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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
FERNANDA PERINI GUSMÃO
Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis
Lorena
2013
FERNANDA PERINI GUSMÃO
Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis
Trabalho de conclusão de curso
apresentado à Escola de Engenharia
de Lorena - Universidade de São Paulo
como requisito parcial para a
conclusão de Graduação do Curso de
Engenharia Bioquímica.
Orientador: Profª Drª Maria Bernadete
de Medeiros
Lorena
2013
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO Serviço de Biblioteca Escola de Engenharia de Lorena
Gusmão, Fernanda Perini
Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis / Fernanda Perini Gusmão;
Orientadora Maria Bernadete de Medeiros.—Lorena, 2013.
42 p.
Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do Curso de
Graduação de Engenharia Bioquímica - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo.
1. Controle biológico. 2. Bacillus thuringiensis. 3. Proteínas Cry. 4.
Processos fermentativos. I. Medeiros, Maria Bernadete de, Orient.
Dedico este trabalho aos meus
pais, Fernando e Magali, pelo
amor incondicional e por não
medirem esforços para que eu
pudesse realizar mais este
sonho.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus.
À minha família, que sempre me apoiou e me deu estrutura para buscar meus
sonhos, especialmente meus pais, Fernando e Magali, e minha irmã Rafaela.
Ao meu namorado, Bruno, pela amizade, amor, companheirismo, incentivo,
paciência e apoio durante todos os momentos, tanto os bons quanto os ruins.
Muito obrigada por estar ao meu lado sempre!
À Dra. Maria Bernadete de Medeiros, minha orientadora, pelo carinho, atenção,
ensinamentos e conselhos. Pela dedicação e empenho durante a realização deste
trabalho.
À Ana Valéria, Ana Laura, Beatriz, Clarice e Juliana, pela amizade sincera, pelos
conselhos, pela paciência e momentos de alegria, que foram fundamentais para a
minha formação e o desenvolvimento deste trabalho.
À Andressa, Gabriella, Inara, Marcela, Renan e Vanessa, amigos de uma vida
inteira.
À Cláudia, Eleonora, Éryka, Fernanda e Ludmila, com vocês esse 5 anos
passaram muito rápido, e a graduação foi muito mais divertida.
A todos os professores da Universidade de São Paulo que contribuíram para a
minha formação.
E a todos que de algum modo colaboraram no meu desenvolvimento e formação.
“Ninguém é tão grande que não possa
aprender, nem tão pequeno que não
possa ensinar.”
Esopo
GUSMÃO, Fernanda Perini. Bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis/ Fernanda Perini Gusmão; Orientadora Maria Bernadete de Medeiros – Lorena, 2013. 42p (Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão do Curso de Graduação de Engenharia Bioquímica – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo).
RESUMO
Nos processos agrícolas, o controle de insetos é realizado, em sua maioria, por
inseticidas químicos sintéticos; cujos efeitos acumulativos ocasionam grandes
prejuízos ambientais e à saúde humana, destacando-se ainda a rápida seleção de
insetos resistentes. O controle biológico utilizando bioinseticidas é uma alternativa
eficiente, principalmente devido a sua alta especificidade, baixa toxicidade,
moderado efeito residual ao meio ambiente e não causam resistência aos insetos
alvos. A bactéria mais utilizada na síntese desses produtos é o Bacillus
thuringiensis, uma bactéria aeróbia, Gram-positiva, formadora de endósporo que
possui como característica principal a presença de inclusões cristalinas
denominadas delta-endotoxinas ou proteínas Cry. Essas proteínas podem ser
altamente tóxicas para insetos susceptíveis, entretanto não apresentam atividade
para outros organismos. Após ingestão da proteína pelo inseto, os cristais são
solubilizados no intestino médio, sob condições alcalinas, liberando protoxinas
que, em presença de enzimas digestivas, são convertidas em polipeptídeos
denominados δ-endotoxinas. Estas endotoxinas atravessam a membrana
peritrófica, ligam-se a receptores específicos localizados na membrana das
células do intestino médio, interferindo no gradiente iônico e balanço osmótico e
formando poros que aumentam a permeabilidade da membrana. O aumento na
absorção de água causa lise celular e eventual ruptura e desintegração das
células do intestino médio.
Palavras-chave: Controle biológico, Bacillus thuringiensis, proteínas Cry, processo
fermentativo.
ABSTRACT
In agriculturist processes, the insect control is accomplished, in most cases,
by chemical products of which accumulative effects cause huge damage to
environment and human health, also outstanding the fast selection of resistant
insects. The biological control through biopesticides is an efficient alternative
mainly due to its high specifically, lack of resistance on target insects, low toxicity
and low residual effect in the environment. The most used bacteria in the
synthesis of these products is the Bacillus thuringiensis, a Gram-positive bacteria,
which produces spores that are characterized by the presence of crystalline
inclusions denominated delta-endotoxine or Cry proteins. These proteins can be
highly toxic for susceptible insects and do not present activity for other organisms.
After ingestion of the protein by the insect, the middle intestine turns the crystal
soluble, under alkaline conditions, releasing protoxins that, in presence of
digestive enzymes, are converted into polypeptides named δ-endotoxins. These
endotoxins go through the peritrophic membrane, bind themselves to specific
receptors located in the membrane of cell of middle intestine, interfering in the
ionic gradient and osmotic balance, forming pores that increase the membrane
permeability. Increase in the absorption of water causes cellular burst and
eventual rupture and disintegration of the middle intestine cell.
