FC500FC500FC500FC500 における FlowPRAFlowPRAFlowPRAFlowPRA プロトコルの自動感度設定

� 設定に必要な試薬・機器類

1.) プロトコルの⾃動感度設定には以下のベックマン・コールター社製の試薬が必要です。

製品番号 製品名 内容 定価 177018 QuickComp 2 キット CD45-FITC/CD45-PE 各 1 mL(50 テスト) 32,000 6607023 CYTO-COMP Cell キット 10 テスト×5 バイアル 38,000 6607007 Flow-Set 10 mL×3 バイアル 35,000 その他に PBS を使用します。 プロトコル感度設定確認・微調整のために以下の 2 検体サンプルが必要となります。 ・FlowPRA Screening のネガティブ血清を検体とした測定サンプル ・FlowPRA Screening の Class I ポジティブ血清を検体とした測定サンプル

2.) その他プロトコル感度設定に必要なサンプルの作成に以下もご⽤意ください。 ・ピペット類 (20, 100, 1000 µLの分取を⾏います) ・ボルテックスミキサー ・フローサイト測定用サンプルチューブ 3 本 ・上記 FlowPRA Screening サンプル調製のための必要な試薬等

� 設定に使用するサンプルの調製

1.) フローサイト測定用サンプルチューブ 3 本の識別が可能になるようにそれぞれのチューブに A, B, C とラベルします。

2.) Flow-Set のバイアルをよく転倒混和し、A のサンプルチューブに 15 滴入れます。

3.) CYTO-COMP Cell キットの⻘いキャップのバイアルの溶液 1 mL を、赤いキャップのバイアルに添加し、沈殿物がしっかり拡散するようによく撹拌します。

4.) 上記 3 で作成した懸濁液を B および C のサンプルチューブに 100 µL 添加します。

5.) Quickcomp 2 キットの CD45-FITC を B へ、CD45-PE を C のサンプルチューブに 20 µL を添加し、よく撹拌した後に暗所、室温にて 20 分間インキュベートします。

6.) B および C のサンプルチューブに PBS を 1 mL 添加し、よく撹拌します。

7.) A, B, C の順にカローセルのロケーション No1 から 3 にサンプルチューブをセットします。

� ADC用アプリケーションの作成

1.) Tool > Auto Setup Application Definition の順にクリックし、Auto Setup Application

Definition ウィンドウを開きます。

2.) Create a new application definition と All user(Common)にチェックを入れて、 Next をクリックします。 3.) Brows をクリックして FlowPRA Screening 測定用 の Protocol を選択(選択後 Openをクリック)し、Next をクリックします。 4.) フィルター設定を確認し、Next をクリックします。

5.) FSの取得角度を確認し、Next をクリックします。

6.) 使用する色素を確認し、Next をクリックします。

7.) FlowSet Pro の各ターゲット値を⼊⼒し、Next をクリックします。

Flow-Setターゲット値

FS 300 SS 270 FL1 200 FL2 440

8.) Application Name を FlowPRA Screening と⼊⼒して Next をクリックします。 (Setting プロトコル名は自動で設定されます）

9.) 再度 Next をクリックし、画面を次に送ります。

10.) Finish をクリックすると 各設定用プロトコルが自動作成されます。

� プロトコル感度設定・蛍光補正のオートセッティングのための準備

1.) 前項で作成したプロトコル「FlowPRA Screening_STAND.pro」をワークスペースに呼び出します。 上記プロトコルは Common(Acquisition)フォルダ内にあります。

2.) 各プロット図のリニアリージョンを選択し、右クリックした後に Reagion Propertiesを選択します。

ドラッグ＆ドロップ

3.) Region Properties の中の Lower limit および Upper limitに下記数値を⼊⼒し、OKをクリックします。FS, SS, FL1, FL2の全てのリージョンに⾏います。 4.) をクリックし、プロトコルを上書き保存します。

