Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA BIOLOGIJO

Špela GORIČKI

FILOGEOGRAFSKA IN MORFOLOŠKA ANALIZA POPULACIJ MOČERILA (Proteus anguinus)

DOKTORSKA DISERTACIJA

PHYLOGEOGRAPHIC AND MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF EUROPEAN CAVE SALAMANDER (Proteus anguinus) POPULATIONS

DOCTORAL DISSERTATION

Ljubljana, 2006

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). II Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

Doktorska disertacija je bila opravljena na Katedri za zoologijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Senat Biotehniške fakultete je za mentorja disertacije imenoval prof. dr. Petra Trontlja. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Boris Sket Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: doc. dr. Franc Janžekovič Univerza v Mariboru, Pedagoška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Peter Trontelj Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora: 18. 7. 2006 Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Špela Gorički

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). III Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd

DK 575.8:591.9:597.9(043.3)=863

KG Proteus anguinus / Dinarski kras / mitohondrijska DNA / filogenija / morfometrija / biogeografija / taksonomija

AV GORIČKI, Špela, univ. dipl. biol., mag. biol.

SA TRONTELJ, Peter

KZ SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

LI 2006

IN FILOGEOGRAFSKA IN MORFOLOŠKA ANALIZA POPULACIJ MOČERILA (Proteus anguinus)

TD Doktorska disertacija

OP X, 76 str., 22 pregl., 30 sl., 6 pril., 88 vir.

IJ sl

JI sl / en

AI Sorodstveni odnosi med populacijami močerila (Proteus anguinus) so bili dolgo neznanka. Njegovo evolucijsko zgodovino smo ugotavljali s filogenetsko analizo zaporedij mitohondrijskih genov 12S in 16S rDNA pri 19 osebkih s 16 lokalitet. Analizirali smo tudi združena zaporedja rDNA in mitohondrijske kontrolne regije, ki smo jo sekvencirali v okviru magistrske naloge. Filogenetske odnose med haplotipi smo rekonstruirali z metodo varčnosti, metodo največjega verjetja in z Bayesovim pristopom. Z uporabo molekulske ure drugih repatih dvoživk smo približno ocenili čase ločitev kladov. Pri 86 osebkih s 27 lokalitet smo primerjali genetske razdalje v zaporedju kontrolne in sosednjih regij med kladi močerila z genetskimi razdaljami med sestrskimi vrstami drugih repatih dvoživk. Morfometrično smo analizirali skupno 164 primerkov z 29 lokalitet. Na bazalni ravni je filogenetsko drevo ostalo nerazrešeno. Cepitve med tremi največjimi kladi, iz (1) Istre, (2) Slovenije in (3) osrednjih Dinaridov ter Dalmacije in Hercegovine so se po naših ocenah zgodile pred približno 7,5–16 mio let. Ločitev teh kladov bi lahko povzročile morske transgresije Paratetide. Omenjeni kladi se ločijo tudi morfološko, po kombinaciji dolžine glave, repa, zadnjih okončin in števila zob. Klada (2) in (3) sta naprej deljena v dva in tri klade; pigmentirana podvrsta je del JV slovenskega klada. Te cepitve, ki naj bi se zgodile pred približno 4,2–6,6 mio let, sovpadajo z obstojem ločenih jezer v Dinaridih, geografska razširjenost kladov pa s paleohidrografskimi povezavami. Glede na recipročno monofilijo geografsko ali hidrografsko ločenih kladov, visoke genetske razdalje, ki dosegajo ali presegajo genetske razdalje med sestrskimi vrstami drugih dvoživk, in morfološke razlike med večino kladov, smo identificirali šest domnevno samostojnih evolucijskih linij iz: (1) Istre, (2) Dalmacije in Hercegovine (3) Bosanske Krajine, (4) Like, (5) JZ Slovenije in (6) JV Slovenije.

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). IV Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd

DC 575.8:591.9:597.9(043.3)=863

CX Proteus anguinus / Dinaric karst / mitochondrial DNA / phylogeny / morphometrics / biogeography / taxonomy

AU GORIČKI, Špela

AA TRONTELJ, Peter

PP SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology

PY 2006

TI PHYLOGEOGRAPHIC AND MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF EUROPEAN CAVE SALAMANDER (Proteus anguinus) POPULATIONS

DT Doctoral Dissertation

NO X, 76 p., 22 tab., 30 fig., 6 ann., 88 ref.

LA sl

AL sl / en

AB Proteus anguinus is one of the famous subterranean animals, yet its evolutionary history has long remained unknown. To resolve it, mitochondrial 12S and 16S rDNA sequences of 19 specimens from 16 localities were analysed, alone and combined with the control region sequences obtained previously, in the MSc project. Inter-clade genetic distances in control region and flanking sequences of 86 individuals from 27 localities were compared with those of sister species in other salamander genera. Another 164 specimens from 29 localities were studied morphometrically. Using parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference, three high-level clades were identified: from (1) the Istra Peninsula, (2) Slovenia, and (3) central Dinarides and Southern Adriatic coast. Using molecular rates of other salamanders we tentatively dated them at 7.5–16 Myr. The splits might have been brought about by marine transgressions of the Paratethys. These clades could be distinguished morphologically primarily by the combination of head, tail and posterior limb length, and the number of teeth. The clades (2) and (3) were further split, respectively, into two and three geographically restricted clades, with the pigmented subspecies nested within the SE Slovenian clade. These splits, dated at roughly 4.2–6.6 Myr, correspond to the lacustrine phase of the Paratethys, or follow paleohydrographic connections. Based on the reciprocal monophyly of geographically or hydrographycally separated clades, the high genetic divergences, reaching or exceeding those of sister species in other salamander genera, and the detected morphological differentiation between most of the clades we identified six putative independent evolutionary lineages from: (1) Istra, (3) Dalmacija-Hercegovina, (3) Bosanska Krajina, (4) Lika, (5) SW Slovenia and (6) SE Slovenia.

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). V Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

KAZALO VSEBINE Ključna dokumentacijska informacija (KDI) IIIKey words documentation (KWD) IVKazalo vsebine VKazalo tabel VIKazalo slik VIIKazalo prilog IXOkrajšave in simboli X

1 UVOD 11.1 RAZISKOVALNI PROBLEMI, CILJI IN HIPOTEZE 21.1.1 Filogeografska analiza 21.1.2 Morfološka analiza 31.1.3 Identifikacija samostojnih evolucijskih linij močerila 4 2 MATERIALI IN METODE 52.1 ANALIZA DNA 52.1.1 Laboratorijski del 52.1.2 Filogenetska analiza 62.1.3 Primerjava genetske diferenciacije močerila z medvrstnimi

divergencami drugih repatih dvoživk 82.2 MORFOLOŠKA ANALIZA 11 3 REZULTATI 153.1 FILOGEOGRAFIJA MOČERILA 153.1.1 Stopnje genetske diferenciacije populacij močerila 233.2 MORFOLOŠKE RAZLIKE MED POPULACIJAMI 253.2.1 Razlike med kladi Istra, [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in

Slovenija 253.2.2 Razlike med skupinami Bosanska Krajina, Lika, Istra, Dalmacija-

Hercegovina, JZ Slovenija, Stična in [Dolenjska-Bela krajina] 34 4 RAZPRAVA IN SKLEPI 514.1 RAZPRAVA 514.1.1 Filogeografija močerila 514.1.2 Morfološke razlike med populacijami 534.1.2.1 Pregled razlik po znakih in primerjava z rezultati prejšnjih analiz 554.1.3 Samostojne evolucijske linije močerila 594.2 SKLEPI 61 5 POVZETEK 625.1 Povzetek 625.2 Summary 66 6 VIRI 70

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). VI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

KAZALO TABEL

Tabela 1. Seznam osebkov močerila, pri katerih smo analizirali fragment med (vključno) 12S in 16S rDNA.

5

Tabela 2. Osebki močerila, katerih zaporedja CR smo uporabili v primerjavah genetskih razdalj. Podane so tudi hierarhične skupine, med katerimi smo računali genetske razdalje.

9

Tabela 3. Haplotipi 672 bp dolgega poravnanega zaporedja kontrolne regije vrst iz rodu Salamandra. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je dolga 690 bp. V tem delu smo pri močerilu našli 18 različnih haplotipov.

10 Tabela 4. Haplotipi 673 bp dolgega poravnanega zaporedja gena za tRNA-Pro (70 bp) in kontrolne regije (603 bp) vrst iz rodu Ambystoma. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je dolga 680 bp (69 bp tRNA-Pro in 611 bp kontrolne regije). Tudi v tem delu smo pri močerilu našli 18 različnih haplotipov.

10 Tabela 5. Haplotipi 190 bp dolgega poravnanega zaporedja gena za citokrom b (157 bp) in gena za tRNA-Thr (33 bp) vrst iz rodu Dicamptodon. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je prav tako dolga 190 bp. V tem delu smo pri močerilu našli 15 različnih haplotipov.

10 Tabela 6. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 66 primerkov, vključno s črno podvrsto. Po DF2 se istrski in slovenskimi primerki niso razlikovali, tudi če črna podvrsta ni bila vključena v analizo (tedaj: P=0,081).

26 Tabela 7. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij. Enaka razmerja med korelacijami smo dobili, če v analizi nismo upoštevali primerkov črne podvrste.

27 Tabela 8. Primerjava povprečnih vrednosti osnovnih znakov med pari skupin vključno s črno podvrsto (tudi s primerki, ki zaradi manjkajočih vrednosti niso bili vključeni v DFA). Razlike v vrednostih posameznih metričnih znakov smo testirali tudi z znakom lnTRL kot soodvisno spremenljivko. V primerjavah smo uporabili Bonferronijevo korekcijo vrednosti P.

28 Tabela 9. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 128 primerkov, vključno s črno podvrsto. Razlike med skupinami so se povečale ob neupoštevanju črne podvrste, vendar so med skupinama [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Istra po DF1 ostale statistično nepomembne.

30 Tabela 10. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij.

31

Tabela 11. Testiranje razlik med pari skupin v vrednostih osnovnih znakov pri 128 primerkih močerila, vključno s črno podvrsto. V primerjavah smo uporabili Bonferronijevo korekcijo vrednosti P. V analizi kovariance smo upoštevali vpliv telesne dolžine, izražene z lnTRL. Razlike med skupinami v sami dolžini trupa smo testirali tako, da smo kot soodvisno spremenljivko upoštevali telesno dolžino (lnTOL).

32 Tabela 12. Bartlettov test statistične pomembnosti posameznih diskriminantnih funkcij. 35 Tabela 13. Pari morfološko najbolj podobnih vzorcev in razdalje med njihovimi centroidi na drevesu najmanjšega razvejanja.

36

Tabela 14. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari genetskih skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 61 primerkov bele podvrste. Ob vsaki DF so prikazani samo tisti pari skupin, ki se po njej v povprečju signifikantno razlikujejo.

36

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). VII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

Tabela 15. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij.

37

Tabela 16. Primerjava parov skupin po posameznih metričnih znakih. Znak lnTRL smo upoštevali kot soodvisno spremenljivko. V primerjavo so vključeni tudi primerki, ki jih v DFA zaradi manjkajočih vrednosti nekaterih znakov nismo upoštevali. Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

40 Tabela 17. Primerjava parov skupin po posameznih merističnih znakih. V primerjavo so vključeni tudi primerki, ki jih v DFA zaradi manjkajočih vrednosti nekaterih znakov nismo upoštevali. Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

41 Tabela 18. Bartlettov test statistične pomembnosti posameznih diskriminantnih funkcij. 43 Tabela 19. Pari morfološko najbolj podobnih vzorcev in razdalje med njihovimi centroidi na drevesu najmanjšega razvejanja.

43

Tabela 20. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 116 primerkov bele podvrste. Ob vsaki DF so prikazani samo tisti pari skupin, ki se po njej v povprečju signifikantno razlikujejo.

44 Tabela 21. Korelacije znakov s kanoničnimi diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij.

45

Tabela 22. Primerjava parov skupin po posameznih metričnih znakih. Znak lnTRL smo upoštevali kot soodvisno spremenljivko (v primerjavi lnTRL smo kot soodvisno spremenljivko upoštevali lnTOL). Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

46 KAZALO SLIK

Slika 1. Proteus anguinus anguinus (levo) je razširjen holodinarsko, Proteus anguinus parkelj (desno) pa je znan le iz okolice Črnomlja v jugovzhodni Sloveniji (Sket, 1997). Foto: Arne Hodalič.

2

Slika 2. Shematski prikaz 18 izmerjenih znakov. 12 Slika 3. Kladogram večinskega soglasja po kriteriju varčnosti močerilovih haplotipov rDNA, koreninjen s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Tri najvarčnejša drevesa so se razlikovala v odnosih znotraj klada [N. alabamensis + N. beyeri + N. cf. beyeri]. Prikazane so relativne podpore razvejitev, izražene v odstotkih. Podpore, nižje od 50%, niso prikazane.

16 Slika 4. Drevo največjega verjetja močerilovih haplotipov rDNA, koreninjeno s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij, merilo predstavlja 0,05 substitucij na nukleotidno mesto. Številke na razvejitvah so v odstotkih izražene relativne podpore; navedene so samo podpore, višje od 50%.

17 Slika 5. Drevo močerilovih haplotipov rDNA po Bayesovi metodi, koreninjeno s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij. Merilo prikazuje 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Prikazane so posteriorne verjetnosti posameznih cepitev. Za dobro podprte cepitve veljajo tiste s posteriorno verjetnostjo, višjo od 0,95.

18

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). VIII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

Slika 6. Kladogram močerilovih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena) po kriteriju varčnosti, koreninjen s haplotipi vrst iz rodov Ambystoma, Lyciasalamandra, Salamandra in Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Na drugem enako varčnem drevesu je bil položaj haplotipov N. alabamensis in N. beyeri zamenjan. Prikazane so relativne podpore razvejitev, izražene v odstotkih. Podpore, nižje od 50%, niso prikazane.

19 Slika 7. Drevo največjega verjetja močerilovih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena), koreninjeno s haplotipi vrst iz rodov Necturus, Salamandra, Lyciasalamandra in Ambystoma. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij, merilo predstavlja 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Številke na razvejitvah so v odstotkih izražene relativne podpore; navedene so samo podpore, višje od 50%.

20 Slika 8. Drevo mitohondrijskih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena) po Bayesovi metodi. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij. Merilo prikazuje 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Prikazane so posteriorne verjetnosti posameznih cepitev. Za dobro podprte cepitve veljajo tiste s posteriorno verjetnostjo, višjo od 0,95.

21 Slika 9. Približne ocene časa ločitve šestih kladov, izražene v milijonih let. Dolžine vej niso sorazmerne s številom substitucij. Za oceno nižjih vrednosti smo uporabili hitrost evolucije mitohondrijskih genov rDNA rodov Taricha in Notophthalmus (0,0047 substitucij na nukleotidno mesto v milijonu let), zgornje vrednosti smo ocenili glede na hitrost evolucije teh genov pri rodovih Euproctus in Calotriton (0,0038 substitucij na nukleotidno mesto v milijonu let) (Caccone in sod., 1997). Približno 4–5 milijonov let sta stari tudi liniji [Necturus alabamensis + N. beyeri] in Necturus maculosus. N. punctatus je od klada teh treh vrst ločen približno 19–23,5 milijone let.

22 Slika 10. Primerjava patrističnih genetskih razdalj med sestrskimi kladi močerila in sestrskimi vrstami iz rodov Salamandra (A), Ambystoma (B) in Dicamptodon (C). Kjer odnosi med kladi niso razrešeni, smo primerjali vse možne pare.

24 Slika 11. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA devetih morfoloških znakov (A). Na sliki B je prikazana uspešnost klasifikacije vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izpeljanih iz vseh ostalih primerkov.

25 Slika 12. Vrednosti diskriminantnih funkcij pri primerkih iz treh bazalnih kladov. Analiza je bila opravljena na devetih osnovnih znakih.

26

Slika 13. Relativne dolžine netransformiranih metričnih znakov, uporabljenih v DFA, glede na dolžino trupa kot mero telesne dolžine. Najbolj očitno se vsi trije bazalni kladi razlikujejo v dolžini glave.

27 Slika 14. Netransformirani znaki ali njihova razmerja, po katerih se istrska skupina najbolj razlikuje od drugih dveh.

29

Slika 15. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA osmih morfometričnih znakov (A) in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih primerkov (B). V obeh primerih je bila klasifikacija brez primerkov črne podvrste enako učinkovita.

30 Slika 16. Vrednosti diskriminantnih funkcij pri primerkih iz treh bazalnih kladov. Postopna analiza je bila opravljena na 18 metričnih znakih, od katerih je bilo osem informativnih.

31

Slika 17. Relativne dolžine netransformiranih metričnih znakov uporabljenih v postopni DFA glede na dolžino trupa kot mero telesne dolžine (z izjemo znaka TRL, ki smo ga prikazali glede na TOL) pri treh bazalnih kladih.

33 Slika 18. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA devetih morfoloških znakov in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). IX Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

primerkov, vključno s primerki črne podvrste (A, B) in ob njihovi predhodni izključitvi iz analize (C, D).

34

Slika 19. Projekcija osebkov sedmih genetskih skupin močerila na prve štiri diskriminantne funkcije. Primerek iz like smo mapirali a-posteriori.

35

Slika 20. Primerki iz Stične imajo relativno krajše zadnje okončine in daljši rep v primerjavi s primerki iz JZ Slovenije. Vrednosti črne podvrste niso prikazane.

37

Slika 21. Primerki iz Bosanske Krajine imajo manj zob na vomerju kot na dentale, liški, dalmatinsko-hercegovski, istrski in JZ slovenski pa vsaj toliko ali več. V levi prikaz niso vključeni primerki črne podvrste, desno so zajeti v skupini [Dolenjska-Bela krajina].

38 Slika 22. Primerki iz Bosanske Krajine imajo relativno daljše zadnje okončine in rep od sorodnih primerkov skupine Dalmacija-Hercegovina.

38

Slika 23. Stiški primerki imajo v povprečju manj zob kot drugi slovenski. V primerjave črna podvrsta ni zajeta.

39

Slika 24. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA enajstih morfometričnih znakov (A) in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih primerkov (B) vključno s primerki črne podvrste in ob njihovi predhodni izključitvi iz analize (C, D).

42 Slika 25. Projekcija osebkov sedmih genetskih skupin močerila na prve štiri diskriminantne funkcije. Primerek iz Like smo mapirali a-posteriori. Vrednosti primerkov na peti diskriminantni osi niso prikazane, saj ta razloži manj kot 3% razlik med skupinami.

43 Slika 26. V primerjavi s stiškimi imajo dolenjsko-belokranjski primerki sorazmerno krajši posteriorni del glave glede na dolžino vratu. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

48

Slika 27. Primerki iz [Dolenjske-Bele krajine] imajo večinoma daljše sprednje okončine od JZ-slovenskih. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

48

Slika 28. Stiški primerki imajo sorazmerno višjo repno plavut od JZ-slovenskih. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

49

Slika 29. Stiški primerki se od drugih slovenskih v manjši meri ločijo tudi po dolžini gobca, ko upoštevamo še druge znake, ki merijo obliko glave. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

49

Slika 30. Primerki iz Bosanske Krajine se od drugih pripadnikov klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] razlikujejo tudi po tem, da imajo dolgo nadlaht ter daljši in nižji rep.

50

KAZALO PRILOG PRILOGA A. Opravljene analize jedrne DNA PRILOGA B. Velikosti vzorcev in seznam analiziranih primerkov PRILOGA C. Primerjava vrednosti metričnih znakov med dvema izvajalcema meritev PRILOGA D. Korelacije med znaki PRILOGA E. Testiranje odstopanja od izometrične rasti PRILOGA F. Rezultati testiranja spolnega dimorfizma v relativni dolžini okončin

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). X Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A adenin BI Bayesova statistika (»Bayesian inference«) bp bazni par C citozin CR mitohondrijska kontrolna regija cytb citokrom b df stopinje prostosti DFA kanonična diskriminantna analiza DNA deoksiribonukleinska kislina G gvanin GTR »general time-reversible« model nukleotidne substitucije H nukleotid A, C ali T I inozin; delež nevariabilnih mest ITS »internal transcribed spacer« ln naravni logaritem M nukleotid A ali C MCMC »Markov Chain Monte Carlo« ML metoda največjega verjetja (»maximum likelihood) MP največja varčnost (»maximum parsimony«) MST drevo najmanjšega razvejanja mtDNA mitohondrijska DNA Nu nukleotidno mesto P stopnja tveganja PCR verižna reakcija s polimerazo R nukleotid A ali G rDNA gen za ribosomsko RNA rRNA ribosomska RNA SE standardna napaka T timin Taq Thermus aquaticus TBR metoda razreza in ponovnega združevanja tRNA prenašalna RNA tRNA-Phe fenilalaninska tRNA tRNA-Pro prolinska tRNA tRNA-Thr treoninska tRNA tRNA-Val valinska tRNA W nukleotid A ali T Y nukleotid C ali T Г gama porazdelitev

Gorički, Š. Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila (Proteus anguinus). 1 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2006

1 UVOD Dinarski kras je mozaik jurskih in poznokrednih topnih apnencev ter netopnih kamnin in usedlin (Herak, 1957). Vode v prevotljenem apnencu so habitat številnih podzemeljskih organizmov, med katerimi je zagotovo najbolj slavna človeška ribica ali močeril (Proteus anguinus Laurenti, 1768). Vendar te kraške vode niso povezane v neprekinjeni podzemeljski splet, ampak zaradi netopnih zaplat deloma tečejo po površju. Tako je prekinjena migracija osebkov med izključno podzemeljskimi populacijami, z njo pa tudi genski pretok. Skozi geološko zgodovino se je območje današnjega Dinarskega krasa predvsem zaradi tektonskih premikov in klimatskih dejavnikov zelo spreminjalo. Takšne spremembe lahko predstavljajo oviro genskemu pretoku med prej povezanimi populacijami. Če dovolj dolgo onemogočajo genski pretok, se genski skladi populacij ločijo (Avise, 2000). Ločeni genski skladi se lahko razvijejo tudi zaradi premikov arealov, lokalnih izumrtij in nihanj demografskih lastnosti. S filogeografijo skušamo ugotoviti, kakšen vpliv na sedanjo razširjenost genskih lastnosti organizmov imajo ti zgodovinski demografski procesi v populacijah. Geografsko razporeditev genskih linij razlagamo z dvema osnovnima pojavoma, vikarianco in disperzijo, ki se ponavadi prepletata: disperziji pogosto sledi vikarianca zaradi sprememb v okolju. Po drugi strani nam povezovanje geografskih podatkov in genetske variabilnosti omogoča preverjanje obstoječih in oblikovanje novih hipotez o geografski ali ekološki zgodovini območja. Genetsko različnost populacij običajno spremljajo morfološke razlike. Izjemoma globoke genetske diferenciacije ne spremlja večja morfološka variabilnost, kadar so morfološki znaki na primer pod velikim vplivom enako usmerjene selekcije. V primerjavi z genetskimi znaki je lahko vpliv okolja na morfološke znake neposrednejši in pogostejši. Zaradi selekcije prihaja do konvergenc, to je do podobnih izpeljanih morfoloških stanj, ki izvirajo iz med seboj različnih predniških stanj (ali pa do divergenc). Morfološko podobnost genetsko globoko diferenciranih populacij lahko razlagamo tudi kot paralelizme, kadar izhajajo podobna izpeljana stanja iz podobnih predniških stanj (Wiens in sod., 2003; Wilcox in sod., 2004). Vendar ne konvergence ne paralelizmi niso nujno adaptivnega značaja. Pri močerilu, ki ohrani nekatere larvalne morfološke lastnosti celo življenje, se pojavlja kar nekaj morfoloških znakov, ki so v tesni povezavi z njegovim pojavljanjem izključno v podzemlju (troglomorfoze). Predvsem zaradi podobnosti večine populacij v splošnih pedomorfnih in troglomorfnih znakih, po drugi strani pa zaradi dokaj velikih morfometričnih razlik znotraj večjih, geografsko razmejenih skupin populacij (Kranjec, 1981; Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997), je močeril taksonomsko problematičen že več kot stopetdeset let. Fitzinger (1850) ga je glede na morfološke razlike med nekaj primerki razdelil na sedem vrst: Hypochthon zoisii (Rupnica pri Stični), H. schreibersii (Vir pri Stični), H. freyeri (Kompoljska jama), H. haidingeri (Planinska jama v postojnsko-planinskem jamskem sistemu – PPJS), H. laurenti (Črna jama v PPJS), H. xanthostictus (Beden – v povezavi s PPJS) in H. carrarae (Sinj v Dalmaciji). Brusina (1880) je tem dodal še vrsto Proteus croaticus (Otočac v Liki) (cit. po Sket, 1997). Razen na ravni podvrst vrste P. anguinus (Schreiber, 1912; de Fejérváry, 1926) ti taksoni niso bili splošno sprejeti. Danes na podlagi morfoloških razlik ločujemo dve podvrsti (Slika 1): Proteus anguinus anguinus Laurenti, 1768 (v nadaljevanju: bela podvrsta), in P. a. parkelj Sket in Arntzen, 1994 (v nadaljevanju: črna podvrsta).


Slika 1. Proteus anguinus anguinus (levo) je razširjen holodinarsko, Proteus anguinus parkelj (desno) pa je znan le iz okolice Črnomlja v jugovzhodni Sloveniji (Sket, 1997). Foto: Arne Hodalič. Rezultati alocimske analize nekaterih slovenskih populacij (Sket in Arntzen, 1994) in geografsko obširnejše analize kontrolne regije (CR) mitohondrijske DNA (mtDNA) (Gorički, 2004) so pokazali, da skupina populacij bele podvrste ni monofiletska. Z analizo zaporedij mtDNA smo ugotovili, da je močeril globoko genetsko diferenciran. Vrsto sestavlja vsaj šest ločenih kladov mitohondrijskih haplotipov, ki ustrezajo naslednjim geografskim območjem: (1) Istra, (2) Lika in Gorski Kotar, (3) Dalmacija in Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) jugozahodna Slovenija in (6) jugovzhodna Slovenija, katere del je tudi črna podvrsta. Grobe ocene časa ločitev linij močerila na osnovi mtDNA postavljajo ločitev istrske, liško-bosansko-dalmatinske in slovenske linije v miocen, 10,5–7,2 milijonov let nazaj. Do ločitve zahodnih in vzhodnih populacij slovenskega krasa je po teh ocenah prišlo v začetku pliocena ali že konec miocena, pred 6,6–4,4 milijoni let, med belo in črno podvrsto pa pred 2,4–1,1 milijonom let. 1.1 RAZISKOVALNI PROBLEMI, CILJI IN HIPOTEZE 1.1.1 Filogeografska analiza Za ugotavljanje genetske diferenciacije močerila smo doslej analizirali zaporedje kontrolne regije in sosednjih odsekov mtDNA. Domnevna bazalna cepitev na linijo iz Istre in klad [Slovenija + [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]] je ostala vprašljiva. Možen vzrok za to je uporaba neprimernih taksonov, s katerimi smo koreninili filogenetsko drevo. Ker sta CR in predvsem bližnji nekodirajoči vmesnik zelo variabilna, te regije pri najbližnjem sorodniku močerila, rodu Necturus (Trontelj in Gorički, 2003; Wiens in sod., 2005; toda glej Weisrock in sod., 2005) nismo uspeli pomnožiti. Za koreninjenje drevesa smo zato uporabili znana zaporedja manj sorodnih vrst iz družin Ambystomatidae in Salamandridae, kar je zaradi številnih razlik oteževalo usklajevanje zaporedij. Nerazrešeni so ostali tudi odnosi znotraj klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]. Najmanj variabilni odseki mtDNA, taka sta oba gena za ribosomalni RNA (rRNA) in geni za prenašalne RNA (tRNA), omogočajo zanesljivejše usklajevanje zaporedij. Ob zadostnem številu razlik lahko z njimi razrešimo globlje cepitve na drevesu. Prvi namen tega dela je zato preveriti sorodstvene odnose monofiletskih skupin močerila z analizo odseka, ki vsebuje gene


za 12S in 16S rRNA ter tRNA-Val. Z uporabo molekulske ure mitohondrijskih genov rRNA, kalibrirane na času ločitve rodov Euproctus in Calotriton ter Taricha in Notophthalmus (Caccone in sod., 1997) bomo ocenili čas njihovih ločitev in preverili ujemanje z ocenami na podlagi hitrosti evolucije kontrolne regije. Filogenetske odnose bomo rekonstruirali tudi s pomočjo informacije v celotnem znanem zaporedju mtDNA, to je na podlagi združenih zaporedij dela gena za citokrom b, zaporedja kontrolne regije, treh celotnih in enega delnega zaporedja genov tRNA in delnih zaporedij genov rRNA. Gensko drevo mitohondrijskih haplotipov verjetno pravilno prikazuje filogenetske odnose med geografskimi populacijami močerila. To hipotezo bomo preverili po naslednjih kriterijih genealoškega ujemanja (gl. tudi Avise, 2000): (1) ujemanje genealoških dreves funkcionalno različnih regij mitohondrijskega genoma, (2) ujemanje z vzorcem alocimske variabilnosti nekaterih slovenskih populacij (Sket in Arntzen, 1994), (3) ujemanje s filogeografskim vzorcem podobno razširjene jamske kozice Troglocaris anophthalmus (Zakšek in sod., v reviziji) in slovenskih podzemeljskih populacij vodnega oslička Asellus aquaticus (Verovnik in sod., 2004) ter (4) z identifikacijo domnevnih paleogeografskih procesov kot dejavnikov, ki so oblikovali opažen filogeografski vzorec mtDNA močerila. Diferenciacijo močerila je mogoče razložiti z zaporedno fragmentacijo areala, najprej zaradi domnevnih sprememb morske gladine okrog območja Dinarskega krasa in Istre. Nadalje so se kladi lahko diferencirali v domnevnih ločenih jezerih v osrednjih Dinaridih in končno s fragmentacijo zaradi sprememb hidrografskih povezav. Diferenciacijo znotraj nekaterih hidrografsko povezanih skupin populacij je mogoče razložiti z izolacijo z razdaljo, genetsko homogenost nekaterih hidrografsko ločenih populacij pa s šele nedavno prekinitvijo hidrografskih povezav. To hipotezo bomo preverili s podatki o paleogeografski zgodovini Dinarskega krasa in časovnim ujemanjem prekinitev geografskih in hidrografskih povezav med deli močerilovega areala z ocenjenimi časi ločitev monofiletskih skupin. Glede na starost treh velikih skupin populacij, ki presega domnevni dvig apnencev v Dinaridih in posledično zakrasevanje, domnevamo, da je kolonizacija podzemlja vsaj teh treh linij potekala neodvisno druga od druge. 1.1.2 Morfološka analiza Če lahko filogeografski vzorec mtDNA interpretiramo kot filogeografski vzorec populacij močerila, so si zaključki dosedanjih analiz morfološke variabilnosti (Kranjec, 1981; Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) med seboj nasprotujoči in neskladni z rezultati genetske analize iz dveh možnih vzrokov: (1) zaradi nenaravne razmejitve primerjanih skupin populacij, ki se ne ujema s historično, evolucijsko razmejitvijo populacij, ali (2) zaradi homoplastičnega značaja določenih morfoloških stanj. Pričakujemo ujemanje med osnovno genetsko členjenostjo taksona in nezveznostjo morfološke variabilnosti, tudi pri znakih, ki bi lahko bili pod velikim vplivom selekcijskega pritiska. Med sorodnimi skupinami, ki so podzemlje domnevno naselile ločeno, obstajajo zaradi konvergentne evolucije kljub morfološki podobnosti pomembne majhne razlike med stanji, ki presegajo razlike znotraj skupine. Za domnevno samostojne evolucijske linije (gl. spodaj, pogl. 1.1.3) bomo poiskali razlikovalne morfološke znake.


1.1.3 Identifikacija samostojnih evolucijskih linij močerila Samostojna evolucijska linija je zaporedje populacij v smeri prednik-potomci, ki se razvija ločeno od drugih in ima lastno enotno evolucijsko vlogo in težnje (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005). Znotraj linije so populacije povezane z genskim pretokom, med linijami pa genskega pretoka ni (Wiens, 2004). Ta koncept so uporabili na primer v taksonomski analizi teksaških pedomorfnih brezpljučarjev (Chippindale in sod., 2000), kjer so samostojne evolucijske linije opisali kot vrste, in v analizi evolucije eko-morfološke variabilnosti rodu Desmognatus (brezpljučarji; Kozak in sod., 2005), kjer so jih upoštevali kot enote primerjav. Samostojne evolucijske linije je mogoče razpoznati glede na več neodvisnih kriterijev. Populacije, ki so dovolj dolgo geografsko izolirane, lahko preko izločanja linij postanejo monofiletske, lahko se diferencirajo genetsko, morfološko, vedenjsko, ekološko in na druge načine, lahko postanejo tudi intrinzično reproduktivno izolirane. Kot samostojne evolucijske linije prepoznamo tiste geografsko ločene klade, ki so razvili eno ali več od teh lastnosti (Mayden, 1997; Wiens, 2004). Pri močerilu lahko prepoznamo več samostojnih evolucijskih linij. Domnevno ločene evolucijske linije bomo prepoznali na osnovi monofilije geografsko ali hidrografsko ločenih mitohondrijskih haplotipov (Wiens in Penkrot, 2002) ter glede na stopnjo genetskih razlik, ki dosega ali presega genetsko divergenco sestrskih vrst pri drugih rodovih repatih dvoživk. Za domnevno samostojne evolucijske linije, razmejene na osnovi genetske izoliranosti, bomo poiskali razlikovalne morfološke znake. Genetska izoliranost samostojnih evolucijskih linij močerila je posledica njihove geografske izoliranosti, zato se nekatere ujemajo z morfološkimi vrstami, ki sta jih opisala Fitzinger (1850) in Brusina (1880). 'Vrste', ki jih je Fitzinger (1850) opisal iz hidrografsko povezanih lokalitet, pripadajo isti evolucijski liniji.


