야생동물에 의한 구제역 바이러스 환경 중 거동조사 - mewebbook.me.go.kr/DLi-File/NIER/06/013/5511398.pdf · 2015-11-03 · 11-1480523-000956-10 야생동물에

발 간 등록 번 호 NIER RP2011-1402

11-1480523-000956-10

야생동물에 의한 구제역 바이러스

환경 중 거동조사

환경건강연구부 바이오안전연구팀

김정현, 김종민, 신정화, 김설희, 이수길, 우찬진

광주지방기상청 흑산도기상대

박준천

Study on the role of Foot-and-Mouth Disease virus

from wildlife in the environment

Jung Hyun Kim, Jong Min Kim, Jeong Hwa Shin,

Seol Hee Kim, Su Kil Lee, Chan Jin Woo

Biosafety Research Team

Environmental Health Research Department

National Institute of Environmental Research

June Chune Park

Heuksando Weather Station

Gwangju Regional Meteorological Administration

2011

목 차❚

i

목 차

목차 ······························································································································ⅰ표목차 ··························································································································ⅱ그림목차 ······················································································································ⅲAbstract ·······················································································································ⅳ

Ⅰ. 서 론 ····················································································································· 1

Ⅱ. 연구개요 ··············································································································· 3

Ⅲ. 연구내용 및 방법 ·································································································5

1. 연구 내용 및 방법 ·····························································································5

가. 시료의 확보 및 채집 ·····················································································5

(1) 야생동물 사체 수집 및 부검 ····································································5

(2) 환경 시료 채집 ····························································································5

나. 시료의 분석 ·····································································································6

(1) 사체조직을 이용한 바이러스 검사 ··························································6

(2) 환경시료에서의 바이러스 검사 ································································7

(3) 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 조건 ················································7

다. 무인카메라를 이용한 야생동물 접근 분석 ···············································8

Ⅳ. 연구결과 및 고찰 ·······························································································10

1. 시료의 채취 ·······································································································10

2. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 선행실험 ·············································12

3. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 통한 구제역 바이러스 분석 ······· 13

가. 고라니 조직 시료를 이용한 구제역 바이러스 분석 결과 ···················13

나. 환경 시료를 이용한 구제역 바이러스 분석 결과 ·································16

4. 무인카메라를 이용한 야생동물 접근 분석 ·················································21

Ⅴ. 결 론 ···················································································································24

참고문헌 ······················································································································25

목 차❚

ii

표 목 차

<표 1> 무인카메라 설치 지역과 설치 개수 ··························································9

<표 2> 고라니 시료 내역 ························································································10

<표 3> 고라니 조직에 대한 실시간 역전사 중합효소 반응 결과 ··················14

<표 4> 환경 시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 결과 ························19

<표 5> 흑산도 기상청 황사필터에서 배양된 미생물 ········································19

<표 6> 흑산도 기상청 황사필터시료의 PM10 (㎍/m3) ·····································20

<표 7> 무인카메라 촬영 결과 ················································································22

목 차❚

iii

그 림 목 차

<그림 1> 구제역 바이러스의 구조 ··········································································4

<그림 2> PM10 glass fiber 황사필터 ······································································6

<그림 3> 매몰지 주변에 설치한 무인카메라 모습 ··············································8

<그림 4> 액세스퀵 onestep RT PCR 시약을 이용한 실시간 역전사 중합효소

연쇄반응 선행실험 ·················································································12

<그림 5> 고라니 조직시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 결과 ········16

<그림 6> 환경 시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 ······························17

<그림 7> 침출수가 유출된 매몰지 ········································································21

<그림 8> 동물별 촬영 빈도 ····················································································23

<그림 9> 무인카메라에 촬영된 야생동물 모습 ··················································23

Abstract❚

iv

Abstract

A number of foot-and-mouth disease (FMD) outbreaks

occurred from November 2010 to Spring of 2011 in Korea.

To understand and prevent the potential role of wildlife in the

spread of FMD, monitoring studies on FMD viruses have been

conducted using carcasses of wild animals and environmental

samples such as soil, water, and dust filter. The results of

the first year, from March 2011 to December 2011, are

summarized as follows:

1. A total of 936 including 477 tissue samples of Hydropotes

inermis and 459 environmental samples were collected for

FMD virus analysis.

2. Construct a real-time PCR system for FMD virus

diagnosis .

3. No FMD viruses were detected in any tissue and

environmental samples.

4. In 92 out of 19,993 photographs of wildlife captured by

motion-sensing cameras, cats, wild birds and H. inermis were

identified.

5. The place where FMD infected animals were buried is

accessible by wild animals.

Ⅰ. 서 론❚

1

Ⅰ. 서 론

구제역 (Foot-and-Mouth Disease, FMD)은 우제류 (Artiodactylae)에 감염

되는 고전염군의 급성 전신성 질병으로, 주로 소, 돼지, 양, 염소 등의 가축 및

70여종 이상의 야생 우제류에 감염한다.

구제역 진단은 임상증상을 바탕으로 한 임상진단, 구제역 바이러스 검출법

및 구제역 바이러스에 대한 항체 검출법이 사용되고 있다. 임상진단은 임상증

상을 바탕으로 실시하나, 확진을 위해서는 실험실에서 구제역 바이러스 또는

구제역 바이러스에 대한 항체 검사를 실시하여야 한다.

