes com características de interesse.
Palavras-chave: colchicina, mixoploide, mutação, raios gama, tetraploide
ix
Mutant induction in Mandevilla ssp. aiming plant breeding
ABSTRACT Mandevillas are ornamental plants with great acceptance in the world ornamental market, but with low variability of flower color and shape for commercial cultivars. Thus, an alternative possibility for increasing the diversity would be the use of induced mutagenesis techniques with physical mutagens (gamma rays, for example) or antimitotic agents (colchicine, for example) to induce changes. While physical mutagens have the ability to induce chromosomal breaks in DNA and cause somatic mutations, colchicine has the ability to induce autopoliploid plants. Thus, the objectives of this study were to establish two methods of induced mutagenesis in Mandevilla plants, one using gamma rays and, the other, using colchicine as mutagens, in order to increase the variability of plants for breeding purposes. Another objective was the phenotypic characterization of Mandevilla autotetraploid plants. In a experiment of induced mutagenesis with gamma rays, the radiosensitivity of rooted and non-rooted cuttings was established, as well as the mutagenic treatment of cuttings with or without protected bases, using lead cylinders. The lethal doses were determined for 30 and 50% (DL30 and DL50) of different types of cuttings. Then, 2,000 Mandevilla cuttings were irradiated and, after that, the repeated pruning method was performed. During flowering period two mutants were selected, one dwarf plant and, other, a mutant with distinct color of the flowers. In experiment of polyploid induction no association was observed between in vitro plant mortality rate and the use of increasing concentration of colchicine nor with increasing exposure time to alkaloid. A total of 12 tetraploid and 54 mixoploid plants were obtained in all treatments but the best one, in terms of percentage of tetraploids induced, was the culture in a medium containing 0.05% colchicine, for 24 hours. Mandevilla autotetraploid plants showed a giga effect in relation to control plants, with the presence of larger organs: broader and thicker leaves, with larger leaf area; larger flowers with thicker petals; leaves with larger stomata, higher rates of chlorophyll a and b Falker (ICFa and ICFb), but lower ICFa/ICFb ratios. The results indicated that induced mutagenesis in Mandevilla with the use of gamma rays or colchicine, were feasible to obtain mutants with characteristics of interest. Key words: colchicine, gamma rays, mixoploid, mutation, tetraploid
10
1 INTRODUÇÃO
O setor de plantas ornamentais é muito diversificado e inclui a produção de culturas florais, tais
como flores e folhagens de corte, bulbos, plantas e flores em vasos. O valor global da produção de
flores foi estimado em US$ 55 bilhões em 2016 (Van Rijswick, 2017). Nesse contexto, a floricultura
brasileira destaca-se pelo notável crescimento nos últimos anos, embora ainda não esteja entre os
principais produtores mundiais.
De acordo com o IBRAFLOR (Instituto Brasileiro de Floricultura), em 2017, as flores
movimentaram R$ 7,2 bilhões no Brasil. Esse desenvolvimento está fundamentado na qualidade da
produção e na mudança de hábito da população que tem hoje produtos com beleza e vida útil,
correspondentes ao valor gasto na sua aquisição, ou seja, houve uma evolução no padrão de exigência
do consumidor final (Ibraflor, 2018).
O mercado de flores no mundo, assim como no Brasil, utiliza-se das novidades, isto é, da
introdução de novas cultivares, para manter e estimular o interesse dos consumidores nos produtos.
Nesta questão, as principais necessidades do mercado de flores são cultivares mais adequadas ao
cultivo intenso, de baixo custo e de fácil cultivo, além do aprimoramento das características desejadas
pelos consumidores, tais como: cor, durabilidade, tamanho, aroma, etc. Diante disto, o melhoramento
genético de plantas ornamentais se torna indispensável ao setor (Cardoso, 2013). Na busca de novas
cultivares com as características descritas acima, a indução de mutações é uma ferramenta muito
importante.
Apesar do destacado papel das mutações espontâneas na obtenção de novas cultivares de
plantas, a frequência de aparecimento destas mutações na natureza é muito baixa. Como a mutagênese
induzida tem a capacidade de aumentar várias vezes a frequência de mutações, ela tem sido utilizada
em programas de melhoramento de ornamentais em vários países (Broertjes e Van Harten, 1988).
Segundo Broertjes e Van Harten (1988) as mutações podem ser induzidas através de agentes
químicos ou físicos. A indução de mutações com uso de raios gama tem sido uma das técnicas mais
utilizadas no melhoramento de plantas e tem como objetivo induzir alterações a nível cromossômico
tais como quebras, deleções a alterações mais pontuais no DNA das plantas, e que podem resultar em
alterações no fenótipo (cor e forma de folhas e flores, porte e hábito de crescimento, arquitetura e
etc...). Já a indução de poliploidia por meio do uso de agentes antimitóticos tem como objetivos
práticos a obtenção de plantas com o efeito “giga”, isto é, plantas contendo órgãos maiores (folhas,
flores, frutos e etc...) e/ou plantas que produzem frutos sem sementes (geralmente plantas triploides).
O gênero Mandevilla possui 151 espécies conhecidas, principalmente lianas ou, menos
frequentemente, arbustos ou subarbustos. Este gênero se destaca pelo grande potencial ornamental e
farmacológico. As Mandevillas possuem uma grande aceitação comercial no mercado doméstico e
11
mundial e isto se deve ao seu hábito de crescimento (lianas) e beleza de suas flores. Sua
comercialização ocorre em todos os continentes, inclusive em regiões mais frias, onde são usadas
como ornamentação de verão. Porém, a variação de cor e formas das Mandevillas comerciais é restrita
a poucas cores (branco, rosa e vermelho) e poucas opções de formas de folhas, flores e hábito de
crescimento (Sales, 1993).
Após uma revisão de literatura na área, não foi possível encontrar nenhum estudo prévio
envolvendo a indução de mutações e de poliploides em plantas do gênero Mandevilla visando o
melhoramento genético.
Diante do exposto, o presente estudo tem os seguintes objetivos:
- Estabelecer um método de mutagênese induzida com raios gama, de forma a induzir e
selecionar mutantes de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”.
- Estabelecer um método de indução de poliploides de Mandevilla bahiensis visando obter
plantas com órgãos maiores.
- Avaliar os efeitos da poliploidização de plantas de Mandevilla bahiensis por meio da
caracterização fenotípica.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Família Apocynaceae e o gênero Mandevilla
A família Apocynaceae apresenta 2.000 espécies, distribuídas em cerca de 200 gêneros. No
Brasil ocorrem 41 gêneros desta família, o que perfaz um total de 376 espécies já catalogadas,
localizadas em diversos ecossistemas (Barroso, 1991). As espécies da família Apocynaceae
desenvolvem-se em vários habitats, desde florestas tropicais úmidas até regiões semiáridas; ao nível
do mar e em topos de montanha, em solos secos, afloramentos rochosos, áreas inundadas e, algumas
vezes, nas margens de rios (Rapini, 2004).
Além de ser bem representada na flora brasileira, esta família destaca-se pela importância
econômica e ou medicinal de alguns representantes devido à produção de metabólitos tais como:
alcaloides e glicosídeos. Apesar disso, ela ainda continua sendo pouco estudada. Os trabalhos
clássicos sobre as Apocynaceae foram elaborados por De Candolle, (1844), Mueller, (1869), Miers,
(1878) e Schumann, (1895), no século dezenove e os estudos foram fundamentalmente ampliados
durante a primeira metade do século vinte, quando propostas de novas classificações e revisões à
12
nível de subfamília ou tribo foram elaboradas (Stapf, 1904; Woodson, 1928, 1933, 1936; Pichon,
1948 e Allorge et al., 1980).
Expedições realizadas na América Central e América do Sul, especialmente na Bolívia,
Suriname e região amazônica da Colômbia e Venezuela, contribuíram sobremaneira para a descoberta
de várias novas espécies, as quais foram descritas por Rusby (1912, 1927); Gleason (1931); Maguire
et al. (1948) e Woodson (1950), entre muitos outros.
Mais recentemente, os estudos desenvolvidos abordaram não só aspectos taxonômicos, como
revisões de gêneros isolados (Allorge, 1975; Boiteau e Allorge, 1976; Barban, 1985 e Stranghetti,
1992), como também acrescentaram valiosas informações sobre morfologia e anatomia floral
(Walker, 1978 e Fallen, 1980) e distribuição geográfica (Allorge et al., 1980). Tais informações são
essenciais para uma melhor interpretação da família, cuja estrutura floral é especializada e complexa.
O gênero Mandevilla possui 151 espécies conhecidas, sendo formado por espécies com
caracteres comuns, tais como estigma penta costado e umbraculiforme, apêndices calicinais
(coléteres) na base interna dos lacínios e a inflorescência racemosa (Sales, 1993). As plantas
pertencentes ao gênero Mandevilla são principalmente lianas ou, menos frequentemente arbustos ou
subarbustos, e com inflorescência em racemos típicos. O período de florescimento parece ser
relativamente curto, ocorrendo na maioria das espécies de dezembro a março, enquanto que a
frutificação ocorre entre junho e agosto. As sementes são anemófilas, numerosas, geralmente estreitas
oblongas a lineares ou às vezes fusiformes (Sales, 1993).
A grande diversidade de formas e cores da corola do gênero Mandevilla, aliada a sua estrutura
floral especializada, pode estar relacionada com a especificidade para polinizadores (Sales, 1993). O
androceu é formado por cinco estames, que formam um cone em volta do estigma. Os grãos de pólen
geralmente são liberados na porção superior do estigma, ainda na fase de botão floral. No entanto, a
parte receptiva do estigma encontra-se localizada na região basal, o que dificulta a realização de
autofecundações e a consequente formação de frutos e sementes a partir de autofecundações (Galetto,
1997; Torres e Galetto, 1998, 1999; Lohne et al., 2004).
As flores abrem no início da manhã e a antese dura aproximadamente quatro dias (Alvino et
al., 2007). Essa longevidade floral, associada à liberação de pólens na parte superior do estigma e à
grande quantidade do mesmo que é retirada durante as primeiras visitas de insetos, sugere que a flor
possa permanecer funcionalmente feminina durante parte da antese, numa estratégia para favorecer a
polinização cruzada. Outra característica que pode influenciar negativamente as taxas de
autofecundação é o baixo volume de néctar presente nas flores, o que induz às espécies polinizadoras
a fazer apenas uma visita na mesma flor e a procurar várias flores favorecendo, assim, a fecundação
cruzada (Alvino et al., 2007).
13
Segundo Alvino et al. (2007), a taxa de pegamento de frutos sob condições de polinização livre
foi de 30,9%. O tratamento experimental de exclusão da visita de insetos revelou que a espécie não é
autogâmica, demonstrando a dependência total de vetores bióticos para a ocorrência de polinização
(cruzada) nas flores. Na autopolinização manual 13,3% das flores formaram frutos que perduraram
até o amadurecimento, significando que o gênero tem certa taxa de autocompatibilidade. Entretanto,
a polinização cruzada manual apresentou uma maior taxa de pegamento de frutos e de produção de
frutos maduros, com cerca de 37,9%.
Este gênero se destaca pelo grande potencial ornamental e farmacológico. Apesar da beleza das
flores, poucas espécies são comercializadas atualmente como plantas ornamentais. No Brasil, são
cultivadas apenas a M. splendens (Hook.) Woodson, enquanto que na Argentina e Chile, a M. laxa
(R. e P.) Woodson também tem sido cultivada comercialmente. No século dezenove, várias espécies
de Mandevilla foram coletadas no Brasil e introduzidas na Europa, para ornamentação de jardins,
como a M. urophylla (Hook.) Woodson, M. illustris (Vell.) Woodson, a M. tenuifolia (Mikan)
Woodson e a M. atroviolaceae (Stadelm.) Woodson (Sales, 1993).
Em estudos farmacológicos, a M. velutina (Mart. ex Stadelm.) Woodson e a M. illustris (Vell.)
Woodson são citadas como eficazes no tratamento de picadas de cobras venenosas, por meio de
maceração e aplicação de extrato de suas túberas (bulbos) na região do corpo onde ocorreu o ataque.
Correia (1984) também atribui essa mesma propriedade às espécies M. atroviolaceae (Stadelm.)
Woodson e M. splendens (Hook.) Woodson. Pesquisas com túberas de M. velutina revelaram a
presença de princípio ativo inibidor da bradequinina, confirmando de certa forma a veracidade das
informações populares (Calixto et al., 1985; Calixto e Yunes, 1986).
Comercialmente, as Mandevillas são utilizadas como ornamentais e reproduzidas
vegetativamente por meio de estacas, retiradas de plantas matrizes, e enraizadas em ambiente
controlado durante aproximadamente quatro semanas. Antes do enraizamento, as estacas devem ter
a base tratada com regulador de crescimento vegetal, indutor de enraizamento, geralmente o ácido
indolbutírico (AIB). O ciclo completo da cultura, considerando do enraizamento de estacas até a
produção de flores, geralmente perfaz 150 dias (Gomes da Costa, 2018, informação pessoal).
Outra forma de reprodução de Mandevillas é por meio de sementes, método usado
principalmente em trabalhos de melhoramento genético. Neste caso, o período desde a polinização
até a dispersão das sementes em frutos maduros é de 112 dias, sendo que a germinação ocorre em 14
dias. Assim, o ciclo sexual completo de plantas deste gênero, da polinização até a nova floração,
demora aproximadamente 350 dias (Gomes da Costa, 2018, informação pessoal).
14
2.1.1 Mandevilla bahiensis
Segundo Watanabe et al. (2009) a Mandevilla bahiensis é uma liana ou arbusto escandente,
com 1-3 m altura e produção de látex branco. Ramos flexuosos, glabros a pubescentes. Folhas
decussadas, 2 - 2,9 × 1,7 – 3 cm, coriáceas, cordiformes, largo-ovais, oblatas, ápice emarginado
mucronulado a cuspidado, base atenuada a cordada, arredondada, margem inteira, sinuada,
conduplicadas, glabras; subsésseis ou curto-pecioladas, pecíolo subcilíndrico, 2 - 4 mm comprimento.
Inflorescência axilar; brácteas 1-4 mm comprimento, triangulares a truladas, ápice agudo, ciliadas;
coléteres 2-4 na base das brácteas. Possui flores actinomorfas. Lacínias do cálice 5-8 mm
comprimento, lanceoladas, ápice acuminado; coléteres 2 – 4 mm escamiformes, oblongos. Corola
infundibuliforme; tubo inferior 1 - 1,4 cm de comprimento, verde-vináceo, o superior 1 - 2,2 cm
comprimento, róseo a magenta; fauce amarela ou branca; lobos 1,2 - 2,3 cm comprimento, obovais,
ápice obtuso, róseos a magenta (Figura 1).