Key-words: biological control, Bacillus thuringiensis, Cry proteins,
fermentative process.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de Bacillus thuringiensis..............14
Figura 2. Diagrama esquemático da esporulação em Bacillus thuringiensis .....15
Figura 3. Microscopia eletrônica de B. thuringiensis mostrando: (A) cristais, (B)
esporos..................................................................................................................16
Figura 4. : Cristal de cepas de Bacillus thuringiensis. (A) Forma bipiramidal da
cepa 344; (B) forma cubóide da cepa 1644...........................................................17
Figura 5. Representação esquemática da estrutura geral das δ- endotoxinas.....17
Figura 6. Esquema representativo do modo de ação das proteínas Cry de Bt....20
Figura 7. Produção comercial de Bt......................................................................26
Figura 8. Variação das UFC (unidades formadora de colônia) em relação aos
fatores que influenciam na quantidade de oxigênio dissolvido no meio de
fermentação...........................................................................................................29
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Exemplos de produtos biotecnológicos à base de δ-endotoxina de
Bacillus thuringiensis ...........................................................................................22
Tabela 2. Exemplos de plantas transgênicas expressando genes cry de Bacillus
thuringiensis ..........................................................................................................23
Tabela 3. Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de Bacillus
thuringiensis e suas concentrações .....................................................................27
SUMÁRIO
1. Objetivos..................................................................................................12
2. Introdução................................................................................................13
3. Bacillus thuringiensis...............................................................................14
3.1 Toxinas produzidas por Bacillus thuringiensis...................................18
3.2 Mecanismo de ação das proteínas Cry.............................................18
4. Processos biotecnológicos utilizando Bacillus thuringiensis......................21
5. Melhoramento de Bacillus thuringiensis.....................................................22
6. Plantas transgênicas..................................................................................23
7. Resistência às proteínas Cry.....................................................................24
8. Produção Comercial...................................................................................25
8.1 Fontes de carbono e nitrogênio.........................................................26
8.2 Sais minerais......................................................................................27
8.3 Temperatura e pH.............................................................................28
8.4 Oxigênio.............................................................................................28
8.5 Processo Fermentativo.......................................................................29
8.6 Separação das Toxinas......................................................................30
8.7 Ensaio e Formulação..........................................................................31
9. Conclusão....................................................................................................33
10. Referências.................................................................................................35
12
1. Objetivos
1.1 Objetivo Geral
O presente trabalho tem como objetivo reunir informações a respeito da
produção industrial de bioinseticidas a partir da bactéria Bacillus thuringiensis,
bem como o seu modo de ação nos insetos-alvo.
1.2 Objetivo específico
Sistemática e descrição das principais características morfológicas e
fisiológicas da bactéria entomopatogênicas, B. thuringiensis;
Cinética da síntese do bioinseticida que é associada ao processo de
esporulação da célula;
Atividade entomopatogênica do B. thurigiensis que é atribuída à
presença da proteína Cry do cristal protéico;
Modelo de ação da proteína Cry no organismo do inseto-alvo;
Descrição dos diferentes tipos de toxinas produzidas por B.
thuringiensis;
Produção industrial, por processo biotecnológico, da proteína Cry por
B. thuringiensis.
13
2. Introdução
Atualmente é intensa a utilização de agrotóxicos nos processos agrícolas. A
justificativa para o seu uso indiscriminado é atender a crescente demanda da
produção de alimentos. O controle de insetos nocivos ou não à agricultura é
realizado na sua maioria, por inseticidas sintéticos. O problema é que esses
produtos podem causar danos ao homem e ao meio ambiente, contaminando
alimentos, solo e aquíferos, além de favorecem uma rápida seleção natural de
insetos resistentes.
Uma alternativa para esses problemas é a utilização de bioinseticidas. As
vantagens do uso desses produtos são a menor toxicidade e o fato de causarem
danos somente ao inseto específico, excluindo os pássaros e mamíferos. Além
disso, os bioinseticidas podem ser utilizados em pequenas concentrações e
possuem decomposição rápida. Como consequência utiliza-se menos agrotóxico,
o que causa um baixo impacto ambiental.
Devido à alta eficiência na redução da quantidade da praga alvo e
especificidade (BRAVO et al., 2007), a utilização dos inseticidas de origem
microbiana, como substitutos aos produtos químicos, tem se tornado uma
alternativa viável para o controle de insetos-pragas das principais culturas
(PARDO-LÓPEZ et al., 2013).
As bactérias entomopatogênicas das espécies Bacillus sphaericus e B.
thuringiensis são utilizadas no controle de insetos (AZEVEDO, 1998). Atualmente
a linhagem B. thuringiensis (Bt), com ampla ação inseticida, é a mais utilizada,
existindo diversas formulações disponíveis no mercado (CASIDA; QUISTAD,
1998).
Essa bactéria é responsável por mais de 90% dos bioinseticidas disponíveis
no mercado internacional (POLANCZYK; ALVES, 2003). Estima–se que sejam
aplicados, aproximadamente 1,3 x 104 toneladas por ano de bioinseticidas, à base
de B. thuringiensis (HANSEN; SALAMITOU, 2000). Para o controle de insetos e
vetores de doenças, o grande mercado dessa bactéria está na África (NARDO;
CAPALBO, 1998). Os maiores produtores de pesticidas biológicos utilizando a
linhagem B. thuringiensis são Estados Unidos e Canadá, que respondem por
cerca de 50% da produção mundial (TAMEZ-GUERRA et al., 2001).
