Fiziologija rastlin za pedagoge

FitofiziologijaMatevž Likar - Katarina Vogel Mikuš

Navodila za vaje

Praktikum fiziologije rastlin

1

KazaloSemena in kalitev

Metabolizem semen 3Vaja: Viabilnost semen  3

Semena in kalitev 5Dihanje semen 5

Vaja: Dihanje semen  6

Dormanca semen 9Primarna (endogena) dormanca semen 9Mehanizmi prekinitve dormance 10

Zaznavanje kvalitete svetlobe 10Vpliv svetlobe na kalitev 11

Vaja: Vpliv kvalitete svetlobe na kalitev

solate  11Vaja: Vpliv dostopnosti vode na kalitev solate in vrtne kreše  12Vaja: Vpliv okoljskih dejavnikov na viabilnost semen  14

Temperaturna odvisnost encimov 16

Lipaza 16Vaja: Temperaturna odvisnost aktivnosti lipaze  16

Polifenol oksidaze 18Vaja: Aktivnost katehol oksidaze pri različnih okoljskih pogojih  19

teSti StrupenoSti

Onesnažila in rastline - rastlinski testi strupenosti 21

Obseg delovanja herbicidov 21

Vaja: Rastlinski test strupenosti  22Vaja: Določanje vsebnosti asimilacijskih barvil  23

FotoSinteza

Asimilacijska barvila 26Klorofili  26

Karotenoidi 26Fikobilini 27

Vaja: Absorpcijski spektri asimilacijskih barvil  27

Fotosinteza 29Difuzija CO2 29Asimilacija CO2 29C-3 29C-4 29CAM – kisli metabolizem sočnic  29Omejitve mehanizmov za koncentriranje CO2 30

Vaja: Poraba CO2 pri fotosintezi  30Vaja: Diurnalni kislinski cikel pri sukulentnih rastlinah  31


2

Vaja: Kranz anatomija  32Vaja: Hillova reakcija  33

Sekundarni metabolizem

Flavonoidi 35Antociani 35Flavoni in flavonoli   35

Vaja: Antociani  36

Vaja: Ločitev flavonoidov s tankoplastno kromatografijo  37

Askorbinska kislina 38Vaja: Določanje vsebnosti askorbinske kisline  39

vodni potencial

Celica 40Vodni potencial celice 40

Vaja: Vodni potencial celice  41

Transpiracija 43Vaja: Merjenje intenzivnosti transpiracije  44

mineralna prehrana raStlin

Mineralna prehrana rastlin 45Vaja: Simptomi pomanjkanja mineralnih hranil  45

Mikoriza 47Arbuskularna mikoriza 47

Vaja: Barvanje struktur arbuskularno mikoriznih gliv  47


3

Semena in kalitev

Metabolizem semen

Mirujoča semena izgledajo na prvi pogled kot mrtva, saj je stopnja metabolizma, zaradi nizke vsebnosti vode, izredno nizka. Ob privzemu vode (imbibicija) metabolna aktivnost naraste, kar se kaže predvsem v porastu dihanja v živih tkivih semena.

Tetrazolijev test temelji na obarvanju semenskih tkiv z dehidrogenazno aktivnostjo. Dehidrogenaze sodelujejo v procesu dihanja, pri čemer se v

semenih založne snovi ob prisotnosti kisika pretvarjajo v energijo, vodo in CO2. Ob reakciji dehidrogenaz s substratom se sproščajo vodikovi ioni, ki reducirajo trifenil tetrazolijev klorid (TTK), pri čemer nastane rdeče obarvan, v vodi netopen formazan. Tetrazolijev test viabilnosti se uporablja predvsem, kadar hočemo v kratkem času določiti odstotek viabilnih semen. V komercialne namene se uporablja tudi dolgotrajnejši način določanja viabilnosti semen, in sicer test kaljivosti.

▌Vaja: Viabilnost semenZa določanje viabilnosti semen s tetrazolijevim testom, moramo najprej poznati morfologijo semen, ki jih testiramo. S TTK se obarvajo le tkiva z dehidrogenazno aktivnostjo, neživa tkiva kot so npr. semenske ovojnice, pa se ne obarvajo. Namen vaje je primerjati obarvanje semenskih tkiv s TTK pri različnih pri enokaličnicah in dvokaličnicah.

Material

imbibirana semena različnih rastlinskih vrst (enokaličnice in dvokaličnice), raztopina 1% trifenil tetrazolijevega klorida (TTK), pripravljena v temni steklenici, filtrirni papir, petrijevke, skalpel, rokavice, lupa

Navodila

Po pet namočenih semen prerežemo vzdolžno, da izpostavimo embrionalna tkiva. Polovičke semena položimo s prerezano stranjo navzdol na filtrirni papir, ki smo ga prej namestili v petrijevke (dve plasti). Polovice semen nato prelijemo z 1% raztopino TTK, tako, da so prerezana semena do

polovice v raztopini. Petrijevke zapremo, ustrezno označimo, zložimo v škatle (v temo) in inkubiramo 1-1,5 ure pri sobni temperaturi. V temi inkubiramo zato, ker TTK na svetlobi razpade. Po končani inkubaciji semena poberemo iz petrijevk in si jih ogledamo pod lupo.

OPOZORILO:

S TTK delajte previdno, da ga ne polijete po koži ali obleki! Vedno uporabljajte rokavice!

Rezultati

Skiciraj in primerjaj morfologijo semen enokaličnic in dvokaličnic!

Vprašanja

1. Katere strukture so se obarvale s TTK pri enokaličnicah in katere pri dvokaličnicah, razloži zakaj?


4

Enokaličnica

Dvokaličnica


5

Semena in kalitev Seme je razmnoževalna struktura rastlin, ki vsebuje rastlinski embrio in hranilne snovi, obdane z zaščitnimi ovojnicami. Ob kalitvi pride do aktivacije hidrolitičnih encimov in razgradnje založnih hranilnih snovi, ki rastočemu kalčku služijo kot vir energije in gradnikov.

Dihanje semenMirujoča semena že vsebujejo večino encimov, ki so potrebni za začetek življenja mlade rastline. Mitohondriji so še nerazviti – v morfološkem in biokemičnem smislu. Metabolizem in izmenjava plinov sta izredno nizka, kar je posledica nizke vsebnosti vode (okrog 10 %). Med imbibicijo semena dihanje hitro naraste in je merljivo tudi s preprostimi metodami. Pri semenih večine

rastlinskih vrst ob kalitvi opazimo značilno krivuljo porabe kisika.

Med imbibicijo in zgodnjimi fazami kalitve poraba kisika strmo narašča. Aktivirajo se encimi, uskladiščeni v semenu. Najprej se porabijo primarne zaloge hranil v embriu, ki jih predstavljajo v glavnem nižji sladkorji. V teh procesih se porablja tudi kisik, ki je bil skladiščen v različnih tkivih semena. Mitohondriji se razvijejo, poveča se njihovo število, naraste pa tudi količina nekaterih encimov v njih.

Pri nekaterih vrstah rastlin začne po nekaj urah poraba kisika stagnirati ali celo rahlo upade. Ta faza stagnacije navadno sovpade s koncem imbibicije. Vzrok zanjo pa je verjetno slaba prepustnost teste za kisik, ki je v imbibiranem

endosperm semenska ovojnica epikotil

epikotil

radikula hipokotil korenina

korenina

kotiledon

kotiledon

kotiledona

koleoptila

epikotil

radikula

radikula

radikula

prvi list

prva lista

koleoptila

semenska ovojnica zlita s steno ovarija

semen. ovojnica

semen. ovojnica

hipokotil

hipokotil

hipokotil

SLIKA 1. Struktura semen koruze in fižola in potek kalitve.


6

stanju še manjša. Kisik, ki prehaja skoznjo prestrezajo tudi fenolne substance, ki so v njej navadno prisotne v visokih koncentracijah. Metabolizem je v tem času delno anaerobni, kljub temu pa v semenu poteka intenzivna sinteza encimov.

Ponoven porast porabe kisika navadno opazimo ko se pojavi s prostim očesom vidni znak kalitve – prodor koreničice. Embrio intenzivno izkorišča rezerve iz sekundarnega endosperma ali

kotiledonov (redko so rezerve skladiščene drugje, npr. v hipokotilu pri arašidih). Mlada rastlinica hitro raste. Na svetlobi lahko pri kalici opazimo pozitivno fototropično reakcijo. Razvije se tudi fotosintezni aparat in kalica preide na avtotrofni način življenja.

Pri kalitvi semen v temi dihanje upade približno ob istem času, kot na svetlobi, ko kalica začne avtotrofni del življenja, zaradi pomanjkanja substrata (npr. pri ovsu peti do sedmi dan). Kalica v temi zato počasi odmre.

▌Vaja: Dihanje semen

Material

semena enokaličnic in dvokaličnic (suha, imbibirana, 2 in 4 dni kaleča), steklenico za meritve izmenjave plinov, merilec ogljikovega dioksida, vodne kopeli, led

Izvedba

V steklenico položimo 15 kalečih/nekalečih semen, nato pa na odprtino namestimo merilec ogljikovega dioksida. Čas meritve v programu

naravnamo na 15 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na 2 podatka/minuto (Slika 7). Zeženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje koncentracij dihalnih plinov v steklenici. Po 15 minutah poskus ponovimo z naslednjo starostjo semen. Na enak način izvedemo tudi meritve pri različnih temperaturah.

Po zaključeni meritvi odčitamo spremembo koncentracije O2 oz. CO2 (Slika 2) tako, da

SLIKA 2. Nastavitve za meritve izmenjave dihalnih plinov v programu LoggerPro in odčitavanje spremembe dihalnih plinov ob zaključku meritve.


7

kliknemo na ikono za linearno regresijo ( ). Na grafu se bo pojavila linearna krivulja in ustrezni podatki, iz katerih je razviden koeficient korelacije (R) in naklon premice (=sprememba koncentracije v časovni enoti). S premikanjem oglatih oklepajev na grafu lahko popravimo del krivulje, ki bo uporabljen za računanje (odstranimo začetne dele, ko se je v sistemu šele vzpostavljalo ravnovesje). Odčitamo spremembo dihalnih plinov in jo vpišemo v spodnjo tabelo.

Rezultati:

V tabelo 1 vpišite spremembe koncentracije CO2 v sistemu. Rezultate vseh skupin vpišite v grafe na naslednji strani.

