Upload
others
View
6
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Fenotypizácia B lymfocytov a klasifikácia CVID
M. Bobovčák ([email protected])Klinické laboratórim – Vysokošpecializovaný ústav pľúcnych chorôb
VVZ. a.s. Nová Polianka – Vysoké Tatry, Slovensko
PID - Primary Immunodeficiency – humorálne PID
- viac ako 250 definovaných PID, v každom veku, > 60% je prevažne humorálnych(nediagnostikovaných PID ?, 1:1200)
- včasná diagnostika a liečba
Edukácia a spolupráca : napr. www.esid.org
Ťažký kombinovaný imunodeficit (SCID) 1:50-100 000
X-viazaná agamaglobulinémia (XLA) 1:100 000
Hyper IgM syndróm 1:100 000
CVID (najzávažnejší v dospelosti) 1:35 000 menej / viac?
Selektívny deficit IgA 1:150 menej?
Deficit podtried IgG 1:2500
Selektívny deficit IgM ?
Selektívny deficit IgG (postvakcinačne <) IgG, IgGx normálne, výskyt ?
Povaha deficitu a Klinika
T-bunkový
Závažný priebeh infekcie „benignými“ vírusmi (CMV, VZV)Kožná alebo systémová KandidózaInfekcie oportunitnými mikroorganizmamiSystémové reakcie na vakcináciuLeukocyty menej ako 1.5Nález (tetánia, erytrodermia, alopécia, poruchy rastu...)
B-bunkový
Recidivujúce infekcie (sinusitídy, otitídy, pneumónie)streptokokoky, stafylokokoky, hemofilyLymfoidná hyperplázia (LU,, slezina, pečeň,tenké črevo,)Autoimunita
Kombinovaný (T a B) Recidivujúce infekcie, Lymfoidná hyperplázia, Autoimunita Nález: Ataxia teleangiektázia, trombocytopénia, ekzém.
Funkcie leukocytovStafylokokové abscesy, kožné, orgánové (Hyper IgE sy)Abscesy , osteomyelitída, fistuly LU, granulómy
Dr. Gürtler: Imunodeficity existujú, ale...
(klinický, laboratórny, skutočný, fiktívny, primárny, sekundárny)
S-IgAD primárny, 1:150, cc IgA < 0.05 g/l u parciálneho IgA < 0.07 g/l (RH –2SD podľa veku
sekundárny (infekcie, lieky, tonzilektómia, adenotómia, splenektómia, transfúzie)
80-85 % asymptomatický priebeh
symptomatický – infekcie (DC, GIT), autoimunita, IgG2,3 deficit , alergie,
malignity, možná progresia do CVID, dramatické transfúzne reakcie.
Selektívny deficit IgA (S-IgAD)
Diagnostika CVID (Bežný variabilný imunodeficit)
Heterogenná skupina ochorení, vyznačujúca sa porušenou schopnosťou tvorbyprotilátok produkovaných B lymfocytmi: znížené hladiny sérového IgG (sub),
IgA (sub), (IgE), hladina IgM bývá variabilná ( podobný klinický obraz )
Patogenéza CVID až na niektoré výnimky nebola objasnená (deficit CD19, ICOS, BAFF-R, TACI)
Popísané B i T lymfocytárne defekty vedúce k neschopnosti kooperácie medzi B a T lymfocytmi ( napr. CD40L) ⇒ porucha v tvorbe protilátok
Laboratórne zmeny v hladinách protilátok
Zvýšenie koncentrácie: polyklonálne, monoklonálne, izolované, kombinované
Zníženie koncentrácie (deficit, CVID): izolované, kombinované (izotyp, potrieda)
závislévek / pohlavie
IgM IgG IgA IgD IgE
cc g/l 0,3 – 4,0 (6%) 7.0 - 16.0 ( 80%) 0.4 – 4,0 (13%) 0.03 0-100 IU/mlPolčas dní 5 - 6 18 - 22 5 - 7 2.8 2.3
CVID < 0.025 (80%)
3 - 5.0(vakcinačné špec. Ig?)
typicky < 3.0mean 2,5
< 0.05 (70 %)
Diagnostika CVID – diagnóza „per exclusionem“
Klinika - Anamnéza vek > 2r. (20r - 50r.- senia)6 ESID pravidiel pre PID – varovné symptómy www. esid.org rekurentné, chronické infekty...respiračné a intestinálne prejavy...autoimunita ...
