神戸大学 先端バイオ工学研究センター蓮沼誠久

Jan 30th, 2019

スマートセル創出プラットフォームの構築と実証に向けて

関西スマートセルフォーラム2018

スマートセルを巡る最新技術動向

25分トーク

バイオ技術の革新による“微生物モノづくり”の進展

①バイオプロセスによる汎用化学品の高効率生産

（省エネ・高い生産性・低コスト化）

②生産困難な高機能物質の大量生産（新産業の創出）

健康・医療

25%

工業

39%

農業

36%

世界バイオ市場予測（2030年）約1.6兆ドル

出展：The Bioeconomy to 2030, OECD (2009)

工業の占める割合が最も大きい

Arkin (2008) Nature Biotechnology 26, 771-774

1,4-ブタンジオール（10万t規模）

ナイロン中間体

アルテミシニン（抗マラリア剤）

ステビア

バニリン，レスベラトロール

ファルネセン

イソプレン

ワクチン，抗体，等

コハク酸, etc.

1,3-プロパンジオール

スクワレン

生物情報解析の進展，合成バイオ技術の革新 合成バイオ製品の事業化（例）

*ヒトゲノム計画時代（1990年）は30億ドル/13年

2

3

米国バイオテクノロジー業界の収益推移

2012年の収益（3240億ドル）

Nature Biotechnology (2016) 34 (3)

4

The Global Goals for Sustainable Development (SDGs)

少なくとも12 項目以上はバイオテクノロジーが技術的に貢献すべき課題 循環型社会を形成するためにバイオマス等の再生可能資源を用いること 石油由来製品や，人の生活を豊かにする機能素材のバイオ化により，環境・資源の持続性を

促進すること

SDGsへの取り組みが世界経済の拡大を支える ESG経営が企業の成長に極めて重要との認識が浸透しつつある

2030 年までに極度の貧困を解消し，持続可能な社会を実現するための国際目標

5

バイオエコノミー戦略

バイオエコノミー

バイオテクノロジーが影響、牽引する産業群が形成する経済、市場生物資源とバイオ技術を用いて地球規模課題の解決と経済発展の共存を目指す

各国で戦略的な取り組みを開始

【欧州】2030年に石油由来製品の30%、輸送燃料の25%を生物由来に置換することを目指す【米国】2030年に10億トンのバイオマスを用いて化石由来燃料の25％を代替、2,300万トンのバイオ由来製品と850億KWhの電力供給、170万人の雇用を目指す

6

合成バイオ技術の国際的な潮流

NGS等の解析装置、バイオデータの高速解析システム、自動化した育種・培養装置といったインフラの整備、集積

遺伝子発現等の機械学習に基づくDNA配列設計や、多様な菌株の大量生成と培養・評価のハイスループット化が進められている

微生物育種システムのファウンドリ化

24連HTP微生物培養装置

微生物構築・培養・評価用HTP液体ハンドリング

次世代DNA

シーケンサー

大型計算機

1000s of designs per strains

700 million base pairs of DNA

31 robots

研究開発責任者 神戸大学 先端バイオ工学研究センター長 蓮沼誠久

NEDOスマートセルPJ（H28～32）

高生産性微生物創製に資する情報解析システムの開発

7

委託先； 神戸大学、産業技術総合研究所、旭化成ファーマ㈱、味の素㈱、江崎グリコ㈱、神戸天然物化学㈱、JSR㈱、㈱島津製作所、長瀬産業㈱、日本テクノサービス㈱、不二製油㈱、プレシジョン・システム・サイエンス㈱、三菱ケミカル㈱、地球環境産業技術研究機構（RITE）、理化学研究所、石川県立大学、東北大学、長岡技術科学大学、新潟薬科大学、京都大学、九州大学、㈱日立製作所、東京大学、Spiber㈱筑波大学、㈱ニコンインステック

