Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2015 – 2016

Exploratie van Pseudomonas syringae pv. porri en

Pseudomonas fluorescens als pathogeen voor prei en

potentiële preventiemethodieken

Tine Maes

Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert

Co-promotor: Bart Declercq

Tutor: Kevin Dewitte

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2015 – 2016

Exploratie van Pseudomonas syringae pv. porri en

Pseudomonas fluorescens als pathogeen voor prei en

potentiële preventiemethodieken

Tine Maes

Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert

Co-promotor: Bart Declercq

Tutor: Kevin Dewitte

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

Auteursrechtelijke bescherming

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt

onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze

scriptie.

The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more

specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.

Gent, mei 2016

Tine Maes

Auteur

Geert Haesaert

Promotor

Woord vooraf

Ik wil graag alle mensen bedanken die me rechtstreeks en onrechtstreeks hebben geholpen

bij het realiseren van deze thesis.

Hierbij bedank ik eerst en vooral mijn promotor prof. dr. ir Geert Haesaert voor het kritisch

nalezen van mijn thesis.

Ik wil ook mijn co-promotor Bart Declercq heel erg bedanken voor het aanwenden van dit

interessante onderwerp. Bij Inagro heb ik door het opvolgen van de rassenproeven heel wat

bijgeleerd. Bart heeft me altijd goed begeleid zowel bij het schrijven van mijn thesis als bij het

praktische werk. Ik wil ook de mensen bedanken van Inagro voor het opstellen en

onderhouden van de proeven. Bart heeft me ook kennis laten maken met het ILVO, waar ik

Johan Van Vaerenbergh leerde kennen. Johan gaf me moed en raad om de wereld van de

bacteriën te verkennen, omdat hij vol passie kon vertellen over zijn job als bacterioloog. Hij

heeft me raad en informatie gegeven bij het uitvoeren van de infectieproeven en hij leverde

me de bacteriestammen.

Mijn begeleider Kevin Dewitte, samen met de mensen van Bottelare, wil ik ook bedanken

voor de praktische hulp bij de infectieproeven. Ik wil Kevin ook bedanken voor het regelmatig

nalezen van mijn thesis. Ik wil ook Sofie Landschoot en Jan Verwaeren bedanken voor de

hulp met de statistische verwerking in SPSS.

Als laatste gaat ook een woord van dank uit naar mijn ouders voor de steun en de kans die

ze me gegeven hebben om verder te studeren. Ook mijn twee zussen, broer en mijn vriend

Bert wil ik bedanken voor de nodige ontspannende momenten tijdens het maken van deze

thesis wat toch wel wat stress met zich meebracht. Ook mijn vrienden die ik leerde kennen in

Gent waren een goede uitlaatklep. De reis naar Californië in maart met hen was hierbij het

hoogtepunt van mijn vierjarige opleiding in Gent, waarvoor ik ook Dirk Fremaut wil bedanken.

Samenvatting

Prei is een belangrijke teelt in West-Vlaanderen. Bacterieziekte veroorzaakt door

Pseudomonas syringae pv. porri en Pseudomonas fluorescens komt steeds meer voor en

daardoor zijn er oogstverliezen en kwalitatieve schade. De ontwikkelings- en infectiestadia

van bacterieziekten zijn nog niet goed gekend en tevens zijn geen middelen beschikbaar om

de ziekte te bestrijden.

Omdat het bestrijden van bacterieziekte met chemische producten uitgesloten is, werd meer

aandacht besteed aan de preventie van deze infectieziekte. Hierbij wordt vooral teelttechniek

zoals rassenkeuze en bacteriofaagbehandeling onderzocht. Voor dit onderzoek werden twee

rassenproeven opgesteld en een veldproef waarbij bacteriofagen werden toegediend door

middel van verneveling en dompeling van de planten. Bij de rassen zijn onderling geen

significante verschillen waargenomen. Voor de behandeling met bacteriofagen onder

veldomstandigheden dient het toepassingstijdstip en -methode geoptimaliseerd te worden

om tot effectieve reducties te komen van bacteriële aantasting.

Het doel van deze thesis is tevens ook meer inzicht te verwerven over de pathogeen a.d.h.v.

infectieproeven. Deze infectieproeven werden uitgevoerd op jonge preiplanten in

groeikamers met verschillende bacteriestammen bij gecontroleerde omgevingsfactoren. Om

relatieve vochtigheid na te gaan werden de planten afgedekt met plastiek gedurende

verschillende perioden. Als resultaat werden geen significante verschillen opgemerkt voor

deze factor. De temperatuur daarentegen is een bepalende factor voor de graad van

aantasting en de densiteit van bepaalde pathogene stammen. Hogere temperaturen leiden

tot een hogere infectiegraad van P.syringae pv. porri. Uit deze thesis blijkt dat de invloed van

rassenkeuze een minimaal effect heeft op de preventie van bacteriële infectie en dat

faagtherapie in staat is de ziekte te onderdrukken, maar dat de efficiëntie op het veld nog

sterk moet worden verbeterd.

Kernwoorden: Pseudomonas syringae pv. porri - Pseudomonas fluorescens – prei -

temperatuur - vochtigheid

Summary

The production of leek is important in Flanders. Problems with bacterial disease caused by

Pseudomonas syringae pv. porri and Pseudomonas fluorescens are increasing. These

diseases are harmful for the yield and the quality of leek for the fresh market. The real

causes for these disease conditions are not yet known and currently, no chemical products

are available to treat or control.

Therefore, the focus is on prevention rather than treatment. Prevention can be accomplished

by optimizing the cultivation technique such as variety selection and the use of

bacteriophages for biocontrol. In the first part of this thesis, two cultivar trials were conducted

and a field trial where plants were dipped in bacteriophages or sprayed with bacteriophages.

No significant differences were obtained in the cultivar trials. The treatment with

bacteriophages for biological control needs optimization to result in effective reduction of

bacterial infection.

The second part of this thesis investigated the lifecycle of Pseudomonas spp. using

infectiontests with seven bacteria strains. To this end, young leek plants were infected with

the strains, and brought up in a phytotron. This allows to investigate the effect of temperature

and relative humidity. To assess the effect of humidity, plants were covered with plastic for

several periods resulting that the relative humidity did not have a significant influence. The

factor temperature was determinative for the level of infestation and the density of several

strains of Pseudomonas syringae pv. porri or strains coming from the Pseudomonas

fluorescens complex. Higher temperature induces a higher level of infection by strains of P.

syringae pv. porri.

In conclusion, the present thesis showed that there are no big differences between leek

cultivars and that phage therapy is able to reduce bacterial blight symptoms in leek, but to

improve the efficacy of the phages in the field, phage persistence in the plant phyllosphere

should be improved.

Keywords: Pseudomonas syringae pv. porri - Pseudomonas fluorescens - leek -

bacteriophages - temperature - humidity

1

Inhoud Lijst met figuren ..................................................................................................................... 3

Lijst met tabellen ................................................................................................................... 4

1 Inleiding .......................................................................................................................... 5

2 Literatuurstudie .............................................................................................................. 6

2.1 Allium porrum ............................................................................................................... 6

2.1.1 Taxonomie............................................................................................................. 6

2.1.2 Biologie en ecologie .............................................................................................. 6

2.1.3 Teelt en productie .................................................................................................. 7

2.2 Fytopathogene bacteriën en de interactie met planten ................................................. 7

2.2.1 De ziektedriehoek en ziektecyclus ......................................................................... 7

2.2.2 Pathogeniciteit en resistentie ................................................................................10

2.3 Genus Pseudomonas.................................................................................................12

2.3.1 Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo) ...............................................................13

2.3.1.1 Taxonomie en morfologie ...............................................................................13

2.3.1.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme .........................................................14

2.3.1.3 Aanwezigheid en verspreiding in het milieu ...................................................16

2.3.1.4 Symptomen en ziektebeeld ............................................................................18

2.3.2 Pseudomonas fluorescens ...................................................................................18

2.3.2.1 Taxonomie en morfologie ...............................................................................18

2.3.2.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme ..........................................................19

2.3.2.3 Symptomen en ziektebeeld ............................................................................20

2.3.3 Bestrijding en controle .........................................................................................20

2.3.4 Overzichtstabel P.syringae pv. porri versus P.fluorescens ...................................25

3 Materiaal en Methoden ..................................................................................................26

3.1 Rassenproef vroege herfstprei ....................................................................................26

3.1.1 Proefplan ..............................................................................................................26

3.1.2 Teelttechnische maatregelen en klimatologische omstandigheden .......................27

3.1.3 Infectiemethode ....................................................................................................29

3.1.4 Beoordelingsmethode ...........................................................................................29

3.2 Rassenonderzoek late herfstprei en winterprei ...........................................................30

3.2.1 Proefplan ..............................................................................................................30

2

3.2.2 Teelttechnische maatregelen ................................................................................31

3.3 Efficiëntie van faagtherapie onder veldomstandigheden .............................................33

3.3.1 Proefplan .............................................................................................................33

3.3.2 Teelttechnische maatregelen ................................................................................34

3.3.3 Proefhandelingen .................................................................................................34

3.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding en verneveling .....................36

3.4.1 Opkweek preiplanten ............................................................................................36

3.4.2 Infectietechniek via verwonding ............................................................................36

3.4.3 Infectietechniek via verneveling ............................................................................37

3.4.4 Beoordelingsmethode ...........................................................................................37

3.5 Statistische analyse van de metingen .........................................................................38

4 Resultaten .....................................................................................................................39

4.1 Rassenproef vroege herfstprei ....................................................................................39

4.1.1 Proefopzet ............................................................................................................39

4.1.2 Resultaten ............................................................................................................39

4.2 Rassenproef winterprei ...............................................................................................40

4.2.1 Proefopzet ............................................................................................................40

4.2.2 Resultaten ............................................................................................................40

4.3 Bacteriofagentoepassing onder veldomstandigheden .................................................41

4.3.1 Proefopzet en resultaten .......................................................................................41

4.3.2 Bespreking resultaten ...........................................................................................42

4.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding .............................................43

4.4.1 Proefopzet ............................................................................................................43

4.4.2 Resultaten ............................................................................................................43

4.4.3 Bespreking resultaten ...........................................................................................48

4.5 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verneveling .............................................49

4.5.1 Proefopzet ............................................................................................................49

4.5.2 Resultaten ............................................................................................................50

4.5.3 Bespreking resultaten ...........................................................................................53

5 Discussie .......................................................................................................................54

6 Algemene conclusie ......................................................................................................56

7 Referentielijst ................................................................................................................57

8 Bijlagen .........................................................................................................................62

3

Lijst met figuren

Figuur 1: De ziektedriehoek (Perkins et al., 2011) ................................................................. 7

Figuur 2: Voorstelling van de ziektecyclus ............................................................................10

Figuur 3: Co-evolutiemodel bestaande uit vier fasen (Sherif et al., 2015) .............................11

Figuur 4: Werking van het type III secretie systeem bij Xanthomonas (Boch en Bonas, 2010)

.............................................................................................................................................15

Figuur 5: De aanwezigheid en verplaatsing van P.syringae gaat goed gepaard met de cyclus

van de waterstromen (Morris et al., 2013) ............................................................................17

Figuur 6: Schadebeeld van aangetaste preiveroorzaakt door Pspo. .....................................18

Figuur 7: Foto’s genomen op besmet veld in Meulebeke ......................................................20

Figuur 8: De structuur van chitosan, waarvan de aminogroepen meestal niet geacetyleerd

zijn (Xing et al., 2015) ...........................................................................................................22

Figuur 9: Algemene structuur en een elektromicroscopische opname van een bacteriofaag 23

Figuur 10: Proefplan rassenproef vroege herfstprei .............................................................26

Figuur 11: Verloop van de temperatuur en neerslag in Beitem. ............................................29

Figuur 12: Proefplan fagenproef ...........................................................................................33

Figuur 13: Duidelijk chlorotische laesie met aan de top van het blad ....................................37

Figuur 14: Boxplot van de ziekte-index per ras (p-waarde van groep a en b is respectievelijk

0,104 en 0,070) ....................................................................................................................39

Figuur 15: Boxplot van ziekte-index van elk ras met bijhorende significantiegroep ...............40

Figuur 16: Percentage aantasting per beoordeling van dompelbehandeling met fagen en

controle ................................................................................................................................42

Figuur 17: Percentage aangetaste knipjes veroorzaakt door de verschillende stammen van

het P.fluorescens complex bij -2°C (Pm1475 staat voor P.marginalis GBBC 1475, Pf1198

staat voor P.fluorescens GBBC 1198, Pf1171 staat voor P.fluorescens GBBC 1171 en

Ps1937 staat voor P.salmoni GBBC 1937) ...........................................................................44

Figuur 18: Aantal aangetaste knipjes (in %) van iedere stam na 24 u en 48 u afdekking drie

weken na infectie bij 8°C ......................................................................................................45

Figuur 19: Aantal knipjes die infectie vertonen (in %), twee weken na de infectie met 0, 24 en

48 uren afdekking onder plastiek ..........................................................................................45

Figuur 20: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door de bacteriestammen bij 18°C twee

weken na infectie ..................................................................................................................46

Figuur 21: Aantal aangetaste blaadjes (in %) twee weken na infectie veroorzaakt door Pspo

stammen bij 24 en 48 u afdekking op een temperatuur van 28°C .........................................47

Figuur 22: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door Pspo stammen bij 28 °C ...............48

Figuur 23: Handsproeier waarmee de bacteriesuspensie werd verneveld op het blad ..........49

Figuur 24: Totale laesielengte na verneveling met bacteriestam een week na infectie bij een

incubatietemperatuur van 25°C ............................................................................................51

Figuur 25: Totale laesielengte na verneveling per bacteriestam twee weken na infectie bij

een incubatietemperatuur van 25°C .....................................................................................51

Figuur 26: Boxplot van de totale laesielengte twee weken na infectie i.f.v de bacteriestam ..52

4

Lijst met tabellen

Tabel 1: Taxonomische indeling van prei............................................................................... 6

Tabel 2: Taxonomische indeling van Pseudomonas .............................................................12

Tabel 3: Taxonomische indeling van Pspo ...........................................................................13

Tabel 4: Taxonomische indeling van P.fluorescens ..............................................................18

Tabel 5: Vroege herfstrassen (15) opgenomen in de proef ...................................................27

Tabel 6: Algemene werkzaamheden en bemestingen. .........................................................27

Tabel 7: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen .............................................................28

Tabel 8: Klimatologische omstandigheden opgemeten in Beitem vergeleken met de

gemiddelde waarden ............................................................................................................28

Tabel 9: De 12 klassen ingedeeld volgens percentage aantasting........................................30

Tabel 10: Opgenomen rassen in de proef late herfst-winterprei ............................................31

Tabel 11: Algemene werkzaamheden en toegepaste bemestingen ......................................31

Tabel 12: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen ...........................................................32

Tabel 13: Overzicht van de objecten opgenomen in de bacteriofagenproef ..........................33

Tabel 14: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen bij de fagenproef ................................34

Tabel 15: Datum van infectie, behandeling en bemonstering. ...............................................35

Tabel 16: Percentage aantasting van de planten en bijhorende ziekte-index per object .......41

Tabel 17: Overzichtstabel van percentage aangetaste knipjes bij 0,24 en 48 u afdekking

(0/24/48) ...............................................................................................................................48

Tabel 18: Aantal zieke blaadjes een en twee weken na infectie bij 25°C na 24 u afdekking .50

5

1 Inleiding

Preiteelt is in Europa een belangrijke teelt waarvan het areaal geschat wordt op 28 000 ha.

België is de derde grootste Europese producent met een relatief stabiel areaal van 4500

hectaren (Eurostat, 2016). Meer dan de helft van de geteelde prei dient voor export. De

Vlaamse prei is van hoge kwaliteit mede door het invoeren van verschillende labels zoals

Flandria, GlobalGap etc. Om aan deze hoge kwaliteit te voldoen is vakmanschap een must

en het ziektevrij houden van het gewas een grote uitdaging. Bladvlekkenziekte en bacteriële

rot veroorzaakt door Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo) en P. fluorescens is gestaag

aan het toenemen in Vlaanderen. Een vermoedelijke verklaring is dat steeds meer preitelers

hun plantmateriaal aankopen bij plantenkwekerijen en niet meer zelf opkweken. In deze

kwekerijen wordt de verspreiding van de pathogeen gestimuleerd door grote plantdichtheden

en bepaalde handelingen zoals maaien en irrigeren (Rombouts et al., 2015). Een factor die

de verspreiding van de pathogeen ook in de hand werkt, is het preiafval die na het schonen

terug op de akkers wordt gevoerd (van Overbeek et al., 2010). De gevolgen kunnen

uiteenlopend zijn. Licht aangetaste percelen ondervinden geen enkele economische schade.

Wanneer echter de omstandigheden voor de bacterie ideaal zijn, kan de schade hoog

oplopen. Deze schade uit zich door een gedaalde kwaliteit van het eindproduct, waardoor

deze voor de versmarkt niet meer voldoet aan bepaalde kwaliteitslabels. Vooral in de winter

van 2010-2011 werd er veel schade waargenomen die veroorzaakt werd door P.

fluorescens. Chemische bestrijdingsmiddelen tegen bacteriële ziekten zijn niet beschikbaar

in België. Het is dus belangrijk om preventief de ziekte onder controle te houden. Een eerste

mogelijkheid is om op zoek te gaan naar rassen die bestendiger zijn tegen infectie van dit

pathogeen. In deze thesis werden aldus twee rassenproeven bemonsterd in functie van

gevoeligheid aan bacteriële infectie. In een tweede luik van het praktische deel werd een

veldproef aangelegd om de werking en de toepassingswijze van faagtherapie onder

veldomstandigheden te onderzoeken. Deze veldproef dient een antwoord te bieden op de

vraag of het toedienen van bacteriofagen via veldbespuitingen of dompelbehandeling de

aantasting van Pseudomonas kan verminderen.

Om infectie door bacteriële pathogenen te kunnen voorkomen, is het tevens van belang een

inzicht te verwerven in de levenscyclus van deze organismen. Doordat de ziekte niet wordt

veroorzaakt door één specifieke stam, maar door verschillenede stammen, wordt het een

heel complex gegeven. Hierbij is het interessant te weten welke bacteriestammen het meest

virulent zijn, op welke wijze ze infecteren en hoe het komt dat bepaalde bacteriën zo

agressief zijn. Infectiedruk is mede sterk afhankelijk van de omgevingsfactoren zoals

temperatuur en relatieve vochtigheid. In een derde luik werden verschillende infectieproeven

uitgevoerd onder gecontroleerde omgevingsfactoren. Hieruit kan worden afgeleid welke

bacteriestammen het meest infectieus zijn op jonge preiplanten en bij welke temperatuur de

infectie het snelst optreedt.

6

2 Literatuurstudie

2.1 Allium porrum

2.1.1 Taxonomie

Prei of Allium porrum maakt deel uit van de lookfamilie (Alliaceae) (Block, 2010).Volgens

Khedim et al. (2013) zou de familie Amaryllidaceae (Asparagales) een betere benaming zijn

voor de familie waartoe het geslacht Allium behoort. Het geslacht Allium omvat meer dan

800 soorten waarvan de economisch belangrijkste gewassen ui, sjalot, knoflook, bieslook en

prei zijn (Block, 2010).