14
Atualmente, no Brasil, existe quatorze formulações comerciais à base de B.
thuringiensis disponíveis no mercado. As principais limitações no comércio são o
elevado custo de produção, a concorrência com os produtos químicos e a
escassez de investimento dos setores público e privado no desenvolvimento e
formulações de novos produtos. Destaca-se que o mercado nacional é carente de
competitividade, considerando que a maioria dos produtos é importada. Espera-se
que com o lançamento de produtos nacionais tão efetivos quanto os importados,
os custos globais sejam reduzidos, favorecendo a ampliação do mercado interno
(POLANCZYK, 2004).
3. Bacillus thuringiensis
Conforme Rabinovich (1997) B. thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva,
aeróbia facultativa, mesófila e quimioheterotrófica. Possui forma de bastonete
com dimensões que se aproximam de 1,1 µm por 4,0 µm de comprimento, sendo
capaz de se movimentar por meio de flagelos peritríqueos. Quando em condições
desfavoráveis a fisiologia celular, desenvolve um ciclo de esporulação típico do
gênero Bacillus, com endósporo de morfologia elipsoidal, que, localizam-se na
região central ou paracentral da célula (SERAFINI et al., 2002).
Figura 1: Bacillus thuringiensis. Micrografia obtida através de uma microscopia eletrônica de varredura em um aumento de 10.000 vezes. (LIU et al.,1994)
15
As bactérias formadoras de endósporos pertencem em sua maioria à família
Bacillacea, incluindo cinco gêneros: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium,
Desulfotomaculum e Sporosarcina. O gênero aeróbio Bacillus é o maior, seguido
pelo anaeróbio Clostridium. (LIU et al., 1994)
A cinética da síntese dos endósporos é resumida de acordo com as fases de
esporulação convencionais: estágio I - formação do filamento axial, estágio II -
formação do septo do pré-esporo; estágio III – invaginação da membrana e
citoplasma e formação do pré-esporo; estágios IV a VI - formação de exoesporo,
parede celular primordial, córtex, capa dos esporos acompanhadas da
transformação do nucleóide, e estágio VII - maturação de esporos e lise dos
esporângios. Para B. thuringiensis um evento adicional, que não ocorre
normalmente em outros bacilos, é a formação de um cristal parasporal proteico,
que é visível na fase III de esporulação e, algumas vezes é acompanhada por
uma inclusão ovóide de função desconhecida. (BECHTEL; BULLA, 1976).
Figura 2: Diagrama esquemático da esporulação em Bacillus thuringiensis (BECHTEL; BULLA,1976)
A atividade entomopatogênica do B. thuringiensis é devido à presença de
inclusões cristalinas denominadas delta–endotoxinas ou proteínas Cry, que são
sintetizadas durante o processo de esporulação da célula, tendo início na fase III
16
e conclusão no final da esporulação. O cristal é identificado no compartimento da
célula mãe e corresponde a aproximadamente 25% do peso seco da célula
(AGAISSE; LERECLUS, 1995) (Figura 3). Estas inclusões cristalinas contêm uma
ou mais proteínas Cry, com um amplo espectro de ação, que apresenta atividade
para as seguintes ordens de insetos Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera,
Coleoptera como também para os nematóides, ácaros e protozoários (SCHNEPF
et al., 1998).
Figura 3: Microscopia eletrônica de B. thuringiensis mostrando: (A) cristais, (B) endósporos (LIMA, 2010)
Estas toxinas são codificadas por genes Cry e sua toxicidade está ligada à
região N-terminal das cadeias polipeptídicas, enquanto a porção C-terminal
determina a forma da estrutura do cristal (LI et al.,1991). O cristal proteico pode
apresentar as seguintes formas: bipiramidal, esféricos, retangulares, cubóides e
irregulares (Figura 4). Os cristais bipiramidais apresentam uma maior frequência
de toxicidade do que os outros tipos. (TYRELL et al., 1981).
17
Figura 4: Morfologia dos Cristais da linhagem de Bacillus thuringiensis. (A) Bipiramidal da
cepa 344; (B) Cubóide da cepa 1644 (VALICENTE; SOUZA, 2004).
A porção amino-terminal contém até cinco blocos altamente conservados,
distribuídos em três domínios claramente definidos: o domínio I, equipado para a
formação de poros em membranas; o domínio II, que aparentemente confere a
especificidade de ligação aos receptores celulares e o domínio III, que participa
principalmente da manutenção da estrutura das moléculas (Figura 5) (SERAFINI
et al., 2002).
Figura 5: Representação esquemática da estrutura geral das δ-endotoxinas, evidenciando a posição dos blocos conservados na extensão da proteína e os domínios presentes na porção N-terminal (SERAFINI et al., 2002).
18
3.1 Toxinas Produzidas por Bacillus thuringiensis
A bactéria B. thuringiensis produz além das proteínas Cry, várias toxinas
com diferentes atividades inseticidas dentre as quais a α e β – exotoxina.
