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FACOLTArsquo DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI
Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia
EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD
IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI INVECCHIAMENTO E NEURODEGENERAZIONE
Anno Accademico 2013-2014
Candidata Maria Lo Giudice
matricola 1466710
CorrelatoreAnnamaria Confaloni
RelatoreGiancarlo Poiana
SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI tra i piugrave importanti enzimi antiossidanti presenti in tutte le cellule che metabolizzano lrsquoO2
3 isoforme
Cu Zn-SOD SOD citosolica- nucleo spazio mitocondriale intermembrana lisosomi perossisomi
Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale
Cu Zn-SOD SOD
extracellulare
rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali
Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie
StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)
Applicazioni
bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)
Promettenti potenzialitagrave
Sistema nervosohellip
INVECCHIAMENTO CEREBRALE
NEURODEGENERAZIONE
Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo
Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso
In quali condizioni del SN
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
In quali condizioni del SN
Mn-SOD
Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)
Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)
STRESS OSSIDATIVO
ECCESSO DI ROS
NEUROINFIAMMAZIONE
Mn-SOD
MORTE CELLULARE
MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)
MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)
MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
0
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
cellu
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risp
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
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5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
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07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI tra i piugrave importanti enzimi antiossidanti presenti in tutte le cellule che metabolizzano lrsquoO2
3 isoforme
Cu Zn-SOD SOD citosolica- nucleo spazio mitocondriale intermembrana lisosomi perossisomi
Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale
Cu Zn-SOD SOD
extracellulare
rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali
Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie
StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)
Applicazioni
bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)
Promettenti potenzialitagrave
Sistema nervosohellip
INVECCHIAMENTO CEREBRALE
NEURODEGENERAZIONE
Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo
Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso
In quali condizioni del SN
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
In quali condizioni del SN
Mn-SOD
Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)
Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)
STRESS OSSIDATIVO
ECCESSO DI ROS
NEUROINFIAMMAZIONE
Mn-SOD
MORTE CELLULARE
MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)
MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)
MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
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Men 50 μMCtrl Men 25 μM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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Mn
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali
Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie
StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)
Applicazioni
bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)
Promettenti potenzialitagrave
Sistema nervosohellip
INVECCHIAMENTO CEREBRALE
NEURODEGENERAZIONE
Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo
Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso
In quali condizioni del SN
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
In quali condizioni del SN
Mn-SOD
Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)
Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)
STRESS OSSIDATIVO
ECCESSO DI ROS
NEUROINFIAMMAZIONE
Mn-SOD
MORTE CELLULARE
MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)
MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)
MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
0
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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
0
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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α
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IL-12 p70IL-13IL-17
I-TACKC
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MIP-1αMIP-1γ
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sTNFR 1sTNFR 2
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con
trol
lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
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5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
INVECCHIAMENTO CEREBRALE
NEURODEGENERAZIONE
Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo
Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso
In quali condizioni del SN
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
In quali condizioni del SN
Mn-SOD
Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)
Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)
STRESS OSSIDATIVO
ECCESSO DI ROS
NEUROINFIAMMAZIONE
Mn-SOD
MORTE CELLULARE
MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)
MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)
MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
0
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
cellu
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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M- r
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
STRESS OSSIDATIVO
ECCESSO DI ROS
NEUROINFIAMMAZIONE
Mn-SOD
MORTE CELLULARE
MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)
MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)
MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
0
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Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
0
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
cellu
lare
risp
etto
al C
trl
MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
nSO
D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
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120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
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120
v
italit
agrave ce
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spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD
Modello in vivo di invecchiamento
Stress ossidativoNeuroinfiammazione
Morte cellulare
Scopo della ricerca
Modello in vitro di neurodegenerazione
Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
0
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
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Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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07
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
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Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Modello IN VIVO
18 topi C57BL maschi di
18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina
9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la
rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina
Al termine del trattamentohellip
Materali e metodi
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
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Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
0
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
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M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
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Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
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Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Analisi comportamentale Fear conditioning
Training tone + shock Baseline Pause
3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo
2rsquorsquo 2rsquorsquo
5 min
4 min
2rsquorsquo
90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo
30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo
Materali e metodi
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
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5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
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Mn
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali
MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione
Cx trattato Cx Ctrl
Materali e metodi
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
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Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Risultati modello in vivo
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
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Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
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Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
FEAR CONDITIONING
4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin
bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali
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Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
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Cor
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
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Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
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Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
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Risultati
Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14
(plt005)
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IL-12 p70IL-13IL-17
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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY
Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
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Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
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Risultati
Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)
Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=
006)
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
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Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
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Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
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Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
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Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare
- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h
Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa
Modello in vitro
Cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
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MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
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Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
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Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Modello in vitro
Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like
Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo
Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale
Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave
Materali e metodi
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
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Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
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Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
lare
risp
etto
al C
trl
Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
40
60
80
100
120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
40
60
80
100
120
v
italit
agrave ce
llula
re ri
spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD
Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate
Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento
IMMUNOCITOCHIMICA
Risultati
vita
litagrave
cellu
lare
risp
etto
al C
trl
MTT
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
nSO
D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
lare
risp
etto
al C
trl
Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
40
60
80
100
120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
40
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80
100
120
v
italit
agrave ce
llula
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spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a
Trattamento con menadione
Trattamento con glutammato
bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA
bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT
Materali e metodi
+rMnSOD 075 μM
1h
+menadione 25 o 50 μM
1h 20h
+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
nSO
D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
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etto
al C
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
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80
100
120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
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80
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agrave ce
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re ri
spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Risultati modello in vitro
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
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07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
nSO
D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
40
60
80
100
120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
40
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80
100
120
v
italit
agrave ce
llula
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spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M
Men 50 μMCtrl Men 25 μM
- rM
nSO
D
Trattamento con menadione DCDHF-DA
Risultati
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
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risp
etto
al C
trl
Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
40
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100
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
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07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
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80
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v
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o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl
Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl
Trattamento con menadione MTT Risultati
vita
litagrave
cellu
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risp
etto
al C
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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM
Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM
Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM
0
20
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100
120
La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
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07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
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agrave ce
llula
re ri
spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato
Trattamento con glutammato DCDHF-DA
Risultati
+ r
Mn
SOD
07
5 μ
M- r
Mn
SOD
Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
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italit
agrave ce
llula
re ri
spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl
Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl
Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl
Trattamento con glutammato MTT
Risultati
Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM
Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD
075μM
Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD
075μM
0
20
40
60
80
100
120
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italit
agrave ce
llula
re ri
spett
o al
Ctr
l
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
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Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo
Nessun effetto
sul profilo cognitivo degli animali trattati
Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII
Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX
Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente
attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo
La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
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DarwinProf Giancarlo Poiana
Grazie per lrsquoattenzione
NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha
Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro
Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE
Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato
Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello
Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato
PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
Dipartimento di Biologia
CellulareampNeuroscienze
Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
DarwinProf Giancarlo Poiana
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PROSPETTIVE FUTURE
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria
Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi
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Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles
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