A Mandevilla bahiensis ocorre sobre os afloramentos rochosos nos campos rupestres.
Aparecendo na forma de liana ou arbusto escandente, sempre com folhas conduplicadas e flores
vistosas. Apresenta flores durante todo o ano e, frutos, de maio a janeiro (Watanabe et al., 2009).
Figura 1. Planta de Mandevilla bahiensis em floração. Foto: Everton G. Costa
2.1.2 Mandevilla híbrida “Pretty Crimson”
Mandevilla híbrida, a cultivar “Pretty Crimson” distingue-se pela sua ramificação com
qualidade superior, internódios mais curtos, mas que ainda mantém um crescimento vigoroso. Possui
folhagem verde-escura brilhante e abundância de flores vermelhas, com 5 a 7,5 cm de diâmetro.
Comercialmente esta cultivar pode ser usada como uma planta de vaso tradicional (pote de 14 cm),
15
mas também é ideal para o plantio em vasos pequenos (8 a 12 cm). Em alguns casos pode ser utilizada
com planta pendente. Planta ideal para segmentos de varanda e pátio. Assim não é surpresa que esta
seja uma das cultivares de Mandevilla mais vendidas no mundo.
Figura 2. Planta de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”. Fonte: Google
2.2 Melhoramento de ornamentais e de Mandevilla
A história do desenvolvimento de flores ornamentais inicia-se há muito tempo atrás, mas
somente nos últimos dois ou três séculos, através das introduções e dos programas de melhoramento
genético, esta atividade tem sido mais documentada para algumas culturas (Kingsbury, 2009). O
melhoramento das espécies Tulipa, Jacinto e Narciso teve seu início datado aproximadamente 300
anos atrás (Doorenbos, 1954), 200 anos atrás para Rosas e Crisântemos (Zlesak, 2006), e menos de
100 anos, para Lírios (Van Tuyl e Arens, 2011).
Os programas de melhoramento de flores e plantas realizados em Institutos e Universidades
públicas são mais bem conhecidos do que os realizados em empresas privadas, devido a maior
divulgação e ao acesso público das publicações. Além do apoio governamental para pesquisa e
desenvolvimento, outra importante fonte de novidades ornamentais são os melhoristas amadores que
estão organizados em sociedades como exemplo: World Federation of Rose Societies, American
Daffodil Society, International Climatis Society, dentre outras (Van Tuyl, 2012).
A principal fonte de novas variedades comerciais para o agronegócio ornamental são as
empresas privadas de melhoramento. Atualmente a Holanda é líder no melhoramento de espécies
ornamentais e quase todas as novas variedades introduzidas são desenvolvidas por empresas
comerciais privadas e comercializadas em todo mundo (Van Tuyl, 2012).
16
Segundo Van Tuyl, 2012, na América do Sul, o Equador e Colômbia são os principais
exportadores de flores de corte. Nestes países, as atividades mais recentes de desenvolvimento de
novas cultivares também são realizadas por empresa privadas (exemplos: Esmeralda Breeding,
Progeny Breeding), que apresentam um alto potencial para o futuro. No Brasil, Argentina e Chile,
Universidades e centros de pesquisa estão envolvidos no melhoramento de ornamentais.
Recentemente, no Brasil, algumas empresas particulares iniciaram programas de melhoramento.
(Tabela 1)
Tabela 1. Melhoramento de ornamentais pelo mundo. Os países estão apresentados por continente e
as importâncias relativas dos locais de condução dos programas de melhoramento (Universidade, empresa privada, Jardim botânico e Hobby) estão indicadas em função do número de indicações (X) (Van Tuyl, 2012).
17
O desenvolvimento de novas cultivares pode ser realizado com a introdução de materiais
nativos, melhoramento de espécies já comercializadas e introdução de plantas exóticas. A introdução
de material nativo pode ser entendida como o uso de espécies nativas em cruzamentos com variedades
comerciais aparentadas, buscando o melhoramento para algumas características desejáveis. As
espécies nativas também podem ser utilizadas diretamente, através de seu pré-melhoramento e
melhoramento genético. Segundo Gomes da Costa et. al. (2012), a seleção de novos produtos nativos
deve ter indicadores objetivos para a avaliação adequada de seu uso, já que a beleza é uma
característica grandemente subjetiva.
O melhoramento de espécies já comerciais atualmente é o caminho mais usado para obtenção
de novos produtos. Este melhoramento busca a criação de novas plantas que atendam as demandas
atuais através das variedades pré-existentes.
A introdução de plantas exóticas ocorre há muito tempo pelo mundo, com trocas de
biodiversidade entre os continentes. Esse processo deve ser realizado com muito cuidado para a
redução da ocorrência de plantas que possam se tornar invasoras.
Atualmente, o melhoramento genético de Mandevillas é realizado por poucas empresas no
mundo. A principal técnica de melhoramento adotada é a hibridização e seleção massal das progênies
obtidas. Essa técnica é trabalhosa, pela dificuldade de polinização, devido a morfologia das flores de
Mandevillas e pela baixa taxa de fertilização. Assim, as técnicas de melhoramento não convencionais,
tais como: a indução de mutações e a poliploidização podem se constituir em ferramentas importantes
no desenvolvimento de novas cultivares.
2.3 Cultura de tecidos de Mandevillas
A primeira revisão sobre a propagação de plantas por meio de cultura de tecidos foi publicada
por Murashige (1974). Ele listou 128 gêneros com potencial para a propagação in vitro, incluindo 22
gêneros de orquídea e 43 outros gêneros de plantas ornamentais. Quatro anos depois, o autor enfatizou
que todas as orquídeas de importância econômica, exceto Paphiopedilum, poderiam ser multiplicadas
in vitro. Adicionalmente, 194 gêneros de vários grupos de plantas, incluindo 118 gêneros de plantas
ornamentais foram considerados passíveis de clonagem por meio de cultura de tecido. Esta lista é
incompleta devido à relutância de alguns laboratórios em divulgar seus casos de sucesso com a
propagação por cultura de tecidos de determinados gêneros, famílias ou espécies vegetais (Laimer et
al., 2003).
Segundo Handro et al. (1998), o cultivo in vitro de Mandevilla velutina e Mandevilla illustris é
importante por causa do potencial uso farmacológico e da necessidade de conservação destas
espécies, que estão ameaçadas na natureza devido à exploração predatória. Os autores estabeleceram
18
um protocolo para a regeneração de plantas a partir de vários explantes de M. velutina (segmentos de
folha, xilopódio ou caule), passando pela fase de calos. O meio mais responsivo para a indução de
calos era o acrescido de ácido naftalenoacético (ANA) e benzilaminopurina (BAP) na concentração
de 1 mg.L-1, cada. Apesar de não ter sido possível obter organogênese direta em nenhum dos meios
testados, os calos obtidos geralmente eram friáveis e altamente organogênicos, resultando em grande
número de brotações após a transferência para meio acrescido de 5 mg.L-1 de BAP e 1 mg.L-1 de
ANA.
Segundo Souza et al. (2011), a fase mais importante do cultivo in vitro de plantas de savana,
caso das Mandevillas, é a de enraizamento das brotações, o que foi obtido por Handro et al. (1998)
após cultivo em meio acrescido de 5 mg.L-1 de ANA ou 8 mg.L-1 de AIB. Assim, os autores sugeriram
a possibilidade de uso de cultivo in vitro de M. velutina para a produção de produtos fitoterápicos.
Biondo et al. (2004) estabeleceram um protocolo para a micropropagação in vitro de M. illustris
a partir de segmentos nodais e consideraram que o enraizamento in vitro de estacas foi mais efetivo
quando se utilizou o meio de cultivo contendo apenas 1/3 da concentração normal de sais de MS. Já
Biondo et al. (2007) estabeleceram um protocolo de micropropagação semelhante, mas para M.
velutina e, Cordeiro et al. (2012), para M. moricandiana.
Souza et al. (2011) testaram vários tratamentos visando o incremento na taxa de enraizamento
in vitro de M. velutina e concluíram que a presença de compostos fenólicos no meio de cultura era
importante para a promoção do enraizamento adventício.
A micropropagação in vitro pode resultar na geração de plantas em grandes quantidades e em
pequeno espaço físico (Teixeira et al., 2001), possibilitando a produção homogênea de metabólitos e
com qualidade garantida (Amaral e Silva, 2003). Técnicas de micropropagação também podem
permitir manipulações genéticas (Rao e Ravishankar, 2002), o estabelecimento de bancos de
germoplasma (Rout et al., 2000), além da redução de extração ilegal de plantas, com consequente
prevenção do declínio dos ecossistemas onde as plantas ocorrem naturalmente (Medeiros, 2003).
Não há ainda relatos de estudos em que se obteve sucesso na regeneração in vitro de plantas de
Mandevilla por meio organogênese direta, nem por embriogênese somática ou protoplastos. Assim,
ainda não se tem descrito um método in vitro apropriado de regeneração de plantas de Mandevilla
com origem a partir de uma ou poucas células. Isto pode ser importante quando se utiliza técnicas de
mutagênese induzida, em que se deseja evitar a presença de quimerismos em plantas tratadas com
mutagênicos.
As técnicas de cultura de tecidos de espécies de Mandevilla podem ser consideradas como
ferramentas biotecnológicas importantes, que podem ser usadas como apoio a programas de
melhoramento, especialmente porque este gênero apresenta uma biologia reprodutiva complexa, com
plantas contendo baixa taxa de cruzamentos e/ou com baixa taxa de obtenção de plantas por sementes.
19
Assim, uma vez obtido um genótipo superior, a manutenção dele pode ser obtida via multiplicação
vegetativa, utilizando-se métodos in vivo (via enraizamento de estacas) ou in vitro (micropropagação
clonal). No entanto, nestes casos, geralmente a cultura de tecidos pode trazer vantagens em termos
de maior taxa de multiplicação, em função do tempo e do espaço físico.
2.4 Indução de poliploides em plantas
Entende-se por poliploidia a existência de mais de dois conjuntos de cromossomos em uma
mesma célula. Células ou tecidos poliploides podem ocorrer em organismos diploides, como na
polissomatia, comum nas raízes das leguminosas. Eventualmente, indivíduos poliploides surgem
espontaneamente em progênies de espécies diploides. Uma determinada espécie pode apresentar
citotipos, isto é, plantas diploides e poliploides, assim como um gênero pode apresentar espécies com
diferentes graus de ploidia (Wittmann e Dall´agnol, 2003).
Os poliploides são classificados basicamente em autopoliploides e alopoliploides. Os primeiros
são originados pela duplicação de um mesmo genoma, se espera alta frequência de multivalentes na
meiose e herança polissômica. Os alopoliploides ou poliploides genômicos são formados pela
duplicação de genomas diferentes de uma planta híbrida, o pareamento cromossômico ocorre apenas
entre os cromossomos do mesmo genoma e se espera herança dissômica. Um tipo intermediário são
os poliploides segmentares, formados pela duplicação dos genomas de espécies aparentadas, que
ainda mantém homologia suficiente entre seus cromossomos para permitir um pareamento parcial.
Assim estes podem exibir formas variadas e intermediárias de herança, ou seja, herança dissômica
para algumas características e, polissômica, para outras (Stebbins, 1971; Sybenga, 1992).
A literatura indica que espécies poliploides naturais surgiram pela união de gametas não
reduzidos (Harlan e De wet, 1975; Hermsen, 1984; Ramsey e Schemske, 1998). No entanto, o
surgimento de espécies poliploides por duplicação somática é considerado um evento raro e isolado,
se é que realmente ocorreu na natureza (De wet, 1980).
Segundo algumas estimativas, até 70% das angiospermas são poliploides naturais (Masterson,
1994). Segundo Soltis e Soltis (1995), os poliploides representam cerca de 53% das espécies de
briófitas e, de acordo com Grant (1981) e Song et al. (2012), pode representar mais que 95% das
pteridófitas. Em gimnospermas, os poliploides representam mais de 38% das espécies existentes
(Ahuja e Neale, 2005), sendo que a Sequoia sempervirens é a única conífera hexaploide natural
(2n=6X=66). A poliploidia é considerada uma via importante para a evolução das plantas e pode
contribuir para o isolamento reprodutivo e especiação abrupta (Ramsey e Schemske, 1998; Wendel,
2000; Soltis et al, 2004).
20
Os efeitos da poliploidia em atributos das plantas também são importantes para horticultores
e agricultores (Ranney, 2006). Cerca de 40% das espécies cultivadas são poliploides (Simmonds,
1980; Wittmann e Dall´Agnol, 2003), entre elas a alfafa, a batata, o fumo e o algodão, que são
tetraploides, As aveias são tetraploides e hexaploides, os trigos são tetraploides (trigo duro) e
hexaploides (trigo de pão, Triticum aestivum) e o morango é octaploide, entre outras espécies.
Entretanto, parece não haver uma relação direta entre poliploidia e domesticação (Hilu, 1993).
O primeiro, e mais conhecido, poliploide surgido por manipulação humana foi
Raphanobrassica, um híbrido entre a couve e o rabanete. Em 1928, Karpechenko, realizando
cruzamentos entre rabanete (Raphanus sativus) e couve (Brassica oleracea), espécies com 2n=18
cromossomos, tentou obter plantas que reunissem a raiz do rabanete e as folhas da couve. Esses
cruzamentos produziam sementes, mas as plantas obtidas eram estéreis. Eventualmente, houve a
produção de algumas sementes, que resultaram em plantas férteis com o dobro do número de
cromossomos. Este alopoliploide, provavelmente, surgiu por poliploidização sexual espontânea.
Entretanto, apresentava a raiz da couve e as folhas do rabanete, não sendo o sucesso agronômico
esperado (Griffiths et al., 2000).
Os poliploides possuem, em geral, plantas maiores e mais robustas do que seus parentes
diploides (Stebbins, 1971). Daí o interesse em desenvolver artificialmente plantas com estas
características (Wittmann e Dall´Agnol, 2003).
Espera-se que plantas poliploides sejam melhores que aquelas diploides em uma série de
características. A razão para tal fato é que, as características adaptativas são controladas por
numerosos genes, distribuídos em vários cromossomos. No processo de evolução dos poliploides, o
efeito da poliploidia em mutações individuais pode ter pequenas consequências, mas coletivamente,
pode gerar características diferentes que estão sob controle de múltiplos genes (Simioni, 2004). Além
disso, o aumento da ploidia pode garantir vantagem adaptativa, pois pode mascarar os efeitos de
mutações deletérias, já que os poliploides, em geral, apresentam um efeito tamponante sobre estas
mutações, que seriam silenciadas devido ao maior número de cópias gênicas (Silva Jr, 2008).