2 MATERIALI IN METODE Celotni seznam primerkov, ki smo jih vključili v različne analize, je podan v Prilogi B (Tabela B1). V nadaljevanju so ločeno navedeni primerki ki smo jih analizirali v vsaki od genetskih analiz, seznam primerkov, ki smo jih analizirali morfometrično, pa podajamo v Tabeli B4 (Priloga B). 2.1 ANALIZA DNA 2.1.1 Laboratorijski del Fragment mitohondrijske DNA, ki vsebuje gene za 12S in 16S rRNA ter tRNA-Val, smo sekvencirali pri 19 osebkih močerila (Tabela 1). Izbrali smo jih tako, da so bile zastopane vse genetske linije kontrolne regije. Z izjemo osebka VI216 smo za pomnoževanje fragmenta uporabili že izolirano genomsko DNA (Gorički, 2004), shranjeno pri –20 ºC. DNA osebka VI216 smo izolirali iz koščka repne plavuti po postopku »mammalian tissue« kompleta GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma). Odvzem tkivnega vzorca z žive živali na kraju ulova je bil odobren z dovoljenjem Ministrstva za okolje, prostor in energijo št. 35701-81/2004 z dne 20. 10. 2004. Tabela 1. Seznam osebkov močerila, pri katerih smo analizirali fragment med (vključno) 12S in 16S rDNA. Skupina haplotipov CRa Lokaliteta Oznaka Bosanska Krajina Dabarska pećina, Lušci polje, Sanski most, BiH DP206 Suvaja pećina, Lušci polje, Sanski most, BiH SP205 Lika Markarova pećina, Stajnica, Otočac, HR MP160 Rupečica, Ivanci, Ogulin, HR RP156 Dalmacija-Hercegovina Miljacka pećina, Šibenik, HR MI158 Vrelo Stuba, Vedrine, Trilj, HR VR48 Vjetrenica, Zavala, Popovo polje, BiH VJ154 Istra Pincinova jama, Nova vas, Poreč, HR PI112, PI120, PI121 JZ Slovenija Mejame, Dane, Divača, SI ME55 Gašpinova jama, Logatec, SI GA167 Malo okence, Verd, Vrhnika, SI MA110 Planinska jama, Planina, SI PL98 JV Slovenija Vir pri Stični, Stična, SI VI216 Kompoljska jama, Dobrepolje, SI KO12 Na trati, Jelševnik, Črnomelj, SI (črna podvrsta) JE143, JE152 Otovški breg, Otovec, Črnomelj, SI OT153

aGorički in Trontelj, 2006 Po istem protokolu smo izolirali tudi genomsko DNA naslednjih vrst (v oklepaju je navedena kataloška oznaka primerka, s katerega je bil odvzet košček tkiva): Necturus alabamensis (Museum of Vertebrate Zoology, Univ. of California: MVZ 187705), N. beyeri (MVZ 187709), N. punctatus (MVZ 187707) in N. maculosus (Oddelek za biologijo Univ. v Ljubljani: ni katalogiziran).


Fragment mtDNA dolžine približno 1900 bp smo pomnožili z oligonukleotidoma 12Sa (5'-AAAACIIGGATTAGATACCC-3'; modificiran po Kocher in sod., 1989) in 16Sbr (5'-CCGGTCTGAACTCAGATCA-3'; Simon in sod., 1991) v verižni reakciji s polimerazo Taq in z naslednjim temperaturnim profilom: 45 s pri 94 ºC, 45 s pri 53 ºC in 2 min 30 s pri 72 ºC. Tridesetim ciklom je sledila še 5-minutna faza podaljševanja pri 72 ºC. Produkt smo očistili preko membranskega sistema Millipore Montage (Bedford) in ga resuspendirali v vodi. Za sekvenciranje smo poleg oligonukleotidov 12Sa in 16Sbr uporabili še oligonukleotida P12Sf (5'-GCATAATGGTCCAGCAAGT-3') in P16Sr (5'-TTCTTGCTACTCATTTCAG-3'), ki se prilegata zaporedju približno 730–750 bp navznoter od oligonukleotidov 12Sa in 16Sbr. Ker smo ju izdelali upoštevajoč predvsem zaporedje močerila, sekvenciranje z oligonukleotidom P16Sr pri nekturu ni bilo uspešno. Vendar se zaporedja, ugotovljena z različnimi oligonukleotidi, v tem delu v veliki meri prekrivajo, zato smo tudi pri nekturu z uporabo samo treh oligonukleotidov ugotovili celotno zaporedje. Sekvenciranje je izvedlo podjetje Macrogen (www.macrogen.com) po protokolu BigDyeTM terminator (Applied Biosystems) na avtomatskem sekvenatorju ABI3730XL (Applied Biosystems). Fragment med oligonukleotidoma 12Sa in 16Sbr je bil pri večini osebkov močerila sekvenciran v dolžini najmanj 1885 bp, pri osebkih VI216, MI158 in VJ154 pa prvih 50 nukleotidov ni bilo mogoče razbrati. Vsa zaporedja nekturov smo ugotovili v celotni dolžini. Po že opisanem postopku (Gorički, 2004; Gorički in Trontelj, 2006) smo pri osebku VI216 pomnožili tudi zaporedje CR in sosednjih genov, to je zaporedje med oligonukleotidoma Pcytb in PFr (v nadaljevanju zaporedje CR). S tema oligonukleotidoma smo dali regijo sekvencirati pri podjetju Macrogen. Filogenetske odnose med haplotipi mtDNA smo skušali preveriti z analizo neodvisnih znakov v jedrni DNA. Pomnoževali in sekvencirali smo več jedrnih regij, vendar informativnega zaporedja nismo uspeli najti. Opravljene analize jedrne DNA so opisane v Prilogi A. 2.1.2 Filogenetska analiza Filogenetsko drevo močerila smo ugotavljali (1) iz zaporedij med oligonukleotidoma 12Sa in 16Sbr (v nadaljevanju: zaporedja rDNA) in (2) iz sestavljenih zaporedij, tako da smo fragment rDNA pripojili k zaporedju CR (v nadaljevanju: celotna zaporedja). V prvem primeru smo za koreninjenje drevesa uporabili zaporedja nekturov, ki smo jih prebrali sami (glej zgoraj) in homologni zaporedji Necturus maculosus DQ283412 in Necturus cf. beyeri DQ283151 (obe Frost in sod., 2006) iz baze GenBank. Za koreninjenje močerilovega filogenetskega drevesa iz celotnih zaporedij smo poleg omenjenih uporabili še homologna zaporedja naslednjih vrst: Ambystoma laterale AY728218, A. californiense AY659995, A. tigrinum AY659992, A. dumerilii AY659994, A. andersoni AY659993, A. mexicanum AY659991 (vse Samuels in sod., 2005), A. mexicanum AJ584639 (Mueller in sod., 2004), Lyciasalamandra atifi AF154053 (Zardoya in Meyer, 2001) in Salamandra salamandra. Slednje zaporedje smo sestavili iz treh neodvisnih virov: AY035819 (citokrom b; Riberon in sod., 2001), DQ232892 (kontrolna regija; Steinfartz in sod., 2000) in DQ283440 (rDNA; Frost in sod., 2006). Tak postopek je na ravni primerjave vrst iz različnih družin upravičen (Wiens in sod., 2005). Zaporedja močerilu manj sorodnih vrst iz družin Ambystomatidae in Salamandridae smo uporabili, ker nam zaporedij CR nektura, ki je najverjetneje močerilov


najbližji sorodnik (Trontelj in Gorički, 2003; Wiens in sod., 2005), ni uspelo pomnožiti in jih tudi ni na voljo v podatkovnih bazah. Homologna zaporedja smo poravnali s pomočjo programa Muscle (Edgar, 2004). Ločeno smo uskladili zaporedja rDNA in zaporedja CR. Za analizo celotnih zaporedij smo usklajena zaporedja rDNA pripojili k usklajenim zaporedjem CR. Pri slednjih smo iz analize predhodno izločili oba odseka tandemskih ponovitev (utemeljitev v Gorički in Trontelj, 2006) in zaradi nezanesljive uskladitve z drugimi vrstami tudi neponovljeni del vmesnika med genoma tRNA-Thr in tRNA-Pro. Tako smo v analizi uporabili 1038 bp dolgo poravnavo zaporedij CR (poravnanih 157 bp gena za citokrom b, 71 bp gena za tRNA-Thr, 73 bp gena za tRNA-Pro, 716 bp kontrolne regije in 21 bp gena za tRNA-Phe). Zaporedja rDNA smo uskladili v 1921 bp dolgo poravnavo, od tega je prvih 470 bp gen za 12S rRNA, naslednjih 69 bp gen za tRNA-Val in zadnjih 1382 bp gen za 16S rRNA. V tem odseku je bilo 568 variabilnih nukleotidnih mest, od katerih je bilo 455 informativnih po metodi varčnosti. V celotnem zaporedju (in v primerjavi več vrst kot samo na delu rDNA) je bilo od 2988 nukleotidnih mest variabilnih 1422 in informativnih po kriteriju varčnosti 1237 znakov. Filogenetske odnose med haplotipi smo ugotavljali po metodi varčnosti (»maximum parsimony«, MP), največjega verjetja (»maximum likelihood«, ML) in po Bayesovi metodi (»Bayesian inference«, BI). V metodi varčnosti smo vsem tipom nukleotidnih substitucij dodelili enako težo. Drevesa MP smo iskali hevristično z naključnim dodajanjem taksonov (zaporedij) in premeščanjem vej po metodi razreza in ponovnega združevanja (»tree bisection and reconnection«, TBR). Obe fazi izbora najbolj varčnega drevesa smo 100-krat ponovili. Za iskanje najbolj varčnega drevesa smo uporabili program PAUP*, verzija 4b10 (Swofford, 2002). Za iskanje drevesa največjega verjetja in Bayesovega drevesa smo najprej ugotovili substitucijski model po kriteriju AIC (»Akaike information criterion«), ki je vgrajen v program Modeltest, verzija 3.7.c (Posada in Crandall, 1998). Po tem kriteriju se zaporedja CR najverjetneje spreminjajo po modelu GTR+Γ, zaporedja rDNA pa po modelu GTR+I+Γ. Oba modela upoštevata razlike v frekvenci nukleotidov, različne verjetnosti posameznih substitucij in različno pogostost substitucij na različnih pozicijah vzdolž zaporedja. To značilnost opiše prvi model z diskretno aproksimacijo distribucije gama, s 4 hitrostnimi razredi, drugi pa tudi z deležem nukleotidnih mest, ki se ne spreminjajo. Slednji model smo uporabili za iskanje obeh dreves ML (drevo rDNA in drevo celotnih zaporedij) s programom Phyml, verzija 2.4.4 (Guindon in Gascuel, 2003), tako da smo vrednosti parametrov modela optimizirali z ML. Statistične podpore posameznih cepitev na vseh drevesih MP in ML smo izračunali z neparametričnim testom samovzorčenja (»bootstrap«) s po 500 ponovitvami. Drevo BI smo poiskali s programom MrBayes, verzija 3.1.2 (Ronquist in Huelsenbeck, 2003). Pri tej metodi je možno za različne odseke zaporedja uporabiti različne modele. Ker pa sta si modela zelo sorodna, tako da je možno model GTR+I+Γ opisati tudi z modelom GTR+Γ in obratno (Yang, 1996), smo tudi v tem postopku uporabili model GTR+I+Γ za iskanje obeh dreves. Posteriorne verjetnosti cepitev smo iskali z algoritmom MCMC (»Markov Chain Monte Carlo«). Hkrati smo vzorčili drevesa iz vsake od štirih markovskih verig s po 1×106 stanji. Vzorčili smo vsako stoto sprejeto stanje, s čimer smo se izognili avtokorelaciji zaporednih vzorcev. V izračunih posteriornih verjetnosti prvih 700 stanj nismo upoštevali, saj v tem času veriga še ni dosegla stacionarnosti in so se ocene posteriornih verjetnosti še bistveno spreminjale.


Za ocenjevanje časa ločitev kladov smo uporabili hitrost evolucije delnih zaporedij 12S in 16S rDNA pri rodovih Euproctus in Calotriton ter Taricha in Notophthalmus (Caccone in sod., 1997). Ta znaša 0,38% razlik na milijon let za prvi par in 0,47% za drugi. Ocene časa ločitve na podlagi prve hitrosti smo uporabili kot zgornjo, slednje pa kot spodnjo mejo časovnega intervala. V odsekih obeh genov, ki so jih uporabili avtorji kalibracije, smo izračunali povprečne distance med kladi po modelu GTR+I+Γ za uporabljene sekvence in jih preračunali v čas ločitve. 2.1.3 Primerjava genetske diferenciacije močerila z medvrstnimi divergencami drugih repatih dvoživk Dele zaporedja CR smo uporabili za primerjavo genetskih razdalj med monofiletskimi skupinami močerila z genetskimi razdaljami med nekaterimi sestrskimi vrstami repatih dvoživk. V primerjavah smo uporabili haplotipe 86 osebkov močerila, ki so navedeni v Tabeli 2. Haplotipe smo združili v monofiletske skupine na treh hierarhičnih ravneh (Tabela 2). Ker so bila zaporedja drugih dvoživk ugotovljena v različnih analizah, je prekrivanje med njimi večinoma majhno, hkrati pa je samo krajši del homologen močerilovim sekvencam. Tako smo iz baze GenBank izbrali tista zaporedja, ki so v čim daljšem delu homologna z močerilovim zaporedjem in so obenem poznana pri čim večjem številu sorodnih vrst, katerih medsebojni sorodstveni odnosi so po možnosti dobro znani. Tako smo uporabili zaporedja, navedena v Tabelah 3–5. Za vsak primerjan odsek pri določeni domnevno monofiletski skupini vrst in pri močerilu smo s hierarhičnim testom razmerja verjetij (»likelihood ratio«, hLRT) izbrali model nukleotidne substitucije v programu Modeltest (Posada in Crandall, 1998). Drevo največjega verjetja pri izbranem modelu smo poiskali hevristično v programu PAUP* (glej zgoraj pod metodo varčnosti). V vseh primerih se je topologija tako izračunanega drevesa ML ujemala s topologijo že objavljenega drevesa. Filogenetsko drevo, ki bi vključevalo vse (oz. vsaj vse izbrane) vrste rodu Ambystoma še ni objavljeno, zato smo sestrske vrste odčitali z drevesa, ki smo ga poiskali sami. Za ugotovitev sestrskih linij smo to drevo koreninili z zaporedji močerila. Primerjali smo patristične genetske razdalje, to je vsote dolžin vej, med sestrskimi kladi močerila in sestrskimi veljavnimi vrstami. Patristične distance med vsemi predstavniki sestrskih vrst in kladov močerila smo izračunali iz dreves največjega verjetja s programom Patristic (Fourment in Gibbs, 2006) ter jih prikazali grafično s programom SPSS za Windows, verzija 12.0.1. Kjer odnosi med kladi niso razrešeni, smo primerjali vse možne pare.


Tabela 2. Osebki močerila, katerih zaporedja CR smo uporabili v primerjavah genetskih razdalj. Podane so tudi hierarhične skupine, med katerimi smo računali genetske razdalje. Oznaka Lokaliteta 1. raven 2. ravena 3. raven

DP206 Dabarska pećina, Lušci polje Sanski most, BiH Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina

Bosanska Krajina

-

SP168, SP169, SP205 Suvaja pećina, Lušci polje, Sanski most, BiH

MP160 Markarova pećina, Stajnica, Otočac, HR Lika - RP156 Rupečica, Ivanci, Ogulin, HR MI157-MI159 Miljacka pećina, Šibenik, HR Dalmacija-

Hercegovina -

TO161 Torak, Šibenik, HR VR33, VR36, VR38–VR40, VR48

Vrelo Stuba, Vedrine, Trilj, HR

VJ154, VJ155, VJ162 Vjetrenica, Zavala, Popovo polje, BiH PI112–PI121 Pincinova jama, Nova vas, Poreč, HR Istra - -

ME55 Mejame, Dane, Divača, SI Slovenija JZ Slovenija - PD53 Podlazi, Štanjel, SI AM135, AM144 Ambroževe mlake, Slavina, Postojna, SI GA167 Gašpinova jama, Logatec, SI MA109, MA110 Malo okence, Verd, Vrhnika, SI MO102 Močilnik, Vrhnika, SI NJ52 Najdena jama, Laze, Planina, SI PL1, PL3, PL14, PL15, PL20, PL23, PL98, PL99, PL149, PL150

Planinska jama, Planina, SI

VE163–VE165 Veliko okence, Verd, Vrhnika, SI RU70 Rupnica, Rupe, Stična, SI JV Slovenija Stična VI216 Vir pri Stični, Stična, SI JE7–JE9, JE143, JE152

Na trati, Jelševnik, Črnomelj, SI (ssp. parkelj) Dolenjska- Bela krajina

KO11, KO12, KO136, KO139

Kompoljska jama, Dobrepolje, SI

MB166 Mobišaht, Ribnica, SI GR122-GR131 Ravne, Grčarice, Ribnica, SI SU103 Sušica, Dolenjske Toplice, SI OT4, OT6, OT13, OT132, OT133, OT137, OT140–OT142, OT151, OT153

Otovški breg, Otovec, Črnomelj, SI

ST101 Stolbe, Črnomelj, SI aposebej smo primerjali linije v skupini [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in v slovenski skupini


Tabela 3. Haplotipi 672 bp dolgega poravnanega zaporedja kontrolne regije vrst iz rodu Salamandra. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je dolga 690 bp. V tem delu smo pri močerilu našli 18 različnih haplotipov.

Vrsta Identifikacijska št. v GenBank Vir S. corsica AF448816 Steinfartz in sod., 2000 S. atra AY628441, AY628442 Bonato in Steinfartz, neobj. AY628436–AY628440 Steinfartz in sod., 2000 S. lanzai AY628443, AY628446 Steinfartz in sod., 2000 S. salamandra DQ232892, AY628444 Steinfartz in sod., 2000

Tabela 4. Haplotipi 673 bp dolgega poravnanega zaporedja gena za tRNA-Pro (70 bp) in kontrolne regije (603 bp) vrst iz rodu Ambystoma. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je dolga 680 bp (69 bp tRNA-Pro in 611 bp kontrolne regije). Tudi v tem delu smo pri močerilu našli 18 različnih haplotipov.

Vrsta Identifikacijska št. v GenBank Vir A. laterale AY728218 Mueller in sod., 2004 A. californiense AY659995 Samuels in sod., 2005 A. dumerilii AY659994 Samuels in sod., 2005 DQ241202, DQ241203 Weisrock in sod., 2006 A. andersoni AY659993 Samuels in sod., 2005 A. tigrinum AY659992 Samuels in sod., 2005 U36419 McKnight in Shaffer, 1997 A. mexicanum AY659991 Samuels in sod., 2005 AJ584639 Arnason in sod., 2004 A. texanum AY288804 Storfer in sod., 2004 A. ordinarium DQ241125 Weisrock in sod., 2006 A. rivulare DQ241215, DQ241217 Weisrock in sod., 2006

Tabela 5. Haplotipi 190 bp dolgega poravnanega zaporedja gena za citokrom b (157 bp) in gena za tRNA-Thr (33 bp) vrst iz rodu Dicamptodon. Poravnava homolognega zaporedja pri močerilu je prav tako dolga 190 bp. V tem delu smo pri močerilu našli 15 različnih haplotipov.

Vrsta Identifikacijska št. v GenBank Vir D. ensatus AY734600, AY734603–AY734605, AY734624 Steele in sod., 2005

D. tenebrosus AY734568, AY734571, AY734573, AY734576, AY734579, AY734581–AY734599, AY734618

Steele in sod., 2005

D. copei AY734606–AY734612 Steele in sod., 2005


2.2 MORFOLOŠKA ANALIZA Na skupno 128 primerkih, ki se nahajajo v zbirki Oddelka za biologijo Univerze v Ljubljani, pri Skupini za funkcionalno morfologijo vretenčarjev na Odd. za biologijo, v zasebni zbirki T. Rađe in v zbirki Hrvaškega prirodoslovnega muzeja v Zagrebu, smo izmerili 18 metričnih (Slika 2) in 3 meristične znake (v nadaljevanju druga meritev):

1. celotna telesna dolžina od konice gobca do konice repa (TOL) 2. dolžina glave od konice gobca do baze prvega para škrg (HL) 3. največja širina glave, posteriorno, pred bazo prvih škrg (HWmax) 4. razdalja med nosnicama kot mera za anteriorno širino gobca1 (ND) 5. dolžina gobca od njegove konice do ustnih kotičkov (SL) 6. posteriorna širina gobca v liniji ustnih kotičkov (PSW) 7. dolžina posteriornega dela glave od ustnih kotičkov do baze prvega para škrg (PHL) 8. dolžina od konice gobca do sprednjih nog (PPL) 9. dolžina nadlahti od pazduhe do komolca (UALL) 10. dolžina podlahti in dlani od komolca do konice najdaljšega prsta (LALL) 11. dolžina trupa med okončinami (TRL) 12. dolžina stegna do kolena (UPLL) 13. dolžina goleni in stopala od kolena do konice daljšega prsta (LPLL) 14. dolžina repa od zadnjih nog do konice (TL) 15. dolžina od zadnjih nog do posteriornega roba kloakalne reže (PLC) 16. anteriorna višina repa tik za zadnjimi okončinami (ATH) 17. anteriorna višina repa na dveh desetinah njegove dolžine2 (ATH2/10) 18. posteriorna višina repa na devetih desetinah njegove dolžine2 (PTH9/10) 19. število miomer (MIO) 20. število vretenc od atlasa do vključno sakralnega vretenca (VER) 21. število repnih vretenc (CVR)

Vsi podatki so bili zbrani na primerkih, shranjenih v alkoholu, formalinu ali glicerolu. Meritve smo izvedli na dorzalni oz. levi strani živali, razen ko je bilo telo živali na levi strani poškodovano ali deformirano. Telesno dolžino smo izmerili tako, da smo žival raztegnili na milimetrskem papirju in vrednost odčitali na 0,5 mm natančno. Druge znake smo izmerili s kljunastim merilom in meritve odčitavali na 0,1 mm natančno. Delne dolžine okončin smo merili pri njihovem pravokotnem položaju na trup in pri pravokotnem položaju komolca in kolena. Vratna in trupna vretenca smo prešteli na prepariranih in z alizarinom obarvanih primerkih. Repna vretenca smo prešteli nad presevno svetlobo, deloma s prostim očesom, deloma pod lupo (Olympus SZX9). Ker so nekateri primerki poškodovani ali deformirani, pri njih manjkajo podatki za nekatere znake. Vrednosti nekaterih drugih znakov brez sekcije ali druge obdelave primerkov nismo mogli določiti (Priloga B, Tabela B2).

1 Spredaj je gobec nekoliko zaobljen, zato bi verjetno prišlo do večje napake, če bi kot mero vzeli vogala gobca. 2 Ker imajo osebki različno število vretenc tako v trupu kot v repu in ni znano, katera so homologna, smo 17. in 18. znak merili na določeni dolžini repa. Pri vseh osebkih je bil 17. znak nad petim kavdalnim vretencem.


UPLL

LPLL

UALL

LALL

HL

PPL

TRL

TL

TOL

HWmax

PSW

ND

PHL

SLPL

C

ATH

2/1

0

ATH

PTH

9/1

0

UPLL

LPLL

UALL

LALL

HL

PPL

TRL

TL

TOL

UPLL

LPLL

UALL

LALL

HL

PPL

TRL

TL

TOL

HWmax

PSW

ND

PHL

SLPL

C

HWmax

PSW

ND

PHL

SLPL

C

ATH

2/1

0

ATH

PTH

9/1

0

ATH

2/1

0

ATH

PTH

9/1

0

Slika 2. Shematski prikaz 18 izmerjenih znakov.


Da bi dobili podatke še za nekatere druge znake in povečali število primerkov v vzorcu, smo upoštevali tudi matriko podatkov, ki sta je pred leti sestavila N. Kranjec in B. Sket (v nadaljevanju prva meritev). Matrika vsebuje vrednosti 12 metričnih in 7 merističnih znakov pri 239 primerkih močerila iz zbirk naslednjih inštitucij: Oddelek za biologijo Univerze v Ljubljani, Hrvatski prirodoslovni muzej Zagreb, Naturkunsthistorisches Museum Wien in Museo Civico di Storia Naturale – Trieste. Na 86 primerkih, ki so bili obakrat vključeni v meritve, smo preverili, ali lahko podatke obeh meritev združimo (Priloga C). Po pričakovanju se v nekaterih skupinah (Tabela C1) meritve niso ujemale. Tako smo k našim primerkom dodali razpoložljive vrednosti MIO, VER in CVR ter podatke o številu zob (gl. spodaj), celotne podatke pri nadaljnjih primerkih pa smo dodali le v nekaterih skupinah (Priloga B, Tabela B2), in jih upoštevali le v analizah kovariance znakov, ne pa v analizah posameznih znakov. Tako smo dobili še podatke za naslednje znake:

22. dolžina sprednje okončine3 (ALL) 23. dolžina zadnje okončine3 (PLL) 24. število zob na dentale (D.DNT) 25. število zob na vomerju (D.VOM) 26. število zob na premaksili (D.PMX)

Zbrali smo podatke za 164 živali (Priloga B, Tabela B4) telesne dolžine od 60 mm do 307 mm. Pri večini raziskanih vretenčarjev rast poteka alometrično, zato iz morfometričnih analiz pogosto izključimo mladostne osebke. Zvezo med telesno dolžino in drugimi metričnimi znaki smo preverili s t-testom naklona regresijskih premic ln[znak]=b*lnTRL+a, ki smo ga primerjali z regresijsko premico naklona 1, pri df=2*N–4. Za to smo uporabili Excelov modul, ki ga je izdelal A. Blejec. Kot mero telesne dolžine smo uporabili znak TRL, ki s TOL visoko korelira, zato da smo izločili vpliv tistih znakov, ki so že zajeti v TOL. Ker smo pri nekaterih znakih zaznali odstopanje od izometrije (Priloga E), smo analize opravili na logaritmiranih podatkih in obdržali tudi majhne primerke. Korelacije med morfometričnimi znaki so zelo visoke (Priloga D). Poleg tega lahko nekatere posebej izmerjene znake izrazimo kot seštevek vrednosti nekaterih drugih (npr. HL=SL+PHL+ostanek; ALL=UALL+LALL+ostanek; PLL=UPLL+LPLL+ostanek; in še nekatere druge kombinacije vzolž telesne osi). Zato smo pred analizo razlik med populacijami izločili »podvojene« znake in znake, ki zaradi visoke korelacije z obdržanimi znaki merijo isto dimenzijo. Kot mero za izključitev smo upoštevali Pearsonove korelacijske koeficiente med netransformiranimi znaki v celotnem vzorcu. Ker so nas zanimale predvsem morebitne morfološke razlike med genetskimi skupinami bele podvrste, saj so razlike med podvrstama že bile opisane (Sket in Arntzen, 1984; Arntzen in Sket, 1997), smo upoštevali korelacije med znaki v vzorcu populacij bele podvrste. Iz kombinacij znakov, katerih korelacijski koeficienti so presegali vrednost 0,9, smo izločili tiste znake, katerih vrednosti so bile izmerjene pri

3 V drugi meritvi smo izmerili tudi celotne dolžine okončin. Dobljene vrednosti se sicer statistično niso razlikovale od vrednosti prve meritve pri nobeni skupini, vendar so se spremenila razmerja med znaki, kar se je odražalo v vrednostih glavnih komponent (ni prikazano). Tako so se vrednosti PC razlikovale med meritvama pri več skupinah, kot če smo analizirali seštevek dolžin zgornjega in spodnjega dela okončine (glej Prilogo C). Večje razlike so verjetno posledica tega, da se okončine pri številnih primerkih ni dalo popolnoma iztegniti, kar je vplivalo na primerljivost njihovih dolžin. V nadaljnjih analizah smo zato kot mero dolžine celotne okončine uporabili seštevek obeh delnih dolžin.


manjšem številu primerkov. Ker smo pri izključevanju upoštevali nepopolnost matrike podatkov, izključitev nismo statistično vrednotili s postopnimi (»stepwise«) regresijskimi metodami. S takšno izločitvijo znakov je v matriki ostalo še precej manjkajočih vrednosti znakov VER, D.DNT, D.VOM in D.PMX. Znak VER smo izločili iz nadaljnje analize, saj v skupinah z malo primerki nismo imeli dovolj podatkov za dopolnjevanje vrednosti z regresijo. Znake D.DNT, D.VOM in D.PMX smo obdržali in izključili primerke z manjkajočimi vrednostmi. Na ta način smo obdržali naslednje znake: HL, HWmax, PLL, TL, MIO, CVR, D.DNT, D.VOM in D.PMX. Razlike med skupinami smo ugotavljali z diskriminantno analizo (DFA) 59 primerkov na dveh ravneh glede na stopnjo genetske diferenciacije (gl. pogl. 3.1.1). Za analizo na prvi ravni smo definirali tri skupine: [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], Istra in Slovenija. Na drugi ravni smo definirali sedem skupin, katerih genetska divergenca med sestrskimi pari je dosegala minimalno genetsko divergenco med sestrskimi vrstami drugih repatih dvoživk. Te skupine so bile: Bosanska Krajina, Lika, Dalmacija-Hercegovina, Istra, JZ Slovenija, Stična in [Dolenjska-Bela krajina] (v to skupino smo uvrstili tudi primerke črne podvrste). V analizah na tej ravni smo edini osebek iz Like mapirali a-posteriori. Analize smo ponovili še brez črne podvrste (4 primerki). Naslednjo diskriminantno analizo smo opravili, upoštevajoč istih devet osnovnih znakov, vendar smo tokrat obdržali 66 primerkov. Manjkajočo vrednost HWmax (primerek Trilj 5) smo ocenili z regresijo tega znaka na PSW v skupini Dalmacija-Hercegovina. Manjkajočo vrednost MIO (primerek 133) smo ocenili z regresijo na VER v skupini [Dolenjska-Bela krajina]. Manjkajoče vrednosti D.DNT v skupini Bosanska Krajina (primerki 2, 3, in 6) smo ocenili z regresijo na PTH, vrednosti D.VOM z regresijo na D.DNT in vrednosti D.PMX z regresijo na D.VOM. V istrski skupini smo manjkajoči vrednosti D.DNT (primerka 71 in 2767) ocenili z regresijo na PPL, D.VOM z regresijo na D.PMX in D.PMX z regresijo na TRL. Vse vrednosti smo ocenili z regresijo logaritmiranih znakov. Ker so se rezultati obeh analiz ujemali, prikazujemo samo rezultate druge analize, ki je vključevala večje število primerkov. Morebitne razlike med skupinami smo iskali tudi s postopno diskriminantno analizo vzorca druge meritve (128 primerkov), na začetku upoštevajoč vseh 18 metričnih znakov, ki smo jih izmerili v tej meritvi (glej zgoraj). Manjkajoče podatke smo dopolnili regresijsko (Priloga B, Tabela B5). Na ta način smo preverili, ali se skupine razlikujejo tudi po katerih od znakov, ki smo jih v prejšnjih analizah izločili. Ponovno smo definirali skupine na dveh ravneh in razlike ugotavljali na celotnem vzorcu ter ob izključitvi črne podvrste. Iz vrednosti centroidov na vsaki od diskriminantnih osi v primerjavah na drugi ravni smo s programom R, verzija 2.1.0 izračunali drevo najmanjšega razvejanja. Iz daljic na tem drevesu smo ugotavljali pare morfološko najbolj podobnih skupin. Tako smo preverili, ali so si najbolj sorodni pari skupin, kot smo jih ugotovili na podlagi zaporedij DNA, tudi morfološko najbliže.


3 REZULTATI 3.1 FILOGEOGRAFIJA MOČERILA Filogenetska drevesa smo izračunali na podlagi poravnanega zaporedja 12S in 16S rDNA ter gena tRNA-Val (zaporedje rDNA) (Slike 3–5) in na osnovi informacije iz tega zaporedja, združenega z zaporedjem kontrolne in sosednjih regij (celotno zaporedje) (Slike 6–8). Vsakič smo drevo ugotavljali po treh metodah: varčnosti, največjega verjetja in po Bayesovi statistiki. Topologiji obeh dreves po metodi varčnosti sta se med seboj ujemali. Na obeh je bila bazalno odcepljena istrska linija, vendar z nizko statistično podporo. Na najbolj varčnem drevesu rDNA je bila podpora te cepitve nekoliko višja kot na celotnem drevesu, nekoliko nižjo podporo pa sta dobila mlajša klada, slovenski in znotraj njega jugovzhodnoslovenski. Taka topologija se povsem ujema s topologijo močerilovih haplotipov kontrolne in sosednjih regij (Gorički, 2004; Gorički in Trontelj, 2006). Dokaj visoko podporo je na najbolj varčnem drevesu rDNA dobil tudi klad haplotipov [Dalmacija-Hercegovina + Bosanska Krajina]. Na drevesu celotnih sekvenc je bil ta klad slabše podprt. Prej analizirana zaporedja CR so po metodi varčnosti ravno tako združila ti dve skupini v svoj klad. Tudi na drevesih ML in BI sta bili po informaciji v rDNA in celotnih sekvencah skupini Dalmacija-Hercegovina in Bosanska Krajina sestrski, v prvem primeru z dokaj visoko statistično podporo. Nasprotno sta bili na drevesih ML in BI na podlagi zaporedij CR sestrski skupina Dalmacija-Hercegovina in linija iz Like. Domnevamo, da je v tem kladu prišlo do cepitev v dokaj kratkih časovnih presledkih ali celo istočasno na treh geografskih regijah. Na najgloblji ravni sta ostali drevesi ML in BI nerazrešeni, saj tudi koreninjenje s sorodnim nekturom in sekvence, ki so na tej ravni informativne, niso nudile podpore nobeni od možnih cepitev. Morda je do cepitve treh osnovnih kladov prišlo hkrati ali v kratkem časovnem zaporedju. S počasi spreminjajočimi se zaporedji rDNA smo odnose med slovenskimi haplotipi razrešili slabše kot z variabilnejšo kontrolno in sosednjimi regijami. Na Bayesovem drevesu zaporedij rDNA slovenski haplotipi niti niso bili združeni v monofiletsko skupino. Verjetno je vzrok njenega razbitja pomanjkanje informacije v zaporedjih rDNA. Znotraj slovenskega klada je položaj haplotipov iz Stične v jugovzhodnoslovenski skupini dobil nekoliko slabšo podporo kot po zaporedjih CR, čeprav tudi po alocimskih podatkih (Sket in Arntzen, 1994) pripada temu kladu. Omenimo še odnose znotraj taksonov, ki smo jih uporabili za koreninjenje drevesa močerila. Ti se ujemajo z že objavljenimi (Trontelj in Gorički, 2003; Samuels in sod., 2005; Wiens in sod., 2005), pomembna ugotovitev je, da so dolžine vej med večino kladov močerila presegale genetsko diferenciacijo med mnogimi sestrskimi vrstami zunanjih skupin.


Slika 3. Kladogram večinskega soglasja po kriteriju varčnosti močerilovih haplotipov rDNA, koreninjen s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Tri najvarčnejša drevesa so se razlikovala v odnosih znotraj klada [N. alabamensis + N. beyeri + N. cf. beyeri]. Prikazane so relativne podpore razvejitev, izražene v odstotkih. Podpore, nižje od 50%, niso prikazane.

Dolenjska-Bela krajina

Stična

Istra

JZ Slovenija

Dalmacija-Hercegovina

Lika

Bosanska Krajina


Slika 4. Drevo največjega verjetja močerilovih haplotipov rDNA, koreninjeno s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij, merilo predstavlja 0,05 substitucij na nukleotidno mesto. Številke na razvejitvah so v odstotkih izražene relativne podpore; navedene so samo podpore, višje od 50%.

Dolenjska- Bela krajina

Stična

Istra

JZ Slovenija


Lika

Bosanska Krajina


Slika 5. Drevo močerilovih haplotipov rDNA po Bayesovi metodi, koreninjeno s šestimi haplotipi vrst iz rodu Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij. Merilo prikazuje 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Prikazane so posteriorne verjetnosti posameznih cepitev. Za dobro podprte cepitve veljajo tiste s posteriorno verjetnostjo, višjo od 0,95.


Stična

Istra

JZ Slovenija


Lika

Bosanska Krajina


Slika 6. Kladogram močerilovih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena) po kriteriju varčnosti, koreninjen s haplotipi vrst iz rodov Ambystoma, Lyciasalamandra, Salamandra in Necturus. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Na drugem enako varčnem drevesu je bil položaj haplotipov N. alabamensis in N. beyeri zamenjan. Prikazane so relativne podpore razvejitev, izražene v odstotkih. Podpore, nižje od 50%, niso prikazane.