Tabel 1: Taxonomische indeling van prei.

2.1.2 Biologie en ecologie

Prei of Allium porrum is net zoals grassen een eenzaadlobbige of monocotyl. Kenmerken

van monocotylen zijn de parallelnervige bladeren en een homorhiz wortelstel dat bestaat uit

adventief wortels. Prei is een tweejarige plant en wordt geoogst in vegetatieve toestand

tijdens het eerste groeijaar. Als de prei niet zou worden geoogst, zou deze in het tweede jaar

na een dormante periode generatief worden. Om generatief te worden heeft de plant een

koude periode nodig. Dit fenomeen wordt vernalisatie genoemd. Soms is het mogelijk dat

bepaalde planten reeds in het eerste jaar generatief worden. Dit is niet gewenst omdat deze

zogenoemde “schieters” niet meer vermarktbaar zijn. De meest aannemelijke oorzaak van

schieten is dat de plant tijdens de groeiperiode in stress heeft komen te staan. Een

voorbeeld van zo’n stresssituatie is een lange droogteperiode tijdens vroege zaai of vroeg

uitplanten. Bij late oogst van winterprei (april) neemt de kans op schieters toe door de stijging

van lange dagen na vernalisatie (Wiebe, 1994).

Prei is een vollegrondgroente die bestaat uit bij- of adventief wortels, lange bladscheden,

bladschijven en groene bladeren. De pseudostengel (schacht) die is opgebouwd uit

bladscheden en bladschijven is cilindrisch van vorm en bevindt zich onder de grond. Het is

vooral deze structuur die wordt geconsumeerd. Doordat de pseudostengel onder de grond zit

bevat deze geen chloroplasten en is ze dus wit van kleur. Door de wortelstructuur vereist de

teelt van prei een losse bodemstructuur. De plant is niet in staat om diep in de grond haar

nutriënten en water te halen zoals bij dicotyle planten met een vertakte penwortel wel het

Rijk Plantae

Stam Embryophyta

Klasse Spermatopsida

Orde Asparagales

Familie Alliaceae

Geslacht Allium

Soort Allium porrum

7

geval is. Prei laat wel een goede structuur na in de bodem want er treed meestal geen

compactie op zelfs wanneer de oogst gebeurt bij te natte omstandigheden (ten Berge et al.,

2010).

2.1.3 Teelt en productie

In 2014 bedroeg het areaal prei in Europa 27 800 hectaren. Turkije, Frankrijk, België en

Polen zijn de belangrijkste Europese producenten met respectievelijk 29 %, 19 %, 16 % en

15 % van het Europese areaal (Eurostat, 2016). In België wordt prei vooral in West-

Vlaanderen geteeld. Het gematigd klimaat zorgt voor ideale omstandigheden voor de teelt

van prei. Lichte en zandige kleigronden zijn het meest geschikt en een lage pH-waarde dient

vermeden te worden. Bij zure gronden zijn er problemen met nutriëntendeficiënties. In een

gematigd klimaat kan een opbrengst van gemiddeld 35 tot 50 ton per hectare worden

gerealiseerd. De nutritionele behoeften zijn 200-250 kg N/ha , 50-100 kg P2O5 en 150-200

kg K2O (Vanheule H., 2015).

Tegenwoordig worden bijna uitsluitend F1 hybriden geteeld. Het telen van hybriderassen

brengt heel wat voordelen met zich mee zoals een betere kwaliteit, betere bewaarbaarheid

en uniformere prei. Prei kan het jaar rond worden geteeld aangezien er zomer-, herfst- en

winterrassen bestaan. Het gewas staat ongeveer zes maanden op het veld. Door zijn relatief

lange groeiperiode moet prei regelmatig worden behandeld met fungiciden en insecticiden.

Ongeveer 30 % van de prei wordt verwerkt door de industrie, de overige 70 % dient voor de

verse markt (Declercq, 2009).

2.2 Fytopathogene bacteriën en de interactie met planten

2.2.1 De ziektedriehoek en ziektecyclus

Infectieziekten bij planten zijn ziekten die worden veroorzaakt door virussen of levende

organismen zoals schimmels en bacteriën. Als er interactie is tussen de plant en het

pathogeen bij gunstige omgevingsfactoren dan wordt de plant ziek. Het al of niet optreden

van ziekte is dus afhankelijk van drie factoren: de plant, de ziekteverwekker en de milieu-

invloeden. Onderstaande figuur toont deze ziektedriehoek (Perkins et al., 2011).

Figuur 1: De ziektedriehoek (Perkins et al., 2011)

8

De ziektecyclus omvat verschillende ontwikkelingsfasen die worden doorlopen bij een

infectieziekte. De opeenvolging van deze fasen leidt tot ontwikkeling en uitbreiding van de

ziekte. De eerste fase in de cyclus is de inoculatiefase waarbij de organismen aan het

buitenoppervlak van de plant aanwezig zijn. De besproken bacteriën in deze thesis zijn

polycyclisch. Ze kunnen m.a.w. meerdere generaties per seizoen aanleggen. Dit is niet

abnormaal bij bacteriën aangezien deze zich heel snel kunnen vermenigvuldigen. De

groeisnelheid van fytopathogene bacteriën is afhankelijk van bepaalde milieufactoren zoals

zuurtegraad, temperatuur, vochtigheid etc. Vooraleer de bacterie het waardplantweefsel

binnendringt, moet deze in staat zijn epifytische groei te verwezenlijken. Hiervoor moet de

pathogeen weerstaan aan ongunstige omgevingsfactoren zoals dehydratatie, uv-licht,

lekkage van nutriënten, competitie met andere epifyten enz. Het is een grote uitdaging om te

kunnen overleven aan het bladoppervlak van de plant. De aanwezigheid van een slijmlaag

(biofilm) rond de bacterie zorgt ervoor dat dit mogelijk is. De biofilm is een beschermende

slijmlaag die de celwand van de bacterie omvat en voornamelijk uit exopolysachariden

bestaat (EPS) (Jones en Dang, 2006; Thordal-Christensen, 2003). Niettegenstaande de

soms minder gunstige omgevingsfactoren zijn pathogenen in staat hoge populatiedichtheden

op te bouwen nl. tot 106-107 cellen per cm². Het fenomeen dat bacteriën gebruiken om hun

populatiedichtheden onder controle te houden heet quorum sensing (QS). Bij quorum

sensing gaan de bacteriën enkel de plant infecteren als ze met een voldoend groot aantal

zijn zodat de plant zich niet voldoende kan verweren (Whitehead et al., 2001). De

levenscyclus van sommige bacteriën zoals Pseudomonas impliceert zowel epifytische als

endofytische groei. De potentie om te weerstaan aan epifytische omstandigheden varieert

afhankelijk van soort en stam. Tijdens deze epifytische groeifase is de biofilm heel belangrijk

om te overleven.

De adhesie is de tweede stap in de cyclus. Deze fysieke aanhechting aan de plant betekent

dat een niet-specifieke binding tussen bacterie en plant gevormd wordt via hydrofobe

interacties. Deze stap is nog reversibel. Later wordt deze binding onomkeerbaar doordat

bacteriën zich vasthechten m.b.v. pilli, fimbrae of polysachariden (cellulose fibrillen of klein

oplosbaar cyclisch beta-1glucaan). Pseudomonas syringae species hechten zich aan de

bladoppervlakte via pilli (Baker et al., 2011).

Na de adhesie gaat de bacterie de plant penetreren. Pathogene schimmels hebben

gespecialiseerde structuren om het plantenweefsel rechtstreeks te penetreren zoals de

aanleg van een appresorium. Anders is het bij de meeste bacteriën. Deze kunnen enkel de

plant binnendringen via wondjes of natuurlijke openingen zoals lenticellen, hydathoden en

stomata. Als de plant aan actieve fotosynthese doet gaan de stomata open om CO2 in de

plant te laten en zuurstof en waterdamp vrij te stellen aan de omgeving. Tijdens dit opengaan

worden organische componenten vrijgesteld waarop bladpathogenen reageren. Als reactie

op deze organische componenten, verplaatsen de bacteriën zich naar de geopende stomata,

waar ze een vrije toegang hebben tot de plant (Goehre en Robatzek, 2008). Het

binnentreden van bacteriën via de stomata is dus geen passief en toevallig proces, maar

wordt geregeld door de vrijstelling van organische componenten tijdens het openen van de

9

stomata. De stomata bestaan uit twee speciale epidermale cellen: de sluitcellen. Door

veranderingen van de turgordruk in deze cellen gaan de stomata open of dicht. De sluitcellen

zijn in staat om PAMP’s (Pathogen-Associated Molecular Patterns) te herkennen. Wanneer

deze PAMP’s herkend worden, gaan de stomata onmiddellijk dicht. De receptoren in de

sluitcellen kunnen geen onderscheid maken tussen niet-pathogene en pathogene bacteriën.

Pathogene bacteriën kunnen echter een heropening van de stomata induceren. Het

fytotoxine coronatine zou voor deze inductie verantwoordelijk zijn. Echter pathogenen die

geen coronatine kunnen produceren, zijn ook in staat om stomata te heropenen. Er zouden

dus mogelijks nog andere fytotoxinen bestaan, die de oorzaak zijn van dit fenomeen (Melotto

et al., 2008). Coranotine heeft dezelfde structuur als methyl-jasmonaat, die de

jasmijnzuurcyclus activeert. Aangezien coranotine dezelfde structuur en functioneel

homoloog is aan het methyl-jasmonaat, kan deze als modulator optreden in de jasmijnzuur

cyclus. Jasmijnzuur is een signaalhormoon in de plant en regelt het openen en sluiten van de

stomata. Het sluiten van de stomata wordt aanzien als de eerste PTI (PAMP Trigered

Imunity) respons. Bepaalde bacteriën hebben hun flagellinemolecule gemodificeerd zodat ze

niet meer worden herkend door de receptoren van de sluitcellen en zo makkelijker toegang

hebben tot de apoplast (Sun et al., 2006).

Sommige bacteriën kunnen echter rechtstreeks doorheen de celwand penetreren door

productie van enzymen of via het type III secretiesysteem. P. fluorescens bevat

pectinolytische enzymen die pectinen in de celwand afbreken. Anderzijds is er het type III

secretie systeem dat een kanaaltje maakt in de celwand en in het plasmamembraan. Op

deze manier kan de bacterie rechtstreeks zijn effectoren in de plantencel injecteren (Sherif et

al., 2015). Na de penetratie wordt de plant geïnfecteerd. Tijdens de infectie komt de bacterie

in contact met gevoelige weefsels en cellen van de plant die als voedingsbasis dienen. In

deze fase worden meestal de ziektesymptomen duidelijk. Als gevolg van een geslaagde

infectie treedt gastheer-kolonisatie op. Fytopathogene bacteriën vermenigvuldigen zich

intercellulair. Ze dringen de plantencel niet binnen, maar bevinden zich tussen de

plantencellen. Sommige bacteriën zoals Xanthomonas (pathogeen voor kolen) kunnen zich

in het vaatbundelsysteem vestigen. Deze bevinden zich in het xyleem, met als gevolg

verwelking van de plant (Höfte en De Vos,2006).

10

Figuur 2: Voorstelling van de ziektecyclus

2.2.2 Pathogeniciteit en resistentie

Fytopathogene bacteriën interfereren met heel wat processen in het plantmetabolisme om

aan hun nutritionele behoefte te voldoen. Deze interactie tussen plant en pathogeen grijpt

plaats op moleculair niveau. Planten en pathogene bacteriën hebben specifieke

mechanismen ontwikkeld om respectievelijk hun resistentie en pathogeniciteit te versterken.

Dit proces wordt beschreven in het co-evolutie model dat bestaat uit vier fasen. Dit co-

evolutie proces wordt ook het zigzag model van het plantimmuunsysteem genoemd. In de

eerste fase (Figuur 3a) is de plant in staat om componenten en structuren (PAMP’s) van

micro-organismen te herkennen. Als reactie op deze aanwezige moleculen wordt een basaal

defensie mechanisme geactiveerd (PTI). Dit mechanisme draagt bij tot een vorm van

resistentie tegenover binnendringende pathogenen, samen met de natuurlijke fysische en

chemische barrières van de plant. Alle plantensoorten vertonen dus enige graad van

immuniteit tegenover pathogene bacteriën. Enkele van deze bacteriën hebben zich

aangepast om via virulentie factoren het basaal defensiesysteem van planten te doorbreken.

Veel plantpathogene bacteriën gebruiken het type III secretie systeem (T3SS) om hun

virulentie eiwitten direct in het cytoplasma van de gastheer te brengen. Op deze manier

wordt vermeden dat de plant de pathogene eiwitten herkend en dus een defensie-

mechanisme zou kunnen worden opgestart (Figuur 3b). In de daarop volgende fase hebben

bepaalde planten specifieke R-genen ontwikkeld die coderen voor resistentie eiwitten (R-

proteïnen). Deze zijn wel weer in staat om virulentiefactoren te herkennen zodanig dat

resistentie terug wordt hersteld (Figuur 3c). Sommige bacteriën zijn in staat om hun

effectoren te elimineren of modificeren zodat de plant ze niet meer herkent (Figuur 3d). Dit

evolutionair proces tussen pathogeen en plant wijst er op dat bacteriesoorten specifieke

gastheerplanten hebben. Dit hangt af van de graad van virulentie van de pathogenen en

tolerantie of resistentie van de plant. De belangrijkste fytopathogene bacteriën zijn

11

gramnegatief en gebruiken het T3SS om hun virulentie factoren in de plantencel te brengen

(Sherif et al., 2015).

.

Figuur 3: Co-evolutiemodel bestaande uit vier fasen (Sherif et al., 2015)

12

2.3 Genus Pseudomonas

Tabel 2: Taxonomische indeling van Pseudomonas

Rijk Bacteria

Stam Proteobacteria

Klasse Gammaproteobacteria

Orde Pseudomonales

Familie Pseudomonaceae

Geslacht Pseudomonas

Ziekten veroorzaakt door bacteriën komen minder voor dan ziekten veroorzaakt door

schimmels en virussen. De meeste bacterieziekten komen voor in tropische gebieden, waar

het warm en vochtig is. Toch is er in Vlaanderen een stijgende tendens in voorkomen van

bacteriële infectie veroorzaakt door Pseudomonas bij prei. Deze stijgende tendens is

hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het feit dat meer preitelers hun plantmateriaal laten

opkweken bij grote plantenkwekers. In deze kwekerijen worden veelal de preiplanten op

dezelfde grond opgekweekt, waardoor de preiplanten mogelijks vanuit de kwekerijen al

besmet zijn met Pspo. Andere handelingen die de verspreiding in de hand werken zijn het

toppen van de bladeren bij de planten waardoor wondjes ontstaan en irrigatie (Rombouts et

al., 2015).

Bacteriën zijn eencellige organismen die gekenmerkt worden door een prokaryotische

cellulaire bouw. Prokaryoten hebben geen kern en hebben ook geen membraan-omvattende

celorganellen. De afmetingen van jonge culturen van bacteriën varieert van 0,6 tot 3,5 µm.

Het cytoplasma in de cel is gevuld met een colloïdale massa waar ribosomen, reserve- en

afvalproducten zijn in opgelost. De ribosomen van bacteriën (70s) zijn kleiner dan deze van

eukaryoten (80s) en ook de moleculaire structuur is verschillend. Het genomisch DNA ligt los

in een niet afgebakende zone in het cytoplasma van de cel. Het genoom van bacteriën

bestaat uit enkele miljoenen basenparen en duizenden genen, meestal gelegen op een

cirkelvormig chromosoom. Het reproductieproces van bacteriën d.m.v. binaire deling gaat

veel sneller dan bij eukaryoten. Daarnaast kunnen ook plasmiden of transposons aanwezig

zijn. Plasmiden zijn kleine cirkelvormige DNA strengen die geen rechtstreeks verband

houden met het metabolisme van de bacteriecel. De plasmiden bevatten eerder

resistentiegenen tegen antibiotica of genen die coderen voor infectieuze proteïnen en

kunnen onderling tussen bacteriën worden uitgewisseld via een zogenoemde pillus. Het op

deze manier overdragen van DNA tussen bacteriën onderling wordt ‘horizontal gene transfer’

genoemd en ligt aan de basis van de snelle evolutie van bacteriën (Vidaver en Lambrecht,

2004).

13

Het geslacht Pseudomonas behoort tot de gramnegatieve bacteriën, meer bepaald tot de

gamma subklasse van de Proteobacteria (Kersters et al.,1996). Zoals de meeste

plantpathogene bacteriën zijn ze staafvormig. Ze zijn ongeveer 0,5 tot 1 µm breed en hebben

een lengte van 1,5 tot 4 µm. De pseudomonassoorten zijn meestal lipotrich. Dit betekent dat

ze meerdere flagellen bezitten aan slechts één zijde. Niettegenstaande zijn sommige echter

onbeweeglijk. Veel soorten uit dit genus zijn fluorescent. Het geslacht Pseudomonas heeft

een heel groot aantal soorten waarvan verschillende pathotypes bestaan. Ze leven in bodem

en water en zijn doorgaans overal terug te vinden (Höfte en De Vos,2006).

Pseudomonas species behoren tot de rRNA groep I (Palleroni et al.,1973). De taxonomische

indeling van deze groep van organismen is verwarrend en zou beter worden aangepast

(Höfte en De Vos, 2006).

2.3.1 Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo)

2.3.1.1 Taxonomie en morfologie

Tabel 3: Taxonomische indeling van Pspo

Rijk Bacteria

Stam Proteobacteria

Klasse Gammaproteobacteria

Orde Pseudomonales

Familie Pseudomonaceae

Geslacht Pseudomonas

Soort Pseudomonas syringae pv. porri

P.syringae pv. porri is een homogene groep die verschillende stammen omvat. Het zijn

gramnegatieve staafjes en ze kunnen zich goed bewegen door de aanwezigheid van twee

flagellen van het serotype H1. Pspo zijn obligate aëroben, kunnen glucose oxideren en

groeien dus goed op een minimaal medium met glucose. P.syringae soorten zijn overal

aanwezig. Groei treedt op bij een breed temperatuursinterval van 4° C tot 40° C. Ze zijn

oxidase negatief en arginine dihydrolase negatief (Samson et al., 1998). Van de oxidase

negatieve species, is P.syringae de meest belangrijkste. Deze bacteriesoort omvat meer dan

50 pathovars. Oorspronkelijk werd aangenomen dat iedere pathovar een specifieke

waardplant had (Young et al., 2004). Noble et al. (2006) diagnosticeerde echter Pspo op ui

en sjalot, waarvan men vroeger dacht dat deze enkel pathogeen was voor prei.

Via DNA-DNA hybridisatie en RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) amplificatie

was Gardan et al. (1999) in staat 48 onderzochte pathotypes van P.syringae in negen

genomiespecies in te delen. Iedere groep heeft een specifieke onderscheidende ribogroep.