Vprašanja

1. Ali si opazil kakšne razlike v intenziteti dihanja med imbibiranimi in neimbibiranimi semeni? Zakaj?

2. Ali si opazil kakšne razlike v intenziteti dihanja pri različno starih kalečih semenih? Zakaj?

Tabela 1. Sproščanje CO2 pri suhih, imbibiranih ter 2 in 4 dni kalečih semenih ječmena oz semenih izpostavljenih različnim temperaturam.

Starost Izdihani CO2 (ppm min-1) T (°C) Izdihani CO2 (ppm min-1)Suha 0Imbibirana 102 dni kaleča 204 dni kaleča 40


8

Graf 1. Sproščanje CO2 pri suhih, imbibiranih ter 2 in 4 dni kalečih semenih ječmena.

Graf 2. Sproščanje CO2 pri semenih ječmena pri 0, 10, 20, 40°C.


9

Dormanca semen

Primarna (endogena) dormanca semenDormanca je fenomen, ko viabilna semena kljub ugodnim razmeram v okolju ne kalijo. S tem je omogočen določen časovni zamik med sproščanjem semen in njihovo kalitvijo, ki omogoči boljše razširjanje semen in kalitev v ugodnem letnem času.

Poznamo dva tipa dormance semen: dormanca zaradi semenskih ovojnic in dormanca embriev.

Dormanca zaradi semenskih ovojnic

Poznanih je pet osnovnih mehanizmov tega tipa dormance:

Preprečevanje sprejema vode je najpogostejši mehanizem pri predstavnikih, ki rastejo v sušnih predelih (še posebej je pogost pri metuljnicah kot je npr. detelja, itd.). Strukture, ki preprečujejo privzem vode, so kutikula, suberinizirani sloji in lignificirane sklereide.

Ovojnica kot mehanska prepreka: semena so lahko obdana s trdimi lupinami, ki preprečujejo prodor radikule in s tem preprečujejo kalitev. Poleg lupin lahko prodor radikule preprečujejo tudi celice endosperma kot npr. pri solati. Njihove celične stene se morajo delno razgraditi z encimi.

Motnje v menjavi dihalnih plinov: v tem primeru naj bi prihajalo do preprečevanja vdora kisika v seme, kar zavre kalitev.

Zadrževanje inhibitorjev: semenske ovojnice zadržujejo inhibitorje kalitve v semenu. Kalitev povzročijo šele poškodbe ovojnic, ki omogočijo difuzijo inhibitorjev iz semena.

Sinteza inhibitorjev kalitve: semenske ovojnice in perikarpi lahko vsebujejo velike količine inhibitorjev kalitve (npr. abscizinska kislina). Večkratno izpiranje semen lahko zniža nivo inhibitorjev do takšne vrednosti, da kalitev ni več zavirana.

Dormanca embrija

Diferencirani embrio: dormaca embria je tip dormance, na katero ne vplivajo semenske ovojnice in druga tkiva. Takšen tip dormance je značilen za semena, ki vsebujejo le rudimentarne embrie (večino semena napolnjuje endosperm – embrio lahko predstavlja le 1 % celotnega semena). Embrii pri teh semenih so diferencirani, vendar je pred kalitvijo potrebna še dodatna rast embria, da lahko seme kali.

Nediferencirani embrio: takšni embrii obstajajo pri pritlikavih semenih (embrio je velik 0,2–3,0 mm) in mikrosemenih (embrio manjši od 0,2 mm). Embrii mikrosemen lahko vsebujejo tudi le dve celici.

Sekundarna (inducirana) dormanca semenZa semena, sproščena iz rastlin v dormantnem stanju pravimo, da so v stanju primarne dormance. Za semena, ki so končala primarno dormanco ali pa so bila sproščena v nedormatnem stanju oz. so bila sposobna takojšnje kalitve velja, da lahko ponovno zapadejo v dormantno stanje pod vplivom nekaterih dejavnikov okolja. Takšna dormanca preprečuje kalitev v neugodnih življenjskih razmerah v okolju. Vzroki zanjo so lahko: fizikalni, kemijski ali mehanski.


10

Mehanizmi prekinitve dormancePrekinitev dormance lahko povzročijo številni zunanji dejavniki. Mednje spadajo skarifikacija (poškodba vrhnjih tkiv), imbibicija, izsušitev, razgradnja delov semen z encimi, kislinami,…, osvetlitev, nizke temperature, delovanje mikroorganizmov …

V nekaterih semenih nastopi prekinitev dormance v primeru, če vsebnost vlage pade pod določen nivo (Avena sp.). Pri vrsti Salvia officinalis je ob visoki vlagi kalitev inhibirana (seme je obdano z ovojnico, ki zadržuje vlago, kar lahko vodi tudi v pomanjkanje kisika). Pri nekaterih vrstah pa je za kalitev potrebna izmenjava sušnih in vlažnih obdobij, čeprav je lahko dormanca prekinjena že

ob imbibiciji (npr. Rumex acetosella).

Dormanco semen lahko prekinejo tudi nizke temperature (semena predstavnikov rodov Malus, Pyrus, Polygonum, Prunus, itd.). Številna semena morajo biti izpostavljena temperaturam 0-10 oC (stratifikacija) daljšem času v namočenem stanju (imbibirana semena). Pri teh semenih lahko pride tako do kalitve šele spomladi (semena jeseni tudi v ugodnih razmerah ne kalijo) po prekinitvi dormance v zimskem času.

Tretji dejavnik, ki igra pomembno vlogo pri prekinitvi dormance, je svetloba. Glavni senzor za ustrezen dražljaj je v tem primeru fitokrom.

Zaznavanje kvalitete svetlobeKalitev semen in njihov nadaljnji razvoj sta odvisna od dejavnikov, ki prekinejo dormanco, eden od teh je svetloba. Rastline svetlobo zaznavajo svetlobo s fotoreceptorji, predvsem s fitokromi, kriptokromi in fototropini. Fitokromi zaznavajo prisotnost kratkovalovne rdeče (660 nm) in dolgovalovne rdeče (730 nm) svetlobe. Odgovori fitokromov so

odvisni tudi od intenzitete svetlobe. Modri del vidnega spektra svetlobe se zaznava s kriptokromi in fototropini. Zaznavanje modre svetlobe z omenjenimi fotoreceptorji sproži fototropizem, regulira izmenjavo plinov preko rež in zavre elongacijo stebla. Zaznavanje zelene svetlobe še ni povsem razjasnjeno. Zelena

200 300 400 500 600 700 800

Valovna dolžina svetlobe (nm)

Pr

Pfr

Abso

rpci

ja (A

E)

SLIKA 3. Absorpcijska spektra obeh oblik fitokroma.


11

svetloba v rastlinah, podobno kot modra, vpliva na delovanje listnih rež in podaljševanje stebla. V splošnem je za nadaljnji razvoj semen najbolj učinkovita dnevna svetloba.

Vpliv svetlobe na kalitev

Fitokrom

Kratkovalovna rdeča svetloba sproži pretvorbo neaktivne oblike (Pr) v aktivno obliko (Pfr), ki vpliva na številne procese v rastlini, vključno s sintezo klorofila in elongacijo stebla. Absorpcija dolgovalovne rdeče svetlobe pretvori Pr obliko nazaj v neaktivno Pfr obliko fitokroma.

Novejše raziskave kažejo, da odgovore semen na svetlobo regulirajo različni tipi fitokroma v odvisnosti od svetlobnih intenzitet. Glede na odzive semen na osvetljevanje z svetlobo ločimo:

Fotoblastičnost semen

Pozitivno fotoblastična semena potrebujejo za kalitev svetlobo. Zadošča tudi kratkotrajno osvetljevanje s kratkovalovno rdečo svetlobo (660 nm). Takšna semena ob dozorenju nimajo dovolj Pfr za indukcijo kalitve, z osvetljevanjem pa se vsebnost Pfr v njih poveča. Semena so pogosto drobna, imajo tanko testo in malo rezervne hrane,

kar pomeni, da morajo kaliti blizu površine tal, da lahko kmalu začnejo fotosintetizirati. Pojavu, da seme ne more kaliti, ker ni osvetljeno, pravimo fotodormanca.

Negativno fotoblastična semena kalijo samo v temi. Ta semena imajo že uskladiščenega dovolj Pfr, da lahko kalijo. Svetloba njihovo kalitev prepreči. Ta pojav lahko vsaj pri nekaterih semenih razlagamo s selektivno prepustnostjo teste za svetlobo (prepušča predvsem dolgovalovno rdečo svetlobo, ki zmanjša količino Pfr). Takšna semena so redka, navadno pa so relativno velika in imajo trdo semensko lupino. Direktna indukcija sekundarne dormance z dolgovalovno rdečo svetlobo je zelo redek pojav. Ponavadi postanejo semena ob obsvetljevanju s takšno svetlobo le bolj občutljiva za druge dejavnike, ki lahko vplivajo na kalitev (npr. vlaga …). Sistem fitokroma s svojim vplivom zagotavlja, da so semena dobro zakopana in s tem dobro imbibirana, ko začnejo kaliti.

Nefotoblastična semena na svetlobo ne reagirajo. Kalijo lahko na svetlobi ali v temi. Lahko imajo dovolj Pfr za kalitev in osvetljevanje na njegovo vsebnost ne vpliva, ali pa kalitev regulirajo predvsem (ali celo samo) drugi mehanizmi.

▌Vaja: Vpliv kvalitete svetlobe na kalitev solate

Material

semena solate, petrijevke, filtrirni papir, pincete, škarje, filtri znamke Lee: zeleni (prepušča svetlobo 460 – 570 nm), rdeči (prepušča svetlobo >560 nm), modri (prepušča svetlobo 308 –570 nm), dolgovalovni rdeči (modri preko rdečega, prepušča svetlobo >640 nm).

Izvedba

V šest petrijevk damo po dva sloja filtrirnega papirja in ga omočimo z destilirano vodo. Posebej v pokrove petrijevk naštejemo po 25 semen in pazimo, da ostanejo suha. V temnici semena razporedimo v petrijevke, jih zalijemo in postavimo pod posamezne tretmaje: rdeča, dolgovalovna rdeča, zelena, modra, bela svetloba


12

in tema. Po enem tednu preštejemo število kalečih semen. Rezultate vpišite v spodnjo tabelo.

