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En la última década, los fabricantes de productos biofarmacéuticos han mostrado importantes mejoras en la producción de anticuerpos monoclo-nales (Mab), con títulos de producto que se han situado con frecuencia en el intervalo de 5–10 g/l mediante el uso de cultivos estándar de células de mamíferos por lote alimentado (1, 2).

El aumento del rendimiento de la producción permite el uso de recipientes de producción a menor escala. La fabri-cación de productos de biomoléculas desechables, con biorreactores de un solo uso de 2000 l ya disponibles en el mercado, es una opción cada vez más habitual.

Existen otras mejoras recientes en el sector biofarmacéutico (como fármacos para indicaciones menores y fármacos más potentes que permiten dosifica-ciones más reducidas) que seguirán es-

timulando la demanda de instalaciones de fabricación de productos de un solo uso más reducidas y flexibles.

Aunque en general la tecnología de un solo uso ha madurado considera-blemente en los últimos años, algunas operaciones con unidades (como la eliminación de células) requieren más atención para llegar a ser más eco-nómicas y sólidas. Los títulos altos de productos son con frecuencia el resul-tado del aumento de las densidades celulares más que del aumento de la productividad específica por célula; el contenido de los sólidos resultantes pre-senta dificultades considerables para las tecnologías de cosecha más empleadas.

Actualmente, la tecnología de cose-cha de un solo uso que prevalece son los filtros de profundidad; bloquean con capacidades de carga más bajas y con concentraciones mayores de biomasa.

Las concentraciones mayores de contaminantes aumentan la sensibili-dad de los filtros de profundidad ante la variación entre lotes, que puede provocar un aumento del tamaño del área del filtro del 50 % para compensar la fluctuación en las capacidades de filtración. Esto aumenta los costes y los residuos. En cuanto a otras tecnologías de eliminación de células de un solo uso disponibles en el mercado, como las centrífugas, por el momento carecen de capacidad suficiente. Para la cosecha de cultivos de alta densidad celular, una innovación técnica importante sería bienvenida.

Filtración con diatomeas eficaz para el fraccionamiento de plasmaCuando hemos puesto nuestra

mirada en otras industrias con las

Tjebbe van der Meer, Benjamin Minow, Bertille Lagrange, Franziska Krumbein y Francois Rolin

Conceptos de un solo uso inno-vadores para la clarificación de cultivos de células de mamíferos de alta densidad.

El microscopio electrónico de barrido (MEB) muestra la es-tructura porosa de tierra con diatomeas Celpure 300 (mag-nitud de 1000 aumentos).

Filtración de tierra con diatomeas

Pharmaceutical Technology 67 Edición Sudamérica 2015 - N º135

FIG

URA

1

Principio de filtración con diatomeas dinámica (DBF, por sus siglas en inglés) con tierra con diatomeas (DE, izquierda) y filtración convencional (derecha)

a)

mismas necesidades en cuanto a pro-cesos (como la de fraccionamiento con plasma), hemos observado que con frecuencia utilizan la filtración con diatomeas para la clarificación de so-luciones con alto contenido en sólidos. Los datos sobre el primer uso de la tierra con diatomeas (DE) como complemento de filtración en el fraccionamiento de plasma humano corresponden a hace más de cinco décadas (3).

Desde entonces, a partir de esa tecnología se han desarrollado varios procesos de fabricación para la pro-ducción de inmunoglobulina intrave-nosa (IGIV), albúmina y factores de coagulación (4–6). El fraccionamiento aplica los principios de precipitación selectiva mediante el ajuste del pH, la fuerza iónica, la adición de alcohol y los cambios de temperatura.

Los precipitados se eliminan me-diante filtración de profundidad, con frecuencia combinada con tierra con diatomeas que se añade como com-plemento para mejorar el rendimiento del filtro.

Recientemente, los principios de la filtración con diatomeas se han probado para la cosecha de cultivos de células; los resultados obtenidos son promete-dores (7). Nuestro objetivo era evaluar la tecnología como posible alternativa de un solo uso a las centrífugas y los filtros de profundidad. En este documento, describimos los hallazgos más intere-santes que hemos logrado con varias

líneas celulares y medios de cultivo que amablemente nos han proporcionado diversas empresas de biotecnología.

Sartorius Stedim Biotech, junto con Rentschler Biotechnologie GmbH, ha probado las condiciones optimizadas en un proceso de producción de cultivos celulares de 600 l con el fin de evaluar la escalabilidad de la tecnología de filtración con diatomeas.