Alle pathovars die tot dezelfde genomiespecies behoren, zijn minstens 70 % homogeen. Zo

14

zit Pspo in genomiespecies 4 samen met P.coronofaciens, P.s.pv. garcae, P.s. pv.

striafaciens, P.s. pv. atropurpurea, P.s. pv. oryzae en P.s. pv. zizaniae. De organismen die

tot genomiespecies 4 behoren hebben allemaal ribogroep F in hun genoom (Höfte en Vos,

2006). Op hetzelfde moment was Sawada et al. (1999) bezig met een fylogenetische analyse

van 56 stammen uit 19 verschillende pathovars van P.syringae. Hierbij werden vier genen

bestudeerd. Om het verloop van de genoomevolutie vast te stellen werden de genen gyrB en

rpoD bekeken. De genen hrpL en hrpS zijn gelokaliseerd op het chromosoom en gerelateerd

aan pathogeniciteit. Uit deze analyse konden de stammen ingedeeld worden in drie

monofyletische groepen. Groep 1 bevatte de organismen die behoorden tot genomiespecies

3 en 8, ontwikkeld door Gardan et al. (1999). Groep 2 correspondeerde met genomiespecies

1 en groep 3 kwam overeen met genomiespecies 2. Vijf jaar later werd de structuur van de

P.syringae populatie en de veranderingen van het genoom bestudeerd met de MLST (Multi

Locus Sequencing Typing) analyse. Er werden 60 stammen onderzocht uit 21 pathovars en

er waren twee pathovars niet pathogeen. MLST is een recente analysetechniek waarbij het

mogelijk is om stammen te typeren door het gemeenschappelijk genoom te vergelijken. Deze

analyse is gebaseerd op de zogenoemde zeven “housekeeping genes”. Bij deze analyse

werden vier groepen getypeerd. De eerste drie komen overeen met deze geïdentificeerd

door Sawada et al. (1999), een vierde groep bevat enkel stammen die pathogeen zijn op

monocotylen (rijst, ui en prei) en die behoren tot genomiespecies 4. De waardplant van het

pathogeen wordt niet bepaald in het core genoom, maar wordt bepaald door andere factoren

(Sarkar en Guttman, 2004).

2.3.1.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme

Pspo is niet enkel een pathogeen voor prei. Deze pathogeen werd ook vastgesteld bij

andere Allium species zoals ui (Allium cepa) en sjalot (Allium cepa var. aggregatum) (Noble

et al., 2006).

P.syringae stammen gebruiken het type III secretie systeem (T3SS) om de plant te

parasiteren. Diverse gramnegatieve bacteriën gebruiken dit mechanisme om

virulentieproteïnen in de plant te kunnen injecteren. In Figuur 4 is de werking van het type III

secretiesysteem bij Xanthomonas voorgesteld. Bij Xanthomonas soorten zijn de belangrijkste

groep van effectoren afkomstig van de TAL (Transcription Activator-Like) familie. De injectie

van de effectoren in het cytoplasma van de plantencel gebeurt via een holle injectienaald. De

geïnjecteerde effectoren gaan vervolgens naar de nucleus van de plantencel waar ze

bepaalde targetgenen, die interfereren met het afweersysteem van de plant, induceren om

tot expressie te komen (Boch en Bonas, 2010). De hrp genen (hypersensitive response en

pathogeniciteit) en de hrc genen (hrp conserved) coderen voor de type III eiwitten. De

effectorproteïnen die in de plantencellen worden geïnjecteerd door T3SS zijn belangrijk voor

de pathogeniciteit (Jin et al.,2003). Het hrp genensysteem zorgt voor de tanslocatie van

effectoreiwitten doorheen de plantencelwand en plasmamembraan (Buel et al., 2003). Deze

effectorgenen kunnen verspreid liggen in het genoom of op een plasmide en al dan niet

vervat in een pathogeeneiland of geassocieerd met de hrp cluster ( Oguiza en Asensio,

2005). Type III effectoreiwitten laten de cel lekken, waardoor water en nutriënten vanuit de

15

gastheercel in de apoplastische ruimte terecht komen. Daarenboven onderdrukken de

effectoren het defensiemechanisme van de plant. Ze interageren met de virulentietargets van

de plant.

Figuur 4: Werking van het type III secretie systeem bij Xanthomonas (Boch en Bonas, 2010)

.

Bij resistente planten zijn de effectoren avirulent. De resistentiegenen van de plant

herkennen het effector-virulentie target complex en activeren een hypersensitive response

(HR). Dit is een primaire verdediging van de plant waarbij omringende cellen versneld

afsterven. Gevoelige planten bezitten deze resistentiegenen niet waardoor het

defensiemechanisme van de plant niet wordt geactiveerd. De effectoren zijn in deze situatie

virulent en pathogeen (Oguiza en Asensio, 2005). Type III effectoren van P.syringae kunnen

in twee klassen worden gegroepeerd afhankelijk van de targetlocatie in de plant.

Extracellulaire types en intracellulaire types zijn beschreven. Intracellulaire type III eiwitten

worden vanuit de bacteriecel direct in het cytosol van de plantencel gebracht. Recente

studies toonden aan dat deze effectoren heel virulent zijn door hun sterk vermogen om

verscheidene beschermingsmechanismen zoals gen-om-gen resistentie en primaire

resistentie, te onderdrukken (Nomura et al.,2005). Extracellulaire type III effectoreiwitten zijn

rijk aan glycine, maar bevatten geen cysteïne. Deze proteïnen worden ook wel harpinen

genoemd en zijn stabiel bij hogere temperaturen. Wanneer ze geïnjecteerd worden in de

intercellulaire ruimte van de bladeren, lokt dit een soort hypersensitieve reactie uit bij de

plant. HrpZ en HrpW zijn voorbeelden van extracellulaire type III effectoren. Waarschijnlijk

helpen deze harpinen bij het translocatieproces van de effectoren in het cytoplasma van de

gastheercel of zijn ze verantwoordelijk voor het lekken van nutriënten uit de cel van de

gastheer (Höfte en Vos, 2006).

16

Pseudomonas spp. produceren heel wat fytotoxische stoffen die dienen als virulentiefactor.

De meest gekende toxinen worden door P.syringae pathovars geproduceerd (Bender et al.,

1999). Enkele voorbeelden van toxinen die door P.syringae pathovars worden geproduceerd

zijn: tabatoxine, phaseolotoxine, syringomycine, syringopeptine en coronatine. Deze

fytotoxinen bevorderen de verplaatsing van de bacterie in de plant, de laesiegrootte en de

vermenigvuldiging van de pathogeen in de gastheer. Tabatoxine wordt geproduceerd door

P.s. pv. tabaci, coronafaciens en garcae, die tevens allemaal tot genomiespecies 4 behoren.

P.s. pv. striafaciens behoort ook tot genomiespecies 4, maar maakt geen tabatoxine aan. In

de literatuur wordt nergens aangehaald dat Pspo tabatoxine produceert, niettegenstaande

deze pathovar wel tot genomiespecies 4 behoort (Höfte en Vos, 2006).

Verschillende P.syringae soorten en enkele andere gerelateerde bacteriën zijn in staat

fytohormonen, zoals auxine en ethyleen aan te maken . De genen die coderen voor deze

hormonen zijn respectievelijk het iaaM/iaaH gen en efe (ethyleen forming enzym) gen die

gelegen zijn op plasmiden. De concentratie IAA is sterk gerelateerd aan de pathogeniciteit,

terwijl dit voor ethyleenproductie nog niet echt duidelijk is (Glickmann et al., 1998; Weingart

en Volksch, 1997; Weingart et al., 2001). Bij Pspo zijn beide genen niet aanwezig.

Algemeen produceren P.syringae pathovars twee EPS moleculen, namelijk levaan

(fructofuranan polymeer) en/of alginaat (Gross en Rudolph, 1987). Pspo kan levaan

produceren op sucrose pepton agar (LOPAT test). Het is niet geweten of Pspo pathogeen is

door productie van dit moleculen.

P.syringae is een INA bacterie (Ice Nucleation Active). Dit betekent dat de bacterie in staat is

ijskristallen te vormen bij temperaturen van 0 tot -5°C en bijgevolg de weefsels van

vorstgevoelige planten te vernietigen. Als INA bacteriën aanwezig zijn op het bladoppervlak

van planten, veroorzaken ze hetzelfde effect als vorst bij temperaturen vanaf 0°C (Hirano en

Upper, 2000).

2.3.1.3 Aanwezigheid en verspreiding in het milieu

De soort P.syringae is veel meer dan een pathogeen voor bepaalde planten. Het is een

veelzijdige bacterie die in heel wat ecosystemen aanwezig is, vooral in een aquatisch milieu.

De bacterie speelt enerzijds een grote rol in het fenomeen van regen en sneeuwval en

anderzijds is het een bacterie die in staat is planten te infecteren. Doordat P.syringae INA

positief is, heeft deze een grote invloed op het bevriezen van water in de watercyclus. Bij

temperaturen tussen 0 en -8° C in de wolken zorgt vooral deze INA actieve bacterie voor

ijskristallen en vervroren waterdruppels wat zich uit tot hagel en sneeuw. De levenscyclus

van P.syringae is complex en eigenlijk bevindt deze bacterie zich overal. Hoewel P.syringae

virulent is , kan ze ook als saprofyt overleven. Ze is aanwezig in water en in de atmosfeer.

Figuur 5 geeft de aanwezigheid en verplaatsing in het mileu weer van P.syringae (Morris et

al., 2013).

17

1. P.syringae komt op bodem en planten terecht door regen en sneeuw.

2. In gebergteomgevingen overleeft P.syringae in de sneeuwlaag.

3. In het milieu bevinden ze zich op bladafval en grassen.

4. Door het smelten van sneeuw of via neerslag, gaat een fractie van de

bacteriepopulatie naar de ondergrondse waterflow.

5. De rest komt via de bovengrondse watercyclus in rivieren terecht.

6. P.syringae wordt getransporteerd in de waterkolom en vormt epifytische biofilms.

Epifytische populaties op wilde planten die worden afgeregend kunnen ook deze weg

volgen.

7. P.syringae kan in cultuurgewassen terecht komen door regen of door irrigatie met

rivierwater.

8. De populaties aanwezig op planten gaan via aerosol terug naar de troposfeer.

9. Een deel van het water dringt door de bodem en zit in het grondwater.

Figuur 5: De aanwezigheid en verplaatsing van P.syringae gaat goed gepaard met de cyclus van de

waterstromen (Morris et al., 2013)

18

2.3.1.4 Symptomen en ziektebeeld

De symptomen van bacteriële infectie op prei zijn afhankelijk van de soort bacterie. De

symptomen veroorzaakt door Pspo verschillen met deze veroorzaakt door P.fluorescens. Bij

bacteriebrand teweeggebracht door Pspo is een bruine bladlaesie, omringd door een

geelachtige cirkel zichtbaar. Typerend zijn de lange, waterachtige plekken uitgerekt in de

lengterichting van het blad (Hall et al., 2007). Meestal zijn het de oudste bladeren die worden

aangetast. Deze zijn het meest gevoelig. Het feit dat ze tegen de grond aan liggen is ook

nadelig. In erge gevallen kan de volledige plant worden aangetast.

Figuur 6: Schadebeeld van aangetaste preiveroorzaakt door Pspo.

Duidelijke bladnecrose vanaf groeipunt langs één zijde

van het blad naar de schacht toe.

2.3.2 Pseudomonas fluorescens

2.3.2.1 Taxonomie en morfologie

Tabel 4: Taxonomische indeling van P.fluorescens

Rijk Bacteria

Stam Proteobacteria

Klasse Gammaproteobacteria

Orde Pseudomonales

Familie Pseudomonaceae

Geslacht Pseudomonas

Soort Pseudomonas fluorescens

Janse et al. (1992) onderzocht de groep van fluorescentie oxidase positieve Pseudomonas

species. Deze groep wordt grotendeels vertegenwoordigd door biotypen van P.fluorescens,

maar ook door andere bacteriesoorten die zachtrot veroorzaken. Oorspronkelijk werd een

19

verschil gemaakt tussen P.marginalis en P.fluorescens. Aangezien er bij diverse fluorescente

pseudomonaden zachtrot wordt waargenomen, was het niet meer nuttig om een onderscheid

te maken binnen deze groep. Al deze pseudomonaden werden samen geschikt tot een

supercluster van P.fluorescens. Het verschijnsel van zachtrot is te wijten aan het vermogen

tot afbraak van plantencelwanden. Ze hebben pectinolytische enzymen die de pectinen in de

celwanden afbreken. P.fluorescens is voor heel wat planten infectieus en is niet gastheer

specifiek (Janse et al., 1992).

2.3.2.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme

P.fluorescens bestaat niet uit een homogene groep met verschillende pathovars zoals bij

P.syringae wel het geval is. Beter is om over het Pseudomonas fluorescens complex te

spreken omdat er heel wat uiteenlopende eigenschappen zijn tussen de stammen onderling.

Mogelijks zitten in deze heterogene groep verschillende soorten. Sommige hebben ook INA

activiteit of hebben ook een T3SS om te infecteren (Warren et al., 1986).

Als virulentiefactor is Pseudomonas fluorescens (marginalis) in staat pectinolytische

enzymen te produceren. Deze polygalacturonasen en pectine lyasen verbreken de α-1,4-

galacturonbindingen in de polymeren van de celwand van de gastheerplant door

respectievelijk hydrolyse en β-eliminatie. De bacteriën produceren deze enzymen enkel als

ze met een voldoende groot aantal aanwezig zijn. Wanneer het afweersysteem van de plant

op dat moment wordt geactiveerd, maakt de plant geen schijn van kans om zich nog te

beschermen tegen de massale aanwezige pathogenen (Höfte en Vos, 2006).

P.fluorescens heeft de potentie om viscosine te produceren (Bender et al., 1999). Viscosine

kan gezien worden als een natuurlijke uitvloeier of biosurfactant. De beweeglijkheid van

P.fluorescens SBW25 in de bodem wordt niet enkel veroorzaakt door het flagellum, maar

ook door de aanmaak van viscosine. Deze molecule zorgt ervoor dat de verspreiding van de

bacterie in de grond, maar ook op bladeren van gewassen, heel efficiënt gebeurd. Heel wat

Pseudomonaden van het fluorescens complex zijn bodembacteriën. Deze zijn niet altijd

pathogeen en kunnen zelfs een positieve invloed hebben op planten. Zo hebben bepaalde

stammen een beschermende rol bij gekiemde zaden tegen de kiemschimmel Pythium door

de aanmaak van viscosine (Alsohim et al., 2014). Anderzijds is de potentie om viscosine te

produceren een virulentiefactor die bijdraagt tot de pathogeniciteit van de bacterie en die het

binnendringen van de bacterie in plantenweefsels bevordert (Hernandez-Anguiano et al.,

2004).

Pathogene P.fluorescens species zijn meer infectieus bij rijpe en oudere prei, terwijl Pspo

meer aanwezig is op jonge prei (Van Vaerenbergh J., 2016).

20

2.3.2.3 Symptomen en ziektebeeld

Bacteriële infectie in prei veroorzaakt door bacteriën van het Pseudomonas fluorescens

complex heeft als voornaamste symptomen rotting waarbij de plantencellen gaan verslijmen.

Onderstaande foto toont een rotte bladvlek juist boven de schacht. Op de tweede foto is

duidelijk te zien dat volledige planten verdwijnen als gevolg van bacteriële infectie.

Opmerkend is dat bacterieziekte veroorzaakt door deze groep meestal later in het seizoen

voorkomt terwijl Pspo meer voorkomt bij warmere temperaturen (Van Vaerenbergh J.,2016).

Figuur 7: Foto’s genomen op besmet veld in Meulebeke

2.3.3 Bestrijding en controle

Onder controle houden van plantpathogene bacteriën is heel moeilijk en nooit 100 %

effectief. Om een geïntegreerde onderdrukking van de ziekte te bekomen, dienen

verschillende strategieën te worden gecombineerd (Bashan en de Bashan, 2002). In het

kader van IPM (Integrated Pest Management) gaat steeds meer aandacht naar preventie

van infectieziekten. Het is altijd beter om ziekten te voorkomen dan ze te bestrijden. Dit geldt

niet enkel voor bacteriële infecties. Zoveel mogelijk voorkomen van infectie en combineren

van verschillende strategieën is het efficiëntst om bacterieziekte te onderdrukken.

Pspo is zaadoverdraagbaar (Smith et al., 1988). Hierbij is het dus belangrijk dat er geen

besmet preizaad wordt gebruikt. Het gebruik van niet gecontamineerd zaad is een vereiste,

maar kan niet worden verzekerd door gecertificeerd zaaizaad te gebruiken of ontsmet zaad.

Bacteriën overleven op plantenresten in de bodem. Gewasrotatie kan ook sterk bijdragen om

inoculum te verlagen op het veld. Als geen waardplanten aanwezig zijn op het veld, is het

moeilijker voor de pathogeen om zich in stand te houden. Hierbij is het ook belangrijk om

onkruiden onder controle te houden aangezien bepaalde onkruiden waardplanten zijn voor

21

Pseudomonas species. Vooral in zaaibedden en serres is bestrijding van onkruiden

noodzakelijk. Plantafval en resten van prei is tevens een goede voedingsbodem waarop

bacteriën zich kunnen vermenigvuldigen. Pspo kan minstens een maand overleven op

gewasafval. Van Overbeek et al. (2010) concludeerde dat het preiafval na de oogst een

belangrijke rol heeft in de epidemiologie van Pspo. De primaire infectie van preiplanten

gebeurt door gewasresten die via de bodem naar de wortels en de volledige preiplant

overgaan (van Overbeek et al., 2010). Andere hygiënische maatregelen kunnen ook een

sterke invloed hebben op het voorkomen van infectie. Voorbeelden zijn ontsmetten van

zaaibedgereedschap, messen en andere machines die in contact komen met de preiplanten

(Lamichhane et al. 2015). Vooral het maaien van preiplanten is een delicaat proces, omdat

er wondjes ontstaan ter hoogte van de bladeren. Deze wondjes zijn rechtstreekse openingen

voor de bacterie om binnen te dringen in de plant. Bij het aanaarden van de rijen op het veld

wordt met een tractor door het gewas gereden en kunnen er ook wondjes ontstaan ter

hoogte van het blad. Een geïnfecteerd veld moet altijd als laatste behandeld worden zodat

geen overdracht mogelijk is naar de gezonde velden.

Overmatig gebruik van stikstofmeststoffen maakt de plant gevoeliger voor infectie. Dit komt

omdat de plant heel snel groeit en daardoor de celwanden veel dunner en minder stevig zijn.

Stilstand en groeipieken gedurende het groeiseizoen dienen ook vermeden te worden. Door

dergelijke groeischeuten ontstaan er fijne haarscheurtjes. Via deze haarscheurtjes is het heel

gemakkelijk voor de bacterie om het plantenweefsel te infecteren. De waslaag van de plant

is een fysische barrière die bescherming voorziet tegen pathogenen. Aantasting van deze

waslaag door overmatig gebruik van fungiciden of uitvloeiers, maakt de plant gevoeliger voor

infectie (Okon, 1990).

