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ライトサイクラー簡易マニュアルLightCycler Software Ver.3.5

更新日: 2002年06月


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機器の起動方法機器の起動方法

①ライトサイクラー本体のスイッチをオンにします。

電源コード差込口の左側にあります。

<本体背面部>

②コンピュータのスイッチをオンにしてください。

Windows NTが自動的に起動されます。

③Windows NTにログオンします。

Ctrl + Alt + Delete を同時に押します。

ユーザー名とパスワードを入力してください。

④ LightCycler 3 Front Screen アイコンをダブルクリックし、フロント画面を起動してください。


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LCLCソフトウェア操作方法ソフトウェア操作方法

まずデスクトップ上の「LightCycler3 Front」アイコンをダブルクリックすると、上図のような画面が現れます。このライトサイクラーのフロント画面では、ボタンあるいはメニューバーを通じて主なソフトウェアモジュールにアクセスすることができます。

RUNプログラミングおよびランモジュールを開き、プロトコールのプログラミングやランの開始を行います。

Data AnalysisLightCycler Data Analysisモジュールを開き、ランで取得したデータを解析します。

•ランプロフィールを見る•定量の実行•融解曲線分析の実行

Edit Graphics DefaultsGraphic Defaultモジュールを開き、グラフに表示される線種や色を編集します。

Log On As Different Userシステムをシャットダウンし、別のユーザーとしてログオンし直します。

LightCycler Data File Editor (オプション)Data File Editorモジュールを開き、ラン後のサンプル特性を変更することができます。メニューバーからのみ開きます。


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プログラミングとランの実行プログラミングとランの実行

ライトサイクラーのプログラミング及び実験の開始を行うときは、フロント画面で「RUN」ボタンをクリックします。

プログラミング画面が開き、コンピュータがライトサイクラーとの接続状態を確認します。

ダイアログボックスが現れ、セルフテスト（1-2分間）を実行するかどうかを問われます。

実行する =Start Selftest実行しない =Skip Selftest

このセルフテストでは装置本体と通信機能が制御されます。セルフテストは一日に一度実行することを推奨します（例: その日の最初のランで実行する）。リッド（蓋部）を閉じ、サンプルカローセルからキャピラリーを取り除いて実行してください。

以下のプログラミング画面より、プロトコールを作成または呼び出します。


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プログラミングについてプログラミングについて

ライトサイクラーでPCRの実験プロトコールを作成する場合、1プロトコール当り通常3-5つのプログラムを組みます。

■PCRSYBR Green I実験

1. 初期変性2. 増幅（ PCR反応）3. メルティングカーブ4. チャンバーの冷却

ハイブリダイゼーションプローブ実験

1. 初期変性2. 増幅（ PCR反応）3. チャンバーの冷却

※変異検出実験の場合、PCRの後にメルティングカーブが必要です。

■1-ステップ RT-PCRSYBR Green I実験

1. RT反応2. 初期変性3. 増幅（ PCR反応）4. メルティングカーブ5. チャンバーの冷却

ハイブリダイゼーションプローブ実験

1. RT反応2. 初期変性3. 増幅（ PCR反応）4. チャンバーの冷却

※変異検出実験の場合、PCRの後にメルティングカーブが必要です。

本マニュアルでは、SYBR Green Iを用いたPCRのプロトコール作成例を基に、操作方法を解説しています。


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プログラミング画面（プロトコールの作成プログラミング画面（プロトコールの作成//呼出し）呼出し）

プロトコールファイル名を入力または選択します。

リスト中から任意のファイルを選び、「開く」ボタンをクリックします。

以前に作成したプロトコールを呼び出したいときは「Open Experiment File」ボタンをクリックします。

以前に作成したプロトコールを呼び出したいときは「Open Experiment File」ボタンをクリックします。

新規にプログラミングする場合は、「New Experiment」ボタンをクリックします。

新規にプログラミングする場合は、「New Experiment」ボタンをクリックします。

実験のタイトル、すなわち温度条件のプログラムファイル全体の名前を入力し、「Save」ボタンを押します。

もしプロトコールに変更が必要なら…


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実験プロトコールのプログラミング（初期変性）実験プロトコールのプログラミング（初期変性）