A α–exotoxina é uma enzima com atividade citolítica que age sobre os
fosfolipídeos presentes na membrana celular dos insetos. É termolábil, solúvel em
água, sendo altamente tóxica para alguns insetos. Também conhecida como
fosfolipase C, lecitinase ou fosfatidilcolina fosfohidrolase (HANSEN; SALAMITOU,
2000).
A β-exotoxina, também chamada de Thuringiensina, é produzida durante a
fase vegetativa da célula e secretada no meio de cultura. É termolábil, com baixa
massa molecular. Existem dois tipos de β–exotoxinas: a toxina tipo I que é um
análogo de ATP, composto por adenina, ribose, glicose e ácido fosfoalárico
(FARKAS et al., 1969). Sua atividade tóxica está relacionada com a inibição da
RNA polimerase através da competição com ATP, apresentando um amplo
espectro de toxicidade para várias ordens de insetos, ácaros, nematóides como
também vertebrados, provocando efeitos teratogênicos e mutagênicos (HANSEN;
SALAMITOU, 2000). A toxina do tipo II é um análogo de UTP, sendo mais tóxica
do que a do tipo I, principalmente para insetos da ordem Coleoptera (LEVINSON
et al., 1990). Devido a sua alta toxicidade aos mamíferos, um dos critérios
indispensáveis em alguns países para a produção comercial é a seleção de
linhagens de B. thuringiensis, que não produzam essa toxina (McCLINTOCK et
al., 1995).
3.2 Mecanismo de ação das proteínas CRY
Após ingestão do complexo do B. thuringiensis pela larva do inseto
susceptível, os cristais são solubilizados no intestino médio sob condição de um
pH alcalino, verifica-se a liberação das protoxinas que, em presença de algumas
19
enzimas digestivas, são convertidas no mínimo em 4 ou mais polipeptídeos
tóxicos denominados de δ-endotoxinas.
As δ-endotoxinas ativas ligam-se com exclusividade e com elevada afinidade
a receptores específicos do epitélio do intestino. Essas identidades são fatores
decisivos para a toxicidade e especificidade das δ-endotoxinas produzidas por B.
thuringiensis (SERAFINI et al., 2002).
Na fase seguinte, as toxinas hidrolisadas atravessam a membrana
peritrófica, ligam-se a receptores específicos localizados na membrana apical das
células colunares do intestino médio, interferindo no gradiente iônico e balanço
osmótico da membrana apical e formando poros que aumentam a permeabilidade
da membrana. O aumento na absorção de água causa lise celular e eventual
ruptura e desintegração das células do intestino médio (COPPING; MENN, 2000).
Uma vez que o funcionamento do intestino médio é interrompido, ocorre uma
redução do pH do fluído intestinal conjuntamente com uma liberação de
nutrientes, os quais criam condições para a germinação dos endósporos de B.
thuringiensis e para a multiplicação de suas células vegetativas. Este, por sua
vez, invade os tecidos larvais do inseto que, eventualmente, interrompe sua
alimentação e consequentemente ocorre a morte celular. (MONNERAT; BRAVO,
2000). A Figura 6 apresenta um esquema do modo de ação da delta-endotoxina
produzida por B. thuringiensis ao ser ingerida por um inseto na forma larval.
20
Figura 6: Modo de ação da proteína Cry. (a) Liberação da protoxina a partir do cristal proteico, e
modificações ocasionadas por meio das proteases no intestino. (b) Inserção das moléculas da toxina ativa na
membrana. (c) Agregação e formação do poro, mostrando uma seção transversal do poro. (d) Formação do
poro hexagonal que provoca um fluxo de água e cátions, bem como uma perda de ATP, resultando em um
desequilíbrio e lise celular. (PRESCOTT et al., 2005)
21
Knowles (1994) descreve em quatro etapas a ação de B. thuringiensis sobre
os insetos:
1. Aumento da absorção de glicose e início dos sintomas histopatológicos (1-5
minutos);
2. Paralisia do intestino médio, cessa a alimentação, membrana apical
permeável, aumento do volume e formação de vesículas nas células,
aumento do pH da hemolinfa e redução do pH do lúmen (5-10 minutos);
3. Aumento do fluxo e concentração de K+ da hemolinfa, diminuição do
transporte de glicose e leucina para a hemolinfa, colapso metabólico
celular (10-30 minutos);
4. Lise celular e ruptura da membrana basal, paralisia geral ocorre em 1 a 7
horas; morte por falta de alimento ou septicemia (1-3 dias)
4. Processos biotecnológicos utilizando Bacillus thuringiensis
A intensa utilização do B. thuringiensis se deve a inúmeras vantagens
oferecidas por esses produtos, como: métodos bem estabelecidos de produção
em fermentadores, utilização dos mesmos equipamentos usados para aplicação
de inseticidas químicos, baixo custo para o desenvolvimento de produtos,
inocuidade a mamíferos, amplo espectro de ação com alta especificidade e
reduzida seleção de resistência em insetos.
Baixa persistência do cristal no meio ambiente, a necessidade de aplicações
recorrentes e a incapacidade de acesso a determinadas partes da planta são
algumas desvantagens do uso do Bt no controle biológico. Para superá-las, a
utilização de diferentes processos biotecnológicos visa aumentar o espectro
altamente específico das linhagens de B. thuringiensis, possibilitando o controle
de um número maior de espécies a partir de um único produto formulado,
prolongar a persistência da bactéria no campo, reduzindo o número de novas
aplicações, desenvolver estratégias para superar uma possível seleção de insetos
22
resistentes, dentre outras (SERAFINI et al., 2002). Na Tabela 1 estão listados
alguns exemplos desses produtos.