再委託先； 大阪大学、岡山大学、鹿児島大学、九州大学、慶應義塾大学、信州大学、千葉大学、東京大学、バイオインダストリー協会、花王㈱、バイオジェット㈱ 、製品評価技術基盤機構（NITE） 16社、4研究機関、16大学

8

プロジェクトの目標

情報解析による代謝経路設計技術、長鎖DNA合成技術、動的メタボロミクス技術といった要素技術を構築してきた

本プロジェクトにより強化、システム化

数 g/Lから10 g/L程度

数10 g/Lから100 g/L程度

生産性

スマートセルの設計図に基づく分子育種，学習を活用したシステマティックな菌株改良と培養最適化，による開発期間の大幅短縮

データの学習、さらなる高度化

従来の1/10の開発期間

プロジェクト開始時点プロトタイプシステムスマートセル創出プラットフォームの確立（PJ終了後）

分子育種

開発期間

菌株改良と培養効率化

スマートセル設計システムの開発、要素技術強化

スマートセル設計に資する新規情報システムの開発、微生物構築の高速化、計測技術高精度化、それらの統合システム化により、世界的に競争力のある微生物育種技術の開発を目指す

従来開発期間；5～10年

9

プロジェクトの目的

スマートセル設計システムの開発に必要なデータを取得するために、①高度の多様性を有する微生物を短時間で構築し、②生産性データおよびオーミクスデータを高精度かつハイスループットで取得する、

ハイスループット合成・分析・評価技術を開発する

多様な微生物株からの大規模データセットの提供

有用物質の生産性を大幅に高める“スマートセル”の設計図を構築する情報解析システム（スマートセル設計システム）を開発する

（２）スマートセル設計システムの開発

活用

参画企業との共同開発（実用株、評価データ等の提供）

活用

（１）ハイスループット合成・分析・評価技術の開発

民間企業が標的とする特定の生産物質で、スマートセル設計システムおよびハイスループット合成・分析・評価技術の有効性を検証するとともに実用化技術を開発する

（３）スマートセル設計システムの有効性検証①開発期間の短縮②目的物質の生産性向上③新規生合成経路の実現

生産ニーズを実現するスマートセル・モデルと育種用遺伝子配列情報の提供

基本技術を大腸菌・出芽酵母等で開発し、産業微生物へ拡張

10

スマートセル創出プラットフォームの開発

Design Build

TestLearn

Data Management

on the IoT

ハイスループットな生産性データ取得高精度かつ体系的なオミクスデータ取得

高精度トランスクリプトームデータ高精度メタボロームデータ定量プロテオームデータ

未知反応を含む代謝経路設計機能未知酵素を含む酵素選定分子動力学に基づくタンパク質配列設計

機械学習に基づく遺伝子配列設計

ハイスループットな長鎖DNA自動合成長鎖DNAの利用可能な半自動微生物構築独自シャーシ株の開発マルチターゲットゲノム編集

代謝ルールの学習基質寛容性に基づく酵素の機能推定独自数理モデルによる遺伝子発現制御ネットワークの推定

遺伝子配列・発現の相関学習 AIを用いた特許・文献からの知識の抽出・整理

スマートセル設計システム

多様な微生物の創製

多様かつ体系的なデータの創出

法則の抽出

方針の設計

11

代謝経路のデザイン② Prof. Araki

A

B

C

D E

Enz2

Enz3

Enz0

Enz1

Enz4

Enz5

既知：

未知：

反応 化合物

EnzX

EnzX

酵素

PATH_0PATH_1 PATH_2

Araki et al., (2015)