Wanneer de bacterie de plant infecteert is relatieve vochtigheid heel belangrijk. De infectie

verloopt optimaal wanneer een waterfilmpje aanwezig is op het blad. Dit is een

klimatologisch gegeven, maar toch is het enigszins mogelijk om de relatieve vochtigheid te

sturen. Als de plantdichtheid wat afneemt bijvoorbeeld kunnen de bladeren veel sneller

opdrogen. Bij een minder dicht gewas zijn de bladeren dus minder lang nat en is de kans op

infectie ook veel kleiner. In serres kan de relatieve vochtigheid en temperatuur worden

gestuurd en gecontroleerd. Door periodische beluchting in de serre, wordt een lage relatieve

vochtigheid behouden. Door druppelirrigatie toe te passen, worden de bladeren niet nat,

maar zijn ze toch voorzien van het nodige vocht (Höfte en Vos, 2006).

Chemische stoffen worden al lang gebruikt om plantenziekten te bestrijden. Bij

bacterieziekten is het moeilijker om chemisch te behandelen (Lamichhane et al., 2015). In

sommige landen wordt antibiotica gebruikt om bacteriële ziekten onder controle te houden.

De meest aangewende antibiotica zijn streptomycine en oxytetracycline. In Europa is het

gebruik van antibiotica als gewasbeschermingsmiddel verboden. Uit vrees voor resistentie

tegenover antibioticamiddelen, moet antibioticagebruik drastisch dalen in de landbouw. Zo is

er al resistentie vastgesteld bij enkele Pseudomonas-stammen tegenover streptomycine

(McManus et al., 2002). Het resistentiegen voor streptomycine bij Pseudomonas is op

22

plasmiden of transposons gelokaliseerd (Feil et al., 2005). Dit gen kan dus heel snel worden

verspreid tussen de bacteriën via ‘horizontal gene transfer’. Sinds het verbod van

antibioticagebruik in Europa, werden andere alternatieven gebruikt. Tegenwoordig wordt

gebruik gemaakt van koperverbindingen die aanwezig zijn in bepaalde fungiciden. Vooral in

de fruitbomenteelt worden koperfungiciden zoals Bordeaulese pap toegepast om

bacterieziekten onder controle te houden. Er zijn toch enkele nadelen verbonden aan het

gebruik van koper. Koper kan niet in grote concentraties worden toegediend omdat dit

fytotoxiciteit veroorzaakt. Een tweede minpunt is dat reeds resistentieontwikkeling optreedt

bij de bacteriën (Höfte en Vos, 2006). In een geïntegreerd model kunnen plant activators

worden ingezet in combinatie met koperfungiciden (Louws et al.,2001). Plant activators

induceren bij de plant systemische resistentie (SAR of Systemic Aquired Resistance) ten

aanzien van bladziekten veroorzaakt door bacteriën, schimmels of virussen. De

resistentiereacties komen op gang in de gehele plant door een accumulatie van salicylzuur.

Vervolgens worden de PR genen (Pathogen Related Genes) geactiveerd, waardoor PR-

eiwitten worden aangemaakt die duidelijk een antifungale en bacteriocide werking hebben.

Het grote voordeel van deze middelen is, dat het niet op de bacteriën rechtstreeks inwerkt en

er zo geen resistentie kan ontstaan. Er werden verschillende moleculen beschreven die als

plant activator kunnen worden ingezet. Zo geeft het toedienen van Actigard (acibenzolar-S-

methyl) aan tabak goede resultaten m.b.t. controle van P. syringae pv.tabaci (Cole, 1999).

Het middel wordt vooral toegepast in de tomatenteelt tegen Botrytis cinerea en

Pseudomonas syringae pv. tomato. Acibenzolar-S-methyl is een benzo-thiadiazoolverbinding

(BTH) die als salicylzuuranaloog werkt. Het product werd in sommige landen van Europa

toegelaten tot 2011. In België werd deze molecule nooit erkend wegens de relatief hoge

fytotoxiciteit en de toxiciteit tegenover vissen (Syngenta,2016). Tegenwoordig is het product

enkel toegelaten in bepaalde staten van de V.S. Het toedienen van deze stoffen zou een

negatieve impact hebben op de plantengroei en opbrengst (Romero et al., 2001).

Figuur 8: De structuur van chitosan, waarvan de aminogroepen meestal niet geacetyleerd zijn (Xing et al., 2015)

Chitosan is een niet toxisch product dat steeds meer interesse wekt bij het bestrijden en

voorkomen van bacterieziekten. Het product bestaat uit een biodegradeerbaar polymeer dat

zowel een werking heeft tegen schimmels, virussen als bacteriën. Bij elk van deze

organismen gaat het molecule op een verschillende manier de structuren inhiberen. Bij

gramnegatieve bacteriën reageert de kationische molecule met de negatief geladen

lipopolysachariden van de buitenste celmembraan. Hoe negatiever de lading van de

membraan, hoe sterker de reactie. Chitosan interageert ook met de gevormde biofilm van

23

verscheidene bacteriële pathogenen. Door elektrostatische interacties met P.syringae treden

er morfologische afwijkingen op en wordt de bioflim gedegradeerd. Bij P.fluorescens soorten

wordt een verlaagde membraan-permeabiliteit gecreëerd door de interactie van het polymeer

met de membraan. Tevens heeft chitine de capaciteit om plantimmuniteit te versterken door

het induceren van het SAR systeem bij planten (Xing et al.,2015).

Een alternatief voor chemische bestrijding is de biologische controle. Bij de biologische

strategie worden niet-pathogene stammen aangewend, saprofyte bacteriën of

rhizobiumbacteriën die de plantengroei bevorderen (Ji et al., 2006). Deze organismen

kunnen pathogene populaties onderdrukken, induceren systemische resistentie of activeren

een bepaald proces in de plant waardoor kolonisatie van de pathogeen sterk bemoeilijkt

wordt.

Een tweede alternatief voor biologische controle is de toepassing van bacteriofaagtherapie.

Bacteriofagen, kortweg fagen genoemd, zijn kleine virussen die specifieke bacteriecellen

infecteren. Ze bestaan net als gewone virussen uit een buitenste eiwitmantel, met daarin het

DNA. De replicatie van fagen resulteert in een lysis van de gastheerbacterie en het vrijkomen

van nieuw gevormde viruspartikels. In de landbouw wordt heel wat onderzoek verricht naar

faagtherapie om bacteriële pathogenen te onderdrukken in verschillende gewassen. Enkele

voorbeelden zijn bacteriofagen tegen Dickeya solani die zachtrot in aardappel veroorzaakt,

en fagen tegen Erwinia amylovora die voorkomt bij appel en peer. Enkel in de tomaten- en

aardappelteelt zijn commerciële producten beschikbaar gebaseerd op faagtherapie tegen de

pathogenen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, P.syringae pv. tomato (AgriPhage) en

Dickeya solani (Biolyse, APS Biocontrol Ltd.) (Rombouts et al., 2016).

Figuur 9: Algemene structuur en een elektromicroscopische opname van een bacteriofaag

(Tack A., 2013; Rombouts et al., 2016)

Doordat bacteriofagen gastheerspecifiek zijn, infecteren ze enkel één specifieke

bacteriespecies. Deze gastheerspecificiteit is te wijten aan de staart-geassocieerde

proteïnen van de fagen die in staat zijn om specifieke oppervlaktemoleculen van de

gevoelige bacterie te herkennen. Fagen hebben de potentie om door de beschermlaag van

24

infecterende bacteriën te dringen. Een van de belangrijkste overlevingsstrategieën bij

bacteriën is de vorming van een beschermlaag of zogenoemde biofilm. Bij meer dan 60 %

van bacteriële infecties wordt een biofilm aangemaakt. De biofilm zorgt ervoor dat bacteriën

minder gevoelig zijn voor antimicrobiële stoffen en organismen zoals virussen en natuurlijke

vijanden. Bacteriofagen hebben de potentie om de biofilm van bacteriën enzymatisch

afbreken door de aanwezigheid van EPS-depolymerasen in de virusgeassocieerde

staartpieken of vezels van de fagen. De infectie en het doden van de bacteriële gastheer

gebeurt heel efficiënt. Per infectiecyclus komen afhankelijk van de soort tientallen nieuwe

faagpartikels vrij (Cornelissen et al., 2012). De infectiecyclus bestaat uit een zoekstadium, de

aanhechting aan de bacterie, de injectie van het DNA, de DNA expressie, de DNA

verpakking en het uiteindelijk vrijkomen van het virion. De replicatie en het vrijkomen van de

nakomelingen van de fagen worden beïnvloed door de metabole status van de bacteriën en

hun aantal. De aanwezigheid van vloeistof is ook belangrijk voor de fagen omdat dit hun

beweeglijkheid bevordert. Wanneer de fagen hun gastheercellen lyseren, ondergaan deze

een selectiedruk om mutanten te produceren die resistent worden aan de fagen. Door de

vele replicaties bij de fagen is de kans groot op fouten waardoor de populatie van de fagen

eerder heterogeen is. Deze heterogeniteit bij de fagen leidt er toe dat fagen zich kunnen

aanpassen bijvoorbeeld aan kleine veranderingen van de receptor van hun gastheer.

Resistentieontwikkeling van de bacterie tegen de fagen is praktisch onmogelijk, wat een heel

groot voordeel is van faagtherapie (Lantin, 2009). Rombouts et al. (2016) concludeerde dat

positieve resultaten van faagtherapie tegen Pspo werden bekomen onder laboratorium-

omstandigheden waarbij mengsels van fagen nagenoeg alle bacteriën konden afdoden. De

gebruikte fagen waren behoorlijk stabiel, overleefden bij pH-waarden van 4 tot 12 en

temperaturen van 4°C tot 37°C. Een nadeel van de aangewende fagen is dat ze enkel

bacteriën kunnen lyseren die groeien bij temperaturen van 28°C of minder. Bij hogere

temperaturen zijn de fagen niet meer in staat om de bacterie te doden. Een mogelijke

verklaring is dat de bacteriële receptor, die nodig is voor faaginfectie, niet meer tot expressie

komt bij hogere temperaturen. Verder werd ook onderzocht of deze fagencocktail bestaande

uit zes fagen de Pspo stammen aanwezig op prei kon afdoden onder veldomstandigheden.

Hier waren de resultaten echter niet eenduidig. Het onderzoek op faagtherapie staat nog

voor heel wat uitdagingen aangezien de fyllosfeer een hard milieu vormt voor bacteriofagen.

Enkele moeilijkheden bij faagtherapie zijn uv-licht gevoeligheid, kans op verdroging,

toedieningsmethode en de behoefte aan grote dichtheden van fagen bij de toediening.

25

2.3.4 Overzichtstabel P.syringae pv. porri versus P.fluorescens

P.fluorescens P. syringae pv. porri (Pspo)

Complex en grote onduidelijkheid i.v.m. indeling Homogene groep bestaande uit diverse

pathovars

Oxidase positief Oxidase negatief

Niet via zaad overdraagbaar Zaadoverdraagbaar

Veroorzaakt rotting Veroorzaakt bacteriebrand

Indringing in plantenweefsel via stomata of

wondjes, maar ook door celwandafbraak met

pectinolytische enzymen

Indringing in plantenweefsel via natuurlijke

openingen en wondjes

Meerdere gastheerplanten Enkel pathogeen bij Allium soorten zoals prei,

ui en sjalot

Sommige INA bacteriën, sommige geen INA Altijd INA activiteit

Meer aanwezig bij koele temperaturen

(nov-feb)

Meer aanwezig bij warme tot matige

temperaturen (jun-sep)

Meer infectieus op rijpe en afgezwakte prei Meer infectieus op jonge prei

26

3 Materiaal en Methoden

3.1 Rassenproef vroege herfstprei

Bij de rassenproef van de herfstprei werden zes waarnemingen uitgevoerd op verschillende

tijdstippen. Zo kan de evolutie van de ziekte over het groeiseizoen worden geschetst door de

observaties die werden verricht op: 17 september (W1), 28 september (W2), 12 oktober

(W3), 26 oktober (W4), 13 november (W5) en 20 december (W6) in 2015. Het percentage

aantasting per plot voor iedere waarneming en de bijhorende ziekte-index is weergegeven in

bijlage 3.

3.1.1 Proefplan

Het proefplan werd opgesteld door het proefcentrum Inagro. Het proefveld werd aangelegd

nabij het proefcentrum, in de gemeente Beitem (coördinaten: 50,90° NB, 3,12° OL). Voor de

opstart van de proef was er braakligging van desbetreffend perceel. Het teeltsysteem dat

werd gehanteerd is ruggenteelt wat het meest wordt toegepast voor de productie van prei

voor de versmarkt.

De proef werd opgezet als een gerandomiseerde blokkenproef met drie herhalingen waarin

15 rassen opgenomen werden. Per plot werden 30 planten geplant waarna twee plantgaten

leeg werden gelaten. Afhankelijk van het aantal beschikbare planten werden hiervan ofwel

tien ofwel 20 planten bemonsterd. De tussenrijafstand is 65 cm en de afstand tussen de

planten in de rij is 10 cm. Tussen de bemonsterde rijen staat een rij Krypton. Deze tussenrij

zorgt voor een homogene ziektedruk over het perceel en vermijdt randeffecten. Het is van

belang dat het ras van de tussenrij overal hetzelfde is, welk ras het precies is, maakt niet uit.

Een schematisch overzicht van het proefplan is weergegeven in Figuur 10.

Figuur 10: Proefplan rassenproef vroege herfstprei

3.09 3.12 3.07 3.13 3.11

3.04 3.02 3.15 3.08 3.03

3.14 3.05 3.10 3.01 3.06

2.08 2.10 2.06 2.12 2.14

2.13 2.15 2.11 2.02 2.04

2.03 2.05 2.01 2.07 2.09

1.11 1.12 1.13 1.14 1.15

1.06 1.07 1.08 1.09 1.10

1.01 1.02 1.03 1.04 1.05

27

Tabel 5: Vroege herfstrassen (15) opgenomen in de proef

Objectnr. Ras Zaadhuis

01 Krypton Nunhems

02 Megaton Nunhems

03 Duraton Nunhems

04 Belton Nunhems

05 Pluston Nunhems

06 Longton Nunhems

07 SV 3274 ZL Seminis

08 SV 3192 ZE Seminis

09 Volta Seminis

10 Copernicus Seminis

11 Takrima Enza

12 Gevaria Enza

13 Cherokee Enza

14 Rally Bejo

15 SG 1101 Syngenta

3.1.2 Teelttechnische maatregelen en klimatologische omstandigheden

Een overzicht van alle teelttechnische maatregelen en de uitgevoerde bemestingen wordt

weergegeven in Tabel 6.

Tabel 6: Algemene werkzaamheden en bemestingen.

Datum Handeling/meststof

19/03/15 Zaai in plastiek serre

18/05/15 Digestaat (20 ton/ha)

08/06/15 Ploegen

09/06/15

Patentkali 30 % (500 kg/ha)

Ammoniumnitraat 27 % (500 kg/ha)

Plantklaar leggen

10/06/15 Ruggen trekken en ponsen (65 x 10 cm)

12/06/15 Planten

29/07/15 Manueel wieden

De aangewende onkruid-, ziekte- en insectenbestrijding tijdens deze proef wordt

weergegeven in Tabel 7.

28

Tabel 7: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen

Datum Middel Dosis Werkzame stof

Onkruidbestrijding 09/07/15 Lentagran

Totril

Stomp aqua

Butisan S

2 kg/ha

0,5 l/ha

1 l/ha

1,5 l/ha

pyridaat

ioxynil

pendimethalin

metazachloor

14/07/15 Aramo 1 l/ha tepraloxydim

Ziektebestrijding 12/06/15 Topsin M Aangieten aan voet van de plant thiofanaat-methyl

18/08/15 Tebusip 1 l/ha tebuconazool

25/09/15 Tanos

Tebusip

0,6 kg/ha

1 l/ha

famoxadone cymoxanil

tebuconazool

23/10/15 Ortiva Top 1 l/ha azoxystrobine

difenoconazool

27/11/15 Ortiva 1 l/ha azoxystrobine

17/12/15 Tanos 0,6 kg/ha famoxadone cymoxanil

Insectenbestrijding 06/07/15 Vertimec 0,5 l/ha abamectine

20/07/15 Mesurol 1,5 l/ha methiocarb

31/07/15 Vertimec 0,5 l/ha abamectine

07/08/15 Mesurol 1,5 l/ha methiocarb

19/08/15 Vertimec 0,5 l/ha abamectine

De zomer van 2015 was iets koeler en droger dan gemiddeld. Een overzicht van de

neerslag, temperatuur en relatieve vochtigheid worden weergegeven in Tabel 8.

Tabel 8: Klimatologische omstandigheden opgemeten in Beitem vergeleken met de gemiddelde waarden

Neerslag

in 2015

(mm/m2)

Gemiddelde

neerslag

(mm/m2)

Temperatuur

per dag in

2015 (°C)

Gemiddelde

temperatuur

per dag(°C)

Relatieve

vochtigheid

per dag (%)

Juli 49 74 17,9 18,4 73,29

Aug 75 79 18,2 18,0 74,67

Sep 56 69 12,8 14,9 80,28

Okt 25 75 9,5 11,1 86,15

Nov 51 76 9,1 6,8 87,48

29

Figuur 11: Verloop van de temperatuur en neerslag in Beitem.

Figuur 11 geeft het verloop weer van de temperatuur en neerslag op de locatie van de

proefvelden in Beitem. Optimale omstandigheden voor bacteriële infectie zijn temperaturen

rond 20°C in combinatie met een hoge relatieve vochtigheid of lichte regen. Uit Figuur 11

blijkt dat begin augustus en half september de weersomstandigheden ideaal waren voor een

natuurlijke aantasting van Pseudomonas spp.

3.1.3 Infectiemethode

De prei werd eenmaal geïnfecteerd op 3 september 2015 met P. syringae pv. porri stam

CFBP 1687. Op dat moment waren de bladeren van het gewas nog nat, wat ideaal is voor de

instandhouding en vermenigvuldiging van de bacterie. De bacteriestam werd op petrischaal

aangeleverd door het ILVO. Vervolgens werd één entoog opgelost in 1 ml kraantjeswater en

werd deze oplossing aangelengd zodat de suspensie een concentratie van 108 CFU/ml

bedroeg. Daarna werd de suspensie verdund tot 1:100. Deze verdunde suspensie werd

verneveld over de veldjes m.b.v. een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met een

debiet van 1000 l/ha. Er werd geen uitvloeier gebruikt.