Lower limit―Upper limitの⼊⼒数値

FS 240-370 SS 210-330 FL1 125.0-275.0 FL2 280.0-600.0

� ADC を使⽤したプロトコル感度・蛍光補正のオートセッティング

1.) Tool -> Auto Setup Scheduler の順にクリックし、Auto Setup Scheduler ウィンドウを開きます。 2.) 前項で作成したアプリケーション「FlowPRA Screening-C」を選択し、サンプルチューブをセットしたカローセルの No.を⼊⼒し、カローセルをセットします。

3.) Schedule ボタンをクリックします。 4.) Carousel Load Report に示された内容とワークリストのカローセルポジションとサンプル調製の項で作成したサンプルチューブをセットしたロケーションが一致していることを確認します。必要であれば、Carousel Load Report を印刷します。 5.) Close ボタンをクリックして Carousel Load Report ウィンドウを閉じます。 6.) Start ボタンをクリックし、Flow-Set のチューブから順に測定を開始します。

7.) 各パラメータの感度設定が⾃動で⾏われます。 ＊感度が合いにくい場合があります。この場合は、マニュアル操作で機器による感度設定を補正してください。 8.) ターゲットリージョンにFlow-Setのピークが全て収まると次のチューブの測定に移ります。 ターゲットリージョンにピークが収まらずに測定が終了した場合は Return をクリックし、再度設定を⾏ってください。その場合は、マニュアル操作により機器の感度設定を補正してください。

目的アプリケーションを選択 使用するカローセルの No.を⼊⼒

9.) 蛍光補正の自動設定のための測定が続いて⾏われます。 この時に、FlowPRA のピーズ測定⽤の感度に FS および SS がなっていますので、細胞は FSの上限を振り切って測定されます。また、蛍光感度も⾼めの設定になっておりますので、陽性集団がリニアリージョンの右端よりはみ出る場合があります。 蛍光補正設定の際には下記を参考にして、細胞の集団を囲むようにゲートを手動で動かしてください。 PE の測定時にも同様に⾏ってください。

10.) すべてのチューブを測定し終わったら Finish ボタンをクリックした後、 Approve ボタンをクリックして、サイトセッティングを保存します。 ＊セッティングをやり直す必要がある場合は Reject All をクリックします。この場合は、サイトセッティングは保存されません。

11.) Common(Acquisition)フォルダ内の FlowPRA Screening settings プロトコルに本設定は保存されております。このプロトコル設定が測定プロトコルに反映されるように以下の⼿順で⾏います。 12.) FlowPRA Screeinig 測定用パネルを構成している測定プロトコルをワークスペースに呼び出します。 13.) Tool バーの Cytometer -> Get Cytosetting from protocol をクリックします。 14.) Look in を usersに変更し、admin -> acquisitionprotocol フォルダ内のプロトコル「FlowPRA Screening settings」を選択し、Open をクリックします。 15.) をクリックし、プロトコルを上書き保存します。

� サンプル測定による設定の確認

1.) パネルおよびプロトコルを使用してネガティブ血清を検体としたサンプルを測定し、各パラメータの感度設定および FL2→FL1 への蛍光補正を確認します。 ＊下記のポイントをチェックしてください。

I. FS/SS のプロット図においてビーズの集団がわかりやすく中央付近で検出される。 II. Class I のビーズの FL1(FITC)におけるピークの頂点が 100 より低く検出される。 III. FS/FL2 のプロット図で 3種類のビーズ集団が明確に識別できる。 IV. FL1/FL2 のプロット図で Class I と II のビーズ集団の中心が直線上に存在する

IIII

IIIIIIII

IIIIIIIIIIII IIIIVVVV

2.) ポジティブ⾎清を検体としたサンプルを測定し、感度設定および FL1→FL2 への蛍光補正を確認します。 ＊下記のポイントをチェックしてください。

V. FL1/FL2 のプロット図において陽性 Class I のビーズの集団の中心が X 軸に沿った形で直線上に検出される。

VVVV