MAb Células y desechos Diatomita

Capacidad de sólidos de gran volumen y superior

Capacidad de sólidos de bajo volumen

e inferior

Caudal específico alto, sin atascos

Caudales específicos bajos, atasco rápido del filtro

Caudal

Caudal

Caudal

Caudal

Filtración DBFFiltración

convencionalvs.

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mostrado una correlación entre el peso celular húmedo (WCW, por sus siglas en inglés) y la cantidad necesaria de DE con un pH constante (no se muestran los datos). La concentración óptima de DE, en el caso de los cultivos analizados, se situó en el intervalo entre el 40 % y el 50 % del WCW. En todos los casos, la relación de filtros adicionales se pudo reducir significativamente hasta un intervalo entre el 20 % y el 30 % cuando el pH se redujo hasta un valor de 5.

La precipitación de pH bajomejora los resultados de la clarificaciónLas diferencias de rendimiento entre líquidos de cultivo

celular acidificados (pH entre 4,3 y 5,5) y neutros en otras tecnologías de eliminación de células como la microfiltración (4) y la filtración profunda(5) se pueden explicar por la preci-pitación de pequeñas partículas con niveles de pH más bajos. La solubilidad de los desechos celulares y de las impurezas con carga negativa, como el ADN y las proteínas de célula huésped (6) disminuyen junto con el pH. En la Figura 2 se muestra la distribución media del tamaño de partículas de tres sobrenadantes de cultivo libre de células distintos con pH neutro (línea verde) y después de disminuir el pH de esos cultivos hasta un valor de 5 (línea roja). La disminución del pH provoca la formación de partículas de mayor tamaño y provoca que las partículas submicrónicas típicas (< 1 μm) presentes con un pH de 7,0 desaparezcan por completo. Por tanto, la filtración con diatomeas mejoraría claramente con niveles de pH más bajos.

Además de la reducción significativa en la concentración del filtro adicional, todos los sobrenadantes de cultivo celular acidificado que se analizaron mostraron filtrados mucho más claros que sus contrapartidas neutras (Figura 3). Cuando ana-lizamos la distribución del tamaño de partículas de filtrados con diatomeas, detectamos solamente partículas pequeñas (< 0,4 μm). La filtración con una membrana de 0,2 μm apenas redujo esos calores de turbidez; esto indica que las partículas muy pequeñas son la principal causa de los valores de turbidez más altos en las filtraciones con diatomeas.

La ausencia de partículas más pequeñas en sobrenadantes de cultivos acidificados también es, probablemente, la causa del aumento de las capacidades de filtración con concentra-ciones de filtro adicional constantes. Partimos del supuesto de que las partículas pequeñas se depositan en los poros de las partículas de DE, lo que disminuye la permeabilidad y la capacidad de filtración total de la DE. Al aumentar la concen-tración de filtro adicional, pudimos aumentar su capacidad de retener pequeñas partículas sin perder la permeabilidad necesaria de la torta.

La reducción significativa del consumo de filtro adicional con pH bajo resulta prometedora desde el punto de vista económico y del manejo.

Otro factor económico importante que se debe tener en cuenta es la tasa de recuperación con niveles de pH más bajos. Aunque la mayoría de los anticuerpos son estables en condiciones ácidas (9), en algunos casos la precipitación de líquido de cultivo celular con pH bajo reducirá las tasas de recuperación, cuya causa más probable es la coprecipitación del anticuerpo (6). No obstante, algunos autores han afirmado

FIG

URA

2

Distribución media del tamaño de partículas de sobrenadantes de cultivo de ovarios de hámster chino libre de células (CHO, por sus siglas en inglés), procedente de tres días de cosecha distintos y determinados con diferentes valores de pH; curva verde = ph 7,0, curva roja = pH 5,0; medición realizada con un sistema Mastersizer 2000 (Malvern Instruments).

Tamaño de la partícula (μm)

15

10

5

00,1 1 10 30N

úmer

o de

par

tícul

as (%

)

FIG

URA

3

Medición de turbidez de los filtrados DBF con un pH de 7,0 y de 5,0 para 10 cultivos celulares distintos con una turbidez inicial de entre 2396 y 3235 NTU

FIG

URA

4

Cantidad de ADN media residual tras la filtración de DE con un pH de 5,0 para 10 sobrenadantes distintos de cultivo celular, expresada en tanto por ciento de la concentración de ADN inicial con un pH de 7,0, medida en el sobrenadante libre de células; las concentra-ciones iniciales se situaban en el intervalo entre 475 y 730 ppm (cuantificación de ADN con análisis PicoGreen de Life Technologies).