전통적인 기술로는 보체결합시험 (complement fixation test, CFT), 혈청중

화시험 (serum neutralization test, SNT) 그리고 효소-연결 면역측정법

(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 등이 구제역바이러스를 검출하

는데 사용되고 있다. FAO/WRL에서는 ELISA를 구제역바이러스 항원의 검출

과 항원형 결정에 사용한다. 결과는 3~4시간 이내에 나오며, 음성 샘플은 민감

한 배양액에 샘플을 접종함으로써 확인한다. 그러나 1차 배양을 통한 바이러스

분리는 어렵고, 비용이 많이 들며 수일 내지 수주의 시간이 소모되기 때문에,

이제는 분자생물학적 기술이 진단 방법에 도입되고 있다.

바이러스 유전체를 검출하는 방범으로는 역전사 중합효소 연쇄반응법

(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)이 있는데, 그의 민

감도와 특수도 때문에 ELISA와 바이러스 분리와 함께 병행되고 있다. 또 다른

형태의 PCR은 다중 PCR (Multiplex PCR)로써 다른 수포성 질병인 수포성 구

내염, 돼지수포병 등과 구분하고 구제역바이러스의 항원형의 구분을 위해 개발

되었다. 최근에는 형광을 발현하는 물질을 탐침으로 이용한 PCR 기법이 개발

되었는데, 이는 실시간으로 정확한 핵산의 양을 결정할 수 있다. 실시간 역전사

중합효소 연쇄반응 (real time RT-PCR)은 기존의 RT-PCR보다 상대적으로 빠른

시간에 결과를 얻을 수 있고 바이러스의 양을 측정할 수 있으며 더 많은 샘플

을 한 번의 측정으로 분석할 수가 있다 (Longjam et al., 2011).

Ⅰ. 서 론❚

2

이번 사업은 야생동물이 구제역 바이러스에 감염될 수 있는 가능성에 대해

알아보기 위한 것이 목적으로 그를 위해 다음과 같은 세 가지 연구를 수행하였

다. 1) 동작감지 무인카메라를 설치해서 야생동물이 가축과 접촉할 수 있는 기

회가 있는지, 혹은 구제역 매몰지에 접근하는지 등을 살펴보았고 2) 구제역이

전국적으로 확산되던 2010년~2011년에 폐사한 야생동물의 사체를 대상으로 실

시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 구제역 바이러스가 야생동물에 존

재하는 지 여부를 판단하였다. 마지막으로 3) 토양이나 물 등 환경 중에 바이러

스가 존재할 수 있을 가능성을 염두에 두고 2011년 3월부터 12월까지 수집한

환경시료를 대상으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행, 결과를 기술하

였다.

Ⅱ. 연구개요❚

3

Ⅱ. 연구개요

구제역 바이러스는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)의 아프타바이러스속

(Aphthovirus)에 속하며 ~8 kb 정도의 유전체를 갖는 positive sense RNA 바

이러스이다 <그림 1>. 프랑스의 Oise에서 발견된 type O를 시작으로, 지금까지

7개의 혈청형 (O, A, C, Asia1, South-African Territories (SAT) -1, -2, -3)과 80

여종의 혈청아형이 밝혀져 있다 (Alexandersen et al., 2003).

구제역의 발병율과 치사율은 숙주의 종과 감염된 바이러스 종류에 따라 다

르게 나타난다. 소와 돼지는 감염된 지 24~48 시간 이내에 열과 바이러스 혈증

이 나타나며 다른 기관과 조직으로 바이러스가 전파되어 이차 수포가 입과 발

에 형성되지만, 양과 염소는 상대적으로 증상이 미미하게 나타나 질병을 찾는

데 어려움을 겪을 수 있다. 또, 송아지는 심각한 심근염이 생기지만, 새끼 돼지

는 위장염이 나타난다. 구제역 증상은 숙주의 나이에 따라서도 달리 나타나는

데, 다 자란 동물의 치사율은 2% 정도로 어린 동물의 20%에 비해 낮은 편이다.

보통 구제역의 치사율은 5% 미만이지만 가축의 생산성과 무역 관계에 큰 손

실을 가져오기 때문에 중요한 가축 질병으로 분류된다. 이가 두려운 바이러스

질병으로 여겨지는 이유는 바로 높은 전염성, 넓은 지역 분포, 광범위한 숙주

범위, 보균 가능성, 약한 교차면역을 일으키는 항원 다양성, 상대적으로 짧은

면역 기간 등을 들 수 있다.구제역은 감염된 동물의 타액, 분뇨 등 분비물에 의한 접촉 감염, 오염된 사

료, 물, 건초 등에 의한 경구감염, 바이러스를 포함한 공기에 의한 공기 감염,

야생조류, 쥐, 사람 등에 의한 기계적 전파, 그리고 감염된 축산물 등의 이동

다양한 방법을 통해 전파될 수 있다 (USDA, 1994; Wijnker et al., 2007; Ryan

et al., 2008). 구제역 바이러스는 온대나 아열대 지역에서 비말(핵) 형태로 오랫

동안 생존할 수 있지만 덥고 건조한 기후에서는 생존 기간이 짧다 (Gloster et

al., 2010). 이는 바이러스가 온도, 습도, pH 등 주변 환경 요인에 민감하게 반응

하기 때문인데 특히 pH 감수성이 매우 높아 pH가 6.5 이하이거나 11이상일 때

Ⅱ. 연구개요❚

4

<그림 1> 구제역 바이러스의 구조

구제역바이러스 유전체는 3΄ 말단이 폴리아데닐화 되어있고 5΄ 말단은 VPg라는 공유결합

으로 연결된 작은 단백질이 있다. 5΄ 비번역지역 (UTR)은 700 base 이상의 큰 파편

(L-fragment)뒤에 이어지는 폴리 C 지역인 짧은 파편 (S-fragment)을 포함하고 있다. 기능

적으로 유전체는 (1) 5΄ 비암호화 조절 지역, (2) 다단백질 암호화 지역 (L, P1, P2, P3),

(3) 3' 비암호화 조절지역의 세 부위로 나눌 수 있다. 바이러스 유전체는 하나의 다단백질

로 번역되며, amino terminal L protease, P1-2A, 2BC, P3의 일차 분할 산물 4개가 만들어

진다. 이후 바이러스 프로테아제에 의해 4개의 구조 단백질 (VP1, VP2, VP3, VP4)과 8개

의 비구조 단백질 (L, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D)로 잘리게 되는데, 각 프로테아제가 작