実験のタイトルが保存されると下図のような画面が表示されます。

第1ステップとして、初期変性のプログラムを入力しますので「Denature」等と名前を付けておきます。名前を入力したら「OK」ボタンを押します。

まず初期変性に関するパラメータを入力します。

プログラムした各ステップの温度条件がシミュレート表示されます。

第二目標温度[Secondary Target Temperature]に各サイクル何℃ずつ[Step Size(℃）]、何サイクル目[Step Delay (Cycles)]より近づけていくかを入力しま

す。タッチダウンPCR等のパラメータです。

通常は何も変更しません。

初期変性は特別な事情が無い限り、95℃、1分（60secと入力）、20℃/secと入力します。抗Taq抗体使用時も

同様です。FastStart DNAポリメラーゼ使用時は、95℃、10分（600secと入力）、20℃/secと入力します。


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実験プロトコールのプログラミング（実験プロトコールのプログラミング（PCRPCR反応）反応）

「Add」ボタンを押し、ＰＣＲプログラムを作成します。

－重要－SYBR Green Ⅰ法では右図のよ

うに伸長反応のステップで「SINGLE」を選びます。HybProbe法ではアニーリングのステップで「SINGLE」を選びま

す。

Analysis Mode定量を行う場合は「Quantification」

を選びます。

温度条件を、上から変性、アニーリング、伸長反応の順で入力します（ここで示すのは一例です）。

<パラメータ入力例>

「Ins」ボタンでカラムを増やします。ここでは3ステップのPCRの例を示しますので3個のカラムを作成しま

す。

測定ポイントにはマークがつきます。

次のステップはPCRの温度条件をプログラミングしますので、「PCR」等と入力し、「OK」ボタンを押します。


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実験プロトコールのプログラミング（融解曲線分析）実験プロトコールのプログラミング（融解曲線分析）

「Add」ボタンを押し、融解曲線プログラムを作成します。（SYBR Green I検出およびHybProbeによる変異解析時）

「Add」ボタンを押します。次に、融解曲線分析を行う場合は、その温度条件をプログラミングします。「Melting」等と入力し、「OK」ボタンを押します。


融解曲線分析を行う場合はAnalysis Modeは「Melting Curves」を選びます。

蛍光検出ポイントは緑色に表示されます。

温度条件を、上図のように入力します。温度上昇開始温度はアニーリング温度 + 5～10 ℃に設定します。融解曲線分析はSYBR Green Iフォーマットの時に行います。95℃への温度上昇は通常0.1℃/sec程度で行います。温度上昇中に連続的に蛍光を検出取得させるため「Acquisition Mode」は「CONT」を選択します。


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実験プロトコールのプログラミング（冷却）実験プロトコールのプログラミング（冷却）

最後に、ライトサイクラーを冷却するために「Cooling」のステップを作成します。入力後「OK」ボタンを押します。

「Add」ボタンを押します。


温度条件を、このように入力します。室温より高めの40℃で、30秒間保持

するように入力します。

最後に左図の画面でプログラムが予定通り入力できたかどうかチェックして下さい。


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実験プロトコールのプログラミング（表示実験プロトコールのプログラミング（表示//ゲインゲイン//セーブ）セーブ）

SYBR Green I HybProbe(LC-Red640)

HybProbe(LC-Red705)

F1 F2 F31 1 1

「Display Mode」は使用する検出フォーマットにより

設定を変更します。この設定は実験中、終了後でも変更可能です。

プログラミングが完全に終了したら「Save Experiment File」ボタンを

押します。この温度条件ファイルはProtocolファイルに一番最初に命名した（ここでは「Roche991202」）として

保存されます。

変更後に上書き保存する場合は「Save Experiment File」ボタンを

押します。違う名前で保存したい場合はメニューバーの「File」→「Save As…」で保存することがで

きます。


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RUNRUN画面における温度条件のプログラミング画面における温度条件のプログラミング（その他）（その他）