Diagnostické kritéria CVIDPacient s poklesom s. IgG (2SD pod priemer pre daný vek) spolu s výnamným poklesom IgM a / alebo IgA a spĺňa nasledovné kritéria:1. Nástup príznakov až po 2 roku života často oneskorenie v diagnostike (7 rokov)2. Chýbanie izohemaglutinínov a/alebo protilátkovej odpovede pri vakcinácii
resp. postinfekčne (špecifické Ig)3. Vylúčenie iných známych protilátkových deficiencií (PID) a sekundárnych ID
(liekmi indukované, genetické poruchy,infekcie HIV, CMV, EBV..., malignita,systémové ochorenia )
Najčastejšie klinické prejavy u CVID
Infekčné závažné alebo recidivujúce infekcie 80-98%DC (sinusitídy, otitídy, bronchitídy, pneumónie)
pneumokoky, hemofily, streptokoky,, stafylokoky,,mykoplazmy, ureaplazmy, pseudomonas, vírusy (Entero, Coxsackie...),
GIT - 15%´H. pylori, Campylobacter, Giardia, SalmonellaChronické ochorenie pľúc (30%)Pyodermie, abscesy
NeinfekčnéAutoimunita - 22% (hematologická (AIHA, AITP..., reumatologická SLE, RA..., kožné, GIT celiakia....)Malignita 15%(lymfoproliferácia (benígny priebeh 30%), lymfadenopatia, hyperplázia,-megálie,iné: adenoCa žalúdok..Granulómy -15%, črevo, slezina, pečeňGIT prejavy -15% (CVID kolitída, gastritída...)
Sekundárne humorálne imunodeficiencie
Sekundárne imunodeficity sú najčastejšiebývajú najmä kombinované, ovplyvňujú (Celulárne, Komplement, Funkcie fago...)zvyčajne reverzibilné a menej závažné
Solídne tumoryLymfómyLeukémieCMV, EBV SLE, RA, AIHSplenektómiaNefrotický syndrómPopáleniny ++Imunosupresíva liekyDiabetes mellitusUrémia, dialýzaVysoký, nízky vek
Varovné príznaky (Baxter)
Diagnostika CVID – laboratórna diagnostika - imunostatus
1.FW (N), KO (Leu n/ / ) , Ig G ( ), IgA (n ) ,IgM ( )
2.IgG1-4, , Ab anti isohemaglutininy, špec. Ab – tetanus, difteria.. (skin testy)Prietoková cytometria:Imunokompetentné subpopulácie Leu, Th,Tc, B, NK, abs. a rel. počtySubpopulácie B lymfocytov ( + vylúčenie deficitu ICOS, CD19, BAFFR,)Subpopulácie T lymfocytov (CD4, CD45RO, CD45RA, T reg)
3. Funkčné testy – produkcia Ig a Cytokínov in vitro, Th1, Th2, TregDeficit niektorých ďalších molekúl – CD40L, agama včítane XLA....odlíšenie od iných PID
4. Genetické testy – preukázanie mutácie. (TACI Gény kodujúce dôležité faktory, receptory)
Stemcell
early pro-B
late pro-B
Largepre-B
Smallpre-B
immat.B
Pre-BCRKostná dreň(Ag nezávislé)
DH to JH VH to DJH VL to JL
BCR
Diferenciácia B Lymfocytov – súčasný pohľad
CD34+ CD22+ CD10+19+20- CD10+19+20+21- sIgM+CD10+19+20+21-
µ
KRV
TransitionalB bunky
T1
SlezinaL. uzlina
T2 FO Folikul
Germinálnecentrum
mem B
Plazmacell
Plazmablast
Plazmablast
mem B
MZ
FO
matureB
MZ
IgM++IgD+CD21- /intCD38++CD10+
IgMhigh
IgD+CD21+CD23+BAFFR+
IgM++IgD+ /intCD21+CD38-CD27+
IgM int /+IgD+CD21+CD38+CD27-
IgM-IgD-
CD21+CD38+CD27+