용하는 부분은 그림에 제시되어 있다. 그 중 P1 지역은 1D, 1B, 1C, 1A 지역으로 구성되

며 각 각 4개의 구조 단백질인 VP1, VP2, VP3, VP4 을 암호화 한다. 각 구조 단백질

(VP1-4)의 60개 복사본은 조립되어 캡시드를 구성한다 (Mason et al., 2003). 실시간 역전

사 중합효소 연쇄반응에 사용한 프라이머/탐침 세트는 5΄ 비번역지역 쪽의 S 파편부터

IRES 앞에 이르는 127 bp를 증폭, 진단한다.

빠르게 감염력이 저하되며 (Bachrach et al., 1957; Pharo et al., 2002), 상대습도

가 50% 이하일 때, 50℃ 이상 온도에서 급격히 불활성화 되는 특징을 갖는다.

일반적으로 냉장 또는 냉동 상태에서는 감염력이 유지되며 (Alexandersen et

al., 2003) 그 외의 상황에서도 주변 환경 요인에 따라 짧게는 6~8일에서 길게는

210일~352일까지 감염력을 유지할 수 있다 (Chou et al., 2004).

Ⅲ. 연구내용 및 방법❚

5

Ⅲ. 연구내용 및 방법

1. 연구 내용 및 방법

가. 시료의 확보 및 채집(1) 야생동물 사체 수집 및 부검

야생동물 구조센터 (울산, 충남)에서 2010년 5월~2011년 11월의 기간

동안 폐사한 고라니 사체를 인수했다 <표 2>. 사체는 모두 -20℃에서

냉동보존된 것으로, 부검술식에 따라 기관, 인후두, 혀, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 생식기, 위 등의 조직을 적출하였다 <표 3>. 떼어낸 조직은

-70℃에 보관했다. (2) 환경시료 채집

2011년 3월~6월경까지 구제역 매몰지 주변의 토양, 물, 퇴비 등의 환

경 시료와 야생동물의 분변, 그리고 야생동물과 접촉 가능성이 있는 식

물 등을 포함 276개의 시료를 채집하였다 <표 4>.

환경시료 채집 시 방역복, 방역장화, 방역마스크 등을 착용하였으며

토양과 물의 경우 매몰지와 매몰지 주변 고인물, 하천수, 토양을 50 ml

튜브에 30 ml이상 담았고 식물시료는 구제역 발생 농장 인근 농경지의

콩과 옥수수 중 야생동물의 섭식에 의해 잘린 부분을 채집하여 15 ml

튜브에 담았다.

분변시료는 분변의 모양에 따라 구별하여 서로 교차오염이 되지 않도록

1회용 라텍스글러브, 기관, 비닐, 나무젓가락 등을 사용하여 각 개체별로

분변 1개당 1개의 15 ml 튜브에 담아서 채취하였다. 흑산도 기상대(전남 신안군 흑산면 예리 산72-2)에서 2011년 5월 25일(±1일)부터 12월 5일까지 사용한 황사 필터 179개를 이관 받았다

(그림 2). 이는 FH62C14 샘플러로 (Andersen Instruments) 포집된 시

료로 40mm glass fiber (Thermo) 필터를 사용하였고, 두루마리 형태의


6

여과지로 필터지 하나당 사용된 기간은 평상시에는 24시간, 황사 시에는

1시간이다. 각 날짜에 대한 PM10 값은 표 6에 제시되어 있다. 환경과학원 대기환경연구과 에어로졸연구실에서 황사 필터 4개를 이관

했다. 이는 PM2.5 자동 샘플러 (PMS-103, APM eng)로 포집된 시료로, 분립장치로는 impactor 타입을 사용해 24시간 동안 채취한 것이다. 47mm Quartz (pall, pallflex membrane / Tissuequartz 2500qat-up) 필터를 사용하였고, 포집 전 전처리 과정으로 850℃에서 4시간 동안 헬

륨 가스로 퍼지 (purge) 강열하여 잔존 유기 성분을 제거하였다.

<그림 2> PM10 glass fiber 황사필터 두루마리 타입으로 전체 사용 기간은 12~15개

월이며, 필터는 평상시엔 1일, 황사 기간에는 1시간에 1개씩 소모된다. 유전자

분석에는 위 필터의 1/2을 사용했다.

나. 시료의 분석(1) 사체조직을 이용한 바이러스 검사

부검술식에 따라 떼어낸 조직을 Precellys bead tube (2.8 mm, 5 ea/tube)에 100 mg~200 mg 무게로 잘라 담고, 시료의 10배 부피가

되도록 pH 7.4의 인산완충식염수 (phosphate buffered saline; PBS, Gibco BRL) 용액을 더했다. Precellys 24 kit MK28을 이용해 6.0 m/s, 40초 조건에서 두 차례 조직을 분쇄했다. 분쇄한 조직은 6000 g에서 10분간 원심분리한 뒤, 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮겨 담

았다. 얻은 용액을 대상으로 QIAampⓇViral RNA Mini Kit (Qiagen)을 이용, 제공자의 지침에 따라 실험을 수행했다.