他のプロトコールファイルより温度条件プログラムの一部もしくは複数を引用することができます。

まず「Import」ボタンを押します。引用したいプロトコールファイルを選択し「Open」ボタンを押します。

選択されたプログラム（ここでは「Cooling」）

の下に引用したプログラムが導入されます。

「Move UP」ボタンで挿入したい位置に

ファイルを移動します。

「Remove」ボタンで不必要なファイル

を削除します。

引用したいプログラムファイルを選択します。「OK」ボタンを押します。


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サンプルリストの作成サンプルリストの作成

サンプルリストを作るときは、「Edit Samples」ボタンをクリックします。

－参考までに－入力したサンプルリストはファイルとして保存可能です。[File] →[Save as…] で保存してください。[File] →[Open …] で開いてください。

サンプル名を入力してください(25文字以内)。

サンプルをタイプ別に振分けます。項目は以下の通りです。

Negative: ネガティブコントロールPositive: ポジティブコントロールStandard: 外部標準Unknown: 未知サンプル

外部標準(スタンダード)の濃度(数値のみ)を入力します。

あるサンプル条件のレプリカ(複製)を作ります。Duplicate、Triplicateでアッセイを行う際に入力します。

プログラム開始前のチャンバー内の温度を設定できます。通常のPCRでは30 ℃、1ステップRT-PCRではRT反応の温度に設定してください。

外部標準(スタンダード)の単位を入力します。

装填したキャピラリーの最大ポジション番号を入力してください。

サンプル名のみをすべて消去します。

リストをデフォルト(初期設定値) に戻します。


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ライトサイクラーをランさせるライトサイクラーをランさせる

ライトサイクラーをランさせる前に、必ずリッド（蓋部）が閉じられていることを確認してください。

重要

ライトサイクラーをランさせるときは、「RUN」ボタ

ンをクリックします。

現在の蛍光強度ここで気になるサンプルを指定すれば、それがハイライト(太線)で表示されます。

蛍光強度の履歴

温度の履歴

現在実行中のプログラムが表示されます。

蛍光表示モードを確認してください。ラン中に変更しても問題ありません。

ランの終了

現在実行中のプログラムを終了

実行中のプログラムのサイクル数に10サイクル追加

「RUN」ボタンをクリックした後、測定されるデータの

ファイル名が訊かれます。ファイル名を入力、保存した後、ライトサイクラーがランします。

サンプルの編集画面が表示され、内容を変更できます。


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データ解析法／定量データ解析法／定量

選択されたデータファイルの簡単な情報(サイクル条件、サンプル条件など)が表示されます。データの確認に便利です。①

③

②

①各自のデータが保存されているフォルダ(“Data”フォルダ)をクリックして選択します。

データファイルの選択

②データフォルダ中のデータファイルがリストアップされます。この中から解析したいデータファイルをクリックして選択してください。

③選択したファイルを開きます

データ表示開始カーソル手動で調整できます。

データ表示終了カーソル手動で調整できます。

カーソルで選択された範囲のデータが表示されます。

① ③

※ もしRUN画面において“Analysis Mode”の設定を忘れた場合は、御自身で測定開始および測定終了のカーソルを調整していただくことになります。

定量分析をする場合は、必ず“Select a Program”においてプログラムを“quantification program ”に選択してから実行してください。

※

②

①解析したいプログラム(データ範囲) を選択します。定量解析=PCR増幅領域

②必要に応じて蛍光グラフのy軸の表示を変更します。■F1:

SYBR Green I実験で使用。■F2/Back-F1 or F3/Back-F1 :

HybProbe実験で使用。F2（LC-Red640）およびF3（LC-Red705）の値をF1の値（2-6サイクルの蛍光値の平均）で割算する。■F2/F1 or F3/F1:

F2（LC-Red640）およびF3（LC-Red705）の値をF1の値で割算する。

③「 Quantification」ボタンをクリックし定量解析プログラムを起動します。


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定量分析／定量分析／Fit PointFit Point法法

ステップ1: ベースラインの補正

①解析方法を選択します。■Fit Points:

Crossing Line(閾値レベル)を設定し、これと各サンプルの対数直線増幅領域との交点をシグナルの立ち上がったサイクル数と定義します。このサイクル数を用いて定量解析を行います。■Second Derivative Maximum:各サンプルデータの二次微分を求め、その最大値をシグナルの立ち上がったサイクル数と定義します。このサイクル数を用いて定量解析を行います。