Stična

Istra

JZ Slovenija


Lika

Bosanska Krajina


Slika 7. Drevo največjega verjetja močerilovih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena), koreninjeno s haplotipi vrst iz rodov Necturus, Salamandra, Lyciasalamandra in Ambystoma. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij, merilo predstavlja 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Številke na razvejitvah so v odstotkih izražene relativne podpore; navedene so samo podpore, višje od 50%.


Stična

Istra

JZ Slovenija


Lika

Bosanska Krajina


Slika 8. Drevo mitohondrijskih haplotipov sestavljenega zaporedja (gen za cytb, tRNA geni, kontrolna regija, 12S in 16S rRNA gena) po Bayesovi metodi. Haplotip črne podvrste je uokvirjen. Dolžine vej so sorazmerne z genetskimi razdaljami po GTR+I+Г modelu substitucij. Merilo prikazuje 0,1 substitucijo na nukleotidno mesto. Prikazane so posteriorne verjetnosti posameznih cepitev. Za dobro podprte cepitve veljajo tiste s posteriorno verjetnostjo, višjo od 0,95.


Stična

Istra

JZ Slovenija


Lika

Bosanska Krajina


Slika 9. Približne ocene časa ločitve šestih kladov, izražene v milijonih let. Dolžine vej niso sorazmerne s številom substitucij. Za oceno nižjih vrednosti smo uporabili hitrost evolucije mitohondrijskih genov rDNA rodov Taricha in Notophthalmus (0,0047 substitucij na nukleotidno mesto v milijonu let), zgornje vrednosti smo ocenili glede na hitrost evolucije teh genov pri rodovih Euproctus in Calotriton (0,0038 substitucij na nukleotidno mesto v milijonu let) (Caccone in sod., 1997). Približno 4–5 milijonov let sta stari tudi liniji [Necturus alabamensis + N. beyeri] in Necturus maculosus. N. punctatus je od klada teh treh vrst ločen približno 19–23,5 milijonov let.


Z uporabo molekulske ure smo ocenili čase ločitev sestrskih linij in kladov (Slika 9). Osnovna cepitev treh glavnih skupin močerila naj bi se po naših ocenah zgodila med 8,8 in 16 milijoni let. V primerjavi z oceno na podlagi domnevne hitrosti evolucije kontrolne regije (7,5 do 10 milijonov let), je čas te cepitve zgodnejši. Nasprotno so ocenjeni časi cepitev najmlajših sestrskih linij nižji od ocen na podlagi kontrolne regije. Cepitev med črno in belo obliko dolenjsko-belokranjske genetske skupine naj bi se tako zgodila šele pred 500.000 do 600.000 leti, in ne pred 1,1 do 2,4 milijoni let. Druge cepitve znotraj slovenskega klada so ravno tako mlajše od tistih, ki smo jih ocenili na podlagi kontrolne regije, vendar njihove zgornje vrednosti segajo v interval ocen na podlagi zaporedij kontrolne regije. Ocenjeni čas cepitve stiške linije od dolenjsko-belokranjskega klada, pred 2,9-3,6 milijoni let, sovpada z ocenjenim intervalom ločitve teh skupin na podlagi podatkov alocimske variabilnosti (Sket in Arntzen, 1994), čas cepitev jugovzhodnega in jugozahodnega slovenskega klada pa je mlajši od ocene Sketa in Arntzena (1994). Medtem ko je bil sestrski odnos haplotipov iz Dalmacije-Hercegovine in Bosanske Krajine z zaporedji kontrolne regije vprašljiv, je na drevesih iz zaporedij rDNA dobro podprt. Tako smo ocenili tudi čas ločitve skupin znotraj klada južnih haplotipov. Linija iz Like je od drugih skupin tega klada ločena po naših ocenah od 9,3 do 11,5 milijonov let. Očitno je čas te cepitve precenjen, saj sovpada z oceno časa cepitve celotnega klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] od drugih dveh, pri tem pa je zelo malo verjetno, da liška linija ne bi pripadala temu kladu. Verjetnejša je ocena časa cepitve bosanske linije od klada Dalmacija-Hercegovina. Ti skupini naj bi se ločili približno istočasno kot oba slovenska klada (pred približno 4,2 do 5,4 milijoni let) in morda se je tudi liška linija ločila v tem časovnem intervalu. Medtem ko imata predstavnika porečij Trebišnjice (VJ154) in Cetine (VR48) isti haplotip rDNA, se je linija iz porečja dalmatinske Krke (predstavlja jo haplotip MI158) od njiju ločila pred 500.000 do 700.000 leti, podobno kot znaša približna ocena časa ločitve črne in bele oblike dolenjsko-belokranjskih haplotipov. 3.1.1 Stopnje genetske diferenciacije populacij močerila V vseh preverjenih segmentih mitohondrijske DNA so patristične razdalje med sestrskimi monofiletskimi skupinami močerila dosegale ali presegale distance med številnimi priznanimi sestrskimi vrstami drugih repatih dvoživk (Slika 10). Tudi haplotip iz Stične je bil od sestrskih dolenjsko-belokranjskih (vključno s črno podvrsto) bolj genetsko oddaljen kot večina sestrskih vrst primerjanih dvoživk. Prikazane so tudi genetske razdalje med haplotipi črne podvrste in njim sestrskimi haplotipi iz Dolenjske in Bele krajine, ki pa niso dosegale tako visokih vrednosti.


Salamandra corsica : Salamandra atra

Salamandra lanzai : Salamandra salamandra

parkelj : [Dolenjska-Bela krajina]

Stična : [[Dolenjska-Bela krajina] + parkelj]

JV Slovenija : JZ Slovenija

Dalmacija-Hercegovina : Lika

Lika : Bosanska Krajina

Dalmacija-Hercegovina : Bosanska Krajina

Istra : Slovenija

[Dalmacija-Hrercegovina + Lika-Krajina] : Slovenija

Istra : [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16

Salamandra corsica : Salamandra atra

Salamandra lanzai : Salamandra salamandra







Istra : Slovenija



0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16

Ambystoma rivulare : Ambystoma dumerilii

Ambystoma ordinarium : Ambystoma andersoni

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14







Istra : Slovenija




0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14


[[Dolenjska-Bela krajina] + parkelj]





Istra : Slovenija









Istra : Slovenija



Ambystoma rivulare : Ambystoma dumerilii


0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14







Istra : Slovenija




0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14







Istra : Slovenija









Istra : Slovenija



Dicamptodon tenebrosus : Dicamptodon ensatus

Dicamptodon copei : Dicamptodon ensatus

Dicamptodon copei : Dicamptodon tenebrosus

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25







Istra : Slovenija



Dicamptodon tenebrosus : Dicamptodon ensatus

Dicamptodon copei : Dicamptodon ensatus

Dicamptodon copei : Dicamptodon tenebrosus

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25







Istra : Slovenija









Istra : Slovenija



Slika 10. Primerjava patrističnih genetskih razdalj med sestrskimi kladi močerila in sestrskimi vrstami iz rodov Salamandra (A), Ambystoma (B) in Dicamptodon (C). Kjer odnosi med kladi niso razrešeni, smo primerjali vse možne pare.

A

B

C


3.2 MORFOLOŠKE RAZLIKE MED POPULACIJAMI 3.2.1 Razlike med kladi Istra, [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija Trije bazalni kladi, med katerimi smo zaznali največje genetske razlike, so bili morfološko dobro ločljivi, tudi če smo primerjali samo osebke bele podvrste. S kombinacijama devetih znakov (HL, Hwmax, PLL, TL, MIO, CVR, D.DNT, D.VOM in D.PMX) smo pravilno klasificirali vse predstavnike istrskega in slovenskega klada ter večino predstavnikov klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] (Slika 11A). Le en primerek iz klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] je bil napačno uvrščen v slovenski klad. V a-posteriori klasifikaciji sta bila dva primerka iz Istre napačno uvrščena v skupino [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], po dva primerka pa sta bila zamenjana tudi med preostalima skupinama (Slika 11B).

A B

Slika 11. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA devetih morfoloških znakov (A). Na sliki B je prikazana uspešnost klasifikacije vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izpeljanih iz vseh ostalih primerkov. Enako učinkovita je bila klasifikacija brez primerkov črne podvrste. Z a-posteriori klasifikacijo brez črne podvrste smo bolje predvideli izvor istrskih osebkov, saj je bil le en primerek (14,3%) napačno uvrščen, slabše pa je bilo razlikovanje med drugima skupinama, saj so bili trije primerki (12,5%) iz skupine [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] klasificirani v slovensko skupino, en primerek (3,2%) iz slovenske skupine pa v skupino [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]. V DFA osebkov brez ocenjenih vrednosti osnovnih znakov je bila klasifikacija vseh treh skupin stoodstotno pravilna, boljše je bilo tudi a-posteriori razvrščanje primerkov, saj je bil le po en osebek iz vsake od skupin [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija zamenjan med skupinama (ni prikazano).

Dejanska skupina

Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina Istra Slovenija

0102030405060708090

100

Dalmacija- Hercegovina + Lika-Krajina

Istra Slovenija

Napovedana skupina

%

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

Istra Slovenija Napovedana skupina

%



Po prvi diskriminantni funkciji, ki je razložila skoraj 90% razlik med vzorci, so se ločile vse tri skupine (Slika 12, Tabela 6). Predstavniki skupin Istra in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] so imeli sicer isti predznak DF1, vendar je bilo prekrivanje med skupinama majhno. Po DF2 se je skupina iz Istre še nadalje ločila od skupine [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]. Ravno tako se je po tej funkciji slednja v povprečju razlikovala od slovenskih primerkov.

-8 -6 -4 -2 0 2 4DF 1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

DF

2

SKUPINA 1. ravenDalmacija-Hercegovina+ Lika-KrajinaIstraSlovenijaCentroid skupine

-8 -6 -4 -2 0 2 4DF 1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

DF

2


Slika 12. Vrednosti diskriminantnih funkcij pri primerkih iz treh bazalnih kladov. Analiza je bila opravljena na devetih osnovnih znakih. Tabela 6. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 66 primerkov, vključno s črno podvrsto. Po DF2 se istrski in slovenskimi primerki niso razlikovali, tudi če črna podvrsta ni bila vključena v analizo (tedaj: P=0,081). DF1 DF2

Primerjani skupini I : J Povprečna razlika I-J SE P

Povprečna razlika I-J SE P

[Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 3,2979 0,4706 0,000 -2,5285 0,4499 0,001[Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -3,5485 0,2656 0,000 -1,2113 0,2619 0,000Istra : Slovenija -6,8463 0,4506 0,000 1,3173 0,4372 0,039

V istrsko skupino so bili združeni primerki s kratkim repom in dolgo glavo ter dolgimi zadnjimi okončinami (Tabela 7, Slika 13), majhnim številom repnih vretenc in večjim številom zob od drugih dveh skupin. Slovenski primerki imajo najkrajšo glavo od primerjanih skupin (Slika 13), ter v povprečju večje število repnih vretenc in miomer. Skupina [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] je izstopala po najširši glavi, ki je tudi daljša od glave slovenskih primerkov, a krajša od istrskih (Slika 13). Tudi v številu repnih vretenc je bila skupina [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] med drugima dvema skupinama.


Tabela 7. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij. Enaka razmerja med korelacijami smo dobili, če v analizi nismo upoštevali primerkov črne podvrste. DF1 DF2 Znak korel. koef. korel. koef.lnHL 0,026 -2,913 0,392 -0,309lnHWmax 0,141 -0,029 0,077 -1,684lnPLL 0,098 -1,071 0,416 -0,004lnTL 0,283 3,959 0,341 1,759lnMIO 0,214 0,177 0,068 0,339lnCVR 0,335 0,382 -0,212 -0,425lnD.DNT -0,231 0,386 0,556 0,343lnD.VOM -0,225 -0,075 0,501 0,214lnD.PMX -0,139 0,214 0,613 0,394

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

HL

SKUPINA 1. ravenDalmacija-Hercegovina+ Lika-KrajinaIstraSlovenija

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

HL




20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

26,0

PLL


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

26,0

PLL




Slika 13. Relativne dolžine netransformiranih metričnih znakov, uporabljenih v DFA, glede na dolžino trupa kot mero telesne dolžine. Najbolj očitno se vsi trije bazalni kladi razlikujejo v dolžini glave.

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

HW

max


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

22,0

24,0

HW

max




20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

TL


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

TL





Večina metričnih znakov se individualno ni razlikovala med skupinami, ob odstranitvi učinka telesne dolžine (znak lnTRL upoštevan kot soodvisna spremenljivka), pa so prišle do izraza pomembne razlike med skupinami (Tabela 8). Diskriminatorna vrednost dolžine repa in zadnjih okončin (navidezne razlike med kladoma Slovenija in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]) se je izničila po odstranitvi vpliva velikosti osebkov, vendar je po drugi strani postala opazna razlika v dolžini repa med skupinama Istra in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]. Primerjava samo primerkov bele podvrste je dala zelo podobne rezultate. Izjema je razlikovanje skupin [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija na podlagi dolžine repa, ki je bilo mogoče tudi po odstranitvi vpliva telesne dolžine. Tabela 8. Primerjava povprečnih vrednosti osnovnih znakov med pari skupin vključno s črno podvrsto (tudi s primerki, ki zaradi manjkajočih vrednosti niso bili vključeni v DFA). Razlike v vrednostih posameznih metričnih znakov smo testirali tudi z znakom lnTRL kot soodvisno spremenljivko. V primerjavah smo uporabili Bonferronijevo korekcijo vrednosti P.

ANOVA ANCOVA

Znak Primerjani skupini I : J Povprečna razlika I-J SE P


lnHL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,2189 0,1037 0,116 -0,165 0,033 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,1367 0,0640 0,110 0,146 0,018 0,000 Istra : Slovenija 0,0822 0,1000 1,000 0,312 0,031 0,000 lnHWmax [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,0697 0,1114 1,000 0,114 0,041 0,017 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,1538 0,0688 0,086 0,143 0,022 0,000 Istra : Slovenija -0,2235 0,1074 0,125 0,029 0,038 1,000 lnPLL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,1704 0,1001 0,282 -0,142 0,049 0,012 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,1983 0,0618 0,006 0,010 0,026 1,000 Istra : Slovenija -0,0279 0,0965 1,000 0,152 0,046 0,003 lnTL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,0168 0,1040 1,000 0,102 0,036 0,015 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,3431 0,0642 0,000 -0,045 0,019 0,057 Istra : Slovenija -0,3599 0,1003 0,002 -0,147 0,034 0,000 lnMIO [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,0308 0,0248 0,655 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,0486 0,0153 0,007 Istra : Slovenija -0,0795 0,0239 0,004 lnCVR [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,1029 0,0269 0,001 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,0585 0,0166 0,002 Istra : Slovenija -0,1614 0,0260 0,000 lnD.DNT [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,2951 0,0584 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,0200 0,0360 1,000 Istra : Slovenija 0,3151 0,0563 0,000 lnD.VOM [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,3610 0,0772 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,0342 0,0477 1,000 Istra : Slovenija 0,3952 0,0744 0,000 lnD.PMX [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,3648 0,0780 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,0453 0,0481 1,000 Istra : Slovenija 0,3195 0,0752 0,000


Na Sliki 14 so prikazani naslednji možni morfološki diagnostični znaki Istrske linije: število zob na dentale je 29 ali več; število zob na vomerju je 34 ali več; število zob na premaksili je 10 ali več; glava je več kot dvakrat tako dolga kot široka; rep je manj kot 1,8-krat daljši od glave. V drugih znakih je prekrivanje s preostalima skupinama večje, čeprav so razlike statistično pomembne. Tudi za razlikovanje med skupinama [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija tako jasno razmejenih posameznih znakov ali njihovih preprostih kombinacij ni bilo mogoče izluščiti, ampak je treba upoštevati več znakov hkrati (glej zgoraj). Največje razlike se kažejo v razmerju med dolžino glave in repa: pri vzorcu [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] s sorazmerno kratkim repom in dolgo glavo ta redko presega vrednost 2,5.

Dalmacija-Hercegovina+ Lika-Krajina

Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

-

-

-

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven


Istra SlovenijaDalmacija-Hercegovina+ Lika-Krajina

Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

-

-

-

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

-

-

-

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

-

-

-

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

HL/

HW

max


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

HL/

HW

max


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven Slika 14. Netransformirani znaki ali njihova razmerja, po katerih so istrska skupina najbolj razlikuje od drugih dveh.

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

TL/H

L


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

TL/H

L


Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven



Istra Slovenija

SKUPINA 1. raven


V postopni DFA 18 morfometričnih znakov smo skupine ločili po kombinacijah osmih znakov. Ločitev skupin [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija je bila slabša kot v prejšnji analizi, saj sta bila po dva primerka napačno klasificirana (Slika 15). Še vedno pa so se skupine tudi samo po morfometričnih znakih dokaj dobro ločile. V a-posteriori klasifikaciji so bili trije primerki iz slovenske skupine napačno uvrščeni v skupino [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], štirje pa obratno.

A B Slika 15. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA osmih morfometričnih znakov (A) in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih primerkov (B). V obeh primerih je bila klasifikacija brez primerkov črne podvrste enako učinkovita. Tabela 9. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 128 primerkov, vključno s črno podvrsto. Razlike med skupinami so se povečale ob neupoštevanju črne podvrste, vendar so med skupinama [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Istra po DF1 ostale statistično nepomembne. DF1 DF2

Primerjani skupini I : J Povprečna razlika I-J SE P


[Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 2,2197 0,5259 0,068 5,9446 0,4120 0,001[Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -3,2179 0,1957 0,000 0,9271 0,2307 0,001Istra : Slovenija -5,4376 0,5108 0,012 -5,0175 0,3680 0,006

Prva diskriminantna funkcija je razložila 75% razlik med skupinami in ločila slovensko skupino od drugih dveh, vendar sta se skupini Slovenija in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] precej prekrivali. Istrska skupina se je od slovenske ločila tudi v vrednostih DF2, od skupine [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] pa le po slednjih (Tabela 9, Slika 16). Razlika med povprečnima vrednostima DF2 v skupinah [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] in Slovenija je sicer bila statistično pomembna, vendar sta se skupini na tej osi v veliki meri prekrivali.

Dejanska skupina

Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina Istra Slovenija

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

Istra Slovenija

Napovedana skupina

%


0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

Istra Slovenija

Napovedana skupina

%



-6 -4 -2 0 2 4DF 1

-6

-4

-2

0

2

4

6

DF

2


-6 -4 -2 0 2 4DF 1

-6

-4

-2

0

2

4

6

DF

2


Slika 16. Vrednosti diskriminantnih funkcij pri primerkih iz treh bazalnih kladov. Postopna analiza je bila opravljena na 18 metričnih znakih, od katerih je bilo osem informativnih. Tabela 10. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij. DF1 DF2 Znak korel. koef. korel. koef.lnHL -0,023 -2,971 -0,002 1,910lnHWmax 0,015 -1,124 0,189 1,192lnPSW 0,085 1,816 0,135 2,593lnPPL -0,020 -2,668 -0,047 -2,070lnLALL 0,060 1,807 -0,057 -1,693lnTRL 0,127 0,627 -0,048 -4,324lnTL 0,163 3,291 0,018 2,529lnPTH9/10 -0,026 -0,683 0,132 -0,131

Kljub postopni analizi, v kateri naj bi izločili znake, ki med seboj visoko korelirajo, so korelacije med ohranjenimi znaki visoke (gl. Tabelo D1). Verjetno imajo zato vsi zelo nizek in med seboj podoben vpliv na diskriminantni funkciji (Tabela 10). Kljub temu lahko kot najpomembnejšo za razlikovanje slovenskih primerkov od istrskih po DF1 omenimo relativno dolžino glave (HL) ali glave z vratom (PPL) glede na dolžino repa (TL). Za razliko od prejšnje analize in prikaza vrednosti v celotnem vzorcu (Slika 13) dolžina glave pri istrskem vzorcu ni bila pomembno drugačna od njene dolžine pri primerkih [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] (Tabela 11), tako da kljub razlikam v dolžini repa omenjena kombinacija ni pripomogla k razlikovanju teh dveh vzorcev po DF1. Na nekoliko drugačen način izražena oblika glave v povezavi z dolžino trupa in repa pa je po DF2 kljub temu omogočila morfometrično ločevanje istrskih primerkov od drugih dveh skupin. Tako so se istrski primerki ločili po sorazmerno ozki glavi (ali gobcu) in relativno kratkem repu. Slovenski


primerki in tisti iz skupine [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] so se poleg že omenjene relativne dolžine in širine glave ločili tudi po višini repne plavuti na konici repa. Slovenski primerki imajo v primerjavi s primerki primerljive telesne dolžine iz skupine [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] sorazmerno ožjo in krajšo glavo ter nižjo repno plavut. (Tabela 11), tako da se zdijo bolj gracilni. Dolžina podlahti je bila, tako kot dolžina trupa, diskriminatorna samo v povezavi z drugimi znaki. Omenjene razlike v povprečnih vrednostih so različno jasno izražene, ko primerjamo celotni razpon vrednosti posameznega znaka v vzorcih (Slika 17). Tabela 11. Testiranje razlik med pari skupin v vrednostih osnovnih znakov pri 128 primerkih močerila, vključno s črno podvrsto. V primerjavah smo uporabili Bonferronijevo korekcijo vrednosti P. V analizi kovariance smo upoštevali vpliv telesne dolžine, izražene z lnTRL. Razlike med skupinami v sami dolžini trupa smo testirali tako, da smo kot soodvisno spremenljivko upoštevali telesno dolžino (lnTOL).

ANOVA ANCOVA

Znak Primerjani skupini I : J Povprečna razlika I-J SE P


lnHL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,0208 0,1924 1,000 -0,019 0,061 1,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,0230 0,0653 1,000 0,160 0,021 0,000 Istra : Slovenija 0,0438 0,1869 1,000 0,179 0,059 0,009 lnHWmax [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,3847 0,2009 0,173 0,386 0,068 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,0425 0,0682 1,000 0,184 0,024 0,000 Istra : Slovenija -0,3422 0,1952 0,246 -0,202 0,066 0,009 lnPSW [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,3759 0,2288 0,309 0,378 0,055 0,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,0559 0,0777 1,000 0,111 0,019 0,000 Istra : Slovenija -0,4317 0,2223 0,163 -0,267 0,054 0,000 lnPPL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,1016 0,1912 1,000 -0,100 0,062 0,322 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,0065 0,0649 1,000 0,142 0,021 0,000 Istra : Slovenija 0,1081 0,1858 1,000 0,242 0,060 0,000 lnLALL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,0600 0,1777 1,000 -0,059 0,082 1,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,0719 0,0603 0,706 0,047 0,028 0,307 Istra : Slovenija -0,0119 0,1727 1,000 0,105 0,080 0,567 lnTRL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra -0,0020 0,2260 1,000 -0,029 0,031 1,000 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,1696 0,0767 0,087 -0,022 0,011 0,133 Istra : Slovenija -0,1676 0,2196 1,000 0,008 0,030 1,000 lnTL [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,1558 0,2015 1,000 0,157 0,063 0,043 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija -0,1695 0,0684 0,044 -0,026 0,022 0,716 Istra : Slovenija -0,3253 0,1957 0,297 -0,183 0,062 0,011 lnPTH9/10 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Istra 0,3741 0,3106 0,692 0,376 0,156 0,052 [Dalm.-Herc. + Lika-Krajina] : Slovenija 0,1052 0,1054 0,961 0,307 0,054 0,000 Istra : Slovenija -0,2688 0,3018 1,000 -0,069 0,152 1,000



20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0

15,0

PSW




20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0

15,0

PSW


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

LALL




20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

LALL


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

PTH

9/1

0




20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

PTH

9/1

0

Slika 17. Relativne dolžine netransformiranih metričnih znakov uporabljenih v postopni DFA glede na dolžino trupa kot mero telesne dolžine (z izjemo znaka TRL, ki smo ga prikazali glede na TOL) pri treh bazalnih kladih.

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

55,0

60,0

PPL


20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

55,0

60,0

PPL





50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0 350,0TOL

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

TRL




50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0 350,0TOL

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

TRL


3.2.2 Razlike med skupinami Bosanska Krajina, Lika, Istra, Dalmacija-Hercegovina, JZ Slovenija, Stična in [Dolenjska-Bela krajina] Preverili smo še možnost ločevanja vseh sedmih genetsko ločenih skupin, ki smo jih poimenovali po njihovi geografski razširjenosti. S štirimi kombinacijami devetih znakov – HL, Hwmax, PLL, TL, MIO, CVR, D.DNT, D.VOM in D.PMX – smo razložili 98% razlik med vzorci. Peta diskriminantna os skupin ni ločila (Tabela 12). Razen skupin JZ Slovenija in [Dolenjska-Bela krajina] so bile vse skupine ločljive po eni ali več oseh (Tabela 14). Slabše ločljivi sta bili skupini Stična in [Dolenjska-Bela krajina], ki sta se ločili le po osi DF3. Stična se je od skupine JZ Slovenija morfološko nekoliko bolje ločila. Glede na to je bila tudi klasifikacija primerkov iz teh skupin manj pravilna (Slika 18A). Tudi iz skupin Bosanska Krajina in Dalmacija-Hercegovina je bil po en primerek napačno klasificiran v JZ slovensko skupino. V a-posteriori klasifikaciji (Slika 18B) sta bila dva primerka iz skupine Dalmacija-Hercegovina uvrščena v bosansko skupino, po en pa v JZ-slovensko skupino in med stiške primerke. Manj od polovice primerkov (41,7%) iz skupine [Dolenjska-Bela krajina] je bilo a-posteriori uvrščenih v pravilno skupino. Enak delež je bil morfološko bolj podobnih primerkom iz JZ Slovenije, preostali so bili podobni stiškim primerkom. A B

C D Slika 18. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA devetih morfoloških znakov in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih primerkov, vključno s primerki črne podvrste (A, B) in ob njihovi predhodni izključitvi iz analize (C, D).

Dejanska skupina

Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina Istra

JZ Slovenija Stična Dolenjska-Bela krajina

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

BosanskaKrajina

Dalmacija- Hercegovina

Istra JZ Slovenija Stična Dolenjska-Bela krajina

Napovedana skupina

%

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%


Ob predhodni izločitvi črne podvrste iz skupine [Dolenjska-Bela krajina] je bila sicer samo četrtina primerkov iz te skupine a-posteriori napačno klasificirana v zahodnoslovenski klad, vendar se je povečal delež primerkov iz slednje skupine, uvrščenih v skupino [Dolenjska- Bela krajina]. Primerki iz Dalmacije-Hercegovine so se kot prej v manjši meri razvrščali tudi po skupinah Bosanska Krajina, JZ Slovenija in celo Stična (Slika 18D). V nadaljevanju so predstavljeni rezultati DFA skupin ob izključitvi črne podvrste. Navajamo možnosti razlikovanja skupin iz klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] (t.j. skupini Bosanska Krajina in Dalmacija-Hercegovina) in iz slovenskega klada, saj smo istrsko skupino morfološko predstavili že v prejšnjem poglavju. Tabela 12. Bartlettov test statistične pomembnosti posameznih diskriminantnih funkcij. DF % variance hi-kvadrat df P 1 69,5 218,258 45 0,000 2 17,9 108,362 32 0,000 3 7,3 53,720 21 0,000 4 4,3 24,422 12 0,018 5 1,0 5,203 5 0,392

-7,5 -5,0 -2,5 0,0 2,5 5,0DF1

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

DF2

SKUPINA 2. ravenBosanskaKrajinaLikaDalmacija-HercegovinaIstra

JZ Slovenija

StičnaDolenjska-Bela krajina

-7,5 -5,0 -2,5 0,0 2,5 5,0DF1

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

DF2


JZ Slovenija



JZ Slovenija


Slika 19. Projekcija osebkov sedmih genetskih skupin močerila na prve štiri diskriminantne funkcije. Primerek iz Like smo mapirali a-posteriori. S prvimi štirimi diskriminantnimi funkcijami smo razložili 99% razlik med skupinami bele podvrste (Tabela 12). Istrska skupina je bila od primerjanih v povprečju najbolj podobna skupini Dalmacija-Hercegovina, vendar so bile morfološke razlike med njima velike (Tabela 13). Sorodni skupini Bosanska Krajina in Dalmacija-Hercegovina sta si bili tudi morfološko najbolj podobni, po drugi strani pa so bili primerki iz stiškega vzorca v povprečju bolj podobni primerkom iz JZ Slovenije kot bolj sorodnim dolenjsko-belokranjskim primerkom. V Tabeli 14 in na Sliki 19 je prikazano, po katerih oseh so se ločili posamezni pari skupin.


JZ Slovenija


-4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF3

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

DF4


JZ Slovenija



JZ Slovenija


-4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF3

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

DF4


Tabela 13. Pari morfološko najbolj podobnih vzorcev in razdalje med njihovimi centroidi na drevesu najmanjšega razvejanja.

Par vzorcev z najmanjšo medsebojno razdaljo dMST

Dalmacija-Hercegovina : Istra 12,68914 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija 8,898705 Bosanska Krajina : Dalmacija-Hercegovina 5,648622 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 4,835997 JZ Slovenija : [Dolenjska-Bela krajina] 3,275493

Tabela 14. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari genetskih skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 61 primerkov bele podvrste. Ob vsaki DF so prikazani samo tisti pari skupin, ki se po njej v povprečju signifikantno razlikujejo. Diskriminantna funkcija Primerjani skupini I : J Povprečna

razlika I-J SE P

DF1 Bosanska Krajina : Istra 4,4653 0,5798 0,000 Bosanska Krajina : JZ Slovenija -2,2485 0,5401 0,016 Bosanska Krajina : Stična -4,2909 0,5609 0,000 Bosanska Krajina : [Dolenjska-Bela krajina] -3,0508 0,4943 0,003 Dalmacija-Hercegovina : Istra 3,8255 0,4371 0,000 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija -2,8884 0,3830 0,000 Dalmacija-Hercegovina : Stična -4,9307 0,4119 0,000 Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] -3,6906 0,3152 0,000 Istra : JZ Slovenija -6,7139 0,4412 0,000 Istra : Stična -8,7562 0,4666 0,000 Istra : [Dolenjska-Bela krajina] -7,5161 0,3839 0,000 JZ Slovenija : Stična -2,0423 0,4163 0,002DF2 Bosanska Krajina : Dalmacija-Hercegovina -3,1328 0,6276 0,007 Bosanska Krajina : Istra -3,9999 0,6346 0,001 Bosanska Krajina : JZ Slovenija -4,3615 0,5894 0,001 Bosanska Krajina : Stična -2,5239 0,5900 0,028 Bosanska Krajina : [Dolenjska-Bela krajina] -3,1782 0,7313 0,009 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija -1,2287 0,3213 0,009 Istra : Stična 1,4760 0,3358 0,013 JZ Slovenija : Stična 1,8376 0,2396 0,000DF3 Bosanska Krajina : Dalmacija-Hercegovina -1,7619 0,4415 0,014 Bosanska Krajina : Stična -1,6409 0,3870 0,020 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija 1,4169 0,3281 0,002 Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] 2,0862 0,4786 0,007 JZ Slovenija : Stična -1,2959 0,2501 0,001 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 1,9651 0,4289 0,010 DF4 Dalmacija-Hercegovina : Stična 1,4352 0,3453 0,009 JZ Slovenija : Stična 1,6983 0,3667 0,003


Po prvi diskriminantni funkciji, ki predstavlja zelo podobno dimenzijo kot DF1 v analizi treh velikih skupin (prim. Tabeli 15 in 7), se je ločila istrska skupina od vseh ostalih, kot je že bilo opisano. Nadalje sta se po njej ločili skupini Bosanska Krajina in Dalmacija-Hercegovina od vseh treh slovenskih skupin, kot smo tudi že opisali. Ti dve skupini se med seboj po DF1 nista razlikovali. A-posteriori mapiran primerek iz Like je bil bolj podoben slovenskim primerkom kot dalmatinsko-hercegovskim ali bosanskim. Od slovenskih skupin sta se po DF1 ločili le skupini JZ Slovenija in Stična, vendar so segale vrednosti posameznih primerkov iz ene skupine v območje vrednosti druge. V povprečju so imeli stiški primerki relativno daljši rep in krajše zadnje okončine kot primerki iz vzorca JZ Slovenija (Slika 20). Po tej dimenziji so se od istrskih primerkov najbolj razlikovali prav stiški. Tabela 15. Korelacije znakov z diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij. DF1 DF2 DF3 DF4 Znak korel. koef. korel. koef. korel. koef. korel. koef. lnHL 0,006 -2,859 0,433 -0,050 0,268 1,062 -0,339 0,635 lnHWmax 0,140 0,225 0,268 -0,845 0,438 1,038 -0,174 0,802 lnPLL 0,098 -0,981 0,405 -0,884 0,072 -0,485 -0,315 0,309 lnTL 0,278 3,730 0,446 1,724 0,232 -0,817 -0,332 -1,857 lnMIO 0,198 -0,164 0,155 0,315 0,022 0,070 0,481 0,679 lnCVR 0,296 0,214 0,060 0,050 -0,200 -0,009 0,552 0,729 lnD.DNT -0,276 0,210 0,394 -0,049 -0,251 -0,529 -0,260 -0,424 lnD.VOM -0,354 -0,226 0,774 0,981 0,073 0,560 -0,064 0,130 lnD.PMX -0,202 0,031 0,512 0,088 -0,381 -0,807 0,016 0,257

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

PLL

SKUPINA

StičnaDolenjska-Bela krajinadruge skupine

JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

PLL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

TL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

TL

Slika 20. Primerki iz Stične imajo relativno krajše zadnje okončine in daljši rep v primerjavi s primerki iz JZ Slovenije. Vrednosti črne podvrste niso prikazane.


Na osi DF2 so najbolj izstopali primerki iz Bosanske Krajine z majhnim številom zob na vomerju. Najbolj izrazita je razlika, če število zob na vomerju prikažemo relativno glede na njihovo število na dentale (Slika 21). Od sorodnih predstavnikov klada Dalmacija-Hercegovina so se bosanski primerki ločili tudi po relativni dolžini repa in zadnjih okončin (Tabela 16, Slika 22). Od istrske in slovenskih skupin so se ločili tudi po relativno širši glavi, od prve tudi po daljšem repu (Tabela 16). Po osi DF2 se je ločila tudi stiška skupina od istrske in JZ-slovenske, predvsem po manjšem številu zob na vomerju. Prekrivanje med skupinama JZ Slovenija in Dalmacija-Hercegovina je bilo na tej osi veliko (Slika 19), čeprav sta se razlikovali v povprečni vrednosti (Tabela 14). Najbolj je bilo število zob variabilno v skupini Dalmacija-Hercegovina.

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina

Lika Dalmacija-Hercegovina

Istra JZ Slovenija

Sticna Dolenjska-Bela krajina

SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven Slika 21. Primerki iz Bosanske Krajine imajo manj zob na vomerju kot na dentale, liški, dalmatinsko-hercegovski, istrski in JZ-slovenski pa vsaj toliko ali več. V levi prikaz niso vključeni primerki črne podvrste, desno so zajeti v skupini [Dolenjska-Bela krajina].

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

PLL

Hercegovina

SKUPINADalmacija-

Bosanska KrajinaLika

druge skupine

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

PLL

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

SKUPINADalmacija-


Dalmacija-


druge skupinedruge skupine

Slika 22. Primerki iz Bosanske Krajine imajo relativno daljše zadnje okončine in rep od sorodnih primerkov skupine Dalmacija-Hercegovina.

