Upload
trinhthuy
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Sedimentação: para quê?
Sedimentação – movimento de
uma partícula por acção de um
campo centrífugo
Técnica usada para
separar
purificar
analisar
espécies celulares (proteínas, ácidos nucleicos,
cromossomas, mitocôndrias)
polímeros
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 2
Sedimentação: num campo gravitacional
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 3
Peso:
m = massa da partícula
sedimentada
Força de impulsão :
= densidade do fluido
= volume efectivo da
partícula
mg
m
gmgmmgFd
1
m
Num fluido a força que
promove a queda da
partícula
Peso
Impulsão
Sedimentação: num campo gravitacional
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 4
tvfF Força de atrito velocidade terminal
que de atinge quando
dv/dt=0
A força de atrito contrapõe-se ao movimento
No equilíbrio as forças igualam-se:
f
gm
v
gmvf
t
t
1
1
Sedimentação: numa ultracentrífuga
São aplicados os mesmos princípios e fórmulas só que a aceleração
da gravidade (g) é substituída pela velocidade angular (w2 r)
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 5
f
rwm
vt
21
Vamos ver Porquê
Sedimentação numa ultracentrífuga
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 6
Estado inicial Alta velocidade
de rotação
Baixa velocidade
de rotação
Sedimentação: numa ultracentrífuga
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 7
Aplicando uma força
centrífuga e causando um
movimento de rotação à
partícula, com uma
frequência angular , ela é
fortemente acelerada e atinge
rapidamente a velocidade
terminal
A velocidade terminal atinge-se quando as forças envolvidas ficarem balanceadas
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0
Sedimentação: numa ultracentrífuga
Fc- força centrífuga = 2 r m
(onde m reperesenta a massa da partícula e -2r representa a aceleração centrípeta)
Fd- força de fricção (viscosidade) = -f v
(onde f é o coeficiente de fricção e v a velocidade terminal)
Fb- força de impulsão = -2 r m0
(onde m0 é a massa do solvente deslocado pela partícula)
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 8
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0
Sedimentação: numa ultracentrífuga
Então
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 9
00
2 fvmmr
m0 = volume específico parcial da partícula densidade
= Volume específico parcial
= densidade da solução
Ftotal = Fd + Fb + Fc = 0 Relembre:
02
0
2 rmmrfv
Rearranjando
Sedimentação: numa ultracentrífuga
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 10
Substitua na equação anterior o m0 :
Colocar os parâmetros moleculares de um lado e os parâmetros
experimentais do outro
00
2 fvmmr
Sedimentação: Coeficiente de sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 11
IMPORTANTE
O coeficiente de sedimentação depende da massa molecular (M)
e do coeficiente de fricção (f)
ãosedimentaç de eCoeficient S
molecular massa M
1_
2
AV
AV
sol
t
Nm
fN
M
r
vs
Definição de coeficiente de
sedimentação
)( aceleração
)( terminalvelocidade2r
vs t
Coeficiente de sedimentação: significado
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 12
O coeficiente de sedimentação é a distância (cm) percorrida pela molécula,
durante 1 segundo, sob efeito de uma força de 10-2 N kg-1, no solvente água, a
293 K.
S depende:
a) Propriedades moleculares da molécula.
m - massa molecular
- volume específico parcial
f – forma da molécula
b) Propriedades da solução.
- densidade
- viscosidade (porque f depende de )
Coeficiente de sedimentação experimental
Unidades
O coeficiente de sedimentação experimental sofre influência da
temperatura e da viscosidade
Como s depende das propriedades da solução, os valores medidos,
devem ser convertidos para as condições padrão, (temperatura é
20°C e o solvente é a água) (para poderem ser comparáveis para
diferentes moléculas)
S20,w (Svedberg)
1s= 10-13 segundos
Nota: S20,w é uma propriedade única da partícula e pode ser utilizado
para avaliar mudanças conformacionais
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 13
sscm
scm
aceleração
vs
2/
/
Relação entre difusão e sedimentação
Segundo Stokes A equação de Einstein
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 14
Velocidade de sedimentação: permite calcular
Coeficiente de sedimentação
Coeficiente de difusão (se os componentes sedimentados são bem
preparados)
Massa efectiva dos componentes do soluto
Formato das partículas (assimetria)
Homogeneidade e estados de agregação
Constantes de associação e estequiometria
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 15
EM RESUMO…….