Rezultati

Vprašanja

1. Kako bi označil semena solate - kot pozitivno/negativno fotoblastična ali nefotoblastična?

▌Vaja: Vpliv dostopnosti vode na kalitev solate in vrtne krešeNa kaljivost semen lahko vpliva mnogo dejavnikov, med drugimi tudi temperatura in dostopnost vode. Voda je zelo pomembna za prvo stopnjo kalitve – imbibicijo, kjer pride do vdora vode v suho seme. To med drugim aktivira encime, ki začnejo razgrajevati kompleksne založne snovi in s tem omogočijo rast kalčku. Če je vode premalo ali preveč, je kalitev zavrta.

Material

Semena vrtne kreše in solate, petrijevke, filtrirni papir, pincete, škarje, merilce, polietilen glikol (PEG, Mr = 6000)

Izvedba

V 8 petrijevk (=2 rastlini x 4 koncentracije) damo po dva sloja filtrirnega papirja. V pokrove petrijevk

Tabela 2. Kalitev semen solate pri različnih kvalitetah svetlobe.

Kvaliteta svetlobe KaljivostKratkovalovna rdečaDolgovalovna rdečaZelenaModraTemaBela svetloba

SLIKA 4. Vsebnost vode v semenu pri različnih vodnih potencialih.


13

naštejemo po 25 semen in pazimo, da ostanejo suha. Filtrirni papir sedaj namočimo z raztopinami PEG iz spodnje tabele.

Po tednu dni preštejemo kaleča semena in izmerimo dolžino radikule. Kot kalečo označimo seme, pri katerem opazimo rast radikule. Pri merjenju dolžine radikule, nekaleča semena in radikule dolžine pod 1 mm označimo z 0 mm.

Tabela 3. Vodni potencial različnih raztopin PEG.

Koncentracija PEG (g/100 ml vode)

Vodni potencial (bar)

0,0 0,00,1 -2,00,3 -10,00,5 -30,0

Rezultati

Tabela 4. Kalitev solate in vodne kreše pri različnih vodnih potencialih.

Vodni potencial (bar)

Vrtna kreša Solata% kalitve dolžina radikule (mm) % kalitve dolžine radikule (mm)

0-2

-10-30

Graf 3. Odvisnost kalitve semen vrtne kreše in solate od vodnega potenciala.


14

Vprašanja

1. Pri katerem vodnem potencialu si opazil najboljšo kalitev solate/vrtne kreše?

2. Ali si opazil kakšno razliko med občutljivostjo kalitve in podaljševanja radikule na sušo?

▌Vaja: Vpliv okoljskih dejavnikov na viabilnost semenDolžina viabilnosti semen je odvisna od posamezne rastlinske vrste (od nekaj tednov pa do nekaj desetletij) pa tudi od okoljskih pogojev. Namen vaje je ugotoviti, kakšen je vpliv temperature na viabilnost mirujočih (suhih) semen koruze.

Material

Semena koruze, sušilnik, zamrzovalnik, kuhalnik, raztopina 1% trifenil tetrazolijevega klorida (TTK), pripravljena v temni steklenici, filtrirni papir, petrijevke, skalpel, rokavice, lupa

Suha semena koruze tretiramo kot kaže Tabela 1. Po končanem tretiranju semena namočimo za en dan (imbibicija).

Test viabilnosti

Po 10 semen prerežemo vzdolžno, da izpostavimo embrionalna tkiva, zložimo v dve petrijevki in preverimo viabilnost tretiranih semen kot pri prejšnji vaji 1! Po končani inkubaciji preštejemo število homogeno obarvanih semen v obeh petrijevkah in izračunamo % viabilnosti. Povprečje % viabilnosti vnesemo v Tabelo 2.

Test kaljivosti

Viabilnosti semen lahko primerjamo tudi z njihovo kaljivostjo. Dvakrat po pet neprerezanih semen posameznega tretmaja položimo v petrijevke na omočen filtrirni papir, petrijevke zapremo, ustrezno označimo in pustimo na svetlobi (na pultu, pri sobni tempeaturi). Čez en teden preštejemo kaleča semena in izračunano % kalečih semen v obeh petrijevkah. Povprečje % kaljivosti vnesemo v Tabelo 2.

Rezultati

V tabelo in graf vpišite rezultate meritev porabe kisika v semenih.

Vprašanja

1. Ali meniš, da je tetrazolijev test dober pokazatelj kaljivosti semen?

2. Ali so rezultati testa kaljivosti v skladu s testom viabilnosti? Komentiraj podobnosti oz. razlike v rezultatih!

Tabela 5. Tretiranje semen

Tretma Tretma-10°C Zmrznemo pri -10ºC20°C Pustimo na sobni temperaturi (20 ºC)50°C Za 60 min v sušilniku segrevamo na 50 ºC

100°C Za 60 min v sušilniku segrevamo na 100 ºC


15

Tabela 6. Primerjava odstotkov viabilnosti in kaljivosti semen.

Tretma Viabilnost (%) Kaljivost (%) -10°C20°C50°C

100°C

Graf 4. Odvisnost viabilnosti in kaljivosti semen od temperature.


16

Temperaturna odvisnost encimov

LipazaMirujoča semena kloščevca (Ricinus communis) ne vsebujejo skoraj nič sladkorjev. Manjka tudi založni škrob. Namesto ogljikovih hidratov so v endospermu velike količine lipidov. Razpad lipidov na glicerol in proste maščobne kisline katalizira encim lipaza. Lipaza se v kloščevcu nahaja na membranah oleosomov (podobno kot v koruzi in bombažu), medtem ko se v arašidih, soji in bučkah nahaja na membranah glioksisomov. V obeh primerih so oleosomi in glioksisomi tesno drug poleg drugega.

Proste maščobne kisline se naprej razgrajujejo z β-oksidacijo. Končni produkt je acetil-CoA. V glioksilatnem ciklu se acetil-CoA pretvori

v sukcinat, ki se transportira iz oleosoma v mitohondrij. Tam se sukcinat preko fumarata pretvori v malat, ta pa v citosolu v oksalacetat in naprej v fosfoenolpiruvat, po poti glukoneogeneze. Sladkorji se skladiščijo v kotiledonih in osnih organih kalice.

Proces pretvorbe maščob v sladkorje je zelo učinkovit: 1g maščob se pretvori v 1g ogljikovih hidratov ob 40% ohranitvi energije (v obliki ogljikovih vezi). Povprečno seme kloščevca vsebuje približno 260 mg lipidov (70 % suhe mase) in 15 mg ogljikovih hidratov. Po osmih dneh kalitve v temi (pri 25°C) je v njem samo še 50 mg lipidov. Količina ogljikovih hidratov lahko v tem času naraste na 230 mg.

▌Vaja: Temperaturna odvisnost aktivnosti lipaze

Material

semena kloščevca (Ricinus communis), sončnice (Helianthus annuus), buče (Cucurbita sp.) in fižola (Phaseolus vulgaris), terilnice, 100ml erlenmajerice, 250ml čaše, 10 in 25ml menzure, bireta, skalpel, tehtnica, termometer, termostatirana vodna kopel, led, acetatni pufer pH 4,7 (v 200ml bučko dodamo 50 ml 1N ocetne kisline in 50 ml 1N amonacetata ter dopolnimo do oznake z destilirano vodo), dietileter, 96% etanol, 1M NaOH, fenolftalein, merilec pH, merilec pretoka, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro

Izvedba

Hitrost delovanja lipaze merimo pri štirih različnih temperaturah. Prva delovna skupina pripravi

z ledom hlajeno vodno kopel (v litrski čaši), ki naj ima 0°C. Druga skupina dela pri 15°C. Tretja inkubira pri sobnih pogojih, četrta in peta skupina si že pred začetkom dela pripravita vodne kopeli s 30 oz. 50°C.

Semenom odstranimo testo in jih za vsako temperaturo odtehtamo dvakrat po 1 g. Vzorce stremo v terilnici z 10 ml pufra pH 4,7 in jih prenesemo v erlenmajerico. Inkubiramo jih 30 minut pri določeni temperaturi. Po tem času reakcijo ustavimo s 7 ml etra in 15 ml etanola. Količino prostih maščobnih kislin določimo tako, da celotni vzorec titriramo z 1M NaOH, ki ga natočimo v plastično bireto. Na pH meter namestimo magnetno mešalo. Merilec pH in merilec pretoka povežemo z vmesnikom LabPro in zaženemo program LoggerPro. Izberemo prednastavitve za titracijo s števcem kapljic.


17

Zeženemo zajemanje podatkov, odpremo bireto in uravnamo pretok na 3-4 kapljic/min ter spremljamo spreminjanje pH. Ko pH preide nevtralno območje (pH 7.0), ustavimo pretok in zaključimo zajemanje podatkov. Na diagramu preberemo količino porabljenega 1M NaOH do točke, ko je prišlo do preskoka pH.

Izračunamo povprečni titer ter izračunamo razliko med inkubiranimi in slepimi vzorci - ta

nam posredno podaja aktivnost lipaze v ml porabljenega 1M NaOH.

Vprašanja

1. Pri kateri temperaturi je bil encim najbolj aktiven?

2. Kakšen vpliv ima temperaturna odvisnost lipaze na kalitev semen?

3. Kje na spodnjem grafu bi se nahajalo območje inducirane dormance semen?

Slika 5. Titracija s programom Logger Pro.

Graf 5. Aktivnost lipaze v semenih ______________ v odvisnosti od temperature.


18

Polifenol oksidazePolifenol oksidaze (katehol oksidaze, kresolaze) so encimi, ki so odgovorni za porjavitev tkiv sadja ali zelenjave ob ranitvi. So metaloproteini, saj sta v molekuli vezana dva bakrova iona,

katalizirajo pa reakcijo, kjer se o-difenoli (npr. brezbarven do rahlo rumen katehol) spremenijo v o-kinone. Le-ti pa nato v prisotnosti kisika polimerizirajo v rjavo-črn melanin.

Fenoli (npr. katehol) se v majhnih količinah nahajajo v celičnih vakuolah, katehol oksidaze pa v citoplazmi. Ko se tkivo poškoduje, se fenoli

sprostijo iz vakuol, katehol oksidaze pa jih pretvorijo v reaktivne kinone, ki delujejo kot naravni antiseptik, saj preprečuje rast in razvoj bakterij in gliv na poškodovanem rastlinskem tkivu. Poleg tega se kinoni vežejo tudi z nekaterimi nukleofilnimi aminokislinami, kar

zavira rast določenih herbivornih žuželk.

Oksidacija fenolov v tkivih je s komercialnega vidika nezaželena, saj skoraj polovica svetovnega pridelka sadja in zelenjave izgubi na vrednosti zaradi procesov rjavenja.