Bioinformatics 31, 905-911

PATH_0 （Enz0_Enz1）：既知

PATH_1 （Enz2_Enz3）：機能未知酵素含む

PATH_2 （Enz4_Enz5）：機能未知酵素・非天然化合物含む

12

スマートセル創出プラットフォームの開発

Design Build

TestLearn

Data Management

on the IoT

ハイスループットな生産性データ取得高精度かつ体系的なオミクスデータ取得

高精度トランスクリプトームデータ高精度メタボロームデータ定量プロテオームデータ

未知反応を含む代謝経路設計機能未知酵素を含む酵素選定分子動力学に基づくタンパク質配列設計

機械学習に基づく遺伝子配列設計

ハイスループットな長鎖DNA自動合成長鎖DNAの利用可能な半自動微生物構築独自シャーシ株の開発マルチターゲットゲノム編集

代謝ルールの学習基質寛容性に基づく酵素の機能推定独自数理モデルによる遺伝子発現制御ネットワークの推定

遺伝子配列・発現の相関学習 AIを用いた特許・文献からの知識の抽出・整理

スマートセル設計システム

多様な微生物の創製

多様かつ体系的なデータの創出

法則の抽出

方針の設計

13

ハイスループット長鎖DNA合成技術 Assoc. Prof. Tsuge

• 一度の組換えで多数の遺伝子発現を制御

• 情報解析に基づく新規代謝経路の容易な具現化

• ハブ化合物を生産する宿主（シャーシ株）の開発による実用株の開発期間短縮

長鎖DNA合成は超高速微生物育種に必要不可欠

世界のDNA合成の現状

• 10 kbを超える長鎖DNA合成を引き受ける会社はない

• 納期が長く（1 kb／1.5ヶ月）、コストがかかる（20

円／base）

OGAB法（Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis）

Tsuge et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31,e133

選択的ライゲーションと枯草菌のプラスミド形質転換系を組合せた多重DNA断片集積法

50 kb超の長鎖DNAを合成可能 世界最多の50断片以上の集積が可能 変異が入らない（世界一高いDNA集積精度）

OGAB法を核とした低コスト・ハイスループット長鎖DNA合成技術の開発に取り組んでいる

14

ハイスループット長鎖DNA合成技術 Assoc. Prof. Tsuge

タンデムリピートライゲーション産物

不要DNAを除去し、等モル調製した材料DNA

枯草菌

DNA化学合成

プラスミド構築

長鎖DNA

96本同時化学合成システム96個のプラスミドを同時調製する液体分注シスム

長鎖DNA合成システム

OGAB法を核とした長鎖DNA合成プラットフォームの開発 原料（一本鎖DNA）調達から遺伝子集積（長鎖DNA）までの一気通貫システムの開発による高速合成と低コスト化の実現

