Extracellular nucleic acids from blood and their using for noninvasive diagnostics and

monitoring of cancer

PhD Tamkovich S.N.Grant Y4-B-08-13

REC-008 Novosibirsk State UniversityInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Intrainstitute Center of DNA Sequencing SB RAS

The objective of the research is the investigation of features of tumor-specific gene alterations circulation on the whole extracellular nucleic acids and search of new DNA-markers in blood cancer patients plasma and cell-surface-bound extracellular nucleic acids.

The characterization of circulating DNA from blood plasma of healthy donors and breast cancer patientsThe experiment

strategy:

The production and isolation of plasmid recombinant DNA

The hydrolysis of plasma DNA by EcoRI и Bsp143I

The ligation of plasma DNA into pBlueScript II KS(-) as vector:insert = 500 ng : 50 ng

The transformation of XL-Blue E. coli by electroporation

The selection of white colonies and screening by PCR

The sequencing and analysis of cloned DNA fragments by BLAST server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

The isolation of plasma DNA from blood

Chromosome localization of circulating DNA

Chromosomenumber

Chromosomenumber

Frequency

Frequency

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X

1 2

10% 1% 6% 5% 6% 14% 4% 9% 2% 4% 8% 5%

1% 1% 1% 2% 4% 4% 2% 4% 1% 2% 4%

Chromosomenumber

Chromosomenumber

Frequency

Frequency

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X

1 2

13% 0% 0% 0% 0% 50% 0% 0% 0% 25% 0% 0%

0% 0% 0% 0% 13% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

Healthy female

Breast cancer patients

Sequence analysis

33%

6%

39%

22%14%

37%

24%

14%

11% CpG islands

undentified sequences ofhuman genome

genes

pseudogenes

repetitive elements

Breast cancer patients

Identified sequences in blood of breast cancer patients:

• Repetitive elements - Alu, LTR, (CAG)n, L1, THE, MST, MIR

• Genes, associated with breast cancer - GSTA1, ANKRD6, ZNF217, DKFZp566C0424

Healthy female

RESULT: Sequence analysis revealed that the number of circulating DNA fragments does not

depend from the size of paternal chromosome both in normal and pathological state. Fragments from chromosome six were found in the healthy female bloodstream more frequently. BLAST analysis demonstrates that 10% of coding DNA fragments circulating in blood of the breast cancer patients is associated with development of this pathology. Moreover, in breast cancer patients blood frequency of genes, pseudogenes and CpG islands was below that in healthy female blood. The unidentified sequences of human genome and repetitive elements in health are presented loss frequently then in disease.

Participation at the conference and courses for young scientists:• 25/06/-02/07/2004 – Main FEBS Congress (Poland, Warsaw)

• 07/2005 – FEBS advanced course “Chemistry for Biology” (Greece, Island Spetses)

• 22/09/-30/09/2006 – FEBS advanced course «Microarray and genosensor techniques in biomedical applications» (Czech Republic, Prague)

• 05/03/2007-08/03/2007 - 11th CIMO winter school «Current challenges in health research: from molecules to epidemiology» (Finland, Tvärminne)

• 21/05-26/05/2007 - FEBS Advanced Lecture Course «Matrix Pathobiology, Signaling and Molecular Targets» (Greece, Patras)

• 05/05/2010 – 08/05/2010 – EMBO IMPAKT: Breast cancer Conference (Belgium, Brussels)

• 2002 – стипендия для талантливых студентов CRDF REC-008 • 2004 – стипендия губернатора Новосибирской области для талантливых

аспирантов высших учебных заведений• 2004 – стипендия Правительства Германии для молодых ученых DAAD• 2006-2008 - грант CRDF для молодых ученых• 2011 г – муниципальный грант г. Новосибирска по теме «Малоинвазивная

диагностика ранних стадий и рецидивов опухолей молочной железы»• Грант Президента РФ 2008-2009 гг

Project financing:

28 articles, 6 Russian patents, 1 European patent, citation = 203, h = 7 Main publications:

• Nucleotides, Nucleosides and Nucleic acids – 2004 – IF = 1.13• Annals New York Academy of Science – 2004, 2006, 2008 – IF =2.67• Clinical Chemistry – 2005 – IF = 6.26• British Journal Cancer - 2006 – IF = 4.35• Annals of Oncology – 2010 – IF = 3.2

2005 – лауреат конкурса «Лучшие аспиранты РАН»2008, 2009 - лауреат конкурса «Лучшие молодые ученые РАН» от Фонда содействия отечественной науке 2009 г - Премия администрации Новосибирской области молодым ученым – победителям конкурса, посвященного 85-летию академика РАМН Казначеева В.П.2010 г – Лауреат конкурса «Женщины в науке-2010» UNESCO,L’Oreal, РАН2010 г - Диплом II степени от администрации Новосибирской области молодым ученым за цикл работ «Циркулирующие нуклеиновые кислоты крови в диагностике онкологических заболеваний»Награждена почетным дипломом "Достояние Сибири" в номинации "наука и образование" за вклад в развитие сибирской науки (2007 г)Награждена дипломом I степени и премией за лучший устный доклад на конференции "Фундаментальные науки - медицине" (2007 г)Награждена дипломом III степени и ценным подарком за лучший устный доклад на конференции "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (2007 г)Награждена дипломом II степени и ценным подарком за лучший стендовый доклад на конференции CRDF (2007 г)."Лучший бизнес-план на практикуме по коммерциализации технологий", Владивосток, май 2010Зворыгинская премия в номинации «Инновационный проект 2010»Награждена почетной грамотой за вклад в развитие науки г. Новосибирска (2011 г)

Awards:

Зворыгинская премия в номинации «Инновационный проект 2010»

Natural sources of exNatural sources of exDDNANAInternal ExternalNecrosis and

Apoptosis of normal or tumor cell

Secretion by normal and (or) tumor

cell

DNA / RNAviruses

Bacteria

Pregnancy Food

Circulation

Targets

Quantitation

Specific sequencesMutatio

ns

Promoter methylati

on

LOH

Microsatellite

instability

mRNA Fetal DNA

Normal

Cancer

Viral NA

K-Ras

XY

XX (TA)5 (TA)2

hTERT

HIV RNA