SLIKA 6. Pretvorba katehola v O-kinon.

Slika 7. Merjenje absorpcije s programom Logger Pro.


19

▌Vaja: Aktivnost katehol oksidaze pri različnih okoljskih pogojih

Material

zrela banana, destilirana voda, terilnica, čaše, til, filtrirni papir No. 6, epruvete, rokavice, 1% raztopina katehola, puferska raztopina, pH = 7, 200 ml 0,1M citronske kisline, 680 ml 0,2M K2HPO4, 200 ml destilirane vode, vodne kopeli z različnimi temperaturami

Vpliv temperature na aktivnost katehol oksidaze

Tretjino banane zmečkamo v terilnici ob dodatku 25 ml destilirane vode. Zmes prefiltriramo preko tila, nato pa še preko filtrirnega papirja (No. 6) v čašo, da dobimo cca. 10 ml filtrata, kjer se nahaja encim katehol oksidaza.

Tabela 7. Absorpcija (AE) reakcijske mešanice v odvisnosti od temperature

Temperatura (°C)

meritev 1 meritev 2 povprečna meritev

01020305070

100

Graf 6. Aktivnost katehol oksidaze v odvisnosti od temperature.


20

V epruvete nalijemo po 1 ml 1% raztopine katehola (substrat) in 9 ml pufra pH=7. Dodamo 1 ml bananinega ekstrakta (encim) in postavimo epruvete na naslednje temperaturae: 0, 10, 20, 30, 50, 70 in 100°C.

Inkubiramo 1-1,5 ure. Vmes epruvete večkrat premešamo, da pospešimo tvorbo melanina. Ob koncu poskusa izmerimo absorpcijo reakcijske mešanice pri 440 nm. Kjer bo aktivnost encima večja, bo tvorba melanina pospešena. Izmerjena absorpcija reakcijske mešanice je tako sorazmerna aktivnosti katehol oksidaze.

Pred meritvijo absorpcije po potrebi ekstrakte centrifugiramo. Po 3 ml ekstrakta nalijemo v

kiveto in izmerimo absorpcijo z Vernierjevim spektrofotometrom.

Zabeležimo rezultate in narišemo grafe odvisnosti absorpcije (aktivnosti) katehol oksidaze od temperature.

Vprašanja

1. Pri kateri temperaturi je bil encim najbolj aktiven?

2. Zakaj se temperaturni odvisnosti lipaze in katehol oksidate razlikujeta?


21

Onesnažila in rastline - rastlinski testi strupenostiMed različnimi onesnažili, ki se pogosto pojavljajo in kopičijo v okolju so tudi herbicidi. Herbicidi so skupina snovi, s katerimi človek zatira nezaželen rastline (plevele). Z uvajanjem monokultur je človek močno pripomogel k širjenju in razmahu plevelov, bolezni in škodljivcev, kar je seveda vodilo do potrebe po razvoju sredstev za njihovo zatiranje. Prvi pesticidi so bile anorganske snovi, ki so jih prvič uporabili sredi 19. stoletja, ko sta evropske vinograde napadli pepelasta plesen in peronospora.

Herbicidi so snovi, ki v rastlinah povzročajo različne fiziološke in morfološke spremembe, ki zavirajo rast in razvoj rastline ali pa vodijo celo v smrt rastline.

Obseg delovanja herbicidovPo obsegu delovanja delimo herbicide na totalne in selektivne:

• totalni herbicidi uničijo vse rastline ali vsaj zelo veliko število rastlinskih vrst;

• selektivni herbicidi pa uničijo le nekatere rastlinske vrste (Slika 9).

Selektivnost temelji na morfoloških in fizioloških razlikah med vrstami rastlin: debelina in struktura kutikule in epidermisa, velikost listov, tarčne molekule (nanje se herbicid veže), sprejem in transport herbicida po rastlini, razgradnja herbicida. Pomembna za delovanje herbicida je tudi njegov odmerek herbicida, ki deluje na rastlino (herbicidi lahko v manjših količinah delujejo kot selektivni, pri večjih pa kot totalni).

Hormonski herbicidi in 2,4 D

Hormonske herbicide predstavljajo snovi, ki v fizioloških koncentracijah delujejo podobno kot avksini. V povišanih koncentracijah pa so ti učinki še bolj pudarjeni oz. pretirani. Posledice so lahko:

neškropljene rastline škropljene rastline

selektiven herbicid je uničil širokolistni (dvokaličniški) plevel, ni pa prizadel

enokaličnic

SLIKA 9. Shematični prikaz selektivnosti herbicidov.


22

abnormalno pospeševanje sinteze DNA, RNA, proteinov, sledijo lahko pretirane celične delitve v meristemih, nepravilne celične delitve, itd. Pod vplivom herbicida se močno poveča produkcija etilena, kar povzroča motnje polarnosti, odebeljevanje in venenje poganjkov, abscizijo listov. Pomembna skupina hormonskih herbicidov so derivati fenoksikarboksilnih kislin, med katere

štejemo 2,4-D (2,4-diklorfenoksiocetna kislina), 2,4,5-T (2,4,5-triklorfenoksiocetna kislina) in MCPA (4-klor-o-tolil oksiocetna kislina). 2,4-D je sistemski herbicid, ki v zmernih koncentracijah povzroča močno sintezo etilena v dvokaličnicah, v visokih koncentracijah pa je toksičen tudi za enokaličnice.

▌Vaja: Rastlinski test strupenosti

Material

mlade rastline sončnice, epruvete, pipete, destilirana voda, herbicid: ___________________, pršilka

Izvedba

Rastline pregledamo in odstranimo slabše rastoče rastline. Sestavimo 6 skupin rastlin. V vsaki skupini preštejte število vzklitih rastlin. Ena skupina je

kontrolna, druge pa bomo tretirali z naslednjimi koncentracijami herbicidov:

• s priporočeno koncentracijo,

• z 10-kratno koncentracijo priporočene konc.,

• s 5-kratno koncentracijo priporočene konc.,

• s 5-kratno redčitvijo priporočene konc.,

• z 10-kratno redčitvijo priporočene konc.

SLIKA 10. Shematični prikaz delovanja herbicida 2,4 D na fiziologijo rastline.


23

OBVEZNO UPORABLJAJTE ROKAVICE!! Herbicid raztopimo v vodi tako, da dobimo navedene koncentracije. Rastline tretiramo s herbicidom in jih prenesemo v rastne komore. Po tretiranju v razmiku dni in tednov opazujemo pojavljanje simptomov in smrtnost med rastlinami. Po treh tednih preštejemo število preživelih rastlin in jih

vzamemo polovico rastlin iz lončkov, odstranimo zemljo ter jih stehtamo. Na podlagi dobljenih ocen smrtnosti v posameznih skupinah poskusimo določiti 50% letalno koncentracijo (LC50) in ugotoviti razlike v priraščanju biomase na podlagi primerjave svežih.

▌Vaja: Določanje vsebnosti asimilacijskih barvil

Material

listi sončnice in koruze, kremenčev pesek, metanol, 25% HCl, terilnica, centrifugirke, 20ml epruvete, stojalo za epruvete, merilni valj, nuča, filter papir, centrifuga, spektrofotometer

Ekstrakcija in določitev vsebnosti asimi-lacijskih barvil

Vzamemo 1 g sveže mase materiala in ga stremo v terilnici z dodatkom (za noževo konico) kremenčevega peska. Vzorce tremo najprej na suho in nato v 10 ml 100% na 4 oC ohlajenega metanola, dokler ne postanejo homogeni. Ekstrakt

nato prefiltriramo v merilni valj. Vzorce spiramo s svežim metanolom tako dolgo, da se metanol ob dodatku v terilnico ne obarva več zeleno. Po končanem spiranju odčitamo volumen ekstrakta v merilnem valju. Ekstrakt razdelimo v dve centrifugirki (približno 10 ml) in centrifugiramo 5-10 minut pri 4200 obratih. Absorpcije ekstraktov izmerimo na spektrofotometru pri valovnih dolžinah 665, 652 in 470 nm. Na podlagi absorpcij s pomočjo spodnjih formul izračunajte koncentracijo klorofilov (v mg pigmenta/g sveže mase lista).

Formule za izračunavanje koncentracije pigmentov:

!"#$#%&" ! =16,72 ∗ !665 − 9,16 ∗ !652 ∗ !!"#$%& [!"]

!"#$% !"#" ! ∗ 1000

!"#$#%&" ! =34,09 ∗ !652 − 15,28 ∗ !665 ∗ !!"#$%& [!"]

!"#$% !"#" ! ∗ 1000

!"#$%& !!"#"$%!! =1,44 ∗ !665 + 24,93 ∗ !652 ∗ !!"#$%& [!"]

!"#$% !"#" ! ∗ 1000

Tabela 12. Masa poganjkov pri _____________ redčitvi herbicida:

Sončnica KoruzaMasa poganjkovŠtevilo rastlinPovprečna masa poganjka


24

Rezultati

V tabelo 12 vpišite število preživelih rastlin

in povprečno maso poganjkov. Nato izmerite koncentracijo klorofilov in rezultate vpišite v tabelo 14.

Graf 7. Smrtnosti kalic glede na koncentracijo uporabljenega herbicida. Vriši LC50.

Graf 8. Biomasa in koncentracije klorofilov kalic sončnice in koruze. Vriši EC50.


25

Tabela 13. Meritve absorpcij:

665 nm [A665] 652 nm [A652]123456Povprečje

Asimilacijsko barvilo Sončnica Koruzaklorofil aklorofil bskupni klorofili

Vprašanja

1. Kakšne razlike ste opazili med različnimi vzorci v preživetju rastlin?

2. Kakšne razlike ste opazili med različnimi vzorci v biomasi rastlin?

3. Kakšne razlike ste opazili med različnimi vzorci v koncentraciji klorofilov?

Tabela 14. Koncentracije asimilacijskih barvil (mg/g):


26

Asimilacijska barvilaV tilakoidnih membranah kloroplastov višjih rastlin lahko najdemo dve skupini asimilacijskih pigmentov: klorofile in karotenoide. Glede na funkcijo pri fotosintezi in izrabi svetlobe pa bi jih lahko razdelili na glavni asimilacijski pigment v reakcijskem centru (klorofil a) in antenske asimilacijske pigmente (preostali klorofili in karotenoidi). Pri nekaterih algah in cianobakterijah pa obstajajo še dodatni pigmenti – fikobiliproteidi.