3.1.4 Beoordelingsmethode

De proef werd continu opgevolgd zodat plagen, ziektes of deficiënties opgemerkt werden en

indien nodig behandeld konden worden. De zes beoordelingen werden uitgevoerd op

17/09/15, 28/09/15, 12/10/15, 26/10/15, 13/11/15 en 10/12/15. Zoals eerder vermeld, werden

per veldje standaard 20 planten beoordeeld. Indien er onvoldoende planten waren, dan

werden slechts tien planten beoordeeld. Bij de beoordeling werd gelet op de aanwezigheid

van duidelijke symptomen zoals beschreven in punten 2.3.1.4 en 2.3.2.3. Zowel de

symptomen veroorzaakt door Pspo als de symptomen veroorzaakt door P.fluorescens

werden in rekening gebracht. Als beoordelingsmethode werd het aantal aangetaste planten

zorgvuldig geteld. Per plot werd zo een percentage zieke planten berekend voor iedere

0

5

10

15

20

25

30

26/05/15 25/06/15 26/07/15 25/08/15 25/09/15 25/10/15 25/11/15

Ne

ers

lag

(mm

/m²)

en

te

mp

era

tuu

r (°

C)

Datum

neerslag T

30

waarneming. Om de gegevens statistisch te verwerken werd een ziekte-index voor het

groeiseizoen opgesteld voor iedere plot. Deze ziekte-index is zo opgebouwd dat alle

waarnemingen evenveel doorwegen op het eindresultaat. Om de ziekte-index te berekenen

werden 12 klassen gemaakt met betrekking tot het percentage aantasting van de planten. De

formule voor de ziekte-index is:

Σ (aantal keer dat klasse n voorkomt) ∗ (klassenr − 1)

6 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑛𝑒𝑚𝑖𝑛𝑔𝑒𝑛∗ 100

Tabel 9: De 12 klassen ingedeeld volgens percentage aantasting

klasse 1 0 % klasse 7 51 – 60 %

klasse 2 1 - 10 % klasse 8 61 – 70 %

klasse 3 11 – 20% klasse 9 71 – 80 %

klasse 4 20 – 30 % klasse 10 81 – 90 %

klasse 5 31 – 40 % klasse 11 91 – 99 %

klasse 6 41 – 50 % klasse 12 100 %

Ter verduidelijking wordt de ziekte-index van plotnummer 101 berekend:

(1∗1)+(1∗4)+(2∗8)+(1∗7)+(1∗11)

6∗ 100 = 650

3.2 Rassenonderzoek late herfstprei en winterprei

3.2.1 Proefplan

Voor de beschrijving van het proefplan wordt verwezen naar het proefplan van de

rassenproef herfstprei (Figuur 10) aangezien dit volledig hetzelfde is. Uiteraard zijn de

onderzochte rassen anders. De tussenliggende rijen zijn in deze proef van het ras TZ 01888

(Uniseeds). De rassen die werden opgenomen in deze proef zijn weergegeven in Tabel 10.

31

Tabel 10: Opgenomen rassen in de proef late herfst-winterprei

Objectnr. Ras Zaadhuis

1 Aylton Nunhems

2 Poulton Nunhems

3 Pluston Nunhems

4 Vitaton Nunhems

5 Walton Nunhems

6 Belton Nunhems

7 Harston Nunhems

8 SV 3274 ZL Seminis

9 Delmas Syngenta

10 Oberon Syngenta

11 Curling Bejo

12 Keeper Bejo

13 Lucretius Seminis

14 Lancaster Uniseeds

15 Nestor CN Seeds

3.2.2 Teelttechnische maatregelen

De algemene werkzaamheden, de bemesting en de toegepaste gewasbeschermings-

middelen voor en tijdens deze proef zijn weergegeven in Tabel 11 en Tabel 12.

Tabel 11: Algemene werkzaamheden en toegepaste bemestingen

Datum Handeling/meststof

09/04/15

14/04/15

Zaai in plastiek serre

Zaai in plastiek serre

18/05/15 Digestaat (20 ton/ha)

08/06/15 Ploegen

09/06/15 Patentkali 30 % (500 kg/ha)

Plantklaar leggen

06/07/15 Ammoniumnitraat 27 % (500 kg/ha)

2e maal plantklaar leggen

09/07/15 10 l/m2 beregend

10/07/15 Ruggen trekken en ponsen (65 x 10 cm)

10/07/15 Planten

32

Tabel 12: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen

Datum Middel Dosis Werkzame stof

Onkruidbestrijding 29/07/15 Lentagran

Totril

Stomp aqua

Butisan S

1,5 kg/ha

0,5 l/ha

1 l/ha

1,5 l/ha

pyridaat

ioxynil

pendimethalin

metazachloor

Ziektebestrijding 10/07/15 Topsin M Aangieten aan voet van de plant thiofanaat-methyl

18/08/15 Tebusip 1 l/ha tebuconazool

25/09/15 Tanos

Tebusip

0,6 kg/ha

1 l/ha

famoxadone

cymoxanil

tebuconazool

23/10/15 Ortiva Top 1 l/ha azoxystrobine

difenoconazool

27/11/15 Ortiva Top 1 l/ha azoxystrobine

17/12/15 Tanos 0,6 kg/ha famoxadone

cymoxanil

Insectenbestrijding 20/07/15 Mesurol 1,5 l/ha methiocarb

31/07/15 Vertimec 0,5 l/ha abamectine

07/08/15 Mesurol 1,5 l/ha methiocarb

19/08/15 Vertimec 0,5 l/ha abamectine

Voor de klimatologische omstandigheden, de infectiemethode en de beoordelingsmethodiek

wordt verwezen naar punt 3.1.2 , 3.1.3 en 3.1.4.

33

3.3 Efficiëntie van faagtherapie onder veldomstandigheden

De interesse in bacteriofagen die potentieel bacterieontwikkeling en -groei kunnen reduceren

wordt alsmaar groter. Er is al heel wat onderzoek uitgevoerd in laboratoria, waar het

toedienen van bacteriofagen een duidelijk effect heeft op de onderdrukking van bacteriële

aantasting. In veldomstandigheden blijkt dit iets moeilijker omdat bacteriofagen niet zo

stabiel zijn in de fyllosfeer (zie punt 2.3.3).

In dit onderzoek naar het gebruik van bacteriofagen om bacterieziekten te voorkomen of te

bestrijden in de praktijk, werd een onderscheid gemaakt in preventieve en curatieve

bestrijding. De preventieve maatregel is gebaseerd op een dompelbehandeling met een

mengsel van bacteriofagen net voor het uitplanten van de prei. Na het uitplanten van de

preiplanten op het besmette perceel, werd deze opgevolgd om na te gaan of deze minder

was aangetast dan de controlebehandeling. De curatieve methode berust op regelmatige

bespuitingen met bacteriofagen na het uitplanten op een besmet perceel.

3.3.1 Proefplan

De proef die werd opgezet is op dezelfde locatie gelegen als voorgaande rassenproeven. Op

dit perceel was de voorteelt spinazie, gevolgd door raaigras. De proef omvat zes

verschillende objecten die in vier herhalingen werden uitgevoerd. Het ras dat werd

aangewend in deze fagenproef is Harston (Nunhems). Het proefveld bevat 16 rijen die elk 30

m lang zijn. Er werden slechts vier rijen bemonsterd, de tussenrijen dienden als bufferstrook.

Ieder object bevat 25 planten. Figuur 12 en Tabel 13 geven het proefplan en het overzicht

van de objecten weer.

106 205 304 403

105 203 306 404

104 206 303 405

103 204 305 406

0,50 m

102 201 302 401

101 202 301 402 Figuur 12: Proefplan fagenproef

Tabel 13: Overzicht van de objecten opgenomen in de bacteriofagenproef

1 Dompelbehandeling met fagen

2 Dompelbehandeling met water zonder aanwezigheid van fagen (negatieve controle)

3 Bespuiting met fagen

4 Inoculatie met Pspo CFBP 1687 door verneveling

5 Inoculatie met Pspo CFBP 1687 door verneveling, gevolgd met faagbespuiting

6 Bespuiting met water (negatieve controle)

34

3.3.2 Teelttechnische maatregelen

Het uitzaaien van de prei in de plastiek serre werd uitgevoerd op 09/04/15 en 14/04/15. Het

ploegen, bemesten, plantklaar leggen en ponsen (65 x 10 cm) werd allemaal dezelfde dag

uitgevoerd nl. op 22/07/15. Als bemesting werd 500 kg/ha patentkali en 500 kg/ha

ammonium-nitraat aangebracht. Op 23/07/15 werd de prei uitgeplant. Voor de toegepaste

gewasbeschermingsmiddelen wordt verwezen naar Tabel 14.

Tabel 14: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen bij de fagenproef

Datum Middel Dosis/ha Werkzame stof

Onkruidbestrijding 17/08/15 Butisan S 500

Stomp aqua

Totril

Lentagran

1,5 l

1 l

0,5 l

1 kg

metazachloor

pendimethalin

ioxynil

pyridaat

21/08/15 Frontier elite

Stomp Aqua

Totril

Lentagran

0,7 l

1 l

0,5 l

1,5 kg

dimethenamide-P

pendimethalin

ioxynil

pyridaat

Ziektebestrijding 25/09/15 Fantic M

Tebusip

2,5 kg

1 l

mancozeb

benalaxyl-M

tebuconazool

23/10/15 Ortiva Top 1 l azoxystrobine

difenoconazool

27/11 Ortiva 1 l azoxystrobine

17/12/15 Tanos 0,6 kg famoxadone

cymoxanil

Insectenbestrijding 07/08/15 Mesurol 1,5 l methiocarb

19/08/15 Vertimec 0,5 l abamectine

03/09/15 Tracer 0,2 l spinosad

3.3.3 Proefhandelingen

De infectie en de beoordeling werden op dezelfde manier als voorgaande proeven

uitgevoerd. Er werden zes waarnemingen uitgevoerd gedurende het groeiseizoen. Voor de

dompelbehandeling werd de eerste observatie uitgevoerd zeven weken na het planten. De

daaropvolgende observaties waren telkens met een interval van twee weken. In Tabel 15

wordt gedetailleerd weergegeven welke handelingen op welk moment werden uitgevoerd.

Aangezien deze proef ook in Beitem plaatsvond, gelden dezelfde klimatologische

omstandigheden als voorgaande rassenproeven.

35

Tabel 15: Datum van infectie, behandeling en bemonstering.

Datum Handeling

23/07/15 Object 1 en 2: bodem besmetten met Pspo stam CFBP 1687

Object 1 : planten volledig onderdompelen met fagenoplossing (15 minuten)

Object 2: planten volledig onderdompelen met water (controle)

03/09/15 Object 4 en 5 : prei infecteren met Pspo stam CFBP 1687 (bij vochtig weer)

27/08/15 Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)

03/09/15 Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)

10/09/15 Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)

17/09/15 Beoordeling (1)

Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)

24/09/15 Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)

28/09/15 Beoordeling (2)

12/10/15 Beoordeling (3)

26/10/15 Beoordeling (4)

13/11/15 Beoordeling (5)

10/12/15 Beoordeling (6)

Voor het toedienen van de fagen werd het protocol gevolgd van Inagro (zie bijlage 1 en 2).

Object 1 werd voor het uitplanten 15 minuten gedompeld in een faagoplossing met een

concentratie van 107 CFU (Rombouts et al., 2016). Bij het dompelen met de faagoplossing

werd met een volume gewerkt van 5 l per 3750 planten wat overeen komt met de gangbare

toepassingen van 200 l/150 000 planten. Om een concentratie te bekomen van 107

PFU/plant werd 37,50 ml van de oplossing (109 PFU/ml) opgelost in 5L water (zie bijlage 1).

Bij object 3 en 5 werd de prei ook behandeld met fagen, maar dan na het uitplanten, op het

veld d.m.v. vijf bespuitingen met een intervalperiode van een week. Doordat fagen gevoelig

zijn voor uv-licht en ze door deze straling worden afgebroken, werd de behandeling

uitgevoerd wanneer er geen zon was. Het uitgangsmateriaal voor de twee objecten (object 3

en 5) in vier herhalingen bedraagt 218,2 ml van de stockoplossing (109 PFU/ml) zodat kan

worden verneveld met een concentratie van 108 PFU/plant (zie bijlage 2).

36

3.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding en

verneveling

Het is nog niet duidelijk welke bacteriestammen precies de meest infectieuze zijn. Omdat bij

de vaststelling van een zieke plant meestal meerdere stammen aanwezig zijn, is niet precies

geweten dewelke het meest voorkomt en dewelke het meeste problemen veroorzaakt. In

samenwerking met het ILVO werden zeven verschillende stammen onderzocht. Hierbij zijn er

vier stammen afkomstig uit het P.fluorescens complex en drie stammen van P. syringae pv.

porri.

3.4.1 Opkweek preiplanten

De infectieproeven werden uitgevoerd op jonge preiplanten. De aangewende preiplanten

werden los aangekocht bij plantenkweker Depraeter en zijn van het ras Krypton (Nunhems).

Daarna werden de planten direct in potten verplant die gevuld werden met potgrond. Er

werden twee planten per pot geplant en daarna werd alles in de serre geplaatst. Een week

voor infectie werden de planten verplaatst naar de fytotron op 18°C om zich wat te herstellen

van de relatief koudere temperaturen in de serre. Bij infectie hadden de preiplanten twee tot

drie echte blaadjes bij de knipmethode en vier tot vijf blaadjes bij de infectie via verneveling.

3.4.2 Infectietechniek via verwonding

Deze proef omvat verscheidene infectieproeven met zeven bacteriestammen die bij

bepaalde temperaturen (-2°C, 8°C, 18°C en 28°C) werden geïncubeerd. Om te kunnen

beoordelen wat de optimale bladnatperiode is voor infectie, werden de planten na infectie

afgedekt met plastiek gedurende een periode van 0, 24 en 48 uur. Ieder object bestond uit

vier potten met elk twee planten. Verwonding werd nagebootst door in de bladtop een knipje

te maken in de lengterichting van het blad. Indien planten of volledige blaadjes afstierven

door infectie of uitdroging, konden niet alle infectielaesies gemeten worden.

De aangewende bacteriestammen afkomstig van het ILVO zijn Pspo GBBC 1422, Pspo

GFBP 1908, Pspo LFBP 1687, P. marginalis GBBC 1475, P.fluorescens GBBC 1198,

P.fluorescens GBBC 1171 (isolaat uit kolen), P.salmoni GBBC 1937 (isolaat uit

plantenkwekerijen). De stammen werden aangebracht in een falconbuisje samen met 10 mM

fosfaatbuffer waarbij de concentratie 108 CFU bedroeg. Bij het uitvoeren van de eigenlijke

infectie werd een schaar in deze suspensie (108 CFU) gebracht en hiermee geknipt in het

blad van de preiplant.

Infectie met P.fluorescens stammen bij vorsttemperaturen

De preiplantjes werden twee dagen voor de infectie in een klimaatkast gebracht waar de

temperatuur -2°C bedroeg. Door deze vorsttemperaturen kunnen in de blaadjes van de prei

barsten ontstaan in de cellen. Dit maakt de kans op infectie door de bacteriën ook groter. Na

het infecteren werden deze planten nog drie dagen op deze negatieve temperatuur

gehouden. Daarna werden ze op een temperatuur gebracht van 8°C zodat de infectie sneller

zou doorgaan.

37

Incubatie bij 8°C en 18°C

Om te zien bij welke temperaturen de bacteriestammen nu het best infecteren en of er

verschillen zijn tussen de stammen onderling, werden de geïnfecteerde preiplantjes in een

klimaatkast van 8°C en 18°C geplaatst gedurende respectievelijk drie en twee weken.

Incubatie van Pspo stammen bij 28°C

Bij de infectie op 28°C werden enkel de Pspo stammen in rekening gebracht omdat bij

warme temperaturen vooral bacterieziekte wordt veroorzaakt door stammen van Pspo (Van

Vaerenbergh, 2016).

3.4.3 Infectietechniek via verneveling

Bij de infectie d.m.v. verneveling werden alle zeven stammen aangewend en deze werden

op dezelfde manier opgekweekt zoals voorgaande proeven. De suspensies bij verneveling

dienden 100 maal meer geconcentreerd te zijn dan deze gebruikt bij de verwonding. Deze

suspensie (1010 CFU/ml) werd opgelost in een halve liter gewoon kraantjeswater samen met

100 µl Tween 80. Deze uitvloeier zorgt voor een gelijkmatigere verspreiding op het blad.

Vervolgens werd deze oplossing verneveld met heel fijne druppeltjes over 12 preiplanten (12

x 4 à 5 blaadjes = 48 à 60 blaadjes). De planten werden direct na infectie afgedekt met

plastiek gedurende 24 u en in een klimaatkast geplaatst van 25°C.

3.4.4 Beoordelingsmethode

Bij de infectie met de knipmethode werden twee en drie weken na het infecteren geteld

hoeveel knipjes er symptomen vertoonden van bacteriële infectie. Indien er symptomen

zichtbaar waren, werd de lengte van de laesie gemeten.

Het scoren van de symptomen werd bij de vernevelingsproef ook tweemaal uitgevoerd, maar

slechts één en twee weken na infectie. Bij de beoordeling van de infectie werd terug de

lengte van de laesie gemeten en er werd rekening gehouden met het feit of deze laesie al

dan niet chlorotisch of necrotisch was.

Figuur 13: Duidelijk chlorotische laesie met aan de top van het blad

lichte necrose twee weken na verneveling met Pspo GBBC 1422

38

3.5 Statistische analyse van de metingen

Bij de statistische verwerking van de resultaten werd gebruik gemaakt van het programma

SPSS. Indien de data normaal verdeeld waren, werd op basis van een ANOVA variantie

analyse conclusies genomen op het 5%-significantieniveau. Wanneer echter de data geen

normale verdeling volgden (infectieproeven), werden niet parametrische testen (Kolmogorov

Smirnov en Mann-Whitney U) gebruikt. De tabellen met de statistische analyse van de data

zijn terug te vinden in bijlage.

39

4 Resultaten

4.1 Rassenproef vroege herfstprei

4.1.1 Proefopzet

Aantasting van planten door Pspo en P. fluorescens is moeilijk te bestrijden. Preventieve

ingrepen zijn daarom fundamenteel om het probleem te voorkomen, eerder dan het te

bestrijden. Dergelijke maatregelen worden in de literatuurstudie uitgebreid aangekaart. Eén

van deze maatregelen is het telen van rassen die toleranter zijn voor ziekten en plagen.

Deze rassenproeven onderzoeken de gevoeligheid voor bacterieziekte veroorzaakt door

Pspo of P. fluorescens. Zowel voor de herfstprei als voor de winterprei werden telkens 15

rassen opgenomen in de proef.

4.1.2 Resultaten

In onderstaande boxplot zijn Rally, Pluston en Belton de rassen met gemiddeld genomen

een lagere ziekte-index dan de andere geteste rassen. Copernic, Krypton en SG 1101 lijken

een hogere ziekte-index te hebben. Om te zien of deze rassen significant verschillen, werd

een two way Anova uitgevoerd. Uit deze statistische verwerking blijkt dat Rally een

significant lagere ziekte-index heeft dan het ras SG 1101. De verschillen tussen alle andere

rassen zijn niet significant. De output van de Tukey test is terug te vinden in bijlage 5.

Figuur 14: Boxplot van de ziekte-index per ras (p-waarde van groep a en b is respectievelijk 0,104 en 0,070)

40

4.2 Rassenproef winterprei

4.2.1 Proefopzet

Deze proef volgt dezelfde strategie als voorgaande proef. Opnieuw werd een ziekte-index

opgesteld op dezelfde wijze als voorgaande proef.

