アミノアシル化ヌクレオチド類の効率合成

(高知大総研セ1 ・ 高知大理2 ・ 高知大医3)

○片岡　正典1、　福井　千春１、　本家　孝一3、　小槻　日吉三2

IMT.KOCHI

安価な原料（ヌクレオシド） 1kgあたり2000円程度

革新的な製造技術　　

簡易短工程で価値を10万-5000万倍に！

高価な化学物質（ヌクレオチド類）

!

ヌクレオチド合成の重要性IMT.KOCHI

・ユニバーサル核酸 ・短鎖RNA ・アミノアシルtRNA ・ヌクレオシド環状二量体 ・糖ヌクレオチド ・全塩基核酸塩基標識法 ・含ヌクレオチド天然有機化合物 ・人工核酸 ・ncRNA

無細胞タンパク質合成の概略IMT.KOCHI

Patrick O'Donoghue, Jiqiang Ling, Yane-Shih Wang & Dieter Söll* Nature Chemical Biology 9, 594‒598 (2013) doi:10.1038/nchembio.1339 Published online 17 September 2013

ヌクレオシド（原料）

ジヌクレオチドpdCpA

アミノアシルpdCpA アミノアシルtRNA

　　 CHEMICAL PROCESS

二量体合成 アミノアシル化 ライゲーションO

CytO

OPO–O O

OAde

HO OH

P–OO–O

OCytO

OPO–O O

OAde

O O

P–OO–O

HO

RNH2

HOO

Ade

HO OH

OCytO

OPO–O O

OAde

O O

P–OOO

HO

RNH2

tRNA

無細胞タンパク質合成に用いるヌクレオチド類の例IMT.KOCHI

共通前駆体pdCpA N型糖タンパク質合成基質 GlcNAc-Asn-pdCpA

標識導入基質 4-NH2-Phe-pdCpA

O HNHO

NHAcO

OH

NH2

O

TBA+ –OO– TBA+O

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

O O

P

HHO

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

O O

PTBA+ –OO– TBA+O

HONH2

H2N

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

HO OH

PTBA+ –OO– TBA+O

全ての保護基の除去と TBA化を一挙におこなう

各工程の最適化によって競合技術よりも効率が高く、操作も簡素化されている

共通前駆体pdCpAの合成IMT.KOCHI

NCCH2CH2OOCH2CH2CNO

OAdeBzHO

HO OH

OAdeBzTBDMSO

TBDMSO OTBDMS

2.2 M CF3COOH

1.5 M [(CH3)3SiO]2

OCytBzHO

OPONCCH2CH2O O

OAdeBz

TBDMSO OTBDMS

OCytBzO

OPONCCH2CH2O O

OAdeBz

TBDMSO OTBDMS

P

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

HO OH

PTBA+ –OO– TBA+O

1.2 M t-C4H9(CH3)2SiCl1.8 M imidazole

0.20 M

OAdeBzHO

TBDMSO OTBDMSdichloromethane, 25°C, 2 h

0.36 M dC-phosphramidite0.45 M benzimidazolium triflateMS 4A

0.030 M

0.30 M

0.29 M CCl3COOH

dichloromethane, 25°C, 2 h

0.45 M (NCCH2CH2O)2PN(i-C3H7)20.60 M benzimidazolium triflateMS 4A

0.30 M

1.5 M [(CH3)3SiO]2

10% TBAOH

0.030 M

DMF, 25°C, 2days>99%

water—THF (1 : 4)25°C, 5 - 6 h83 %yield

dichloromethane25°C, 1 h

dichloromethane25°C, 10 min68 %yield (3 steps)

dichloromethane25°C, 1 h65 %yield (2 steps)

water—methanol—dioxane (9 : 7 : 1)0.80 GPa, 25°C, 14 h~100 %yield

1

短工程製造技術 効率的縮合反応＋超高圧脱保護

競合技術１ Koster法

競合技術２ 改良Koster法

製造工程 ８ １３ １２

精製回数 ５ ８ ９

収率 ３０％ ＜１０％ ＜１０％

純度 ＞９９・５％ ～9０％ ～9０％

高知法のアドバンテージ 　製造工程が競合技術に比べて短く（競合技術の１２−１３工程に対してシーズ技術は９工程）、中間体の精製操作は５回で、競合技術の８−９回を凌ぐことから、合成コストの面からも価格競争力が高い。危険な薬品や大規模な設備を必要としないことから、小規模製造場所でグラムスケールの生産が十分に可能である。 　競合技術によって生産されたものはすでに流通しているが、製品品質は低く、技術面でも大きなアドバンテージを有する。

出願番号：特願 2014-48194

pdCpA製造技術比較IMT.KOCHI

従来のアミノアシル化反応IMT.KOCHI

OCytO

OPO–O O

OAde

HO OH

P–OOHO

amino acid (large excess)

OCytO

OPO–O O

OAde

O O

P–OOHO

HO

H2NR

mixture of regio isomers

stoichiometric

pdCpA + aminoacyl pdCpAH2N COOCH2CN

R

1 equiv 5 equiv 20-30％

ジヌクレオチドpdCpA アミノアシル化pdCpA

　　 TYPICAL CONDITION

検討に用いる縮合剤と添加剤IMT.KOCHI

ADDITIVE

CONDENSING AGENT (ACTIVATOR)

NN

NMeO

MeO

N+ O

Me

Cl-NCN

N

N

O

N N

PF6

O CNO

N O

N NO

PF6 NNN

O PN

NN

PF6

N N N N

O

DMT-MM DIC HBTU COMU PyBOP CDI

NN

N

OHN N

NN

OHO CNO

N OH

MeN O

HOBt HOAt Oxyma NMM

アミノアシル化条件の探索-1IMT.KOCHI

entry coupling reagent (equiv) additive (equiv)

1 DMT-MM (1) HOBt (2)2 DMT-MM (5) HOBt (2)3 DMT-MM (10) HOBt (10)45 HBTU (5) HOBt (10)6 PyBOP (1) HOBt (2)

HBTU (1) HOBt (1)

yield, %a

458425

1120

57

a) Determined by HPLC.

