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7/24/2019 Extraccin de ADN Minipreparacin
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Extraccin De ADN MinipreparacinModificado de Dellaporta
1. Colectar, 1 hoja o cogollo la mitad de una hoja madura;
aproximadamente 0.15-
0.2 gr de tejido.
2. Macerar en un mortero con nitrgeno l!uido.". #ran$ferir a un
tu%o eppendorf, de 1.5 ml fro, u$e una e$p&tula fra.
'. (dicionar )00 *lde %uffer de extraccin, precalentado a 65C, y
50 *I de +D+ 20.no manipular m&$ de " tu%o$ eppendorf/.
5. (gitar igoro$amente el tejido ha$ta !ue $e mecle %ien con el
%uffer,continuar
meclando durante 1 min.. ncu%ar en %a3o mara a 54C, y meclar por
iner$in 5- ece$, durante15 min.. 6etirar lo$ tu%o$ del %a3o y dejar
enfriar a temperatura am%iente,aproximadamente
2min.). (dicionar 250*l de (cetato de 7ota$io 5M fro, meclar por
iner$in $uae5-
ece$.
8. ncu%ar en hielo durante 20 min.10. Centrifugar a 12000 rpm en
una centrifuga eppendorf durante 10 min.
11. #ran$ferir el $o%renadante a un tu%o eppendorf nueo de 1.5
m.
12. (dicionar un olumen de i$opropanol fro aprox. 00*l/, 9
meclar porner$in$uae )-10 ece$.
1". ncu%ar a -)0:C durante 1 h, 9 centrifugar a 12000 rpm
durante 10 min.
1'. liminar el $o%renadante < remoer el exce$o de i$opropanol
inirtiendo lo$tu%o$$o%re una toalla de papel.
15. 6e$u$pender el precipitado en 500 lde #50l0 50mM
#ri$-=C>l?MmD#(/,incu%ar a 54C preferi%lemente durante 10 a 15
min con agitacin$uae y con$tante.
1. (dicionar un olumen de i$opropanol fro 500 *l) 9 meclar por
iner$in$uae )-
10 ece$.1. ncu%ar a -)0:C durante 1 h, 9 centrifugar a 12000 rpm
durante 1?min.1). liminar el $o%renadante, y remoer el exce$o de
i$opropanol inirtiendo lo$tu%o$
$o%re una toalla de papel. Dejar lo$ tu%o$ $o%re la toalla de
papeldurante 1 h, para
!ue el precipitado !uede %ien $eco.18. (dicionar 100-200 *I de
#l?l 10mM #ri$-=C>1Mm D#(, !ue contiene10
mg>ml 6@($a, dependiendo del tama3o del precipitado/. Auardar
lo$ tu%o$a 4C
toda la noche, o incu%ar a 65Cpara di$oler el precipitado.
20. #ran$ferir a tu%o$ eppendorf< correr 2 *lde mue$tra en un
gel de agaro$apara er lacalidad.
21. Auardar el (D@ a -20:C paraalmacenar a largo plao a '4C $i
$e a a almacenar
durante 1 o 2 da$.
Buffer de xtracccin 7ara 1 litro de $olucin/.
6eactio olumen
l??mM#r$-=Cl 100 ml de M #ri$-=C
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50mM D#( 100 ml de ?.5M D#(
500mM@aC 100 ml de 5M @aC
Completar el olumen con agua deioniada.
(utoclaar durante 15 min.
(dicionar 1%. (w/v) de 77; di$oler.(dicionar 00l de
2p-Mercaptoetanol.
7recaucin l 2p-Mercaptoetanol e$ altamente txico, de%e u$ar$e
guante$ < ma$carillapara manipularlo.
Anexo 2
Extraccin De ADN Minipreparacin#omado de Dellaporta,
modificado-la%oratorio de genEtica < %iologa molecular/
1. Colectar hoja$ tierna$, aproximadamente 0.15-0.2 gr de
tejido.
2. Macerar en un mortero con nitrgeno l!uido.
". #ran$ferir a un tu%o eppendorf, de 1.5 ml fro, u$e una
e$p&tula o a$a fra.
'. (dicionar )00 *lde %uffer de extraccin, a temperatura
am%iente, y 50 *I de +D+20.
5. (gitar igoro$amente el tejido ha$ta !ue $e mecle %ien con el
%uffer,continuar
meclando durante 1 min manualmente.
. ncu%ar en %a3o mara a 54C, y meclar por iner$in 5- ece$,
durante15 min.. 6etirar lo$ tu%o$ del %a3o y dejar enfriar a
temperatura am%iente,aproximadamente
2min.
). (dicionar 250*l de (cetato de 7ota$io 5M fro, meclar por
iner$in $uae5-ece$.
8. ncu%ar en hielo durante 20 min.
10. Centrifugar a 12000 rpm en una centrifuga eppendorf durante
10 min.11. #ran$ferir el $o%renadante a un tu%o eppendorf nueo de
1.5 m.
12. (dicionar un olumen de i$opropanol fro aprox. 00*l/, 9
meclar porner$in
$uae )-10 ece$.1". ncu%ar a -20:4C durante "0 min <
centrifugar a 12000 rpm durante 10 min.
1'. liminar el $o%renadante < remoer el exce$o de i$opropanol
inirtiendo lo$tu%o$$o%re una toalla de papel.
15. 6e$u$pender el precipitado en 500 lde #50l0 50mM
#ri$-=C>l?MmD#(/,
incu%ar a 54C preferi%lemente durante 10 a 15 min con
agitacin$uae y con$tante.1. (dicionar un olumen de i$opropanol fro
500 *l) 9 meclar por iner$in$uae )-
10 ece$.
1. ncu%ar a -20:4C durante "0 min < centrifugar a 12000 rpm
durante 1?min.1). liminar el $o%renadante, y remoer el exce$o de
i$opropanol inirtiendo lo$tu%o$
$o%re una toalla de papel. Dejar lo$ tu%o$ $o%re la toalla
durante 10 min aprox. para
!ue el precipitado !uede %ien $eco.
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18. (dicionar 100-200 *I de #l?l 10mM #ri$-=C>1Mm D#(, !ue
contiene10
mg>ml 6@($a, dependiendo del tama3o del precipitado/. Auardar
lo$ tu%o$a 44C
toda la noche, o incu%ar a 65Cpara di$oler el precipitado.
20. #ran$ferir a tu%o$ eppendorf< correr 2 *lde mue$tra en un
gel de agaro$apara er lacalidad.
21. Auardar el (D@ a -20:C paraalmacenar a largo plao a '4C $i
$e a a almacenardurante 1 o 2 da$.
C(# -7rotocolo de Fa%oratorio '
Buffer de xtracccin 7ara 10 ml de $olucin/.
6eactio olumen
l??mM#r$-=Cl p= ,5 1 ml de M #ri$-=C
50mM D#( 1 ml de ?.5M D#(
500mM@aC 1 ml de 5M @aC
(gua deionniada ml
(utoclaar durante 15 min.
(dicionar 1%. (w/v) de 77/; di$oler.(dicionar l de
2p-Mercaptoetanol.
7recaucin l 2p-Mercaptoetanol e$ altamente txico, de%e u$ar$e
guante$ < ma$carilla
para manipularlo.
Nota:adicionar el PVP y el 2p-Mercaptoetanol ju$to ante$ de
utiliar el %uffer.
Los 10 ml de %uffer de extraccin preparado, alcana para tratar
xx mue$tra$.