Turb

idez

med

ia (N

TU)

Cómo funciona la filtración con diatomeasCuando la concentración de sólidos o coloides es de-

masiado alta en fluidos de procesos biológicos turbios que necesitan clarificación, la torta de filtración que se forma en la superficie de un filtro se vuelve impermeable y bloquea el filtro (Figura 1, derecha). La adición de DE altamente porosa crea una torta de filtración más permeable que evita bloqueos (Figura 1, izquierda).

La cantidad mínima de DE necesaria para garantizar una filtración sin problemas depende de la concentración de par-tículas. Los experimentos de laboratorio con diferentes líneas celulares de mamíferos, medios de cultivo y viabilidades han

120

100

80

60

40

20

0HCCF pH7 HCCF pH5

Turb

idez

med

ia (N

TU)

100

80

60

40

20

0pH7 pH5

Pharmaceutical Technology 69 Edición Sudamérica 2015 - N º135

FIG

URA

6

que la disminución del valor de pH influ-yó de forma positiva en la recuperación general del anticuerpo, ya que evitó la reducción enzimática del producto (10, 11). En todas nuestras pruebas con dia-tomeas de laboratorio con un pH bajo, conseguimos una tasa de recuperación > 85 % (no se muestran los datos).

Influencia positiva en el ADN residual y en la carga de proteína de célula huéspedCon la precipitación de pH bajo y la

posterior retención de contaminantes mediante filtración con diatomeas, he-mos logrado una reducción considerable del ADN en el proceso de recuperación primaria a partir de nuestros procesa-mientos de cultivos celulares.

En la Figura 4 se muestra el conte-nido medio de ADN residual de 10 fil-trados con diatomeas distintos después de una precipitación de pH bajo con un pH de 5,0. En primer lugar, medimos el contenido de ADN en el sobrenadante neutro libre de células de cada cultivo celular con un pH de 7,0.

Después de una precipitación con pH bajo seguida por filtración de DE, el contenido de ADN en los sobrenadantes del cultivo celular se redujo en un 65 %.

Resultados de las pruebas a escala pilotoEn Rentschler Biotechnologie, reali-

zamos pruebas a escala de producción piloto para evaluar la aplicabilidad de la tecnología DBF con fines de fabri-cación (12).

En total, 1000 l de cultivo de lotes alimentados de células de ovario de hámster chino (CHO) de alta densidad celular (17,6 x 106 células/ml, viabilidad

del 95 %) estaban disponibles para la filtración de profundidad y los proce-sos de filtración con diatomeas. En el procesamiento único mayor, sometimos 600 l de filtración con diatomeas con un pH de 5,0. El WCW ese día era del 8 %.

Para el experimento de aumento, instalamos siete módulos de escala de procesos con un área total de filtración de 1,61 m2 en un soporte universal de acero inoxidable. Los cartuchos de filtro consisten en dos placas de filtro de polietileno que retienen la DE y la biomasa (Figura 6).

En total, añadimos 12 kg de tierra con diatomeas Cellpure C300 a la cosecha a granel de 600 l. Las bolsas de DE prelle-nadas se conectaron con un adaptador sin polvo a una bolsa de mezcla para lograr una transferencia de DE rápida y segura. Sólo fueron necesarios cinco minutos de mezclado suave para disol-ver el polvo de DE en la suspensión de células. Antes de la filtración, ajustamos el pH de la mezcla resultante en un nivel final de 5,0 y lo mezclamos suavemente durante dos horas a 140 rpm.

La presión aumentó regularmente durante la filtración (Figura 7, izquier-da). Finalizamos la filtración cuando la presión alcanzó los 1,3 bares y la co-secha con impurezas se había filtrado. Durante todo el proceso de filtración, el sistema mantuvo un flujo alto y estable ligeramente superior a los 300 l/m2/h. En general, se alcanzó una capacidad de 311 l/m2. Registramos una turbidez muy baja de entre 5 y 8 NTU (Figura 7, izquierda) en el flujo de cosecha clari-ficado durante la filtración.