4.2.2 Resultaten

De aangetaste planten per plot uitgedrukt in procent, samen met de berekende ziekte-index

zijn terug te vinden in bijlage 5. Een two way Anova werd uitgevoerd om na te gaan of er

geen blokeffect aanwezig is. De hypothese dat de factor herhaling geen verschillen geeft,

werd ook bevestigd in deze analyse. De rassen kunnen worden onderverdeeld in drie

significantiegroepen met bijhorende p-waarden van 0,073(a), 0,072(b) en 0,122(c). De output

van de tukey test is weergegeven in bijlage 6.

Figuur 15: Boxplot van ziekte-index van elk ras met bijhorende significantiegroep

De ziekte-index van Curling is significant lager dan deze van Harston, SV3274 ZL en Nestor.

Dit wil zeggen dat Curling minder gevoelig is aan bacterieziekte dan de drie laatst genoemde

rassen. Curling heeft de laagste ziekte-index met een waarde van 306, maar deze verschilt

niet significant met de andere rassen. Nestor (528) scoort significant minder goed dan

Curling, Keeper, Delmas en Pluston. Met alle overige rassen is er geen significant verschil.

41

Uit deze proef blijkt dat de winterrassen die gemiddeld genomen minder gevoelig zijn aan

bacteriële infectie Curling, Keeper, Delmas en Pluston zijn. Nestor is eerder een gevoelig

ras.

4.3 Bacteriofagentoepassing onder veldomstandigheden

4.3.1 Proefopzet en resultaten

De dataset van de gegevens worden weergegeven in bijlage 7. Tabel 16 geeft de

gemiddelde waarde weer van de aantasting per object voor iedere waarneming en de

bijhorende ziekte-index. De ziekte-index werd op dezelfde methode berekend als in

voorgaande proeven. In deze proef werd een behandeling met bacteriofagen uitgevoerd op

twee verschillende methoden. Er werd een dompelingbehandeling uitgevoerd (object 1 en 2)

en daarnaast werd ook een vernevelingsbehandeling uitgevoerd (object 3-6). Deze twee

behandelingen kunnen afzonderlijk worden beoordeeld.

Tabel 16: Percentage aantasting van de planten en bijhorende ziekte-index per object

Object W1 W2 W3 W4 W5 W6 Ziekte-index

Object 1 Dompelbehandeling met fagen 0 2 24 51 46 44 312

Object 2 Dompelbehandeling met water

(controle)

3 4 21 71 40 35 329

Object 3 Faagbehandeling door bespuiting 0 7 21 76 46 51 371

Object 4 Inoculatie met bacterie

(negatieve controle)

0 6 23 68 46 56 371

Object 5 Inoculatie met bacterie en

faagbehandeling door bespuiting

1 8 23 73 54 47 375

Object 6 Controle 0 6 22 77 51 52 379

Uit de resultaten voor de ziekte-index is een tendens zichtbaar waarbij planten die

ondergedompeld werden (object 1 en 2) minder aantasting vertonen. Echter deze

behandeling is niet significant verschillend van de andere behandelingen.

In Figuur 16 werd de dompelbehandeling vergeleken met de controledompeling met water.

De lijnen vallen ongeveer samen met elkaar. Enkel bij de vierde waarneming (drie maanden

na behandeling) is een significant verschil (p<0,05) waarbij de behandeling een

aantastingsgraad van 51 % weergeeft tegenover de controle 71 %. Later op het seizoen is er

een sterkere daling bij de onbehandelde planten dan bij deze die een faagbehandeling

kregen. Deze tendens leidt tot een iets hogere aantasting bij de behandelde planten.

42

Figuur 16: Percentage aantasting per beoordeling van dompelbehandeling met fagen en controle

4.3.2 Bespreking resultaten

Bij de ziekte-index van alle objecten is er een trend dat de dompelbehandeling minder

ziekteverschijnselen vertoont dan de behandelingen via verneveling. Ook de controle-

behandeling bij het dompelen vertoont een lagere ziekte-index. Bij de laatste waarnemingen

is deze trend veel minder uitgesproken, waardoor het verschil van aantasting vooral in het

begin aantoonbaar was. Een mogelijke verklaring is dat de gedompelde planten een

optimalere groeistart hebben gehad bij het verplanten van de prei, zodat ze in het begin

minder gevoeliger waren. Een mogelijke bijkomende verklaring is dat in het begin van het

groeiseizoen de toegediende bacteriofagen de relatief lage druk van Pspo stammen onder

controle had terwijl bij toenemende druk in het seizoen de efficiëntie van de bacteriofagen

vermindert.

De vier behandelingen die uitgevoerd werden met een vernevelaar tonen bijna geen

verschillende waarden voor de ziekte-index. De controles, waarbij geen fagen werden

toegepast, vertonen niet meer ziektesymptomen. Bij de objecten waar een extra inoculatie

met bacteriën werd aangebracht (object 4), is ook geen hogere aantasting dan waar dit niet

werd aangebracht (object 6). Dit kan een aanwijzing zijn dat er een hoge graad van

natuurlijke druk van Pspo aanwezig is op het veld, wat niet uitgesloten is door de ideale

weersomstandigheden begin augustus en half september (zie punt 3.1.2). Op basis van dit

gegeven, is de kans reëel dat er andere stammen dan Pspo CFBP 1687 op het veld

aanwezig waren, waardoor het toegediende fagenprofiel niet werkte. Het feit dat de

vernevelingsbehandelingen niet veel effect vertonen, kan ook te wijten zijn aan een niet

opgaande competitie met de bacteriën, waarbij de bacteriën in te hoge concentratie

aanwezig waren in vergelijking met het toegediende aantal fagen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80P

erc

en

tage

aan

tast

ing

Dompelbehandeling metfagen

Controlebehandeling

43

4.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding

4.4.1 Proefopzet

Uit de literatuur blijkt dat de infectie door Pspo en P.fluorescens meestal via wondjes

plaatsvindt (Lamichhane et al., 2015). Welke parameters het belangrijkst zijn, dient nog

verder onderzocht te worden. Bij deze infectieproeven werden de parameters temperatuur

en relatieve vochtigheid (bladnatperiode) vergeleken. De ingezette bacteriesuspensies

hadden allemaal dezelfde concentratie (108 CFU/ml). Deze concentratie zou voldoende

moeten zijn als de infectie via wondjes gebeurd (Van Vaerenbergh, 2016). De onderzochte

incubatietemperaturen zijn -2°C, 8°C, 18°C en 28°C. Om het verschil in relatieve vochtigheid

te testen, werden de planten afgedekt met plastiek. Door de combinatie van een laagje water

in de bak te doen waar de potten in staan en het afdekken van de planten wordt een hoge

relatieve vochtigheid gecreëerd omdat het water niet kan verdwijnen uit het milieu. Bij de

eerste test werden er drie verschillende afdekperiodes gebruikt nl. 0, 24 en 48 u afdekking

direct na het infecteren. Later werden slechts twee afdekperiodes gebruikt (24 en 48 u). Als

hypothese wordt gesteld dat de infectie meer uitgesprokener zal zijn bij de planten die het

langst werden afgedekt.

Twee en drie weken na infectie werden alle plantjes gecontroleerd op de aanwezigheid van

symptomen veroorzaakt door de onderzochte bacteriestammen die via een knipje in het blad

van de plant werden binnengebracht. Bij het beëindigen van de proef na twee of drie weken

(afhankelijk van de incubatietemperatuur) werd het aantal plantjes geteld die de symptomen

vertonen. Indien er een duidelijke laesie aanwezig was, werd deze gemeten.

4.4.2 Resultaten

Incubatie van P.fluorescens bij -2°C

Uit de literatuur blijkt dat het aandeel P.fluorescens soorten hoger is dan de Pspo stammen

op zieke prei tijdens de winter. Of dit te maken heeft met de andere infectiewijze

(pectinolytische enzymen versus T3SS) is nog niet geweten. Het is tevens niet uitgesloten

dat bepaalde stammen uit het P.fluorescens complex een meer uitgesprokener INA activiteit

bezit. Of kunnen sommige P.fluorescens stammen gewoon sneller groeien bij temperaturen

onder het vriespunt vergeleken met Pspo stammen?

Bij deze infectieproef werden enkel de stammen van het P.fluorescens complex aangewend.

Figuur 17 geeft het aantal knipjes (in %) weer die een duidelijke infectie vertonen drie weken

na infectie. Enkel het verschil dat P.salmoni GBBC 1937 meer aantasting veroorzaakt dan

P.fluorescens GBBC 1198 (p=0,016) was statistisch aantoonbaar, verder waren er geen

significante verschillen.

44

Figuur 17: Percentage aangetaste knipjes veroorzaakt door de verschillende stammen van het P.fluorescens complex bij -2°C (Pm1475 staat voor P.marginalis GBBC 1475, Pf1198 staat voor P.fluorescens GBBC 1198, Pf1171 staat voor P.fluorescens GBBC 1171 en Ps1937 staat voor P.salmoni GBBC 1937)

Het percentage aangetaste knipjes schommelt tussen 0 en 33 % over alle stammen heen.

Gemiddeld genomen worden door P.salmoni GBBC 1937 (33 % en 15 % bij respectievelijk

24 u en 48 u afdekking) meer aantastingen veroorzaakt. P.fluorescens GBBC 1198 vertoont

daarentegen een lager aandeel geïnfecteerde knipjes (7 % bij 24 u afdekking en 0 % bij 48

u afdekking). De controle die enkel met de bufferoplossing werd behandeld, vertoont een

aantal laesies (16 % en 9 %) die verklaart kunnen worden als rechtstreeks gevolg door de

verwonding. Er zijn geen significante verschillen tussen de 24 u afgedekte planten en de 48

u afgedekte planten.

Incubatie bij 8°C

Na drie weken werd geteld hoeveel knipjes er symptomen vertonen per object. Deze

tellingen zijn weergegeven in Figuur 18. P.fluorescens GBBC 1198 vertoont hier merkelijk

meer geïnfecteerde knipjes (43 %) dan alle andere bij 24 u afdekking. Daarna volgt Pspo

GBBC 1422 met een percentage aangetaste knipjes van 21 % voor beide afdekkingen. Als

er wordt rekening gehouden met de lengtes van de laesies, dan geeft dit dezelfde resultaten

weer. De laesielengtes veroorzaakt door P.fluorescens GBBC 1198 en Pspo GBBC 1422 zijn

significant verschillend van de controle. Verder is de laesielengte van P.fluorescens GBBC

1198 ook significant groter dan deze van P.salmoni GBBC 1937. De overige stammen

vertonen geen significante verschillen. Het aantal uren afdekking veroorzaakt eveneens

geen significante verschillen, er is ook geen trend te zien dat 48 u afdekking aanleiding geeft

tot hogere infecties.

0

5

10

15

20

25

30

35

Pm1475 Pf1198 Pf1171 Ps1937 controle

Pe

rce

nta

ge a

ange

tast

e k

nip

jes

Bacteriestam

24 u afgedekt

48 u afgedekt

45

Figuur 18: Aantal aangetaste knipjes (in %) van iedere stam na 24 u en 48 u afdekking drie weken na infectie bij 8°C

Incubatie bij 18°C

De infectieproef bij een incubatietemperatuur van 18°C werd in twee delen uitgevoerd. De

infectie met de P.fluorescens stammen werd uitgevoerd met drie verschillende afdekperiodes

(0 u, 24 u en 48 u) en de Pspo stammen werden slechts met twee verschillende periodes

afgedekt (24 u en 48 u).

Figuur 19: Aantal knipjes die infectie vertonen (in %), twee weken na de infectie met 0, 24 en 48 uren afdekking onder plastiek

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pe

rce

nta

ge a

ange

tast

e k

nip

jes

Bacteriestam

24 u afgedekt

48 u afgedekt

0

10

20

30

40

50

60

Co

ntro

le

Pm

14

75

Pf1

19

8

Pf1

17

1

Ps1

93

7

Psp

o1

42

2

Psp

o1

90

8

Psp

o1

68

7

Aan

tal a

ange

tast

e k

inp

jes

(in

%)

Bacteriestam

0 u afgedekt

24 u afgedekt

48 u afgedekt

46

Volgens Figuur 19 zouden de twee stammen van P.fluorescens (GBBC 1171 en GBBC

1198) en Pspo GBBC 1422 de meest infectieuze zijn. De boxplot in Figuur 20 bevestigt deze

stelling. Met uitzondering van de controle is op de grafiek geen duidelijk verband te zien

zoals gesteld in de hypothese dat afdekking zou leiden tot hogere infectie. In de helft van de

gevallen geeft de afdekking van 24 u de duidelijkste infecties weer.

Figuur 20: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door de bacteriestammen bij 18°C twee weken na infectie

Als alle afdekkingen in rekening worden gebracht, is de laesielengte van de controle

significant lager dan deze van Pspo GBBC 1422 (p=0,0015), P.fluorescens GBBC 1198

(p=0,006), P.fluorescens GBBC 1171 (p=0,0065) en Pspo LFBP 1687 (p=0,047). P.salmoni

GBBC 1937 heeft de significant laagste waarde voor de laesielengte (p=0,0115).

47

Incubatie van Pspo bij 28 °C

Figuur 21 geeft het percentage aangetaste knipjes weer twee weken na de infectie. Bij de

incubatie van preiplanten op een temperatuur van 28°C waren de symptomen niet geheel

duidelijk. Vanwege deze reden werd een onderscheid gemaakt in lichte aantasting en

symptomen op basis van een duidelijke laesie. De verschillen tussen de stammen zijn in

deze proef minimaal en niet significant. Niettegenstaande kunnen toch enkele trends worden

besproken. In Figuur 21 is er een tendens dat bij de objecten die 48 u werden afgedekt meer

duidelijke laesies verschijnen. Bij 48 u afdekking lijkt Pspo GFBP 1908 het meest infectieus.

Pspo GBBC 1422 vertoont een hoge graad van lichte aantasting, doch geen hoge graad van

duidelijke laesies. De stam Pspo LFBP 1687 vertoont net een omgekeerde trend. Hieruit kan

worden verondersteld dat Pspo LFBP 1687 agressiever is dan Pspo GBBC 1422 die trager

symptomen vertoont bij de planten.

Figuur 21: Aantal aangetaste blaadjes (in %) twee weken na infectie veroorzaakt door Pspo stammen bij 24 en 48 u afdekking op een temperatuur van 28°C

Uit Figuur 22 blijkt, rekening houdend met de laesielengte, Pspo LFBP 1687 het agressiefst

te reageren op de preiplantjes. Door een gepaarde Mann-Whitney U test uit te voeren is er

enkel een significant verschil tussen de controlebehandeling en de Pspo stam CFBP 1908

(p=0,0365).

48

Figuur 22: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door Pspo stammen bij 28 °C

4.4.3 Bespreking resultaten

Tabel 17 is een overzichtstabel waar de aantastingsgraad (in % aangetaste knipjes) vermeld

wordt in functie van de incubatietemperaturen en de bacteriestam voor iedere afdekking

(0/24 en 48 u).

Tabel 17: Overzichtstabel van percentage aangetaste knipjes bij 0,24 en 48 u afdekking (0/24/48)

P.m

arg

inalis

GB

BC

1475

P.f

luore

scens

GB

BC

1198

P.f

luore

scens

GB

BC

1171

P.s

alm

oni

GB

BC

193

7

Psp

o

GB

BC

142

2

Psp

o

GF

BP

1908

Psp

o

LF

BP

1687

Co

ntr

ole

-2°C -/21/17 -/7/0 -/0/21 -

/33/15

- - - -/17/9

8°C -/15/7 -/43/8 -/7/14 -/0/14 -/21/21 -/14/8 -/7/14 -/7/0

18°C 33/7/33 50/36/17 39/50/29 10/0/7 -/50/25 -/30/14 -/25/23 8/13/20

28°C - - - - 27/46/54 38/42/64 50/42/50 25/15/36

49

De controle bij de negatieve temperaturen heeft minder maar toch enige vorm van

aantasting. Een mogelijke verklaring voor dit verschijnsel is dat door de knipjes gevolgd door

vorsttemperaturen de cellen degraderen met als gevolg moeilijk onderscheidbare

symptomen. De resultaten dienen dan ook met de nodige voorzichtigheid en kritisch

beoordeeld te worden. Er is een trend dat P.salmoni GBBC 1937 het meeste infectie

vertoont bij temperaturen onder het vriespunt. Dit blijkt enkel bij deze temperaturen,

aangezien deze stam bij de andere incubatietemperaturen nagenoeg geen infectie vertoont.

Bij een temperatuur van 8°C zijn P.fluorescens GBBC 1198 en Pspo GBBC 1422 het meest

infectieus. Door de relatief lagere symptoomvorming bij P.fluorescens GBBC 1171 en

P.salmoni GBBC 1937 kan verondersteld worden dat deze stammen niet infectieus zijn op

jonge preiplanten bij 8°C. Het optreden van enige symptoomvorming kan te wijten zijn aan

de gevolgen van schade door het knippen.

Bij een temperatuur van 18°C zijn de vier meest infectieuze stammen P.fluorescens GBBC

1171, P.fluorescens GBBC 1198, Pspo GBBC 1422 en Pspo LFBP 1687. P.salmoni GBBC

1937 geeft bij deze temperatuur geen verschillen met de controle. P.fluorescens GBBC 1171

reageert verschillend bij temperaturen van 8°C en 18°C. Bij de koelere temperatuur zou de

bacterie geen infectie veroorzaken terwijl bij 18°C deze stam een van de meest infectieuze

blijkt te zijn.

Bij 28°C werden enkel de Pspo stammen in rekening gebracht. Hierbij is het moeilijk om een

verschil op te merken tussen de stammen onderling. Het is wel duidelijk dat naarmate de

temperatuur stijgt, de symptomen teweeggebracht door besmetting met Pspo meer

uitgesprokener is. Bij koelere temperaturen (8°C en 18°C) is het vooral stam GBBC 1422 van

de Pspo stammen die meest infectieus is, echter bij 28°C wordt dit verschil kleiner.

4.5 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verneveling

4.5.1 Proefopzet

Meestal worden infectieproeven met bacteriën via verneveling toegepast.

Ook onder veldomstandigheden worden inoculaties uitgevoerd m.b.v.

een rugsproeier. De bacteriën worden zo op het blad gebracht en dienen

zelf de plant te penetreren zoals dat in de natuur voorkomt. Bij deze

wijze van infecteren worden de pathogenen niet rechtstreeks in de plant

gebracht en dient de concentratie dan ook wat hoger te zijn (concentratie

t.h.v. blad bedraagt 1010 CFU) vergeleken met de knipmethode. Er

werden per stam 12 preiplanten geïnfecteerd met een handsproeiertje

(zie Figuur 23). Een week en twee weken na de infectie werden de

plantjes gescoord op eventuele symptomen. De incubatietemperatuur

bedroeg 25°C en er werd één afdekperiode gehanteerd namelijk 24 u

afdekking. Figuur 23: Handsproeier waarmee de bacteriesuspensie werd verneveld op het blad

50

4.5.2 Resultaten

Het aantal blaadjes die laesies vertoonden was verschillend naargelang de stam en het

waarnemingstijdstip. Onderstaande tabel geeft het aantal blaadjes weer per stam op de twee

observatiemomenten.