KlorofiliSestavljeni so iz tetrapirolovega obroča na katerem je zaestren fitol. V obroč je vezan atom magnezija. Klorofili absorbirajo v rdečem in modrem delu vidnega spektra: klorofil a pri 430 in 660 nm, klorofil b pa pri 460 in 640 nm. Klorofil a je modrozelen, klorofil b pa rumenozelen. Podobna klorofiloma sta feofitin a in b, ki se od

klorofila a in b razlikujeta le po manjkajočem magnezijevem atomu. Poznamo še klorofil c in d. Pri klorofilu c ni fitolnega dela molekule in pri klorofilu d je vinilna skupina v porfirinskem obroču nadomeščena s formilno skupino.

KarotenoidiKarotenoidi so kemično tetraterpeni, ki absorbirajo v modrem delu sprektra med 400 in 520 nm (imajo tipičen trojni vrh). Ločimo dve skupini: karotene (čisti ogljikovodiki) in ksantofile (derivati karotenov, ki vsebujejo kisik). Karoteni so rumene do rdeče barve. Med karoteni sta najpogostejša α- in β-karoten. Ksantofili so oksidacijski produkti karotenov in so najpogosteje rumenkasti. Najpogostejši ksantofili so zeaksantin, lutein, violaksantin, likopen, neoksantin, kriptoksantin,…

klorofil a

klorofil b

karotenoid

400

Valovna dolžina svetlobe (nm)

Abso

rban

ca

500 600 700

SLIKA 11. Absorpcijski spektri nekaterih asimilacijskih pigmentov višjih rastlin


27

Karotenoidi lahko sprejemajo energijo svetlobe in jo po mehanizmu induktivne resonance prenesejo na klorofil a. Poleg tega imajo tudi zaščitno funkcijo v primeru visokih intenzitet svetlobe. Takrat preko ksantofilnega cikla odvajajo odvečni NADPH2 iz fotosistema. V ciklu se violaksantina preko anteraksantina pretvori do zeaksantina z deepoksidacijo. Reakcija se aktivira, kadar pride do večjega zakisanja lumna tilakoid, zaradi porušenega razmerja med porabo ATP in možnostjo njegove sinteze. Poznamo štiri načine porabe eksitacijske energije, ki jo sprejmejo asimilacijski pigmenti: a) vezava energije v končne produkte fotosinteze, b) poraba v metabolnih procesih, ki onemogočijo kopičenje energije, c) emisija svetlobe (fluorescenca) in d) pretvorba svetlobne energije v toploto.

V tilakoidni membrani, kjer so pigmentne molekule nameščene tesno ena zraven druge,

se energije z antenskih molekul prenese na klorofil a v reakcijskem centru, pri čemer se vzbudi elektron. Vzbujeni elektroni preidejo na akceptorje, ki so nameščeni ob reakcijskem centru. Če stika med klorofilom a in akceptorskimi molekulami ni, klorofil odda vsaj del energije (3–4 %) preko fluorescence (670 nm pri klorofilu a in 650 nm pri klorofilu b) in vzbujeni elektron se vrne v osnovno stanje.

FikobiliniPo kemični naravi imajo fikobilini 4 linearno razporejene pirolove obroče. V celicah so vezani na proteinski del in tvorijo fikobiliproteide. Fikocianin je moder, fikoeritrin pa rdeč. Absorbirajo v zelenem in rumenem delu sprektra. Vsi so vodotopni. Vsebujejo jih cianobakterije in rdeče alge.

▌Vaja: Absorpcijski spektri asimilacijskih barvil

Material

listi različnih rastlin, terilnica, 250ml erlenmajerica, 250ml čaša, presesalna erlenmajerica z Büchnerjevim lijem, filtrirni papir, 4 5ml pipete, 10 in 100ml menzure, plošča za tankoplastno kromatografijo (Silikagel G 250), komora za razvijanje, sušilnik za plošče, priprava za nanašanje gela, eksikator, rotavapor, centrifuga, centrifugirke, stojalo za centrifugirke, lopatica za odstranjevanje gela s plošče, UV-svetilka, spektrofotometer

Priprava plošč za tankoplastno kromato-grafijo

30 g silikagela zmešamo s 60 ml destilirane vode v 250 ml erlenmajerici in ga nanesemo na plošče v

250μm plast. Plošče aktiviramo 30 minut v komori in jih do uporabe shranimo v eksikatorju.

Priprava ekstrakta

2 g listov stremo v terilnici in jih ekstrahiramo s 25 ml hladnega (4 oC) acetona. Ko se ekstrakt obarva temnozeleno, mu dodamo malo Na2SO4, da odstranimo vodo. Filtriramo skozi Büchnerjev lij. Filtrat evaporiramo na rotavaporju in suhe pigmente raztopimo v 1 ml kloroforma.

Ločitev asimilacijskih pigmentov in mer-itev njihovih absorpcijskih spektrov

Na kromatografski plošči označimo začetek 3 cm od roba, 10 cm od starta zarežemo v silikagel in tako označimo fronto. Enako naredimo na obeh


28

straneh plošče 1,5 cm od roba. Z 0.1ml pipeto nanjo nanesemo 0,5 ml ekstrakta v ravni črti. Ploščo razvijemo v mešanici heksan : dieter : aceton (6 : 3 : 2). Izračunamo retenzijski faktor (Rf) posameznih pigmentov in pogledamo flourescenco pod UV-svetlobo.

S plošče odstranimo gel, ki vsebuje posamezno barvilo, v centrifugirko in mu dolijemo 5 ml metanola. Centrifugiramo 3 minute pri 1000 obratih na minuto. Odpipetiramo supernatant in izmerimo absorpcijo na spektrofotometru v območju med 400 in 700 nm.

Izračun retenzijskega faktorja:

d … razdalja, ki jo je prepotoval posamezen pigment

F … fronta topila

Rezultati

Kromatogram:

Barva pigmenta (vidna svetl.) Barva pigmenta (UV-luč) Rf


29

FotosintezaFotosintetsko aktivnost lahko merimo posredno preko izmenjave plinov (produkcije O2 ali porabe CO2).

Difuzija CO2 CO2 mora z difuzijo pripotovati v kloroplaste. Na poti se pojavljajo štiri ključne točke, ki jim pravimo točke upornosti. To so upornost mejne plasti zraka, stomatarna upornost, upornost intercelularnih prostorov in mezofilno upornost. Upornosti mejne plasti, intercelularnih prostorov in mezofilna upornost so precej majhne v primerjavi s stomatarno upornostjo (upornost intercelularnih prostorov povzroči padec parcialnega tlaka CO2 za 0,5 Pa – v primerjavi s 36 Pa izven lista).

Asimilacija CO2

Pri različnih predstavnikih rastlin obstaja nekaj razlik v asimilaciji CO2, vendar pri vseh poteka vezava CO2 preko Calvinovega cikla. Glede na razlike pa ločimo C-3, C-4 in CAM rastline.

C-3Kalvinov cikel poteka v treh stopnjah: karboksilaciji, redukciji in regeneraciji. V prvi stopnji se CO2 veže na ribulozo-1,5-bisfosfat. Ob vezavi molekula razpade na dve molekuli s 3 C-atomi: 5-fosfoglicerat. V drugi stopnji nastopi redukcija do gliceraldehid-3-fosfata, ki se porablja za regeneracijo ribuloze-1,5-bisfosfat in tvorbo saharoze oz. škroba.

Najpomembnejši encim pri asimilaciji CO2 je RuBiSCO, ki katalizira vezavo CO2 na ribulozo-1,5-bisfosfat.

C-4Ogljikov C-4 cikel predstavlja mehanizem za koncentriranje CO2. Proces poteka v dveh tipih celic in v štirih stopnjah. CO2 vstopa v mezofilne celice, kjer se veže na fosfoenolpiruvata (PEP) (reakcijo katalizira PEP-karboksilaza). Nastane kislina s 4 C-atomi, ki se transportira v celice žilnega ovoja. V teh celicah poteče dekarboksilacija in CO2 vstopi v Calvinov cikel. C-3 spojina pa se vrne v mezofilne celice, kjer se regenerira PEP.

Obstajajo tri različice ogljikovega C-4 cikla, ki se razlikujejo po spojinah, ki se transportirajo med celicami (C-4: malat ali aspartat, C-3: piruvat ali alanin), in po encimu, ki katalizira dekarboksilacijo C-4 spojine. Tako ločimo NADP-malatni encimski tip (najdemo pri koruzi in sladkornem trsu), NAD-malatni encimski tip in še PEP-karboksikinazni tip.

Ogljikov C-4 cikel se pojavlja pri eno- in dvokaličnicah v 16 družinah (predvsem v družinah Poaceae, Chenopodiaceae in Cyperaceae).

CAM – kisli metabolizem sočnicCAM je zelo podoben C-4 metabolizmu, vendar v njem posamezne stopnje med seboj niso ločene prostorsko, temveč časovno. Tako se ponoči CO2 veže na PEP, pri čemer nastane, preko oksalacetata, malat. Reakcijo vezave CO2 katalizira PEP-karboksilaza. Malat se skladišči v vakuoli v obliki jabolčne kisline. Na svetlobi se sprošča malata iz vakuole in iz malata CO2. CO2 vstopa v Calvinov cikel, preostanek malata (piruvat) pa se pretvori v škrob.

CAM ne najdemo samo v rastlinah družine Crassulaceae, temveč tudi pri kaktejah, mlečkih, agavi in ananasu. V rastlini Mesembryanthemum


30

crystallinum v nestresnih razmerah poteka C-3 metabolizem, če pa je rastlina izpostavljena vročini, suši in visokim koncentracijam soli pa preide na CAM metabolizem.

Omejitve mehanizmov za kon-centriranje CO2

V C-4 in CAM rastlinah karboksilacija pogosto poteka pri saturacijskih koncentracijah CO2. Poleg tega takšni mehanizmi omogočajo visoko intenziteto fotosinteze tudi v razmerah nizkih parcialnih tlakov CO2 v listu, zaradi česar se

znižuje izguba vode skozi odprte listne reže. C-4 metabolizem torej pomeni tudi učinkovitejšo izrabo vode in dušika (manj encima RuBiSCO) v primerjavi s C-3 metabolizmom. Na drugi strani pa nastajajo dodatni energijski stroški v obliki transportnih procesov, kar pomeni slabšo učinkovitost v izrabi svetlobe pri C-4.