① ②

②ベースラインの補正(ゼロ合わせ)を行います。■None: バックグラウンドの補正を適用しません。■Arithmetic: SYBR Green Iフォーマットで選択します。■Proportional: HybProbeフォーマットで選択します。■Normalized: 解析には使用しません。

ステップ2: Noise Bandの設定

①「Step2: Noise Band」のタグをクリックして、ステップ2に進んでください。①

②

③

②各サンプルの測定データが片対数でプロットされています。対数直線領域の開始ポイントをNoise Bandで設定します。このレベルより蛍光強度が低いデータはバックグラウンドとみなされ、解析から外されます。

③Noise Band以上のデータのみ示されています。ここでは、対数直線領域の直線性を確認してください。

-参考-グラフ右隅のボタンについて各グラフの右隅には左図のようなボタンがあります。上のボタン: そのグラフの拡大図が現れます。下のボタン: 設定したノイズバンドの位置（値）が示されます。


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定量分析／定量分析／Fit PointFit Point法法（続き）（続き）

ステップ3: 解析(濃度の算出) ポイント数:Ct値を計算するためのデータポイント数(対数直線領域開始点から何ポイント使用するか?)を入力します。多くの場合、2ポイントで充分です。

①

③

④

②

①「Step:3 Analysis」タグをクリックして、ステップ3に進んでください。

②チェックするとCt値の計算用に使用さ

れているデータポイントが表示されます。

③外部標準の濃度(Log値)に対して、Crossing Lineと対数直線領域の交点(Crossing Point)がプロットされ、検量線が算出されます。検量線の評価として、■検量線の傾き(Slope)■y切片(Interception)■誤差(Error)■相関係数(r)

がグラフ左側に表示されます。

④検量線より計算された濃度、およびCrossing Pointがリストに表示されます。

[Minimize Error]ボタンについてCrossing Lineの最初の設定はノイズバンドと同じ位置にあります。多くの場合、定量にはこの位置で十分です。しかし幾つかの場合では、Crossing Lineを動かすか、このボタンを使うことでエラー値が改善されることがあります。

☆検量線評価の目安☆測定対象にもよりますが、例えばCV=10 %以内とするとき、

Slope PCR効率（E) 基準Error値-3.32 2.0 0.058-3.59 1.9 0.054-3.92 1.8 0.049･･･

これらのError値以内であれば良いということになりますが、これ以上であれば、Crossing Lineを微調整するか、異常値を示すサンプルをリストからはずします(「Ctrl」キーを押しながらクリック)。

E = 101

slope-

尚、PCR効率は次式で計算できます。


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定量分析／定量分析／Second Derivative MaximumSecond Derivative Maximum法法

Second Derivative Maximumによる定量解析

この解析法は各サンプルごとに測定データ(増幅曲線)の二次微分値を自動計算し、その最大値を交点(Crossing Point)と定義して濃度を定量します。ゆっくりとした上昇、下降もしくはバックグランドのノイズ等をPCR由来の蛍光履歴曲線の上昇曲線と識別することによりソフトウエアの計算法の信頼性を向上させています。

①｢Second Derivative Maximum｣をチェッ

クします。①

①「Step:2 Analysis」タグをクリックして、次に進んでください。

②

①

②すべて全自動で標準曲線および定量結果が表示されます｡手動による操作は全くありません。


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定量分析定量分析//定量（その他）定量（その他）

ライトサイクラーソフトウェアver.3.5には、他のランで生成された標準曲線（検量線）を使うことができるツールがあります。他のランの標準曲線データが存在すれば、それを元に別の標準曲線ファイル（*.xscファイル）を作成しておき、それを標準曲線の存在しないランファイルにロードすることで、定量解析を行うことができます（前提条件として、各ランに1本の既知濃度サンプルが含まれる必要があります）。

ただし、この方法の使用は基本的に推奨しておりません。どうしても適用したい場合は、必ずその標準曲線データが汎用可能なものであるかどうかの裏付けデータを十分に取った上でご使用ください。そうでない場合、出てきた結果を保証しかねます。