Tabela 1 – Exemplos de produtos biotecnológicos à base de δ-endotoxina de Bacillus thuringiensis, com linhagens de Bt modificadas (SERAFINI et al., 2002).
Produto EMPRESA Inseto-alvo
Condor
Cutlass
Raven
Ecogen
Ecogen
Ecogen
Larvas de Lepidópteros
Larvas de Lepidópteros
Larvas de Coleópteros
5. Melhoramento de Bacillus thuringiensis
O desenvolvimento de linhagens modificadas geneticamente com atividade
otimizada contra um dado inseto-alvo ou com um espectro de atividade mais
amplo, teve inicio com o processo de conjugação (SERAFINI et al., 2002).
Posteriormente, o melhoramento de linhagens de B. thuringiensis se deu
pelo desenvolvimento de métodos eficientes de transformação por eletroporação
(LERECLUS et al., 1989) e otimização de vetores (ARANTES; LERECLUS, 1991;
LERECLUS; ARANTES,1992), o que permitiu o aproveitamento da grande
diversidade de genes Cry, introduzindo novos genes numa única linhagem,
permitindo a expansão do espectro de controle, bem como o melhoramento da
atividade inseticida pela ação sinérgica entre algumas proteínas. (SERAFINI et
al., 2002).
O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, a clonagem e o
sequenciamento de diversos genes Cry, a determinação da estrutura e do modo
de ação das δ-endotoxinas permitiram a manipulação das proteínas Cry, para um
aumento na toxicidade. Alterações nos domínios, utilizando a técnica de
mutagênese dirigida, geraram aumentos na toxicidade de até 32 vezes
(RAJAMOHAN et al., 1996). Os resultados mais interessantes foram conseguidos
alterando-se os domínios I e II, por meio de mutações simples ou múltiplas, com
23
consequências no aumento da eficiência como também na irreversibilidade da
ligação da toxina aos receptores de membrana do intestino do inseto. (SERAFINI
et al., 2002).
6. Plantas transgênicas
A obtenção de plantas transgênicas resistentes a insetos, conferida pela
presença dos genes Cry, é uma tecnologia recente, cuja utilização se apresenta
como uma alternativa para o controle de insetos nocivos, oferecendo
especificidade ao inseto-alvo, apresentando biodegradação rápida, independência
das condições meteorológicas, proteção a tecidos inacessíveis ao controle
convencional, e redução da quantidade de toxina no meio ambiente. (SERAFINI
et al., 2002).
Atualmente, existem mais de 20 espécies de plantas expressando genes Cry
de B. thuringiensis, sendo que alguns exemplos estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Exemplos de plantas transgênicas expressando genes Cry de Bacillus thuringiensis
Proteína Cristal Insetos-alvo Plantas transformadas
Cry1A; Cry1B;
Cry1C, Cry1H
Lepidópteros Álamo, alfafa, algodão,
arabidopsis, arroz, batata,
brócolis, maçã, milho, pêra,
repolho, soja, tabaco, tomate,
videira
Cry2Aa Lepidópteros Algodão, milho
Cry3A Coleópteros Batata, tabaco
Cry6A Coleópteros Alfafa
Cry9C Lepidópteros Milho
Não - especificada Pêra, cana-de-açucar
Fonte: USDA/APHIS Biotechnology Permit Database (http://www.aphis.usda.gov/bbep/bp/)
24
Uma estratégia que otimiza a segurança dessas plantas é o uso de
promotores que induzem a expressão dos genes Cry somente nas regiões da
planta que são susceptíveis aos insetos-alvo como, por exemplo, promotores
específicos de floema para genes Cry, que codificam proteínas tóxicas a insetos
sugadores de floema, como é o caso dos afídios. (SERAFINI et al., 2002). A
inserção de genes Cry de B. thuringiensis, no DNA nuclear de plantas, leva a
baixos níveis de expressão, principalmente pelas diferenças consideráveis
existentes entre os sistemas de expressão gênica dos organismos procariontes e
os das plantas.
Atualmente, a maioria das plantas transgênicas contendo genes Cry
apresenta genes de resistência a antibióticos para a seleção, ou seja, que
permitem a separação das células, portanto os genes de interesse daquelas não-
transformadas.
A obtenção de plantas transgênicas vem evoluindo no sentido de serem
produzidas plantas mais efetivas no controle das espécies-alvo, com maior
espectro de atividade para o controle não só da praga principal, mas também, das
pragas secundárias e plantas capacitadas a contornar possíveis resistências dos
insetos. (SERAFINI et al., 2002).
7. Resistência às proteínas Cry
Após anos da utilização de produtos à base de endósporos e cristais de B.
thuringiensis como bioinseticidas, insetos resistentes foram detectados somente
em algumas populações de Plutella xylostella, apresentando um aumento de
resistência de, no máximo, 30 vezes (TABASHNIK et al., 1994).
Os mecanismos de resistência podem envolver a não ligação da toxina aos
receptores da BBMV (Brush Border Membrane Vesicles), incapacidade de criar
poros na membrana do epitélio e a sua baixa eficiência pela rápida reparação dos
danos causados pela toxina nas células infectadas (FERRÉ; RIE, 2002;
MACHADO; FIUZA, 2010).