Después de la neutralización, la mezcla 3 (la mezcla final) mostró una turbidez de 41 NTU (Figura 7, derecha), que fue considerablemente superior a

(a) ilustración en 3D del soporte para mó-dulo de escala de procesos DBF comercial; (CENTRO) ilustración de un módulo DBF de un solo uso; (b) el caudal dentro de un módulo indica en color rojo el flujo de ali-mentación y, en color verde, la trayectoria del flujo de filtrado; las líneas discontinuas indican las placas de filtros.

Alimentación

Espa

cio

de t

orta

Espa

cio

de t

orta

Filtrado

a)

b)

FIG

URA

5

Representación esquemática de filtración con diatomeas a escala piloto la turbidez durante la filtración. Una dosificación insuficiente del búfer de neutralización probablemente provocó un exceso del pH local y un aumento de la turbidez en esa mezcla final. En una prueba paralele a pequeña escala, el aumento de la turbidez se evitó me-diante una neutralización más suave de la mezcla de filtrado. Para mejorar ese proceso de neutralización, existe un deslizador de procesos listo para usar integrado que está en desarrollo y permitirá un ajuste en línea controlado del pH e impedirá los rebasamientos.

Consideramos que la recuperación de IgG1 fue aceptablemente alta al 85 % (Figura 7, derecha). En el futuro, un procedimiento de neutralización optimi-zado, así como un lavado posterior a la filtración más amplio, deberían mejorar la recuperación de MAb. Durante todo el proceso, supervisamos los conta-

1000 l SUBSistema

de mezclaFiltro con diatomeas

Filtro de 0,2 μm

Filtrado estéril clarificado

Ajuste controlado del pH

Solución madre de ácido acético (2 M)

Tierra con diatomeas Celpure C300

Transferencia sin polvo

70 Edición Sudamérica 2015 - N º135Pharmaceutical TechnologyFI

GU

RA 7

Resultados del experimento de aumento de DE con un pH reducido (5,0) con siete módulos de filtro; rendimiento de la filtración (Izquierda), presión (bares) y flujo (l/m ), así como el curso de turbidez durante la filtración; recuperación de IgG1, columnas azules (Derecha) medidas a partir de la cosecha con impurezas y la mezcla de cosecha sin lavado del búfer (mezcla 1), con lavado del búfer (mezcla 2) y tras la neutralización del líquido de cosecha (mezcla 3)

minantes como la proteína de célula huésped y el ADN. En la mezcla final (después del lavado y neutralización del búfer), esos niveles disminuyeron de 841 a 629 mg/ml y de 13,8 a 5,0 μg/ml, respectivamente.

Observaciones finalesNuestro objetivo fue mostrar la apli-

cabilidad universal de un nuevo método de cosecha de un solo uso para cultivos de células de mamíferos que resulta adecuado incluso para cultivos de alta densidad celular. Las pruebas en las que se emplearon cosechas con impu-rezas de diferentes líneas de células y condiciones de cultivo nos permitieron determinar la concentración óptima de DE como filtro adicional en relación con el WCW, que es un proceso de fácil ac-ceso y específico para la eliminación de células y el procesamiento de cosechas. En cuanto a la economía del proceso, la reducción del 50 % del filtro adicional

necesario con filtraciones de pH bajo resulta prometedora.

En general, los resultados a escala piloto confirmaron nuestras observa-ciones en las pruebas de filtración DBF a escala de laboratorio: la reducción del pH hasta 5,0 tras la adición de DE al sobrenadante de cultivo celular con im-purezas proporciona el mejor resultado en términos de capacidad de filtración, flujo y eliminación de contaminantes.

La tasa de flujo aplicable de la tec-nología DBF resulta muy ventajosa. Se procesó una cosecha de 600 l en un pe-ríodo de tan solo una hora de filtración con el uso de solo siete módulos. Un soporte para módulo permite disponer un máximo de 33 módulos, por lo que calculamos que un volumen de cosecha de aproximadamente 3000 l podría filtrarse al mismo tiempo.

En definitiva, este método permite una clarificación eficaz de cosechas de cultivo celular con impurezas de alta

densidad celular en una configuración de un solo uso a gran escala. Es posible su uso económico y competitivo como sustituto de la centrifugación, que ac-tualmente es el método más empleado para la eliminación de células a gran escala. Incluso las cosechas de células con impurezas muy densas se pueden clarificar de forma rápida con caudales altos. Además, este método ofrece la ventaja adicional de reducir eficazmente los contaminantes con un solo proceso.