A poliploidia leva à duplicação genômica e, consequentemente, à duplicação gênica. Segundo
Adams e Wendel (2005), a duplicação gênica pode ter as seguintes consequências evolutivas: (a)
genes adquirindo novas funções; (b) “silenciamento” de uma ou das duas cópias duplicadas; (c)
retenção da função original ou similar, persistindo a expressão gênica duplicada, que pode favorecer
casos em que mutações de uma cópia gênica podem conduzir a interações negativas com os produtos
de outros genes essenciais; (d) interação entre genes duplicados (efeito de dose = quanto mais alelos,
mais produto). Estudos envolvendo várias plantas poliploides revelaram um complexo padrão de
evolução dinâmica e contribuíram para o conhecimento sobre a relação entre a composição genômica
e a função dos genes (Yang et al., 2011).
21
A poliploidia induzida pode ser uma poderosa ferramenta para o melhoramento genético, sendo
utilizada basicamente de três maneiras: (1) poliploidização na própria espécie, como um modo de se
tentar conseguir plantas maiores e melhores; (2) poliploidização de um híbrido para restaurar a
fertilidade do híbrido estéril, sintetizar uma nova espécie ou ressintetizar uma espécie já existente e
(3) como uma ponte para transferir genes de interesse entre plantas com diferentes níveis de ploidia,
na mesma ou entre espécies diferentes (Dewey, 1980).
Poliploides induzidos podem ser obtidos por via somática ou sexual. A indução de poliploidia
por via somática é basicamente feita através da utilização de um agente inibidor dos fusos acromáticos
durante a mitose. A poliploidização com origem sexual, por sua vez, se baseia na ocorrência de
gametas não-reduzidos. Gametas contendo o mesmo número somático de cromossomos (não-
reduzidos) ocorrem, normalmente, em frequências muito baixas (em torno de 1%), em populações
naturais, surgindo a partir da não-redução do número cromossômico, causada por anormalidades na
meiose. A falha na redução pode ocorrer na primeira divisão meiótica - restituição na primeira divisão
- se os cromossomos não se dirigem para os pólos na anáfase, ou na segunda divisão meiótica -
restituição na segunda divisão - se não ocorre a citocinese. A detecção citológica, no lado masculino,
é facilmente realizada pela identificação de grãos de pólen diploides maiores do que os normais, ou
pela presença de díades ou tríades na telófase II (Schifino-Wittmann e Dall´Agnol, 2001).
Para a indução de poliploidização somática podem ser utilizados alguns agentes inibidores dos
fusos acromáticos (agentes antimitóticos). Dentre destes, o alcaloide colchicina (C22H25O6N),
extraído das sementes e bulbos do açafrão do prado (Colchicum autumnale), é o mais conhecido e o
mais empregado (Jackson, 1976 e Dhooghe et al., 2011). Diversos métodos de aplicação da colchicina
são utilizados, havendo sempre a necessidade de ajustes e de padronizações, de acordo com a espécie.
A aplicação pode ser feita em sementes, plântulas ou partes vegetativas com tecidos meristemáticos
ativos, como perfilhos e estolhos, por exemplo. O essencial é que haja tecidos em divisão ou com alto
potencial para tanto. Geralmente, concentrações próximas a 0,2% (quase sempre em solução aquosa),
e tempos de exposição de 1 a 16 horas, são as que apresentam melhores resultados. A aplicação pode
ser por imersão do tecido meristemático na solução, por gotejamento da solução sobre o meristema,
por aplicação de algodão embebido na solução diretamente sobre o ponto de crescimento (Eigsti e
Dustin, 1957; Elliott, 1967) ou ainda, adicionando-se a colchicina no meio de cultura in vitro (Silva
et al., 2000; Väinölä, 2000; Petersen et al., 2002).
As grandes vantagens da utilização da colchicina são sua facilidade de aplicação e eficiência na
produção de poliploides. Enquanto que as principais limitações para seu uso seriam: (1) Nem sempre
todas as células do tecido tratado se poliploidizam, o que pode levar à formação de quimeras, ou seja,
tecidos ou plantas com setores duplicados e outros não duplicados coexistindo no mesmo organismo;
22
(2) Fitotóxico para os tecidos das plantas, em concentrações elevadas ou sob tratamento muito
prolongado e (3) Muito prejudicial à saúde humana (Van Tuyl et al., 1992; Hammill et al., 1992).
O primeiro trabalho utilizando colchicina foi o de Menninger que em 1963 induziu tetraploides
de orquídeas do gênero Cymbidium por tratamento de sessões de pseudobulbos com solução de
colchicina.
Outra técnica utilizada para induzir poliploidia consiste em submergir sementes germinadas
recentemente, em água fria, a uma temperatura compreendida entre 1 e 3° C. O tratamento com água
fria é mais eficaz do que com água quente, uma vez que o calor pode danificar o tecido tratado
(Dermen, 1940).
Uma técnica alternativa de poliploidização de plantas é pelo uso da orizalina (Tosca et al.,
1995), utilizado por Van Tuyl et al. (1992) na duplicação de cromossomos de lírio. Os autores relatam
terem observado grande eficácia ao induzir poliploides com orizalina, podendo ser considerada como
uma alternativa para a colchicina. No entanto, a orizalina, que foi originalmente desenvolvida para
uso como herbicida, não está disponível para o uso comercial.
O herbicida Surflan é uma das substâncias com a capacidade de induzir poliploidização em
plantas. O Surflan contém 40% do princípio ativo orizalina e, portanto, é uma alternativa para
colchicina e orizalina pura (Takamura et al., 2002). No entanto, além de orizalina, o Surflan contém
alguns outros ingredientes secundários que, segundo Takamura et al. (2002), não apresentaram
influência na duplicação cromossômica e regeneração de plantas in vitro de lírio. O Surflan também
foi considerado um composto confiável para a poliploidização em kiwi, cebola, gérbera, maçã, batata,
milho e tabaco (Wan et al., 1991; Ramulu et al., 1991; Bouvier et al., 1994; Tosca et al., 1995; Chalak
e Legave, 1996 e Geoffriau et al., 1997). O Surflan pode ser uma alternativa para orizalina na
duplicação de cromossomos por causa da eficácia e preço barato, porém mais testes em outros
genótipos, doses e duração do tratamento são necessários. De acordo com Ascough e Staden (2008),
as dosagens usadas de orizalina variam de 2,5 mM (Allum et al., 2007) a 150 mM (Contreras et al.,
2007).
A época áurea da indução de poliploidia ocorreu nas décadas de 30 a 70 do século XX. Muitos
trabalhos foram publicados sobre poliploides induzidos, em espécies ornamentais e frutíferas (Nebel
e Ruttle, 1938), alfafa (Cooper, 1939; Dunbier et al., 1975), mandioca (Graner, 1941), trevos (Levan,
1942; Bragdo, 1955; Hutton, 1957; Armstrong e Robertson, 1960), Phalaris (Covas e Cialzeta, 1953;
Östergren, 1957), Phaseolus mungo (Sen e Chheda, 1958), Lolium, (Ahloowalia, 1967; Crowley e
Rees, 1968), Phlox drumondii (Raguvanshi e Pathak, 1975), Agroppyron (Asay e Dewey, 1979),
Matricaria chamomilla (Madhusoodana e Arora, 1979), Portulaca grandiflora (Singh, 1979) e
diversas outras, como centeio, uvas, beterraba e melancia (Dewey, 1980). Verificou-se, ao mesmo
tempo, que, de maneira geral, principalmente os autopoliploides recém-induzidos apresentavam, além
23
de níveis variáveis de gigantismo, também características desvantajosas, principalmente uma
diminuição da fertilidade. Sendo assim, houve uma reação de pessimismo em relação à indução de
poliploidia, pois, para utilização deste material, eram necessárias grandes populações e intensa
seleção.
Dewey (1980), examinando o que ocorreu com poliploides induzidos que eram considerados
economicamente promissores na década de 60, como centeio, uvas e beterrabas, mostrou que nenhum
destes teve o sucesso esperado à longo prazo. Mas, mesmo assim, a indução de poliploidia continuava
a ser feita em diversos países, principalmente naqueles com menores recursos econômicos. Segundo
o autor, a poliploidia induzida, para fins de melhoramento, seria mais importante para transferir
características de interesse entre plantas com diferentes níveis de ploidia, do que para obter plantas
maiores. Como em todos os assuntos polêmicos, ou como naquelas situações em que as promessas e
expectativas são muito altas e os resultados modestos, é necessário um balanço das vantagens e
desvantagens e avaliação da relação custo-benefício. Vários autores, desde o início da utilização desta
técnica, apresentavam uma postura mais realista, apontando não só seus problemas, mas
principalmente as suas possibilidades, mostrando que a poliploidia induzida pode ser utilizada como
o passo inicial, e como uma ferramenta importante, em alguns programas de melhoramento (Levan,
1942; Eigsti e Dustin, 1957; Stebbins, 1957, 1971; Elliot, 1967; Simmonds, 1980; Evans, 1981).
Um dos principais obstáculos à utilização de autopoliploides induzidos é a diminuição na
fertilidade, atribuída principalmente, mas não exclusivamente, ao comportamento meiótico dos
poliploides jovens. Entretanto, Ramsey e Schemske (2002), revisando dados da literatura, não
encontraram comprovações de que a fertilidade em neoautopoliploides seja menor do que em
neoalopoliploides. A fertilidade de um organismo está relacionada com o equilíbrio gênico,
consequentemente com o comportamento cromossômico na meiose e, ainda, com outros fatores,
genéticos, fisiológicos e ambientais, que agem na formação dos gametas, no desenvolvimento e na
maturidade do indivíduo. Em gerações avançadas de autotetraploides, muitas vezes, pode ser
observada uma tendência à regularização da meiose, semelhante à diploidização dos poliploides
naturais (Hazarika e Rees, 1967; Simonsen, 1973).
Um dos grandes problemas, que talvez tenha levado, durante um período, a certo descrédito em
relação à indução de poliploidia no melhoramento, é a comparação desigual entre um neopoliploide,
em suas primeiras gerações após a indução, e um progenitor, com milhões de gerações submetidas à
seleção natural, o que se reflete no desempenho inferior dos poliploides em relação aos diploides dos
quais foram derivados (Eigsti e Dustin, 1957). Muitos poliploides induzidos apresentam uma
compensação ao efeito “giga”, como menor número de folhas e flores, desenvolvimento mais lento,
etc... As características indesejáveis presentes em um neopoliploide podem, geralmente, ser
removidas por seleção em grandes populações (Elliott, 1967).
24
Diferentes tipos de plantas cultivadas respondem diferentemente à poliploidia induzida. Tanto
o nível de ploidia original, como o modo de reprodução, o ciclo de vida, perene ou anual, e a parte da
planta cultivada (por exemplo, se o produto final da cultura é o fruto, a semente, a flor ou a parte
vegetativa) influenciam o sucesso do procedimento. Portanto, o melhorista deve considerar com
cuidado as vantagens e desvantagens da utilização desta técnica em seu trabalho específico (Dewey,
1980). Nas espécies ornamentais, principalmente as de reprodução vegetativa, a duplicação do
número cromossômico é, em geral, vantajosa, pois não há uma dependência da fertilidade
(Simmonds, 1980; Allard, 1999). A redução na produção de sementes pode ser compensada, por
exemplo, por flores maiores e mais vistosas (Eigsti e Dustin, 1957). Um exemplo de alopoliploide
artificial em culturas graníferas relativamente bem sucedido e bastante utilizado é o do Triticale,
resultante do cruzamento do trigo e centeio (Müntzig, 1980).
Em geral, o objetivo é alcançar o nível tetraploide ou níveis de ploidia pares. Entretanto,
triploides são usados no melhoramento exatamente por sua esterilidade, como no caso da melancia
triploide, obtida pelo cruzamento de plantas diploides com tetraploides somáticos induzidos. A sua
grande vantagem é a não produção de sementes, o que atrai o consumidor. Por outro lado, o produtor
fica na dependência da compra das sementes triploides, devido à necessidade contínua de refazer os
cruzamentos. Muitos destes triploides podem, também, apresentar vigor híbrido e ser mais resistentes
à doenças. Nos Estados Unidos, cerca de 20 a 50% da produção de melancias é de triploides (Ufl,
1999).
Em plantas forrageiras, principalmente quando o interesse é a produção de forragem, a
poliploidia pode ser vantajosa, como nos autotetraploides de Lolium perenne e Lolium multiflorum e
nos alopoliploides de Lolium x Festuca (Carnahan e Hill, 1961; Evans, 1981). Entre as leguminosas
forrageiras, um bom exemplo é o trevo vermelho, Trifolium pratense (Taylor e Quesenberry, 1996).
Nesta espécie, vários trabalhos demonstraram que, em muitos casos, os autotetraploides são mais
persistentes, produtivos e resistentes à doenças. A diminuição da fertilidade, refletida pela baixa
produção de sementes, pode ser superada por seleção. Na Suécia, até 50% da produção de semente
certificada de trevo vermelho é oriunda de autotetraploides, que, de maneira geral, são mais bem
sucedidos e cultivados na Europa do que na América. Isto, muito provavelmente, deve-se ao fato de
que os melhoristas europeus vêm trabalhando há muito mais tempo com indução de poliploidia em
trevo vermelho, do que os pesquisadores americanos. Aparentemente, é necessário um período
considerável de tempo para que os genes do trevo vermelho se tornem adaptados à existência em
células com nível de ploidia mais alto (Taylor e Quesenberry, 1996).
Em culturas como a alfafa, a poliploidização sexual é utilizada como uma maneira de otimizar
a heterozigose, especialmente pelo modo bilateral (Bingham, 1980), e de possibilitar a introgressão
de genes de espécies diploides silvestres para a alfafa tetraploide cultivada (McCoy e Bingham,
25
1991). Tetraploides formados por poliploidização sexual bilateral apresentam maiores valores para
os componentes de rendimento de forragem e tamanho de folha e de caule, quando comparados a
seus progenitores diploides, apesar de haver uma diminuição na fertilidade (Barcaccia et al., 1998).
Em batata, tetraploides obtidos por poliploidização sexual apresentam maior produção de
tubérculos do que aqueles induzidos por colchicina (Peloquin et al., 1989). Nesta cultura, a
poliploidização sexual vem sendo utilizada como uma forma de transferir, de espécies selvagens
diploides para a tetraploide cultivada, a resistência ao escurecimento durante a armazenagem à frio
(Hayes e Thill, 2002). Uma das dificuldades a serem superadas para uma utilização mais ampla da
poliploidização sexual é a obtenção de genótipos com as características de interesse e que, ao mesmo
tempo, produzam gametas não-reduzidos de forma regular (Ramanna, 1992). Para que isto seja
atingido, há necessidade de seleção para ambos os aspectos.