Em estudos realizados em laboratório, sob intensa pressão de seleção,
foram obtidos altos níveis de resistência a diferentes toxinas de B. thuringiensis. A
25
utilização dessa técnica é importante para permitir o estudo de mecanismos de
resistência e para promover estratégias para superá-la antes mesmo que ela
apareça no campo. Entretanto, a resistência obtida em laboratório não é
comparável à obtida na natureza, pois populações de insetos mantidas em
laboratório são geneticamente isoladas, tendo menor variabilidade do que as
populações naturais. No campo, podem ocorrer fatores que contra-selecionam os
insetos resistentes, como: fertilidade, viabilidade e diluição do gene da resistência
por cruzamento com insetos susceptíveis, além da ocorrência de inimigos naturais
que podem retardar o aparecimento de insetos resistentes (SERAFINI et al.,
2002).
8. Produção industrial
A aplicação de patógenos como inseticidas requer grandes quantidades do
agente ativo, consequentemente, sua produção deve ser relativamente fácil. A
produção depende do microrganismo entomopatogênico se desenvolver em meio
artificial ou não. Se ele crescer em meio artificial (in vitro) poderá ser produzido
em larga escala, utilizando-se as modernas técnicas de fermentação. Por outro
lado, se o patógeno se reproduzir apenas in vivo, faz-se necessário o hospedeiro
vivo, ou um organismo alternativo para multiplicação (PARRA, 1986).
A bactéria Bacillus thuringiensis cresce em diferentes meios de cultura em
escala de bancada. Com a produção industrial em massa, altas densidades
celulares foram produzidas com taxas de esporulação de mais de 90%
(BERNHARD; UTZ, 1993). As principais etapas para a produção de B.
thuringiensis são: seleção da linhagem, estocagem, processo fermentativo,
recuperação do princípio ativo (endósporos e cristais), formulação e análise da
qualidade do produto (MORAES et al. 2001; COUCH, 2000).
Segundo Dulmage (1989), é devido a mudanças nos nutrientes do meio e
nas condições de cultivo que se obtém o incremento na quantidade de delta-
endotoxina no meio. É importante entender que a quantidade de delta-endotoxina
é independente do número de endósporos. Contagens de endósporos apenas
26
indicam o crescimento do bacilo, a única maneira de quantificar a delta-
endotoxina é através da técnica de bioensaios (DULMAGE, 1989).
Pode-se esquematizar a produção industrial de B. thuringiensis por processo
submerso ou semi-sólido, conforme o seguinte diagrama:
Figura 7: As etapas da produção comercial de B. thuringiensis. (LIMA et al., 2001)
8.1 Fontes de carbono e nitrogênio
Nos cultivos com B. thuringiensis há necessidade de altos níveis de carbono,
nitrogênio e oxigênio. A fonte de carbono além de ser utilizada como substrato
para a síntese de compostos celulares é uma fonte de energia. Com o aumento
27
da concentração de carbono aumenta a biomassa e a quantidade de cristal, mas
não interfere nas atividades biológicas. Já a mudança da fonte de carbono
propicia alterações nas velocidades de formação de toxinas e mudanças nas
principais características bioativas do B. thuringiensis (LIMA et al., 2001). O
nitrogênio é requerido principalmente para síntese dos aminoácidos das proteínas
como também dos ácidos nucléicos.
Para a produção de B. thuringiensis, fatores como viabilidade e custo são
importantes para a seleção de um meio de produção em escala industrial.
Portanto, matérias-primas como farelo de soja, água de maceração de milho
(milhocina), melaço, farelo de semente de algodão, farelo de feijão, caseína e
farinha de peixe são utilizados (BERNHARD; UTZ, 1993). Couch (2000) cita os
principais componentes e suas concentrações utilizadas no cultivo de B.
thuringiensis na América do Norte (Tabela 3).
Tabela 3. Principais componentes utilizados em meios de cultivo de Bacillus thuringiensis e suas concentrações (COUCH, 2000)
8.2 Sais minerais
São necessários também sais inorgânicos para o crescimento de bactérias,
tais como cálcio, zinco, manganês e magnésio. O balanço adequado de sais
28
minerais auxilia no equilíbrio do pH do meio de fermentação, o que é de extrema
importância na produção e posterior recuperação e estabilidade da toxina, ou
produto final desejado (DULMAGE, 1993). O cálcio, segundo Dulmage; Rhodes
(1973) é necessário para a termoestabilidade dos endósporos de B. thuringiensis,
enquanto que o manganês é requerido para a esporulação.
Sikdar et al. (1991), estudando o efeito de alguns minerais sobre o
crescimento de B. thuringiensis, verificaram que as concentrações ótimas de
minerais para o crescimento e produção de endotoxinas são diferentes, não
havendo relação entre crescimento celular e produção de toxina. Entre os
elementos estudados (potássio, magnésio, cálcio, ferro, cobre e molibdênio),
apenas o molibdênio provocou inibição.
8.3 Temperatura e pH
Segundo Bernhard (1993), o Bacillus thuringiensis tem seu crescimento
ocorrendo na faixa de pH entre 5,5 a 8,5, sendo a faixa ótima entre 6,5 e 7,5. A
temperatura ideal para o crescimento de Bt é entre 26°C e 37°C (LIMA et al.,
2001), tendo a capacidade de crescer numa faixa de 15°C até 45°C.