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

TL

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

SKUPINADalmacija-


Dalmacija-



20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

TL

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija

Sti?na Dolenjska-Bela krajina

SKUPINA 2. nivo

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. nivo

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

D.D

NT/

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven


Tudi po DF3 so se stiški primerki ločili od drugih dveh slovenskih skupin, ponovno po manjšem številu zob. Primerjava skupin v številu zob na posamezni kosti je prikazana na Sliki 23. Skupine Bosanska Krajina, JZ Slovenija in [Dolenjska-Bela krajina] so se po relativno manjši glavi ločile od stiške skupine in skupine Dalmacija-Hercegovina.

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija

Stična Dolenjska-Bela krajina

SKUPINA 2. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.D

NT

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

D.P

MX

Slika 23. Stiški primerki imajo v povprečju manj zob kot drugi slovenski. V primerjave črna podvrsta ni zajeta. Po osi DF4 so se razlikovala le povprečja stiških primerkov od JZ-slovenskih in dalmatinsko-hercegovskih, vendar je bilo prekrivanje med skupinami precejšnje. Število miomer in repnih vretenc je le v manjši meri prispevalo k razlikovanju med skupinami (Tabela 15). Po teh znakih so se ločile le tri velike skupine med seboj, znotraj njih pa so imeli primerki podobne vrednosti (Tabela 17).

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

D.V

OM

BosanskaKrajina


Istra JZ Slovenija


SKUPINA 2. raven


Tabela 16. Primerjava parov skupin po posameznih metričnih znakih. Znak lnTRL smo upoštevali kot soodvisno spremenljivko. V primerjavo so vključeni tudi primerki, ki jih v DFA zaradi manjkajočih vrednosti nekaterih znakov nismo upoštevali. Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

Znak Skupina I Skupina J Povprečnarazlika I-J SE P

lnHL Bosanska Krajina Istra -0,1254 0,0332 0,004 Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,1729 0,0292 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,1896 0,0315 0,000 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1396 0,0271 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra -0,1732 0,0247 0,000 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1251 0,0169 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,1418 0,0191 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,0917 0,0178 0,000 Istra JZ Slovenija 0,2983 0,0246 0,000 Istra Stična 0,3150 0,0264 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,2649 0,0247 0,000lnHWmax Bosanska Krajina Istra 0,1975 0,0519 0,003 Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,2291 0,0456 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,1658 0,0493 0,015 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,2210 0,0424 0,000 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1223 0,0267 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1142 0,0280 0,001lnPLL Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina 0,1581 0,0398 0,002 Bosanska Krajina Stična 0,1841 0,0434 0,001 Dalmacija-Hercegovina Istra -0,1762 0,0340 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] -0,1019 0,0245 0,001 Istra JZ Slovenija 0,1162 0,0339 0,012 Istra Stična 0,2022 0,0363 0,000 JZ Slovenija Stična 0,0860 0,0256 0,015 Stična [Dolenjska-Bela krajina] -0,1280 0,0285 0,000lnTL Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina 0,0977 0,0279 0,009 Bosanska Krajina Istra 0,1772 0,0321 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,0795 0,0239 0,017 Dalmacija-Hercegovina Stična -0,1045 0,0185 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] -0,1289 0,0172 0,000 Istra JZ Slovenija -0,1234 0,0238 0,000 Istra Stična -0,1839 0,0255 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,2083 0,0239 0,000 JZ Slovenija Stična -0,0605 0,0180 0,015 JZ Slovenija [Dolenjska-Bela krajina] -0,0849 0,0173 0,000


Tabela 17. Primerjava parov skupin po posameznih merističnih znakih. V primerjavo so vključeni tudi primerki, ki jih v DFA zaradi manjkajočih vrednosti nekaterih znakov nismo upoštevali. Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

Znak Skupina I Skupina J Povprečnarazlika I-J SE P

lnMIO Bosanska Krajina JZ Slovenija -0,0520 0,0132 0,002 Bosanska Krajina Stična -0,0504 0,0137 0,005 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,0355 0,0117 0,044 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija -0,0445 0,0080 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična -0,0430 0,0089 0,000 Istra JZ Slovenija -0,0800 0,0116 0,000 Istra Stična -0,0784 0,0122 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,0585 0,0117 0,000 lnCVR Bosanska Krajina Istra 0,1131 0,0297 0,003 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,1005 0,0247 0,001 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija -0,0788 0,0152 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] -0,0792 0,0151 0,000 Istra JZ Slovenija -0,1793 0,0238 0,000 Istra Stična -0,1394 0,0269 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,1797 0,0237 0,000 lnD.DNT Bosanska Krajina Istra -0,3768 0,0794 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra -0,2832 0,0539 0,000 Istra JZ Slovenija 0,2347 0,0542 0,001 Istra Stična 0,3910 0,0561 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,2691 0,0648 0,001 JZ Slovenija Stična 0,1562 0,0435 0,009 lnD.VOM Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina -0,3486 0,0772 0,000 Bosanska Krajina Istra -0,6354 0,0866 0,000 Bosanska Krajina JZ Slovenija -0,3509 0,0778 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra -0,2868 0,0588 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,2322 0,0469 0,000 Istra JZ Slovenija 0,2844 0,0596 0,000 Istra Stična 0,5190 0,0612 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,4255 0,0707 0,000 JZ Slovenija Stična 0,2346 0,0480 0,000 lnD.PMX Bosanska Krajina Istra -0,5276 0,0971 0,000 Bosanska Krajina JZ Slovenija -0,3065 0,0887 0,014 Dalmacija-Hercegovina Istra -0,3677 0,0659 0,000 Istra JZ Slovenija 0,2211 0,0687 0,030 Istra Stična 0,4781 0,0680 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,3456 0,0793 0,001 JZ Slovenija Stična 0,2571 0,0552 0,000


V postopni analizi DFA smo skupine razlikovali po petih različnih kombinacijah 11 morfometričnih znakov. Na Sliki 24 je prikazana uspešnost razlikovanja skupin ob upoštevanju črne podvrste znotraj skupine [Dolenjska-Bela krajina] (Slika 24A in B) in ob predhodni izključitvi teh primerkov (Slika 24C in D). Tudi le z metričnimi znaki smo največje prekrivanje zaznali med tremi slovenskimi skupinami, ki se je v analizi brez črne podvrste nekoliko zmanjšalo. Ob izključitvi primerkov črne podvrste se je izboljšalo tudi razlikovanje med bosanskimi in dolenjsko-belokranjskimi primerki. Slabše smo ločili primerke iz Dalmacije-Hercegovine od tistih iz JZ Slovenije, en primerek iz prve pa smo v tej analizi tudi napačno uvrstili med bosanske. Ponovno navajamo le možnosti razlikovanja skupin upoštevajoč samo troglomorfne primerke. A B C D Slika 24. Odstotek pravilno uvrščenih primerkov na podlagi DFA enajstih morfometričnih znakov (A) in a-posteriori klasifikacija vsakega posameznega primerka na podlagi DF, izračunanih iz vseh ostalih primerkov (B) vključno s primerki črne podvrste in ob njihovi predhodni izključitvi iz analize (C, D).

Dejanska skupina

Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina Istra

JZ Slovenija Stična Dolenjska-Bela krajina

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0

100.0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0

100.0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

BosanskaKrajina



Napovedana skupina

%


Tabela 18. Bartlettov test statistične pomembnosti posameznih diskriminantnih funkcij. DF % variance hi-kvadrat df P 1 50,235 400,090 55 0,0002 22,531 242,918 40 0,0003 15,326 144,758 27 0,0004 8,987 69,379 16 0,0005 2,921 19,080 7 0,008

Tabela 19. Pari morfološko najbolj podobnih vzorcev in razdalje med njihovimi centroidi na drevesu najmanjšega razvejanja.

Par vzorcev z najmanjšo medsebojno razdaljo dMST

Dalmacija-Hercegovina : Istra 20,24312Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] 8,219078Bosanska Krajina : Dalmacija-Hercegovina 7,413997 Stična : JZ Slovenija 3,709001JZ Slovenija : [Dolenjska-Bela krajina] 2,415657


JZ Slovenija


-8,0 -6,0 -4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF1

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

DF2


JZ Slovenija



JZ Slovenija


-8,0 -6,0 -4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF1

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

DF2

Slika 25. Projekcija osebkov sedmih genetskih skupin močerila na prve štiri diskriminantne funkcije. Primerek iz Like smo mapirali a-posteriori. Vrednosti primerkov na peti diskriminantni osi niso prikazane, saj ta razloži manj kot 3% razlik med skupinami.


JZ Slovenija


-6,0 -4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF3

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

DF4


JZ Slovenija



JZ Slovenija


-6,0 -4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0DF3

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

DF4


Tabela 20. Rezultati Games-Howellovega testa razlik med pari skupin v vrednostih diskriminantnih funkcij 116 primerkov bele podvrste. Ob vsaki DF so prikazani samo tisti pari skupin, ki se po njej v povprečju signifikantno razlikujejo. Diskriminantna funkcija Primerjani skupini I : J Povprečna

razlika I-J SE P

DF1 Bosanska Krajina : JZ Slovenija -3,3412 0,3116 0,000 Bosanska Krajina : Stična -3,7738 0,4275 0,000 Bosanska Krajina : [Dolenjska-Bela krajina] -3,0599 0,3193 0,000 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija -3,5826 0,2511 0,000 Dalmacija-Hercegovina : Stična -4,0152 0,3855 0,000 Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] -3,3013 0,2605 0,000 Istra : JZ Slovenija -6,9007 0,7589 0,033 Istra : Stična -7,3333 0,8134 0,016 Istra : [Dolenjska-Bela krajina] -6,6194 0,7621 0,035DF2 Bosanska Krajina : Dalmacija-Hercegovina -3,8408 0,5480 0,000 Bosanska Krajina : Istra -5,7006 0,7292 0,002 Bosanska Krajina : JZ Slovenija -3,9344 0,5303 0,000 Bosanska Krajina : Stična -3,7930 0,5787 0,000 Bosanska Krajina : [Dolenjska-Bela krajina] -2,3913 0,5328 0,012 Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] 1,4494 0,2626 0,000 JZ Slovenija : [Dolenjska-Bela krajina] 1,5430 0,2233 0,000 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 1,4017 0,3218 0,007DF3 Bosanska Krajina : Istra 4,8415 0,5989 0,001 Dalmacija-Hercegovina : Istra 5,1931 0,4410 0,005 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija 0,7562 0,2381 0,034 Dalmacija-Hercegovina : [Dolenjska-Bela krajina] 1,8710 0,2860 0,000 Istra : JZ Slovenija -4,4370 0,4092 0,017 Istra : Stična -4,9536 0,4681 0,003 Istra : [Dolenjska-Bela krajina] -3,3222 0,4388 0,019 JZ Slovenija : [Dolenjska-Bela krajina] 1,1148 0,2341 0,000 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 1,6314 0,3263 0,001DF4 Bosanska Krajina : Stična -2,4746 0,4394 0,001 Dalmacija-Hercegovina : JZ Slovenija 1,2126 0,2420 0,000 Dalmacija-Hercegovina : Stična -1,3636 0,2752 0,001 JZ Slovenija : Stična -2,5762 0,2509 0,000 JZ Slovenija : [Dolenjska-Bela krajina] -1,2123 0,2460 0,000 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 1,3639 0,2788 0,001DF5 Dalmacija-Hercegovina : Stična -1,3513 0,3086 0,003 JZ Slovenija : Stična -0,8717 0,2653 0,044 Stična : [Dolenjska-Bela krajina] 1,2654 0,2819 0,003


Vseh pet diskriminantnih funkcij je bilo pomembnih za razlikovanje med skupinami (Tabela 18), čeprav je zadnja razložila manj kot 3% razlik. Skupina iz JZ Slovenije in skupina Dalmacija-Hercegovina sta si bili v 11 morfometričnih znakih v povprečju manj podobni kot v prejšnji analizi (prim. Tabeli 19 in 13). V tej analizi so bili primerki iz skupine Dalmacija-Hercegovina izmed slovenskih v povprečju bolj podobni dolenjsko-belokranjskim. Ponovno so bili stiški primerki v povprečju bolj podobni JZ-slovenskim kot dolenjsko-belokranjskim. Po DF1 so se ločile istrska, bosanska in dalmatinsko-hercegovska skupina na eni strani od vsake od treh slovenskih skupin na drugi (Slika 25, Tabela 20). A-posteriori mapiran primerek iz Like je bil ponovno podoben slovenskim primerkom in ne bolj sorodnim primerkom (Dalmacija-Hercegovina in Bosanska Krajina). Istrska in bosanska skupina sta se med seboj dobro ločili po DF2 in DF3, istrska in dalmatinsko-hercegovska pa le po DF3. Po slednji se je ponovno ločila istrska skupina tudi od vseh treh slovenskih. Po DF2 so se bosanski primerki ločili od vseh ostalih, razen teh pa je DF2 ločila v povprečju tudi dolenjsko-belokranjske primerke od drugih skupin. V primerjavi s prejšnjo analizo sta se skupini JZ Slovenija in [Dolenjska-Bela krajina] bolje ločili (DF2, DF3 in DF4), slabše pa je bilo samo po metričnih znakih mogoče razpoznati stiške primerke. Ti so se od primerkov iz skupine [Dolenjska-Bela krajina] ločili v vrednostih DF2 do DF5, manj razlik pa je bilo med stiškimi in jugozahodnoslovenskimi primerki, saj so se razlikovali le po DF4 in deloma po DF5. Znaki, po katerih so se skupine najbolje ločile med sabo, so navedeni v Tabelah 21 in 22. Tabela 21. Korelacije znakov s kanoničnimi diskriminantnimi funkcijami in standardizirani koeficienti diskriminantnih funkcij. DF1 DF2 DF3 DF4 DF5 Znak korel. koef. korel. koef. korel. koef. korel. koef. korel. koef.lnHL 0,001 -6,373 0,399 0,517 0,265 -0,462 0,112 3,949 0,274 0,897lnHWmax 0,049 -0,600 0,344 -1,295 0,478 0,567 0,197 0,758 0,335 0,476lnSL 0,032 1,658 0,417 1,223 0,312 0,476 0,008 -2,535 0,299 -2,019lnPSW 0,098 1,801 0,390 -1,302 0,459 2,630 0,085 -1,899 0,357 0,731lnPHL -0,004 2,116 0,394 2,143 0,241 1,655 0,134 -1,645 0,234 -6,188lnPPL 0,002 -2,629 0,382 -3,589 0,214 -1,922 0,091 -1,853 0,335 5,027lnUALL 0,054 -0,177 0,272 -1,593 0,122 0,088 0,148 0,182 0,385 1,624lnLALL 0,098 1,539 0,407 1,555 0,178 -1,744 0,175 1,548 0,319 -0,168lnTRL 0,129 -0,062 0,469 5,147 0,251 -1,432 0,129 -0,608 0,370 1,676lnTL 0,187 3,638 0,361 -2,982 0,229 0,341 0,195 0,834 0,296 -1,882lnPTH9/10 -0,010 -0,830 0,404 0,558 0,460 0,198 0,389 1,538 0,338 0,184

Po DF1 so se slovenske skupine najbolj razlikovale od vseh drugih v tem, da so imeli ti primerki ob relativno kratki glavi sorazmerno dolg posteriorni del glave, medtem ko so imeli primerki iz dugih skupin sorazmerno kratek posteriorni del glave glede na njeno veliko dolžino in (z izjemo JZ Slovenije) daljši ter širši ([Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]) ali ožji (Istra) gobec. V primerjavi s skupinama Dalmacija-Hercegovina in Istra so imeli tudi sorazmerno daljši rep (Tabela 22).


Tabela 22. Primerjava parov skupin po posameznih metričnih znakih. Znak lnTRL smo upoštevali kot soodvisno spremenljivko (v primerjavi lnTRL smo kot soodvisno spremenljivko upoštevali lnTOL). Prikazani so samo pari, ki se signifikantno razlikujejo v posameznem znaku. Uporabili smo Bonferronijevo korekcijo P za večkratne primerjave.

Znak Skupina I Skupina J Povprečna razlika I-J SE P

lnHL Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,1742 0,0281 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,2164 0,0364 0,000 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1402 0,0259 0,000 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1423 0,0183 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,1845 0,0277 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1083 0,0188 0,000 Istra JZ Slovenija 0,1685 0,0408 0,001 Istra Stična 0,2106 0,0461 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,1345 0,0406 0,019lnHWmax Bosanska Krajina Istra 0,4203 0,0702 0,000 Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,2091 0,0432 0,000 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,2115 0,0398 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,3715 0,0640 0,000 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1603 0,0281 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1627 0,0289 0,000 Istra JZ Slovenija -0,2112 0,0628 0,016 Istra Stična -0,2970 0,0709 0,001 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,2088 0,0624 0,017lnSL Bosanska Krajina Stična 0,1980 0,0586 0,015 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1491 0,0417 0,008 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,1684 0,0445 0,004 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1194 0,0303 0,002lnPSW Bosanska Krajina Istra 0,4230 0,0596 0,000 Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,1303 0,0367 0,008 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1908 0,0338 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,3606 0,0544 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1284 0,0245 0,000 Istra JZ Slovenija -0,2927 0,0533 0,000 Istra Stična -0,2955 0,0602 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,2322 0,0530 0,000lnPHL Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,1761 0,0311 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,2157 0,0403 0,000 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1199 0,0287 0,001 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1576 0,0203 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,1972 0,0306 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1014 0,0208 0,000 Istra JZ Slovenija 0,2027 0,0453 0,000 Istra Stična 0,2423 0,0511 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,1465 0,0450 0,023 Stična [Dolenjska-Bela krajina] -0,0958 0,0307 0,035

(se nadaljuje)


Tabela 22. Nadaljevanje.

Znak Skupina I Skupina J Povprečna razlika I-J SE P

lnPPL Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,1992 0,0279 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,2492 0,0361 0,000 Bosanska Krajina [Dolenjska-Bela krajina] 0,1544 0,0256 0,000 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,1158 0,0181 0,000 Dalmacija-Hercegovina Stična 0,1658 0,0274 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,0710 0,0186 0,003 Istra JZ Slovenija 0,2379 0,0405 0,000 Istra Stična 0,2879 0,0457 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] 0,1931 0,0403 0,000 Stična [Dolenjska-Bela krajina] -0,0948 0,0275 0,012lnUALL Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina 0,1690 0,0436 0,003 Bosanska Krajina JZ Slovenija 0,2154 0,0427 0,000 Bosanska Krajina Stična 0,2019 0,0553 0,006 JZ Slovenija [Dolenjska-Bela krajina] -0,1052 0,0261 0,002lnLALL JZ Slovenija [Dolenjska-Bela krajina] -0,0590 0,0180 0,027lnTRL Bosanska Krajina JZ Slovenija -0,0488 0,0123 0,002 JZ Slovenija [Dolenjska-Bela krajina] 0,0301 0,0075 0,002lnTL Bosanska Krajina Dalmacija-Hercegovina 0,0793 0,0251 0,031 Bosanska Krajina Istra 0,2104 0,0400 0,000 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,1310 0,0365 0,007 Dalmacija-Hercegovina Stična -0,0776 0,0242 0,027 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] -0,1137 0,0165 0,000 Istra JZ Slovenija -0,1634 0,0358 0,000 Istra Stična -0,2087 0,0404 0,000 Istra [Dolenjska-Bela krajina] -0,2447 0,0356 0,000 JZ Slovenija [Dolenjska-Bela krajina] -0,0814 0,0150 0,000lnPTH9/10 Dalmacija-Hercegovina Istra 0,4503 0,1482 0,045 Dalmacija-Hercegovina JZ Slovenija 0,4074 0,0652 0,000 Dalmacija-Hercegovina [Dolenjska-Bela krajina] 0,3791 0,0669 0,000 JZ Slovenija Stična -0,3591 0,0911 0,002 Stična [Dolenjska-Bela krajina] 0,3309 0,0986 0,016 Bosanska skupina se je po DF2 od slovenskih ločila predvsem po sorazmerno dolgi glavi z vratom (merjeno kot PPL) ob kratkem posteriornem delu glave (kar bi lahko opisali tudi kot: kratka glava z dolgim vratom) in po sorazmerno daljši nadlahti (gl. Sliko 30). V primerjavi z istrsko in dalmatinsko-hercegovsko skupino so imeli bosanski primerki relativno daljši rep (gl. tudi Sliko 22). Skupina [Dolenjska-Bela krajina] se je od JZ-slovenskih primerkov ločila predvsem po daljšem repu (gl. tudi Sliko 20), od stiških pa po sorazmerno krajšem zadnjem delu glave glede na dolžino vratu (Slika 26), čeprav je bilo prekrivanje precejšnje. V primerjavi s skupino Dalmacija-Hercegovina so imeli dolenjsko-belokranjski primerki ravno tako daljši rep, a krajši zadnji del glave glede na dolžino vratu. V vzorcu te analize se JZ-slovenski primerki v dolžini repa niso razlikovali od stiških, medtem ko so se v prejšnji analizi na Sliki 20 vidne razlike izkazale kot statistično pomembne.


V vrednostih DF3 se je istrska skupina ločila od vseh drugih, ločila pa se je tudi skupina [Dolenjska-Bela krajina] od drugih slovenskih in od skupine Dalmacija-Hercegovina. Istrski primerki, z nizkimi vrednostmi DF3, so imeli v primerjavi z drugimi ozek gobec in dolg sprednji del telesa. Primerki iz [Dolenjske-Bele krajine] so imeli večinoma daljše sprednje okončine od JZ-slovenskih (Slika 27), od stiških in dalmatinsko-hercegovskih pa so se ločili tudi po tej osi predvsem glede na dolžino glave in vratu.

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

PHL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

PHL

Slika 26. V primerjavi s stiškimi imajo dolenjsko-belokranjski primerki sorazmerno krajši posteriorni del glave glede na dolžino vratu. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

UAL

L

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

UAL

L

Slika 27. Primerki iz [Dolenjske-Bele krajine] imajo večinoma daljše sprednje okončine od JZ-slovenskih. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

PPL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

PPL

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

LALL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

LALL


Po obliki glave ter višini repne plavuti (DF4) se je dokaj dobro ločila stiška skupina od obeh skupin klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], od skupine iz JZ Slovenije pa le po višini repne plavuti (Slika 28). Slednja se je v povprečni vrednosti te osi ločila tudi od povprečij skupin Dalmacija-Hercegovina in [Dolenjska-Bela krajina], vendar je bilo prekrivanje vrednosti dokaj veliko. Razlike v višini plavuti med skupinama Bosanska Krajina in Dalmacija-Hercegovina (gl. Sliko 30) v kombinaciji z drugimi, bolj diskriminatornimi znaki (prejšnje DF), niso bile dovolj pomembne. Po zadnji kombinaciji znakov, kjer je ponovno pomembna relativna dolžina vratu in posameznih delov glave, se nekoliko ločijo le stiški primerki od drugih dveh slovenskih (Slika 29) in od dalmatinsko-hercegovske skupine.

SKUPINA


JZ Slovenija

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0TRL

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

PTH

9/1

0

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0TRL

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

PTH

9/1

0

Slika 28. Stiški primerki imajo sorazmerno višjo repno plavut od JZ-slovenskih. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.

SKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

SL

SKUPINA


JZ SlovenijaSKUPINA


JZ Slovenija

25,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0TRL

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

SL

Slika 29. Stiški primerki se od drugih slovenskih v manjši meri ločijo tudi po dolžini gobca, ko upoštevamo še druge znake, ki merijo obliko glave. Vrednosti primerkov črne podvrste niso prikazane.


Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

UAL

L

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


druge skupine

SKUPINADalmacija-


Dalmacija-



20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

UAL

L

Slika 30. Primerki iz Bosanske Krajine se od drugih pripadnikov klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] razlikujejo tudi po tem, da imajo dolgo nadlaht ter daljši in nižji rep.

Hercegovina

SKUPINADalmacija-

Bosanska KrajinaLikadruge skupine

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

PTH

9/1

0

Hercegovina

SKUPINADalmacija-


Hercegovina

SKUPINADalmacija-


SKUPINADalmacija-


Dalmacija-

Bosanska KrajinaLikadruge skupinedruge skupine

20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0TRL

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

PTH

9/1

0


4 RAZPRAVA IN SKLEPI 4.1 RAZPRAVA 4.1.1 Filogeografija močerila V tem poglavju razlagamo potek genetske diferenciacije močerila z domnevnimi paleogeografskimi in paleohidrografskimi dogodki na območju Dinarskega krasa. Identifikacija možnih vzrokov za genetsko ločitev kladov sloni na dveh predpostavkah. (1) Kljub nekaterim domnevnim migracijam dvoživk preko morij (Vences in sod., 2003; Veith in sod., 2004) je za močerila, tako kot za večino dvoživk, morje prepreka, preko katere genski pretok ni mogoč. (2) Tako močeril kot njegov najbližji sorodnik, ameriški nektur, sta celo življenje vezana na vodno okolje (tudi fosilna domnevna sorodnika močerila, Mioproteus caucasicus Estes in Darevsky, 1978 in Orthophya longa Meyer, 1845 naj bi kazala pedomorfne značilnosti lobanje; Estes, 1981). Zato so po najbolj varčni domnevi – pedomorfoze kot sinapomorfije družine Proteidae – predniki današnjih skupin že bili omejeni izključno na vodno okolje in migracija osebkov med populacijami je lahko potekala le po vodnih zvezah. V nadaljevanju navedeni domnevni paleohidrografski dogodki bi ob gornjih predpostavkah lahko bili povzročili prekinitev genskega pretoka med danes genetsko ločenimi populacijami. Glavne tri alopatrične linije oz. kladi močerila so globoko genetsko ločeni, vendar ostaja na tej ravni močerilovo filogenetsko drevo nerazrešeno. Tudi koreninjenje s sorodnim nekturom in manj variabilne sekvence, ki so na tej ravni informativne, niso nudile podpore nobenemu od možnih sestrskih kladov. Še največjo podporo je tudi po zaporedjih rDNA dobila bazalna odcepitev istrske linije, vendar le na najvarčnejših drevesih. Morda je do cepitve treh osnovnih kladov prišlo hkrati, kar se je lahko zgodilo na območju ali v bližini območja njihove današnje razširjenosti. V primerjavi z oceno na podlagi domnevne hitrosti evolucije kontrolne regije (10–7,5 milijonov let), je čas te cepitve, ocenjen iz zaporedij rDNA, nekoliko zgodnejši (16–8,8 milijonov let). Verjetno je razlog za opaženo odstopanje posledica napake pri ocenjevanju časov ločitev iz zaporedij rDNA, saj v tem primeru nismo upoštevali, da se hitrost evolucije med kladi domnevno razlikuje (kot je sklepati po različnih dolžinah zunanjih vej). Nasprotno naj bi se del kontrolne regije, ki smo ga uporabili za ocenjevanja starosti kladov, spreminjal enakomerno (Gorički in Trontelj, 2006). Tako za prvo kot za drugo oceno starosti treh glavnih kladov lahko poiščemo geografske vzroke. Pred približno 17 milijoni let naj bi namreč obstajala manjša morska transgresija čez severne Dinaride, bodisi zaradi tektonske aktivnosti ali zaradi dviga morske gladine (Pavelić, 2002). Na začetku srednjega miocena, pred približno 16 milijoni let, se je višanje morske gladine še stopnjevalo. Zadnja miocenska morska transgresija naj bi po Paveliću (2002) to območje poplavila pred 13,4 milijoni let. V enem ali v več naštetih obdobij je bila Istra verjetno ločena od kontinenta, ravno tako pa naj bi obstajala morska zveza med Srednjo Paratetido in Sredozemskim morjem. Ta naj bi vse od karpatske do zgodnje-badenijske (17,3–14 milij. let) transgresije pokrivala območje osrednje Slovenije – t.i. »Trans-Tethyan Trench Corridor« (Rögl, 1998). Morska voda bi lahko predstavljala migracjsko bariero med otokom današnje Istre ter populacijami severno in južno od morskega koridorja, kar je najkasneje pred 9–7 milijoni let, verjetno pa že prej, vodilo do popolne genetske ločitve treh glavnih skupin


populacij. Tudi filogeografski podatki o jamskih kozicah rodov Troglocaris in Spelaeocaris (Zakšek in sod., v reviziji) in slepi jamski postranici Niphargus steueri (Fišer, 2006) kažejo na to, da bi vsi ti taksoni v omenjenem obdobju lahko izkusili neke skupne vikariantske dogodke. Vendar pa se niti močerilova niti filogeografija rakov ne ujemajo z osrednjeslovenskim položajem morskega koridorja. Sicer bi se predniška populacija slovenskega močerilovega klada lahko formirala severno od koridorja in po njegovem umiku migrirala južno, vendar bi morska povezava lahko obstajala tudi čez Hrvaško. Prelogović in sod. (1975) namreč omenjajo tako zgodnje-miocenske kot kasnejše morske usedline na Hrvaškem. Glede na filogeografijo močerila naj bi ta morski koridor potekal približno na črti Zagreb – Rijeka, na kar sklepamo po pripadnosti vzorca iz Gorskega Kotarja južnemu in ne slovenskemu kladu, glede na vzorec razširjenosti jamskih rakov pa še nekoliko južneje. Morda bi se to hipotezo dalo preveriti z analizo vzorcev iz hrvaškega Primorja (iz območja Rijeke). Z izjemo populacije v Istri, od koder smo analizirali primerke le iz ene lokalitete, je znotraj glavnih kladov opaziti nadaljnjo genetsko strukturiranost geografsko ločenih linij. Tako v slovenskem kot v južnem kladu je po približnih ocenah do nadaljnih cepitev prišlo pred 5,4–4,2 (6,6–4,4 po kontrolni regiji) milijonoma let. Linija iz Like kaže domnevno višjo hitrost mutacij kot drugi dve skupini v kladu [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], tako v hitro spreminjajočem se delu kontrolne regije (Gorički, 2004; Gorički in Trontelj, 2006) kot v zaporedju rDNA. Vendar je območje Like v vzorcu preslabo zastopano, da bi lahko postavili dokončne zaključke o položaju te linije znotraj klada. V kladu [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] bi lahko prišlo do cepitev v dokaj kratkih časovnih presledkih ali celo istočasno na treh območjih. Po umiku Paratetide na začetku poznega miocena, pred približno 11 milijoni let, so nastali v osrednjih Dinaridih ločeni vodni bazeni, kjer je celinska voda postopoma nadomestila morsko (Pavelić, 2002). Časi ločitev treh glavnih linij in kladov haplotipov iz tega območja sovpadajo z domnevnim obstojem jezer v mesiniju, pribl. 6 do 5,5 milijonov let nazaj (Prelogović in sod., 1975). Predniki današnjih linij Lika in Bosanska Krajina ter klada Dalmacija-Hercegovina bi se lahko bili ločili v takšnih razmerah. Najbolj zgodaj po dvigu Dinaridov na današnjo raven, pred pribl. 5 milijoni let (F. šušteršič, osebni vir), bi te populacije že tudi lahko prešle v podzemlje. V dalmatinsko-hercegovski regiji smo zaznali nadaljnjo, mlado diferenciacijo haplotipov iz porečja dalmatinske Krke in od nje ločenima porečjema Cetine in Trebišnjice, ki pa sta verjetno ločeni šele kratek čas. Konec miocena, pred 7–5 milijoni let naj bi tudi v južni Sloveniji tektonska aktivnost povzročila nastanek ločenih jezerskih kotanj (Prelogović in sod., 1975), kjer bi lahko prišlo do diferenciacije prednikov današnjega jugovzhodnega in jugozahodnega klada. Zaporedja rDNA so sicer odnose med slovenskimi haplotipi razrešile slabše kot variabilnejše kontrolna in sosednje regije. Na Bayesovem drevesu zaporedij rDNA slovenski haplotipi niti niso bili združeni v monofiletsko skupino. Kljub temu le malo dvomimo v monofilijo vseh slovenskih haplotipov. Bistveno verjetnejši vzrok njenega razbitja je pomanjkanje informacije v počasi spreminjajočih se zaporedjih rDNA. Zaporedja mitohondrijske rDNA so običajno primerna za razreševanje odnosov na ravni rodov in družin (npr. Titus in Larson, 1995; Caranza in Amat, 2005; Frost in sod., 2006). Zato so verjetno tudi časi ločitev najmlajših kladov podcenjeni. Znotraj slovenskega klada je položaj haplotipov iz Stične v jugovzhodnoslovenski skupini dobil nekoliko slabšo podporo kot po zaporedjih kontrolne regije, čeprav tudi po alocimskih podatkih (Sket in Arntzen, 1994) pripada temu kladu. Stiška linija naj bi se od drugih


haplotipov JV Slovenije ločila pred vsaj približno 3,6–2,9 milijoni let (5,5–3,5 po kontrolni regiji). Opažen filogeografski vzorec se ujema s filogeografskim vzorcem populacij vodnega oslička iz zgornjega toka Krke, ki so ravno tako del JV-slovenskega klada (Verovnik in sod., 2004), in domnevo, da so imeli rečni tokovi na območju Stične in Bele krajine že od miocena zelo podobno smer toka kot danes (Sket in Arntzen 1994). Pri teksaških brezpljučarjih kompleksa Eurycea multiplicata, tako pedomorfnih kot večino življenja terestričnih, so ravno tako zaznali visoko genetsko divergenco med populacijami iz nasprotnih strani zbirnega vodotoka (Bonett in Chippindale, 2004). Vendar je opaženo visoko stopnjo ločenosti stiške od dolenjsko-belokranjske populacije treba preveriti še na vzorcih iz vmesnih lokalitet, iz izvira Krke (Krška jama) in Grosupeljskega območja (Lučka jama), ki v opravljeni analizi manjkajo. V JZ-slovenskem kladu in kladu Dalmacija-Hercegovina haplotipi iz ločenih porečij niso genetsko globoko ločeni (gl. tudi Gorički, 2004). Nasprotno so Verovnik in sod. (2004) ugotovili visoko genetsko divergenco med populacijama porečja Reke in Ljubljanice. Genetsko homogenost močerila je mogoče razložiti s šele nedavno in še zdaj nepopolno prekinitvijo povezav med porečjema (Habič, 1989). Tudi Verovnik in sod. (2004) opažene stopnje divergence vodnega oslička ne razlagajo z vikariantskim dogodkom, ampak z neodvisno kolonizacijo obeh porečij iz ločenih refugijev. Za potrditev naših domnev bi bilo treba v analizo vključiti še vzorce z italijanskih lokalitet. Tudi hidrografska izoliranost populacij Cetine in Trebišnjice naj bi se pojavila nedavno, kot bi mogli sklepati po arealu slepe jamske postranice Niphargus trullipes (Sket, 2002). Znotraj slovenskih hidroloških omrežij smo zaznali genetsko ločenost haplotipov iz izvirov Ljubljanice od južnejšega dela tega porečja in med haplotipi črnega in belega močerila v Beli krajini. Po ocenah iz rDNA naj bi se slednji ločili pred 600 000 do 500 000 leti, kar se ne ujema z ocenami iz zaporedij kontrolne regije (2,4–1,1 milijon let) niti z ocenami na podlagi alocimske variabilnosti (4,5–1,1 milijon let; Sket in Arntzen, 1994). Ker smo tudi za ocenjevanje časa mlajših cepitev uporabili hitrost evolucije zaporedij rDNA, ki so jo kalibrirali na dogodkih domnevno izpred nekaj milijonov let, se nam zdi predpleistocenska ocena ločitve populacij Bele krajine verjetnejša. Ta se ujema z domnevnim začetkom zakrasevanja na tem območju (Radinja, 1972). Začetek zakrasevanja je lahko vodil do genetske izolacije črne in bele belokranjske populacije zaradi morebitnega časovno in prostorsko ločenega vseljevanja v podzemlje (Sket in Arntzen, 1994). Ker je vzrok za ohranitev netroglomorfnih značilnosti pri črni podvrsti neznan in bi lahko bil tudi posledica ekološke različnosti habitatov teh dveh populacij, je možna bariera genskemu pretoku med njima lahko tudi njuna različna ekološka specializiranost (Sket in Arntzen, 1994). Genetsko ločenost hidrografsko povezanih delov porečja Ljubljanice lahko razlagamo z izolacijo z razdaljo in fragmentacijo podzemnega habitata s površinskimi odseki vodotokov. 4.1.2 Morfološke razlike med populacijami Ena od posledic filogenetskih raziskav DNA v sistematiki je naraščanje števila taksonov, za katere ugotavljajo, da morfološke razlike ne odražajo njihovih sorodstvenih odnosov in stopnje genetske diferenciacije. Pri troglomorfnih taksonih je ta trend še posebej izrazit, saj številne sistematske analize, ki vključujejo molekulske znake, vodijo do taksonomskih revizij (npr. Chippindale, 2000; Lefébure in sod., 2006; Lefébure in sod., (a), (b), v reviziji; Trontelj