La escalabilidad (uno de los requi-sitos más importantes del bioprocesa-miento) se puede alcanzar con facilidad mediante un enfoque generalmente lineal con un rendimiento del proceso muy sólido n

Referencias1 Kelley B. Industrialization of MAb Production Tech-

nology: The Bioprocessing Industry at a Crossroads. MAbs 1(5) 2009: 443–452.

2 Buttler M. Animal Cell Cultures: Recent Achievements and Perspectives in the Production of Biopharmaceu-ticals. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 283–291.

3 Cohn EJ, et al. Preparation and Properties of Serum and Plasmaproteins, IV: A System for Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissue and Fluids. J. Am. Chem. Soc. 68, 1946: 459–475.

4 Curling J, et al. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, 2012.

5 More J, et al. Purif ication of Albumin from Plasma. Blood Separation and Plasma Fractionation. Harris J, Ed. Wiley-Liss: Hoboken, NJ, 1991.

6 Stucki M, and al. Investigations of Prion and Virus Safety of a New Liquid IVIG Product. Biologicals 36, 2008: 239–247.

7 Westoby M, et al. Effects of Solution Environment on Mammalian Cell Fermentation Broth Properties. Biotechnol. Bioeng. 108(1) 2011: 50.

8 Delavaille D. How to Apply Old Techniques to New Processes. European Downstream Technology Fo-rum, 7–8 de septiembre 2010, Göttingen, Alemania. Sartorius Stedim Biotech AG: Goettingen, Alemania.

9 Singh N, et al. Clarif ication of Recombinant Proteins from High Cell Density Mammalian Cell Culture Sys-tems Using New Improved Depth Filters. Biotechnol. Bioeng. 110(7) 2013: 1964.

10 Brodsky Y, et al. Caprylic Acid Precipitation Method for Impurity Reduction: An Alternative to Conven-tional Chromatography for Monoclonal Antibody Purification. Biotechnol. Bioeng. 109(10) 2012: 2589.

11 Kao Y, et al. Mechanism of Antibody Reduction in Cell Culture Production Processes. Biotechnol. Bioeng. 107(4) 2010: 622.

12 Trexler-Schmidt M, et al. Identification and Preven-tion of Antibody Disulfide Bond Reduction During Cell Culture Manufacturing. Biotechnol. Bioeng. 106(3) 2010: 452.

13 Minow B, et al. High-Cell-Density Clarif ication By Single-Use Diatomaceous Earth Filtration. BioProcess Int. 12(4) 2014: S36 –S47.

• Tjebbe van der Meer, licenciado, es jefe de productos en Sartorius Stedim Biotech GmbH, August-Spindler-Straße 11, 37079, Göttingen, Alemania, tjebbe.vandermeer@sartorius- stedim.com. • Benjamin Minow, doctor, es director de fabricación de desechables para cultivos celulares en Rentschler Biotech-nologie GmbH, Erwin Rentschler Straße 21, 88471 Laupheim, Alemania, benjamin.minow@ rentschler.de. • Bertille Lagrange, licenciado, es científico en Sartorius Ste-dim Biotech GmbH, August-Spindler-Straße 11, 37079, Göt-tingen, Alemania, bertille.lagrange@sartorius- stedim.com. • Franziska Krumbein, ingeniera diplomada (FH), es direc-tora de tecnologías de procesos en Sartorius Stedim Biotech GmbH, August- Spindler-Straße 11, 37079, Göttingen, Ale-mania, franziska.krumbein@sartorius- stedim.com. • Francois Rolin, ingeniero Diplomado, trabaja con Chan-geXplorer Production SAS, Z.I. des Waillons 02220, Braine, Francia changexplorer@orange.fr.

Mezcla 1

0 1 2 0 2 4 0 3 6 0

2

1

0

2400

1600

800

0

Presión

Flujo

Turbidez durante la filtración

600

300

0

Dp (b

ar)

igG

1 (g)

1128 NTU

16 NTU

41 NTU 41 NTU

Capacidad (l/m2)

5 NTU7 NTU5 NTU5 NTU6 NTU8 NTU

pJ 5-0 DBF x 7

Turb

idez

(NTU

)

10000

1000

100

10

1

IgG

1

IgG

1

IgG

1

IgG

1

Capa

cida

d (l/

m2 )

Cosecha con impurezas

Mezcla 2

Mezcla 3

a)

b)