8.4 Oxigênio
Avignone-Rossa et al. (1992) observaram a influência do oxigênio sobre a
formação de endotoxinas de Bt. Apesar da esporulação e síntese de endotoxinas
serem ambas intensamente afetadas pelo suprimento de O2, uma vez iniciada a
esporulação ela será completada, mesmo que o fornecimento de oxigênio seja
interrompido. Entretanto, a síntese de endotoxina é afetada por tal interrupção e
apenas uma fração do rendimento esperado será atingida. Assim, o oxigênio deve
ser continuamente suprido se for desejado atingir um alto rendimento.
Tianjian et al. (1993) demonstra a influência dos diversos fatores que
promovem a dissolução do oxigênio no meio de fermentação. A figura 8 mostra
29
essas relações e sua influência sobre a concentração de células no meio
fermentado.
Figura 8: Relação entre UFC (unidades formadora de colônia) e cada um dos quatro fatores que influenciam na quantidade de oxigênio dissolvido no meio de fermentação. (TIANJIAN et al.,
1993)
8.5 Processo fermentativo
A maneira mais comum de produção de B. thuringiensis é por fermentação
submersa descontínua, também conhecida como processo em batelada. Nesta
fermentação, um recipiente contendo meio de cultura líquido é inoculado com o
microrganismo, não havendo acréscimo ou retirada significativa do meio
fermentado. Portanto, ocorre todo o desenvolvimento da cultura, sendo retirado o
produto apenas no final do processo. Em geral, as proteínas Cry de B.
thuringiensis são formadas no fim da fermentação, quando as condições do meio
se tornam desfavoráveis, sendo o processo em batelada satisfatório para tal
produção (MORAES et al. 2001).
Outro processo que vêm sendo bastante explorado é o processo de cultivo
em estado sólido (CES), que é o processo de cultivo no qual o microrganismo
cresce na ausência de água livre no meio de cultura. Água livre é a água não
30
absorvida pelo substrato sólido devido à sua saturação, sendo, portanto, mais
uma função do poder de absorção deste do que do conteúdo de umidade contido
no meio. Para a maioria dos substratos, a presença de água livre é evidente
quando alcançado um teor de 80% de umidade (HESSELTINE, 1972; LONSANE
et al, 1985).
Conforme Cannel; Moo-Young (1980), o processo CES apresenta uma série
de características extremamente interessantes e vantajosas, quando comparado
com o clássico processo de cultivo submerso (CS): redução do volume de meio
por massa de substratos sem perda no rendimento do produto, com consequente
redução do espaço ocupado pelo equipamento, composições dos meios de
fermentação normalmente simples, baixo consumo de energia, baixo custo das
instalações e tratamentos finais simplificados. Contudo, há a necessidade de
volumes relativamente grandes de inóculo, pouca disponibilidade de dados de
engenharia para ampliação de escala e difícil acompanhamento e controle do
processo de cultivo devido à heterogeneidade da massa sólida.
8.6 Separação das toxinas
Ao final da fermentação, a cultura de B. thuringiensis apresenta em média 6
a 8% de sólidos, sendo que os endósporos e cristais podem corresponder até a
metade deste total. Há vários métodos que podem ser utilizados para a
recuperação destes cristais e esporos, sendo a centrifugação e a micro-filtração
os mais comuns. É importante ressaltar que tais processos permitem a
recuperação principalmente das proteínas Cry. Muitas outras toxinas que podem
contribuir para a toxicidade final do produto são perdidas. Atualmente novas
técnicas de recuperação e/ou concentração do produto estão sendo
desenvolvidas para complementar as mais utilizadas, destacando-se: a liofilização
e a flotação (BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).
Qualquer que seja a forma de separação desejada ou possível, ela
envolverá etapas de purificação e concentração do mosto fermentado, uma vez
que este contém água, remanescente do meio de cultura (sólidos e material
31
dissolvido), fragmentos celulares, os endósporos e cristais. Essa separação é
outra etapa crítica no desenvolvimento do processo produtivo, pois nela a
potência do produto pode ser reduzida, caso o desenho aplicado à separação não
seja adequado (BRYANT, 1994).
8.7 Ensaio e Formulação
Os produtos de Bt poderão conter três princípios ativos (endósporo, cristal e
exotoxina) necessitando de biotestes: contagem de endósporos (método
presuntivo) e bioensaios com insetos (conclusivo), para determinar a potência do
produto. A contagem de endósporos ou de cristais como único método, não tem
relação com a atividade da toxina, uma vez que o processo de obtenção pode
modificar a atividade dos componentes tóxicos (HEIMPEL; ANGUS, 1963).
O meio fermentado deve ser estabilizado antes de ser utilizado, de forma a
não perder a potência. Assim, a remoção de fragmentos celulares e compostos
intermediários da fermentação que podem “desativar” o composto tóxico, é feita
através de lavagens e centrifugações sucessivas da biomassa com soluções de
pH controlado (entre 7 e 8) permitindo a limpeza e estabilização das unidades
tóxicas. Ao mesmo tempo, a redução do líquido em que esteve suspensa a
biomassa, aumenta a potência do caldo total. O controle de qualidade é vital
durante esse procedimento, pois minimiza variações inevitáveis que podem
ocorrer com o processo biológico (BRYANT, 1994).