重要

■外部標準曲線データの作成

①外部標準曲線を作成するファイルを開き、定量解析画面を開きます。適切な蛍光チャンネルおよび解析モードが選択されているかどうかを確認してください。

②外部標準曲線に含ませたいスタンダードをハイライトします。

③メニューバーから、以下の項目（Quantification / External Standard Curve）を選択します。

④サブメニュー「Create External Standard...」を選択します。ポップアップウィンドウが現れ、作成する標準曲線ファイルの名前と、それを保存する場所を尋ねてきます。作成された標準曲線ファイル（*.xsc）は次の情報を含みます。

•標準曲線の元となるランファイルの名前•標準曲線に使用されたサンプルのID番号• Y切片データ•傾き•解析モード（Analysis Mode）•シグナルチャンネル


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定量分析定量分析//定量（その他）定量（その他）

■外部標準曲線データのインポート

①標準曲線で解析したいファイルを開き、定量解析画面を開きます。適切な解析法（Fit Points/ Second Derivarive Maximum）か、蛍光チャンネルかを確認し、適用したい外部標準曲線に一致させます。

②解析したいサンプルと、ランに含まれる既知濃度のサンプルを選択してください。

③メニューバーから、Quantification / External Standard Curveを選択します。

④サブメニューの「Import External Standard …」を選択します。

⑤適切な標準曲線ファイルを選択し、開きます。プログラムに標準曲線データがロードされ、濃度が算出されます。インポートされた標準曲線は標準曲線グラフ上に表示されます。例えば下図の通りです。

外部標準曲線のファイル名とパスは、サマリーレポートに表示されます。

注意: インポートされた標準曲線はサンプル表（リスト）に表示されません。また前述の通り、解析する上で既知濃度のスタンダードが1本含まれることが必要です。


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データ解析法／融解曲線分析データ解析法／融解曲線分析

※もしRUN画面において“Analysis Mode”の設定を忘れた場合は、御自身で測定開始および測定終了のカーソルを調整していただくことになります。

※融解曲線分析をする場合は、必ず“Select a Program”においてプログラムを“melting curve program ”に選択してから実行してください。

データ表示開始カーソル手動でも調整できます。

① ②

①解析したいプログラム(データ範囲) を選択します。融解曲線分析=融解温度領域

②「Melting Curve」ボタンをクリックし融解曲線解析プログラムを起動します。

Digital Filterは常に“enable” をチェック状態にして下さい。

①

②

次に、融解ピークの計算方法の選択を行います。

①融解ピークの計算方法を選択します。■Linear:旧バージョンのソフトウェアの計算法で解析を行いたい場合に選択します。■Polynominal:特に理由がない限りは、こちらの計算方法を強く推奨いたします。■… with Background:融解ピーク面積を求めたい場合に選択します。

②“℃ to Avereage”の調整値を入力しなおすか、カーソルを上下させることにより融解ピークのスムージングができます。


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融解曲線分析／ピーク面積の計算融解曲線分析／ピーク面積の計算

ピーク面積を求めるには、まずバックグラウンドを調整する必要があります。

①ピークの計算方法として、“...with Background”を選択します。

①

②

②カーソルを移動して、バックグラウンドを調整します。

■緑色カーソルグラフ左部(低温側)のバックグラウンドを調整します。低温側では、温度変化(上昇)により、Tm値に依存しない蛍光強度の減衰が見られるためです。

■青色カーソルグラフ右部(高温側)のバックグラウンドを調整します。

①｢ Step 2: Peak Areas ｣タグをクリックします。

②

③

① ②目視で確認できるピークの数(3本まで)を選択してください。

③各サンプルごとに、それぞれのピークTm値、ピーク面積、標準偏差値が表示されます。

注意:これは各サンプル毎に解析を行ってください。


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融解曲線分析／手動による融解曲線分析／手動によるTmTm値の値の決定決定

手動により各融解ピークのTm値を決定できます。カーソルを各ピークの頂点に合わせてください。最大４つのピークのTm値を同時に表示できます。

①｢ Extra: Manual Tm｣タグをクリックします。

①

②

③

②各カーソル(最大4つ)をそれぞれピークの頂点に合わせます。

③各カーソルの位置する温度が表示されます。


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融解曲線分析／融解曲線分析／SYBR Green ISYBR Green Iへの応用への応用