in sod., v pripravi). Te vključujejo tako spremembe taksonomske pripadnosti posameznih populacij kot tudi identifikacijo številnih novih, kriptičnih taksonov. Dostikrat lahko podcenjenost taksonomske diverzitete priznanih troglomorfnih vrst pripišemo konvergentni evoluciji troglomorfnih znakov (npr. Wiens in sod., 2003; Bonett in Chippindale, 2004). V tem delu smo pokazali, da kljub morfološki podobnosti bodisi zaradi pedomorfnosti ali zaradi konvergentne evolucije troglomorfnih znakov (ali obojega) med večino skupin obstajajo pomembne razlike, ki presegajo razlike znotraj skupine. Po analiziranih znakih so slabše ločljive edino tri molekularno definirane slovenske skupine, predvsem JZ-slovenska in dolenjsko-belokranjska skupina, ki vključujeta zelo različne osebke. Vendar se osebki iz Bele krajine (Otovški breg) od JZ-slovenskih osebkov (Planinska jama) ločijo, kljub znotrajpopulacijski variabilnosti, v stopnji strukturne razvitosti leče, slojevitosti in uvihanosti mrežnice ter degeneracije fotoreceptorskih celic (Kos in sod., 2001). Oko tako mladih kot odraslih osebkov iz Otovškega brega je bolj reducirano kot oko osebkov iz Planinske jame: nikoli ne vsebuje leče, plasti mrežnice niso razpoznavne, vse fotoreceptorske celice so brez zunanjih segmentov, velika večina tudi brez notranjih. Ali se opažene razlike ujemajo z genetsko strukturo močerila, bi veljalo preveriti na dodatnih slovenskih primerkih in v primerjavi z drugimi, v tem delu definiranimi populacijami močerila. Poleg tega je za razlikovanje slovenskih skupin treba analizirati še druge morfološke znake, morda bi pomembne razlike našli s primerjavo oblike lobanjskih kosti ali pojavljanja določenih struktur na njih. Ravno domnevna konvergentna evolucija troglomorfnih populacij bi po drugi strani lahko bila razlog, da smo opazili nekatere morfološke razlike med skupinami. Pri konvergencah predpostavljamo, da so se predniške skupine morfološko razlikovale (Wiens in sod., 2003). Zato si tudi potomci niso podobni do take mere, kot bi si bili, če bi do izpeljanega stanja prišlo že pri skupnem predniku in se te skupine ne bi nadalje morfološko diferencirale – bodisi zaradi kratkega časa izolacije ali zaradi podobnosti habitata. Na ta način lahko razložimo opažene razlike med tremi bazalnimi kladi močerila, ki so bile v naši analizi najbolj izrazite. Morfološke razlike med tremi osnovnimi kladi se ujemajo z njihovo visoko genetsko divergenco. Ravno zaradi manjkajoče genetske informacije prejšnji avtorji (Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) na te razlike niso bili pozorni (glej spodaj). Znotraj obeh nadalje genetsko diferenciranih kladov se skupine razlikujejo v manjši meri. Tudi v teh skupinah bi se podobna morfološka stanja lahko razvila konvergentno, saj bi se populacije lahko diferencirale že v površinskih vodah. Manjše morfološke razlike med njimi bi lahko bile posledica omejitev zaradi njihovega bližnjega sorodstva in torej ne konvergentnega, ampak paralelnega razvoja troglomorfnih znakov (morfološko med seboj podobne predniške populacije). Tako se morda skupine pred selitvijo v podzemlje niso še bistveno morfološko razlikovale, bodisi zaradi relativno kratkega obdobja medsebojne izoliranosti pred vselitvijo v podzemlje ali podobnega okolja. V nekaterih morfoloških znakih smo opazili tudi veliko podobnost skupin, ki ne pripadajo istemu višjemu kladu (konvergence), medtem ko se skupine iz istega klada v teh znakih razlikujejo. Poleg zgoraj navedenega je verjetno tudi to razlog, da samo po morfoloških znakih (Kranjec, 1981; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) ni bilo mogoče predvideti visoke stopnje genetske diferenciacije močerila. Razlike med skupinami znotraj istega klada bi lahko


bile posledica konvergentne evolucije morfološko diferenciranih prednikov – ta hipoteza predvideva prostorsko in morda tudi časovno ločeno vseljevanje v podzemlje (Sket, 1997). Po drugi hipotezi, upoštevajoč tudi podobnost manj sorodnih skupin, bi te razlike lahko bile posledica različnega selekcijskega pritiska med hidrografskimi regijami istega širšega geografskega predela – po tej hipotezi je mogoča tudi enkratna vselitev v podzemlje in kasnejša divergenca. 4.1.2.1 Pregled razlik po znakih in primerjava z rezultati prejšnjih analiz Zunanji morfometrični znaki med seboj močno korelirajo, kar ne preseneča glede na dokaj preprosto obliko močerila, ki smo jo skušali opisati s številnimi znaki v isti, longitudinalni osi. Vendar je presenetljiva visoka korelacija znakov, izmerjenih v drugih oseh, ki se odraža v tem, da v številnih skupinah za te znake nismo mogli zavrniti hipoteze o izometrični rasti. Deloma najdemo vzrok za to v majhnem vzorcu, kjer ima t-test manjšo moč (npr. vzorec iz Bosanske Krajine), deloma tudi v tem, da so nekateri vzorci vsebovali le primerke ozkega velikostnega razreda (npr. vzorec iz Stične). Kljub temu je v večini teh vzorcev naklon regresijske krivulje za večino znakov podoben kot v vzorcih, ki vsebujejo tako majhne kot velike primerke, kar pomeni, da način rasti tudi pri manjkajočih primerljivih velikostnih razredih verjetno ni bistveno drugačen. Med skupinami, ki so dobro morfometrično ločljive, se je tudi naklon regresijske krivulje podaljševanja razlikovalnih znakov z večanjem telesne dolžine razlikoval, ne glede na primerjano telesno dolžino primerkov (istrski vzorec, parkelj). Različen koeficient ontogenetske alometrije, ki ga fiksiranega lahko opažamo kot morfometrične razlike med skupinami (npr. Alberch in sod., 1979; Reilly in sod., 1997) tako izgleda omejen na manjše osebke, kot so bili vključeni v analizo. Podoben alometrični koeficient bi lahko bil vzrok podobnosti morfometrično neločljivih skupin. V večjih vzorcih, ki so obsegali različno velike primerke, smo sicer za večino znakov zavrnili izometrično rast, vendar je odstopanje, vsaj na videz, manjše od pričakovanega. Deloma je lahko alometrična rast ostala neopažena zaradi primerjav vrednosti pri različnih osebkih, od katerih lahko vsak zase ontogenetsko v obravnavanem »velikostnem« intervalu raste alometrično, z majhnim časovnim zamikom v primerjavi z drugimi osebki. Pri močerilu so opazili, da se tudi v konstantnih pogojih ontogenetsko pojavljajo različno dolge faze zastoja v povečevanju telesne dolžine (M. Aljančič, osebni vir; prim. Vandel in sod., 1964). Če vsako tako zamaknjeno krivuljo vzorčimo le enkrat, lahko dobimo vtis, da je rast izometrična (npr. Slika 1 v Fiorello in German, 1997; op.: na oseh so lahko drugi parametri; prim. tudi Reilly in Lauder, 1990). Kljub temu, sodeč po opisih, risbah in morfometričnih podatkih za nekatere telesne regije v longitudinalnih študijah osebkov iz postojnsko-planinskega sistema (Vandel in Bouillon, 1959a, b; Vandel in sod., 1966), se že kmalu po izleganju (telesna dolžina 20-22 mm) oblika ne spreminja več bistveno. Relativna dolžina repa se v postembrionalnem razvoju ne spreminja več, pri telesni dolžini 21 mm (merjeno 8 dni po izleganju pri temperaturi 11,95 ± 0,25 ºC) doseže dokončno relativno dolžino. Še se reducirata dolžina in višina plavuti, kar se upočasni, ko žival doseže pribl. 36 mm, in v juvenilni fazi (sensu Vandel in sod., 1966) dobi že skoraj končno obliko. Sprednje okončine so popolnoma razvite pri 23 mm (25 dni po izleganju, temp. 11,95 ± 0,25 ºC), zadnje se oblikujejo pri tel. dolžini 33 mm (Vandel in sod., 1966). Do telesne dolžine 41–42 mm (3,5 mesece pri temp. 11,5 ºC) se še nekoliko poveča njihova relativna dolžina (Vandel in Buillon, 1959a). Glava v juvenilnem obdobju še


spreminja obliko (se podaljšuje, oži in plošči, oči se reducirajo), vendar spremembe oblike več niso tako hitre in očitne kot pred nastopom samostojnega hranjenja (33 mm, 105 dni pri omenjeni temperaturi). Trapezoidno obliko dobi glava že pri telesni dolžini 22,5 mm (19 dni po izvalitvi), takrat so že tudi vidne zasnove zob. Vsekakor dosežejo osebki razmerja med telesnimi merami, kakršna imajo pri spolni zrelosti – kar je pri samicah pri vsaj 210 mm telesne dolžine (Vandel in Durand, 1970) – že veliko pred tem. Morda je nespremenljivost oblike povezana s pedomorfnostjo, saj so izometrijo standardnih meritev na glavi ugotovili tudi pri ličinkah močerada (Reilly, 1995) kot tudi izometrijo v podaljševanju in širjenju nekaterih lobanjskih kosti pri larvah fosilnih temnospondilov (Witzman in Pfretzschner, 2003). Nasprotno se oblika glave med metamorfozo, verjetno zaradi prehoda iz vodnega v kopensko okolje in z njim povezanega načina prehranjevanja in dihanja, bistveno spremeni, medtem ko njena velikost ostane enaka (Reilly in Lauder, 1990). Vpliv visoke koreliranosti merjenih znakov na rezultate multivariatnih analiz smo skušali omiliti z izločitvijo nekaterih od znakov. V popolni matriki morfometričnih podatkov smo izbor tudi statistično vrednotili. Vendar so pri visoko koreliranih znakih standardne napake standardiziranih koeficientov DF visoke, kar otežuje ocenjevanje relativne pomembnosti posameznih osnovnih znakov (gl. tudi Tabeli 10 in 21). Na postopne metode zelo vplivajo slučajne zveze med spremenljivkami, zato je dejanska statistična pomembnost manjša (višje vrednosti P) od podane (Menard, 1995). Verjetno je to razlog, da se nekateri znaki (npr. LALL in TRL) pojavljajo kot diskriminatorni v kombinaciji z drugimi, čeprav se individualno med skupinami ne razlikujejo (gl. Tabelo 11 in Sliko 17). Morda so se zaradi tega v postopni analizi ohranili tudi znaki, ki so že vključeni v druge ohranjene znake (npr. SL, PHL, HL in PPL). V nadaljnji obravnavi znakov, po katerih se skupine razlikujejo, ne upoštevamo črne podvrste, saj je bila ta podrobno analizirana že prej (Sket in Arntzen, 1994; Arntzen in Sket, 1997), rezultati naše analize pa se povsem ujemajo z navedenima. Glava se je izkazala kot uporaben razlikovalni znak med istrsko, bosansko, dalmatinsko-hercegovsko in slovensko skupino populacij, tako po svoji relativni dolžini kot deloma po širini in številu zob. Tudi po relativni dolžini repa se tri glavne skupine dobro ločijo. Primerki iz Istre imajo izrazito dolgo in ozko glavo, kratek rep in veliko število zob. Slovenske skupine združujejo primerke z najkrajšo, sorazmerno ozko glavo in relativno dolgim repom. Južne populacije lahko razpoznamo po relativno dolgi in široki glavi ter relativno kratkem repu. Te razlike sta zaznala tudi Arntzen in Sket (1997), ki sta ločila obalne populacije (naše Dalmacija-Hercegovina in Istra ter italijanski vzorec iz dveh lokalitet, ki ni bil zajet v naši analizi) z dolgo glavo in kratkim repom od populacij notranjosti (naše slovenske skupine) s kratko glavo in dolgim repom. V istih znakih so se razlikovale tri skupine primerkov: iz slovenskih lokalitet, Sinja (naša Dalmacija-Hercegovina) ter Istre (in Italije), ki sta jih analizirala Grillitsch in Tiedemann (1994). Nadalje ločimo bosansko skupino od podobnih primerkov iz Dalmacije-Hercegovine po nižjem številu zob na vomerju glede na njihovo število na dentale in daljšem repu. Tudi stiški primerki imajo v povprečju majhno število zob na vseh kosteh in daljši rep.


Medtem ko N. Kranjec (1981) zob ni štela, je v dolžini glave ravno tako ugotovila razlike med (z našimi primerljivimi) skupinami. Tako ugotavlja, da imajo osebki iz Istre izrazito dolgo glavo, tisti iz Stične pa izrazito kratko. Med drugima slovenskima vzorcema (ekvivalent JZ-slovenskemu in dolenjsko-belokranjskemu) in v primerjavi teh z dalmatinskim vzorcem razlik v dolžini glave ni opazila. V naši analizi razlik v dolžini glave med stiškimi in drugimi slovenskimi primerki nismo zaznali (gl. tudi Sket in Arntzen, 1994, kjer se vzorci ravno tako prekrivajo), pač pa so se, kot je že omenjeno, razlikovali slovenski in dalmatinski primerki. Medtem ko je N. Kranjec ugotovila razlike v širini glave med stiškim (širša), istrskim (ožja) in preostalimi vzorci (ekvivalent JZ-slovenskemu, dolenjsko-belokranjskemu in dalmatinsko-hercegovskemu), se širina glave v naših vzorcih med vsemi slovenskimi in istrsko skupino ni razlikovala, v povprečju pa sta imeli skupini Dalmacija-Hercegovina in Bosanska Krajina širšo glavo od drugih skupin. Oblika glave je eden ključnih znakov za razlikovanje vrst, ki jih je opisal Fitzinger (1850). Tako loči vrste s kratko hruškasto (Hypochthon zoisii – Rupa = Stična), dolgo hruškasto (H. schreibersi, Vir = Stična in H. freyeri – Kompolje, Potiskavca = [Dolenjska-Bela krajina]), dolgo stožčasto (H. carrarae – Sinj, Neretva = Dalmacija-Hercegovina) in dolgo trikotno glavo (H. haidingeri – Planinska jama, H. laurenti – Črna jama in H. xanthostictus – Beden; vsi JZ Slovenija) ter navaja podatke o dolžini glave, širini konice gobca, in širini glave v posteriornem delu. Po velikosti in obliki gobca razlikuje vrste s kratkim, širokim in prisekanim gobcem (Rupa, Planinska jama), dolgim, širokim in prisekanim (Vir, Črna jama, Beden), dolgim, ozkim in prisekanim (Kompolje, Potiskavca) ter dolgim, ozkim, topo zašiljenim gobcem (Sinj, Neretva). Tudi de Fejérváry (1926) razlikuje primerke iz Planinske in sosednjih jam od primerkov iz okolice Kočevja, ki jih uvrsti v podvrsto freyeri, med drugim po obliki glave in gobca (ukrivljene ali ravne lateralne konture, anteriorno primaknjene, razmaknjene ali vzporedne stranice gobca, raven ali zaokrožen gobec). N. Kranjec (1981) ugotavlja, da sta dolžina in širina gobca sorazmerni z »velikostjo« glave. V širini konice gobca je zaznala razlike med JZ-slovenskim vzorcem (Planinska jama), s širokim gobcem, in drugimi skupinami, pri katerih je gobec v povprečju ožji. Ravno tako naj ne bi noben primerek iz Planinske jame imel zašiljenega gobca. Sicer pa ugotavlja, da je variabilnost oblike glave in gobca zelo velika tudi znotraj vzorcev. Arntzen in Sket (1997) sta v posteriorni širini gobca (njun SB-BAS) opazila signifikantne razlike med spoloma. Te trditve nismo mogli preveriti, saj smo imeli premalo primerkov z znanim spolom. V pričujoči analizi smo obliko glave in gobca skušali povzeti z znaki SL, PHL, ND, PSW, HWmax in HL ter deloma PPL. Zaobljenosti gobca nismo opisovali, saj imajo številni primerki zaradi načina konzervacije zmaličeno konico gobca, razen tega pa na njem ni bilo mogoče določiti homolognih struktur kot skrajnih točk za numerično izražanje oblike. Za razliko od prejšnjih analiz so se po obliki glave ločile le tri največje skupine. Slovenska skupina, znotraj katere najbolj izstopa stiška, se razlikuje od vseh drugih v tem, da ima ob relativno kratki glavi sorazmerno dolg posteriorni del glave, medtem ko imajo primerki iz dugih skupin sorazmerno kratek posteriorni del glave in relativno (z izjemo JZ Slovenije) daljši in ožji (Istra) ali daljši in širši gobec. V širini konice gobca se primerki iz JZ Slovenije niso razlikovali od drugih. Ker omenjeni znaki med seboj zelo visoko korelirajo, se je izkazalo, da je mogoče skupine razlikovati tudi brez te informacije, saj je dovolj že samo podatek o njeni celotni in največji širini. Ker znaki niso bistveni za razlikovanje med skupinami in ker je pri večjem številu meritev, ki imajo iste skrajne točke, možnost napak večja, uporabe oblike glave kot razlikovalnega znaka ne zagovarjamo.


Relativna dolžina repa, ki jo navajajo vsi predhodni avtorji kot pomemben taksonomski znak, se je tudi v tej analizi izkazala za pomembno pri razlikovanju treh glavnih skupin močerila, v manjši meri pa tudi za razlikovanje obeh južnih skupin in za ločevanje JZ-slovenskih primerkov od drugih slovenskih. V analizi Kranjčeve (1981) so imeli istrski primerki krajši rep od slovenskih, niso se pa v dolžini repa razlikovali od dalmatinskih. V naših analizah so imeli slednji rep v povprečju signifikantno daljši od istrskih, vendar, med vsemi različnimi skupinami, pri najnižji stopnji tveganja. Bosanski osebki imajo v povprečju daljši rep. Kranjčeva ravno tako ni zaznala razlik v dolžini repa med JZ slovenskimi primerki in tistimi iz Stične. Oblika repa je pri Fitzingerju (1850) zelo pomemben razlikovalni znak. Tako je opisal vrste z visoko, na koncu topo zaokroženo (Rupa, Vir) ali koničasto zaokroženo repno plavutjo (Sinj, Neretva), z nizko, na koncu zašiljeno (Kompolje, Potiskavca, Planinska jama), koničasto zaokroženo (Črna jama) ali topo zaokroženo plavutjo (Beden). Bedriaga (1879) je domneval, da je oblika repa odvisna od spola. To verjetno ne drži in tudi drugih spolno dimorfnih zunanjih znakov niso potrdili (Grillitsch in Tiedemann, 1994; Sket in Arntzen, 1994; Arntzen in Sket, 1997). Tudi de Fejérváry (1926) ločuje primerke iz Planinske jame in Kočevja po obliki konice repa: pri prvih je topo koničasta, pri drugih pa zaokrožena. Sket in Arntzen (1994) navajata, da je rep pri primerkih iz Stične (Rupnica, Vir) običajno višji od trupa, pri primerkih iz Planinske jame (JZ Slovenija) pa tako visok kot trup in topo koničast. V pričujoči analizi smo rep opisali z znaki TL, ATH, ATH2/10 in PTH9/10. Edino po visokem posterornem delu repne plavuti sta se dve skupini, ne samo Stiška, temveč tudi dalmatinsko-hercegovska, ločili od drugih. V dolžini sprednjih okončin so pri Kranjčevi izstopali edino istrski primerki z dolgimi okončinami, kar se je v naših analizah pokazalo v nepostopni DFA v dolžini zadnjih okončin, medtem ko se v postopni DFA sprednje okončine niso razlikovale med to skupino in preostalimi. Značilno so se sprednje, a tudi zadnje, okončine razlikovale med bosansko (z daljšimi okončinami) in dalmatinsko-hercegovsko skupino ter med stiško (s krajšimi okončinami) in dolenjsko-belokranjsko skupino. Sprednje okončine so nekoliko daljše od zadnjih; več avtorjev navaja, da je ta razlika v dolžini bolj izrazita pri samcih (Werner, 1897; Bedriaga, 1897; Arntzen in Sket, 1997). V vzorcih, ki smo ju uporabili za ugotavljanje razlik med skupinami, je bilo premalo primerkov z znanim spolom, da bi lahko preverili, če pri katerem od znakov neenaka zastopanost spolov vpliva na opažene razlike med skupinami. Razlike med spoloma v relativni dolžini okončin smo zato preverili na posebnem vzorcu 101 primerka z znanim spolom, v katerem so bile zajete skupine JZ Slovenija, Stična in [Dolenjska-Bela krajina]. Skupine so se razlikovale v dolžini PLL, ne pa tudi v dolžini ALL. Na dolžino nobene od okončin spol primerkov ni pomembno vplival (Priloga F). Število repnih vretenc in miomer sta ravno tako diskriminatorna le v manjši meri – ločita le nekatere skupine, med katerimi je tudi prekrivanje vrednosti večje. Kratkorepi istrski primerki imajo v povprečju manjše število repnih vretenc, vendar se pojavljajo tudi taki, ki po številu segajo v rang drugih skupin. Za zanesljivejše zaključke o pomembnosti tega znaka je treba pregledati večje število primerkov iz Istre. Po številu miomer se ločita predvsem stiška in JZ-slovenska skupina od vseh neslovenskih, vendar je znak precej nepomemben, saj so standardizitrani koeficienti v DFA (Tabela 15) nizki, še najvišji je na DF4, ki pa razloži le nekaj več kot 4% razlik med skupinami. Tako nismo potrdili razlik med istrsko, dalmatinsko-


hercegovsko in slovenskimi skupinami, kot jih lahko razberemo iz navedb Grillitscha in Tiedemanna (1994) ali vsaj med slovenskimi na eni in obema drugima skupinama na drugi strani (Sket in Arntzen 1997). Verjetno sta k razlikovanju njunih obalnih skupin in skupin notranjščine doprinesli ravno stiška in JZ-slovenska, vendar smo pokazali, da razlike niso konsistentne znotraj večjih skupin. Po številu vratnih in trupnih vretenc (VER), to je po znaku, ki ga zaradi manjkajočih vrednosti v multivariatno analizo nismo mogli vključiti, se od vseh drugih skupin razlikuje le črna podvrsta (ni prikazano). Tudi v relativni dolžini trupa se razlikuje le ta podvrsta od belih primerkov vseh, tudi lastne genetske skupine. Drugi analizirani znaki niso pomembno prispevali k razlikovanju med skupinami. Kljub nekaterim izrazitim razlikam med skupinami, zaradi katerih z dodatnim analiziranjem primerkov iz drugih lokalitet večjih sprememb v zaključkih te analize ne pričakujemo, pa rezultati analiz, ki so vključevale tudi italijanske primerke, kažejo na to, da bi ti lahko predstavljali bistveno dopolnilo analiziranim skupinam. Teh primerkov tudi genetsko nismo analizirali, vendar glede na recentne hidrografske povezave domnevamo, da pripadajo JZ-slovenskemu kladu. Če ta domneva velja, preseneča njihova morfologija, saj kaže, da so v večini znakov zelo podobni istrskim (Kranjec, 1981; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997). 4.1.3 Samostojne evolucijske linije močerila Ugotovljena filogeografska struktura močerila nakazuje, da močeril vključuje več samostojnih evolucijskih linij (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005), ki se ne ujemajo z njegovo današnjo taksonomsko delitvijo. Identifikacijo potencialnih samostojnih evolucijskih linij, med katerimi genskega pretoka ni, argumentiramo predvsem z recipročno monofilijo njihovih haplotipov mtDNA. Zaradi manjše efektivne velikosti populacije je v enakih razmerah čas koalescence mitohondrijskih haplotipov krajši kot čas koalescence jedrnih markerjev (Moore, 1995). Zato mtDNA omogoča razpoznavanje samostojnih evolucijskih linij znotraj skupin, ki jih po jedrni DNA (gl. tudi prilogo A) ali drugih v jedru kodiranih markerjih (npr. po morfologiji) težko ločimo (Wiens in Penkrot, 2002). Le na vzorcu diferenciacije mtDNA osnovane ocene stopnje genskega pretoka pa so lahko v primerih višje migracijske stopnje samcev ali poliginije podcenjene (Moore, 1997; Avise, 2000). Zato upoštevamo tudi njihovo ujemanje z geografsko ločenostjo populacij (Wiens in Penkrot, 2002). Če se haplotipi geografsko omejenih skupin lokalitet ne združujejo v monofiletske skupine, lahko to nakazuje genski pretok med ločenimi geografskimi regijami, nepopolno izločanje genskih linij (in ohranitev predniških haplotipov ali alelov) ali napačno oceno filogenetskih odnosov. Slednje možnosti v nadaljevanju posebej ne obravnavamo, saj smo v poglavju 4.1.1 pokazali, da je manj verjetna. Učinek nepopolnega razvrščanja genskih linij4 težko ločimo od učinka genskega pretoka. Zato genetska homogenost močerila v nekaterih jedrnih lokusih (Priloga A) ni nujno posledica genskega pretoka med domnevno ločenimi kladi in tudi ni nujno zavrnitev na mtDNA osnovanih razmejitev domnevnih samostojnih evolucijskih linij. V nasprotju z jedrnimi lokusi lahko uporaba mtDNA zaradi manjše efektivne velikosti populacije v veliki meri zmanjša možnost, da so skupni haplotipi posledica 4 Ko se geografska bariera pojavi, imata populaciji enak genski sklad, sčasoma pa se zaradi odstranitve oz. izginotja posameznih alelov ali haplotipov iz populacije in mutacij na ohranjenih alelih njuna genska sklada razlikujeta do te mere, da skupnih alelov več ni (»lineage sorting«; Avise, 2000).


ohranitve predniškega polimorfizma. Zato v nadaljevanju recipročno monofilijo geografskih skupin interpretiramo kot odsotnost genskega pretoka med temi skupinami. Poleg filogeografskega vzorca mtDNA za razmejitev potencialnih samostojnih evolucijskih linij upoštevamo še opaženo stopnjo njihove genetske diferenciacije v mtDNA, morfološko diferenciacijo in, kolikor je mogoče, objavljene podatke o alocimski variabilnosti (Sket in Arntzen, 1994). Haplotipi iz (1) Istre, (2) Slovenije in (3) Dalmacije-Hercegovine, Like ter Bosanske Krajine so združeni v dobro podprte, geografsko ločene monofiletske skupine, ki so razpoznavne tudi morfološko. Znotraj slovenskega klada in klada [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] so skupine haplotipov nadalje globoko ločene, kar pomeni, da bi ta dva klada lahko nadalje vsebovala samostojne evolucijske linije. Vse tri skupine v kladu južnih haplotipov so recipročno monofiletske, genetska divergenca med njimi pa dosega ali presega genetsko divergenco med sestrskimi vrstami drugih repatih dvoživk. Hitrost in vzorec evolucije kontrolne in sosednjih regij mtDNA pri močerilu se ne razlikuje od dinamike evolucije pri drugih dvoživkah (Gorički in Trontelj, 2006), zato tako visoke genetske razlike, kot smo jih zaznali med temi domnevno samostojnimi linijami močerila, verjetno niso posledica hitrejše evolucije primerjanih regij pri močerilu. Linije Dalmacija-Hercegovina, Lika in Bosanska Krajina so med seboj tudi geografsko ločene, zato je malo verjetno, da smo zaradi majhnih vzorcev (predvsem v linijah Lika in Bosanska Krajina) spregledali morebitni genski pretok med njimi. Medtem ko za linijo iz Like zadostnih morfoloških podatkov nimamo, je bosansko in dalmatinsko-hercegovsko linijo mogoče razpoznati tudi morfološko. Tudi znotraj slovenskega klada lahko razpoznamo vsaj dve domnevni samostojni evolucijski liniji. To sta JV- in JZ-slovenska linija, ki sta recipročno monofiletski, stopnja njune genetske divergence pa je na ravni genetske diferenciacije sestrskih vrst repatih dvoživk. Pri teh dveh potencialnih samostojnih evolucijskih linijah se vzorec morfološke diferenciacije ne ujema z genetsko. Vendar lahko v podporo njune domnevne evolucijske samostojnosti navedemo njuno geografsko ločenost in razlike v alocimski sestavi (Sket in Arntzen, 1994). Bolj vprašljiv je status morfološko in genetsko diferenciranih primerkov iz Stične. Glede na to, da se haplotipi Dolenjske in Bele krajine združujejo v lastno monofiletsko skupino, sestrsko stiški, domnevamo, da med skupinama Stična in [Dolenjska-Bela krajina] genskega pretoka ni. Vendar sta hidrografsko ti dve populaciji povezani preko skupnega zbirnega vodotoka (Krka). Ker smo analizirali DNA le enega primerka iz vsake od dveh bližnjih lokalitet iz Stične, bi lahko bila stopnja genskega pretoka iz dolenjsko-belokranjske v stiško populacijo podcenjena. Njuno domnevno evolucijsko samostojnost bi potrdili ali zavrnili z analizo vzorcev iz drugih lokalitet v okolici Stične in zgornjega dela porečja Krke. Morebitna dodelitev statusa samostojne evolucijske linije črni podvrsti je po upoštevanih kriterijih ravno tako dvomljiva. Kljub temu, da je populacija hidrografsko povezana s troglomorfno populacijo [Dolenjske-Bele krajine], njun ločen položaj na filogenetskem drevesu in izrazite morfološke razlike nakazujejo, da med njima genskega pretoka ni. Ker pa vzrokov, poteka in hitrosti razvoja troglomorfnih znakov pri močerilu ne poznamo, je utemeljevanje evolucijske samostojnosti troglomorfne in netroglomorfne oblike iz


[Dolenjske-Bele krajine] na morfologiji, ob nizki genetski diferenciaciji, manj zanesljivo. Ali sta populaciji reproduktivno ločeni, bi bilo treba preveriti z analizo nevezanih nevtralnih jedrnih markerjev (npr. visoko variabilnih mikrosatelitnih lokusov) in drugih lastnosti (npr. morebitne različne habitatne specializiranosti, vedenjskih razlik). Zaradi nizke stopnje genetske diferenciacije haplotipov iz porečja dalmatinske Krke in od njih ločenih porečij Cetine in Trebišnjice teh dveh skupin verjetno ne moremo razpoznati za samostojne evolucijske linije, kot tudi ne haplotipov iz izvirov Ljubljanice in južnejšega dela tega porečja. Navidezna recipročna ekskluzivnost haplotipov iz dveh delov porečja Ljubljanice bi lahko bila posledica pomanjkljivega vzorčenja vmesnih lokalitet, saj domnevamo, da je genski pretok med njima omejen predvsem zaradi razdalje. Tako smo razpoznali šest domnevno samostojnih evolucijskih linij. Te linije so geografsko omejene na naslednja območja: (1) Istra, (2) Lika in Gorski Kotar, (3) Dalmacija in Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) jugozahodna Slovenija in (6) jugovzhodna Slovenija. Navedene samostojne evolucijske linije bi bilo nujno upoštevati kot ločene enote v vseh raziskavah biologije močerila, ob že doslej upoštevani črni podvrsti. Za ugotovitev statusa populacij iz Stične, [Dolenjske-Bele krajine] in znotraj slednje še črne in bele skupine je treba opraviti dodatne analize. Pokazali smo, da je na diferenciacijo populacij močerila verjetno vplivala geo- in hidrografska členjenost v preteklosti. Ker je genetska izoliranost samostojnih linij močerila posledica njihove geografske izoliranosti, se genetsko razpoznani samostojni evolucijski liniji iz Dalmacije-Hercegovine in Like ujemata s taksonoma carrarae (Fitzinger, 1850) in croaticus (Brusina, 1880). Morfološke 'vrste', ki jih je Fitzinger (1850) opisal iz hidrografsko povezanih lokalitet (zoisii, schreibersi in freyery; haidingeri, laurenti in xanthostictus), pripadajo dvema domnevnima evolucijskima vrstama: prve tri JV-slovenski, druge tri pa JZ-slovenski liniji. 4.2 SKLEPI Po informaciji v nizko variabilnih odsekih mtDNA ostaja močerilovo filogenetsko drevo na bazalni ravni nerazrešeno. Še največjo podporo je dobila bazalna odcepitev istrske linije, vendar le na najvarčnejših drevesih. Trije potencialno bazalni kladi (Istra, Slovenija in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]) bi se lahko bili ločili v relativno kratkem časovnem zaporedju, za kar smo poiskali možno paleogeografsko razlago – morske transgresije Paratetide. Odnosi med temi kladi in znotraj njih se ujemajo s hipotetičnimi sorodstvenimi odnosi prej analiziranih haplotipov kontrolne in sosednjih regij (Gorički, 2004; Gorički in Trontelj, 2006), rezultati alocimske analize slovenskih populacij (Sket in Arntzen, 1994) in deloma s filogeografskim vzorcem podobno razširjenih vrst rakov (Verovnik, 2004; Zakšek in sod., v reviziji). Približno ocenjeni časi ločitev kladov ne odstopajo veliko od tistih, ki smo jih ocenili na podlagi domnevne hitrosti evolucije kontrolne regije. Tudi filogenetske odnose na tej ravni smo razložili z zaporedno geografsko in hidrografsko členitvijo areala predniške populacije. Trije največji kladi se razlikujejo tudi morfološko, in sicer predvsem po kombinaciji naslednjih znakov: dolžina glave, dolžina repa, število zob in dolžina zadnjih okončin. Izkazalo se je, da morfološke razlike med temi tremi kladi presegajo razlike znotraj njih. Bolj


sorodne genetsko definirane skupine so si tudi morfološko bolj podobne, vendar smo vzorca iz Dalmacije-Hercegovine in Bosanske Krajine morfološko še vedno lahko ločili. Za popolnejšo sliko stopnje in vzorca morfološke diferenciacije južnega klada je treba v analize vključiti vsaj še vzorec populacije iz Like. V slovenskem kladu se vzorec morfološke diferenciacije ne ujema z domnevno stopnjo sorodnosti skupin (tudi ne glede na očitne razlike med belo in črno podvrsto), opazili pa smo tudi verjetno konvergenco posameznih znakov med (nekaterimi) slovenskimi in katero od južnih skupin. Zaradi take mozaične razporeditve prejšnji avtorji (Kranjec, 1981; Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) brez informacije o relativni stopnji diferenciacije v domnevno nevtralnih genetskih markerjih niso uspeli izluščiti razlik med tremi osnovnimi kladi. Ravno domnevna konvergentna evolucija troglomorfnih populacij bi po drugi strani lahko bila razlog, da smo opazili nekatere morfološke razlike med tremi bazalnimi skupinami. Glede na ugotovljeno filogeografsko strukturo močerila, visoko stopnjo genetske diferenciacije v mtDNA, morfološko diferenciacijo in deloma objavljene podatke o alocimski strukturi (Sket in Arntzen, 1994) smo identificirali šest domnevno samostojnih evolucijskih linij. Te linije so geografsko omejene na naslednja območja: (1) Istra, (2) Lika in Gorski Kotar, (3) Dalmacija in Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) jugozahodna Slovenija in (6) jugovzhodna Slovenija. Le dve od teh linij se zaradi njune geografske razširjenosti ujemata z morfološkima vrstama Fitzingerja (1850) in Brusine (1880). Nadaljnjih šest 'vrst', ki jih je opisal Fitzinger (1850), pripada JZ- ali JV-slovenski liniji. Možno je, da JV-slovenska linija vključuje dve ali tri samostojne evolucijske linije, ki pa jih z zbranimi podatki in po uporabljenih kriterijih (manjka hidrografska ločenost) nismo mogli potrditi. Problem pri stiški populaciji je pomanjkljivo vzorčenje, pri črni in beli populaciji iz Dolenjske in Bele krajine pa nepoznavanje vzrokov in procesov ohranitve pleziomorfnih stanj morfoloških znakov in razvoja troglomorfoz ter nizka stopnja njune genetske diferenciacije. Navidezno reprodukcijsko izoliranost JV-slovenskih populacij iz hidrografsko povezanih lokalitet je vsekakor treba preveriti še z analizo drugih markerjev. 5 POVZETEK 5.1 Povzetek Začetek ugotavljanja populacijske strukture močerila (Proteus anguinus Laurenti, 1768) sega v leto 1850. Fitzinger (1850) ga je glede na morfološke razlike razdelil na sedem vrst. Brusina (1880) je tem dodal še eno vrsto (cit. po Sket, 1997). Razen na ravni podvrst vrste P. anguinus (Schreiber, 1912; de Fejérváry, 1926) ti taksoni niso bili splošno sprejeti. Danes na podlagi morfoloških razlik ločujemo dve podvrsti (Slika 1): Proteus anguinus anguinus Laurenti, 1768 (v nadaljevanju: bela podvrsta), in P. a. parkelj Sket in Arntzen, 1994 (v nadaljevanju: črna podvrsta). Predvsem zaradi podobnosti večine populacij v splošnih pedomorfnih in troglomorfnih znakih, po drugi strani pa zaradi dokaj velikih morfometričnih razlik znotraj večjih, geografsko razmejenih skupin populacij (Kranjec, 1981; Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) je taksonomija močerila ostala nekoliko problematična (gl. Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1996; Arntzen in Sket, 1997).