mIgG+/IgA+
CD19lowCD21lowCD38+++CD27++
Antigén Class switch, SHM
10-20%
10-20%
ThNaivní
F1CXCL13
KRV
T1 mem BPlazma
blast
FOMZ
IgM++IgD++CD21- /intCD38++CD10+
IgM++IgD+ /intCD21+CD38-CD27+
IgM int /+IgD+CD21+CD38+CD27-
IgM-IgD-CD21+CD38+CD27+mIgG+/IgA+
CD19lowCD21lowCD38+++CD27++
Subpopulácie B Lymfocytov v periférnej krvi
7 - 30%včasná odpoveď
Pneu PS like antigény - BCRPokles – slabá vakcinácia
hlavne T nezávislá IO
Naivné B
40- 80%Proteíny - BCR
Pokles – slabá vakcináciahlavne T závislá IO
diferenciácia:-dlho žijúce pamäťové bunky
-plazmatické bunky
MZ BTransitional B Pamäťové Bclass svitch
6 - 30%Post germinálne Ag stimulované B bunky
U defektu CD40L, ICOStáto populácia chýba.
(Bunky IgM+IgD-CD27+veľmi nízky počet)
Pod 2%dlho žijúcich0.6-3,4%
dlho žijúcich
Po úspešnej aktivácii fB bunky a kooperácii s fTh sa tvorí germinálne centrum, fázy MB1 až MB5 , od naivnej bunky MB1-2
až po postgerminálne BM5 pamäťové Ag špecifické klony – prítomné aj v cirkulácii.Vplyvom IL10, IL21 – časť buniek v GR – alternatívna diferenciácia – Plazmatické b.
NK like funkcia,osteoklasty
Prečo je potrebná B fenotypizácia ?CVID –hetoregénna skupina pacientov s protilátkovým deficitom
defekt – môže byť na odlišnej úrovni v B a T diferenciácii, kooperácii
bonus - detekcia deficitu CD19, BAFFR, ICOS (nie TACI)
Snaha o klasifikáciu skupín pacientov s podobným pozadím deficitu CVID
klinický priebeh ochorenia
prognóza
terapia
Freiburgská klasifikácia (Warnatz a spol. 2002)
Parížska klasifikácia (Piqueras a spol. 2003)
EUROclass klasifikácia (kombinácia oboch + nové kritéria 2008)
Freiburgská a Parížska klasifikácia CVID
Založená na memory B lymfo
Ia < 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM-> 20% nezrelých B:CD19+21- (21% pc)
Ib < 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM->= 20% nezrelých B:CD19+21- (56% pc)
II >= 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM- (23% pc)
Založená na memory B lymfo a izotyp. „switch“
MB0 < 11% mem B: CD19+27+IgD+-splenomegália, granulomatóza
MB1 < 8% mem B: CD19+27+IgD-
MB2 < 8% mem B: CD19+27+IgD-
switch = IgD-memory = CD27+
Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008
EUROclass klasifikácia CVID
Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008
Prietoková cytometria fenotypizácia subpopulácií B
Cytometria klasických populácií lymfocytov: T, B, NK – absolútne a relatívne počty
B fenotypizácia kombinácia protilátok:
Panel B1 anti-CD19 /anti- CD27/anti-IgD/anti-IgM
Panel B2 anti-CD19 /anti- CD38/anti-CD21/anti-IgM
CD19 - líniový znak B lymfocytov (CD20, CD22)CD27 – memory markerIgD – znak izotypového prešmyku
Panel B1 – rozoznávané populácie :Naivné B bunky: CD19+ 27- IgM+ IgD+B bunky Marginálnej Zóny (like): CD19+ 27+IgM++IgD+Pamäťové (memory) class switched B bunky: CD19+ 27+IgM- IgD-Pamäťové (memory) non switched B bunky: CD19+ 27+IgM++IgD-