Além da ampla utilização de poliploides espontâneos em espécies ornamentais, como por
exemplo, narcisos, tulipas, jacintos (Brandham et al., 1995) e cactos (Karle et al., 2002), poliploides
induzidos continuam sendo utilizados no melhoramento de Tripsacum dactyloides (Salon e Earle,
1998), Trifolium alexandrinum (1999), orquídeas (Silva et al., 2000), Gentiana triflora (Morgan et
al., 2003), e nos gêneros Avena (Ladizinsky, 2000) e Rhododendron (Väinölä, 2000), entre muitos
outros. Os trabalhos mais recentes utilizando técnicas de poliploidia são: alterações fenotípicas e
genômicas em poliploides sintéticos de Tulipa (Tulipa) e Hemerocallis em relação aos seus
homólogos diploides (Podwyszynska et al., 2012), ploidia de Lachenalia spp. regenerada e propagada
in vitro em diferentes meios (Bach et al., 2012), indução de poliploidia em Dendrobium hibrido “Miss
Singapore” por meio de cultura de tecidos (Bunnag e Hongthongkham, 2012), indução de poliploidia
in vitro por aplicação de colchicina em Heliconia bihai (Cavalcanti-Filho, et al., 2012), indução de
tetraploides in vitro de Lilium (Gabryszewska, et al., 2012), poliploidização meiótica em Tulipas
Darwin híbridas (Marasek-Ciotakowska, et al., 2012) e geração de poliploides em Calluna vulgaris
(Przybyla, 2014).
As plantas poliploides podem ser identificadas por meio de contagem do número cromossômico
de células, avaliação de caracteres citológicos, tais como: tamanho das células-guarda dos estômatos,
densidade estomática, avaliação do diâmetro dos grãos de pólen (Graner, 1941; Brewbaker, 1952;
Evans, 1955; Armstrong e Robertson, 1960; Elliott, 1967; Silva et al., 2000; Beck et al., 2003; Morgan
et al., 2003), assim como, pela avaliação do número de plastídios presentes nas células dos estômatos
(Bingham, 1968; Boaventura et al., 1981).
Uma alternativa seria a estimativa do nível de ploidia através da determinação do volume de
DNA nuclear, que pode ser feita por microdensitometria ou citometria de fluxo (Schifino-wittmann,
2001). A citometria de fluxo vem sendo cada vez utilizada em determinações de nível de ploidia,
associada à indução de poliploidia ou identificação de poliploides espontâneos (Salon e Earle, 1998;
26
Sáuco et al., 2001; Morgan et al., 2003). Características morfológicas externas, tais como gigantismo
(órgãos maiores e, em geral, mais espessos), podem auxiliar na distinção de plantas poliploides (Eigsti
e Dustin, 1957; Elliot, 1967), sendo, entretanto, estas avaliações consideradas como subjetivas, pois
sofrem grande efeito ambiental e, portanto, são passives de falhas com maior frequência.
É necessário um cuidado especial quando há formação de quimeras nas plantas tratadas com
agentes poliploidizantes pois, dependendo da parte da planta analisada, podem ser observados
resultados contrastantes, levando a conclusões errôneas (Wittmann e Dall´Agnol, 2003).
Apesar da importância do uso de poliploides para obtenção de novas cultivares ornamentais, o
gênero Mandevilla não apresenta nenhum estudo anterior sobre a indução de poliploides, em espécies
nativas ou comerciais.
2.4.1 Técnica de citometria de fluxo
A citometria de fluxo é uma tecnologia que permite a análise simultânea e multiparamétrica de
células ou partículas em suspensão, avaliando-as individualmente. À medida que o fluxo de amostra
passa por um ou mais feixes de luz (gerados por um ou mais lasers), o sistema óptico-eletrônico
registra a forma como as estruturas dispersam a luz do laser incidente e captando as fluorescências
emitidas. Assim, o equipamento obtém informações de diversos parâmetros tais como: tamanho
relativo, complexidade interna e intensidades de fluorescências de cada célula ou partícula avaliada.
Desta maneira, podem ser realizadas análises quantitativas de DNA e revelar a ploidia de células em
suspensão (Loureiro et. al, 2012).
As aplicações da citometria de fluxo na horticultura estão majoritariamente relacionadas com o
controle da estabilidade do nível de ploidia; a conformidade de lotes de sementes; a detecção de
plantas haploides para posterior produção de linhas duplo-haploides, ou seja, linhas puras férteis; a
produção e detecção de triploides estéreis em plantas hortícolas ou para cultivo em parques; a
produção e detecção de novos níveis de ploidia, como plantas tetraploides, que podem apresentar
novas características de interesse econômico e a produção e detecção de híbridos interespecíficos.
Estas aplicações estão intimamente relacionadas com as áreas da biotecnologia e melhoramento
vegetal e beneficiam-se da elevada capacidade de processamento de amostras associada à citometria
de fluxo, aspecto fundamental para a detecção das plantas de interesse em estados de desenvolvimento
inicial.
As principais vantagens no uso da citometria de fluxo são: conveniência (fácil preparação de
amostras), rapidez, análise não destrutiva (as quantidades de material vegetal que são necessárias são
mínimas), não necessita de células em divisão, é capaz de detectar mixoploidias e, por fim, após a
aquisição do instrumento, os custos associados às análises são relativamente diminutos. Por estas
27
razões, a citometria de fluxo é cada vez mais tida como a metodologia ideal para análises deste tipo
em diversas áreas, incluindo a horticultura (Loureiro et. al, 2012).
2.4.2 Número cromossômico de plantas de Mandevilla
Em Apocynaceae, o número cromossômico 2n=22 é o mais comum, embora ocorram
variações nos níveis de ploidia, com registros de triploides (2n=3x=33) e tetraploides (2n=4x=44). O
número básico primário referido para Apocynaceae é x=11, com vários números básicos secundários,
x=6, 12, 16, 18, 20, 21 e 23, de origem diploide (Raven, 1975; Van Der Laan e Arends, 1985).
Segundo Santos et al. (2009) a Mandevilla bahiensis e M. hatschibachii apresentaram 2n=16,
enquanto a Mandevilla sancta, 2n=20. Em todos os casos, foram observados núcleo semi-reticulado
e cromossomos relativamente pequenos.
2.5 Mutagênese induzida com radiações ionizantes em plantas
Apesar do destacado papel das mutações espontâneas na obtenção de novas cultivares de
plantas, a frequência de aparecimento destas mutações na natureza é muito baixa (Broertjes e Van
Harten, 1988). A mutagênese induzida tem a capacidade de aumentar várias vezes à frequência de
mutações. Devido a isto, ela tem sido rotineiramente utilizada em programas de melhoramento de
ornamentais em vários países (Broertjes e Van Harten, 1988).
Os principais fatores da evolução das espécies são as mutações espontâneas, recombinação e
seleção natural. Nesse sentido, o melhoramento de plantas pode ser considerado como a evolução
controlada pelo Homem (Tulmann et al., 1990).
Quando Stadler (1928) relatou que raios x provocavam mutações também em plantas os
melhoristas passaram a dispor de mais uma ferramenta de trabalho para a ampliação da variabilidade
genética. Nos primeiros trabalhos de indução de mutações foram utilizadas sementes, borbulhas,
pólen, etc., isto é, propágulos in vivo (Konzak, 1984). Porém, com o avanço das técnicas de cultura
de células e tecidos, abriu-se novo campo de uso destes mutagênicos associado à cultura in vitro
(Tulmann et al., 1990).
A escolha do mutagênico a ser usado nos tratamentos in vivo ou in vitro de plantas depende de
sua efetividade (relação entre dose utilizada e frequência de mutação) e da sua eficiência (produção
de mutações desejáveis, livres de associações com mutações indesejáveis) (Konzak 1984).
Os mutagênicos físicos compreendem os diferentes tipos de radiações, tais como as radiações
eletromagnéticas: luz ultravioleta (UV), raios x e raios gama, e radiações corpusculares: partículas
alfa, beta, prótons, nêutrons e etc... As radiações transferem sua energia, direta ou indiretamente, ao
28
material genético que é o DNA, por meio de vários processos físico-químicos (Tulmann et al., 1990),
tais como colisão, excitação e ionização. Evidentemente todos os componentes celulares sofrem esses
efeitos. No caso do DNA, a maior parte dos danos é reconstituída pelo sistema de reparo da própria
célula. Nesse caso de reconstituição, poderá haver reposição errada de bases nitrogenadas, causando
alterações no código genético e, consequentemente, causar mutações. Para os outros componentes, o
grau de injurias pode variar, resultando em redução da divisão mitótica ou até morte das células. No
material tratado podem coexistir efeitos fisiológicos, não transmissíveis à linhagem de células
posteriores, e os efeitos genéticos (mutações) (Tulmann et al., 1990).
Quanto às radiações ionizantes, os raios gama têm sido os mais utilizados para mutagênese,
sendo obtidos principalmente por meio dos radioisótopos Cobalto 60 e Césio 137, existindo vários
tipos de equipamentos disponíveis para o tratamento (Briggs e Constantin, 1977; El-Khateeb et al.,
2016).
A determinação da sensibilidade dos propágulos, às radiações a serem utilizadas, é uma etapa
indispensável na aplicação da mutagênese induzida. Estes parâmetros são baseados nos efeitos
fisiológicos indiretos tais como: redução na altura da planta, redução na sobrevivência e outros,
produzidos pelos mutagênicos. Um parâmetro muito utilizado é a recomendação de doses que causem
50% de letalidade. Para a mutagênese in vitro os critérios ainda não estão bem definidos, mas em
linhas gerais, seguem os da mutagênese in vivo (Howland e Hart, 1977).
O que tem sido feito são experimentos preliminares, usando-se doses ou concentrações
crescentes do mutagênico, a partir do explante escolhido para o tratamento. As respostas obtidas são
analisadas e determinadas às doses ou concentrações do mutagênico em função da redução dos
seguintes parâmetros: sobrevivência, crescimento (baseado no peso seco ou peso fresco), número de
novas brotações, número de embriões formados, entre outros. O que se espera é a determinação de
uma alta associação entre o efeito do mutagênico e frequência de mutações (Tulmann et al., 1990).
Uma vez determinada a sensibilidade, pode-se iniciar o experimento com uso de doses definidas de
mutagênico.
Os mutagênicos químicos e físicos apresentam diferenças no modo de ação e a recomendação
geral é que os dois tipos podem ser usados, aumentando assim a possibilidade de obtenção da mutação
procurada. No entanto, não se recomenda o uso das duas formas de tratamento em conjunto evitando
assim mutações deletérias (Tulmann et al., 1990).
Quanto ao tamanho da população inicial a ser tratada, há algumas considerações gerais para a
mutagênese as quais apresentam, também, fórmulas que estimam o tamanho da população a ser
utilizada, levando-se em conta a frequência de mutações naturais ou induzidas, obtidas para uma série
de organismos, de acordo com tipo de mutação (Nabors, 1976; Brock, 1977).
29
Os raios gama foram os mutagênicos físicos mais empregados em trabalhos de mutagênese
induzida (64% dos casos) e as plantas ornamentais ou decorativas foram as que obtiveram o maior
número de cultivares mutantes liberadas, com 25% do total (Maluzynski et al., 2000). Este sucesso
deve-se ao fato de haver uma maior facilidade na seleção de mutações de coloração e de morfologia
e, além disto, pelo fato de as plantas ornamentais geralmente apresentarem ciclo curto e altos níveis
de heterozigosidade, o que possibilita que mutações recessivas (as mais frequentes) possam ser
reconhecidas imediatamente (Broertjes e Van Harten, 1988).
O sucesso desta técnica em ornamentais é particularmente notável na cultura de crisântemo, na
qual foram lançadas 210 novas cultivares, sendo que muitas dessas permaneceram por vários anos no
mercado, contribuindo com milhões de dólares para os produtores (Ahloowalia et al., 2004). Tais
mutantes destacaram-se não apenas pelas novas colorações obtidas, muitas vezes inexistentes na
cultivar original usada para o tratamento, como também por apresentarem novos formatos de
inflorescência, precocidade, resistência ao frio, dentre outras características.
No Brasil a indução de mutações com uso de raios gama já produziu novas cultivares de
crisântemo de corte, que foram liberadas aos produtores e consumidores (Tulmann Neto e Latado,
1997; Adames et al., 1999).
Em experimentos de mutagênese induzida vários são os fatores que podem afetar a frequência
e o espectro de mutantes obtidos, bem como o tipo de quimerismo que pode ocorrer nos mutantes
(quimeras setoriais, mericlinais ou periclinais). Dentre os fatores, podem ser citados o tipo e a dose
de mutagênico, material vegetativo a ser tratado, método de condução das plantas pós-tratamento,
tipo de mutação a ser selecionado, método de seleção da mutação, estabilidade da cultivar usada,
dentre outros (Tulmann Neto e Latado, 1997). Como destacam Broertjes e Van Harten (1988), uma
vez que ocorra alguma mutação com o uso do mutagênico, o quimerismo automaticamente ocorrerá
se mais de uma célula estiver presente no momento do tratamento. Esses autores citam ainda que
quimeras mericlinais, por exemplo, não são estáveis, e que do ponto de vista do melhoramento, outros
métodos devem ser usados de modo a obter mutantes não quiméricos (sólidos) ou quimeras periclinais
(estáveis).
Uma possibilidade para a obtenção de mutantes estáveis (mutantes sólidos ou periclinais) é pelo
o uso da técnica de podas repetidas no ramo ou na planta irradiada, com o objetivo de ampliar o setor
mutado até se conseguir a estabilização. Spiegel–Roy et al. (1990) avançaram até a terceira geração
de podas sucessivas para estabilizar ramos mutantes de limão sem sementes. Já Boersen et al. (2003)
obtiveram mutantes periclinais na primeira geração de plantas resultantes do evento mutagênico e
sem a necessidade de podas, mas somente após o uso das doses maiores de mutagênico, acima de 15
Gy de raios gama.