Em condições
experimentais diversas!!!!
Sem interferências
externas!!!!
Relação entre s e M
A velocidade de sedimentação de uma partícula depende da sua M
◦ Quanto maior for M maior o valor de s
O coeficiente de atrito f , reduz o valor de s
◦ Quanto menos globular for uma proteína menor a sua velocidade de
sedimentação
Quanto maior a densidade de uma partícula maior a sua velocidade
de sedimentação
◦ Quanto maior for o valor da componente (1-) maior a velocidade de
sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 16
_
1 D
sRTM
Nota: Os itens 2 e 3 são importantes
para o estudo estrutural de proteínas
quando comparadas com proteínas com
a mesma massa
Determinação do Coeficiente de Sedimentação:
métodos
Método da velocidade de sedimentação
Sedimentação de fronteira
◦ Sedimentação de uma macromolécula numa solução homogénea
Sedimentação em gradiente (zonal, ou em faixas ou em bandas)
◦ Sedimentação de uma macromolécula em gradiente de concentração
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 17
O valor de S deve ser extrapolado a uma diluição infinita por forma a
obter parâmetros molecularmente significativos
Método da velocidade de sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 18
Fornece informação hidrodinâmica sobre as moléculas em solução
Parâmetros experimentalmente determinados:
Coeficiente de sedimentação, s, a constante de difusão, D, e
em alguns casos, a massa molecular, M.
Se a massa molecular é conhecida, o coeficiente de
sedimentação pode ser usado para obter uma estimativa da
forma molecular da molécula em solução
Usado para grandes moléculas que difundem lentamente.
A força de sedimentação deverá ser muito superior à força de
difusão
Sedimentação de fronteira
Começar com uma solução homogénea de macromolécula
Como a solução é centrifugada na ultracentrífuga, as
macromoléculas movimentam-se por acção desse campo , gerando-
se uma zona limite de solvente
Seguindo essa faixa limite ao longo do tempo, podemos calcular o
coeficiente de sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 19
fN
M
r
vs
AV
sol
t
_
2
1
Velocidade de sedimentação limite: limitações ao
método
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 23
Dispersão das zonas limite (se a difusão se torna significativa)
-Difusão e sedimentação são duas formas de transporte do
soluto
-A sedimentação gera gradiente, a difusão opõe-se a esse efeito
Dificuldade de separar componentes em misturas complexas
Necessita de equipamento caro
Difusão radial : um fenómeno que contribui para a
limitação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 24
• A difusão radial ocorre em
consequência da forma que têm as
células de sedimentação.
• Todas as moléculas (não importa em que
posição estejam) difundirão na mesma
extensão causando uma redução na
densidade óptica observada. Para um
dado tempo, esta difusão é a mesma em
cada ponto da célula
• A Difusão radial pode ser observada
através da redução do “plateau” nos
sucessivos scans da absorvência
Espalhamento de zonas : Difusão versus heterogeneidade
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 26
1- Sistema com um componente ( as
bandas espalham-se devido à difusão e dá
um aspecto sigmoidal)
2- Sistema multicomponente ( os
degraus que definem os perfis de cada
componente podem perder definição
quando aumenta a difusão)
3- Sistema multicomponente ou
monocomponente? ( sem análises
posteriores é impossível afirmar se o
limite de espalhamento é devido à
heterogeneidade de S ou se é devido à
difusão)
Dificuldade de separar componentes em
misturas complexas
Como obviar essas limitações?
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 27
Utilize o mesmo método mas em gradiente de concentração
Centrifugação por Zonas
Centrifugação em zonas ou pelo método da
velocidade de sedimentação
Preparação de um gradiente contínuo de densidade usando
sacarose centrifugando uma solução de sacarose
Aplicar a amostra sobre o gradiente.
Recolher as fracções dos componentes separados
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 28
Velocidade de sedimentação em gradiente de
concentração: vantagens e desvantagens
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 29
Limitações:
- não é exacta a medida da massa molecular
Vantagens:
- resolução completa dos componentes de uma mistura
- relativamente barata
Sucrose Density Centrifugation of
Cellular Membranes from G. violaceus
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 30
(A) Schematic of the sucrose density gradients
used for separation; the dark shading at the
bottom represents the area of sample
application in 50% sucrose (w/w).