Rezultati alocimske analize nekaterih slovenskih populacij (Sket in Arntzen, 1994) in geografsko obširnejše analize kontrolne regije (CR) mitohondrijske DNA (mtDNA) (Gorički, 2004) so pokazali, da skupina populacij bele podvrste ni monofiletska. Z analizo zaporedij mtDNA smo ugotovili, da je močeril globoko genetsko diferenciran. Vrsto sestavlja vsaj šest ločenih kladov mitohondrijskih haplotipov, ki pripadajo naslednjim geografskim območjem: (1) Istra, (2) Lika in Gorski Kotar, (3) Dalmacija in Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) jugozahodna Slovenija in (6) jugovzhodna Slovenija, katere del je tudi črna podvrsta. Bazalna odcepitev Istrske linije na filogenetskem drevesu je ostala vprašljiva, kot tudi odnosi med kladi (2), (3) in (4). Najmanj variabilni odseki mtDNA omogočajo zanesljivejše usklajevanje zaporedij in ob zadostnem številu razlik razrešitev globljih cepitev na drevesu. Prvi namen tega dela je bil zato preveriti sorodstvene odnose monofiletskih skupin močerila z analizo odseka, ki vsebuje gene za 12S in 16S rRNA ter tRNA-Val. Z uporabo molekulske ure smo ocenili čas ločitev sestrskih kladov močerila in v neodvisnih virih poiskali možne paleogeografske procese, ki so oblikovali filogeografski vzorec mtDNA močerila. Preverili smo ujemanje filogenetskih hipotez na osnovi zaporedij mtDNA z vzorcem alocimske variabilnosti nekaterih slovenskih populacij (Sket in Arntzen, 1994) in filogeografskimi vzorci podobno razširjenih vrst rakov (Verovnik in sod., 2004; Zakšek in sod., v reviziji). S pomočjo informacije o genetski strukturi močerila smo definirali monofiletske skupine, med katerimi smo iskali razlike v morfologiji. Glede na ugotovljeno filogeografsko strukturo močerila, visoko stopnjo genetske diferenciacije v mtDNA, morfološko diferenciacijo in deloma objavljene podatke o alocimski strukturi (Sket in Arntzen, 1994) smo prepoznali samostojne evolucijske linije (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005) znotraj močerila. Fragment mitohondrijske DNA med oligonukleotidoma 12Sa (modificiran po Kocher in sod., 1989) in 16Sbr (Simon in sod., 1991) smo sekvencirali pri 19 osebkih močerila iz 16 lokalitet (Tabela 1), ki smo jih izbrali tako, da so bile zastopane vse genetske linije kontrolne regije (Gorički in Trontelj, 2006). Z istimi oligonukleotidi smo ta fragment pomnožili še pri enem osebku vsake od štirih vrst sorodnega rodu Necturus, ki smo jih uporabili za koreninjenje drevesa močerilovih haplotipov. Filogenetske odnose med haplotipi smo ugotavljali po metodi varčnosti, največjega verjetja in po Bayesovi metodi. V metodi varčnosti smo vsem tipom nukleotidnih substitucij dodelili enako težo. Za iskanje drevesa največjega verjetja in Bayesovega drevesa smo uporabili substitucijski model GTR+I+Γ. Z uporabo molekulske ure mitohondrijskih genov rRNA, kalibrirane na času ločitve rodov Euproctus in Calotriton ter Taricha in Notophthalmus (Caccone in sod., 1997), smo ocenili čas ločitev sestrskih kladov močerila in poiskali možne paleogeografske procese, ki so oblikovali filogeografski vzorec mtDNA močerila. Filogenetske odnose smo rekonstruirali tudi na podlagi informacije v celotnem znanem zaporedju mtDNA, to je na podlagi združenih zaporedij dela gena za citokrom b, zaporedja kontrolne regije, treh celotnih in enega delnega zaporedja genov tRNA in delnih zaporedij genov rRNA. Za koreninjenje drevesa smo uporabili zaporedja vrst iz rodov Necturus, Ambystoma, Salamandra, in Lyciasalamandra, večinoma iz baze GenBank. Sorodstvene odnose med haplotipi smo ugotavljali po enakih kriterijih kot odnose med haplotipi rDNA.


Dele zaporedja CR smo uporabili za primerjavo genetskih razdalj med monofiletskimi skupinami močerila z genetskimi razdaljami med nekaterimi sestrskimi vrstami repatih dvoživk. V primerjavah smo uporabili haplotipe 86 osebkov močerila iz 27 lokalitet. Haplotipe smo združili v monofiletske skupine na treh hierarhičnih ravneh (Tabela 2). Iz baze GenBank smo izbrali tista zaporedja, ki so v čim daljšem delu homologna z močerilovim zaporedjem in so obenem poznana pri čim večjem številu sorodnih vrst, katerih medsebojni sorodstveni odnosi so po možnosti dobro znani (Tabele 3–5). Primerjali smo patristične genetske razdalje med sestrskimi kladi močerila in sestrskimi veljavnimi vrstami. Patristične distance med vsemi predstavniki sestrskih vrst in kladov močerila smo izračunali iz dreves največjega verjetja. Na skupno 128 primerkih iz zbirk različnih inštitucij smo izmerili 18 metričnih in 3 meristične znake. Da bi dobili podatke še za nekatere druge znake in povečali število primerkov v vzorcu, smo upoštevali tudi matriko podatkov, ki sta jo pred leti sestavila N. Kranjec in B. Sket. Matrika vsebuje vrednosti 12 metričnih in 7 merističnih znakov. Tako smo zbrali podatke za 164 živali (Priloga B, Tabela B4) iz 29 lokalitet. Pred analizo razlik med populacijami smo izločili znake, ki zaradi visoke korelacije z obdržanimi znaki merijo isto dimenzijo. Iz kombinacij znakov, katerih Personovi korelacijski koeficienti v celotnem vzorcu troglomorfnih populacij so presegali vrednost 0,9, smo izločili tiste znake, katerih vrednosti so bile izmerjene pri manjšem številu primerkov. Na ta način smo obdržali naslednje znake: HL, HWmax, PLL, TL, MIO, CVR, D.DNT, D.VOM in D.PMX. Razlike med skupinami smo ugotavljali z diskriminantno analizo (DFA) 59 primerkov na dveh ravneh glede na stopnjo genetske diferenciacije. Za analizo na prvi ravni smo definirali tri skupine: [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina], Istra in Slovenija. Na drugi ravni smo definirali sedem skupin, katerih najmanjša povprečna genetska divergenca med sestrskimi pari je presegala minimalno genetsko divergenco med sestrskimi vrstami drugih repatih dvoživk. Te skupine so bile: Bosanska Krajina, Lika, Dalmacija-Hercegovina, Istra, JZ Slovenija, Stična in [Dolenjska-Bela krajina] (v to skupino smo uvrstili tudi primerke črne podvrste). V analizah na tej ravni smo edini osebek iz Like mapirali a-posteriori. Analize smo ponovili še brez črne podvrste (4 primerki). Naslednjo diskriminantno analizo smo opravili, upoštevajoč istih devet osnovnih znakov in iste skupine, vendar smo tokrat obdržali 66 primerkov, manjkajoče vrednosti znakov pa ocenili regresijsko. Analizo smo ponovili še brez črne podvrste. Morebitne razlike med skupinami smo iskali tudi s postopno DFA vzorca lastne meritve (128 primerkov), na začetku upoštevajoč vseh 18 metričnih znakov, ki smo jih izmerili v tej meritvi. Manjkajoče podatke smo dopolnili regresijsko (Priloga B, Tabela B5). Na ta način smo preverili, ali se skupine razlikujejo tudi po katerih od znakov, ki smo jih v prejšnjih analizah izločili. Ponovno smo definirali skupine na dveh ravneh in razlike ugotavljali na celotnem vzorcu ter ob izključitvi črne podvrste. Odnosi med kladi haplotipov rDNA (Slike 3–5) se ujemajo s hipotetičnimi sorodstvenimi odnosi prej analiziranih haplotipov kontrolne in sosednjih regij (Gorički, 2004; Gorički in Trontelj, 2006). Približno ocenjeni časi ločitev kladov ne odstopajo veliko od tistih, ki smo jih ocenili na podlagi domnevne hitrosti evolucije kontrolne regije. Po informaciji v nizko variabilnih odsekih mtDNA ostaja močerilovo filogenetsko drevo na bazalni ravni


nerazrešeno. Še največjo podporo je dobila bazalna odcepitev istrske linije, vendar le na najvarčnejših drevesih. Trije potencialno bazalni kladi (Istra, Slovenija in [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina]) bi se lahko ločili v relativno kratkem časovnem zaporedju, med približno 8,8 in 16 milijoni let. Vzrok cepitve teh linij bi lahko bile miocenske morske transgresije, ki bi predniku teh kladov predstavljale migracijsko bariero. Vse od karpatske do zgodnje-badenijske (17,3–14 milij. let) transgresije naj bi namreč morje pokrivalo območje osrednje Slovenije (Rögl, 1998), Istra pa bi lahko bila ločena od kontinenta. Zadnja miocenska morska transgresija naj bi po Paveliću (2002) to območje poplavila pred 13,4 milijoni let. Tako v slovenskem kot v južnem kladu je po približnih ocenah do nadaljnih cepitev prišlo pred 5,4–4,2 milijonoma let. V kladu [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] bi lahko prišlo do cepitev med liško, bosansko in dalmatinsko-hercegovsko skupino v dokaj kratkih časovnih presledkih ali celo istočasno na treh območjih. Časi ločitev treh glavnih linij in kladov haplotipov iz tega območja sovpadajo z domnevnim obstojem nepovezanih jezer v mesiniju, pribl. 6 do 5,5 milijonov let nazaj (Prelogović in sod., 1975), v katerih bi se te linije lahko ločile. Konec miocena naj bi tudi v južni Sloveniji tektonska aktivnost povzročila nastanek ločenih jezerskih kotanj (Prelogović in sod., 1975), kjer bi lahko prišlo do diferenciacije prednikov današnjega jugovzhodnega in jugozahodnega klada. Stiška linija naj bi se od drugih haplotipov JV Slovenije ločila pred vsaj približno 3,6–2,9 milijoni let. Opažen filogeografski vzorec se ujema s filogeografskim vzorcem populacij vodnega oslička iz zgornjega toka Krke, ki so ravno tako del JV-slovenskega klada (Verovnik in sod., 2004), in domnevo, da so imeli rečni tokovi na območju Stične in Bele krajine že od miocena zelo podobno smer toka kot danes (Sket in Arntzen 1994). Cepitev črne in bele oblike dolenjsko-belokranjske genetske skupine naj bi se po rDNA zgodila šele pred 500.000 do 600.000 in ne pred 1,1 do 2,4 milijoni let, vendar je predpleistocenska ocena ločitve populacij Bele krajine verjetnejša. Ta se ujema z domnevnim začetkom zakrasevanja na tem območju (Radinja, 1972). Začetek zakrasevanja bi lahko vodil do genetske izolacije črne in bele belokranjske populacije zaradi morebitnega časovno in prostorsko ločenega vseljevanja v podzemlje (Sket in Arntzen, 1994). V vseh preverjenih segmentih mitohondrijske DNA so patristične razdalje med sestrskimi monofiletskimi skupinami močerila dosegale ali presegale distance med priznanimi sestrskimi vrstami nekaterih drugih repatih dvoživk (Slika 10). Tudi haplotip iz Stične je bil od sestrskih dolenjsko-belokranjskih (vključno s črno podvrsto) bolj genetsko oddaljen kot večina sestrskih vrst primerjanih dvoživk. Genetske razdalje med haplotipi črne podvrste in njim sestrskimi haplotipi iz Dolenjske in Bele krajine pa so bile nizke in niso dosegale genetskih razdalj med sestrskimi vrstami primerjanih repatih dvoživk. Trije največji kladi se razlikujejo tudi morfološko, in sicer predvsem po kombinaciji naslednjih znakov: dolžina glave, dolžina repa, število zob in dolžina zadnjih okončin. Izkazalo se je, da morfološke razlike med temi tremi kladi presegajo razlike znotraj njih. Bolj sorodne genetsko definirane skupine so si tudi morfološko bolj podobne, vendar smo vzorca iz Dalmacije-Hercegovine in Bosanske Krajine morfološko še vedno lahko ločili. Za popolnejšo sliko stopnje in vzorca morfološke diferenciacije južnega klada je treba v analize vključiti vsaj še vzorec populacije iz Like. V slovenskem kladu se vzorec morfološke diferenciacije ni ujemal z domnevno stopnjo sorodnosti skupin (tudi ne glede na očitne razlike


med belo in črno podvrsto), opazili pa smo tudi verjetno konvergenco posameznih znakov med (nekaterimi) slovenskimi in katero od južnih skupin. Zaradi take mozaične razporeditve prejšnji avtorji (Kranjec, 1981; Sket in Arntzen, 1994; Grillitsch in Tiedemann, 1994; Arntzen in Sket, 1997) brez informacije o relativni stopnji diferenciacije v domnevno nevtralnih genetskih markerjih niso uspeli izluščiti razlik med tremi osnovnimi kladi. Ravno domnevna konvergentna evolucija troglomorfnih populacij bi po drugi strani lahko bila razlog, da smo opazili nekatere morfološke razlike med tremi bazalnimi skupinami. Ugotovljena filogeografska struktura močerila nakazuje, da močeril vključuje več samostojnih evolucijskih linij (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005), ki se ne ujemajo z njegovo današnjo taksonomsko delitvijo. Glede na recipročno monofilijo geografsko ali hidrografsko ločenih kladov, visoko stopnjo njihove genetske diferenciacije v mtDNA, morfološko diferenciacijo in deloma objavljene podatke o alocimski strukturi (Sket in Arntzen, 1994) smo identificirali šest domnevno samostojnih evolucijskih linij. Te linije so geografsko omejene na naslednja območja: (1) Istra, (2) Lika in Gorski Kotar, (3) Južna Dalmacija in Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) jugozahodna Slovenija in (6) jugovzhodna Slovenija. Le dve od linij se zaradi njune geografske razširjenosti ujemata z morfološkima vrstama Fitzingerja (1850) in Brusine (1880). Nadaljnjih šest 'vrst', ki jih je opisal Fitzinger (1850) pripada JZ- ali JV-slovenski liniji. Možno je, da JV-slovenska linija vključuje dve ali tri samostojne evolucijske linije, ki pa jih z zbranimi podatki in po uporabljenih kriterijih nismo mogli potrditi. Problem pri stiški populaciji je pomanjkljivo vzorčenje, pri črni in beli populaciji iz Dolenjske in Bele krajine pa nepoznavanje vzrokov in procesov ohranitve pleziomorfnih stanj morfoloških znakov in razvoja troglomorfoz ter nizka stopnja njune genetske diferenciacije. Navidezno reprodukcijsko izoliranost teh populacij iz geografsko povezanih lokalitet je vsekakor treba preveriti še z analizo drugih markerjev. 5.2 Summary The first study of the European cave salamander (Proteus anguinus Laurenti, 1768) population structure dates back to 1850, when Fitzinger (1850) described seven species based on morphological differences. Another species was later described by Brusina (1880). However, none of these taxa were widely recognised. In current taxonomy, Proteus is divided into two subspecies (Figure 1): the troglomorphic P. a. anguinus Laurenti, 1768 and the pigmented P. a. parkelj Sket et Arntzen, 1994. Most populations are very similar in the general pedomorphic and troglomorphic traits, while morphometric variability within large, geographically delimited populations can be quite high (Kranjec, 1981; Sket and Arntzen, 1994; Grillitsch and Tiedemann, 1994; Arntzen and Sket, 1997). For these reasons, the taxonomy of Proteus has remained to some degree controversial (see Grillitsch and Tiedemann, 1994; Arntzen and Sket, 1996; Arntzen and Sket, 1997). The study of alozyme variability in a few Slovenian populations (Sket and Arntzen, 1994), and a geographically broader analysis of mitochondrial control region (CR) DNA sequences (Gorički, 2004) revealed that the currently recognised non-troglomorphic subspecies P. a. parkelj and the implicated P. a. anguinus are not sister-taxa (sister clades). The species is divided into at least six deeply separated clades of CR haplotypes, from (1) The Istra Peninsula, (2) Lika and Gorski Kotar, (3) Dalmacija and Hercegovina, (4) Bosanska Krajina,


(5) SW Slovenia and (6) SE Slovenia. The pigmented subspecies is nested within the SE Slovenian clade. The Istrian lineage was identified as the most likely basal lineage, but its basal position remained questionable. Least variable sections of mtDNA can be aligned more reliably and, assuming the number of substitutions is high enough, should provide a better resolution at the deepest nodes. Our first aim was therefore to examine the relationships among the monophyletic groups of Proteus by analyzing the mtDNA fragment containg the 12S rRNA, 16S rRNA and tRNA-Val genes. Applying the molecular clock we estimated approximate divergence dates of the clades of Proteus and identified possible paleogeographic or paleohydrographic barriers to gene flow among the clades. The validity of phylogenetic hypotheses based on mtDNA sequences was veryfied through their concordance with the pattern of alozyme variability in the Slovenian populations analyzed by Sket and Arntzen (1994) and by means of their concordance with the phylogeographyc patterns of subterranean crayfish taxa (data from Verovnik et al., 2004; Zakšek et al., in revision). Based on the inferred genetic structure of Proteus and the degree of genetic differentiation (Figure 9), monophyletic groups were defined that were compared morphometrically. Based on the phylogeographic pattern, mtDNA genetic divergences among the clades, morphological differentiation and partly on the published allozyme data (Sket and Arntzen, 1994), we identified independent evolutionary lineages (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005) within Proteus. The mtDNA fragment between primers 12Sa (modified after Kocher et al., 1989) and 16Sbr (Simon et al., 1991) was sequenced in 19 individuals from 16 localities (Table 1). All genetic lineages of the CR (Gorički and Trontelj, 2006) were represented by the selected individuals. The same fragment was sequenced in four species of Necturus, which were used to root the tree. Phylogenetic relationships among the haplotypes were inferred using parsimony, maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI). In the parsimony analyses, all substitutions were weighted equally. ML and BI trees were searched for under the GTR+I+Γ model of substitutions. Applying the molecular clock of the rRNA genes calibrated on the time of the Euproctus – Calotriton and Taricha – Notophthalmus splits (Caccone et al., 1997), we estimated approximate divergence dates of the clades of Proteus. Phylogenetic relationships were inferred also by using the concatenated cytochrome b gene, CR, three complete and a partial tRNA gene, and the above mentioned rDNA sequences. Trees were rooted using sequences of Necturus, Ambystoma, Salamandra and Lyciasalamndra species, mostly obtained from GenBank. The relationships among haplotypes were inferred under the same criteria as above. Inter-clade genetic distances in CR and flanking sequences of 86 Proteus individuals from 27 localities were compared with those of sister species in several other salamander genera. Homologous mtDNA sections of the latter were obtained from GenBank (Tables 3–5). Patristic genetic distances between sister clades of Proteus (Table 2) and sister species of other genera were calculated from the ML trees. On 128 preserved specimens, 18 metric and 3 meristic characters were measured. Additional specimens and characters were obtained from the matrix containing the values of 12 metric


and 7 meristic characters, compiled previously by N. Kranjec and B. Sket. We thus collected data for 164 specimens from 29 localities (Appendix B). Prior to the analyses of inter-clade morphometric variability, the majority of the characters was excluded from the dataset because of their high mutual correlations. Among the characters whose Pearson correlation coeficients in the total sample of troglomorphic populations exceeded 0.9, those with more missing values in the dataset were excluded. The characters HL, Hwmax, PLL, TL, MIO, CVR, D.DNT, D.VOM and D.PMX were used in the discriminant function analysis (DFA) of 59 individuals, split into monophyletic groups at two hierarchical levels. At the first level we defined three groups: Istra, [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] and Slovenia. At the second level, seven groups were defined: Istra, Dalmacija-Hercegovina, Bosanska Krajina, Lika, SW Slovenia, Stična and [Dolenjska-Bela krajina] (including the pigmented subspecies). The only individual from Lika was maped a-posteriori. The analyses were repeated without the black subspecies (4 specimens). The next DFA was performed on the same set of characters and groups, but including 66 individuals, whose missing values were estimated by regressions. The same groups composed of 128 individuals were compared in a stepwise DFA of 18 morphometric characters measured by the author. Phylogenetic analyses confirmed six deeply separated lineages and clades identified by the previous analysis of CR sequences in a larger sample (Gorički, 2004). The approximate datations of their splits calculated from the rDNA sequences largely coincide with those estimated fom CR. Three high-level clades were identified: from (1) the Istra Peninsula, (2) Slovenia and (3) Dalmacija, Hercegovina, Lika, Gorski Kotar and Bosanska Krajina. The rDNA sequences did not resolve the basal split among these candidate clades. The Istrian lineage again appeared the most likely basal lineage, however only on the parsimony tree. The tree lineages might have split in a relatively short time span. Using molecular rates of other salamanders we tentatively dated these splits at 8.8-16 Myr. The splits might have been brought about by marine transgressions of the Paratethys during Miocene, between 17.3 and 13.4 Myr ago (Rögl, 1998; Pavelić, 2002). The clades (2) and (3) were further split into, respectively, two and three geographically restricted clades. These splits, dated at roughly 4.2–5.4 Myr, correspond to the lacustrine phase of the Paratethys (Prelogović, 1975), or follow paleohydrographic connections. The three lineages in the [Dalmacija-Hercegovina + Lika-Krajina] are geographically restricted to the areas (1) Dalmacija and Hercegovina, (2) Lika and Gorski Kotar and (3) Bosanska Krajina. The two clades within the Slovenian group occur on the SW and the SE Slovenian karst, respectively, with the black subspecies nested within the SE Slovenian clade. The lineage from Stična was presumably separated from the hydrologically connected clade from [Dolenjska-Bela krajina] (including the black subspecies) 3.6–2.9 Myr ago. Its affinity to the SE clade is in agreement with the phylogeographyc pattern of water lice Asellus aquaticus (Verovnik et al., 2004). Based on the rDNA sequences, the split between the black and the white morph of the [Dolenjska-Bela krajina] clade presumably occurred at cca. 500,000 to 600,000 years ago, however, we find the pre-Pleistocene datation of CR (at 1.1-2.4 Myr) more plausible. The latter coincides with the presumed onset of karstification in this region (Radinja, 1972), which might have lead to the isolation of the two forms through spatiatially or temporally separated cave invations (Sket and Arntzen, 1994).


In all segments of the CR and adjacent genes, patristic distances between sister clades of Proteus reached or exceeded the level of genetic differentiation between sister species of several other salamanders. Not only was this observed among the six major clades, but also between the Stična lineage and the [Dolenjska-Bela krajina] (including the black subspecies) clade. On the other hand, genetic distances between the troglomorphic and the nontroglomorphic form of the [Dolenjska-Bela krajina] clade were below the level of genetic differentiation in the compared salamander sister species. The tree high-level clades could be distinguished morphologically primarily by the combination of head, tail and posterior limb length and the number of teeth. More closely related groups within them are morphometrically more similar. However, the samples fom Dalmacija-Hercegovina and Bosanska Krajina could still be distinguished based largely on the relative tail length and the number of vomerine teeth relative to those on other bones. For a more thorough picture of morphological differentiation within this clade, we lacked a sample from Lika. In the Slovenian clade, the pattern of morphological differentiation did not match the genetic phylogeographic patern (even irrespective of the obvious discrepancies concerning the distinctive morphology of the black subspecies). In some individual characters we noted a putative convergence between a certain group from the Slovenian clade and either the Dalmacija-Hercegovina or the Bosanska Krajina clade. Probably because of such mosaic distribution, previous authors (Kranjec, 1981; Sket and Arntzen, 1994; Grillitsch and Tiedemann, 1994; Arntzen and Sket, 1997), lacking the information on the relative differentiation in genetic markers, failed to identify morphological differences between the three high-level clades. The established phylogeographic pattern suggests that in Proteus the number of independent evolutionary lineages (Simpson, 1961; Wiley, 1978; de Queiroz, 1998, 2005) is underestimated by current taxonomy. Based on the detected reciprocal monophyly of the geographically or hydrographycally separated lineages, the high genetic divergences, reaching or exceeding those of sister species in other salamander genera, the detected morphological differentiation between most of the clades and partly on published allozyme data (Sket and Arntzen, 1994), we delimited six putative independent evolutionary lineages. They correspond to the following geographic areas: (1) Istra, (2) Lika and Gorski Kotar, (3) Dalmacija and Hercegovina, (4) Bosanska Krajina, (5) SW Slovenia and (6) SE Slovenia. Only two pf these putative independent evolutionary lineages match the morphological species of Fitzinger (1850) and Brusina (1880). The other six “species” described by Fitzinger (1850) belong to the SW or SE Slovenian lineage. It is possible, that the SE Slovenian lineage contains further two or three independent evolutionary lineages. However, they could not be confirmed given the available data and the applied criteria. A possible error might exist in the scarce sampling in the Stična area. Furthermore, the lack of information about the rate and the mechanism of troglomorphisms attainment in Proteus renders the recognition of the black and the white morph in the [Dolenjska-Bela krajina clade] as independent lineages untenable. The apparent reproductive isolation of the three SE Slovenian populations from hydrographically connected regions has to be tested by analyzing other markers.


6 VIRI Alberch, P., Gould, S. J., Oster, G. F. in Wake, D. B. 1979. Size and shape in ontogeny and phylogeny. Paleobiology 5, 296-317. Arnason, U., Gullberg, A., Janke, A., Joss, J. in Elmerot, C. 2004. Mitogenomic analyses of deep gnathostome divergences: a fish is a fish. Gene 333, 61–70. Arntzen, J. W. in Sket, B. 1996. Speak of the devil: the taxonomic status of Proteus anguinus parkelj revisited (Caudata: Proteidae). Herpetozoa 8, 165-166. Arntzen, J. W. in Sket, B. 1997. Morphometric analysis of black and white European cave salamanders, Proteus anguinus. J. Zool., London 241, 699-707. Avise, J. C. 2000. Phylogeography, the history and formation of species. Harvard university press, London, 447 str. Bonett, R. M. in Chippindale, P. T. 2004. Speciation, phylogeography and evolution of life history and morphology in plethodontid salamanders of the Eurycea multiplicata complex. Mol. Ecol. 13, 1189-1203. Bossuyt, F. in Milinkovitch, M. C. 2000. Convergent adaptive radiations in Madagascan and Asian ranid frogs reveal covariation between larval and adult traits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6585-6590. Brusina, S. 1880. Jedan decenium naše zoologičke literature (1867-1877). Rad JAZU 52, 1-87. Caccone, A., Milinkovitch, M. C., Sbordoni, V. in Powell, J. R. 1997. Mitochondrial DNA rates and biogeography in European newts (genus Euproctus). Syst. Biol. 46, 126-144. Carranza, S. in Amat, F. 2005. Taxonomy, biogeography and evolution of Euproctus (Amphibia: Salamandridae), with the resurrection of the genus Calotriton and the description of a new endemic species from the Iberian Peninsula. Zool. J. Linn. Soc. 145, 555-582. Chippindale, P. T., Hillis, D. M. Wiens, J. J. in Price, A. H. 2000. Phylogenetic relationships and systematic revision of central Texas hemidactyliine plethodontid salamanders. Herpetological Monographs 14, 1-80. de Fejérváry, G. J. 1926. Note sur la variations du Protée et description d'individus provenants d'un nouvel habitat. Ann. hist. nat. Mus. hung. 24, 228-236. de Queiroz, K. 1998. The general lineage concept of species, species criteria, and the process of speciation: a conceptual unification and terminological recommendations. V: Howard, D. J. in Berlocher, S. H. (ured.). Endless forms: species and speciation. Oxford University Press, Oxford, 57-75.


de Queiroz, K. 2005. Ernst Mayr and the modern concept of species. Proc. natl. Acad. Sci. USA 102, 6600-6607. Edgar R. C. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, 1792–1797. Elwood, H. J., Olsen, G. J. in Sogin, M. L. 1985. The small-subunit ribosomal RNA gene sequences from the hypotrichous ciliates Oxytricha nova and Stylonychia pustulata. Mol. Biol. Evol 2, 399-410. Estes, R. 1981. Gymnophiona, Caudata. V: Wellenhofer, P. 1981. Handbuch der Paläoherpetologie. Fisher Verlag, Jena, 26-29. Fiorello, C. V. in German, R. Z. Heterochrony within species: craniofacial growth in giant, standard, and dwarf rabbits. Evolution 51, 250-261. Fišer, C. 2006. Filogenetski odnosi in taksonomija slepih postranic (Crustacea: Amphipoda: Niphargidae). Doktorska disertacija, Ljubljana, 51 str. Fitzinger, L. 1850. Über den Proteus anguinus der Autoren. Sitz.-ber. kais. Akad. Wiss. Math, nat. Classe 5, 291-303. Fourment, M. in Gibbs, M. J. 2006. PATRISTIC: a program for calculating patristic distances and graphically comparing the components of genetic change. BMC Evolutionary Biology 6, 1. Frost, D. R., Grant, T., Faivovich, J., Bain, R., Haas, A., Haddad, C. F. B., de Sa, R. O., Channing, A., Wilkinson, M., Donnellan, S. C., Raxworthy, C., Campbell, J. A., Blotto, B. L., Moler, P., Drewes, R. C., Nussbaum, R. A., Lynch, J. D., Green, D. M. in Wheeler, W. C. 2006. The Amphibian Tree of Life. Bull. Am. Mus. Nat. Hist. 297, 1-291. Gorički, Š. 2004. Ugotavljanje genetske diferenciacije močerila (Proteus anguinus) z analizo zaporedij mitohondrijske DNA. Magistrsko delo, Ljubljana, 63 str. Gorički, Š. in Trontelj, P. 2006. Structure and evolution of the mitochondrial control region and flanking sequences in the European cave salamander Proteus anguinus. Gene, v tisku. Grillitsch, H. in Tiedemann, F. 1994. Die Grottenolm-Typen Leopold FITZINGERs (Caudata: Proteidae: Proteus). Herpetozoa 7, 139-148. Guindon, S. in Gascuel, O., 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst. Biol. 52, 696–704. Habič, P. 1989. Kraška bifurkacija Pivke na jadransko črnomorskem razvodju. Acta Cars. 18, 233-264. Herak, M. 1957. Geološka podloga krškog područja. Krš Jugoslavije 5, 11-23.


Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards; S. W., Pääbo, S., Villablanca, F. X. in Wilson, A. C. 1989. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6196-6200. Kos, M., Bulog, B., Szél, Á. in Röhlich, P. 2001. Immunocytochemical demonstration of visual pigments in the degenerate retinal and pineal photoreceptors of the blind cave salamander (Proteus anguinus). Cell Tissue Res. 303, 15-25. Kozak, K. H., Larson, A., Bonett, R. M. in Harmon, L. J. 2005. Phylogenetic analysis of ecomorphological divergence, community structure, and diversification rates in dusky salamanders (Plethodontidae: Desmognathus). Evolution 59, 2000–2016. Kranjec, N. 1981. Razširjenost in variabilnost močerila (Proteus anguinus Laurenti). Diplomsko delo, Ljubljana, 70 str. Lefébure, T., Douady, C., Gouy, M. in Gibert, J. (a). Relationship between morphological taxonomy and molecular divergence within Crustacea: proposal of a molecular threshold to help species delimitation. Mol. Phylogenet. Evol., v reviziji. Lefébure T., Douady C.J., Gouy M., Trontelj P., Briolay J. in Gibert J., 2006. Molecular phylogeography of Niphargus virei. Mol. Ecol. 15, 1797-1806. Lefébure T., Douady C.J., Malard F. in Gibert J. (b). Testing dispersal and cryptic diversity in a widely distributed groundwater amphipod (Niphargus rhenorhodanesis). Molecular Phylogenetics and Evolution, v reviziji. Mayden, R. L. 1997. A hierarchy of species concepts: the denouement in the saga of the species problem,. V: Claridge, M. F., Dawah, H. A. in Wilson, M. R. (ured). Species: the units of biodiversity. Chapman and Hall, London, 381-424. Menard, S. W. 1995. Applied logistic regression analysis. Quantitative applications in the social sciences No. 106. Sage Publications, Thousand Oaks, 98 str. McKnight M. L. in Shaffer H. B. 1997. Large, rapidly evolving intergenic spacers in the mitochondrial DNA of the salamander family Ambystomatidae (Amphibia: Caudata). Mol. Biol. Evol. 14, 1167-l 176. Moore, W. S. 1995. Inferring phylogenies from mtDNA variation: mitochondrial gene trees versus nuclear gene trees. Evolution 49, 718-726. Moore, W. S. 1997. Mitochondrial gene trees versus nuclear-gene trees: a reply to Hoelzer. Evolution 49, 627-629. Mueller, R. L., Macey, J. R., Jaekel, M., Wake, D. B. in Boore, J. L. 2004. Morphological homoplasy, life history evolution, and historical biogeography of plethodontid salamanders


inferred from complete mitochondrial genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 13820–13825. Palumbi, S. R. 1996. Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. V: Hillis, D. M., Moritz, C. in Mable, B. K. (ured.). Molecular Systematics. Sinauer Associates, Sunderland, 205-247. Pavelić, D. 2002. The south-western boundary of Central Paratethys. Geologia Croatica 55, 83-92. Posada, D. in Crandall, K. A. 1998. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14, 817-818. Prelogović, E., Arsovski, M., Kranjec, V, Radulović, V, Sikošek, B. in Soklić, S. 1975. Paleogeografska evolucija teritorije Jugoslavije od terciera do danas. Acta seismologica iugoslavica 2-3, 7-11. Radinja, D. 1972. Zakrasevanje v Sloveniji v luči celotnega morfogenetskega razvoja. Geogr. zbornik 13, 199-242. Reilly, S. M. 1995. The ontogeny of aquatic feeding behavior in Salamandra salamandra: stereotypy and isometry in feeding kinematics. J. Exp. Biol. 198, 701-708. Reilly, S. M. in Lauder, G. V. 1990. Metamorphosis of cranial design in tiger salamanders (Ambystoma tigrinum): a morphometric analysis of ontogenetic change. J. Morphol. 204, 121-137. Reilly, S. M., Wiley, E. O. in Meinhardt, D. J. 1997. An integrative approach to heterochrony: the distinction between interspecific and intraspecific phenomena. Biol. J. Linn. Soc. 60, 119-143. Riberon, A., Miaud, C., Grossenbacher, K. in Taberlet, P. 2001. Phylogeography of the Alpine salamander, Salamandra atra (Salamandridae) and the influence of the Pleistocene climatic oscillations on population divergence. Mol. Ecol. 10, 2555-2560. Ronquist, F. in Huelsenbeck, J. P. 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 19, 1572–1574. Rögl, F., 1998. Palaegeographic Considerations for Mediterranean and Paratethys Seaways (Oligocene to Miocene). Ann. Naturhist. Mus. Wien 99A, 279-310. Samuels, A. K., Weisrock, D. W., Smith, J. J., France, K. J., Walker, J. A., Putta, S. in Voss, S. R., 2005. Transcriptional and phylogenetic analysis of five complete ambystomatid salamander mitochondrial genomes. Gene 349, 43–53. Schreiber, E. 1912. Herpetologia europaea: Eine systematische Bearbeitung der Amphibien und Reptilien welche bisher in Europa aufgefunden sind. 2. izd. Verlag von Gustav Fischer, Jena, 960 str.


Simon, C., Franke, A. in Martin, A., 1991. The polymerase chain reaction: DNA extraction and amplification. V: Hewitt, G. M., Johnson A. W. B. in Young, J. P. W. (ured.). Molecular techniques in taxonomy. Springer-Verlag, Berlin, 329-355. Simpson, G. G. 1961. Principles of Animal Taxonomy. Columbia Univ. Press, New York, 247 str. Sket, B. 1997. Distribution of Proteus (Amphibia: Urodela: Proteidae) and its possible explanation. J. Biogeogr. 24, 263-280. Sket, B. 2002. The evolution of the karst versus the distribution and diversity of the hypogean fauna. V: Gabrovšek, F. (ured.). Evolution of karst: from prekarst to cessation. ZRC SAZU, Ljubljana – Postojna, 225-232. Sket, B. in Arntzen, J. W. 1994. A black, non-troglomorphic amphibian from the karst of Slovenia: Proteus anguinus parkelj n. ssp. (Urodela: Proteidae). Contrib. Zool. 64, 33-53. Steele C. A., Carstens, B. C., Storfer, A. in Sullivan, J. 2005. Testing hypotheses of speciation timing in Dicamptodon copei and Dicamptodon aterrimus (Caudata: Dicamptodontidae). Mol. Phylogenet. Evol. 36, 90–100. Steinfartz, S., Veith, M. in Tautz D. 2000. Mitochondrial sequence analysis of Salamandra taxa suggests old splits of major lineages and postglacial recolonizations of central Europe from distinct source populations of Salamandra salamandra. Mol. Ecol. 9, 397-410. Storfer A., Mech, S. G., Reudink, M. W., Ziemba, R. E., Warren, J. in Collins, J. P. 2004. Evidence for introgression in the endangered sonora tiger salamander, Ambystoma tigrinum stebbinsi (Lowe). Copeia 2004, 783–796. Swofford, D. L. 2002. PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods). Version 4.0b10. Sinauer Associates, Sunderland. Titus, T. A: in Larson, A. 1995. A molecular phylogenetic perspective on the evolutionary radiation of the salamander family Salamandridae. Syst. Biol. 44, 125-151. Trontelj, P. in Gorički, Š. 2003. Monophyly of the family Proteidae (Amphibia: Caudata) tested by phylogenetic analysis of mitochondial 12S rDNA sequences. Nat. Croat. 12, 113-120. Vandel, A. in Bouillon, M. 1959a. Le Protée et son intêrêt biologique. Ann. Spéléol. 14, 111-127. Vandel, A. in Bouillon, M. 1959b. La reproduction du Protée (Proteus anguinus Laurenti). C. r. Acad. Sc. Paris 248, 1267-1272.


Vandel, A. in Durand, J. P. 1970. Le cycle vital du Protée, Proteus anguinus Laurenti (Batraciens, Urodèles). C. r. Acad. Sc. Paris 270, 2699-2701. Vandel, A., Durand, J. in Bouillon, M. 1964. Observations sur le développment du Protée, Proteus anguinus Laurenti (Batraciens, Urodèles). C. r. Acad. Sc. Paris 259, 4801-4804. Vandel, A., Durand, J. in Bouillon, M. 1966. Contribution à l'étude du développement de Proteus anguinus Laurenti, (Batraciens, Urodèles). Ann. Spéléol. 21, 609-619. Veith, M., Mayer, C., Samraoui, B., Barroso, D. D. in Bogaerts, S. 2004. From Europe to Africa and vice versa: evidence for multiple intercontinental dispersal in ribbed salamanders (Genus Pleurodeles). J. Biogeogr. 31, 159-171. Vences, M., Vieites, D. R., Glaw, F., Brinkmann, H., Kosuch, J., Veith, M. in Meyer, A. 2003. Multiple overseas dispersal in amphibians. Proc. R. Soc. Lond. B 270, 1471-2954. Verovnik, R., Sket, B. in Trontelj, P. 2004. Phylogeography of subterranean and surface populations of water lice Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda). Mol. Ecol. 13, 1519-1532. Verovnik, R., Sket, B. in Trontelj, P. 2005. The colonization of Europe by the freshwater crustacean Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) proceeded from ancient refugia and was directed by habitat connectivity. Mol. Ecol. 14, 4355-4369. Weisrock, D.W., Harmon, L.J., Larson, A., 2005. Resolving deep phylogenetic relationships in salamanders: analyses of mitochondrial and nuclear genomic data. Syst. Biol. 54, 758-77. Weisrock D. W., Shaffer, H. B., Storz B. L., Storz S. R. in Voss, S. R. 2006. Multiple nuclear gene sequences identify phylogenetic species boundaries in the rapidly radiating clade of Mexican ambystomatid salamanders. Mol. Ecol., v tisku. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. in Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. V: Innis, M. A., Gelfand, G. H., Sninsky, J. J. in White, T. J. (ured.). PCR Protocols. Academic Press, San Diego, 315-332. Wiens, J. J. 2004. What is speciation and how should we study it? Am. Nat. 163, 914-923. Wiens, J. J. in Penkrot T. A. 2002. Delimiting species using DNA and morphological variation and discordant species limits in spiny lizards (Sceloporus). Syst. Biol. 51, 69-91. Wiens, J. J., Bonett, R., Chippindale, P., 2005. Ontogeny discombobulates phylogeny: paedomorphosis and higher-level salamander relationships. Syst. Biol. 54, 91-110. Wiens, J. J., Chippindale, P. T. in Hillis, D. M. 2003. When are phylogenetic analyses misled by convergence? A case study in Texas cave salamanders. Syst. Biol. 52, 501-514.


Wilcox, T. P., García de Leon, F. J., Hendrickson, D. A. in D. M. Hillis. 2004. Convergence among cave catfishes: Long-branch attraction and a Bayesian relative rates test. Mol. Phylogenet. Evol. 31, 1101-1113. Wiley, E. O. 1978. The evolutionary species concept reconsidered. Syst. Zool. 27, 17-26. Witzmann, F. in Pfretzschner, H.-U. 2003. Larval ontogeny of Micromelerpeton credneri (Temnospondyli, Dissorophoidea). J. Vert. Paleont. 23, 750-768. Yang, Z. 1996. Among-site ratevariation and its impact on phylogenetic analyses. Trends. Ecol. Evol. 11, 367-372. Zakšek, V., Sket, B. in Trontelj, P. Phylogeny of the cave shrimp Troglocaris: evidence of a young connection between Balkans and Caucasus. Mol. Phylogenet. Evol., v reviziji. Zardoya, R. in Meyer, A. 2001. Vertebrate phylogeny: limits of inference of mitochondrial genome and nuclear rDNA sequence data due to an adverse phylogenetic signal/noise ratio. V: Ahlberg, P. E. (ured.). Major Events in Early Vertebrate Evolution. Taylor and Francis, London, 135-155.

ZAHVALA Iskrena hvala mentorju prof. dr. Petru Trontlju za vodenje skozi ves projekt, vse kritike in pohvale ter predvsem za potrpežljivost do mojega nekonvencionalnega upravljanja s časom in energijo. Hvala članoma komisije prof. dr. Borisu Sketu in doc. dr. Francu Janžekoviču za pripombe in predloge ter razumevanje za mojo časovno stisko. Številne primerke za morfometrično analizo je posodil Tonči Rađa iz svoje zbirke, za kar se mu najlepše zahvaljujem. Za pomoč pri izpeljavi naloge se najlepše zahvaljujem sodelavcem in prijateljem Cenetu Fišerju, Frenku Kljunu, Valeriji Zakšek, Simoni Prevorčnik, Damjanu Vinku, Maji Zagmajster, Gregorju Bračku, Borutu Toškanu, Barbari Vilhar, Andreju Bavdku in Lukášu Kratochvílu. Hvala vam tudi za sodelovanje v naših obšolskih dejavnostih. Hvala referentkama za študijske zadeve Zdenki Repanšek in Vesni Ješe Janežič, mentorju Petru ter kolegoma raziskovalcu Cenetu in študentu Damjanu, ker so poskrbeli, da roki niso šli mimo mene. Tatjani Ambruž se zahvaljujem za jezikovni pregled rokopisa. Seveda iz vsega tega ne bi bilo nič brez paketov iz Murske Sobote. Ista, ki jih je pošiljala, sedaj organizira zelo pomemben del zaključnega dejanja te naloge. Mama, hvala!

PRILOGA A Opravljene analize jedrne DNA Tabela A1. Seznam uporabljenih oligonukleotidov za pomnoževanje medgenskih regij ITS1 in ITS2.

Orientacija Mesto vezave Naziv Zaporedje v smeri 5'-3' Vir

+ 18S rDNA ITS its1-p GTTTCCGTAGGTGAACCTGC White in sod., 1990 (modificiran) 1400F TGYACACACCGCCCGTC Elwood in sod., 1985 itsIII CACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTG Palumbi, 1996 5,8S rDNA its3 GCATCGATGAAGAACGCAGC White in sod., 1990 itsVIIIrev TTGATCATCGACACTTCGAACGCAC Trontelj, osebni vir

– 5,8S rDNA its2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White in sod., 1990 itsVIII GTGCGTTCGAAGTGTCGATGATCAA Palumbi, 1996 28S rDNA its4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White in sod., 1990 cilITS CCTAGTTAGTTTCTTTTCCTC Steinbrück, osebni vir itsIX AGACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGAC Palumbi, 1996

Preizkusili smo vse kombinacije nasprotno orientiranih oligonukleotidov v reakcijah PCR z različnimi encimi in različnimi temperaturnimi profili. Pomnožili smo le fragmenta med oligonukleotidi itsIII + its2 (pribl. 550 bp) in itsVIIIrev + its4 (500-550 bp), ki smo ju sekvencirali z obeh smeri. Zaradi nečitljivosti zaporedij smo domnevali, da je v genomu več različnih kopij regije. Produkt druge PCR smo zato pri treh osebkih iz različnih skupin haplotipov CR (VJ39, PL99 in OT153 – gl. Tabelo 2) klonirali v vektor pGEM-T Easy (Promega). Od 9, 6 in 14 pozitivnih kolonij E. coli DH5α smo z oligonukleotidom M13R (5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'; www.biocompare.com/matrix/836/M13-Primers.html) sekvencirali insert pri dveh (VJ39), štirih (PL99) in treh (OT153) klonih. V posameznem genomu smo tako potrdili različnost kopij regije ITS, ki so se razlikovale tudi v dolžini. Na drevesu K80 genetskih razdalj med kopijami po metodi neighbor-joining se kopije iz istega genoma niso združile v skupino, zato te regije nismo mogli uporabiti za preverjanje sorodstvenih odnosov med populacijami močerila. Tabela A2. Seznam uporabljenih oligonukleotidov za pomnoževanje gena za 28S rRNA. Začetnika 28S-256f in 18S-1742r smo izdelali s primerjavo poravnanih zaporedij iz različnih skupin vretenčarjev (http://www.psb.ugent.be/rRNA/lsu/list/Eucaryota.html). Orientacija Naziv Zaporedje v smeri 5'-3' Vir

+ 28Slev1 CTACCCCCTGAATTTAAGCAT Trontelj, osebni vir 28Slev2 CAAGTACCGTGAGGGAAAGTT Verovnik in sod., 2005 28S-256f AGTGAAGAGGGAAGAGCCCAG

– 28Sdes2 GTTCACCATCTTTCGGGTC Zakšek in sod., v reviziji 28Srtest1 TAGATAGTTCGATTGGTCTTTCGCC Trontelj, osebni vir 28Srtest2 AGGGAAACTTCGGAGGGAACC Verovnik in sod., 2005 28S-1742r TCTGGGGTCTGATGAGCGTCG

Tudi tu smo preizkusili vse kombinacije nasprotno orientiranih oligonukleotidov v reakcijah PCR z različnimi encimi in različnimi temperaturnimi profili. Sekvencirali smo produkta pomnoževanja s kombinacijama 28Slev1 + 28Sdes2 (pribl. 1100 bp) in 28Slev2 + 28S-1742 (pribl. 800 bp) pri osebkih iz vseh skupin haplotipov CR, vendar uspešno le z oligonukleotidom 28Slev2. Vsi osebki so imeli enako zaporedje tega odseka genoma. Tabela A3. Seznam uporabljenih oligonukleotidov za pomnoževanje nekaterih proteinskih genov. Začetnike brez navedbe vira smo izdelali sami, s primerjavo genomske DNA in mRNA predstavnikov različnih skupin vretenčarjev, med njimi tudi nektura.

Gen Orientacija Mesto vezave Naziv Zaporedje v smeri 5'-3' Vir

rhoa + 1. ekson Rhod1-a ACCATGAACGGAACAGAAGGYCC Bossuyt in Milinkovitch, 2000 Rhod1-nov GCACAAGAARCTCMGAACACC – 4. ekson Rhod4-d AGCATAATGTAGATGACRGGGTT Bossuyt in Milinkovitch, 2000 Rhod4-nov AGCCYTGRTGGGTGAAGATG thrab + 5. ekson thra-lev5 GACAAGATCACCCGCAACCA – 7. ekson thra-des7 GTGATGGCCGGGGTGATGAT 8. ekson thra-des8 GACATGATCTCCATGCAGCA pkm2c + 3. ekson pkm2-lev3 TCTGGRATGAATGTKGCTCG 5. ekson pkm2-lev5 GGCAGCAAGATCTACGTGGA – 4. ekson pkm2-des4 AGGCCGGTAGAGAATGGGAT 6. ekson pkm2-des6 AGGTTCACTCCCTTCTTGCT col3d + 3. ekson col3-lev3 GGCACTGCTGACATCATGAT 4. ekson col3-lev4 TTCTACCCATTTGATGGCCC – 5. ekson col3-des5 CCAAAYTCATGRGCAGCAAC

arodopsin btiroksinski receptor α

cpiruvat kinaza M2 dkolagenaza 3 Preizkusili smo vse smiselne kombinacije nasprotno orientiranih oligonukleotidov v reakcijah PCR z različnimi encimi in različnimi temperaturnimi profili. Pomnožili in sekvencirali smo fragmente med pari oligonukleotidov: Rhod1-a + Rhod4-d (pribl. 1100 bp), Rhod1-nov + Rhod4-nov (dva produkta približne dolžine 1600 in 2400 bp), pkm2-lev3 + pkm2-des6 (pribl. 800 bp) in col3-lev3 + col3-des5 (pribl. 1200 bp). Čitljive sekvence smo dobili le z oligonukleotidoma pkm2-lev3 + pkm2-des6, ki pa se med osebki VJ39, PL99 in OT153 niso razlikovale. Po rezultatih iskanja med zaporedji v GenBank tudi domnevamo, da zaporedje ni del gena za pkm2. Produkt PCR med oligonukleotidoma col3-lev3 + col3-des5, ki verjetno je del gena za col3, smo pri osebkih VJ39, PL99 in OT153 klonirali v vektor pGEM-T Easy (Promega). Od dveh, petih in 14 pozitivnih smo sekvencirali insert pri dveh (VJ39), treh (PL99) in štirih (OT153) klonih, z oligonukleotidom M13-20 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'). Tudi ta regija je v genomu močerila prisotna v več kopijah, ki se razlikujejo v dolžini in zaporedju. Ker je bilo med nekaterimi kopijami več intragenomskih kot intergenomskih razlik, zaporedja nismo mogli uporabiti za preverjanje filogenije močerila.

PRILOGA B Velikosti vzorcev in seznam analiziranih primerkov Tabela B1. Seznam vseh primerkov močerila, analiziranih morfometrično in/ali genetsko.

Skupina Oznaka Zbirka Lokaliteta Morfo- metrija

CRa rDNAb

Bosanska Krajina 26.7.2004 (SP205) OB UL Suvaja pećina + + + SP168 - Suvaja pećina + SP169 - Suvaja pećina + krat.ng3* OB UL Lušci + 2 OB UL Lušci + 3 OB UL Lušci + 4 OB UL Lušci + 5 OB UL Lušci + 6 OB UL Lušci + 7 OB UL Lušci + [?] OB UL Lušci + DP206 - Dabarska pećina + + Lika 41 OB UL Markarova pećina + MP160 - Markarova pećina + + RP156 - Rupečica + + Dalmacija- Trilj1 T. Rađa Trilj, Vedrine + Hercegovina Trilj2 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj3 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj4 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj5 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj6 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj7 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj8 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj9 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj10 (VR39) T. Rađa Trilj, Vedrine + + Trilj11 (VR40) T. Rađa Trilj, Vedrine + + Trilj12 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj13 (VR48) T. Rađa Trilj, Vedrine + + + Trilj14 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj15 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj16 T. Rađa Trilj, Vedrine + Trilj17 (VR36) T. Rađa Trilj, Vedrine + + Trilj18 (VR38) T. Rađa Trilj, Vedrine + + Trilj19 (VR33) T. Rađa Trilj, Vedrine + + 978:1 NMW Dalmacija + 978:2 NMW Dalmacija + 26 NMW Ljubuški + 973:2 NMW Ljubuški, Studenci + 973:3 NMW Ljubuški, Studenci + 976:1 NMW Neretva + 976:2 NMW Neretva + 1716 Sinj +

(Se nadaljuje.)

Tabela B1. Nadaljevanje.


CRa rDNAb

Dalmacija- 979:0 NMW Sinj + Hercegovina 980:0 NMW Sinj + 973:1 NMW Trebinje, Rasovac + 40 OB UL Vjetrenica + 29.8.2003 (VJ162) OB UL Vjetrenica + + VJ154 - Vjetrenica + + VJ155 - Vjetrenica + [večji] OB UL Vrgorac + [manjši] OB UL Vrgorac + MI157 - Miljacka pećina + MI158 - Miljacka pećina + + MI159 - Miljacka pećina + TO161 - Torak + Istra 70 OB UL Pincinova jama + 71 OB UL Pincinova jama + 2767 HPMZ Pincinova jama + PI112 - Pincinova jama + + PI113 - Pincinova jama + PI114 - Pincinova jama + PI115 - Pincinova jama + PI116 - Pincinova jama + PI117 - Pincinova jama + PI118 - Pincinova jama + PI119 - Pincinova jama + PI120 - Pincinova jama + + PI121 - Pincinova jama + + 90 MCSNT Vodnjan + 105 MCSNT Krapan + 106 MCSNT Krapan + 107 MCSNT Krapan + 108 MCSNT Krapan + 109 MCSNT Krapan + 975:1 NMW Krapan + 975:2 NMW Krapan + JZ Slovenija 5 OB UL Planinska jama + 6 OB UL Planinska jama + 7 OB UL Planinska jama + 8 OB UL Planinska jama + 9 OB UL Planinska jama + 10 OB UL Planinska jama + 12 OB UL Planinska jama + 13 OB UL Planinska jama + 14 OB UL Planinska jama + 20 OB UL Planinska jama + 21 OB UL Planinska jama + 36 OB UL Planinska jama + 39 OB UL Planinska jama + 47 OB UL Planinska jama + 55 OB UL Planinska jama +

(Se nadaljuje.)



CRa rDNAb

JZ Slovenija 56 OB UL Planinska jama + 60 OB UL Planinska jama + 116 OB UL Planinska jama + 119 OB UL Planinska jama + 124 OB UL Planinska jama + 127 OB UL Planinska jama + 23.2.1993 OB UL Planinska jama + 129 (PL15) Planinska jama + PL3 - Planinska jama + PL20 - Planinaska jama + PL23 - Planinska jama + PL98 - Planinska jama + + PL99 - Planinska jama + PL150 - Planinska jama + P146 (PL149) - Planinska jama + 115 (PL1) OBUL Planinska jama + 66 OB UL Planina + 68 OB UL Planina + 130 (PL14) OB UL Planina + + 131 OB UL Planina + 132 OB UL Planina + #5 OB UL Planina + #6 OB UL Planina + 134 (ME55) OB UL Mejame + + + 135 OB UL Mejame + K223 (PD53) OB UL Podlazi, Štanjel + + maj97 (NJ52) OB UL Najdena jama + + 12.12.1983 OB UL Rak ob postojnski točki + 42 OB UL Fužine + 43 OB UL Logarček + 64 OB UL Veliko okence + VE163 - Veliko okence + VE164 - Veliko okence + VE165 - Veliko okence + MA109 - Malo okence + MA110 - Malo okence + + MO102 - Močilnik + GA167 - Gašpinova jama + + 27.12.1999 (AM135) OB UL Ambroževe mlake + 27.12.1999 (AM144) OB UL Ambroževe mlake + Stična 49 OB UL Rupa + #1 (RU70) OB UL Rupa + + #2=2a OB UL Rupa + (22/11-91) OB UL Rupa + 959:2=2 NMW Rupa + 959:3 NMW Rupa + 959:4 NMW Rupnica + 959:5 NMW Rupnica + 22 OB UL Vir + 72 OB UL Vir +

(Se nadaljuje.)



CRa rDNAb

Stična 73 OB UL Vir + #7=7a OB UL Vir + 10.12.91 OB UL Vir + 962:0 NMW Vir + 966:1 NMW Vir + 966:2=2 NMW Vir + 966:3 NMW Vir + 966:4 NMW Vir + 966:5 NMW Vir + 966:6 NMW Vir + 966:7 NMW Vir + 966:8 NMW Vir + 966:9 NMW Vir + 967:1=1a NMW Vir + 967:2 NMW Vir + VI216 - Vir + + parkelj 1 OB UL Jelševnik + 2 OB UL Jelševnik + 3 OB UL Jelševnik + 5 OB UL Jelševnik + 6 OB UL Jelševnik + 7 OB UL Jelševnik + 8 OB UL Jelševnik + 15 OB UL Jelševnik + 16 OB UL Jelševnik + 17 OB UL Jelševnik + JE8 - Jelševnik + JE9 - Jelševnik + JE7 - Jelševnik + JE143 - Jelševnik + + JE152 - Jelševnik + + Dobličica1 OB UL Dobličica + Dolenjska- 57 OB UL Kompoljska jama + Bela krajina 58 OB UL Kompoljska jama + 59 OB UL Kompoljska jama + +6.4.77 OB UL Kompoljska jama + 25.2.2002 OB UL Kompoljska jama + 15.8.1999 [večji] OB UL Kompoljska jama + 15.8.1999 [manjši] OB UL Kompoljska jama + 10.197[?] OB UL Kompoljska jama + D265 OB UL Kompoljska jama + D266 OB UL Kompoljska jama + D267 OB UL Kompoljska jama + D268 OB UL Kompoljska jama + D269 OB UL Kompoljska jama + D270 OB UL Kompoljska jama + D271 OB UL Kompoljska jama + KO11 - Kompoljska jama + KO12 - Kompoljska jama + +

(Se nadaljuje.)



CRa rDNAb

Dolenjska- P152 (KO139) - Kompoljska jama + Bela krajina KO136 - Kompoljska jama + 133 OB UL Potiskavc + E230 OB UL Slovenska vas, Kočevje + 23.5.2001 OB UL Otovški breg + 10.8.1998 (OT4) OB UL Otovški breg + + P143 OB UL Otovški breg + OT13 - Otovški breg + OT6 - Otovški breg + OT132 - Otovški breg + OT133 - Otovški breg + P140 (OT137) - Otovški breg + OT140 - Otovški breg + P141 (OT141) - Otovški breg + P150 (OT142) - Otovški breg + P139 (OT151) - Otovški breg + OT153 - Otovški breg + + P182 OB UL Grčarske Ravne + P180 OB UL Grčarske Ravne + P181 OB UL Grčarske Ravne + GR122 - Grčarske Ravne + GR123 - Grčarske Ravne + GR124 - Grčarske Ravne + GR125 - Grčarske Ravne + GR126 - Grčarske Ravne + GR127 - Grčarske Ravne + GR128 - Grčarske Ravne + GR129 - Grčarske Ravne + GR130 - Grčarske Ravne + GR131 - Grčarske Ravne + 1980-1991 OB UL Prečna + 1 OB UL Prečna + 2 OB UL Prečna + 3 OB UL Prečna + 4 OB UL Prečna + 5 OB UL Prečna + 6 OB UL Prečna + 7 OB UL Prečna + 8 OB UL Prečna + Prečna 9 OB UL Luknja, izvir + 11 OB UL Prečna + 20.3.1998 OB UL Prečna + x OB UL Prečna + MB166 - Mobišaht + SU103 - Sušica + ST101 - Stolbe +

aprimerki, vključeni v analizo kontrolne regije (gl. pogl. 2.1.3) bprimerki, vključeni v analizo genov rRNA (gl. pogl. 2.1.1)

Tabela B2. Velikost vzorca v drugi meritvi (avtorica disertacije) pri posameznem znaku.

Znak N

Bosanska Krajina Lika Dalmacija-

Hercegovina Istra JZ Slovenija Stična Parkelj Dolenjska-

Bela krajina Skupaj

TOL 9 1 22 3 37 9 11 35 127 HL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 HWmax 9 1 21 3 37 9 11 36 127 ND 9 1 20 2 35 9 10 34 120 SL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 PSW 9 1 22 3 37 9 11 36 128 PHL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 PPL 9 1 22 3 37 9 11 35 127 UALL 8 1 22 3 37 9 11 36 127 LALL 8 1 22 3 37 9 11 36 127 TRL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 UPLL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 LPLL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 TL 9 1 22 3 37 9 11 36 128 PLC 9 1 22 3 37 9 11 36 128 ATH 9 1 22 2 37 8 11 35 125 ATH2/10 7 1 22 2 37 8 11 34 122 PTH9/10 9 1 20 3 36 6 10 34 119 MIO 2 0 6 0 14 0 5 26 53 VER 0 0 1 0 4 1 2 6 14 CVR 5 0 19 2 16 2 8 30 82

Tabela B3. Število dodanih primerkov iz prve meritve (N. Kranjec in B. Sket) pri posameznem znaku.

Znak N



Bela krajina Skupaj

TOL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 HL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 HWmax 0 0 12 8 0 16 0 0 36 PPL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 ALL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 TRL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 PLL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 TL 0 0 12 8 0 16 0 0 36 MIO 6 1 28 11 23 25 6 9 109 VER 1 1 25 10 27 23 7 6 100 CVR 3 1 5 5 19 11 1 6 51 D.DNT 4 1 21 8 20 16 6 8 84 D.VOM 4 1 21 8 19 16 6 8 83 D.PMX 4 1 21 8 16 19 6 8 81

Tabela B4. Seznam primerkov vključenih v morfološko analizo. Spol je bil določen s sekcijo živali. Če so bili podatki zbrani v obeh meritvah, smo v glavni analizi uporabili metrične podatke druge meritve. Kjer je prva meritev podana v oklepaju, vrednosti te meritve nismo upoštevali v analizi napake merilca (Priloga C), smo pa uporabili števne znake v analizah združenih meritev. Primerke iz lokalitet, s katerih nismo imeli vzorcev DNA, smo uvrstili po skupinah glede na znane hidrološke povezave.

Skupina Oznaka primerka Zbirka Lokaliteta Spol Meritev Bosanska Krajina 26.7.2004 OB UL Suvaja pećina ? 2 krat.ng3* OB UL Lušci ? (1), 2 2 OB UL Lušci ? 1, 2 3 OB UL Lušci ? 1, 2 4 OB UL Lušci juv 1, 2 5 OB UL Lušci juv 1, 2 6 OB UL Lušci juv 1, 2 7 OB UL Lušci juv 1, 2 [?] OB UL Lušci juv 2 Lika 41 OB UL Markarova pećina ? 1, 2 Dalmacija-Hercegovina Trilj1 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj2 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj3 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj4 T. Rađa Trilj, Vedrine ? (1), 2 Trilj5 T. Rađa Trilj, Vedrine ? (1), 2 Trilj6 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj7 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj8 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj9 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj10 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj11 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj12 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj13 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj14 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj15 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj16 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj17 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj18 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 Trilj19 T. Rađa Trilj, Vedrine ? 1, 2 978:1 NMW Dalmacija f 1 978:2 NMW Dalmacija m 1 26 NMW Ljubuški ? 1 973:2 NMW Ljubuški, Studenci m 1 973:3 NMW Ljubuški, Studenci f 1 976:1 NMW Neretva f 1 976:2 NMW Neretva ? 1 1716 Sinj ? 1 979:0 NMW Sinj f 1 980:0 NMW Sinj f 1 973:1 NMW Trebinje, Rasovac ? 1 40 OB UL Vjetrenica ? 1 29.8.2003 OB UL Vjetrenica ? 2 [večji] OB UL Vrgorac ? 1, 2 [manjši] OB UL Vrgorac ? 2 Istra 70 OB UL Pincinova jama f 1, 2 71 OB UL Pincinova jama f 1, 2 2767 HPMZ Pincinova jama ? 1, 2 90 MCSNT Vodnjan ? 1

(Se nadaljuje.)


Skupina Oznaka primerka Zbirka Lokaliteta Spol Meritev Istra 105 MCSNT Krapan ? 1 106 MCSNT Krapan ? 1 107 MCSNT Krapan ? 1 108 MCSNT Krapan ? 1 109 MCSNT Krapan ? 1 975:1 NMW Krapan f 1 975:2 NMW Krapan f 1 JZ Slovenija 5 OB UL Planinska jama m 1, 2 6 OB UL Planinska jama m 1, 2 7 OB UL Planinska jama f 1, 2 8 OB UL Planinska jama f 1, 2 9 OB UL Planinska jama m 1, 2 10 OB UL Planinska jama ? 1, 2 12 OB UL Planinska jama f 1, 2 13 OB UL Planinska jama ? 1, 2 14 OB UL Planinska jama m 1, 2 20 OB UL Planinska jama ? 1, 2 21 OB UL Planinska jama ? 1, 2 36 OB UL Planinska jama m 1, 2 39 OB UL Planinska jama m 1, 2 47 OB UL Planinska jama ? 1, 2 55 OB UL Planinska jama f 1, 2 56 OB UL Planinska jama m 1, 2 60 OB UL Planinska jama f 1, 2 116 OB UL Planinska jama ? 1, 2 119 OB UL Planinska jama f 1, 2 124 OB UL Planinska jama ? 1, 2 127 OB UL Planinska jama m 1, 2 23.2.1993 OB UL Planinska jama ? 2 66 OB UL Planina ? 1, 2 68 OB UL Planina ? 1, 2 130 OB UL Planina ? 1, 2 131 OB UL Planina ? 1, 2 132 OB UL Planina ? 1, 2 #5 OB UL Planina f 1, 2 #6 OB UL Planina f 1, 2 134 OB UL Mejame ? 1, 2 135 OB UL Mejame ? 1, 2 K223 OB UL Podlazi, Štanjel ? 1, 2 maj97 OB UL Najdena jama ? 2 12.12.1983 OB UL Rak ob postojnski točki juv 2 42 OB UL Fužine juv 2 43 OB UL Logarček juv 2 64 OB UL Veliko okence ? 2 Stična 49 OB UL Rupa f 1, 2 #1 OB UL Rupa f 1, 2 #2=2a OB UL Rupa f 1, 2 (22/11-91) OB UL Rupa ? (1), 2 959:2=2 NMW Rupa m 1 959:3 NMW Rupa m 1 959:4 NMW Rupnica f 1 959:5 NMW Rupnica m 1

(Se nadaljuje.)