7

(2) 환경 시료에서의 바이러스 검사

볏짚이나 식물 등의 환경 시료는 시료의 10배 부피가 되도록 탈리

용액 (3% beef extract, Difco)을 더한 뒤 1시간 동안 교반했다. 10000 g에서 15분간 원심분리 해 상층액을 수거하고 이를 나노세람

필터 (nanoceram filter, Argonide)에 2회 통과시켰다. 여과 후 탈착

용액 (1% beef extract)을 필터에 넣고 5분 동안 반응시킨 후 역방향

으로 여과한 뒤 같은 과정을 되풀이했다. 여과액은 QIAampⓇViral RNA Mini Kit (Qiagen)을 이용해 제공자의 지침에 따라 실험했고, 남은 시료는 -20℃에 보관했다. 물과 같은 액체 시료는 여과 과정부터

동일한 방법으로 실험했고, 토양 시료는 Fast RNA Pro Soil Direct/Indirect Kit (MPbio)을 이용해 제공자의 지침에 따라 실험을

수행했다. 분변 시료는 15ml 튜브에 약 100 mg의 시료를 담고 시료의 10배 부

피가 되도록 PBS를 추가한 뒤 진탕시켜 분변이 잘 풀리도록 했다. 시료를 3600 rpm에서 10분간 원심분리해서 상층액을 1.5 ml 튜브에 옮

겨 담고 QIAampⓇViral RNA Mini Kit (Qiagen)의 지침에 따라 실험

을 수행했다. 황사필터는 100mg 정도 무게로 시료를 잘라 1.5 ml 튜브에 넣고

900 ㎕ PBS (pH 7.4, Gibco BRL) 용액을 더한 뒤 1시간 동안 교반했

다. 3000g에서 10초간 원심분리한 뒤 교반액의 140 ㎕는 QIAampⓇViral RNA Mini Kit (Qiagen)의 지침에 따라 바이러스 분리에 사용했

고, 남은 교반액은 황사필터의 미생물 동정을 위한 배양 과정에 사용

했다. (3) 실시간역전사중합효소연쇄반응 (real time RT-PCR) 조건

분리한 유전체에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기

위해 5΄ 비번역지역을 주형으로 진단할 수 있는 SA-IR-219-246F (5΄-CAC YTY AAG RTG ACA YTG RTA CTG GTA C-3΄)와SA-IR-315-293R (5΄-CAG ATY CCR AGT GWC ICI TGT TA-3


8

΄), 한 쌍의 OIE 추천 프라이머와 탐침인 SAmulti2-P-IR-292-269R (5΄-CCT CGG GGT ACC TGA AGG GCA TCC-3΄), 액세스퀵 one step RT-PCR (Promega) 시약, 그리고 FMDV advanced 키트(Genesig, Primer Design)를 사용했다. 유전자 증폭 및 바이러스 판별/진단에는 ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)을 사용했으며 45℃에서 30분간 역전사, 95℃에서 5분간

변성 과정 후 95℃에서 15초, 60℃에서 60초간 40회의 데이터 수집 과

정을 반복했다.

다. 무인카메라를 이용한 야생동물 접근 분석2010년 구제역이 시작되었던 경북 안동을 비롯하여 영주, 봉화, 원주, 진천

등 9개 지역의 구제역 매몰지에 주야간 감시가 가능하고 동작감시센서를 내

장한 무인카메라를 설치하여 야생동물의 접근성을 관찰하였다.

<그림 3> 매몰지 주변에 설치한 무인카메라 모습

무인카메라 설치 장소는 구제역 매몰지와 매몰지 주변의 농경지로 하였고 한지

역당 3~6대의 무인카메라를 설치하였다 <표 1>.