Tabel 18: Aantal zieke blaadjes een en twee weken na infectie bij 25°C na 24 u afdekking

Bacteriestam Na 1 week Na 2 weken

Pspo GBBC 1422 14 26

Pspo GFBP 1908 11 18

P. marginalis GBBC 1475 10 9

Pspo LFBP 1687 6 22

P.fluorescens GBBC 1198 6 11

P.salmoni GBBC 1937 4 9

Controle 2 8

P.fluorescens GBBC 1171 2 4

Deze tabel toont aan dat Pspo GBBC 1422, Pspo GFBP 1908, P. marginalis GBBC 1475 en

Pspo LFBP 1687 het meeste aangetaste blaadjes heeft. P.salmoni GBBC 1937,

P.fluorescens GBBC 1171 en de controle infecteren het minste blaadjes. Bij P. marginalis

GBBC 1475 is na twee weken geen infectie bijgekomen, terwijl bij Pspo LFBP 1687 na de

tweede week het aantal geïnfecteerde blaadjes bijna verviervoudigd is. Het fenomeen dat

Pspo stammen het meest agressief zijn bij warmere temperaturen wordt bij deze proef

bevestigd. P.salmoni en P.fluorescens GBBC 1171 zijn heel weinig infectieus.

51

Figuur 24: Totale laesielengte na verneveling met bacteriestam een week na infectie bij een incubatietemperatuur van 25°C

Als er wordt rekening gehouden met de grootte van de laesies en het al of niet necrotisch

worden dan lijkt hier P.marginalis GBBC 1475 het agressiefst aangezien het aandeel

necrotische laesies bijna 90 % is. De totale laesielengte veroorzaakt door Pspo GBBC 1422

is na de eerste week het grootst met een aandeel necrotische laesies van 34 %. De controle,

P.fluorescens GBBC 1171 en Pspo CFBP hebben de kleinste laesies een week na de

infectie.

Figuur 25: Totale laesielengte na verneveling per bacteriestam twee weken na infectie bij een incubatietemperatuur van 25°C

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

PsG

BB

C 1

42

2

PsC

FBP

16

87

PfG

BB

C1

17

1

PsC

FBP

19

08

PfG

BB

C1

19

8

Co

ntro

le

PfG

BB

C1

93

7

Pm

GB

BC

14

75

Tota

le le

sie

len

gte

(in

mm

)

Bacteriestam

necrose 1

chlorose1

0

500

1000

1500

2000

2500

PsG

BB

C 1

42

2

PsC

FBP

16

87

PfG

BB

C1

17

1

PsC

FBP

19

08

PfG

BB

C1

19

8

Co

ntro

le

PfG

BB

C1

93

7

Pm

GB

BC

14

75

Tota

le le

sie

len

gte

(in

mm

)

Bacteriestam

necrose 2

chlorose 2

52

Als de totale laesielengte wordt bemonsterd twee weken na het infecteren, kunnen enkele

verschuivingen worden waargenomen. Pspo GBBC 1422 vertoont nog steeds de grootste

laesies in totaal, maar het aandeel necrose is nu van 34 % naar bijna 80 % geëvolueerd.

Opmerkelijk is dat Pspo CFBP 1687 na de tweede week 1870 mm laesies veroorzaakt

waarvan 90 % necrotisch is terwijl dit na een week slechts 160 mm bedroeg met necrose van

70 %. Het omgekeerde fenomeen komt voor bij de P.marginalis stam waar na twee weken,

vergeleken met de andere stammen, de totale laesielengte slechts op de vijfde plaats staat

terwijl dit na de eerste week nog de tweede plaats was.

Figuur 26: Boxplot van de totale laesielengte twee weken na infectie i.f.v de bacteriestam

In Figuur 26 is het duidelijk dat de Pspo stammen het meest infectieus zijn. De laesies

veroorzaakt door Pspo CFBP 1908 zijn minder dan de helft van de andere twee Pspo

stammen, doch dit is geen significant verschil. De Pspo stammen zijn significant meer

infectieus dan de andere stammen. P.fluorescens GBBC 1171 is niet infectieus op de

preiplantjes want deze stam is niet significant verschillend ten opzichte van de controle. De

vergelijkingstabel met de bijhorende p-waarden is weergegeven in bijlage 9.

53

4.5.3 Bespreking resultaten

De Pspo stammen zijn hier significant meer infectieus dan de andere stammen afkomstig

van het P.fluorescens complex. De proeven werden uitgevoerd met jonge preiplanten. Deze

bevinding bevestigd de literatuurstudie waar wordt aangehaald dat bacteriestammen uit het

fluorescens complex niet of minder infecteren bij jonge preiplanten, maar later in het

groeiseizoen, bij oudere prei dus, actief worden. De vaststelling dat de eerste week na

infectie vooral P.marginalis aantasting veroorzaakte en later na twee weken andere

stammen infectieuzer bleken, wijst in de richting dat P. marginalis heel snel de plant kan

infecteren om nadien stabiel te blijven. Het tegenovergestelde wordt waargenomen bij Pspo

CFBP 1687 waar na twee weken een heel groot aantal blaadjes werden aangetast.

54

5 Discussie

Rassenproeven die de gevoeligheid aan bacterieziekte veroorzaakt door Pspo onderzoeken,

werden eerder uitgevoerd in het PCG in Kruishoutem in 2012 en 2013. De vroege

herfstrassen die werden opgenomen in deze thesis en tegelijk ook in de rassenproeven bij

het PCG zijn Belton en Pluston in 2012 en Krypton, Duraton en Pluston in 2013. Er werden

bij deze rassenproeven ook geen significante verschillen waargenomen. Belton was bij een

eerste waarneming een van de meest aangetaste samen met nog twee andere rassen.

Echter dit verschil van aantasting verdween naar het einde van de proef. In deze thesis werd

met een ziekte-index gewerkt waarbij alle waarnemingen over het groeiseizoen in rekening

werden gebracht. Op basis van deze ziekte-index kan een goede vergelijking worden

gemaakt tussen de rassen onderling. Echter waren ook hier geen significante verschillen van

de ziekte-index voor de opgenomen rassen. Er is wel een significant verschil tussen het ras

met de hoogste ziekte-index (SG 1101) en de laagste ziekte-index (Rally) voor de herfstprei.

Bij de rassenproef late herfst-winterprei zijn meer rassen opgenomen die ook in het PCG

werden onderzocht. Bij deze rassenproef werden ook geen significante verschillen

waargenomen. Er kunnen wel enkele bevindingen worden gedaan. Zo vertoonde Curling,

Nestor en Aylton in 2012 iets minder symptomen van aantasting door Pspo dan de andere

rassen. Harston had bij de oogst iets meer aantasting vergeleken met de andere rassen. Het

ras Curling komt hier tevens ook bovenaan de lijst naar tolerantie tegen Pspo aantasting.

Nestor had hier een grotere ziekte-index wat niet wordt bevestigd door de proeven van 2012,

waar dit ras eerder meer tolerantie vertoonde vergeleken met de andere rassen.

Verder werd een veldproef uitgevoerd om de mogelijkheden voor bacteriofaagtherapie te

optimaliseren. Een eerste toediening van de bacteriofagen was door middel van een

dompelbehandeling. Dit werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij Rombouts et al. (2016).

Bij de beoordeling drie maanden na de behandeling is het percentage aangetaste planten 51

% bij het behandelde object en 71 % bij de controle. Omdat een verschil op een welbepaald

moment niet veelzeggend is, werd hier terug een ziekte-index opgesteld waarbij de zes

observaties samen vervat zitten in één waarde. De ziekte-index voor de met bacteriofagen

behandelde prei en de controle bedraagt respectievelijk 312 en 329. Dit minimaal verschil is

niet significant. Bij de toediening van bacteriofagen via spuitmethode (verneveling) werden

geen significante verschillen waargenomen bij ieder observatiemoment en de ziekte-index.

Uit deze resultaten kan worden bevestigd dat faagtherapie onder veldomstandigheden wel

mogelijk is, maar afhankelijk is van heel wat factoren zoals bepaalde weersomstandigheden

(zonlicht, neerslag etc.). De moeilijkheid van faagtherapie is de toediening ervan en de nood

aan een hoge densiteit van de bacteriofagen om potentieel te kunnen concurreren met de

Pspo stammen aanwezig op dat moment. De vele milieufactoren in de fyllosfeer maakt

faagtherapie heel moeilijk om bladziekten zoals bacterieziekte bij prei te behandelen

(Rombouts et al., 2016).

De infectieproeven die zowel via de knipmethode als de vernevelingsmethode werden

uitgevoerd, bevestigen dat Pspo stammen meer infectieus zijn bij warmere temperaturen dan

55

de stammen afkomstig van het Pseudomonas fluorescens complex. Van de Pspo stammen

zou stam GBBC 1422 het meest infectieus zijn. Dit verschil is vooral het grootst bij koelere

temperaturen. Niettegenstaande geen significante verschillen voorkwamen, werd bij

vorsttemperatuur vooral schade veroorzaakt door P.salmoni GBBC 1937 vastgesteld.

Daarna volgde P.marginalis GBBC 1475.

De vernevelingsproef toont aan dat P.marginalis heel snel het blad kan infecteren vergeleken

met Pspo CFBP 1687 waarbij de symptomen later optreden. Dit kan een mogelijke verklaring

bieden voor het feit dat stammen uit het P.fluorescens complex meer schade verrichten bij

koude temperaturen dan Pspo stammen die meer infectie veroorzaken bij warme

temperaturen.

De parameter relatieve vochtigheid die werd gestuurd aan de hand van afdekking met

plastiek geeft geen eenduidige resultaten. Als hypothese werd gesteld dat hoe langer werd

afgedekt (langere relatieve vochtigheid), hoe hoger de kans op infectie. Deze hypothese

wordt slechts in redelijke mate gevolgd bij de infectie op 28°C. Bij de andere temperaturen

zijn geen significante verschillen tussen de periode van afdekken.

De symptomen bij het vernevelen waren duidelijker onderscheidbaar dan bij de infectie met

de knipmethode. Een mogelijke oorzaak kan zijn dat de concentratie van de bacteriën bij de

knipmethode lager was dan bij het vernevelen. Anderzijds kan de oorzaak ook te wijten zijn

aan een onderschatting van de besmetting via de knip, waarbij het gebruikte volume

bacteriesuspensie kleiner was dan deze gebruikt bij het vernevelen. Eventueel kan het

verschil ook te wijten zijn aan het stadium waarin de prei zich bevond bij het infecteren. Zo

was de prei bij de infectie d.m.v. de knipmethode iets jonger dan de prei die werd

geïnfecteerd door verneveling.

56

6 Algemene conclusie

Uit deze thesis blijkt dat rassenkeuze geen grote rol speelt in gevoeligheid aan bacteriële

infectie veroorzaakt door Pseudomonas syringae pv. porri en P.fluorescens. De

gezondheidstoestand en het fysiologisch stadium van de prei zijn meer bepalend voor

gevoeligheid aan infectie. Het onder controle houden van de bacterieziekte door middel van

bacteriofaagtoediening in gecontroleerde omstandigheden is vrijwel bewezen, maar het

gebruik onder veldomstandigheden geeft onduidelijke resultaten weer. Het dompelen van de

prei voor het uitplanten in een bacteriofaagoplossing lijkt hier een betere toedieningsmethode

te zijn dan het herhaaldelijk vernevelen van een bacteriofaagoplossing na het uitplanten

hoewel deze verschillen niet significant zijn. Faagtherapie onder veldomstandigheden dient

geoptimaliseerd te worden waarbij de bestendigheid van de bacteriofagen in de fyllosfeer

tegen verschillende omgevingsfactoren zoals uv-licht en uitdroging de grootste uitdagingen

zullen zijn.

De infectieproeven bevestigen dat P.syringae pv. porri stammen meer infectieus zijn bij

jonge preiplanten en warmere temperaturen vergeleken met stammen uit het P.fluorescens

complex. De infectiemethode via verwonding kan nog verbeterd worden aangezien deze

minder duidelijke symptomen van aantasting weergeeft vergeleken met de infectie via

verneveling.

57

7 Referentielijst

Alsohim, A. S., et al. (2014). The biosurfactant viscosin produced by Pseudomonas

fluorescens SBW25 aids spreading motility and plant growth promotion. Environmental

Microbiology, pp. 2267-2281.

Baker, C. J., et al. (2011). Detection of bacterial aggregation in tobacco cell suspensions

treated with pathogenic bacteria. Physiological and Molecular Plant Pathology, pp. 170-175.

Bashan, Y., & de Bashan, L.E. (2002). Reduction of bacterial speck (Pseudomonas syringae

pv. tomato) of tomato by combined treatments of plant growth-promoting bacterium,

Azospirillum brasilense, streptomycin sulfate, and chemo-thermal seed treatment. European

Journal of Plant Pathology, pp. 821-829.

Bender, C.L., Alarcon-Chaidez, F., & Gross, D.C. (1999). Pseudomonas syringae

phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide

synthetases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, pp. 266-292.

Block, E. (2010). Garlic and Other Alliums: The Lore and the Science. RSC Publishing, 480

blz.

Boch, J. en Bonas, U. (2010). Xanthomonas AvrBs3 family - type III effectors: discovery and

function. Annual Review of Phytopathology, pp. 419-436.

Buell, C.R., Joardar, V., Lindeberg, M., Selengut, J., Paulsen, I.T., Gwinn, M.L. et al. (2003).

The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonas

syringae pv. tomato DC3000. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,

pp.10181-10186.

Cole, D.L. (1999). The efficacy of acibenzolar-S-methyl, an inducer of systemic acquired

resistance, against bacterial and fungal diseases of tobacco. Crop Protection, pp. 267-273.

Cornelissen, A., et al. (2012). Identification of EPS-degrading activity within the tail spikes of

the novel Pseudomonas putida phage AF. Virology 434(2), pp. 251-256.

Declercq, B. (2009). Integrated disease management based on the life cycle of Phytophthora

porri. Doctoraat, Gent, Universiteit Gent, Fac. Toegepaste bio-ingenieurswetenschappen:

landbouw, 2005-2009, 228 blz.

Denny, T.P. (1995). Involvement of bacterial polysaccharide in plant pathogenesis. Annual

Review of Phytopathology, pp. 173-197.

Eurostat. Geraadpleegd op 1 april 2016 via ec.europa.eu

Feil, H., Feil, W.S., Chain, P., Larimer, F., Dibartolo, G., Copeland, A. et al. (2005).

Comparison of the complete genome sequences of Pseudomonas syringae pv. syringae

B728a and pv. tomato DC3000. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

USA, pp. 11064-11069.

58

Gardan, L., Shafik, H., Belouin, S., Broch, R., Grimont, F., & Grimont, P.A.D. (1999). DNA

relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of

Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. In Sutic en Dowson

(Eds.), International Journal of Systemic Bacteriology, pp. 469-478.

Glickmann, E., Gardan, L., Jacquet, S., Hussain, S., Elasri, M., Petit, A., & Dessaux, Y.

(1998). Auxin production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas syringae.

Molecular Plant Microbe Interactions, pp. 156-162.

Goehre, V. & Robatzek, S. (2008). Breaking the barriers: Microbial effector molecules

subvert plant immunity. Annual Review of Phytopathology. pp.189-215.

Gross, M. & Rudolph, K. (1987). Demonstration of levan and alginate in bean plants

(Phaseolus vulgaris) infected by Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Journal of

Phytopathology, pp. 9-19.

Hall, B. H., et al. (2007). Leek diseases in Australia. Australasian Plant Pathology, pp. 383-

388.

Hernandez-Anguiano, A. M., et al. (2004). Biosurfactants produced by Pseudomonas

fluorescens and soft-rotting of harvested florets of broccoli and cauliflower. Plant Pathology,

pp. 596-601.

Hirano, S., & Upper, C.D. (2000). Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on

Pseudomonas syringae – a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular

Biology Reviews, pp. 624-653.

Höfte, M. & Vos, P. (2006). Plant pathogenic Pseudomonas species. Plant-Associated

Bacteria, pp. 507-533. Dordrecht: Springer Netherlands.

Janse, J.D., Derks, J.H.J., Spit, B.E., 1 and Van Der Tuin, W.R. (1992). Classification of

fluorescent soft rot Pseudomonas bacteria, including P. marginalis strains, using whole cell

fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology, pp. 538-553.

Ji, P., et al. (2006). Integrated biological control of bacterial speck and spot of tomato under

field conditions using foliar biological control agents and plant growth-promoting

rhizobacteria. Biological Control, pp. 358-367.

Jin, Q., Thilmony, R., Zwieser-Vollick, J., & He, S.H. (2003). Type III protein secretion in

Pseudomonas syringae. Microbes and Infection, pp. 301-310.

Jones, J.D.G en DangI, J.l. (2006). The plant immune system. Nature 444, pp. 323-329.

Kersters, K., Ludwig, W. Vancanneyt, M., De Vos, P., Gillis, M., & Schleifer, K.H. (1996).

Recent changes in the classification of the pseudomonads: an overview. Systematic and

Applied Microbiology, pp. 465-477.

59

Khedim, T., et al. (2013). Biosystematics and Plant Genetic Resources: Example from the

Genus Allium (Amaryllidaceae) of the Algerian Flora. International Symposium on Medicinal

and Aromatic Plants - Sipam 2012. M. Neffati and H. Khatteli, pp. 19-23.

Lamichhane, J. R., et al. (2015). Insights into epidemiology and control of diseases of annual

plants caused by the Pseudomonas syringae species complex. Journal of General Plant

Pathology, pp. 331-350.

Lantin, C. (2009). De toepassing van bacteriofagen in de beheersing van pathogenen in

eetwaren van dierlijke oorsprong. Masterproef, Gent, Universiteit Gent, Fac.

Dierengeneeskunde, 2008-2009, 19 blz.

Li, B., et al. (2009). First Report on Bacterial Heart Rot of Garlic Caused by Pseudomonas

fluorescens in China. Plant Pathology Journal, pp. 91-94.

Louws, F. J., et al. (2001). Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using

a plant activator. Plant Disease, pp. 481-488.

Manoharan, B., et al. (2015). The Identification of Genes Important in Pseudomonas

syringae pv. phaseolicola Plant Colonisation Using In Vitro Screening of Transposon

Libraries. Plos One, pp. 19.

McManus, P.S., Stockwell, V.O., Sundin, G.W., & Jones, A.L. (2002). Antibiotic use in plant

agriculture. Annual Review of Phytopathology, pp. 443-465.

Melotto, M., et al. (2008). Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial

diseases. Annual Review of Phytopathology, pp. 101-122.

Morris, C. E., et al. (2013). The Life History of Pseudomonas syringae: Linking Agriculture to

Earth System Processes. In N.K. Van Alfen (ed), Annual Review of Phytopathology, Vol 51,

pp. 85-104.