(B) The gradient after 16 h of centrifugation at
160,000g displays an orange (1.07 g/mL) and a
green (1.16 g/mL) membrane fraction.
(C) A distinct band is formed from the green
fraction in (B) when recentrifuged on the
sucrose density gradient.
(D) A third membrane fraction with an
apparent density of 1.19 g/mL (corresponding
to the outer membrane) is obtained when the
boundary between the 48 and 50% layer is
applied to a second sucrose gradient
centrifugation.
S é determinado pelo deslocamento
da banda, no tubo de centrífuga,
com o tempo
Exercício prático
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 32
Calcular o coeficiente de sedimentação (s) e o coeficiente de fricção (f) para a E. Coli DNA ligase em soluções diluidas de tampão aquoso (20 mM de fosfato, 10 mM NH4Cl, pH 6,5 e temperatura de 20,6°C. Considere os seguintes dados:
Peso Molecular = 74,000g/mol
Vmolécula= 0,737 cm3/g
tampão= 1,010 g/cm3 a 20,6°C
= 56,050 rpm
T(min) x1/2 log x1/2
0 5,9110 0,7717
20 6,0217 0,7797
40 6,1141 0,7863
60 6,2068 0,7929
80 6,3040 0,7996
100 6,4047 0,8065
120 6,5133 0,8138
140 6,6141 0,8205
Exercício Prático
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 33
= 56,050 rpm x (2 radianos/revolução) (1 minuto/60 segundos)
=5,87 x103 rad/segundo
dt
xds 2/1
2
log303,21
213
14
min60/1087,5
min1042,3303,2
sxsrad
xxs
S= 2,31 x 10-11 segundos= 23,1 S
Exercício Prático
s
m
x
vf t
1
2
gmolmoléculas
molgm 19
231023,1
/10023,6
/000,74
seggf
segrad
gf
/1057,5
/1087,5
010,1737,011023,1
24
3
19
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 34
Calcule agora o coeficiente de fricção
Primeiro calcule o valor de m
e….
Sedimentação: Equilíbrio de sedimentação
Baixas velocidades de rotação
◦ Balanço entre as forças de
sedimentação e as forças de
difusão (A amostra é
simultaneamente sujeita a
sedimentação e a difusão
produzindo-se um gradiente que
não variará até que o equilíbrio seja
atingido)
◦ Não há transporte efectivo
◦ Não há influência da forma das
partículas
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 36
Fenómenos de transporte: Equilíbrio Sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 37
Distribuição das moléculas num campo
gravitacional ou centrífugo após atingir o
equilíbrio
O balanço entre a força de sedimentação
numa dada direcção e o efeito aleatório da
difusão origina um gradiente de
concentração; a concentração no fundo do
tubo é maior.
O gradiente de concentração depende do
peso molecular das moléculas
Sedimentação: equilíbrio de sedimentação
dx
dcDJ
cvJ
dif
tsed
f
xm
v
dx
dcDcv
t
t
21
0
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 38
Informação termodinâmica
Sedimentação gradiente de concentração difusão
Equilíbrio de gradiente de concentração: sedimentação é exactamente
balanceada pela difusão (moléculas exponencialmente distribuídas ao
longo da célula)
Equilíbrio: J = 0
J = Jsed + Jdifusão
Sedimentação: equilíbrio de sedimentação
xdxMRT
dcc
xdxMRT
dcc
xMRTdx
dc
c
dx
dcDcM
RT
xD
MRT
xD
f
xm
v
x
x
c
c
t
11
11
11
1
1
1
2
1
2
1
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
1
2 12
ln xxMRTc
c
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 39
Sedimentação: equilíbrio de sedimentação
12
2
MRT
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 40
Calcular M através do declive
Nota: Este método não necessita da determinação de D
Ln c
x2
Declive =
Equilíbrio de sedimentação: permite calcular
Massa / peso molecular
Homogeneidade em relação ao peso molecular
Estados de agregação
Estequiometria e constantes de equilíbrio para
processos de associação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 41
Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente
de concentração
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 42
Equilíbrio de sedimentação: equilíbrio de gradiente
de concentração
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 43
Solução das macromoléculas preparada
em solução de CsCl
Centrifugação até ao equilíbrio produz
um forte gradiente de CsCl e
consequentemente um gradiente de
densidade através do tubo
Se a concentração de CsCl é
correctamente escolhida as
macromoléculas migram em banda
através do gradiente do solvente até que