9

<표 1> 무인카메라 설치 지역과 설치개수

시도 시군 읍면동 리 지번 설치개수

경북 봉화 봉화 적덕 산121-6 3

경북 영주 이산 용상 1134-1 3

강원 원주 흥업 사제 산79 3

충북 제천 금성 중전 250 3

충북 증평 증평 안자산길 51-51 2

충북 청원 오창 후기 산103-1 2

충북 진천 이월 사곡 887-2 3

충북 진천 이월 사곡 1174-12 3

Ⅳ. 연구결과 및 고찰❚

10

Ⅳ. 연구결과 및 고찰

1. 시료의 채취

연구기간 중 울산, 충남의 야생구조관리센터에서 시료 이관을 통해 총 47

마리의 고라니 사체 시료를 수집하고 부검을 통해 477 점의 조직 시료를 얻

었다 <표 3>. 또 환경 중 바이러스 거동 예찰을 위해 경기 화성, 안산 및 충

북 제천 지역에서 분변 106개를 채취했으며 경북 봉화, 안동 지역 등에 위

<표 2> 고라니 시료 내역

연번 접수번호 폐사일 장소

1 10-05-115 10.05.22 울산 중구 성인동 풍암마을 입구부근 과수원

2 10-05-125 10.05.26 울산 북구 양정동 산 91번지

3 10-08-247 10.08.06 울산 북구 염포동 팔각정등산로

4 10-07-220 10.08.09 울산 을주군 은산중학교 뒷산

5 10-07-238 10.08.10 울산 북구 송정동 울산공장 부근

6 10-09-298 10.09.12 울산 을주군 응촌면 석천리 마을부근 도로변

7 10-09-297 10.09.13 울산 북구 연암동 533번지

8 10-10-333 10.10.07 울산 중구 성안동 도원암 개울가

9 10-10-353 10.10.31 울산 울주군 신북면 등업리 535-11번지

10 10-11-372 10.11.09 울산 중구 번영교 지하교 부근

11 10-12-393 10.12.04 울산 울주군 청량면 율리못 부근

12 10-12-401 10.12.09 울산 읍주군 은산읍 학남리 거남마을

13 10-12-396 10.12.22 울산 남구 여천동 금영기업내

14 10-12-407 10.12.31 울산 북구 염포동 KCC사택 뒤편 인근야산

15 CN11-306 충남 구조센터

16 CN11-378 11.08.04 충남 구조센터

17 CN11-621 11.10.21 충남 구조센터


19 CN11-622 11.10.22 충남 구조센터


11

연번 접수번호 폐사일 장소


21 정보없음 충남 구조센터


23 CN11-477 11.10.10 충남 구조센터

24 CN11-615 11.10.19 충남 구조센터

25 CN11-480 11.10.13 충남 구조센터


27 CN11-630 11.10.31 충남 구조센터

28 CN11-480 11.10.13 충남 구조센터

29 CN11-637 11.11.08 충남 구조센터

30 CN11-254 11.06.19 충남 구조센터







37 CN11-245 11.06.21 충남 구조센터


39 CN11-349 11.07.22 충남 구조센터


41 CN11-326 11.07.13 충남 구조센터

42 CN11-253 11.06.19 충남 구조센터


44 CN11-276 11.06.26 충남 구조센터



47 CN11-626 11.10.26 충남 구조센터

48 포획 11.05.03 충남 보령

49 포획 11.05.04 충남 보령

50 포획 11.05.06 충남 보령

51 포획 11.05.08 충남 보령

52 포획 11.05.19 충남 보령

53 포획 11.05.24 충남 보령

54 포획 11.05.24 충남 보령


12

치한 매몰지 주변에서 토양, 물 등의 환경 시료 170 점을 채집했다 <표 4>.

공기 전파 가능성을 살펴보기 위해 흑산도 기상청에서 5월 25일(±1일)부터

12월 5일까지 사용한 황사필터 (PM10) 179개, 환경과학원 대기환경과에서

2011년 2월 1일에 사용한 서울, 백령도, 대전, 광주의 네 지역에서 포집한 황

사필터 4개 (PM2.5)를 각각 전달받았다. 해당 날짜에 대한 미세먼지

(particulate matter, PM) 값은 <표 6>에 제시되어 있다.

2. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 선행 실험

실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 실험을 통해 구제역 바이러스를 진단 가

능한지 판별하기 위해 선행 실험을 수행했다. OIE 매뉴얼에서 추천하는 방

법 중 5΄ 비번역 지역을 진단할 수 있는 프라이머/탐침 세트를 이용해 ABI

PRISM® 7000 Sequence Detection System에서 실험을 수행했다 <그림 4>.

역전사 효소를 첨가한 경우에는 시그모이드형 곡선이 나타나지만, 역전사

효소가 없는 음성대조군에서는 뚜렷한 곡선이 나타나지 않는 것을 볼 수 있다.

<그림 4> 액세스퀵 onestep RT PCR 시약을 이용한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응

선행실험.


13

연두색 곡선이 역전사 효소를 첨가한 샘플, 빨간 곡선이 역전사 효소를 제외한 샘플,

즉음성대조군이다. 초록색 화살표는 역치 값을 나타낸다.

3. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 통한 구제역 바이러스 진단

실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 선행실험을 통해 구제역 바이러스 여

부를 진단할 수 있을 것이라는 결론을 얻고, 사체 및 환경 시료에서 추출

한 샘플을 주형으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 실험을 수행했다.

가. 고라니 조직 시료의 구제역 바이러스 분석 결과

구제역은 숙주에 따라 다른 감염 경로와 증상을 나타내는 전염성 질병이

다. 대표적인 사례로 소는 호흡기를 통해 주로 감염되며 증상도 처음 감염된

곳(주로 인후두, 기관, 폐 등의 호흡기)을 중심으로 전신으로 바이러스 혈증

이 퍼져나가는 반면, 돼지는 오염된 사료나 감염동물의 분비물에 의한 감염

사례가 많으며 림프계를 통해 발굽위 관상대나 간, 혀, 인후두, 비장 등 여러

기관에서 혈증을 나타낸다는 차이가 있다 (Arzt et al., 2011a; Arzt et al.,

2011b).

아직까지 고라니에 대한 구제역 바이러스 감염 사례가 발표된 적은 없기 때

문에 바이러스 진단에 어떤 조직을 사용할 것인지 결정하기 위해 다른 야생

동물들의 사례를 참고했다. 지금까지 양이나 염소, 그리고 물소 (buffalo)나

영양 (impala) 같은 몇몇 야생동물을 연구한 결과에 따르면 대부분이 소와 비

슷한 형태로 감염 양상이 진행되는 것을 알 수 있는데 (Arzt et al., 2011b), 이

를 통해 고라니도 호흡기관 쪽이 중요할 것이라 예상할 수 있었다. 또한 림프

/혈관 등의 순환계를 통해 다른 기관들로 2차 감염이 전파되었을 수도 있으

므로 간, 심장, 비장, 신장과 상피세포를 추가했고, 구제역 바이러스가 pH에

민감하다는 점을 고려해 위장 또는 직장을 음성 대조군으로 사용하였으며 부

검 중 눈에 띈 몇몇 생식기나 식도, 갑상선 등도 시료에 추가했다 (표 3).