Odpiranje listnih rež pri CAM-rastlinah le v nočnem času pomeni manjšo izgubo vode, v primerjavi s C-3 metabolizmom. Pojavi pa se problem omejenih možnosti skladiščenja jabolčne kisline v vakuoli.

▌Vaja: Poraba CO2 pri fotosintezi

Material

rastline vodne leče, steklenico za meritve izmenjave plinov, merilec ogljikovega dioksida, vmesnik LabPro, računalniški program LoggerPro

za analizo zajetih meritev

V steklenico natočimo 60 ml vode in dodamo 6 g vodne leče (vodne rastline stehtamo). Na odprtine namestimo merilec ogljikovega dioksida.

C3 CAM C4

CO2

CO2 CO2

C4 C4

CO2 CO2

glukoza glukoza glukoza

Kalvinov cikel

Kalvinov cikel

Kalvinov cikel

Ponoči

Podnevi

SLIKA 12. Shematična primerjava asimilacije CO2 pri C-3, C-4 in CAM rastlinah.


31

Čas meritve v programu naravnamo na 15 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na dva podatka/minuto. Zaženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje koncentracije CO2 v steklenici.

Steklenice osvetlimo z lučjo iz svetilke, pri tem namestimo med luč in steklenico rdeč, zelen filter ali moder filter. Eno meritev izvedemo z nefiltrirano svetlobo (bela svetloba).

Rezultati

V spodnjo tabelo vpišemo spremembo

koncentracije ogljikovega dioksida na enoto časa.

Vprašanja

1. Kako si razlagaš razlike v porabi CO2 pri uporabi različnih kvalitet svetlobe?

▌Vaja: Diurnalni kislinski cikel pri sukulentnih rastlinah

Material

listi sukulentnih rastlin (Bryophyllum sp., Kalanchoe sp., Sedum sp.), 0,01N KOH, pH-meter, fenolftalein, birete, stojalo za bireto, filtrirni papir, vodna črpalka, Büchnerjev lij, terilnica, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro, merilec pretoka, merilec pH

Izvedba

Iz rastline odstranimo 8 približno enako velikih listov. 4 liste postavimo v temo, 4 pa pod stalen vir svetlobe. Čez 24 urah liste stehtamo, razrežemo na majhne koščke in kuhamo 10 minut v 40 ml destilirane vode. Ekstrakt ohladimo in liste homogeniziramo v terilnici. Homogenatu dodamo 10 ml destilirane vode. Dobro premešamo in prefiltriramo.

Sedaj določimo pH filtrata in s titracijo določimo vsebnost kisline. Po meritvi pH razredčimo filtrat z 20 ml destilirane vode. Merilec pH in merilec pretoka povežemo z vmesnikom LabPro in zaženemo program LoggerPro. Gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na »nepretrgoma« (za pomoč pri nastavitvah gl. str. 7). Zeženemo zajemanje podatkov, odpremo bireto in uravnamo pretok na 2-3 kapljic/10 s ter spremljamo spreminjanje pH. Ko pH preide nevtralno območje (pH 7.0), ustavimo pretok in zaključimo zajemanje podatkov. Na diagramu preberemo količino porabljenega KOH do točke, ko je prišlo do preskoka pH.

Rezultati

S pomočjo spodnje formule izračunajte koncentracijo malata in rezultate vpišite v tabelo

Tabela 15. Sprememba koncentracije CO2

Kvaliteta svetlobe Sprememba konc. CO2

BelaRdečaZelenaModra

Tabela 16. Rezultati meritev pH in vsebnost jabolčne kisline.

Listi Masa (g) Vrednost pH Kislina (ml/mg)na svetlobiv temi


32

na prejšnji strani:

Upoštevajte V KOH, ki bi ga porabili za celoten V ekstrakta.

Vprašanja:

1. Vsebnost katere kisline smo določali pri tej vaji?

2. Ali misliš, se zaradi višanja koncentracije CO2 v ozračju lahko izenačile kompetativne sposobnosti C-3, C-4 in CAM-rastlin, ali so prisotni tudi drugi kompetativni pritiski?

▌Vaja: Kranz anatomija

Material

prezi listov enokaličnic s C4 in C4 metabolizmom, miskroskop, program za analizo slike ImageJ

Izvedba

Preglejte preparate in locirajte položaj prevajalnih tkiv. Analizirajte celike, ki obdajajo prevajalna tkiva (c. žilnega ovoja) in jih primerjajte z mezofilnimi celicami. Zapišite si tudi vse opažene razlike med kloroplasti, ki jih opazite med obema preparatoma.

Analiza slike

V programu ImageJ odpremo sliko in narišemo ravno črto od zgornje do spodnje povrhnjice lista (kar ustreza 0,15 mm). V meniju «Analyze» izberemo «Set Scale» in vpišemo pod «Known distance» ustrezno dolžino (v našem primeru 0.15). S tem smo kalibrirali sliko. Na sliki sedaj orodjem «Freehand selection» obkrožimo celice žilnega ovoja in stisnemo Ctrl+M, s čimer opravimo meritev površine. Meritev ponovimo na 10 celicah in jih vpišemo v tabelo z rezultati. Nato serijo meritev ponovimo še za drugo rastlino.

Skice

Tabela 17. Površina celic ob

Meritev P celic pri C4 rastlini

P celic pri C3 rastlino

12345678910povprečje

𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀[𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑔𝑔 ] = 𝑉𝑉!"#[𝑙𝑙] ∗

0,01𝑀𝑀2 ∗𝑚𝑚[𝑔𝑔]


33

▌Vaja: Hillova reakcija

Material

listi špinače, 0,5 M raztopina saharoze, raztopina DCPIP (1 mg/ml), 1 mM K-fosfatni pufer (pH 8,0), 10 mM raztopina DCMU (naprej raztopimo v etanolu, nato pa pripravimo suspenzijo v vodi)

Priprava suspenzije kloroplastov

Pripravimo si led, s katerim bomo hladili terilnico. Prav tako na led postavimo 100 ml centrifugirko in merilne valje, ki jih bomo potrebovali med izolacijo kloroplastov. Listom špinače odstranimo osrednjo listno žilo in natehtamo 10 g materiala. Liste nato narežemo na majhne koščke in jih stremo ob dodatku 20 ml hladne 0,5 M raztopine saharoze. Homogenat prefiltriramo preko dveh plasti gaze in ga prenesemo v ohlajen 100-ml

merilni valj.

Prefiltriran ekstrakt razdelimo med dve centrifugirke in ga 1 min centrifugiramo pri 500 g pri 2-4°C. Supernatant previdno prenesmo v sveže centrifugirke in ponovno centrifugiramo (10 min, 1000 g). Supernatant odlijemo, usedlino pa resuspendiramo v 10 ml 0,5 M raztopine saharoze in prenesemo na led.

Kvantitativna Hillova reakcija

Za meritev poteka hitrosti elektronskega transporta prenesemo 1 ml suspenzije kloroplastov v epruveto z 9 ml 0,5 M saharoze in 0,5 ml raztopine DCPIP. Pripravimo pet epruvet in jih označimo kot: bela, rdeča, modra, zelena in tema. Epruvete potem prenesemo na ustrezne

C4 enokaličnica C3 enokaličnica

Prerezi listov:

Tabela 18. Absorpcija reakcijske mešanice glede na osvetlitev.

Osvetlitev

Absorpcija0 min 5 min 10 min 15 min 20 min

BelaRdečaModraZelenaTema


34

osvetlitve oz. v temo. Naslednjih 20 min v razmiku po 5 min merimo absorpcijo pri 600 nm in vrednosti vpišemo v spodnjo tabelo 18.

Graf 9. Odvisnost absorpcije reakcijske mešanice od kvalitete in časa osvetlitve.


35

FlavonoidiFlavonoidi so barvila, ki rastlinske cvetove in plodove obarvajo rdeče, modro, rožnato, vijolično ali rumeno. Prisotni so tudi v listih. Večinoma se skladiščijo v vakuolah. Kemično spadajo v veliko skupino vodotopnih polifenolov, nastopajo pa večinoma kot glikozidi. Osnova za aglikon je flavanova struktura, nanjo pa se veže različno število hidroksilnih (lahko pa tudi metoksi-) skupin. Sintetizirajo se po šikimatni (most iz treh ogljikovih atomov in en aromatski obroč) in malonatni poti (drugi aromatski obroč).

Antociani So modra do rdeča barvila, aglikon je antocianidin. Barva spojine je odvisna od: osnovne strukture antocianidina, to je od števila in položaja hidroksilnih skupin na B-obroču (gl. sliko 7); pH: v kislem okolju so rdeči, v bazičnem se njihova barva pomakne proti modri; kelacije s kovinskimi ioni: kelati so modri; kopigmentacije z drugimi flavonoidi in galotanini; števila vezanih sladkornih molekul: vpliva večinoma le na barvni odtenek.

Flavoni in flavonoli So večinoma brezbarvni; če so metilirani, so rumeni. Prisotni so tudi v plodovih, v vsakem primeru pa prispevajo le malo barve (ponavadi absorbirajo pri krajših valovnih dolžinah svetlobe).

SLIKA 16. Struktura flavononov (zgoraj) in flavonolov (spodaj).

Opazneje so prisotni v cvetovih vrst Lathyrus pratensis, Antirrhinum spp., Tagetes spp.,

CC

C

OH

OH

OH

HO O

CC

C

OH

OH

OH

HO O

SLIKA 13. Flavonoidni skelet

Flavonoidi so pomembni za opraševalce cvetov in raznašalce semen. Flavonoli ob obsevanju z UV-svetlobo fluorescirajo vijolično do modro. Antociani imajo poleg tega tudi zaščitno funkcijo: absorpcija svetlobe v antocianskih molekulah in odvajanje odvečne energije iz sistema pomeni za občutljivejše organske molekule zaščito pred fotodestrukcijo. Učinek je še posebej opazen pri kalicah in mladih delih rastlin.

Funkcija

SLIKA 14. Struktura antocianov

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

HO O

O

O

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

HO O

O

O


36

Calendula officinalis (v zadnjem primeru večino barve dajejo karotenoidi). Opazna je šibka reakcija na pH – v bazičnem se obarvajo intenzivneje rumeno. Njihovi funkciji sta predvsem tvorba

medokazov (opraševanje) in absorpcija UV-B svetlobe (zaščita).