15

ハイスループット長鎖DNA合成技術 Assoc. Prof. Tsuge

試作1号機200塩基

20時間以内24本同時合成

試作2号機200塩基

20時間以内に96本同時合成

H28年度 H29年度 H30年度

ハイスループット化を達成し、コストと変異率の低さは既に市

販品レベルを達成

さらなる低コスト化と正確性向上を行っている

試作3号機（ほぼ市販機）

200塩基96本同時合成

従来の半分の時間従来の1/10のコスト

DNA化学合成装置の開発

16

ハイスループット長鎖DNA合成技術 Assoc. Prof. Tsuge

二本鎖DNA構築技術の開発と自動化

オーバーラップPCRによる2 kbまでの二本鎖DNA合成

従来の二本鎖DNAの構築法

偏りの大きい配列は集積できない

数百bpの二本鎖DNA

1st PCR（小断片形成）

2nd PCR（大断片形成）

新規二本鎖DNA構築法

受託合成会社が合成拒否したDNA配列（長い反復配列､同一塩基の連続配列､AT-rich､GC-rich等）を高速ロボット合成することが可能になった

動画をご覧ください

ハイスループット形質転換技術Assoc. Prof. Ishii

96穴プレートフォーマットでの微生物半自動形質転換システム

情報技術で設計された代謝経路

酵素, 遺伝子, プロモーターの有力候補の選択

組合せ発生

17

～20 gene expression/deletion

required

Suitable enzyme (type, isozyme) and

gene expression level unknown ～105 kinds of DNA constructs

Yeast E. coli

Transformation of β-

carotene plasmids into

S. cerevisae

形質転換

Transformation of GFP

plasmids into E. coli

生育の悪い変異株も宿主として形質転換ができる シングルコロニーの単離、遺伝子導入確認操作の

省略が可能

バイオテックEDR-384 SX

動画をご覧ください

プロトコルの検討により、1000種類以上／day

の作出を実現

18

ハイスループット形質転換技術Assoc. Prof. Ishii

遺伝子KOライブラリへのβカロテン生合成遺伝子群の導入No. 1 No. 2 No. 3 No. 4 No. 5

自動形質転換・・・

1.00

1.50

2.00

1

101

201

301

401

501

601

701

801

901

1001

1101

1201

1301

1401

1501

1601

1701

1801

1901

2001

2101

2201

2301

2401

2501

2601

2701

2801

2901

3001

3101

3201

3301

3401

3501

3601

3701

3801

3901

4001

4101

4201

4301

4401

4501

4601

4701

4801

4901

R/G値

ライブラリー株

WT

スキャナによる画像取得

＋

背景の補正 ROI(座標軸)の決定416-blue 426-bluemin max min max1 140 255 194 2552 139 255 198 2553 141 255 190 2554 143 255 195 2555 140 255 202 2556 138 255 185 2557 143 255 154 2558 141 255 189 2559 140 255 196 25510 143 255 173 25511 138 255 203 25512 138 255 185 25513 145 255 177 25514 143 255 165 25515 146 255 184 25516 145 255 193 25517 145 255 185 25518 139 255 190 25519 143 255 182 25520 145 255 169 25521 144 255 178 25522 146 255 174 25523 147 255 177 25524 143 255 165 25525 145 255 193 25526 145 255 197 25527 147 255 190 25528 146 255 203 25529 144 255 195 25530 147 255 203 25531 148 255 190 25532 144 255 200 25533 146 255 195 25534 143 255 197 25535 145 255 197 25536 144 255 174 25537 144 255 181 25538 146 255 204 25539 145 255 203 25540 143 255 199 25541 145 255 205 25542 144 255 176 25543 144 255 189 25544 141 255 182 25545 143 255 187 25546 141 255 186 25547 148 255 163 25548 139 255 191 25549 146 255 181 25550 144 255 201 25551 140 255 138 25552 147 255 202 25553 148 255 181 25554 144 255 195 25555 143 255 200 25556 140 255 188 25557 142 255 170 25558 142 255 205 25559 146 255 199 25560 141 255 193 25561 144 255 182 25562 143 255 199 25563 145 255 180 25564 146 255 187 25565 140 255 196 25566 146 255 174 25567 148 255 189 25568 146 255 179 25569 147 255 188 25570 144 255 208 25571 143 255 207 25572 139 255 197 25573 140 255 194 25574 142 255 191 25575 144 255 195 25576 145 255 166 25577 144 255 191 25578 147 255 180 25579 146 255 188 25580 146 255 183 25581 145 255 181 25582 147 255 179 25583 144 255 151 25584 143 255 166 25585 140 255 189 25586 140 255 190 25587 142 255 192 25588 144 255 198 25589 137 255 203 25590 141 255 196 25591 139 255 202 25592 144 255 191 25593 143 255 183 25594 145 255 172 25595 144 255 168 25596 137 255 193 255