고라니 1마리 당 6~10개의 조직을 적출해, 총 477 개의 샘플에 대해 조직 기

관 별로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 (그림 6), 양성 대


14

연번 인후 기관 폐 간 심장 비장 신장 상피 위 직장 비고

1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND -

2 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 고환,장간막

3 ND ND ND ND ND ND ND - - -

4 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

5 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 회장

6 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 회장

7 ND ND ND ND ND ND ND - ND -

8 ND ND ND ND ND ND ND - ND -

9 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 고환

10 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND


13 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 유선


15 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 식도


17 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 갑상선,식도


19 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 갑상선,식도








조군을 제외한 다른 시료‒호흡기를 포함한 각종 장기 및 음성 대조군인 위,

장‒에서는 시그모이드형 곡선이 나타나지 않는 것을 볼 수 있었다.

<표 3> 고라니 조직에 대한 실시간 역전사 중합효소 반응 결과


15

연번 인후 기관 폐 간 심장 비장 신장 상피 위 직장 비고






















48 ND ND ND - - - - - - -

49 ND ND ND ND ND - - - - -

50 ND ND ND - - - - - - -

51 ND ND ND - - - - - - -

52 ND ND ND - - - - - - -

53 ND ND ND - ND - - - - -

54 ND ND ND - ND - - - - - 　

고라니 조직에서 분리한 유전체를 주형으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행한결과이다. 음성대조군인 위, 장을 포함 모든 조직에서 음성(ND)결과를 얻었다. 연번은<표 2>에 제시된 것과 동일하다.


16

이처럼 고라니 사체 조직을 분자생물학적 항원 검출 방법으로 진단해본 결과

2010년~2011년에 폐사한 고라니에서는 구제역 바이러스가 검출되지 않았다는

결론을 내릴 수 있었다. 따라서 추후에는 사체 조직을 이용한 항원 진단을 계속

하는 한편, 야생동물 포획을 통해 얻은 혈액 시료로 항체 진단도 병행해서 좀

더 폭넓은 거동조사를 수행할 예정이다.

<그림 5> 고라니 조직시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 결과

보라색 곡선이 양성대조군이고, 다른 색 (연두, 빨강, 파랑) 곡선은 조직 시료 샘플이다. 양

성대조군만 시그모이드 형 곡선을 나타내는 것을 볼 수 있다.

나. 환경 시료의 구제역 바이러스 분석 결과

구제역 바이러스는 높은 온도와 산, 알칼리에는 민감하지만 역으로 낮은

온도와 중성 pH 환경에서는 비교적 장시간 생존할 수 있다. 18~20 ℃의

소털에서는 4주, 건조된 분변에서 14일까지, 오줌에서 39일까지, 토양에서

여름에는 3일, 가을에는 28일까지 살아남을 수 있고 (Alexandersen et al.,

2003; Park et al., 2008), 실험적으로 바이러스를 감염시킨 동물에서 얻은


17

내장으로 만든 천연 케이싱(casing)에서 구제역바이러스가 250일 까지 존

재했다는 보고도 있다 (Wijnker et al., 2007). 건초에서는 200일 이상, 사료

는 12~20 ℃에서 52일간, 2~5 ℃에서는 70일간 생존하고, 퇴비에서는 냉장

시 66일, 냉동시 168일, 실온에서는 12일, 초지의 경우 양지에서 며칠, 가

을에는 195일, 겨울에는 262일 이상 생존 가능하다고 한다 (USDA, 1994).

따라서 환경 중에 바이러스가 존재한다면 분자생물학적 방법을 통해 바

이러스를 검출해낼 수 있을 거라 보고, 구제역 매몰지 부근의 토양이나

물, 야생동물과 접촉 가능성이 있는 식물 시료, 고라니나 멧돼지 등 야생

동물의 분변, 그리고 공기 중의 미세먼지를 포집한 황사필터들을 대상으

로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다 <그림 7>.

<그림 6> 환경 시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응

연두색 곡선이 양성대조군 샘플, 다른 색(빨강, 파랑, 보라)들은 물 시료의 증폭 곡선이다.

초록색 화살표는 역치 값이다. 토양, 분변, 황사필터 들도 양성 대조군만 시그모이드 곡선

을 나타내고 환경 시료에서는 위와 비슷한 양상을 보였다.


18

시료 종류 채집날짜 지역 분석 결과 시료수 비고

토양　　

　

3월 13일 경기 남양주 음성 2 매몰지 및 주변 토양

4월 8일 경북 안동 음성 9 (상동)

4월 9일 경북 봉화 음성 9 (상동)

4월 9일 강원 원주 음성 1 (상동)

물　　　　　

　

3월 12일 경북 안동 음성 10 매몰지 옆 하천수

3월 13일 경기 남양주 음성 5 매몰지 주변 고인 물

4월 8일 경북 안동 음성 3 매몰지 옆 하천수

4월 8일 경북 예천 음성 13 (상동)

4월 9일 경북 봉화 음성 6 (상동)

4월 9일 경북 영주 음성 5 (상동)

4월 9일 강원 원주 음성 1 매몰지 주변 고인물

분변　

　

3월 15일 경기 화성 음성 100

8월 12일 충북 제천 음성 2 멧돼지 분변 1개 포함

8월 29일 경기 안산 음성 4 　

식물　　

　

4월 9일 경북 영주 음성 5 볏짚

8월 12일 충북 제천 음성 1 콩순

8월 26일 충북 제천 음성 21 콩순

8월 26일 충북 제천 음성 79 옥수수

대기　　　

　

2월 1일 서울 음성 1 PM2.5=61.5 μg/m3

2월 1일 백령도 음성 1 PM2.5=37.4 μg/m3

2월 1일 대전 음성 1 PM2.5=60.9 μg/m3

2월 1일 광주 음성 1 PM2.5=58.8 μg/m3

5월 25일

~12월 5일

흑산도 음성 179 PM10

환경시료도 조직 시료와 마찬가지로 양성 대조군 외의 샘플에서는 시그

모이드형 곡선이 나타나지 않는 것을 볼 수 있었고, 이를 통해 실시간 역

전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 항원 진단법으로 구제역 바이러스가 검

출되지 않았다는 결과를 얻었다.