30
Segundo El-Khateeb et al. (2016) é recomendado usar raios gama em doses mais baixas (10-
100 Gy) para obter mutantes úteis. A esse respeito, Raghava et al. (1988) descobriram que doses de
100 Gy e superiores provaram ser prejudiciais para a altura da planta, número de folhas e tamanho
das folhas do gladíolo. Datta (1997), em Lantana depressa, determinou que a altura de plantas e o
número de folhas foram significativamente reduzidos em todas as doses, exceto 10 Gy. Já
Chakravarty e Sen (2001), em Scilla indica, afirmaram que os raios gama nas doses de 2 ou 5 Gy
promoveram maiores taxas de crescimento e aceleraram a divisão celular. Arafa et al. (2011), em
Zantedeschia aethiopica, descobriram que o tratamento 30 Gy foi superior para o crescimento. Vários
pesquisadores mencionam que se doses mais elevadas de raios gama são utilizadas, o crescimento e
a qualidade das plantas tratadas, diminuem.
Nesse sentido, Dilta et al. (2003) em crisântemo, encontraram reduções significativas na
sobrevivência das plantas, altura da planta, número de folhas e tamanho e número de flores, bem
como aumento em anormalidades de plantas, em função do aumento da dose de mutagênico. Nas
orquídeas, Kozlowska (1994) mostrou que a dose 200 Gy inibia totalmente o crescimento e Gonzales
(2007) descobriu que a altura e o número de folhas diminuíram com doses maiores. Também El-
Khateeb et al. (2007), em melissa, descobriram que o número de folhas diminuía com o aumento das
doses gama. Suraninpong e Wuthisuthimethavee (2013), trabalhando com antúrio (A. andraeanum),
Patil (2014) e Upadhyay (2014) trabalhando com gladíolo, relataram que o crescimento das plantas
tendia a diminuição com o aumento das doses. O efeito da radiação gama no pigmento clorofila foi
estudado por Palamine et al. (2005) em dracena. Eles observaram que o uso de dose de 20 Gy diminuía
a proporção das clorofilas a e b. Também Jinxi (2006), no antúrio (A. andraeanum), encontrou uma
correlação negativa entre doses de radiação gama e conteúdo de clorofilas. No sentido contrário,
Chandrashekar et al. (2013), em Terminalia arjuna, observaram que os teores de clorofila
aumentavam com o uso de doses crescentes de radiação.
Várias anormalidades em folhas (forma, tamanho, margem, ápice e fusão) foram relatadas por
Datta (1997) em plantas de Lantana depressa irradiadas com doses de raios gama superiores a 30 Gy.
Rashid et al. (2013), em gengibre, afirmaram que raios gama causaram anormalidades tais como:
plantas anãs, caules tortos e folhas onduladas. Singh et al. (2015) no gladíolo, observaram a existência
de várias alterações morfológicas após uso de doses de 25 a 45 Gy de raios gama.
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
Neste estudo foram utilizadas plantas de Mandevilla bahiensis, que apresentam flores rosas,
pequenas e florescem o ano todo (Figura 1), além de plantas de Mandevilla da cultivar comercial
“Pretty Crimson” da empresa Santory, com flores vermelhas escuro; folhas pequenas, lanceoladas e
com cor verde brilhante (Figura 2).
Plantas da espécie M. bahiensis foram utilizadas para indução de plantas autopoliploides,
enquanto as plantas da cultivar comercial “Pretty Crimson” foram utilizadas nos experimentos de
indução de mutações com uso de raios gama, visando obter mutantes com alteração no ciclo de
cultivo, na coloração e formato da inflorescência.
As cultivares foram selecionadas pela sua importância no mercado de flores sendo consideradas
como as mais comercializadas no Brasil e por apresentarem florações mais uniformes durante todo o
ano.
3.2 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios
gama
3.2.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama
O objetivo deste experimento foi avaliar a radiossensibilidade de estacas (enraizadas ou não
enraizadas) à raios gama. Observando os efeitos de doses crescentes de raios gama e a necessidade
ou não de proteção da base das estacas com cilindros de chumbo para evitar danos severos no sistema
radicular das plantas.
Foram utilizadas 960 estacas enraizadas e 960 estacas não enraizadas da cultivar comercial
“Pretty Crimson”, com 10 cm de comprimento, contendo cerca de seis gemas axilares cada. Estas
estacas foram submetidas ao tratamento de exposição aos raios gama na fonte de Co60 do Centro de
Energia Nuclear na Agricultura, Piracicaba, SP, com as doses 0; 7,5; 15; 22,5; 30; 37,5; 45 e 52,5 Gy
(taxa de dose aproximada de 290 Gy/h) e com e sem proteção de cilindros de chumbo.
Foram irradiadas 120 estacas enraizadas com cada dose distinta de mutagênico (8 doses), sendo
metade destas (60 estacas) protegidas com cilindros de chumbo no momento da irradiação, para
proteger a base das plantas (duas últimas gemas basais) dos efeitos da radiação. A outra metade das
plantas não foi protegida com cilindros de chumbo. Os mesmos tratamentos foram realizados com as
estacas não enraizadas.
32
As estacas enraizadas e não enraizadas, após os tratamentos, foram plantadas em vasos de 1 L
de volume usando substrato de casca de Pinus, em estufas climatizadas no município de Holambra,
SP. Os tratos culturais durante todo o período do experimento consistiram de fertirrigações semanais
com condutividade elétrica de 1,5 µs/cm. A temperatura média foi de 25° C e a intensidade média de
luz foi de 40.000 lux.
O delineamento experimental foi realizado em blocos ao acaso, contendo três blocos, sendo
cada parcela composta por 20 estacas, o que totalizava 120 estacas para cada dose de radiação (60
protegidas e outras 60, não protegidas). Os experimentos foram conduzidos na forma de fatorial duplo
(8 x 2), com oito doses de radiação e uso, ou não, de proteção das bases das mudas (bases protegidas
ou não protegidas). Foram realizados dois experimentos iguais e independentes com o uso de estacas
enraizadas ou com uso de estacas não enraizadas (Figura 3).
Figura 3. (A) Mudas enraizadas e mudas sem raiz; (B) Cilindro de proteção; (C) Fonte de raios
gama; (D) Plantio de mudas enraizadas em potes com substrato e mudas sem raiz em túneis.
A avaliação da radiossensitividade foi feita 30 dias após o plantio, com a contagem do total de
plantas vivas em cada tratamento. Em seguida, foi calculada a porcentagem de plantas sobreviventes
por dose de mutagênico.
A escolha da dose de raios gama e a necessidade de proteção da base das estacas para o
prosseguimento da pesquisa foi realizada observando-se o DL50 (dose letal de 50% das plantas) e o
DL30 (dose letal de 30% das plantas) de cada cultivar, nas estacas com bases protegidas ou não, e
ajustando-se os dados com uso de equação de regressão linear.
Os resultados obtidos foram também submetidos à análise de variância do tipo fatorial, com
avaliação do efeito dos dois fatores (proteção das raízes e dose de mutagênico). Em seguida, as médias
dos tratamentos foram comparadas entre si por meio do uso do teste Tukey, a 1% probabilidade.
33
3.2.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o florescimento
Após a determinação da radiossensitividade foi realizada a irradiação de 2.000 estacas, com
comprimento de 10 cm, não enraizadas, da cultivar “Pretty Crimson”, utilizando-se as doses de 24,7
e 41,2 Gy de raios gama e protegidas na base por cilindros de chumbo. Desta forma foram utilizadas
1.000 estacas para cada dose de mutagênico. Como controle experimental foram utilizadas 100
estacas não irradiadas.
As estacas foram plantadas em vasos pote número 15 sob condições de estufa comercial.
Quando as plantas apresentavam altura média de 15 cm foi feita a aplicação do método das podas
repetidas, de acordo com o citado em Broertjes e Van Harten (1988), descrito a seguir. A primeira
poda foi realizada com a retirada do ápice caulinar de cada planta, o que resultou na quebra da
dominância apical nas plantas. Em seguida, cada planta foi conduzida mantendo-se somente três
ramos (M1V1) e eliminando-se os demais. Ramos M1V1 eram os desenvolvidos a partir de gemas
axilares presentes nas plantas na região inferior ao local das podas.
Após o período de 15 dias, foram aplicadas novas podas, agora com eliminação dos ápices
caulinares dos ramos M1V1, possibilitando o desenvolvimento de ramos M1V2. Apenas um ramo
M1V2 originado de cada ramo M1V1 foi mantido para o desenvolvimento. Em cada planta, a
eliminação dos ramos sem interesse foi feita ao acaso. Os procedimentos foram repetidos até o
desenvolvimento de ramos M1V3, momento a partir do qual as plantas se desenvolveram livremente
(Figura 4).
Figura 4. Método das podas repetidas de plantas irradiadas.
No período de florescimento foram avaliadas e selecionadas plantas com as seguintes
características: flores com coloração e/ou formato da inflorescência, distintas das da cultivar original;
folhas variegadas; folhas com formato distinto ou plantas com alteração no ciclo, isto é, com
florescimento precoce. Essas mutações selecionadas foram consideradas como de interesse para
avaliação ou para uso em programas de melhoramento genético de Mandevillas.
M1V1
M1V2 M1V3
34
Os mutantes encontrados foram numerados e multiplicados vegetativamente por meio de
estaquia, totalizando 200 estacas por mutante selecionado (replicatas). Estes materiais propagativos
foram usados no experimento de avaliação da estabilidade e homogeneidade das mutações.
Para tal, 200 estacas enraizadas de cada clone mutante foram plantadas em vasos e mantidas
em estufa. A estabilidade e a homogeneidade das plantas mutantes foram avaliadas após seis meses
de cultivo. Para a estabilidade foi observado se as características mutadas se mantiveram inalteradas
nas plantas mutantes, propagadas vegetativamente, em relação à característica de interesse observada
na cultivar original cultivar “Pretty Crimsom”. Já a homogeneidade foi avaliada observando se as
características mutadas se mantiveram inalteradas em todas as 200 plantas mutantes, após terem sido
propagadas vegetativamente.
3.3 Indução de plantas autotetraploides de Mandevilla
3.3.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro
O objetivo deste experimento foi induzir plantas autotetraploides de M. bahiensis utilizando-se
do cultivo in vitro temporário de explantes em meio de cultivo contendo colchicina, seguido de
regeneração de brotações em meio sem a presença do alcaloide.
O tipo de explante utilizado para o estabelecimento in vitro foi o segmento nodal, obtidos de
ramos adultos de plantas mantidas em estufas. O meio de cultivo in vitro utilizado para o tratamento
temporário com colchicina e para a regeneração de brotações foi o meio MS acrescido de 30 g.L-1 de
sacarose, 1 mg.L-1 de BAP e 7 g.L-1 de ágar.
Para os tratamentos com colchicina os segmentos nodais foram imersos em meio de cultura
líquido contendo sais e vitaminas de meio MS, acrescido de 10 mM de MES (ácido
morfolinoetanosulfônico), com pH ajustado para 6,0 antes da autoclavagem. A colchicina foi
dissolvida em solução aquosa (3 mL), seguido de filtro-esterilização e adição ao meio de cultura nas
concentrações de 0,025 e 0,05% m/v. O mesmo meio de cultivo (líquido) sem a presença de colchicina
foi usado como controle experimental.
Os frascos contendo solução de colchicina e os explantes foram mantidos a 26° C, no escuro e
sob agitação de 50 rpm, durante 8, 16 e 24 h. Em seguida, os explantes foram lavados duas vezes em
água destilada esterilizada e secos sobre discos de papel filtro esterilizados, antes da transferência
para meio de regeneração de plantas.
Os explantes foram cultivados em meio de regeneração sob condições de fotoperíodo de 16
horas de luz (50 µmol/m2/s) e temperatura de 26° C, até o desenvolvimento de brotações. Após 60
dias de cultivo foi realizada a avaliação do número de brotações contaminadas e brotações
35
sobreviventes. Em seguida, calculou-se as taxas de contaminação e taxa de sobrevivência, expressas
em porcentagem (Figura 5).
Figura 5. (A) Explantes de M. bahiensis e meio de cultura; (B) Preparação dos segmentos nodais;
(5) Segmentos nodais em meio liquido contendo colchicina; (E) Segmentos nodais em meio liquido
contendo colchicina em agitação; (F) Plantas tratadas com colchicina em rustificação.
O delineamento experimental utilizado foi o fatorial 3 x 3, contendo três tempos de exposição
(8, 16 e 24 h.) e 3 concentrações de colchicina (0; 0,025 e 0,05% m/v), sendo cada tratamento
composto por três repetições. Cada repetição do tratamento foi formada por 25 segmentos nodais in
vitro. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANAVA) e as médias, foram
comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.
3.3.2 Identificação e caracterização de plantas autotetraploides de M. bahiensis
Para a aclimatização, as brotações desenvolvidas foram mantidas em câmara úmida durante 30
dias, sendo a seguir, transferidas para estufas sob condições de temperatura e umidade relativa
controladas, mantendo-se sempre a identificação do tratamento utilizado (tempo de exposição e
concentração da colchicina). Após este período, avaliou-se a sobrevivência das plantas aclimatizadas.
As plantas aclimatizadas tiveram a sua ploidia avaliada utilizando o método de citometria de
fluxo. A etapa inicial foi a identificação da ploidia das plantas originais usadas no experimento. Para
tal, foram avaliadas duas plantas por meio da técnica de citometria de fluxo utilizando-se o
equipamento Partec CyFlow Ploidy Analyzer DAPI (Partec Gmbh., Alemanha), que é equipado com
lâmpada UV-LED (emissão com comprimento de onda de 365 nm) e um parâmetro ótico para
detecção de fluorescência.
Cada amostra foi composta por suspensões nucleares isoladas a partir de segmentos de folha
(lâmina foliar) com tamanho aproximado de 0,25 cm2 (0,5 x 0,5 cm). Os núcleos das células foram
extraídos por meio de cortes no limbo foliar com auxílio de lâmina de aço afiada (bisturi) e na
presença de 0,2 ml do tampão de extração (kit de coloração CyStain UV precise T-DAPI, Partec
Gmbh.). A seguir, as suspensões foram coradas com 0,8 ml da solução corante do mesmo kit, que usa
36
o 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) como fluorocromo, filtradas com filtros CellTrics de 30 μm
(Partec Gmbh.) e analisadas imediatamente.
De cada amostra foram avaliados no citômetro 1.000 núcleos intactos, no mínimo, com uso do
software CyView (Partec Gmbh.) e a calibração: Gain = 535 e Low Level (LL) = 0,70, resultando em
histogramas com o tamanho relativo dos núcleos das células de cada amostra. As amostras cujos
coeficientes de variação (CV) se situaram acima de 10% foram descartadas.
O tamanho relativo médio dos núcleos de cada amostra foi calculado posteriormente utilizando-
se como controle, amostras de plantas de M. bahiensis diploide. Dentre todas as plantas poliploides e
mixoploides identificadas foram selecionadas e multiplicadas vegetativamente seis plantas
tetraploides para serem usadas nos testes posteriores de avaliação fenotípica.