(1-molécula )=0
Centrifugação: equilíbrio de sedimentação com gradiente de
concentração
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 44
Solução das macromoléculas
preparada em solução de CsCl
Centrifugação até ao equilíbrio
produz um forte gradiente de
CsCl e consequentemente um
gradiente de densidade através
do tubo
Se a concentração de CsCl é
correctamente escolhida as
macromoléculas migram em
banda através do gradiente do
solvente até que (1-molécula )=0
Relação entre o coeficiente de sedimentação e o
peso molecular de proteínas
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 46
Forma, massa e densidade de proteínas
/coeficiente de sedimentação
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 47
Eletroforese: generalidades
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 50
Transporte de partículas num campo eléctrico
Técnica usada para separar e às vezes purificar
macromoléculas que diferem na carga, conformação ou
tamanho
Aplicações:
Separação de compostos com carga (aminoácidos,
péptidos, proteínas, ácidos nucleícos). Carga dependente
do pH do meio. Moléculas negativas e positivas movem-
se em direcções opostas ao campo eléctrico.
Determinação da composição das proteínas por
comparação com padrões electroforéticos
Eletroforese: princípios gerais
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 53
Movimento molecular sob acção de um campo eléctrico
Num solvente não condutor:
Força de eléctrica (Coulomb):
F = qE
q= Z e
Força de fricção: Ff = - f v
No equilíbrio:
V = Fe + Ft = 0
Z = nº de cargas (sem dimensões)
e = carga eléctrica (1,6022 x10-19 C)
E= campo eléctrico (volt m-1)
f = coeficiente de fricção (Kg s-1)
v= velocidae de migração
Como proceder?
Aplica-se uma diferença de potencial e a partícula move-se na
direcção do polo de carga oposta
No início há resistência devido à viscosidade do meio mas a certa
altura atinge-se um equilíbrio quando as forças electrostáticas
atractivas se igualam à resistência ao fluxo. Então a mobilidade
electroforética passa a ser constante
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 54
Recorde…
Mobilidade Electroforética (u) é a velocidade linear (v) por
unidade de gradiente de potencial eléctrico (X)
Traduz-se pela razão entre a velocidade da macromolécula (v) e o
potencial eléctrico (E) que promove o movimento , ou
Traduz-se pela razão entre a carga líquida da partícula (Z) e o seu
coeficiente de fricção (f)
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 55
11
ou
smVf
Z
E
v
X
v
Mobilidade electroforética e carga da partícula
Para uma molécula esférica
Então:
A mobilidade electroforética serve para medir a carga da partícula
num meio não condutor
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 56
rf 6
r
Zu
6
Eletroforese: mobilidade eletroforética
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 57
Contudo....
* molécula carregada rodeada por atmosférica iónica (dificulta
a interpretação dos resultados de mobilidade)
* molécula carregada altera o coeficiente de fricção
Mobilidade electroforética e peso molecular
Pode-se usar a mobilidade electroforética para
determinar o peso molecular ?
Os ácidos nucleicos podem ser separados de acordo com o
peso molecular porque possuem uma carga de fosfato por cada
base (nucleótido)
Para as proteínas o número de cargas depende da composição
dos aminoácidos e do pH do tampão
As cadeias polipetídicas de determinado comprimento podem
adquirir diferentes formas com diferentes coeficientes de fricção (f ) (é proporcional ao seu comprimento)
Para usar a electroforese para determinar o peso
molecular é necessário:
Desnaturar as proteínas
Introduzir uma carga em cada peptídeo
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 58
Electroforese em gel: determinação do peso
molecular das proteinas
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 63
A carga e as propriedades hidrodinâmicas da proteína são função do seu peso
molecular
bxaM log
M = peso molecular da
proteína;
X = distância de migração
no gel (proporcional à
mobilidade)
a e b = constantes para
um dado gel e um dado
campo eléctrico Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido