ヒトiPS細胞から気道・肺胞上皮細胞への効率的な …...CPM ＋細胞を単離するとNKX2-1+細胞が取れた 100 μm 100 μm Scale Bar, 100 μm hPSCs : human

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ヒトiPS細胞から気道・肺胞上皮細胞への効率的な分化誘導法

京都大学大学院医学研究科呼吸器疾患創薬講座／呼吸器内科

特定准教授後藤慎平

肺の上皮細胞は様々な細胞から構成

線毛上皮細胞

粘液産生細胞

クラブ細胞

基底細胞

神経内分泌細胞

Ⅱ型肺胞上皮細胞

Ⅰ型肺胞上皮細胞

近位側気道末梢側気道・肺胞

ヒトES /

iPS 細胞内胚葉前方前腸腹側前方前腸

肺胞上皮細胞

甲状腺咽頭・食道・胸腺・胃など

肝臓・膵臓・腸管など

中胚葉（心臓など）・外胚葉（神経など）

NKX2.1+

気道上皮細胞

Konishi S, et al. Stem Cell Reports. 2016

McCauley KB, et al. Cell Stem Cell. 2017

Hawkins F, et al. J Clin Invest. 2017

Yamamoto Y, et al. Nat Methods. 2017

Jacob A, et al. Cell Stem Cell. 2017

CPM+

発生学の知見に基づいた段階的な分化誘導が有効

Green MD, et al. Nat Biotechnol. 2011

Longmire TA, et al . Cell Stem Cell. 2012

Mou H, et al. Cell Stem Cell. 2012

Ghaedi M, et al. J Clin Invest. 2013

Huang SXL, et al. Nat Biotechnol. 2014

Gotoh S, et al. Stem Cell Reports. 2014

オルガノイド分化誘導

問題点①段階を経るごとに分化誘導効率が低下してしまう

問題点②細胞の単離に適した表面抗原がなかった

問題点③平面培養では再現性と分化効率が低い。特にヒトII

型肺胞上皮細胞は培養も難しいとされてきた。

低効率ヒトES /


呼吸器上皮幹細胞

肺胞上皮細胞

気道上皮細胞

低効率




従来法の問題点

私たちが確立してきた技術

①：腹側前方前腸細胞（＝気道と肺胞上皮の

前駆細胞）を単離できる表面抗原の発見

②：オルガノイド分化誘導法の開発

③：肺胞上皮細胞の分化誘導法と長期培養

④：気道上皮細胞の分化誘導法

ATRA, BMP4,

CHIR99021のABC3因子

の濃度を細胞株ごとに最適化して腹側化。

ヒトES /



肺胞上皮細胞

気道上皮細胞




腹側前方前腸の分化効率を高める方法を開発

Gotoh S, et al. Stem Cell Reports, 2014

Arrow : Carboxypeptidase M (CPM)

Arrowhead : NKX2-1

遺伝子発現マイクロアレイ

Scale Bars, 100 μm

蛍光免疫染色で同じ細胞に染まることを確認

Carboxypeptidase M (CPM)はNKX2-1と同時に同じ細胞で誘導されることで同定


FDR-adjusted p < 0.05

2倍より大きく変化した336遺伝子をクラスター解析

CPMは腹側前方前腸細胞の単離に有用


CPM＋細胞を単離するとNKX2-1+細胞が取れた

100 μm

100 μm

Scale Bar, 100 μm

hPSCs : human pluripotent stem cells

VAFECs : ventralized anterior foregut cells

CPMを表面抗原として利用したNKX2-1+ 前駆細胞の単離

オルガノイド分化誘導法で肺胞を再現

SFTPC-GFP レポーター iPS cells


Lamellar bodies

GFP+ alveolar organoids

分化効率 10-15%

オルガノイドを用いた分化誘導法を開発

Day 21

三次元共培養

II型肺胞上皮細胞

Day 35

CPM+ 細胞の単離

Day 0 Day 10 Day 14Day 6

ヒトiPS細胞内胚葉

前方前腸呼吸器上皮幹細胞

NKX2.1+

前駆細胞

前処理培養で効率よいII型肺胞上皮細胞への分化が可能

Yamamoto Y, et al.

Nat Methods, 2017.

前処理培養

肺胞上皮細胞への分化

CHIR,

KGF,

FGF10,

DAPT

> 3ヶ月以上

ヒトiPS細胞由来II型肺胞上皮細胞

ヒトiPS細胞由来のII型肺胞上皮細胞の長期培養も可能

Yamamoto Y, et al. Nat Methods, 2017.

フィーダー細胞不要なII型肺胞上皮細胞の分化誘導法

Yamamoto Y, et al.

Nat Methods, 2017.

2 μm

2 μm

ヒト由来肺胞上皮細胞への薬剤の影響を可視化


SFTPC-GFP LysoTrackerA

mio

da

ron

eG

NE

791

5

V

eh

icle

20 μm

LR

RK

2 in

hib

ito

r


ヒト由来II型肺胞上皮細胞への薬剤の影響についてオミックス解析が可能

II型肺胞上皮細胞だけを単離して網羅的遺伝子発現解析

気道上皮細胞の分化誘導法も確立

フィーダー細胞の不要なオルガノイド分化誘導

ヒトiPS/

ES 細胞


CPMを用いたNKX2-1+細胞の単離

Konishi S, et al., Stem Cell Reports, 2016

Ac-tub CFTR Merged

Scale bar：25 μm

Medium

Medium

Matrigel

Air-Liquid Interface (ALI)

繊毛機能評価へ

ヒトiPS細胞から分化させた気道上皮細胞はシート状にして機能評価可能

Ac-tub FOXJ1 (Day 56)


ヒトiPS細胞から分化させた気道上皮細胞は形態学的にも成熟した多繊毛を認める

3D-ALI (2D) Brownian motion

3D-ALI (2D)3D

ヒトiPS細胞由来の気道上皮細胞はほぼ正常な機能を持つ


大阪大学月田研との共同研究

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1. 気道や肺胞上皮細胞の両方に分化する前駆細胞を単離するための表面抗原としてCarboxypeptidase M (CPM)を同定したこと

2. オルガノイドを用いた分化誘導法により、分化効率が大幅に改善し安定することを初めて発見

3. 従来、肺に分化しやすい稀少な細胞株を選ばなければならなかったが、１と２により細胞株にあまり依存せずに気道も肺胞上皮細胞も効率よく分化でき、細胞のストックも可能になった

• 細胞を単離出来るCPM抗体は販売が一時期中止されていたが、現在は再開発されて市販されている。

標準化可能な方法で呼吸器上皮細胞を量産化

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1. 再生医療用人工気管や細胞移植による再生治療

2．創薬研究用遺伝性含めた難治性呼吸器疾患や新興感染症を含む呼吸器感染症のモデリング

3．安全性評価用薬剤や曝露物質の肺への毒性評価・動物実験の代替

想定される用途

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実用化に向けて

1. 再生医療用動物移植のモデル開発（細胞移植、脱細胞化足場材料や人工素材の利用も検討）

2．創薬研究用

まずは遺伝性の間質性肺炎、嚢胞性線維症、原発性線毛機能不全症などのモデリングに取り組み、将来的にはCOPD

や呼吸器感染症などメジャーな対象疾患にも広げたい

3．安全性評価用

薬剤性の間質性肺炎やタバコなど肺毒性が懸念される曝露物質の評価方法を開発

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1. 再生医療用肺の臓器再生につながる素材・方法の共同開発

2．創薬研究用疾患特異的iPS細胞や遺伝子改変iPS細胞を用いた呼吸器疾患モデリング、化合物スクリーニングへの利用

3．安全性評価用

国際的な標準化に耐えられるような薬剤や環境曝露物質の細胞レベルでの肺毒性評価方法について共同開発

企業への期待

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「肺胞上皮前駆細胞の誘導方法」特願2013-084034, PCT/JP2014/061106, WO2014/168264

発明者：長船健二、後藤慎平、伊藤功朗、三嶋理晃

「肺胞上皮細胞の分化誘導法」特願2015-045298, PCT/JP2016/057254, WO2016/143803発明者：後藤慎平、山本佑樹、小西聡史、三嶋理晃

「気道上皮細胞の分化誘導法」特願2015-056791, PCT/JP2016/059786, WO2016/148307発明者：後藤慎平、小西聡史、山本佑樹、三嶋理晃

出願者：国立大学法人京都大学管理： iPSアカデミアジャパン株式会社

特許出願

ヒトiPS /

ES 細胞

気道上皮細胞

難治性呼吸器疾患の創薬

肺の再生医療


NKX2.1+

肺胞上皮細胞

「肺胞上皮前駆細胞の誘導方法」特願2013-084034,

PCT/JP2014/061106,

WO2014/168264


「気道上皮細胞の分化誘導法」特願2015-056791,

PCT/JP2016/059786, WO2016/148307

Konishi S, et al. Stem Cell Reports, 2016

「肺胞上皮細胞の分化誘導法」特願2015-045298, PCT/JP2016/057254,

WO2016/143803


気道・肺胞上皮細胞の製造法を標準化して再生医療と創薬への貢献を目指す

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お問い合わせ先

iPSアカデミアジャパン株式会社

ライセンス部宮脇茂樹

TEL： 075-754-0625

FAX： 075-761-3577

e-mail: [email protected]

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ヒトiPS細胞から気道・肺胞上皮 細胞への効率的な …...CPM ＋細胞を単離するとNKX2-1+細胞が取れた 100 μm 100 μm Scale Bar, 100 μm hPSCs : human

ヒトiPS細胞から気道・肺胞上皮細胞への効率的な …...CPM ＋細胞を単離するとNKX2-1+細胞が取れた 100 μm 100 μm Scale Bar, 100 μm hPSCs : human