De acordo com normas nacionais e internacionais (TOMPKINS et al, 1990;
NARDO et al, 1995), um pesticida para ser registrado necessita apresentar
resultado oficial de dosagem de ingrediente ativo. Nos Estados Unidos
estabeleceu-se em 1971 o uso de Unidades Internacionais (UI) para expressar a
potência dos produtos à base de Bt, sendo para isso necessária uma preparação
padrão. A primeira preparação fornecida pelo Instituto Pasteur, na França foi
designada E-61, continha B. thuringiensis, e sua potência verificada em bioensaio
contra Trichoplusia ni, foi atribuído o valor arbitrário de 1000 UI/mg.
32
Os bioensaios de padronização podem ser realizados segundo protocolos da
Organização Mundial de Saúde (OMS) ou do Departamento de Agricultura dos
Estados Unidos (USDA). Com o surgimento de variedades ativas contra outros
insetos, as normas de registro estão sendo revisadas, sendo que se observa nos
rótulos atualmente as Unidades Internacionais acompanhadas da % em peso do
ingrediente ativo (esporo + cristal) (TOMPKINS et al. 1990; DULMAGE, et al.
1990).
Existe a impossibilidade de se ter inseto padrão internacional, por
dificuldades da legislação de alguns países que exigem quarentena. Por outro
lado, é questionável se é melhor usar um inseto teste ou vários, a fim de se obter
uma útil complementação de informações. Além, disso para se obter resultados
reprodutivos, é necessário ter uniformidade dos insetos (idade e peso), constância
de fatores climáticos e quantidade de alimento administrado.
33
9. Conclusão
Com o crescimento do conceito de sustentabilidade, o uso de bioinseticidas
tem sido cada vez mais uma alternativa ao uso de inseticidas químicos. Menor
toxicidade, especificidade ao inseto-alvo, rápida decomposição, baixo impacto
ambiental e o fato de não causarem danos a pássaros e mamíferos são algumas
das vantagens desses produtos.
Bacillus thuringiensis é o microrganismo mais utilizado na produção de
bioinseticidas. Trata-se de uma bactéria Gram-positiva, aeróbia facultativa,
mesófila e quimioheterotrofica. Possui forma de bastonetes e, quando em
condições desfavoráveis desenvolve um ciclo de esporulação. O que diferencia o
ciclo de esporulação do Bt das demais bactérias formadoras de endósporo é a
síntese de um cristal proteico que contêm a proteína Cry que, por sua vez, é
responsável pela atividade inseticida do Bt.
O cristal proteico, uma vez ingerido pela larva do inseto susceptível, é
hidrolisado, em condições alcalinas, no intestino médio, liberando protoxinas que
em presença de enzimas digestivas, são convertidas em delta-endotoxinas. Essas
toxinas se ligam a receptores específicos na membrana das células do intestino,
interferindo no gradiente iônico e balanço osmótico da membrana apical e
formando poros que aumentam a permeabilidade da membrana. O aumento na
absorção de água causa lise celular e eventual ruptura e desintegração das
células do intestino médio, levando o inseto à morte.
As inúmeras vantagens do uso de bioinseticidas levaram ao interesse na sua
produção em escala industrial. As principais etapas para a produção de B.
thuringiensis são: seleção da linhagem, estocagem, processo fermentativo,
recuperação do princípio ativo (endósporos e cristais), formulação e análise da
qualidade do produto. A maneira mais comum de produção de B. thuringiensis é
por fermentação submersa descontínua, também conhecida como processo em
batelada. Geralmente, as proteínas Cry são formadas no fim da fermentação,
quando as condições do meio se tornam desfavoráveis e levam à formação do
endósporo. Dessa forma, o processo em batelada é satisfatório para a produção.
34
Outro processo bastante explorado é o processo de cultivo em estado sólido,
que é o processo de cultivo no qual o microrganismo cresce na ausência de água
livre no meio de cultura.
Para a produção de Bt são necessários altos níveis de carbono, nitrogênio e
oxigênio. A fonte de carbono além de ser utilizada como substrato para a síntese
de compostos celulares é uma fonte de energia. O nitrogênio, por sua vez, é
requerido principalmente para síntese dos aminoácidos das proteínas como
também dos ácidos nucléicos. Os valores ideais de temperatura e pH variam na
faixa de 26 a 37ºC e 6,5 a 7,5, respectivamente.
Apesar das inúmeras vantagens do uso de bioinseticidas em relação aos
inseticidas químicos, o Brasil ainda não é um grande produtor desses produtos.
Isso é decorrente do elevado custo de produção, a concorrência com os
inseticidas químicos e a escassez de investimento dos setores público e privado
no desenvolvimento e formulações de novos produtos. Destacando-se ainda que
o mercado nacional é carente de competitividade, considerando que a maioria dos
bioinseticidas são importados. Para reverter essa situação, espera-se um maior
investimento em pesquisa e desenvolvimento por parte dos setores públicos e
privados, resultando no lançamento de produtos nacionais tão efetivos quanto os
importados, dessa forma os custos globais serão reduzidos, favorecendo a
ampliação do mercado interno. Assim, o Brasil poderá fazer frente aos grandes
produtores como Estados Unidos e Canadá, que respondem por cerca de 50% da
produção mundial.
35
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