3.3.2.1 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis
Para as análises morfológicas de plantas tetraploides foram utilizadas seis plantas tetraploides
distintas, identificadas por citometria de fluxo, além de uma planta controle diploide. As variáveis
mensuradas foram o diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre dois nós (DE),
comprimento foliar (C) e largura foliar (L) de três folhas totalmente expandidas (mais superiores),
sendo posteriormente calculada a relação comprimento/largura foliar (C/L). Em seguida foram
mensuradas a espessura e área foliar.
O diâmetro do caule, distância entre dois nós e a espessura foliar foram avaliados com auxílio
de um paquímetro digital. A área foliar foi avaliada por meio de fotografia digital de folhas, sendo as
imagens posteriormente manuseadas através do Software ImageJ® (Powerful Image Analysis).
A caracterização anatômica das folhas das plantas tetraploides foi realizada confeccionando-se
lâminas permanentes contendo cortes transversais de seções da folha. Utilizou-se o terço médio das
amostras (folhas) contendo a nervura central das terceiras folhas maduras (completamente maduras),
contadas a partir do ápice de plantas.
As amostras foram fixadas em solução FAA 70% (formaldeído, ácido acético e etanol 5:5:90
v/v), por 24 h. Posteriormente as amostras foram mantidas em solução de etanol 70% por mais 24 h.
e, posteriormente, desidratadas em série etílica (70, 80, 90, 95 e 100% v/v), antes da embebição em
solução de infiltração e inclusas em resina de hidroxietilmetacrilato (LEICA-HISTORESIN®),
conforme recomendação do fabricante.
Os blocos foram então cortados em secções transversais com 6 µm de espessura em micrótomo
automático da marca Leica®. Os cortes foram colocados em banho histológico e sobrepostos em
lâminas. Essas lâminas, contendo os cortes, foram coradas com safrablau (Astra-blue 1% e safranina
1%) e as lamínulas foram fixadas nas lâminas com resina sintética (Entellan®).
37
As lâminas histológicas foram fotomicrografadas em microscópio ótico sendo que as imagens
capturadas já continham a escala automática, devidamente calibrada. As imagens foram analisadas
com auxílio do software ImageJ® para mensuração das espessuras da epiderme adaxial (EAd), da
epiderme abaxial (EAb), do parênquima paliçádico (PP) e do parênquima lacunoso (PL).
Os resultados obtidos neste conjunto de experimentos foram submetidos à análise de variância
e as médias comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.
3.3.2.2 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas autotetraploides
de M. bahiensis
Para avaliação da densidade estomática e do tamanho (largura e comprimento) das células-
guarda dos estômatos foram utilizadas folhas totalmente expandidas, geralmente da terceira folha,
contada do ápice para a base do ramo e em ramos distintos.
As folhas foram lavadas e seccionadas em tiras, transferidas para solução de etanol 70%, por
cinco minutos. A seguir, as tiras de folhas foram transferidas para solução de hidróxido de potássio a
5%, em temperatura próxima do ponto de fervura, durante três minutos, seguido de transferência para
água destilada, à temperatura ambiente.
A epiderme abaxial foi retirada com auxílio de uma pinça e colocada na lâmina, com a face
externa para abaixo. Após cobrir a amostra com a lamínula, procedeu-se a visualização num
microscópio ótico Zeiss Axioscop 40 HBO 50 A/C, onde as imagens foram capturadas e depois,
digitalizadas.
A avaliação da densidade estomática foi realizada com uso da objetiva de 40x, observando-se
dez campos de visão por amostra. Como cada campo de visão possuía uma área de 0,046876 mm2,
optou-se pela transformação dos dados originais para densidade de estômatos por mm² de folha.
O comprimento e a largura das células-guarda dos estômatos foram avaliados utilizando-se a
mesma objetiva e com o auxílio do software AxioVision. Foram tomadas medidas de dez células-
guarda, escolhidas ao acaso, de três repetições de cada planta.
A determinação de teores de clorofilas presentes nas folhas de plantas tetraploides e diploides
foi realizada utilizando-se o equipamento Clorofilog (Falker®) que fornece uma medida
adimensional, o Índice de Clorofila Falker (ICF), em folhas. As leituras foram realizadas em quatro
folhas situadas em região superior do caule das plantas, contadas a partir do ápice em direção a base.
Realizou-se cinco leituras na região mediana de cada folha. Depois, calculou-se a média das cinco
leituras e essa média foi tomada como uma repetição, sendo realizadas dez repetições.
Os resultados obtidos neste conjunto de experimentos foram submetidos à análise de variância
e as médias comparadas através do teste Tukey, a 1% probabilidade.
38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Indução de mutações in vivo em Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de raios gama
4.1.1 Avaliação da radiossensitividade de estacas (enraizadas ou não) à raios gama
Observou-se que as mudas provenientes dos tratamentos com as doses mais elevadas do
agente mutagênico, especialmente exposição à dose de 52,5 Gy de raios gama, apresentaram efeitos
fisiológicos típicos, poucos dias após a irradiação, tais como: plantas com redução no crescimento,
folhas pequenas e deformadas, que se mostravam quebradiças e com pontos cloróticos. Em plantas,
os efeitos fisiológicos pós-irradiação são considerados como transitórios e geralmente cessam durante
o desenvolvimento posterior das plantas (Broertjes & Van Harten, 1988).
No presente estudo, as taxas de sobrevivência de estacas caulinares diminuíram com o
aumento das doses de radiação, independentemente do uso de estacas enraizadas ou não enraizadas
e, também, do uso de estacas com bases protegidas ou desprotegidas (Tabela 1). Outros autores
descreveram a diminuição das taxas de sobrevivência com o aumento das doses de radiação. Boersen
et al. (2007), por exemplo, observaram em mudas de Chrysanthemum diminuições de
aproximadamente 45% nas taxas de sobrevivência após irradiações com dosagens de 20 ou 25 Gy de
raios gama e letalidade completa quando utilizou-se 30 Gy. O mesmo foi observado por Swaroop et
al. (2015) em Bougainvillea, em que a taxa de sobrevivência foi de 41% para dose de 20 Gy, seguida
de 59,5% (15 Gy), 71,5% (10 Gy) e 94% (5 Gy).
Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de sobrevivência de estacas
enraizadas e não enraizadas (protegidas ou não protegidas), quando comparados com as do controle
(estacas não irradiadas) quando foram utilizadas as doses de 7,5 e 15 Gy de raios gama (Tabela 1).
Também foi possível observar que a proteção das bases quase sempre resultou na elevação das taxas
de sobrevivência de plantas após a irradiação, em comparação com as estacas não protegidas,
principalmente nas doses iguais ou acima de 22,5 Gy de mutagênico, seja em estacas enraizadas ou
não enraizadas. Isto provavelmente ocorreu devido à proteção com cilindros de chumbo, o que
possivelmente impediu a ação do mutagênico causando danos nas bases das estacas (onde se
originaram posteriormente as raízes das estacas não enraizadas) e nas raízes já existentes (em estacas
enraizadas).
Isso ficou mais evidente para as doses maiores de radiação, a partir da dose de 30 Gy, em que
houve a observação de diferenças estatísticas entre as estacas com e sem proteção, fortalecendo a
hipótese de danos fisiológicos causados pelo uso de altas doses de radiação associado a não proteção
das bases das estacas (Tabela 1).
39
À exceção da dosagem de 52,5 Gy de raios gama, as demais dosagens de mutagênico resultaram
em maiores efeitos, isto é, reduções maiores nas taxas de sobrevivência de estacas quando se utilizou
estacas não enraizadas, em comparação com estacas enraizadas (Tabela 1).
Tabela 2. Taxas de sobrevivência (em %) de estacas enraizadas e não enraizadas de Mandevilla após uso de diferentes doses de raios gama, com e sem proteção da base.
Estacas enraizada (%) Estacas não enraizadas (%) Tratamentos (Gy) Proteção Proteção Com sem Com sem Dose 0,0 95,7 aA 93,8 aA 68,1 abA 71,8 aA Dose 7,5 100,0 aA 95,7 aA 72,8 abA 72,9 aA Dose 15 100,0 aA 87,1 aA 84,4 aA 71,5 aA Dose 22,5 100,0 aA 73,8 bB 69,2 abB 56,9 aB Dose 30 64,8 bB 52,0 cB 77,0 aA 30,0 bB Dose 37,5 51,1 bA 16,1 dB 51,3 bcA 10,0 bB Dose 45 37,2 cA 10,0 dB 34,5 cA 10,0 bB Dose 52,5 10,0 dB 10,0 dB 37,16 cA 10,0 bB CV 25,94 18,29 F Irradiação 80,59 ** 40,89 ** F Proteção 28,47 ** 62,33 ** F Int. I x P 2,69 * 6,35 **
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0.01) * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (p < 0,05).
Para a escolha da dose de mutagênico mais adequada para uso no experimento seguinte, além
da decisão sobre a pertinência ou não do uso de proteção das bases das estacas com chumbo, foram
realizadas análises de regressão linear dos dados com observação das doses relativas a DL30 e DL50
(dose letal de 30 e 50% das plantas, respectivamente), com proteção ou não das bases das mudas
(Figura 6).
As análises de regressão linear dos dados obtidos com o uso de mudas não enraizadas e com
proteção da base resultaram na equação linear ajustada y = -1,213x + 91,852, onde y é o valor da taxa
de sobrevivência ajustada e x é o valor da dosagem de mutagênico usado (Figura 6). Utilizando-se
esta equação é possível calcular DL30 e DL50 teórico com valores de DL 30 = 24,7 Gy e DL50=
41,2 Gy de raios gama. Para estacas não enraizadas e sem proteção, DL30 calculado utilizando-se a
equação de regressão linear definida y = -1,905x + 87,222, onde y é o valor da taxa de sobrevivência
ajustada e x é o valor da dosagem de mutagênico usado foi de 15,8 Gy, assim como o valor calculado
para DL50 foi 26,3 Gy (Figura 6). O mesmo tipo de cálculo foi realizado para estacas enraizadas e
sem proteção, com DL30 e DL50 ajustados resultando nas doses de 12,8 Gy e 21,4 Gy de raios gama,
40
respectivamente. Enquanto que na irradiação de estacas enraizadas e com bases protegidas, DL30
calculado foi de 14,7 Gy e DL50, foi de 24,5 Gy.
No presente estudo os valores de DL30 e DL50 obtidos quando se utilizou proteção da base
das estacas, apresentaram, tanto para estacas enraizadas como para não enraizadas, maiores valores
(indicando menores radiosensibilidades das estacas) de aplicação de raios gama, em comparação a
não proteção das bases das estacas. Isto indica a importância da proteção da base das estacas no
momento da irradiação como forma de aumentar a sobrevivência e evitar efeitos indesejáveis da
utilização da radiação gama.
O uso de estacas não enraizadas, tanto para estacas protegidas ou não protegidas nas bases,
resultou em menores danos fisiológicos e, consequentemente, em menores letalidades após a
irradiação. Isto significa que, teoricamente, doses mais elevadas de raios gama podem ser aplicadas
em estacas não enraizadas, obtendo-se a mesma letalidade. Diante deste fato, em associação com o
fato de que o uso de doses ligeiramente mais elevadas de mutagênico provavelmente poderão
proporcionar percentagens mais elevadas de obtenção de mutantes ou mutantes com setores mutados
maiores (quimeras). Com base nestas considerações conclui-se que a irradiação de estacas não-
enraizadas com suas bases protegidas por cilindros de chumbo deveria ser usada no experimento
seguinte de irradiação de grande número de estacas, em busca de mutantes de Mandevilla com valor
comercial.
41
Figura 6. Sobrevivência de estacas enraizadas e não-enraizadas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com uso de diversas doses de mutagênico. Estacas enraizadas e não enraizadas, com proteção e sem proteção das bases das estacas.
y = -2,3333x + 112,5R² = 0,9059
-20,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5
% d
e S
obre
vivê
nci
a
Doses de raio Gama
Estacas enraizadas não protegidas
y = -2,037x + 119,72
R² = 0,8638
-20,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5
% d
e S
obre
vivê
ncia
Doses de raio Gama
Estacas enraizadas protegidas
y = -1,9048x + 87,222
R² = 0,8795
-20,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5
% d
e S
obre
vivê
ncia
Doses de raio Gama
Estacas não enraizadas e não protegidas
y = -1,2134x + 91,852
R² = 0,6323
-20,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 7,5 15 22,5 30 37,5 45 52,5
% d
e S
obr
e vi
vên
cia
Doses de raio Gama
Estacas não enraizadas e protegidas
42
Outros autores utilizaram parâmetros distintos para selecionar doses mais apropriadas
de mutagênico para uso em programas de melhoramento de plantas de propagação vegetativa.
Boersen et al. (2007), por exemplo, utilizaram a redução da altura das plantas (GR) para a
seleção de doses ótimas de mutagênico após testar doses crescentes de radiação em mudas
enraizadas de crisântemo e correlacionaram estes resultados com as frequências de mutantes
obtidos após os tratamentos mutagênicos. Os resultados obtidos demonstraram que as maiores
frequências totais de mutações foram obtidas com o uso de doses intermediárias (entre 10 e 15
Gy) mas com maior porcentagem de plantas apresentando quimeras setoriais, que são instáveis.
Em contrapartida, o uso de doses maiores (20 e 25 Gy) resultou na observação de maiores
frequências de mutantes periclinais, estáveis, que possuem maior interesse.
4.1.2 Irradiação de estacas com dose selecionada e seleção de mutantes durante o
florescimento
Foram irradiadas 1.000 estacas não enraizadas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson”
com a dose de mutagênico: 24,7 Gy mais 1.000 estacas não enraizadas da mesma cultivar com
a dose 41,2 Gy de raios gama e, após quatro semanas de enraizamento em substrato, as mudas
foram transplantadas e cultivadas em estufa climatizada.
Durante a seleção de mutantes na época de florescimento não foram encontrados mutantes
nas plantas do controle (Figura 7A) e nem nas plantas irradiadas com dose mais baixa (DL30 =
24,7 Gy). Nas plantas obtidas após a irradiação com dose mais elevada (DL50 = 41,20 Gy),
foram selecionados apenas um mutante anão (Figura 7D) e um mutante de cor da flor (com
pétalas com cor variegada, vermelha e branca) (Figura 7C).
Segundo Konzak e Mikaelsen (1977) a recomendação, observada em estudos anteriores
de mutação induzida, seria para a utilização de mais de uma dose de mutagênico na irradiação
de plantas, em busca de mutantes. Esta estratégia foi utilizada no presente estudo e resultou em
aumento das chances de sucesso, pois possibilitou a obtenção de dois mutantes, apenas nas
plantas irradiadas com a dose mais elevada (41,2 Gy) de raios gama.