<표 4> 환경시료의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 결과

충북 제천 분변 1개를 제외한 나머지는 고라니 분변이고, 식물 시료는 구제역 발생농가 인근

의 농경지 작물을 대상으로 했다. 2011년 2월 1일자 황사 필터 시료(PM2.5)는 서울, 백령도, 대

전, 광주의 네 지역에서 포집된 결과로 시료 및 데이터는 국립환경과학원 대기환경연구과 에

어로졸 연구실에서 제공했다.


19

사용날짜 종명

05월 27일 Microbacterium sp. 11I1 16S ribosomal RNA gene06월 02일 Paenibacillus campinasensis partial 16S rRNA gene06월 03일 Bacillus megaterium strain EIF43 16S ribosomal RNA gene06월 05일 Bacillus sp. IP-95 gene for 16S ribosomal RNA06월 12일 Psychrobacter pulmonis strain06월 12일 Micrococcus luteus 16S ribosomal RNA gene06월 12일 Micrococcus luteus strain PCSB6 16S ribosomal RNA gene06월 12일 Gordonia terrae strain K22-39 16S ribosomal RNA gene06월 13일 Bacillus megaterium strain AIMST 16S ribosomal RNA gene06월 16일 Micrococcus luteus partial 16S rRNA gene, isolate O5 114206월 16일 Sporosarcina luteola gene for 16S rRNA07월 01일 Micrococcus luteus strain QD485-1 16S ribosomal RNA gene07월 11일 Janibacter melonis strain K01-07 16S ribosomal RNA gene07월 12일 Micrococcus luteus strain 16S ribosomal RNA gene07월 15일 Bacillus lehensis strain 57YG65 16S ribosomal RNA gene07월 23일 Bacillus megaterium strain K22-31 16S ribosomal RNA gene

다만 환경시료의 경우 채집한 시료에 내포된 유전체가 다양한 값을 가

지기 때문에 시료의 적합성 또한 판별해야할 필요성이 있었는데, 따라서

NanoDrop2000 (Thermo)을 사용해 준비한 샘플 내의 RNA 농도를 측정

하고, 18s rRNA나 16s rRNA에 대한 중합효소 연쇄반응 실험을 병행해

실험의 신뢰도를 높이고자 했다.

Nanodrop2000으로 측정한 결과, 식물시료는 10 ng/μl 미만, 물이나 토

양, 분변 시료는 60~80 ng/μl 가량, 황사필터 시료는 90 ng/μl 이상의

RNA 값을 나타내어 대부분의 환경 시료가 중합효소 연쇄반응으로 분석

하기 충분한 유전체 농도를 가지고 있다는 점을 확인할 수 있었다. 또한

RNA양이 가장 높게 측정된 황사 필터를 대상으로 미생물 배양 및 16s

rRNA 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 <표 5> 황사 필터에 다양한 미

생물이 존재한다는 것을 알 수 있었는데, 이런 결과들은 환경 시료도 분석

에 적합한 유전체양을 보유하고 있다는 사실을 지지한다.

<표 5> 흑산도 기상청 황사필터에서 배양된 미생물


20

　 월

일 5 6 7 8 9 10 11 12

1 　 72.33 53.92 25.35 32.50 22.58 34.13 7.002 53.35 26.79 54.79 35.25 22.54 32.25 8.793 124.45 57.92 31.81 29.25 20.54 47.38 13.134 36.27 33.04 25.63 23.48 22.46 27.65 25.755 26.58 48.13 30.96 27.54 22.13 19.93 18.836 38.91 19.42 27.39 28.08 50.11 20.29 　7 43.58 26.17 28.82 32.96 39.21 23.17 　8 70.05 11.04 38.88 41.50 45.42 32.71 　9 29.00 8.95 11.00 25.63 45.25 33.38 　10 83.69 10.83 7.73 22.46 33.71 19.29 　11 14.79 8.75 10.08 37.54 12.38 　12 37.28 12.39 14.83 33.46 52.38 　13 18.77 15.70 16.67 50.58 87.71 　14 49.29 10.13 19.13 17.21 26.92 26.67 　15 66.83 11.00 25.25 24.71 58.33 29.21 　16 56.83 11.74 28.61 25.00 44.25 30.00 　17 45.42 20.38 34.50 28.17 25.21 33.08 　18 43.13 33.21 20.57 31.54 22.83 16.83 　19 40.54 28.21 24.22 20.54 27.67 22.58 　20 40.00 36.58 19.88 17.75 23.76 20.21 　21 29.88 106.50 22.33 16.38 20.22 16.67 　22 5.74 23.71 25.04 28.13 18.50 　23 8.17 14.75 39.88 26.75 48.31 　24 6.91 51.33 18.50 42.21 21.42 　25 33.42 10.59 26.45 15.96 31.29 19.00 16.67 　26 46.55 34.83 26.92 18.04 33.17 18.79 24.58 　27 36.52 82.13 17.54 47.38 24.67 29.00 　28 51.22 16.54 16.00 21.13 27.08 21.08 26.75 　29 57.79 6.24 15.96 22.75 15.71 35.58 38.46 　30 50.00 12.39 15.57 26.21 27.83 42.00 27.06 　31 51.69 　 12.35 16.83 　 55.63 　　