ave. 143.3854 187.3333stdev 2.720944 13.03175

R,G,B値の抽出

RGBカラー画像解析

イソプレノイド生産を左右する有用遺伝子の超高速単離に成功した

19

スマートセル創出プラットフォームの開発

Design Build

TestLearn

Data Management

on the IoT

ハイスループットな生産性データ取得高精度かつ体系的なオミクスデータ取得

高精度トランスクリプトームデータ高精度メタボロームデータ定量プロテオームデータ

未知反応を含む代謝経路設計機能未知酵素を含む酵素選定分子動力学に基づくタンパク質配列設計

機械学習に基づく遺伝子配列設計

ハイスループットな長鎖DNA自動合成長鎖DNAの利用可能な半自動微生物構築独自シャーシ株の開発マルチターゲットゲノム編集

代謝ルールの学習基質寛容性に基づく酵素の機能推定独自数理モデルによる遺伝子発現制御ネットワークの推定

遺伝子配列・発現の相関学習 AIを用いた特許・文献からの知識の抽出・整理

スマートセル設計システム

多様な微生物の創製

法則の抽出

方針の設計

多様かつ体系的なデータの創出

20

高精度メタボローム解析

• 生産性に寄与する代謝物質（バイオマーカー）を特定できる• バイオマーカーに基づいて優良株の選抜、培養条件の最適化ができる• 生合成経路のボトルネックとなる代謝反応（律速反応）を特定できる

メタボローム解析は細胞の表現型（代謝状態）を特徴づけるのに必要

代謝経路の設計に必要なデータを取得するには、スループット性、網羅性、精度に課題がある

CE-TOFMSメタボローム解析の現状

• 培養をはじめてからデータを取得するまでに時間がかかる（3-4

weeks以上/data set)

• 一斉分析で定量できる代謝物は100成分程度しかなく、重要な代謝中間体（ハブ化合物）を定量できないことが多い

• LC-MSでは分離・検出の向上にイオンペア剤を用いるため、感度と精度が低下する

LC-MS

イオン化抑制

Hasunuma et al. J. Exp. Bot., 2013; Kono et al. Nature Commun., 2017; Hasunuma et al. Metab. Eng., 2018

21

メタボローム解析の課題

培養液採取

LC-MS/MS測定

Peak Picking

溶媒抽出

細胞

代謝物抽出物

chromatograms

バイオリアクター

メタボロームデータ

代謝反応停止

従来の方法では、代謝モデル構築に必要なデータを取得するにはスループット、精度、網羅性に課題がある

スマートセルモデル構築へ

従来の前処理（溶媒抽出）

遠心分離

加温抽出

遠心分離

代謝反応停止用冷却アルコール

抽出有機溶媒

上清

遠心分離

上清

乾固代謝物標品

代謝反応停止

上清

ボルテックス攪拌

培養液採取

減圧乾固

前処理が煩雑でスループットが低く、手作業のため再現性が低い

前処理

22

細胞回収

代謝物抽出

抽出液回収

代謝反応停止

培養液採取

細胞培養自動サンプリング

ユニット

自動抽出ユニット

自動前処理システム

P

代謝停止用冷却アルコール

発酵ベッセル

P

分注ロボットV

V

12連リアクターから15sec

間隔で自動サンプリング・自動クエンチング可能な機構の開発

世界初のメタボローム解析用試料調製ロボット

LC-MS/MS測定

従来（24サンプル/day)の10倍以上の（288サンプル/day）スループットと、手技を超えた効率・精度を実現

自動前処理システムの開発

バーコードによるID管理システムを実装

23

自動抽出ユニットの性能評価

精度について

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

0 10 20 30 40

80%以上の代謝物において、自動抽出ユニットの方がC.V.が小さかった（さらに改良中！）

1. 自動抽出ユニットと手技、それぞれで代謝物を抽出。

2. LC-MS/MSで代謝物を定量し、C.V.を求めた。

自動抽出ユニット vs 手技再現性比較

自動前処理システムはスループット性だけでなく、精度も高い。

自動抽出ユニット(C.V.%)

手技

(C.V

.%)