43
Figura 7. (A) Flor da cultivar comercial de Mandevilla cv. “Pretty Crimson”; (B) Efeito deletério e transitório nas folhas de plantas M1V1 após a irradiação; (C) Mutante com alteração na cor de pétalas; (D) flores do mutante anão (M1) e do controle (Co).
Segmentos nodais destes mutantes foram extraídos para proceder à multiplicação
vegetativa e obter novos indivíduos. Os clones mutantes foram multiplicados vegetativamente
até a obtenção de 200 indivíduos de cada e colocados em estufa climatizada. Foram observados
no final do ciclo de produção a homogeneidade e estabilidade das plantas clonadas dos
mutantes. O mutante anão apresentou plantas com características distintas daquelas da cultivar
comercial, sendo homogêneas e estáveis. Já o mutante para cor das pétalas se mostrou diferente
da cultivar comercial, mas com plantas demonstrando possuir mutação com pouca estabilidade
e homogeneidade, isto é, as plantas clonadas não apresentaram a mesma distribuição de cores
em suas pétalas, com indicação de quimerismo instável.
Van Harten (1998) recomendou que, em estudos de indução de mutações em plantas,
devem ser utilizadas populações com grande número de indivíduos tratados com mutagênico,
a fim de aumentar as chances de obter mutantes desejados.
Um estudo prévio de indução de mutações em crisântemo resultou na liberação de nova
cultivar mutante após irradiação de uma população de 7.764 plantas. Foram selecionados 5,9%
de mutantes com diferentes cores das sépalas. A partir desta seleção, apenas dois mutantes
tiveram interesse comercial (Tulmann Neto e Latado, 1997). A seleção de maior número de
mutantes com o mesmo fenótipo também pode ser considerado como positivo pois, por não se
saber se as alterações genotípicas foram idênticas, existe a possibilidade de se selecionar mais
44
de um mutante com mesmo fenótipo e, nos testes posteriores de estabilidade e homogeneidade,
aumentam se as chances de sucesso na seleção de algum mutante com valor comercial.
Embora tenha sido utilizado um pequeno número de estacas, o presente trabalho permitiu
verificar alguns pontos relacionados ao uso de mutações baseadas em radiação gama e a
obtenção de dois mutantes. A escolha prévia de doses adequadas de mutagênico não resultou
em grande quantidade de mutações de interesse. Desta forma seria interessante o uso de
quantidades maiores de estacas a serem tratadas com mutagênico visando a obtenção de maior
número de mutantes e/ou com a seleção de outros tipos de mutantes.
Os mutantes obtidos estão sendo mantidos e continuarão a ser avaliados para determinar
se possuem ou não potencial comercial.
4.2 Indução de plantas autotetraploides.
4.2.1 Indução de plantas autotetraploides de M. bahiensis por meio de tratamento in vitro
Após o cultivo temporário (durante 8, 16 ou 24 h.) dos explantes em meios de cultura
contendo concentrações distintas de colchicina (0,025% e 0,05%), além do controle (meio sem
adição de colchicina), não foram observados incrementos nas taxas de mortalidade de explantes
em função do uso de concentrações crescentes de colchicina e do aumento do tempo de
exposição à colchicina (Tabela 3). Este fato não é comum e dá uma indicação de que as
concentrações de colchicina testadas não apresentaram fitotoxidez nas plantas in vitro de
Mandevilla.
As maiores taxas absolutas de mortalidade foram observadas no tratamento de 24 horas
para a dosagem de 0,025% e 0,05%, com 9,3 % e 8,0% de explantes mortos, respectivamente.
Resultados semelhantes foram obtidos por Cavalcanti (2012), com a indução de poliploides de
Heliconia bihai após a aplicação de colchicina nas seguintes doses: 0%, 0,5%, 0,1% e 0,2%,
por 24 e 48 horas.
Os resultados obtidos também demonstraram que, mesmo nos tratamentos do controle (8,
16 e 24 h.), as taxas de sobrevivência não alcançaram 100%. Isto ocorreu possivelmente devido
à imersão e agitação dos explantes durante diferentes períodos em meio de cultura, o que pode
ter ocasionado danos devido à anoxia (Tabela 3).
Após a realização de cultivos sucessivos em meio de indução de brotação foram
selecionados 60 indivíduos ao acaso, de cada tratamento, que foram submetidas as fases de
aclimatização e rustificação às condições ambientais de estufa. O primeiro passo foi a
transferência das plantas in vitro, com ou sem raízes, para câmara de aclimatização. Após quatro
45
semanas, as plantas já bem enraizadas foram transplantadas para vaso de 1,5 L de volume,
contendo substrato comercial (casca de Pinus) para proceder à rustificação em estufa
climatizada.
Tabela 3. Taxa de mortalidade, após cultivo temporário de explantes de M. bahiensis em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina.
Tratamento Horas Taxa de
mortalidade (%)
CONTROLE 8 1,3 a
0,025% 8 5,3 a 0,05% 8 4,0 a
CONTROLE 16 2,7 a
0,025% 16 6,7 a 0,05% 16 2,7 a
CONTROLE 24 6,7 a
0,025% 24 9,3 a 0,05% 24 8,0 a
CV% 28,31
As médias seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
A tabela 4 apresenta os dados do total de plantas enviadas para rustificação e do número
de plantas sobreviventes de cada tratamento durante esta etapa experimental. Observou-se uma
diminuição de plantas aclimatizadas com sucesso, em função do aumento da dose de colchicina,
independente do tempo de exposição. Nos tratamentos com concentração de 0,05% de
colchicina, a mortalidade ficou acima dos 30% nos três tempos de exposição (8, 16 e 24 horas).
Como o período, desde o tratamento com colchicina até a aclimatização das plantas, pode
ser considerado como longo (12 semanas), estes resultados não podem ser associados com uma
possível maior fitotoxidez da colchicina nas doses mais elevadas. Seria mais crível supor que o
uso de doses mais elevadas de colchicina resultou na obtenção de maior número de plantas
poliploides e, estas plantas (poliploides) apresentaram menor vigor e maior dificuldade de
enraizamento, o que resultou em maior mortalidade de plantas in vitro no momento de
aclimatização e rustificação.
46
De fato, também foi possível observar o desenvolvimento inicial (enraizamento) mais
lento das plantas tratadas com colchicina quando comparadas aos das plantas controle. Na
literatura, a mortalidade e o desenvolvimento mais lento em outros materiais vegetais
submetidos à poliploidização estão relacionados possivelmente aos efeitos fisiológicos e
fitotoxidez da colchicina (Tang et al., 2010), assim como observa-se menor taxa de crescimento
nas plantas poliploides.
Tabela 4. Taxa de sobrevivência, após cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina. Plantas mantidas em substrato de Pinus, em vasos de 1,5 L e em estufa climatizada.
Tratamento Horas Taxa de
sobrevivência (%)
CONTROLE 8 71.7 a
0,025% 8 50,0 ab
0,05% 8 40,0 b
CONTROLE 16 70,0 a
0,025% 16 61,7 a
0,05% 16 15,0 b
CONTROLE 24 75,0 a
0,025% 24 56,7 ab
0,05% 24 38,3 b
CV% 24,96 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Por outro lado, uma associação diretamente proporcional entre a taxa de mortalidade de
plantas, com a concentração e com o tempo de exposição ao agente antimitótico já foi relatado
em vários trabalhos de indução de poliploidia in vitro, em diversas culturas, tais como
Asparagus afficinalis (Carmona-Martín et al., 2015), Paulownnia tomentosa (Tang et al., 2010),
Thymus persicus (Tavan et al., 2015), o que é coerente com a ação tóxica da colchicina.
Após as etapas de aclimatização e rustificação foram determinadas as ploidias das plantas
sobreviventes utilizando-se o método de citometria de fluxo, o que possibilitou a classificação
das plantas tratadas em diploides, mixoploides e tetraploides.
47
Como não há relatos na literatura de trabalhos envolvendo análises de citometria de fluxo
para esta espécie, foi necessário primeiramente ajustar o método determinação de ploidia por
citometria de fluxo. Este método ajustado se mostrou adequado para a determinação de ploidia
em plantas da espécie, com a obtenção de resultados na forma de histogramas com capacidade
de diferenciar plantas com ploidias distintas, além de elevada repetibilidade (Figura 8).
Figura 8. Histogramas obtidos por meio da técnica de citometria de fluxo representando a ploidia de plantas diploide (A); mixoploide (B) e tetraploide (C) de M. bahiensis.
O sucesso da poliploidização se encontra no limite entre a toxicidade do agente
poliploidizante e a sua eficácia da duplicação cromossômica (Dhooghe et al., 2011). A
aplicação de baixas doses de colchicina e/ou por períodos curtos de exposição aumentam a taxa
de sobrevivência dos propágulos, mas, por outro lado, podem resultar na diminuição da
porcentagem de plantas poliploidizadas. Já o aumento das doses de colchicina e/ou o aumento
do tempo de exposição, pode resultar em aumento da taxa de mortalidade e da frequência de
indução de plantas poliploides, mas, também, pode ocasionar a formação de células com níveis
de ploidia maiores que as desejadas (octaploides, por exemplo) (Dhooghe et al., 2011).
Atualmente não existe na literatura um consenso para a definição do tratamento mais
adequado para a indução de poliploides, ocorrendo divergências na realização do cálculo da
eficiência dos tratamentos. Segundo Dhooghe et al. (2011) a eficiência na indução de
poliploides consiste na relação entre o número de plantas poliploidizadas e o número de mudas
tratadas. No presente estudo calculou-se a eficiência de poliploidização calculando-se a razão
entre o número de plantas poliploidizadas (considerando-se a soma de tetraploides e
mixoploides) e o número de plantas avaliadas (Tabela 5).
48
Tabela 5. Determinação da ploidia em plantas de M. bahiensis rustificadas, provenientes de explantes previamente submetidos à cultivo temporário em meio de cultura contendo diferentes concentrações de colchicina e diferentes tempos de exposição.
¹ Eficiência = Número de plantas poliploidizadas (tetraploide + mixoploide)/Número de plantas avaliadas x 100
Assim sendo, ao considerarmos os números de plantas poliploidizadas (soma de
mixoploides e tetraploides) obtidos em relação ao total de plantas avaliadas, observamos que a
eficiência máxima de 27% ocorreu no tratamento de 0,025% de colchicina, em 16 horas de
exposição. Já a menor eficiência foi de 5% para o tratamento 0,05% por 16 horas de exposição.
Isso possivelmente foi resultado da alta taxa de mortalidade de plantas in vitro (85%),
representando uma desvantagem se comparado aos demais tratamentos (Tabela 5). De acordo
com Dhooghe et al. (2011), as taxas de eficiência dos tratamentos encontrados em diversos
trabalhos científicos variam entre 15 e 55%.
A eficiência de indução de poliploides pode variar de acordo com a espécie ou cultivar
utilizada. Segundo Silva (2014) a eficiência de indução de poliploidia in vitro é genótipo-
dependente. Outro fator que gera dúvidas no cálculo da eficiência dos tratamentos é a inclusão
ou não, do número de mixoploides obtidos (Dhooghe et al., 2011).
No presente trabalho o uso de colchicina foi efetivo na produção de plantas
autotetraploides de M. bahiensis, apresentando 12 indivíduos com esta ploidia, além de 54
plantas mixoploides (Tabela 5). A concentração de colchicina que induziu à maior porcentagem
de tetraploides foi a de 0,05%, após 24 horas de exposição ao alcaloide (17% de tetraploides),
assim como o tempo de exposição de 24 horas foi melhor para induzir tetraploides em todas as
dosagens. A dose de 0,05% foi sempre melhor para induzir tetraploides, a exceção de 16 horas.
diploide mixoploide tetraploide
CONTROLE 8 43 (100%) 0 0 00,025% 8 17 (57%) 12 (40%) 01 (3%) 220,05% 8 13 (54%) 09 (38%) 02(8%) 18
CONTROLE 16 42 (100%) 0 0 00,025% 16 21 (57%) 14 (38%) 02 (5%) 270,05% 16 06 (67%) 03 (33%) 0 (0%) 5
CONTROLE 24 45 (100%) 0 0 00,025% 24 23 (68%) 08 (24%) 03 (9%) 180,05% 24 11 (48%) 08 (35%) 04 (17%) 20
Eficiência¹ %
Ploidia explantesTratamento Horas
49
Mas, neste caso, o número de plantas tetraploides observadas foi menor (9 indivíduos), devido
à contaminação excessiva durante o cultivo in vitro.
4.2.2 Análises morfológicas e anatômicas de plantas autotetraploides de M. bahiensis
Seis diferentes plantas tetraploides foram identificadas e multiplicadas vegetativamente
em estufa climatizada para o experimento de caracterização morfológica em relação as
seguintes variáveis: folha (largura, comprimento, espessura, área foliar e a relação comprimento
e largura foliar), caule (internódio e espessura) e flor (comprimento corola, largura corola e
espessura pétala)
Com relação à morfologia externa observou-se diferenças significativas entre as plantas
diploides e as autotetraploides (Figura 9).
Figura 9. (A) Flor e folha de planta autotetraploide de Mandevilla bahiensis; (B) Flor e
folha de planta diploide de M. bahiensis. Quadriculado com 1cm².
As plantas autotetraploides obtidas por indução in vitro podem apresentar fenótipos
distintos. Isso pode se dar pois o processo de duplicação cromossômica in vitro é um processo
que causa distúrbios fisiológicos no momento da divisão celular, com o impedimento da
formação das fibras do fuso, induzindo as células (e plantas) a duplicarem o seu conjunto
A B
50
cromossômico. Entretanto, esse processo, por não ser totalmente controlável, podendo ser
excessivo ou parcial, o que pode resultar em alterações indesejáveis, como a obtenção de plantas
tetraploides aneuploides (devido à perda ou ganho de partes de um ou de mais de um
cromossomo), plantas tetraploides mixoploides (contendo setores quiméricos com ploidias
diferentes) e/ou plantas com ploidia mais elevada (octaploides e etc.), oriundas de um mesmo
tratamento mutagênico com o agente antimitótico. Assim, o fato de terem como origem o
mesmo explante, de uma mesma planta, não garante que os regenerantes sejam geneticamente
iguais ou, mesmo, fenotipicamente iguais (Leitch e Bennett, 2004).