Skupina Oznaka primerka Zbirka Lokaliteta Spol Meritev Stična 22 OB UL Vir f 1, 2 72 OB UL Vir ? 1, 2 73 OB UL Vir ? 1, 2 #7=7a OB UL Vir f 1, 2 10.12.91 OB UL Vir ? 1, 2 962:0 NMW Vir ? 1 966:1 NMW Vir m 1 966:2=2 NMW Vir m 1 966:3 NMW Vir m 1 966:4 NMW Vir f 1 966:5 NMW Vir m 1 966:6 NMW Vir m 1 966:7 NMW Vir m 1 966:8 NMW Vir f 1 966:9 NMW Vir m 1 967:1=1a NMW Vir f 1 967:2 NMW Vir f 1 parkelj 1 OB UL Jelševnik ? 1, 2 2 OB UL Jelševnik ? (1), 2 3 OB UL Jelševnik m 1, 2 5 OB UL Jelševnik ? 1, 2 6 OB UL Jelševnik ? 2 7 OB UL Jelševnik ? 1, 2 8 OB UL Jelševnik f 1, 2 15 OB UL Jelševnik ? 1, 2 16 OB UL Jelševnik f 1, 2 17 OB UL Jelševnik ? 1, 2 Dobličica1 OB UL Dobličica ? 2 Dolenjska-Bela krajina 57 OB UL Kompoljska jama ? 1, 2 58 OB UL Kompoljska jama ? 1, 2 59 OB UL Kompoljska jama ? 1, 2 +6.4.77 OB UL Kompoljska jama ? 1, 2 25.2.2002 OB UL Kompoljska jama ? 2 15.8.1999 [večji] OB UL Kompoljska jama ? 2 15.8.1999 [manjši] OB UL Kompoljska jama ? 2 10.197[?] OB UL Kompoljska jama juv 2 D265 OB UL Kompoljska jama juv 2 D266 OB UL Kompoljska jama juv 2 D267 OB UL Kompoljska jama juv 2 D268 OB UL Kompoljska jama juv 2 D269 OB UL Kompoljska jama juv 2 D270 OB UL Kompoljska jama juv 2 D271 OB UL Kompoljska jama juv 2 133 OB UL Potiskavc ? 1, 2 E230 OB UL Slovenska vas, Kočevje ? 1, 2 23.5.2001 OB UL Otovški breg ? 2 10.8.1998 OB UL Otovški breg ? 2 P143 OB UL Otovški breg ? 2 P182 OB UL Grčarske Ravne f 2 P180 OB UL Grčarske Ravne m 2 P181 OB UL Grčarske Ravne ? 2 1980-1991 OB UL Prečna juv 2

(Se nadaljuje.)


Skupina Oznaka primerka Zbirka Lokaliteta Spol Meritev Dolenjska-Bela krajina 1 OB UL Prečna ? (1), 2 2 OB UL Prečna ? 1, 2 3 OB UL Prečna juv (1), 2 4 OB UL Prečna ? 1, 2 5 OB UL Prečna ? 2 6 OB UL Prečna ? 2 7 OB UL Prečna ? 2 8 OB UL Prečna ? 1, 2 Prečna 9 OB UL Luknja, izvir ? 2 11 OB UL Prečna ? 1, 2 20.3.1998 OB UL Prečna ? 2 x OB UL Prečna ? 1, 2

Tabela B5. Znaki, katerih vrednosti pri posameznih primerkih smo ocenili z regresijo znotraj skupine.

Skupina Manjkajoči znak Ocenjen iz znaka Primerek Bosanska Krajina UALL LPLL krat.ng 3* LALL HL krat.ng 3* ATH 2/10 ATH 5

6 Dalmacija-Hercegovina HWmax PSW Trilj 5 ND HL Trilj 5

Trilj 8 PTH 9/10 ATH Trilj 16

29.8.2003 Istra ND PSWa 2767 ATH HWmaxa 2767 ATH 2/10 ATHa 2767 JZ Slovenija ND PSW 131

132 PTH 9/10 PSW 134 Stična ATH ND (22/11-91) ATH 2/10 ATH (22/11-91) PTH 9/10 PPL (22/11-91)

73 10.12.91

parkelj ND PSW 5 PTH 9/10 ATH 5 Dolenjska-Bela krajina TOL TRL P143 ND LALL 3

7 PPL HL P143 ATH HWmax 133 ATH 2/10 ATH 133

25.2.2002 PTH 9/10 ATH 2/10 133

7 apremica samo iz dveh primerkov

PRILOGA C Primerjava vrednosti metričnih znakov med dvema izvajalcema meritev Pri merjenju mehkih tkiv in tkiv, kjer skrajne točke daljice niso nedvoumno izražene, lahko pride do razlik v izmerjenih vrednostih med različnimi izvajalci meritev. Zato naj bi vse meritve izvedla ista oseba, da je napaka merilca, če je že ne ocenimo in upoštevamo, vsaj zmeraj enaka. Kadar je meritve opravljalo več oseb, je pred morebitnim združevanjem vzorcev treba preveriti, ali se meritve na istih osebkih med merilci ne razlikujejo. Če najdemo pomembne razlike, vzorce še vedno lahko združimo, vendar moramo iz analize izločiti znake, ki kažejo na pristranskost merilca (npr. Arntzen in Sket, 1997). Druga težava, ki se pojavlja pri združevanju vzorcev, merjenih v daljšem časovnem intervalu, je dehidracija mehkih tkiv v konzervansu in njihova posledična deformacija. V našem primeru je med meritvama preteklo vsaj sedem let, zato odstopanja v vrednostih znakov pri istih primerkih tudi zaradi teh sprememb niso neverjetna. V primerjavo vrednosti osmih metričnih znakov (gl. pogl. 2.2), ki sta jih zbrala oba izvajalca meritev na istih primerkih močerila, smo vključili 86 primerkov brez manjkajočih vrednosti (Bosanska Krajina 6, Lika 1, južna obalna regija 18, Istra 3, JZ Slovenija 31, Stična 8, parkelj 8 in Dolenjska-Bela krajina 11). Kot mero ALL in PLL v drugi meritvi smo vzeli seštevek znakov UALL in LALL za znak ALL ter UPLL in LPLL za znak PLL. Primerjavo smo izvedli tako na celotnem vzorcu kot po posameznih skupinah, z izjemo primerka iz Like. Ugotavljali smo tudi, ali obstajajo med meritvama razlike v splošni morfološki variabilnosti vzorcev. Analizo glavnih komponent (PCA) smo najprej opravili s pravokotno (varimax) rotacijo. Najprej smo obdržali prve štiri glavne komponente. S četrto komponento smo razložili le 2,3% variance pri prvi meritvi (N. Kranjec in B. Sket) in 3,9% pri drugi meritvi (avtorica disertacije), zato smo analizo ponovili tako, da smo obdržali le prve tri komponente. Analizo smo ponovili še z nepravokotno (oblimin) rotacijo, ki dovoljuje korelacijo med glavnimi komponentami. Visoke obtežitve prvih treh glavnih komponent nepravokotne rotacije so se pojavljale pri istih znakih kot v pravokotni rotaciji. Ker pa sta prva in druga komponenta visoko korelirali (Pearsonov korelacijski koeficient 0,814 pri prvi in 0,827 pri drugi meritvi) smo preverjali ujemanje vrednosti nepravokotnih komponent med meritvama. V manjši meri sta korelirali tudi drugi dve komponenti (kor. koef. 0,336 in 0,367) korelacija med prvo in tretjo komponento (0,170 in 0,245) pa je bila statistično pomembna v drugi meritvi. Razlike med meritvama v vrednostih osnovnih spremenljivk in prvih treh glavnih komponent smo testirali z neparametričnim Wilcoxonovim testom za odvisna vzorca. Analize smo opravili v programu SPSS za Windows, verzija 12.0.1. V nerazdeljenem vzorcu so z izjemo dolžin okončin prevladovale nižje vrednosti druge meritve od vrednosti prve meritve. Čeprav so razlike v porazdelitvi vrednosti majhne (Slika C1), je primerjava pri vsakem primerku posebej pokazala, da so za vse znake statistično pomembne (Tabela C2, zadnji stolpec). Sistematično nižje vrednosti druge meritve znakih kažejo na to, da bi razlike med meritvama lahko bile posledica dehidracije tkiv. Drugačna slika se pokaže, ko primerjamo meritve po posameznih skupinah. Predznak razlik je od znaka do znaka variiral, statistično pomembne razlike pa so se pojavljale samo pri nekaterih znakih. Najpogostejše so bile razlike v dolžinah obeh okončin (ALL in PLL) in dolžini trupa (TRL),

sledile so jim razlike v telesni dolžini (TOL) in dolžini repa (TL). Razen tega med meritvama istrskih primerkov ni bilo razlik med merilcema, nasprotno pa so bile razlike statistično pomembne pri večini znakov JZ-slovenske skupine. Ti rezultati kažejo na to, da pri večini skupin razlike med merilcema najverjetneje niso posledica deformacije tkiv v konzervansu, ampak drugačnega načina merjenja. Slika C1. Porazdelitev izmerjenih vrednosti osmih metričnih znakov v prvi (m1) in drugi meritvi (m2). Leva in desna stran slike sta v različnem merilu. Tabela C1. Rezultati primerjave izmerjenih vrednosti znakov pri posameznih genetskih linijah in v celotnem vzorcu med različnima izvajalcema meritev. Statistično pomembne (P<0,05) razlike so označene s krepkim tiskom.

Znak P



Bela krajina Skupaj

TOL 0,063 a - 0,089 b 0,180 a 0,001 a 0,046 a 0,079 b 0,034 a 0,005 a HL 0,068 a - 0,570 a 0,102 a 0,000 a 0,150 a 0,141 a 0,593 a 0,000 a HWmax 0,414 a - 0,006 a 0,109 a 0,955 a 0,865 a 0,049 a 0,213 a 0,005 a PPL 0,173 a - 0,325 b 0,593 b 0,006 a 0,553 a 0,400 a 0,878 b 0,042 a ALL 0,027 b - 0,006 b 0,109 b 0,000 b 0,025 b 0,021 b 0,011 b 0,000 b TRL 0,080 a - 0,029 a 0,285 a 0,000 a 0,018 a 0,025 a 0,003 a 0,000 a PLL 0,104 b - 0,004 b 0,285 b 0,000 b 0,017 b 0,018 b 0,018 b 0,000 b TL 0,916 b - 0,587 b 0,285 a 0,000 a 0,021 a 0,482 a 0,005 a 0,000 a

a: v drugi meritvi prevladujejo NIŽJE vrednosti b: v drugi meritvi prevladujejo VIŠJE vrednosti S tremi nepravokotnimi glavnimi komponentami smo v prvem primeru razložili 96,7% variance, v drugi meritvi pa 97,0% celotne variance. Med meritvama ni bilo bistvenih razlik v

m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2 m1 m2

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0mm

HL HWmax PPL ALL PLL

m1 m2 m1 m2 m1 m2

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0mm

TOL TRL TL

obtežitvah komponent s posameznimi znaki. Tako odraža PC1 predvsem dolžino okončin in sprednjega dela telesa, PC2 predvsem dolžino trupa in repa ter celotno dolžino, PC3 pa je predvsem mera relativne širine glave (Tabela C2). Tabela C2. Obtežitve glavnih komponent s posameznimi znaki po nepravokotni rotaciji. Nepravokotne obtežitve znakov z največjim vplivom na posamezno komponento so označene krepko.

1. meritev 2. meritev PC1 PC2 PC3 PC1 PC2 PC3

TOL 0,148 0,869 0,015 0,170 0,853 -0,001 HL 0,915 0,011 0,198 0,901 0,021 0,200 HWmax 0,462 0,363 0,404 0,403 0,394 0,417 PPL 0,871 0,091 0,150 0,916 0,035 0,119 ALL 0,883 0,143 -0,120 0,956 0,052 -0,070 TRL -0,122 1,047 0,083 -0,130 1,067 0,054 PLL 1,037 -0,049 -0,143 1,004 0,012 -0,141 TL 0,190 0,858 -0,164 0,285 0,764 -0,121

Vrednosti posameznih PC osebkov se med meritvama statistično niso razlikovale. Nekoliko drugače se vrednosti glavnih komponent obnašajo, ko jih primerjamo po skupinah. Tako so se med meritvama razlikovale vrednosti vseh treh komponent pri osebkih črne podvrste (PPC1=0,017; PPC2=0,036; PPC3=0,017), prve komponente pri osebkih iz JZ Slovenije (P=0,028) in vrednosti druge komponente pri dolenjskih in belokranjskih primerkih (P=0,041). Pri drugih skupinah pa različni načini merjenja ne vplivajo na razmerja med osnovnimi metričnimi znaki. Na podlagi rezultatov primerjav zaključujemo, da lahko v analizah posameznih znakov podatke iz druge meritve dopolnimo s podatki prve meritve le pri Istrski skupini primerkov. Nasprotno pa lahko v analizah, katerih osnova je kovarianca znakov, primerke iz ene meritve dodamo k primerkom v drugi meritvi pri večini skupin. Tabela C3. Glavne komponente, po katerih se ločijo (P<0,05) skupine (gl. tudi Sliko C2). Primerjave med pari skupin smo izvedli z Games-Howellovim testom. Edini primerek iz Like je iz primerjav izključen. Razlike med meritvama se pojavljajo pri razlikovanju skupin po PC3 (krepki tisk).

Bosanska Krajina

Dalmacija- Hercegovina Istra JZ

Slovenija Stična Parkelj Dolenjska- Bela krajina

Bosanska Krajina – – – PC2 – – Dalmacija-Hercegovina PC3 PC3 PC2, PC3 PC2 PC2 PC3 Istra – PC3 PC3 PC2, PC3 PC2, PC3 – JZ Slovenija – PC2, PC3 – PC2 PC1, PC3 – Stična PC2 PC2 PC2 PC2 PC1 PC2 Parkelj PC3 PC2 PC2, PC3 PC1, PC3 PC1, PC3 PC3 Dolenjska-Bela krajina – PC3 – – PC2 PC3

Slika B2. Prikaz morfometričnih razlik med osebki pri prvi (zgoraj) in drugi meritvi (spodaj).

-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC1 (m1)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m1)

SKUPINABosanska KrajinaLikaDalmacija-HercegovinaIstraJZ SlovenijaStičnaparkeljDolenjska-Bela krajina

-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC1 (m1)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m1)



-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC2 (m1)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m1)

-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC2 (m1)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m1)


-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC1 (m2)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m2)



-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC1 (m2)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

PC3

(m2)

-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC2 (m2)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0PC

3 (m

2)

-3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0PC2 (m2)

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

3,0PC

3 (m

2)

PRILOGA D Korelacije med znaki

Tabela D1. Pearsonov korelacijski koeficient med znaki v celotnem vzorcu (desno zgoraj) in v vzorcu brez črne podvrste (levo spodaj). Osenčeni so korelacijski koeficienti, višji od 0,9 v drugem vzorcu. Podčrtani korelacijski koeficienti so statistično pomembni pri P<0,05. S krepkim tiskom so označeni statistično nepomembni koeficienti. Vsi drugi korelacijski koeficienti so statistično pomembni pri P<0,01.

TOL HL HW max ND SL PSW PHL PPL UALL LALL ALL TRL UPLL LPLL PLL TL PLC ATH

ATH 2/10

PTH 9/10 MIO VER CVR D.DNT D.VOM D.PMX

TOL 0,898 0,925 0,914 0,903 0,943 0,912 0,911 0,841 0,912 0,895 0,978 0,809 0,891 0,867 0,958 0,857 0,865 0,824 0,782 0,144 0,162 -0,054 0,091 0,041 0,138 HL 0,916 0,894 0,923 0,954 0,876 0,991 0,982 0,900 0,945 0,888 0,839 0,890 0,906 0,878 0,823 0,810 0,846 0,806 0,790 -0,155 -0,260 -0,213 0,498 0,489 0,491 HWmax 0,930 0,897 0,915 0,880 0,927 0,900 0,886 0,798 0,873 0,848 0,897 0,757 0,827 0,808 0,890 0,809 0,908 0,874 0,823 -0,001 -0,080 -0,150 0,084 0,066 0,102 ND 0,918 0,932 0,917 0,898 0,915 0,911 0,908 0,828 0,887 0,879 0,884 0,774 0,832 0,832 0,878 0,825 0,849 0,821 0,812 0,064 -0,037 -0,102 0,112 0,146 0,123 SL 0,920 0,955 0,886 0,906 0,865 0,915 0,942 0,856 0,909 0,904 0,853 0,844 0,881 0,891 0,874 0,788 0,811 0,776 0,787 -0,040 -0,107 -0,113 0,338 0,393 0,372 PSW 0,952 0,937 0,962 0,942 0,921 0,851 0,857 0,726 0,813 0,792 0,957 0,689 0,765 0,753 0,874 0,867 0,844 0,808 0,784 0,287 0,297 -0,127 -0,062 0,048 0,036 PHL 0,936 0,992 0,906 0,922 0,917 0,918 0,984 0,898 0,938 0,939 0,855 0,887 0,897 0,920 0,884 0,795 0,826 0,787 0,761 -0,105 -0,215 -0,152 0,437 0,452 0,394 PPL 0,928 0,982 0,888 0,916 0,943 0,917 0,984 0,910 0,948 0,916 0,849 0,907 0,919 0,914 0,838 0,800 0,834 0,791 0,765 -0,129 -0,188 -0,197 0,502 0,460 0,487 UALL 0,903 0,911 0,826 0,856 0,865 0,837 0,908 0,922 0,925 0,973 0,763 0,934 0,893 0,938 0,862 0,718 0,742 0,697 0,688 -0,207 -0,304 -0,106 0,346 0,373 0,318 LALL 0,971 0,955 0,899 0,918 0,920 0,928 0,945 0,957 0,926 0,988 0,838 0,906 0,951 0,958 0,930 0,784 0,828 0,796 0,747 -0,155 -0,284 -0,050 0,365 0,386 0,364 ALL 0,940 0,890 0,865 0,909 0,914 0,907 0,947 0,920 0,973 0,988 0,818 0,934 0,945 0,957 0,884 0,771 0,807 0,770 0,737 -0,149 -0,174 -0,039 0,326 0,291 0,293 TRL 0,988 0,894 0,926 0,911 0,910 0,955 0,922 0,901 0,886 0,958 0,913 0,729 0,813 0,782 0,914 0,861 0,827 0,785 0,757 0,273 0,317 -0,067 -0,038 -0,066 0,033 UPLL 0,877 0,902 0,787 0,806 0,857 0,812 0,896 0,921 0,931 0,902 0,931 0,862 0,880 0,963 0,828 0,688 0,707 0,653 0,637 -0,225 -0,273 -0,086 0,497 0,394 0,460 LPLL 0,962 0,922 0,864 0,875 0,898 0,894 0,910 0,936 0,899 0,955 0,949 0,946 0,882 0,976 0,902 0,739 0,776 0,738 0,675 -0,145 -0,227 -0,006 0,365 0,343 0,374 PLL 0,918 0,883 0,830 0,871 0,906 0,883 0,932 0,922 0,940 0,958 0,957 0,886 0,963 0,976 0,845 0,738 0,768 0,722 0,678 -0,173 -0,149 -0,036 0,421 0,343 0,402 TL 0,968 0,823 0,891 0,883 0,875 0,919 0,886 0,838 0,884 0,950 0,897 0,954 0,850 0,931 0,861 0,798 0,867 0,824 0,761 0,055 0,047 0,080 -0,041 -0,124 -0,024 PLC 0,865 0,855 0,825 0,843 0,829 0,868 0,847 0,845 0,807 0,877 0,864 0,863 0,789 0,845 0,845 0,834 0,744 0,711 0,725 0,253 0,262 -0,089 0,143 0,257 0,180 ATH 0,875 0,853 0,912 0,862 0,819 0,887 0,835 0,841 0,774 0,856 0,838 0,864 0,738 0,812 0,802 0,870 0,770 0,966 0,881 0,020 -0,088 -0,099 0,043 0,054 -0,035 ATH 2/10 0,834 0,814 0,879 0,832 0,782 0,849 0,798 0,798 0,726 0,824 0,799 0,824 0,681 0,775 0,756 0,826 0,734 0,967 0,891 0,014 -0,098 -0,116 -0,018 -0,005 -0,164 PTH 9/10 0,789 0,803 0,828 0,827 0,800 0,819 0,776 0,777 0,724 0,786 0,775 0,783 0,675 0,727 0,725 0,765 0,744 0,884 0,898 0,078 -0,095 -0,185 0,038 0,123 -0,038 MIO 0,104 -0,133 -0,002 0,032 0,011 0,086 -0,069 -0,105 -0,043 0,030 0,025 0,124 -0,030 0,068 0,007 0,155 0,100 -0,004 -0,004 0,043 0,844 0,100 -0,402 -0,391 -0,280 VER 0,129 -0,195 -0,073 -0,123 0,046 0,045 -0,123 -0,111 -0,081 0,002 0,057 0,140 0,058 0,129 0,136 0,178 0,086 -0,069 -0,065 -0,192 0,611 0,271 -0,298 -0,338 -0,177 CVR -0,049 -0,220 -0,149 -0,104 -0,117 -0,114 -0,163 -0,203 -0,122 -0,071 -0,050 -0,056 -0,106 -0,032 -0,052 0,083 -0,066 -0,092 -0,107 -0,171 0,265 0,397 -0,315 -0,325 -0,258 D.DNT 0,147 0,492 0,080 0,176 0,317 0,113 0,432 0,497 0,240 0,257 0,266 0,085 0,409 0,252 0,363 -0,071 0,271 -0,010 -0,121 0,051 -0,206 -0,017 -0,337 0,796 0,819 D.VOM 0,085 0,481 0,066 0,199 0,386 0,197 0,440 0,451 0,307 0,316 0,246 0,028 0,319 0,271 0,299 -0,144 0,370 0,023 -0,063 0,126 -0,308 -0,156 -0,333 0,783 0,779 D.PMX 0,180 0,479 0,102 0,155 0,354 0,165 0,370 0,476 0,239 0,285 0,247 0,124 0,389 0,307 0,363 -0,038 0,278 -0,072 -0,254 -0,045 -0,143 0,070 -0,261 0,819 0,767

PRILOGA E Testiranje odstopanja od izometrične rasti Tabela E1. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine Bosanska Krajina in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 60-215 0,992 0,949 0,172 0,336 14 0,7421 lnHL 60-215 -0,568 0,856 0,156 0,978 14 0,3444 lnHWmax 60-215 -0,532 0,713 0,131 2,092 14 0,0552 lnND 60-215 -1,924 0,824 0,154 1,204 14 0,2485 lnSL 60-215 -1,063 0,658 0,126 2,528 14 0,0241 lnPSW 60-215 -1,266 0,745 0,137 1,832 14 0,0883 lnPHL 60-215 -1,143 0,918 0,167 0,545 14 0,5946 lnPPL 60-215 -0,549 0,925 0,169 0,494 14 0,6287 lnUALL 60-215 -1,142 0,730 0,139 1,738 12 0,1077 lnLALL 60-215 -1,250 0,804 0,153 1,214 12 0,2479 lnALL 60-215 -0,512 0,771 0,146 1,447 12 0,1734 lnUPLL 60-215 -1,971 0,932 0,173 0,440 14 0,6665 lnLPLL 60-215 -1,497 0,824 0,152 1,210 14 0,2464 lnPLL 60-215 -1,033 0,877 0,162 0,826 14 0,4226 lnTL 60-215 -0,018 0,917 0,168 0,546 14 0,5938 lnPLC 60-215 -3,156 1,122 0,207 -0,723 14 0,4814 lnATH 60-215 -1,087 0,756 0,140 1,736 14 0,1046 ln(ATH 2/10) 60-215 -0,880 0,697 0,157 1,710 10 0,1180 ln(PTH 9/10) 60-215 -1,295 0,693 0,143 2,169 14 0,0478

Tabela E2. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine Dalmacija-Hercegovina in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 112-283 0,955 0,946 0,041 1,310 64 0,1949 lnHL 112-283 -1,155 0,978 0,043 0,532 64 0,5968 lnHWmax 112-283 -1,255 0,870 0,042 3,077 62 0,0031 lnND 112-246,5 -3,339 1,133 0,072 -1,635 36 0,1109 lnSL 112-246,5 -2,626 1,019 0,058 -0,286 40 0,7765 lnPSW 112-246,5 -2,868 1,111 0,060 -1,601 40 0,1172 lnPHL 112-246,5 -1,693 1,033 0,057 -0,486 40 0,6299 lnPPL 112-283 -0,630 0,914 0,041 2,107 64 0,0391 lnUALL 112-246,5 -2,624 1,023 0,060 -0,339 40 0,7361 lnLALL 112-246,5 -1,723 0,903 0,051 1,515 40 0,1377 lnALL 112-283 -0,756 0,793 0,040 5,110 64 0,0000 lnUPLL 112-246,5 -2,112 0,909 0,053 1,404 40 0,1680 lnLPLL 112-246,5 -1,760 0,871 0,049 2,072 40 0,0448 lnPLL 112-283 -0,772 0,773 0,041 5,581 64 0,0000 lnTL 112-283 -0,191 0,938 0,042 1,497 64 0,1394 lnPLC 112-246,5 -3,136 1,128 0,068 -1,709 40 0,0952 lnATH 112-246,5 -1,143 0,776 0,050 3,566 40 0,0010 ln(ATH 2/10) 112-246,5 -0,653 0,678 0,050 5,107 40 0,0000 ln(PTH 9/10) 112-246,5 -2,087 0,966 0,066 0,444 36 0,6595

Tabela E3. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine Istra in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 134-295 0,022 1,168 0,068 -1,179 18 0,2537 lnHL 134-295 -2,023 1,214 0,074 -1,423 18 0,1719 lnHWmax 134-295 -3,624 1,382 0,090 -2,222 18 0,0394 lnND 138-198 -1,386 0,632 0,112 – – – lnSL 138-198 -2,953 1,336 0,144 -0,603 2 0,6077 lnPSW 138-198 -1,431 0,742 0,081 0,620 2 0,5986 lnPHL 138-198 -3,039 1,072 0,116 -0,148 2 0,8960 lnPPL 134-295 -1,732 1,203 0,070 -1,389 18 0,1817 lnUALL 138-198 -3,093 1,171 0,133 -0,324 2 0,7766 lnLALL 138-198 -2,050 0,997 0,108 0,006 2 0,9954 lnALL 134-295 -1,004 0,872 0,053 1,017 18 0,3226 lnUPLL 138-198 -3,279 1,231 0,134 -0,435 2 0,7063 lnLPLL 138-198 -1,914 0,940 0,102 0,132 2 0,9071 lnPLL 134-295 -0,934 0,849 0,054 1,196 18 0,2472 lnTL 134-295 -1,120 1,128 0,067 -0,904 18 0,3777 lnPLC 138-198 -2,944 1,045 0,113 -0,093 2 0,9345 lnATH 138-198 2,622 -0,189 0,033 – – – ln(ATH 2/10) 138-198 1,209 0,138 0,024 – – – ln(PTH 9/10) 138-198 -1,338 0,682 0,131 0,607 2 0,6057

Tabela E4. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine JZ- Slovenija in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 103-275 0,802 0,982 0,038 0,482 70 0,6312 lnHL 103-275 -0,955 0,906 0,036 2,524 70 0,0139 lnHWmax 103-275 -1,657 0,931 0,038 1,796 70 0,0769 lnND 103-275 -3,134 1,059 0,045 -1,346 66 0,1829 lnSL 103-275 -2,421 0,954 0,038 1,189 70 0,2386 lnPSW 103-275 -2,445 1,001 0,039 -0,023 70 0,9817 lnPHL 103-275 -1,106 0,868 0,035 3,583 70 0,0006 lnPPL 103-275 -0,618 0,893 0,036 2,899 70 0,0050 lnUALL 103-275 -1,196 0,698 0,030 8,806 70 0,0000 lnLALL 103-275 -1,582 0,863 0,034 3,750 70 0,0004 lnALL 103-275 -0,735 0,793 0,032 5,874 70 0,0000 lnUPLL 103-275 -1,217 0,705 0,031 8,405 70 0,0000 lnLPLL 103-275 -1,706 0,861 0,035 3,793 70 0,0003 lnPLL 103-275 -0,795 0,791 0,032 5,953 70 0,0000 lnTL 103-275 -0,393 0,991 0,039 0,225 70 0,8223 lnPLC 103-275 -2,410 0,950 0,045 1,181 70 0,2416 lnATH 103-275 -1,797 0,883 0,040 2,973 70 0,0040 ln(ATH 2/10) 103-275 -1,872 0,899 0,044 2,442 70 0,0172 ln(PTH 9/10) 103-269 -3,129 1,104 0,047 -2,353 68 0,0215

Tabela E5. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine Stična in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 153,5-307 0,840 0,974 0,034 0,463 46 0,6459 lnHL 220-307 -0,237 0,751 0,029 4,763 46 0,0000 lnHWmax 220-307 -2,176 1,052 0,037 -0,881 46 0,3829 lnND 220-307 -4,929 1,420 0,058 -2,130 14 0,0514 lnSL 220-307 -0,633 0,562 0,041 2,748 14 0,0157 lnPSW 220-307 -4,695 1,462 0,060 -2,278 14 0,0390 lnPHL 220-307 -2,518 1,151 0,049 -0,853 14 0,4081 lnPPL 153,5-307 -0,335 0,823 0,030 3,292 46 0,0019 lnUALL 220-307 -2,335 0,937 0,047 0,363 14 0,7220 lnLALL 220-307 -2,592 1,071 0,044 -0,423 14 0,6786 lnALL 153,5-307 -1,511 0,948 0,036 0,882 46 0,3826 lnUPLL 220-307 -1,921 0,845 0,050 0,865 14 0,4016 lnLPLL 220-307 -1,801 0,875 0,039 0,798 14 0,4380 lnPLL 153,5-307 -1,255 0,869 0,033 2,332 46 0,0241 lnTL 153,5-307 0,049 0,910 0,033 1,619 46 0,1124 lnPLC 220-307 -3,991 1,262 0,059 -1,301 14 0,2143 lnATH 220-296 -5,860 1,753 0,081 -2,651 12 0,0211 ln(ATH 2/10) 220-296 -1,363 0,833 0,052 0,808 12 0,4347 ln(PTH 9/10) 220-289 -4,111 1,382 0,070 -1,191 8 0,2679

Tabela E6. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine parkelj in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 160-277 0,692 0,977 0,047 0,178 18 0,8609 lnHL 160-277 -1,723 1,008 0,049 -0,064 18 0,9500 lnHWmax 160-277 -2,055 0,976 0,050 0,180 18 0,8594 lnND 160-277 -3,996 1,194 0,072 -1,149 16 0,2676 lnSL 160-277 -2,820 0,972 0,052 0,211 18 0,8356 lnPSW 160-277 -3,428 1,207 0,062 -1,386 18 0,1826 lnPHL 160-277 -2,086 1,014 0,050 -0,105 18 0,9178 lnPPL 160-277 -1,181 0,953 0,047 0,370 18 0,7157 lnUALL 160-277 -3,502 1,101 0,061 -0,679 18 0,5057 lnLALL 160-277 -1,375 0,735 0,040 2,225 18 0,0391 lnALL 160-277 -1,544 0,880 0,046 0,950 18 0,3547 lnUPLL 160-277 -2,649 0,916 0,048 0,642 18 0,5288 lnLPLL 160-277 -0,027 0,418 0,042 4,778 18 0,0002 lnPLL 160-277 -0,547 0,649 0,039 2,976 18 0,0081 lnTL 160-277 -0,140 0,881 0,047 0,924 18 0,3679 lnPLC 160-277 -2,223 0,907 0,062 0,622 18 0,5421 lnATH 160-277 -0,159 0,513 0,037 4,220 18 0,0005 ln(ATH 2/10) 160-277 -0,321 0,547 0,044 3,659 18 0,0018 ln(PTH 9/10) 160-277 -1,079 0,661 0,064 2,151 16 0,0471

Tabela E7. Koeficienti regresijske premice ln[znak]=b*lnTRL+a pri primerkih podanih velikosti iz skupine [Dolenjska-Bela krajina (brez črne podvrste)] in rezultati t-testa primerjave njenega naklona (b) s premico naklona 1 (df= 2*N-4).

Znak TOL (mm) a b SE (b) t df P lnTOL 61,5-258 0,976 0,949 0,064 1,286 66 0,2030 lnHL 61,5-258 -0,639 0,842 0,057 4,320 68 0,0001 lnHWmax 61,5-258 -1,507 0,901 0,064 2,558 68 0,0128 lnND 61,5-258 -2,400 0,896 0,066 2,535 64 0,0137 lnSL 61,5-258 -1,952 0,843 0,059 4,202 68 0,0001 lnPSW 61,5-258 -2,434 0,988 0,068 0,314 68 0,7547 lnPHL 61,5-258 -0,962 0,845 0,057 4,215 68 0,0001 lnPPL 61,5-258 -0,377 0,846 0,058 4,092 66 0,0001 lnUALL 61,5-258 -1,125 0,702 0,050 8,613 68 0,0000 lnLALL 61,5-258 -0,964 0,738 0,050 7,537 68 0,0000 lnALL 61,5-258 -0,350 0,722 0,049 8,029 68 0,0000 lnUPLL 61,5-258 -1,330 0,744 0,053 7,216 68 0,0000 lnLPLL 61,5-258 -1,000 0,706 0,049 8,507 68 0,0000 lnPLL 61,5-258 -0,461 0,723 0,050 7,945 68 0,0000 lnTL 61,5-258 -0,102 0,946 0,064 1,393 68 0,1681 lnPLC 61,5-258 -2,357 0,943 0,069 1,415 68 0,1615 lnATH 61,5-258 -2,219 0,998 0,073 0,046 66 0,9633 ln(ATH 2/10) 61,5-258 -2,338 1,016 0,077 -0,364 64 0,7170 ln(PTH 9/10) 61,5-258 -4,357 1,397 0,113 -7,091 64 0,0000

PRILOGA F Rezultati testiranja spolnega dimorfizma v relativni dolžini okončin Na vzorcih populacij iz JZ Slovenije (n=56), Stične (n=20) in [Dolenjske-Bele krajine] (n=25) smo z multivariatno analizo kovariance preverili, ali spol vpliva na razlike v relativni dolžini okončin med skupinami. Kot soodvisno spremenljivko smo upoštevali tudi telesno dolžino, izraženo z lnTRL. Hipoteze o istem razmerju dolžin sprednje in zadnje okončine med spoloma, kot tudi o enaki dolžini posamezne okončine, nismo mogli zavrniti. Tabela F1. Testiranje dolžine sprednje (lnALL) in zadnje okončine (lnPLL) glede na razlike med spoloma z univariatno analizo kovariance. Znak Učinek F df P lnALL Presečišče z osjo Y 18,384 1 0,000 SPOL 1,820 1 0,180 lnTRL 447,767 1 0,000 SKUPINA 1,437 2 0,243lnPLL Presečišče z osjo Y 46,714 1 0,000 SPOL 2,086 1 0,152 lnTRL 570,093 1 0,000 SKUPINA 7,389 2 0,001

Tabela F2. Rezultati štirih multivariatnih testov razlik med spoloma v razmerju med dolžinama okončin. Učinek Test Vrednost testa F df (hipoteza) df (napaka) P Presečišče z osjo Y Pillai's Trace 0,329 23,238 2,000 95,000 0,000 Wilks' Lambda 0,671 23,238 2,000 95,000 0,000 Hotelling's Trace 0,489 23,238 2,000 95,000 0,000 Roy's Largest Root 0,489 23,238 2,000 95,000 0,000SPOL Pillai's Trace 0,024 1,155 2,000 95,000 0,319 Wilks' Lambda 0,976 1,155 2,000 95,000 0,319 Hotelling's Trace 0,024 1,155 2,000 95,000 0,319 Roy's Largest Root 0,024 1,155 2,000 95,000 0,319lnTRL Pillai's Trace 0,865 304,228 2,000 95,000 0,000 Wilks' Lambda 0,135 304,228 2,000 95,000 0,000 Hotelling's Trace 6,405 304,228 2,000 95,000 0,000 Roy's Largest Root 6,405 304,228 2,000 95,000 0,000SKUPINA Pillai's Trace 0,236 6,429 4,000 192,000 0,000 Wilks' Lambda 0,770 6,638 4,000 190,000 0,000 Hotelling's Trace 0,291 6,844 4,000 188,000 0,000 Roy's Largest Root 0,261 12,541 2,000 96,000 0,000

Documents

Filogeografska in morfološka analiza populacij močerila