Panel B2 – dodatočné populácie :Transitional B: CD19+ CD21int CD38++ IgM++ (CD27 -)Plazmablasty: CD19low CD21int CD38+++ IgM-(+) (CD27 ++)CD21low B: (neprítomné v zdraví) CD19++ CD21low CD38low IgM+ (CD27 -)
FC Fenotypizácia subpopulácií B ly zdravý darca
LyB Ly
CD19+ B Ly
Panel B1CD19 / CD27/IgD/IgM /
Panel B2CD19 / CD38/CD21/IgM /
Naive FO
MZone
Switch MEM MEM
IgMPl.Blasty
Trans.B
Pl.Blasty
CD21/38 low
Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008
Pamäťové B lymfocyty
T2
IgMhigh
IgDlow
CD21-
CD23-
IgMl low
IgD high
CD21+
CD23+
IgMhigh
IgDlow
CD21high
CD23-
IgG, IgA, IgE
IgMhigh
IgD+
CD21+
CD23+
(Modifikované podľa C. Schiff)
Transitional B cells
B lymfocyty v perifernej krvi
IgG ,IgA, IgE
CD27
IgD
CD21lowCD38low
IgM
CD38 CD38
CD21
T1 FO
MZ
mem B
Plazmacell
CD 27 CD 27
IgD IgD
Naivné B lymf: 60,5% Naivní B lymf.: 93%
B lymf. marginal zóny: 15,3% B lymf. marginal zóny : 5,6%
Izotypovo prepnuté pamäťové B lymf.: 21,3%
Izotypovo prepnuté
pamäťové B lymf.0,1%
Zdravý dárca CVID
CD19+ 45+ Lymfocyty
Marcela Vlková, Znojmo 2009
IgD-,CD27-
nekonvenčné memory B, SHM
krátko žijúce IgG+IgD-27-
CVID1
CD 27
IgD IgM
CD 38
CD19+ 45+ Lymfocyty
Marcela Vlková, Znojmo 2009
CD 27
IgD
CD 38
IgM
CD19+ 45+ Lymfocyty
Marcela Vlková, Znojmo 2009
CVID2
CD21
CD 38CD 27
IgD
Marcela Vlková, Znojmo 2009
CVID3CD19+ 45+ Lymfocyty
Interpretácia deregulovanej B homeostázy
90% CVID pacientov skoro normálne počty B v periférnej krvi5-10% pacientov - veľmi nízke počty – menej ako 1% -(defekt vývoja v kostnej dreni, defekt faktorov v periférii, negatívne regulátory)
Switchované pamäťové B – marker správnej funkcie Germinálneho centra nízke počty u typu I, MB1/MB0, smB-(defekt v prípade deficitu CD40L, ICOS)u dostatočného počtu typ – II, MB2, smB+ pátrať po sprievodných ochoreniach (myotonická dystrofia DM2, u skupiny II – defektná postgerminálna diferenciácia na Plazm. bunky)
Selektívna redukcia IgM+pamäťových buniek - problém diferenciácie v marginálnej zóne (včasná odpoveď, defektná odpoveď na antigény typu PnPS, vakcinácia)
Expanzia cirkulujúcich CD21 low – CD21 – receptor pre C3d, expresia CD21(spolu s CD19) – zvyšuje účinnosť prenosu signálu z antigénu viazaného na BCR a C3d manifestácia pri chronických ochorenia prevažne typu Th1 asociácia so splenomegáliou a granulomatóznymi ochoreniami
Expanzia Transitional B buniek asociácia s lymfadenopatiou, popísaná aj u Pokles zrelých B buniek a významý nárast Tr. B buniek u BAFF-R defektu
Expanzia IgA+B – zvýšené riziko infúznej reakcie pri Ig terapii, u kompletne IgA deficitných CVID
CD21 – (C3d receptor) súčasť BCR signálového komplexu CD19/CD21/CD81/...