Na Tabela 6 podemos observar que seis plantas autotetraploides apresentaram valores
diferentes para largura, comprimento, espessura e área foliar. Para largura folhar e espessura, o
tetraploide 1 foi o que apresentou os maiores valores 50,2 mm e 0,74 mm respectivamente. Para
o comprimento e área foliar, o tetraploide 5 apresentou os maiores valores 45,1 mm e 146,5
mm², respectivamente.
Tabela 6. Características morfológicas de folhas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.
Tratamentos Largura
(mm) Comprimento
(mm) C/L Espessura
(mm) Área Foliar
(cm²) Controle 31,25 d 40,24 ab 1,29 a 0,38 d 55,47 d Tetraploide 1 50,25 a 39,60 abc 0,79 c 0,74 a 94,10 bc Tetraploide 2 46,45 abc 38,55 bc 0,83 bc 0,47 c 114,43 b Tetraploide 3 48,12 ab 38,28 bc 0,79 c 0,58 b 110,26 bc Tetraploide 4 41,59 c 30,89 d 0,73 c 0,47 c 92,74 bc Tetraploide 5 48,34 ab 45,17 a 0,94 b 0,55 bc 146,57 a Tetraploide 6 43,93 bc 34,00 cd 0,77 c 0,48 c 86,52 c CV % 7,7 9,85 9 9,78 19.03 dms 5,64 6,21 0,13 0,084 25,9 Valor de p <.0001** <.0001** <.0001** <.0001** <0,0001**
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico. C/L: relação entre comprimento e largura.
Podemos observar também que a largura média das folhas dos autotetraploides foi maior
do que a média da largura foliar do controle (diploide), enquanto o comprimento médio das
folhas foi quase em sua totalidade menor nos autotetraploides. Para espessura da folha também
houve uma diferenciação, com as plantas autotetraploides apresentando folhas mais espessas.
Shao et al. (2003), trabalhando com indução de tetraploides in vitro usando colchicina em
romã (Punica granatum L.) também observaram alterações nos padrões morfológicos foliares
51
das plantas tetraploides tais como: a diminuição do tamanho da folha e a presença de folhas
mais escuras.
Sobre a morfologia das folhas das plantas tetraploides, Cameron e Frost (1968) e Moreira
(1980) relataram que, comparando-se plantas tetraploides com plantas diploides, as primeiras
geralmente apresentam folhas maiores em largura, do que em comprimento, mais espessas e
com tendência a uma coloração mais escura.
O resultado para a característica distância entre nós (DE), que é relacionada ao vigor das
plantas, não apresentou diferenças significativas entre as plantas controle e as tetraploides
(Tabela 7). Diferentemente do observado por Vichiato et al. (2007), em orquídea, e Dias et al.
(2016), em mudas de eucalipto, a aplicação de colchicina não causou diminuição do vigor das
plantas já estabelecidas. Já para o diâmetro do caule a 10 cm, o tetraploide 1 foi o que apresentou
o maior diâmetro (3,93 mm) e o tetraploide 4 apresentou o menor diâmetro (3,06 mm). Os
demais tetraploides não apresentaram diferenças significativas em relação às plantas do
controle (Tabela 7).
Tabela 7. Diâmetro do caule a 10 cm de altura (DC) e distância entre nós (DE) de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.
Tratamentos DC (mm) DE (cm) Controle 3,64 ab 4,17 Tetraploide 1 3,93 a 5,12 Tetraploide 2 3,64 ab 3,99 Tetraploide 3 3,60 ab 4,02 Tetraploide 4 3,06 b 3,98 Tetraploide 5 3,53 ab 4,4,9 Tetraploide 6 3,16 ab 3,94 CV % 14,75 19,34 dms 0,86 13,58 Valor de p 0,0454* 0,0977ns
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico
A caracterização das flores permitiu observar, nas plantas autotetraploides, o efeito
“giga”, onde os indivíduos poliploides apresentam órgãos maiores, no caso, flores maiores. No
presente estudo observamos um aumento de até 80% na largura da flor de alguns indivíduos
tetraploides. Os indivíduos tetraploides 1 e 2 apresentaram as maiores larguras de flor, ambas
com 60,6 mm (Tabela 8). Já para o comprimento da flor, o tetraploide 6 apresentou o maior
52
valor: 35,6 mm. Este valor é aproximadamente 21% maior que o da planta controle. Já para
espessura de pétalas, em alguns casos o aumento foi maior que 100% quando comparado à
planta controle. O tetraploide 1 apresentou a maior espessura de pétala (0,29 mm) enquanto o
controle apresentou flores com 0,14 mm de espessura de pétala (Tabela 8).
Tabela 8. Largura, comprimento e espessura das flores de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico
As análises histológicas de secções transversais das folhas evidenciaram que havia
diferenças nas estruturas foliares de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias (Tabela 9,
Figuras 10 e 11). A espessura das epidermes adaxial (Ead) e abaxial (Eab) apresentaram-se
maiores (e semelhantes entre si) nas plantas tetraploides em comparação com as plantas
diploides (Tabela 9). As espessuras dos parênquimas paliçádico (PP) e lacunoso (PL) também
apresentaram diferenças entre os valores quando comparadas as plantas tetraploides e as do
controle. Dentro das plantas tetraploides, a de número 1 apresentou a maior espessura (111,14
µm). Novamente as plantas tetraploides apresentaram maior espessura do parênquima lacunoso,
quando comparadas ao da planta diploide (Figuras 10 e 11).
TratamentosLargura de flor
(mm)Comprimento de
flor (mm)Espessura de
flor (mm)
Controle 33,6 d 29,4 d 0,14 cTetraploide 1 60,6 a 30,5 cd 0,29 aTetraploide 2 60,6 a 31,7 bc 0,28 aTetraploide 3 58,3 ab 33,0 b 0,25 bTetraploide 4 56,0 b 32,5 b 0,28 aTetraploide 5 55,3 b 32,9 b 0,28 aTetraploide 6 47,1 c 35,6 a 0,25 b
CV % 3,41 2,8 4,1dms 2,99 1,49 0,017Valor de p <.0001** <.0001** <.0001**
53
Tabela 9. Características anatômicas das terceiras folhas completamente expandidas de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.
Tratamentos Ead (µm) Eab (µm) PP (µm) PL (µm) Controle 25,75 b 16,71 b 66,40 c 102,99 c Tetraploide 1 43,70 a 22,07 a 111,14 a 221,51 a Tetraploide 2 45,58 a 21,66 a 93,05 b 225,07 a Tetraploide 3 44,32 a 21,01 a 90,29 b 170,91 b CV % 15,44 31,17 13,97 23,9 Dms 31,88 3,29 66,34 22,31 Valor de p <.0001** <.0001** <.0001** <.0001**
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0,01). * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (0,01 < p < 0,05). ns = não significativo. Ead – Espessura da epiderme adaxial; Eab – Espessura Epiderme abaxial; PP – Espessura Parênquima paliçádico; PL – Espessura Parênquima lacunoso.
Valores maiores para espessura de parênquimas paliçádico e lacunoso bem como,
espessura total das folhas (soma de mesofilos mais epidermes) foram encontrados em plantas
tetraploides de Phlox drummondii, quando comparadas com as diploides (Vyas et al., 2007).
Ye et al. (2010), ao duplicar os cromossomos de Lagerstroemia indica L., verificaram um
aumento de mais de 50% na espessura das folhas. Enquanto um genótipo diploide apresentava
folhas com espessura de 0,39 mm, plantas tetraploides do mesmo genótipo passaram a medir
0,96 mm de espessura.
Em Triticum observou-se que o volume das células do mesofilo de plantas poliploides
estava fortemente correlacionado com o tamanho do genoma (Jellings e Leech, 1984).
Na análise de anatomia foliar realizada no presente estudo foi possível observar as
diferentes estruturas da folha de M. bahiensis, com estômatos, câmara subestomática,
parênquima paliçádico e lacunoso e epidermes abaxial e adaxial (Figuras 10 e 11).
54
Figura 10. Secção transversal de um folíolo terminal de folha adulta de planta tetraploide de
Mandevilla PP – Parenquima Paliçádico; PL – Parenquima Lacunoso; * – Câmara Subestomática; EAd – Epiderme adaxial; EAb – Epiderme abaxial; Setas brancas indicam estômatos. Barra 100µm.
Figura 11. Secções transversais do limbo foliar de Mandevilla tetraploide (a) e diploides (b). Secção transversal da folha na região da nervura central de Mandevilla tetraploide (c) e diploide (d) Barra 100 µm.
55
4.2.3 Análises estomáticas e determinação de teores de clorofila de plantas
autotetraploides de M. bahiensis
Segundo Dhooghe et al. (2011) existe uma correlação muito forte entre características
estomáticas de folhas e o nível de ploidia de plantas, de modo que essas características podem
ser utilizadas para diferenciar plantas poliploides. Plantas tetraploides tendem a possuir
estômatos maiores, mas geralmente se apresentam com menor densidade estomática nas folhas
(Dhooghe et al., 2011). Estas diferenças no tamanho e no número de estômatos por área têm
sido características comuns apresentadas por diversos materiais vegetais submetidos à
poliploidização, sendo utilizadas como características base na identificação de indivíduos
poliploides em diversos estudos como em Vitis x Muscadinia (Xie et al., 2015) e Thymus
persicus (Tavan et al., 2015).
A análise de caracterização estomática das folhas evidenciou que houve diferenças no
tamanho dos estômatos entre as plantas tetraploides e a do controle (Figura 12 e Tabela 10). A
planta tetraploide apresentava folhas com estômatos com maiores diâmetros polar e equatorial,
o que resultou em estômatos com área acima do dobro do observados nas folhas de plantas
diploides (Tabela 10).
Figura 12. A) estômatos de M. bahiensis de planta diploide; B) estômatos de M. bahiensis de planta tetraploide. Barra = 0,03 mm.
56
Tabela 10. Caracterização de estômatos de secções paradérmicas da superfície abaxial da terceira folha a partir do ápice, com diâmetro polar dos estômatos (DPE), diâmetro equatorial dos estômatos (DEE) e área dos estômatos de plantas de M. bahiensis com diferentes ploidias.
Tratamentos DPE (mm) DEE (mm) Área (mm²) Diploide 0,0346 b 0,0258 b 0,00062 b Tetraploide 0,0528 a 0,0326 a 0,00152 a CV % 7,987 13,637 18,587 Dms 0,0033 0,0037 0,0002 Valor de p <.0001** 0,0013* <.0001**
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. ** significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro (p < 0,01). * significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro (0,01 < p < 0,05). ns = não significativo.
Outro indicador das transformações causadas pela duplicação cromossômica é o índice
de clorofilas Falker a e b (ICFa e ICFb). As clorofilas são grupos de pigmentos verdes
absorventes de luz, ativos na fotossíntese. A luz absorvida por carotenoides ou pela clorofila b
é rapidamente transferida para a clorofila a dando continuidade à cadeia de produção de energia
(Taiz e Zeiger, 2004). Portanto, os teores de clorofilas e as suas proporções equilibradas, são
fundamentais para que as plantas apresentem uma maior eficiência fotossintética.
Provavelmente, quanto maior o teor de clorofila total, maior será a eficiência de produção de
energia para a planta, desde que outros fatores que contribuem para realização da fotossíntese
também estejam em proporções adequadas.
Todos os indivíduos tetraploides apresentaram índice ICFa maiores que o controle, sendo
os tetraploides 1, 2 e 4 os que apresentaram os maiores índices, 43,3, 42,9 e 42,5
respectivamente. Já para o índice ICFb os valores foram, em alguns casos, duplicados em
relação ao do controle. Os tetraploides 1 e 6 apresentaram os maiores valores, ambos com 20,9
(Tabela 11).
Outra característica alterada nas plantas tetraploides de M. bahiensis foi a relação entre
clorofila a e b, que diminuiu nas seis plantas em aproximadamente 30%, quando comparadas
com as plantas diploides (Tabela 11). Romero-Aranda et al. (1997) também observaram valores
25% menores da relação de clorofila a/b nas plantas tetraploides de limão, apesar de verificarem
incremento na concentração total de clorofila nas mesmas plantas.
Para Warner e Edwards (1993), existe uma forte correlação entre tamanho do genoma e
o número de cloroplastos. De modo que, com o aumento da ploidia nas células, ocorre o
aumento de número de cloroplastos. Em milho, essa correlação foi confirmada por Ho e
Rayburn (1991). Em melancia o número de cloroplastos por par de células-guardas é uma
57
técnica usada para a diferenciação de plantas tetraploides e diploides. Enquanto plantas
diploides apresentam em média 11 cloroplastos por par de células, as plantas tetraploides
possuem aproximadamente 19 e, em triploides, a média é de 14. Em melão, as plantas diploides
têm, em média, oito cloroplastos por par de células-guarda, enquanto plantas tetraploides têm
18 (McCuiston e Elmstron,1993).
Assim como as plantas mutantes de Mandevilla da cultivar “Pretty Crimson”, as plantas
autotetraploides estão sendo mantidas em cultivo e continuarão a serem avaliadas para
determinar se possuem ou não potencial comercial e/ou para cruzamentos.
Tabela 11. ICF – Índices de Clorofila Falker a e b de plantas de Mandevilla com diferentes ploidias.
Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey. * probabilidade de erro de 5%. ** probabilidade de erro de 1%. ns – Diferenças não significativas pelo teste estatístico
Tratamentos ICF a ICF b ICFa/ICFb
Controle 34,9 c 9,9 c 3,6 aTetraploide 1 43,3 a 20,9 a 2,1 bTetraploide 2 42,9 a 18,8 ab 2,3 bTetraploide 3 42,1 ab 18,3 ab 2,3 bTetraploide 4 42,5 a 17,7 ab 2,4 bTetraploide 5 39,6 b 15,9 b 2,5 bTetraploide 6 41,8 ab 20,9 a 2,51b
CV % 4,87 14,78 14,33dms 2,722 3,409 0,498Valor de p <.0001** <.0001** <.0001**
58
5 CONCLUSÕES
1. Foi possível estabelecer com sucesso um método de mutagênese induzida com raios gama
em plantas de Mandevilla cultivar “Pretty Crimson” com a seleção de dois mutantes.
2. Foi possível estabelecer com sucesso um método de indução de plantas autotetraploides em
plantas de Mandevilla bahiensis utilizando o método in vitro e identificação por meio de
citometria de fluxo, com a obtenção de várias plantas tetraploides.
3. As plantas autotetraploides de Mandevilla bahiensis apresentam efeito “giga” em relação às
plantas controle, com a presença de órgãos maiores: folhas mais largas, mais espessas, com
maior área foliar; flores maiores e com pétalas mais espessas; folhas com estômatos maiores,
maiores índices de clorofila Falker a e b (ICFa e ICFb), mas menores relações ICFa/ICFb.
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