흑산도 기상청에서 이관받은 황사필터 (2011년 5월 25일~7월 25일 사용 분량)에서 얻은

미생물. 내용 및 방법에 기술한 대로 얻은 교반액을 LB 배지에 도말, 30℃에서 키운 뒤

16s rRNA 중합효소 연쇄반응을 수행해 종 동정(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)한

결과이다. 황사 필터 날짜에는 ±1일의 오차가 있을 수 있다.

<표 6> 흑산도 기상청 황사필터 시료의 PM10 (μg/m3)


21

이 자료는 기상청 홈페이지 (www.kma.go.kr)에서 제공하는 자료를 바탕으로 해당 날짜

(5월 25일(±1일)~12월 5일)에 대한 PM10값 (단위=㎍/m3)의 평균을 구한 것이다. 이 수치

에는 자료 수집율이 50~80%인 경우가 포함되어 있으며, 공란은 기상청 자료에 값이 기재

되어 있지 않은 경우이다.

4. 무인카메라를 이용한 야생동물 접근 분석

2010년 구제역이 시작되었던 경북 안동을 비롯하여 영주, 봉화, 원주, 진천

등 9개 지역의 구제역 매몰지에 무인카메라를 설치하여 야생동물의 접근성

을 관찰한 결과 경북 안동을 제외한 8개 지역에서 야생동물이 매몰지로 접

근함을 알 수 있었다. 특히 원주지역의 매몰지에서는 매몰된 동물의 혈액 및

지방 성분이 지표면으로 침출되고 있음을 확인할 수 있었다 <그림 7>.

<그림 7> 침출수가 유출된 매몰지


22

무인카메라에 동작이 감지되어 촬영된 사진은 모두 19,993장이었으며 이중

야생동물은 92장이 촬영되었다. 지역별로 경북 봉화에서는 12장이 촬영되었

고 <표 7> 이중 고라니가 6장으로 가장 많았다. 영주지역에서는 13장이 촬

영되었는데 고양이가 11장으로 대부분이었고 원주에서는 야생조류와 개가

각각 3장씩 촬영되었으며 진천지역은 촬영된 8장중 야생조류가 5장, 너구리

2장 개가 1장씩 촬영되었다. 이밖에 제천, 증평, 청원 지역의 카메라에서도

고양이, 닭, 고라니 등이 촬영되었다 <그림 9>.

<표 7> 무인카메라 촬영 결과

지역 촬영된 사진 수 촬영된 동물 촬영 빈도

봉화 923장

고라니 6

너구리 3

야생조류 3

소계 9

영주 4,082장

야생조류 2

고양이 11

소계 13

원주 5,802장

야생조류 3

개 3

소계 6

진천 9,121장

너구리 2

야생조류 5

개 1

소계 8

제천 58장

고양이 39

닭 7

소계 46

증평 6장

고라니 2

야생조류 4

소계 6

청원 1장고라니 1

소계 1

계 19,928장 39


23

원주 지역의 매몰지 촬영 전에는 매몰된 동물의 혈액, 지방성분의 침출 및

침출 성분에 찍힌 야생멧돼지의 발자국이 관찰되었으나 무인카메라 설치 후

매몰지 보수공사가 진행되었고 이후 야생멧돼지는 촬영되지 않았다. 이는

매몰지의 관리 상태에 따라 야생동물의 접근 정도를 조절할 수 있고 이를

통해 야생동물에 의해 침출수 및 침출수에 포함된 병원체가 외부로 유출되

는 것을 방지 할 수 있음을 나타낸다.

<그림 8> 동물별 촬영 빈도


24

<그림 9> 무인카메라에 촬영된 야생동물 모습

Ⅴ. 결 론❚

25

Ⅴ. 결 론

1. 실시간 역전사 중합반응 연쇄반응법을 이용한 구제역 바이러스 검출기법

을 구축 완료하였다.

2. 유전자 분석 결과, 구제역 바이러스는 고라니 54개체의 조직시료 477점 및

환경시료 (토양, 물, 식물, 분변, 황사필터) 459점에서 모두 음성으로 나타

났다.

3. 경북 안동, 영주, 봉화, 원주, 진천 등 전국 9개 지역의 구제역 매몰지에

동작감지 카메라를 설치한 결과, 총 19,993장이 촬영되었으며 그 중 92장

에서 야생동물이 촬영되었다.

4. 고양이와 야생조류가 각각 50회, 17회 촬영되어 높은 빈도로 나타났으며,

이밖에 고라니, 닭, 너구리, 개 등이 각각 9회, 7회, 5회, 4회씩 촬영되었다.

5. 혈액, 지방성분 등 침출수가 유출되었던 매몰지에 멧돼지 발자국이 찍혀있

었으나 매몰지 관리 후에는 나타나지 않았다. 이로 미루어 매몰지의 관리

를 통하여 야생동물에 의해 침출수 및 침출수에 포함된 병원체가 외부로

유출되는 것을 방지 할 수 있음을 나타낸다.

참 고 문 헌❚

26

참 고 문 헌

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diagnosis of foot-and-mouth disease. J Comp Pathol. 2003;129:1-36.

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참 고 문 헌❚

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