Pri fenotypizácii 19/27/IgD sa nachádzajú CD21low, v oblasti naivných buniek
vysoká expresia CD19, IgMnízka expresia znakov germinálneho centra CD38, CD10 a CD77, neprítomnosť CD39 spolu so zvýšenou hladinou CXCR6 usídlenie týchto B lymfocytov mimo lymfatické uzliny (Wehr et al., 2004).
zvýšené percento týchto buniek u pacientov (autoimunita)s CVID, RA, SLE, Sjögrenovým syndromem (Wehr et al., 2004)
u pacientov so SLE prevažne fenotyp IgD-charakterizované ako IgD-CD38- memory B lymfocyty (Culton et al., 2007)
považované za pre-plazma B lymfocyty zodpovedné za produkciu autoprotilátok (Nicholas et al., 2008).
alebo
nezrelé B lymfocyty, pred ďalšou diferenciáciou (Warnatz et al., 2002).
CD21lowCD38low B lymfocyty
Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008
Prietoková cytometria fenotypizácia subpopulácií T u CVID
Popísané: - redukcia u niektorých CVID pacientov:total CD3+4, a naivných CD3+4+RA+pacienti s chronickou Th1 (TNFa) stimuláciou, MonoMf - stimuláciou =B lymfopénia a hypogamaglobulinémia
- CD3+4+RA+ pod 15%redukcia výstupu CD3+4+ z thymuexpanzia CD21lowredukcia switch memory Bsplenomegália, granulomatóza
-redukcia Treg buniek u CVID pac.splenomegália, chron. inflamáciau typu smB- CD21low
-pacienti ICOS deficitnývýznamná redukcia CXCR5+CD3+4+
Pozn. B lymfo u CVID spojených s T funkčným deficitom sú in vitro aktivovateľné.
Prietoková cytometria u genetických defektov spojených s CVID
ICOS deficit
CD19 deficit
BAFFR deficit
TACI deficit
BAFF-R – B cell activation factor - TNF receptor family vysoko exprimovaný na všetkých periférnych B bunkách. Receptor pre BAFF – kľúčový regulátor periférnej B bunkovej homeostázy. Deficit ústi k ťažkému poklesu periférnych zrelých B buniek a zýšenej prítomnosti Transitional buniek. Blok diferenciácie T1-T2 (popísaný 1 pacient)
CD19 – expresia medzi pre B bunkou a Plazmatickou bunkou, súčasť B cell kostimulačného komplexu, ľahká detekcia expresiou iných B líniových znakov ako, CD21, IgM ... (popísaných 5 pacientov)
Inducible costimulator – CD28 receptor family na aktivovaných T bunkách, Kooperácia s ICOSR na B bunkách – pri deficite ICOS porušené formovanie GC a tvorba pamäťových klonov B (Class switched memory B deficiencia), ale aj MZB-nevysvetlenéT CD4, RO, RA neovplyvnené – okrem redukcie CXCR5+CD3+4+. Strata upregulácie ICOS u PHA (CD3,CD28) stimulácie T buniek. V skupine smB- by mala byť ICOS deficiencia testovaná (rodinná história), 10 prípadov
(transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand interactor)TACI – TNF receptor family prevažne exprimovaný na pamäťových CD27+ B bunkách, neovpyvňuje T a B homeostázu – bodová mutácia, ťažko detegovateľný prietokovou cytometriou. Najčastejší deficit u CVID (až 8%)
Genetické defekty spojené s CVID
Referenčné hodnoty periférnych B subpopulácii lymfcytov
Warnatz - Schlesier, Cytometry Part B, 74B: 261-271, 2008
Záver
1 Fenotypizácia B subpopulácií buniek (čiastočne T) prietokovou cytometriouby sa mala stať súčasťou štandartnej diagnostiky u CVID pacientov. Dokáže klasifikovať heterogénnu skupinu pacientov s touto diagnózou. Fenotypizácia dokáže identifikovať pacientov s: ťažkými defktmi vývoja pamäťových B buniek v germinálnom centrevčasné defekty v periférnej diferenciácii B buniekmožné zápalové zmenyporuchu v kooperácii s T bunkami
2 Funkčné testy lymfocytárnej aktivácie (zatiaľ vo výskume)by mali v budúcnosti priniesť nové prístupy k diagnostike týchto pacientov objasniť patogenézu u CVID a stanoviť nové prediktívne markery. Pri ESID – skupina „Immune phenotyping in immunodeficiency“ (IPID) - web