Noble, D. H., et al. (2006). Characterisation of Pseudomonas syringae strains associated

with a leaf disease of leek in Australia. European Journal of Plant Pathology, pp. 419-430.

Nomura, K., Melotto, M., & He, S.Y. (2005). Suppression of host defense in compatible plant-

Pseudomonas syringae interactions. Current Opinion in Plant Biology, pp. 361-368.

Oguiza, J.A., & Asensio, A.C. (2005). The VirPphA/AvrPtoB family of type III effectors in

Pseudomonas syringae. Research in Microbiology, pp. 298-303.

Okon, J. (1990). Methods in agronomy to reduce bacterial diseases. In Z. Klement, K.

Rudolph, & D.C. Sands (Eds.), Methods in Phytobacteriology, pp. 301-306). Budapest:

Akadémiai Kiadó.

60

Palleroni, N.J., Kunisawa, R., Contopoulou, R., & Doudoroff, M. (1973). Nucleic acid

homologies in the genus Pseudomonas. International Journal of Systematic Bacteriology, pp.

333-339.

Perkins, L. B., Leger, E.A., Nowak, R.S. (2011). Invasion triangle: an organizational

framework for species invasion. Ecology and Evolution.

Rombouts, S., et al. (2015). Isolation and characterization of Pseudomonas syringae pv.

porri from leek in Flanders. European Journal of Plant Pathology, pp. 185-198.

Rombouts, S., et al. (2016). Isolation and characterization of Pseudomonas syringae pv.

porri from leek in Flanders. European Journal of Plant Pathology, pp. 185-198.

Romero, A. M., et al. (2001). Resistance to bacterial spot in bell pepper induced by

acibenzolar-S-methyl. Plant Disease, pp. 189-194.

Sarkar, S. F. & Guttman, D. S. (2004). Evolution of the core genome of Pseudomonas

syringae, a highly clonal, endemic plant pathogen. Applied and Environmental Microbiology,

pp. 1999-2012.

Sawada, H., et al. (1999). Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars

suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp, gene

cluster. Journal of Molecular Evolution, pp. 627-644.

Sherif, S., et al. (2015). Molecular Insights into Plant-Phytopathogenic Bacteria Interactions.

Plant Molecular Biology Reporter, pp. 1116-1130.

Skirvin, R.M., Kohler, E., Steiner, H., Ayers, D., Laughnan, A., Norton, M.A., & Warmund, M.

(2000). The use of genetically engineered bacteria to control frost on strawberries and

potatoes. Scientia Horticulturae, pp. 179-189.

Smith, I.M., Dunez, J., Lelliott, R.A., Phillips, D.H., & Arch, S.A. (Eds.) (1988). European

Handbook of Plant Diseases. Oxford, UK: Blackwell Scientific Publications.

Sun, W. X., et al. (2006). Within-species flagellin polymorphism in Xanthomonas campestris

pv campestris and its impact on elicitation of Arabidopsis flagellin sensing2-dependent

defenses. Plant Cell, pp. 764-779.

Syngenta. Geraadpleegd op 8 april 2016 via http://www.syngentacropprotection.com

/labels/p-644/actigard-50wg

Tack, A. (2013). Rol van Xanthomonas campestris pv. campestris in oppervlaktewater in de

epidemiologie van zwartnervigheid bij koolgewassen. Masterproef, Gent, Unversiteit Gent,

Fac. Bio-ingenieurswetenschappen, 2012-2013, 85 blz.

ten Berge, H. F. M., van Geel, W. C. A., Radersma, S., Meurs, E.J.J., Grashoff, C. (2010).

Feed the Crop or Feed the Soil? A Case Study in Leek (Allium porrum L.). Iv International

61

Symposium on Ecologically Sound Fertilization Strategies for Field Vegetable Production. R.

U. Larsen. pp. 85-95.

Thordal-Christensen H. (2003). Fresh insights into processes of nonhost resistance. Current

Opinion in Plant Biologie , pp. 351-357.

Vanheule, H. (2015). Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen. Masterproef,Gent,

Universiteit Gent, Fac. Toegepaste Bio-ingenieurswetenschappen, 2014-2015, 76 blz.

van Overbeek, L. S., et al. (2010). The role of crop waste and soil in Pseudomonas syringae

pathovar porri infection of leek (Allium porrum). Applied Soil Ecology, pp. 457-463.

Van Vaerenbergh J., 2016,mondelinge mededeling.

Vidaver, A.K. en P.A. Lambrecht. (2004). Bacteria as plant pathogens. The Plant Health

Instructor, pp. 10.

Warren, G., Corotto, L., & Wolber, P. (1986). Conserved repeats in diverged ice nucleation

structural genes from two species of Pseudomonas. Nucleic Acids Research, pp. 8047-8060.

Weingart, H., et al. (2001). The role of ethylene production in virulence of Pseudomonas

syringae pvs. glycinea and phaseolicola. Phytopathology, pp. 511-518.

Weingart, H., & Volksch, B. (1997). Ethylene production by Pseudomonas syringae

pathovars in vitro and in planta. Applied and Environmental Microbiology, pp. 156-161.

Whitehead, N. A., et al. (2001). Quorum-sensing in gram-negative bacteria. Fems

Microbiology Reviews. pp. 365-404.

Wiebe, H.J. (1994). Effects of temperature and daylength on bolting of leek (Allium porrum

L.). Scientia Horticulturae, pp. 177-185.

Xing, K., et al. (2015). Chitosan antimicrobial and eliciting properties for pest control in

agriculture: a review. Agronomy for Sustainable Development, pp. 569-588.

Young, J.M., Bull, C.T., De Boer, S.H., Firrao, G., Gardan, L., Saddler, G.E., Stead, D.E., &

Takikawa, Y. (2004). Names of Plant Pathogenic Bacteria Published Since 1995.

International Society of Plant Pathology.

62

8 Bijlagen

Bijlage 1: Efficiëntie van bacteriofagen tegen Pseudomonas syringae pv. porri:

dompelbehandeling (protocol Inagro)

Doel: Beschermde planten worden uitgeplant in een perceel dat aangetast is door Pspo

(piste dat Pspo in het veld aanwezig is). Als het perceel niet aangetast is, kan de grond voor

plant geïnfecteerd worden.

Eventuele infectie: De dichtheid van de suspensie bedraagt 108 cellen per ml (1 kolonie

oplossen in 1 ml). Voor het spuiten wordt de suspensie verdund tot 1:100. De suspensie

wordt over de proef verneveld met een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met 1000

l/ha water.

Objecten: minimum 25 planten per object, proef aanleggen in 4 herhalingen

- Onbehandeld (gelijk volume water!)

- Faagcoctail (107 PFU/plant)

Werkwijze:

1. Ga op zoek naar geïnfecteerde grond of infecteer de grond zelf: beschermde planten

worden nadien in besmette grond geplant

2. Faagtoepassing: dompelbehandeling

3. Plant

4. Beoordeling wekelijks: pest incidence (aantal aangetaste planten)

Infectie goed opvolgen om vroege verschillen op te merken (eens infectie er is zullen fagen

weinig verschil kunnen maken)

Benodigdheden:

- Besmette grond of bacterieoplossing

- Planten

- Faagoplossing

o nodig: 107 PFU/plant

o uitgangsmateriaal: 109 PFU/ml

o gangbare toepassing: 200 liter voor 150 000 planten

o proeftoepassing: meer oplossing maken om goed te kunnen behandelen: 5

liter = 3750 planten (PCG zal maar 1280 planten behandelen met fagen maar

wel 5 liter oplossing maken)

o dus: 3750*107 PFU

o of: 37,5 ml 109 PFU/ml

o Uitgangsmateriaal voor 1 object in 4 herhalingen in de proef: 37,5 ml

63

Bijlage 2: Efficiëntie van bacteriofagen tegen Pseudomonas syringae pv. porri:

bespuitingen in het veld (protocol Inagro)

Doel: Na plant worden besmette Pspo planten behandeld met fagen (piste dat Pspo op de

planten zit).

Infectie: De dichtheid van de suspensie bedraagt 108 cellen per ml (1 kolonie oplossen in 1

ml). Voor het spuiten wordt de suspensie verdund tot 1:100. De suspensie wordt over de

proef verneveld met een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met 1000 l/ha water.

Objecten: minimum 25 planten per object, proef aanleggen in 4 herhalingen

- Faagcocktail (108 PFU/plant); water

- Bacteriesuspensie; water

- Bacteriesuspensie; Faagcocktail (108 PFU/plant)

- Onbehandeld (gelijk volume water!)

Werkwijze:

1. Plant

2. Bacterie-infectie: liefst uitvoeren bij regenachtig weer, indien niet mogelijk: planten

nat zetten, inoculum vernevelen; Let op: niet volledige proef moet geïnfecteerd

worden, enkel objecten 2 en 3!

3. Faagbehandeling in het veld: liefst uitvoeren bij bewolkt weer of 's avonds (fagen

worden afgebroken door UV)

- 1 faagbehandeling voor infectie, 4 weken lang elke week behandelen na infectie

- infectie goed opvolgen om vroege verschillen op te merken (eens infectie er is

zullen fagen weinig verschil kunnen maken)

4. Beoordeling wekelijks: pest incidence (aantal aangetaste planten)

Benodigdheden:

- Bacterieoplossing

- Planten

- Faagoplossing

o nodig: 108 PFU/plant

o plantdichtheid proef PCG: 100 000 planten/ha

o dus: 100 000*108 PFU/ha

o of: 10 000 ml 109 PFU/ml per ha

o of: 10 liter 109 PFU/ml per ha

o Uitgangsmateriaal voor twee objecten in 4 herhalingen in de proef: 218,2 ml

64

Bijlage 3: Resultaten rassenproef vroege herfstprei

Plotnr

Herhaling W1 (%) W2(%) W3(%) W4(%) W5(%) W6(%) Ziekte-index

101 1 10 40 80 70 80 100 650

201 2 10 60 100 100 100 100 850

301 3 0 70 100 86 93 100 800

102 1 20 40 60 80 80 100 650

202 2 10 55 95 100 95 100 817

302 3 0 55 80 100 100 100 767

103 1 0 55 75 95 100 100 767

203 2 0 25 50 45 100 100 583

303 3 0 80 50 100 100 100 767

104 1 0 40 70 80 90 100 650

204 2 0 40 60 100 80 80 617

304 3 5 45 60 60 65 90 567

105 1 0 60 70 60 80 100 633

205 2 0 50 50 80 80 90 583

305 3 10 20 10 70 70 100 483

106 1 0 70 75 80 85 95 700

206 2 0 70 70 95 100 100 767

306 3 0 35 75 75 85 90 633

107 1 17 100 83 100 100 100 917

207 2 0 40 60 95 100 100 700

307 3 10 20 50 80 80 100 583

108 1 0 35 60 100 80 95 650

208 2 0 25 80 75 100 100 683

308 3 0 40 30 80 80 100 567

109 1 0 50 80 100 90 100 733

209 2 0 35 85 70 80 100 650

309 3 5 35 75 95 90 95 700

110 1 0 45 95 100 100 100 800

210 2 5 55 80 85 85 100 733

310 3 0 50 80 100 90 100 733

111 1 10 40 90 90 90 90 683

211 2 0 60 90 100 90 100 767

311 3 0 60 70 70 80 80 600

112 1 5 30 70 85 80 100 650

212 2 0 20 70 100 100 100 700

312 3 0 50 40 100 90 90 633

113 1 0 40 80 100 90 100 717

213 2 10 10 100 100 80 70 650

313 3 0 30 80 85 85 100 667

114 1 0 30 60 70 70 100 567

214 2 0 120 50 70 80 90 517

314 3 0 15 65 70 90 100 600

115 1 0 40 90 95 100 100 750

215 2 10 30 100 100 85 100 767

315 3 0 60 85 100 100 100 800

65

Bijlage 4: Output van Tuckey test vroege herfstprei

ziekteindex

ras N

Subset for alpha = 0.05

1 2

Tukey HSDa Pluston 3 566,33

Rally 3 583,67

Belton 3 611,33

SV 3192 3 638,67 638,67

Gevaria 3 650,00 650,00

Volta 3 650,00 650,00

Cherokee 3 666,67 666,67

Longton 3 700,00 700,00

Duraton 3 705,67 705,67

SG 1101 3 705,67 705,67

Takrima 3 727,67 727,67

Copernic 3 744,33 744,33

Megaton 3 744,67 744,67

Krypton 3 766,67 766,67

SV 3274 3 844,67

Sig. ,152 ,127

Tukey Ba Pluston 3 566,33

Rally 3 583,67

Belton 3 611,33

SV 3192 3 638,67 638,67

Gevaria 3 650,00 650,00

Volta 3 650,00 650,00

Cherokee 3 666,67 666,67

Longton 3 700,00 700,00

Duraton 3 705,67 705,67

SG 1101 3 705,67 705,67

Takrima 3 727,67 727,67

Copernic 3 744,33 744,33

Megaton 3 744,67 744,67

Krypton 3 766,67 766,67

SV 3274 3 844,67

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.

66

Bijlage 5: Resultaten rassenproef late herfst en winterprei

Plotnr Objectnr Herhaling W1 (%) W2 (%) W3 (%) W4 (%) W5 (%) W6 (%) Ziekte-

index 101 1 1 0 25 30 50 50 60 367

201 1 2 0 35 25 55 50 75 433

301 1 3 0 25 30 50 55 65 400

102 2 1 0 15 50 40 50 45 350

202 2 2 0 30 35 55 45 50 383

302 2 3 0 35 35 45 50 65 417

103 3 1 0 20 25 65 50 65 400

203 3 2 0 35 20 30 50 70 350

303 3 3 0 25 5 35 10 55 250

104 4 1 0 30 20 60 65 90 450

204 4 2 10 35 35 35 45 60 400

304 4 3 0 55 20 45 30 50 350

105 5 1 0 30 40 70 65 55 450

205 5 2 0 40 50 60 40 50 400

305 5 3 10 25 40 60 65 60 450

106 6 1 0 30 50 90 30 80 467

206 6 2 0 20 40 50 50 60 367

306 6 3 0 10 70 40 20 60 333

107 7 1 0 30 50 45 70 65 450

207 7 2 0 40 25 60 55 65 433

307 7 3 0 20 65 60 90 95 567

108 8 1 0 45 55 40 55 95 517

208 8 2 0 35 45 50 70 45 433

308 8 3 0 35 30 55 60 100 500

109 9 1 0 30 20 60 45 65 383

209 9 2 0 25 25 35 65 35 350

309 9 3 0 10 20 30 35 60 267

110 10 1 5 20 50 65 60 65 467

210 10 2 0 30 40 85 70 60 483

310 10 3 0 20 35 85 40 75 450

111 11 1 0 15 45 35 35 70 367

211 11 2 0 20 35 30 25 40 267

311 11 3 0 25 20 30 35 45 283

112 12 1 0 25 20 50 30 65 333

212 12 2 0 35 5 50 30 50 300

312 12 3 0 20 20 35 45 70 333

113 13 1 0 20 30 50 40 75 367

213 13 2 0 25 25 40 45 45 333

313 13 3 5 35 30 65 70 40 433

114 14 1 0 30 30 60 40 90 417

214 14 2 0 20 55 45 75 65 467

314 14 3 0 20 45 75 70 65 483

115 15 1 0 35 20 60 75 70 450

215 15 2 0 30 50 75 60 65 483

315 15 3 0 40 65 75 90 100 650

67

Bijlage 6: Output van Tuckey test bij late herfst-winterprei

waarde

Tukey HSDa,b

objectnummer N

Subset

1 2 3

Curling 3 305,67

Keeper 3 322,00 322,00

Delmas 3 333,33 333,33

Pluston 3 333,33 333,33

Lucretius 3 377,67 377,67 377,67

Poulton 3 383,33 383,33 383,33

Belton 3 389,00 389,00 389,00

Aylton 3 400,00 400,00 400,00

Vitaton 3 400,00 400,00 400,00

Walton 3 433,33 433,33 433,33

Lancaster 3 455,67 455,67 455,67

Oberon 3 466,67 466,67 466,67

Harston 3 483,33 483,33

SV 3274 ZL 3 483,33 483,33

Nestor 3 527,67

Sig. ,073 ,072 ,122

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 3110,789.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.

b. Alpha = ,05.

68

Bijlage 7: Resultaten van de fagenproef

Plotnr Objectnr Herhaling W1 (%) W2 (%) W3 (%) W4 (%) W5 (%) W6 (%) Ziekte-index

101 1 1 0 4 36 32 52 48 333

201 1 2 0 4 12 56 48 60 333

301 1 3 0 0 24 48 52 40 300

401 1 4 0 0 24 68 32 28 283

102 2 1 8 4 12 76 52 36 367

202 2 2 0 0 20 64 36 36 283

302 2 3 4 4 16 76 44 36 350

402 2 4 0 8 36 68 28 32 317

103 3 1 0 8 16 76 52 56 383

203 3 2 0 8 20 68 68 72 417

303 3 3 0 4 32 76 32 36 350

403 3 4 0 8 16 84 32 40 333

104 4 1 0 8 20 60 32 52 317

204 4 2 0 4 20 64 56 52 367

304 4 3 0 4 20 84 52 72 433

404 4 4 0 8 32 64 44 48 367

105 5 1 4 12 36 84 56 60 467

205 5 2 0 12 20 88 84 56 467

305 5 3 0 4 20 60 40 40 283

405 5 4 0 4 16 60 36 32 283

106 6 1 0 8 32 92 56 56 450

206 6 2 0 8 16 80 60 48 367

306 6 3 0 8 24 64 36 36 317

406 6 4 0 0 16 72 52 68 383

69

Bijlage 8: Output Tuckey test van de ziekte-index bij de verschillende objecten van

de fagenproef

index

Tukey HSDa,b

object N

Subset

1

1 4 312,25

2 4 329,25

3 4 370,75

4 4 371,00

5 4 375,00

6 4 379,25

Sig. ,548

Means for groups in homogeneous subsets are

displayed.

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 3080,322.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4,000.

b. Alpha = 0,05.

70

Bijlage 9: P-waarden van de paarsgewijze vergelijkingen tussen de stammen bij

infectie door verneveling d.m.v. Mann-Whitney U test (significante p-waarden zijn

gemarkeerd)

Pspo

GBBC

1422

Pspo

CFBP

1908

Pspo

CFBP

1687

Pm

GBBC

1475

Pf

GBBC

1937

Pf

GBBC

1198

Pf

GBBC

1171

Controle

Controle 0,001 0,031 0,004 0,788 0,801 0,402 0,222 -

Pspo

GBBC

1422

- 0,191 0,622 0,001 0,001 0,012 0,000 0,001

Pspo

CFBP

1908

- - 0,442 0,058 0,057 0,199 0,001 0,031

Pspo

CFBP

1687

- - - 0,009 0,008 0,046 0,000 0,004

Pm

GBBC

1475

- - - - 1,000 0,564 0,143 0,788

Pf

GBBC

1937

- - - - - 0,564 0,143 0,801

Pf

GBBC

1198

- - - - - - 0,048 0,402

Pf

GBBC

1171

- - - - - - - 0,222