自動抽出ユニットの方がC.V.が小さい。

手技の方がC.V.が小さい

24

微生物構築育種のワークフロー

標的生産物質の選定

宿主微生物の選定

導入遺伝子配列の設計

組換え微生物の構築

標的物質の生産性評価

代謝経路の設計

酵素・遺伝子の選定

培養条件の検討

プラスミドの構築生産性を改善するため、前のステップに戻る

AIによる収集，整理

公開データ文献・特許情報

情報解析システム（スマートセル設計システム）

情報の供給

超高速分析

ラボオートメーション

新たに取得した独自データセット*の提供

*大規模で多様性に富んでいることが強みになる

スマートセル創出プラットフォーム

25

課題ごとのワークフロー構築、データの質・量選定が重要！

①多様化方針の設計

⑤高生産株の設計

②多様性の創出

③多様性の数値化④法則の抽出

ビッグデータに基づく微生物開発のキモ

26

スマートセル工業への展開

ハイスループット長鎖DNA合成

ハイスループット微生物構築

生産性評価（生成物，副産物，細胞密度，主要代謝中間体）

モデルの高度化と遺伝子配列の再設計

物質の生産ニーズ

製造プロセス開発

ニーズ物質製造

高生産性微生物構築

スマートセル創出プラットフォーム

スマートセルモデルと遺伝子配列情報の決定

27

神戸大学における研究拠点の整備

神戸大学自然科学総合研究棟4号館クロスラボ（産学連携）

神戸大学先端バイオ工学研究センタースケールアップラボ

神戸大学統合研究拠点クロスラボ（産学連携）

28

研究設備の整備＠ポートアイランド統合拠点

国内最大の次世代バイオ医薬品GMP製造技術基盤開発施設（連携）

クロスラボ（産学連携ラボ）1,000 m2

29

研究設備の整備＠六甲台第二キャンパス

バイオマス水蒸気処理装置（3台）

蒸留塔（７ｍ）発酵槽（30 L×3台、50 L×2台、100 L×1台)

スケールアップラボ；パイロットプラントを整備

クロスラボ（産学連携ラボ）

30

マルチオミクス解析装置

アプリケーション

31

バイオエタノール生産 バイオコハク酸（プラ原料）生産

バイオディーゼル燃料生産

バイオ乳酸生産

菌体の増殖促進H. Kawaguchi, et al. Microbial Cell

Factories, 17: 76 (2018)

S.H. Ho, et al. Scientific Reports, 7: 45471

(2017)

Hasunuma T, et al., Metabolic Engineering

Communications,3, 130-141 (2016)

S. Hondo, et al. Journal of Bioscience and

Bioengineering, 120, 510-517 (2015)

PHA（生分解性プラ）生産

T. Hasunuma, et al. Metabolic Engineering

Communications,3, 130-141 (2016)

バイオフェニル乳酸（エンプラ原料）生産H. Kawaguchi, et al. Bioresource

Technology, 182: 169-178 (2015)

T. Hasunuma, et al. Biotechnology for

Biofuels, 7:493 (2014)

藻類の光合成の促進

T. Hasunuma, et al. Applied Microbiology

and Biotechnology, 90, 997-1004 (2011)

Oil

3232

◆ 研究科を超えた全学体制 ◆

バイオエコノミーを牽引する多様な有用物質のバイオプロダクションに関する先端研究開発の推進とプラットフォーム化

バイオベース燃料・化学品研究部門

バイオロジクス研究部門

機能性食品素材・アグロバイオ

研究部門

化学・プロセス研究部門

先端プラットフォーム技術開発部門

バイオエコノミー研究部門

ハード（研究スペース、機器）とソフト（研究者、知財）を整備

産産学によるオープンイノベーションの場を形成、研究開発の加速

スマートセルインダストリーへの貢献

世界的に激しい競争

バイオプロダクションに係る研究領域の急速な拡大

イノベーションハブ

工学研究科 理学研究科 農学研究科科学技術イノベーション研究科

バイオ燃料

食料

機能性食品

バイオ医薬品

化学品

先端バイオ工学研究センターEngineering Biology Research Center