FEBRE MACULOSA BRASILEIRA:

DIAGNOSTICO HISTOPATOLÓGICO E

IMUNOHISTOQUIMICO NA REGIÃO METROPOLITANA

DE SÃO PAULO

Dra Silvia D’Andretta Iglezias

Nucleo de Anatomia Patológica

Instituto Adolfo Lutz

Febre Maculosa Brasileira (FMB)

• A FMB é causada pela Rickettsia ricketsii,

cocobacilo intracelular Gram negativo, que

infecta células endoteliais causando graves

manifestações sistêmicas em humanos.

• É considerada uma das mais virulentas

infecções humanas e apresenta alta

letalidade em São Paulo.

Núcleo de Patologia do IAL

• Amostras de tecido de autópsia ou biópsia;

• Estado de São Paulo (também GO, DF, ES e MS)

• FMB corresponde a 5% do total dos óbitos recebidos;

• 2016 (até agosto): 390 óbitos, 9 casos provenientes do estado de São Paulo , sendo 3 da RMSP

Associação entre diagnóstico histopatológico e imunohistoquímico.

Nucleo de Patologia - IAL

Nucleo de Patologia - IAL

Febre Maculosa Brasileira (NAP – IAL)

PeríodoDRS I

Gde.S.Paulo

DRS VI

Baurú

DRS VII

Campinas

DRS IX

Marília

DRS X

Piracicaba

DRS XI

Pres.Prudente

DRS XIII

Rib.Preto

DRS XVI

SorocabaTotal/ano

2001 1 0 2 0 0 0 0 0 3

2002 1 0 1 0 0 0 0 0 2

2003 1 0 2 0 0 0 0 0 3

2004 6 0 5 0 0 0 0 0 11

2005 5 0 0 0 1 0 0 0 6

2006 3 0 5 0 0 0 0 0 8

2007 1 0 1 0 0 0 0 0 2

2008 4 0 2 2 0 0 0 0 8

2009 3 0 7 0 0 0 0 0 10

2010 4 0 5 1 0 0 0 0 10

2011 0 0 3 0 0 0 0 0 3

2012 6 1 4 0 0 0 0 0 11

2013 3 0 6 0 0 1 0 0 10

2014 3 0 7 1 1 0 0 1 13

2015 3 0 12 2 1 0 1 0 19

2016* 3 0 4 0 2 0 0 0 9

Total/DRS 47 1 66 6 5 1 1 1 128

(*) até junho/2016

128 casos FMB (15 anos, NAP – IAL)

FMB – sequência patogenética:

• Picada do carrapato (saliva)→ inoculação da bactéria na pele→ escara de inoculação → vasos linfáticos→ linfonodos→ corrente sanguínea para todos órgãos

• Células alvo: endotélio de pequenos vasos sanguíneos

• Infecção endotelial disseminada de todos órgãos sendo cérebro, fígado e pulmões os órgãos vitais mais afetados

Células endoteliais infectadas

1, 2- Attachment of rickettsia via adhesins (OmpA, OmpB) to host cell receptors (Ku70) – ubiquitin

ligase

3 - rearrangement and engulfment

4 - rickettsia in cytoplasmic endosome

5 - rickettsial enzymes (phospholipase) lyse vacuolar membrane allowing rickettsial escape into the

cytosol

6 - replication by binary fission

7 - rickettsial RickA activation of Arp2/3 leads to host actin-based mobility and extracellular release

8 - cell-to-cell spread, or invagination into the endothelial cell nucleus (N) .

llustrated by Aaron Medina-Sanchez

D. Walker 2007

rosa = cel endotelial

marron = nucleo

verde = bacteriaadesinas

Fisiopatologia FMB

• células endoteliais infectadas

• Vasculite aguda / disfunção vascular

• Aumento da permeabilidade vascular

cérebro: ↓função

• Edema extracelular pulmões: hipoxemia

fígado: ↑ transaminases

rim: insuficiência renal

Aumento da permeabilidade vascular

• Ruptura de junções “adherens” entre células endoteliais

infectadas → “gaps” → aumento de permeabilidade

microvascular → passagem de plasma para interstício →

edema tecidual

O edema pulmonar e cerebral são as principais causas de

alta morbidade e mortalidade nas infecções por rickettsia

Vasculite típica e edema perivascular no tecido

cerebral de paciente com FMB fatal (H&E)

Núcleo de Patologia do IAL

• óbitos de causa infecciosa à esclarecer de interesse em Saúde Pública: SFIHA, SRAG, meningoencefalites, miocardites, etc

• Serviços de verificação de óbito (Svos e FMs)

• Conceito órgão-alvo do agente infeccioso é fundamental na seleção de amostras

• Amostras de 7 órgãos vitais: cérebro, coração, pulmão, fígado, baço e rim, eventualmente pele, supra renal e músculo esquelético.