▌Vaja: Antociani

Material

»rdeča« čebula (Allium cepa), listi rdečega zelja (Brassica oleracea var. capitata), plodovi navadne kaline (Ligustrum vulgare), rdeče in modro cvetje (Cyclamen, Iris, Rosa, Dianthus, Hydrangea, Pulmonaria, ...), rdeča pesa (Beta vulgaris), 6 epruvet, 100ml čaša, skalpel, petrijevke, mikroskop s priborom, HCl, NH3, 10% FeCl3, pufri pH 2, 4, 6, 8, 10

Izvedba

S kuhanjem rastlinskega material pripravimo vodni ekstrakt, ki je zaradi visoke vsebnosti rastlinskih barvil intenzivno obarvan. Ekstrakt razdelimo v 6 epruvet (2ml/epruveto). V posamezne epruvete dolijemo 2 ml pufra oz. drugega reagenta iz spodnje tabele. Opazujemo spreminjanje barve in zapišemo opažanja.

pelargonidin cianidin delfinidin

v cvetovih rodov Rosa, Pulmonaria, Centaurea; v plodovih – jabolka, češnje, maline, rdeči ribez; v listih (tudi v rdečem zelju) obstaja cianidin-3-glukozid;

v cvetovih rodov Delphinium, Malva; v plodovih jajčevca.

v cvetovih rodov Pelargonia, Papaver, Dahlia; v plodovih jagode;

SLIKA 15. Odvisnost barve antocianov od njihove strukture.


37

Vprašanja

1. Ali se ekstrakti barvil razlikujejo med seboj glede na spremembo barve ob dodatku pufrov in reagentov? Zakaj?

▌Vaja: Ločitev flavonoidov s tankoplastno kromatografijo

Material

modri in rumeni cvetovi (Dianthus, Antirrhinum, Rosa, Iris, Lysianthus ...), terilnica, petrijevka Φ 15–25 cm, petrijevka Φ 4 cm, filtrirni papir, spatula, centrifuga, centrifugirke, UV-svetilka, 1% HCl v etanolu, 1% HCl v metanolu, n-butanol, ocetna kislina, kivete, spektrofotometer, celuloza za kromatografijo, silikagel G 250, plošče za kromatografijo

Izvedba

Za pripravo plošč za tankoplastno kromatografijo mešamo 10 g celuloze in 4 g silikagela H v 80 ml destilirane vode. Mešanica zadostuje za pripravo 5 plošč (20 x 20 cm) za tankoplastno kromatografijo debeline 250 μm. Plošče aktiviramo pri 40 °C preko noči.

Ekstrakt pigmentov pripravimo iz 1 g svežega rastlinskega materiala, ki ga stremo v terilnici ob dodatku 3 ml 1% HCl v 95% etanolu. Homogenat prefiltriramo skozi Büchnerjev lij in skoncentriramo na rotavaporju. Filtrat lahko do uporabe shranimo v hladilniku.

Pred začetkom kromatografije pripravimo kromatografske plošče: na kromatografski plošči označimo začetek 3 cm od roba, 10 cm od začetka zarežemo v silikagel in tako označimo fronto. Enako naredimo na obeh straneh plošče 1,5 cm od roba. Z 0,1ml pipeto nanesemo 0,1 ml ekstrakta (točkovno). Ploščo razvijemo v mešanici n-butanol : ocetna kislina : voda (5 : 1 : 4). Izračunamo vrednosti Rf posameznih pigmentov in si ogledamo flourescenco pod UV-svetlobo. S pomočjo spodnje tabele določimo prisotnost in Rf posamezne skupine antocianov.

S plošče odstranimo gel, ki vsebuje posamezen pigment, v centrifugirko in mu dolijemo 5 ml 1% HCl v metanolu. Centrifugiramo 3 minute pri 1000 obratih na minuto. Odpipetiramo supernatant in s spektrofotometrom izmerimo absorpcijo v območju med 400 in 700 nm.

Rezultati

S pomočjo tabele 18 določite skupine pigmentov, ki ste jih opazili na svojih kromatogramih.

Tabela 19. Sprememba barve ekstraktov ob dodatku pufrov in FeCl3.

Tretma Sprememba barveDodamo pufer s pH 2

468

10Dodamo FeCl3


38

Askorbinska kislinaAskorbinska kislina je ogljikovim hidratom sorodna spojina, ki se sintetizira iz glukuronske kisline. Zaradi dveh hidroksilnih skupin ob dvojni vezi je reducent – eden od najmočnejših v celici. V celični presnovi deluje v oksidoredukcijskih procesih kot donor H (pri sintezi nekaterih aminokislin, v askorbinsko-glutationski dihalni verigi, v katalizi fotofosforilacije; pospeševanje delovanja vitamina B9), pri čemer se reverzibilno oksidira v dehidroaskorbinsko kislino. Lahko je vezana na proteine kot askorbigen.

Askorbinska kislina je v vsaki rastlinski celici, v posebej visokih koncentracijah je prisotna v zelenih delih rastline in v plodovih. Koncentracije

so višje v sončnih delih rastline (listi na prisojni strani drevesa, plodovi na zunanji, proti soncu obrnjeni strani oz. tik pod povrhnjico).

Kot močan reducent je askorbinska kislina občutljiva za kisik, na svetlobi in pri visoki temperaturi hitro oksidira. Ekstrahiramo jo s kislino, ker je spojina v kislem okolju obstojneša, poleg tega pa z nizkim pH izključimo naravne oksidaze ter imobiliziramo druge reducente, ki bi vplivali na poznejšo titracijo.

Tabela 20. Barve in absorpcijski vrhovi nekaterih flavonoidov


39

▌Vaja: Določanje vsebnosti askorbinske kisline

Material

etiolirane in neetiolirane rastline fižola (Phaseolus vulgaris), različno sadje in zelenjava, različno stare kalice koruze (Zea mays), terilnica, skalpel, 2 in 10ml pipete, 25 in 50ml erlenmajerice, 10, 50 in 100ml menzure, 50ml čaša, lij, vata, bireta, tehtnica, 2,6-diklorfenol indofenol (100 mg barvila raztopimo v 500 ml vode, zavremo in še vročo raztopino prefiltriramo v temno steklenico; do 1 tedna jo hranimo v hladilniku.), 2% metafosforna kislina, 0,05% askorbinska kislina v metafosforni kislini

Izvedba

Askorbinsko kislino določamo s titracijo z barvilom 2,6-diklorindofenol, ki askorbinsko kislino oksidira in se pri tem razbarva. Barvilo 2,6-diklorfenol indofenol je v raztopini neobstojna spojina, zato uporabljamo čim bolj svežega. Vodna raztopina je temno modre barve; pri titraciji se (zaradi kislega pH) obarva rdeče, nato pa se zaradi redukcije z askorbinsko kislino takoj razbarva. Takoj ko začne rožnata barva zastajati, nehamo titrirati; počasno razbarvanje je posledica reakcije z drugimi snovmi.

Ločimo dele rastline (listi, steblo, korenine). Vsaka skupina rastlinskih organov naj tehta 15 g. Rastlinski material s skalpelom razrežemo in stremo v terilnici. Odmerimo 60 ml 2% metafosforne kisline in jo dodajamo vzorcu. Homogenat skozi tankega sloja vate prefiltriramo v 100ml merilni valj, ostanek na vati pa speremo z 2% metafosforno kislino tako, da filtrat dopolnimo do 100 ml.

Nato določimo titer barvila 2,6-diklorfenol indofenol. 2 ml standardne raztopine askorbinske kisline v metafosforni kislini (vsebuje natanko

1 mg askorbinske kisline) titriramo z barvilom. Barvilo se zaradi nizkega pH vzorca najprej obarva rdeče, nato pa se zaradi redukcije razbarva. Ko začne rožnata barva zastajati, titracijo končamo. Titriramo trikrat in izračunamo srednjo vrednost.

Nato titriramo še 10 ml vzorca. Titracijo ponovimo najmanj trikrat, pred vsakim odvzemom pa vzorec vsakokrat dobro premešamo.

S pomočjo titra barvila izračunamo vsebnost askorbinske kisline v titriranem vzorcu. To preračunamo na začetnih 100 ml ekstrakta ter na maso rastlinskega materiala:

x = vsebnost askorbinske kisline v rastlinskem materialu (mg/g)

a = srednji titer barvila (ml/mg)

b = srednji titer 10 ml vzorca (ml)

m = masa rastlinskega vzorca (g)

Objekt:

masa (g):

titri barvila (ml/mg):

titri 10 ml ekstrakta (ml):


40

Celica

Vodni potencial celiceVodni potencial nam pove, koliko je sistem (celica, vakuola, tla, raztopina, itd.) nasičen z vodo. Merimo ga v barih oz. MPa. Vrednost 0 barov je dogovorjena za vodo pri standardnih pogojih (298 K in 0,1013 MPa). Vodni potencial v drugih vodnih sistemih tako definiramo kot kvocient razlike med kemijskimi potenciali čiste vode in našega sistema ter parcialnim molskim volumnom vode v sistemu.

Nižje vrednosti vodnega potenciala pomenijo večjo afiniteto sistema do privzemanja vode. Iz definicije je razvidno, da imajo rastlinske celice in tkiva lahko le negativen vodni potencial oz. vodni potencial kvečjemu enak 0 barov.

Če dva sistema ločimo s polprepustno membrano, voda prehaja iz sistema z višjim vodnim potencialom v tistega z nižjim.

Vodni potencial je sestavljen iz treh komponent: osmotskega potenciala, potenciala matriksa in potenciala tlaka.

Osmotski potencial pove, kakšen je učinek topljencev na vodni potencial sistema. Po definiciji je vodni potencial čiste vode enak 0, torej bo v raztopini osmotski potencial negativen.

V idealni (zelo razredčeni raztopini) raztopini neelektrolita lahko vodni potencial kar enačimo z osmotskim, medtem ko moramo v raztopini elektrolita upoštevati tudi disociacijo topljenca, ki osmotski potencial poveča za faktor i (izosmotska konstanta).

Rastline oz. celice lahko svoj vodni potencial spreminjajo s pomočjo spreminjanja koncentracij raztopljenih snovi v vakouli (sladkorji, aminokisline …).