SYBR GreenⅠフォーマットは簡単で便利なフォーマットですが、目的外のPCR産物（プライマーダイマー等）もモニタリングしてしまいます。従って、このフォーマットで定量を行う場合、目的外のPCR産物による

蛍光を考慮する必要があります。SYBR GreenⅠフォーマットの解析法のひとつの融解曲線分析の結果を用いてこれら目的外のPCR産物

の影響を除去できる場合があります。本項では下図のような融解曲線分析結果が得られた場合の「目的外PCR産物の影響への対処方法」に

ついて説明します。

ただし、ここに表記する方法の使用は、基本的に推奨しておりません。プライマーの良し悪し（設計、品質）が定量のキーポイントなりますので、非特異的産物がどうしても生成される場合はプライマーの状況を見直してください。プライマーの位置を変更できないなど、特別な理由がある時のみ適用してください。そうでない場合、出てきた結果を保証しかねます。

重要

融解曲線分析の画面で「Extra:Manual Tm」の

タグを選択します。

左例では目的のPCR産物のTmは86.7℃、プライマーダイマーと考えられるPCR産物のTmは82.3℃と測定されました。また２つのピークの谷間部分の温度は83.55℃と測定され、この温度では、「目的のPCR産

物は２重鎖ですが、プライマーダイマーと考えられるPCR産物は１本鎖に解離している」と考えられます。１本鎖のDNAにはSYBR GreenⅠは結合しませんので、この温度で蛍

光を取得するように設定を変更すれば、目的のPCR産物由来の蛍光のみを測定でき

ることになります。

Tm：その50 %が1本鎖DNAに融解する温度

４色のラインをマウスで移動させることによりTm値を決定することができます。


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融解曲線分析／融解曲線分析／SYBR Green ISYBR Green Iへの応用（への応用（続き続き））

「Ins」ボタンをクリックし、カラムを増やします。

上図の各プログラム表示画面で、「PCR」プログラムを

選択します。

まずプログラミング画面で融解曲線を描かせたプログラム（前ページまでの検討を行ったプログラム）を呼び出します（左図｢Open Experiment File｣部分をクリック）。

Elongationの後に左図のように入力を行います。融解曲線の谷間の温度は83.55℃（約84℃）でしたので84℃で蛍光を測定するように設定します。このような場合Incubation時間は１秒にします。「Acquisition Mode」は72℃のElongation部分を「NONE」に戻し、新たに設定した84℃のステップを「SINGLE」に変更します。

入力後、プログラムを上書き保存する場合は「Save Experimental File」をクリックします。名前を変えて保存する場合は、「File」の中の「Save As」で名前を付けてから保存します。

OR

変更後は次ページのようなサイクル、温度条件になっていることを確認して下さい。


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融解曲線分析／融解曲線分析／SYBR Green ISYBR Green Iへの応用（への応用（続き続き））

PCRは４ステップになり、ポリメラーゼが高温の環境にさらされる時間が増えますが、殆どの場合、PCR反応

自体に影響を与えることはありません。

融解曲線のプログラムは実験系を一度決定してしまえば必ずしも必要ではありませんが、目的のPCR産物が

得られているかどうかの確認の為に残しておくことを推奨します。

注意:目的及び目的外のPCR産物の融解曲線の山が重なっているような場合ではこの方法は

使用できません（下図）。

目的のPCR産物目的外のPCR産物

使える場合

目的のPCR産物目的外のPCR産物

使えない場合


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データ解析法／レポートの出力データ解析法／レポートの出力

Reportをクリックすると各種レポート形式のリストが表れます。

定量解析のレポート

実験全体のレポート(テキスト主体)のプレビュー実験全体のレポート(テキスト主体)の印刷

定量分析の各ステップで作成されたグラフを出力します。

定量解析の結果（定量値）は、テキストファイル（タブ区切り形式）としてエクスポートすることができます。定量モジュールのメニューバーから‘Quantification’ ‘Export’ ’Standard Curve’を選択し、ファイルとして保存します。

融解曲線分析のレポート Reportをクリックすると各種レポート形式のリストが表れます。

実験全体のレポート(テキスト主体)の印刷実験全体のレポート(テキスト主体)のプレビュー

融解曲線分析の各ステップで作成されたグラフを出力します。


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各種パラメータの設定について各種パラメータの設定について