Amostra tecidual

• Frasco boca larga

• Fragmentos 2 x 2cm

• Formalina tamponada qsp

• Temperatura ambiente

• Identificação correta

INADEQUADO

Fixação inadequada da amostra tecidual

Quantidade

insuficiente de

formol: a fixação

não ocorreu na

totalidade da

amostra.

Quantidade insuficiente

de formol: a fixação não

ocorreu na totalidade da

amostra.

INADEQUADO

Fixação da amostra tecidual

• Formol p.a. = solução de formaldeído a ~ 40% = Formalina 100%

• Solução fixadora: Formalina neutra tamponada

Formaldeído p.a. .................................100 mL

Fosfato monobásico de sódio ............. 4,0 g

Fosfato dibásico de sódio ................... 6,5 g

Água destilada q.s.p. ........................1000 mL

• Mecanismo de fixação: Formação de pontes de metileno

• Tempo recomendável para procedimento de fixação: 18 – 24 h.

• Tecidos mal e/ou excessivamente fixados = problemas para

utilização em reações IHQ e de biologia molecular técnicos

Processamento histológico

SVO

Tempo: 24h

histotécnicobloco

micrótomo

lâmina em branco

cassete

Coloração

Ex histológico e IHQ

+ informações clínicas

LAUDO FINAL

H&E

IHQ

lâmina em branco

O que é imuno-histoquímica?

• É a localização em corte histológico de um antígeno

conhecido por meio de anticorpos diretamente

direcionados a esse antígeno.

• O complexo Ag-Ac é visualizado usando-se um marcador:

Reação imuno-histoquímica (IHQ)

IHQ:

• Reação antígeno-anticorpo diretamente em corte histológico, avanços a partir da década de 80.

• 1990’s: polímero de Dextranconjugado com enzimas e anticorpos (camundongo, coelho) Envision TM

• Sabattini et al, J.Clin Pathol 1998;

51:506-511.

Envision TM

Antígeno

Enzima

Polímero

Ac 2º

Ac 1º

lâmina

IHQ- protocolo básico:

• Microtomia – uso de lâminas silanisadas/carga/adesivo

• Desparafinização e reidratação dos cortes histológicos

• Recuperação de antígenos (fonte de calor)

• Reação imuno-histoquímica propriamente dita (Ag-Ac)

• Substratos e cromógenos (DAB, FA, True Blue etc)

• Desidratação dos cortes e montagem em meio de

montagem permanente para exame microscópico.

• Tempo médio: 30 a 36 horas

Reação imuno-histoquímica

Limitações:

• disponibilidade do anticorpo

• preservação de epitopos com fixação adequada

IHQ no diagnóstico de doenças infecciosas

1. Resultados rápidos

2. Menor risco de exposição de agentes infecciosos altamente patogênicos já que utiliza amostra fixada e emblocada em parafina

3. Alta sensibilidade

4. Possibilidade de diagnóstico retrospectivo

5. Permite identificação de agentes infecciosos específicos pela utilização de anticorpos monoclonais e alguns policlonais

Utilizamos sempre painel de pesquisa de anticorpos relacionados à sindrome clínica

IHQ no dg de doenças infecciosas - Dificuldades:

1. Qualidade técnica adequada

2. Obtenção de caso controle positivo adequado

3. Anticorpos policlonais (↑sensibilidade) x

monoclonais (↑especificidade)

4. Anticorpos “in house” x comerciais

5. Reação cruzada: especialmente entre as várias

espécies de fungos entre si e algumas

bactérias entre si

Laudo de IHQ em doenças infecciosas

• POSITIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...

• NEGATIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...

• INCONCLUSIVA a pesquisa IHQ de antígenos de ...

(refere-se a problemas da reação)

• INADEQUADA a pesquisa IHQ de antígenos de ...

(refere-se a problemas da amostra)

É obrigatório que o aspecto histológico seja

concordante com resultados obtidos pela IHQ!

IHQ na Febre Maculosa Brasileira

• IHQ tem sido usada com sucesso para detectar

antígenos do grupo Rickettsiae em cortes

histológicos: imunomarcação positiva em endotélio

vascular de qualquer órgão!

• Alta especificidade e sensibilidade tanto em

amostras de autópsia como de biópsia (bi de pele)

• Anticorpo policlonal fornecido pelo CDC/USA (grupo

Rickettsiae: R. rickettsii, R. parkeri; R. conorii)

Demonstração imuno-histológica de antígenos do grupo Rickettsiae no

endotélio vascular no fígado em caso fatal de FMB

Lesão de pele - FMB

• Infiltrado perivascular

• Edema e necrose de

células endoteliais

• Extravazamento de

hemácias

• Edema tecidual

• Vasculite leucocitoclásica

• Trombos de fibrina focais.

• Escara de inoculação (H&E)

Lesão de pele - FMB

• Rash cutâneo

Lesão de pele - FMB

Biópsia de pele

A IHQ é útil no

diagnóstico de FMB,

especialmente quando a

biópsia é realizada na fase

aguda do rash cutâneo.

IHQ

Sistema nervoso central - FMB

↓função neurológica

• Inflamação angiocêntrica

(linfócitos e macrófagos)

• Vasculite

• Trombose , microinfartos

e hemorragia perivascular

• Edema extracelular

H&E

Sistema nervoso central - FMB

H&E IHQ

Meninges - FMB

H&E IHQ

Coração - FMB

H&E - Miocardite IHQ

Pulmões - FMB

Insuficiência respiratória

hipoxemia

• Lesão microvascular de

septos alveolares

• Edema intersticial

• Edema intralveolar

• Congestão

H&E

Pulmões - FMB

H&E IHQ

Fígado - FMB

icterícia

↑ transaminase

• Inflamação portal

• Vasculite portal

• Trombos vasculares portais

• Hemorragia do trato portal

• Leucocitose sinusoidal

Necrose focal de hepatócitos, porém sem falência

hepática!!

H&E

Fígado - FMB

• H&E: espaço porta • veia centrolobular

Fígado - FMB

Imunomarcação positiva em vasos portais

Baço - FMB

H&E: esplenite inespecífica IHQ

Rim - FMB

↓ função renal

• Nefrite intersticial

• Edema

• Necrose de células

tubulares

• Vasculite leucocitoclásica

H&E - vasculitis

Rim - FMB

H&E IHQ

Músculo esquelético

H&E - miosite IHQ

Outros órgãos:

miométrio

Pâncreas

Aspectos histológicos marcantes na FMB:

• Típicamente lesões multifocais em vários órgãos,

caracterizada por vasculite leucocitoclásica em

pequenos vasos.

• Apesar do estado de propensão à coagulação, a

CIVD é rara, mesmo em casos graves!

• Também são raras as hemorragias e os trombos

vaso-oclusivos causando infartos!

Diagnóstico diferencial anátomo-patológico da FMB

• Leptospirose

• Dengue

• Febre amarela

• Malária

• Sepsis

• Meningococcemia

Síndrome febril íctero-hemorrágica

(SFIHA)

Sintomas clínicos iniciais são semelhantes à FMB!

Leptospirose - fígado

• H&E • IHQ

Dengue - fígadoH&E IHQ

Febre amarela - fígadoH&E IHQ

Malária - fígado

Meningococcemia

• Dg diferencial com FMB

especialmente em

crianças e jovens

• Amostras de SNC e de

supra-renal, sempre que

possível!

SNC -Imunomarcação positiva

para N. meningitidis

OBRIGADA !

Dra Silvia D’Andretta Iglezias

Nucleo de Anatomia Patológica -IALimunohistoquimicaial@yahoo.com

Cinthya dos S Cirqueira,

Maria Cristina Kanamura,

Natalia Fernandes,

Rodrigo Ressio