7 COMU (1) Oxyma (2) 13

アミノアシル化条件の探索-2IMT.KOCHI

entry additive (equiv)

1 DMT-MM (5) HOBt (2)2 DMT-MM (5) HOAt (2)3 DMT-MM (5)4 DMT-MM (5) NMM (2)

8435

—b

24Oxyma (2)

coupling reagent (equiv) yield, %a

a) Determined by HPLC. b) Side reactions were observed.

アミノアシル体の合成IMT.KOCHI

entry N-Boc-amino acid isolation yield, %

1 N-Boc-Phe 502 N-Boc-4-NH2-Phe 223 N-Boc-Asn 19

OCytO

OPO–O O

OAde

HO OH

P–OOHO

50 mM N-Boc-amino acid250 mM DMT-MM100 mM HOBT

DMF25 °C, 5 h

OCytO

OPO–O O

OAde

O O

P–OOHO

HO

H2NR50 mM

変換率は90%以上精製は改善可能

N型糖タンパク質合成用基質 GlcNAc-Asn-pdCpAIMT.KOCHI

GlcNAc-Asn-pdCpA

pdCpA + GlcNAc-Asn-pdCpA

1 equiv 5 equiv

O HNBnO

BnO

NHAcO

OBn

COOCH2CN

NHBoc×

A TRYAL BY THE TYPICAL PROCEDURE

O HNHO

NHAcO

OH

NH2

O

TBA+ –OO– TBA+O

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

O O

P

HHO

GlcNAc-Asn-pdCpA の合成IMT.KOCHI

出願番号：PCT/JP2014/58711

849.0 1040.6 1232.2 1423.8 1615.4 1807.0Mass (m/z )

1.3E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

TOF/TOF™ Reflector Spec #1 MC[BP = 954.6, 12614]

954.5668

916.9097

1119.6761

1360.9719

1077.9105

1189.9360

952.5826

996.9929

1018.9600

1286.5602

1141.6709

1574.9703

906.2728

851.5216

1521.9758

1238.2418

1402.9971

1324.4833

1372.1987

924.6241

1344.9043

1115.5927

1596.9779

881.3270

1447.0170

950.9760

1170.9023

1093.8907

1490.0444

975.7003

1619.1130

1047.5995

1642.2249

1211.9203

1466.0511

1266.2983

1075.9469

1788.9845

1676.9469

1553.9482

Chemical Formula: C31H45N11O20P2 Exact Mass: 953.23 Molecular Weight: 953.70 m/z: 953.23 (100.0%), 954.24 (34.8%), 955.24 (10.0%), 954.23 (4.1%), 956.24 (2.3%), 955.23 (1.5%) Elemental Analysis: C, 39.04; H, 4.76; N, 16.16; O, 33.55; P, 6.50

MA

LDI-T

OF

MA

SS S

PEC

TRU

M

Bn基とBoc基 の除去

M+1 954.5868

methanol, 25 °C

1 mol% Pd/silica1 atm H2

O HNBnO

NHAcO

OBn

NHBocO

TBA+ –OO– TBA+O

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

O O

P

O HNBnO

BnO

NHAcO

OBn

COOH

NHBoc

50 mM

250 mM DMT-MM100 mM HOBT

DMF, 25 °C2 h, 34%

50 mM

+

H

22 h, 93%

O HNHO

NHAcO

OH

NH2

O

TBA+ –OO– TBA+O

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

O O

P

HBnO HO

TBA+ –OO– TBA+O

OCytO

OPOTBA+ –O O

OAde

HO OH

P

まとめIMT.KOCHI

・DMT-MM/HOBtを用いるアミノアシル化反応を開発

・アミノ酸の使用量を化学量論量まで削減

・高い変換効率

・従来法で合成できないGlcNAc-Asn-pdCpAの合成に成功

・精製操作の最適化を残す

OCytO

OPO–O O

OAde

HO OH

P–OOHO

50 mM N-Boc-amino acid250 mM DMT-MM100 mM HOBT

DMF25 °C, 5 h

OCytO

OPO–O O

OAde

O O

P–OOHO

HO

H2NR50 mM

本技術に関する知的財産

発明の名称：Ｎ-グリコシル酸アミドアミノ酸-核酸誘導体およびその製造方法出願番号：PCT/JP2014/58711 出願人：国立大学法人高知大学 発明者：片岡正典、本家孝一、小槻日吉三、福井千春　

発明の名称：アミノアシルヌクレオチド化合物の製造方法出願番号： 特願2014-48194 出願人：国立大学法人高知大学 発明者：片岡正典、本家孝一、小槻日吉三、福井千春　

お問い合わせ先

四国TLO（株式会社テクノネットワーク四国）

技術移転部

TEL: 087-811-5039　FAX: 087-811-5040

E-MAIL: yasuda@s-tlo.co.jp