方法用途理由

Proportional

Arithmetic

Normalized

サンプル間のバックグラウンドの差が大きいもの総てに適用することを推奨します。

● SYBR Green I

●Hybridization Probes、TaqMan、Beacons

●デュアルカラーで

の実験

Arithmetic法を使用すると、テンプレートDNAのバックグラウンドシグナルが最も効果的に除去されます。

テンプレートDNAのバックグランドに問題が無い場合で、ピペッティングによるチューブ間のバラツキを除去するのがProportionalです。

これを解析用に使用しないでください。表示目的にのみ使用します。

定量解析におけるバックグラウンド処理の選び方

計算方法

蛍光値が最も低い5つの測定値の平均値が、全測定値から引き算されます。

引き算と平均値による割り算の混合式で計算されます。

最後に測定された蛍光値を100として、他のデータをその割合として計算します。

定量解析における計算方法の選び方

セッティングモード．．．のとき選択します。

Second Derivative Method

Fit Points Method

●全自動化された定量方法です。ノイズバンドなどのラインの設定が無く、人による設定の差が出ません。

●増幅曲線がS字型になっていないと、二次微分の極大値が計算できないません。したがって定量値を得るためには、反応のプラトーフェーズ（あるいはログリニアフェーズの失速するところ）まで検出する必要があります。

●幅広い初期コピー数のサンプルに適用できます。初期コピー数が低く、十分なS字型の増幅曲線が得られなくてもノイズバンドの設定によっては定量の対象にすることができます。

●旧ソフトウェアとの互換性があります。

融解曲線解析における計算方法およびバックグラウンド処理の選び方

方法用途理由

Polynomial

Linear

With Background

Without Background

すべてのアプリケーションで使用。

旧バージョンの計算方法を踏襲したいときのみ使用します。

● ピーク面積の計算● “Zoom”効果

Linearに比べ、より安定で、改善されています。データの小細工(人為的操作)を防ぎます。

この計算方法は、ソフトウェア Ver. 1.2の融解曲線の計算方法と同じです。

融解温度の決定融解温度はバックグラウンドに影響しません。


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終了方法終了方法

①ライトサイクラーソフトウェアの各モジュールを終了させます。以下のいずれかの方法を使用してください。

■各モジュール画面に配置されている｢EXIT｣ボタンをクリックする。

■メニューバーの｢File｣メニューから｢Exit Program｣で終了。

■各ウィンドウの右上にある×印をクリックする。

②Windows NTを終了させます。

以下の画面が出ますので、“Shut down the computer?”を選んで｢Yes｣ボタンをクリックしてください。

画面左下の“Start”ボタンをクリックし、｢Shut Down｣を選択します。

電源を切るための手続きが行われますので、しばらくお待ちください。電源は自動的に切れます。

③ライトサイクラー本体のスイッチをオフにします。

電源コード差込口の左側にあります。

<本体背面部>


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追補－追補－ Data File EditorData File Editor

■LightCycler DataFile Editor

実験終了後、データファイルのいくつかのパラメータ、名前などを簡便に変更できるようになりました。オプションでインストール可能。

変更可能なパラメータ:ユーザー名、実験ノート（Experimental Notes）、サンプルデータ（Name, Concentration, Type, Replicate of, Note）、ユニット（濃度の単位）、プログラムの名前と解析タイプ、解析に使用するデフォルトのカラーコンペンゼーション（色補正）、デフォルトのディスプレイモード（Display Mode）

①フロント画面のメニューバーのOption/ LC Data File Editorを選択してください。

注意:インストールしていないと、この表示は出てきません。

②以下の画面が現れます。ここでデータファイルを変更します。ここではよくご質問いただく、サンプル情報（スタンダードの濃度変更など）に使用するボタンについて説明します。詳細はオペレーターズマニュアルをご覧ください。

(1) 変更したいデータファイルを開きます。

(3) 変更後、データファイルを保存します。

(2) このボタンを押すと、そのデータのサンプルリストが現れます。スタンダードの濃度の修正／変更などが行えます。

(4) 本モジュールを終了します。

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