Potencial matriksa je posledica vezave vode na makromolekule. Makromolekule v celici in izven nje (celična stena) lahko vežejo hidratacijsko in kapilarno vodo. Potencial matriksa se uporablja za

Tabela 21. Vsebnost askorbinske kisline (mg/g):

Material Vsebnost askorbinske kislineetiolirani neetiolirani

lististeblosadje:

zelenjava:


41

izražanje zmanjševanja proste energije vode, če se ta nahaja v izredno tankem sloju (1–2 molekuli), adsorbiranem na delce suhe prsti, celične stene … Njegov vpliv na vodni potencial celice je majhen, zato se pri opisu vodnega potenciala ponavadi opušča. Velik pa je njegov pomen v celičnih stenah in pri nabrekanju suhih semen (to je povsem fizikalen pojav).

Potencial tlaka predstavlja hidrostatski tlak tekočine. Pozitivni tlak poviša vodni potencial, negativni pa ga znižuje. V primeru rastlinske celice je ponavadi mišljen pozitivni potencial znotraj celice, ki ga imenujemo stenski tlak ali turgor. Negativni potencial tlaka se lahko pojavi v ksilemu ali med celičnimi stenami. Imenujemo ga tenzija. Negativni potencial tlaka je zelo pomemben za transport vode po rastlini (na velike razdalje).

Za celico v izoosmotski raztopini velja, da je vodni potencial celice enak potencialu raztopine (celica je turgescentna). Iz poenostavljene oblike zapisa enačbe vodnega potenciala sledi, da sta si potencial tlaka in osmotski potencial nasprotno

enaka …

Če celico postavimo v hipotonično raztopino, bo voda vdrla v celico in naprej v vakoulo. Posledica je povečanje mase celice. Če pa celico postavimo v hipertonično okolje, bo prišlo do oddajanja vode iz celice v okolje. Posledica je krčenje vakoule in izguba mase celice oz. njenega volumna.

Omenjene pojave lahko uporabimo za merjenja vodnega in osmotskega potenciala celic. Za merjenje vodnega potenciala celic ali tkiv postavimo celice v serijo raztopin z različnimi koncentracijami. V raztopini, v kateri se masa celic ne spremeni, sta vodna potenciala izenačena. Osmotski potencial celice pa merimo tako, da opazujemo, v kateri raztopini nastopila mejna plazmoliza. Ta se pojavi, ko celica izgubi ravno tolikšno količino vode, da plazmalema odstopi od celične stene. Ob nastopu mejne plazmolize je potencial tlaka v celici skoraj enak 0, ker protoplast že odstopa od stene, in iz enačbe sledi, da je vodni potencial celice tedaj enak osmotskemu potencialu celice oz. osmotskemu potencialu raztopine.

▌Vaja: Vodni potencial celice

Material

gomolji krompirja in repe, plutovrt premera 5 mm, skalpel, milimetrsko merilo, tehtnica, epruvete, papirnate brisače, raztopine KNO3 ali saharoze 0,00, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,60 m

Izvedba

V epruvete nalijemo serijo koncentracij raztopin KNO3 ali saharoze. S plutovrtom izrežemo iz gomolja natanko 4 cm dolge valje. Natančno jih stehtamo in potopimo v raztopine.

Po eni do dveh urah inkubacije raztopine odlijemo, koščke narahlo obrišemo s papirnato brisačo in jih stehtamo. Za vsako koncentracijo raztopine izračunamo odstotek spremembe v masi (s):

mz = masa na začetku; mk = masa na koncu

Rezultate vnesemo v graf in odčitamo točko, pri kateri je sprememba mase enaka 0. Pri tej koncentraciji osmotika sta vodna potenciala tkiva


42

in raztopine enaka. Vodni potencial raztopine, ki je v tem primeru enak njenemu osmotskemu potencialu, izračunamo po formuli za ozmotski potencial, pri čemer uporabi za saharozo i = 1, za KNO3 i = 1.69 in za R (splošna plinska konstanta) = 0,083 bar l mol–1 K–1

Rezultati

Objekt:

Ozmotik:

Koncentracija osmotika, v kateri se masa ne spremeni:

Vodni potencial Ψ =

Vprašanja

1. Osmotski potencial je odvisen od števila

delcev, ki jih topljenec tvori v raztopini. Kako bo uporaba KNO3 in saharoze vplivala na izračun osmotskega potenciala?

2. Od katerih faktorjev je odvisen transport (tok) vode skozi plazmaleme v celico in iz nje? Ali bi znal zapisati enačbo?

3. Če opazuješ stolpce vode v ksilemskem tkivu, kateri dodatni faktor (poleg navedenih v teoriji) še vpliva na transport vode? Kaj to pomeni za rastlino?

Tabela 22. Sprememba mase tkiva.

Koncentracija plazmolitika (m)

Začetna masa (g) Končna masa (g) Sprememba (g) % spremembe

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,500,60

Tabela 23. Rezulati vseh skupin

Objekt Ozmolitik Ψ

Repa KNO3

saharozaKrompir KNO3

saharoza


43

Transpiracija Rastline lahko sprejemajo vodo na dva načina: z nabrekanjem in z osmozo. Pri višjih rastlinah je, za razliko od steljčnic, ki lahko vodo sprejemajo s celotno površino, privzem vode omejen na specializirane organe – korenine.

Rastlina lahko sprejme vodo,če je vodni potencial korenine nižji od vodnega potenciala tal. Rastlina aktivno včrpava ione v korenine, kar znižuje osmotski potencial korenine in omogoči pasivno vstopanje vode vanjo. Voda vstopa v korenine skozi koreninske laske.

Transpiracija je izparevanje vode iz listov skozi listne reže. Nastopa vedno, kadar zrak ni nasičen z vodno paro (potreben je torej neki saturacijski deficit). Voda pride v list s ksilemskim tokom, difundira v intercelularje in skozi listne reže ali površino lista (evaporacija!) v atmosfero. Razlika med vodnima potencialoma intercelularjev in atmosfere lahko znaša celo 100 MPa. Večji del vode rastlina izgubi skozi listne reže. Izgubo vode preko listnih rež lahko rastlina regulira. Če so odprte vse listne reže, znaša njihova skupna

površina približno 1–2 % listne površine. Listne reže so lahko različno razporejene. Pri mnogih rastlinah so nameščene samo spodaj (listopadno drevje), lahko pa so tudi samo na zgornji strani

Predpostavi, da sta osmotski potencial celice A –1,6 MPa in potencial tlaka +1,0 MPa. Ozmotski potencial celice in potecial tlaka celice B pa –1,0 in +0,6 MPa. Odgovori na naslednja vprašanja:

1. Kakšen je vodni potencial celice A?

2. Kakšen je vodni potencial celice B?

3. Če bi se obe celici stikali, kam bi se premikala voda?

4. Kakšen bo vodni potencial obeh celic, ko bosta dosegli ravnovesje?

5. Predpostavi, da v nobeni izmed obeh celic ne bo prišlo do premikanja raztopljenih snovi. Kakšen bo potencial tlaka v obeh celicah?

Računanje

veter

temperatura

površina lista

odprtost listnih rež

SLIKA 17. Dejavniki, ki vplivajo na hitrost transpiracije.


44

(plavajoči listi) ali pa na obeh straneh lista.

Rastlina pa lahko vodo izgublja tudi skozi listno površino, ki nima listnih rež (kutikularna

transpiracija). Tega dela izgube vode rastlina ne more nadzorovati. Veliko rastlin je razvilo strukture, ki omejujejo evaporacijo (trihomi, voščene prevleke,…).

▌Vaja: Merjenje intenzivnosti transpiracije

Material

listi ali mladi poganjki različnih rastlin, plastična cev, merilec pritiska, vmesnik LoggerPro, računalniški program LogerPro, digitalni fotoaparat ali optični čitalec, program ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)

Izvedba

Poganjke ali liste odrežemo pod vodo, da v žile ne vdre zrak in jih vtaknemo v plastično napolnjeno z vodo. Cev na delu z rastlino zatesnimo z zažemko, drug konec pa pritrdimo na merilec pritiska. Pri tem pazimo, da voda ne vdre v merilec. Čas meritve v programu naravnamo na 30 min, gostoto zajemanja podatkov pa nastavimo na 1 podatek/min. Zaženemo zajemanje podatkov in spremljamo spreminjanje tlak v cevki (negativna sprememba tlaka je posledic transpiracije). Po zaključeni meritvi odčitamo spremembo tlaka v eni uri.

Meritve izvedemo v zaprti posodi s povečano vlažnostjo, pri sobnih pogojih in ob prepihavanju.

Za izmero transpiracijske površine liste položimo na milimetrski papir in fotografiramo z digitalnim fotoaparatom (postavljenim vzporedno s podlago!) ali skeniramo z optičnim čitalcem. Slike odpremo v programu ImageJ in jih umerimo tako, da z orodjem za črte označimo razdaljo 1 cm. Izberemo meni »Analyze > Set Scale« in pod »Known distance« vstavimo 1.0 (= označeni razdalji). Sedaj z orodjem za prostoročno risanje obkrožimo listne lamine in izberemo »Analyze > Measure«.

Intenzivnost trasnpiracije podamo kot spremembo tlaka na min na transpiracijsko površino (MPa min-1 cm-2).

Vprašanja

1. Kakšen je bil vpliv zračne vlažnosti na intenzivnost transpiracije? Razloži.

2. Kakšen je bil vpliv prepihavanja (vetra) na intenzivnost transpiracije? Razloži.

Tabela 24. Meritve transpiracije.

PogojiSobni Prepihavanje Visoka vlaga

sprememba tlakalistna površinatranspiracija


45

Mineralna prehrana rastlinRastlina potrebuje za normalno rast in razvoj številne elemente. Elementi brez katerih ne more skleniti življenjskega kroga, so označeni kot esencialni. Rastlina za normalno delovanje potrebuje določene vsebnosti hranil; ob

pomanjkanju kakšnega elementa lahko upade nivo tistih procesov, pri katerih ta element sodeluje. Podobno lahko previsoke koncentracije elementov v rastlini učinkujejo strupeno.

▌Vaja: Simptomi pomanjkanja mineralnih hranil

Material

Za izvedbo vaje potrebujemo nekaj dni stare kalice koruze (Zea mays) in sončnic (Helianthus annuus), 1000ml čaše, pokrovčki za čaše (4 luknje za kalice), zračna črpalka, cevi, deionizirana voda, popolna hranilna raztopina, pH meter

Priprava raztopin

Najprej pripravimo raztopino mikroelementov.

Nato pripravimo hranilne raztopine s padajočo koncentracijo fosforja.

Pomanjkanje Op,mum Prekomerne koncentracije

Esencialni element

Nestrupene koncentracije

Strupene koncentracije

Neesencialni element

Biom

asa rastline

Biom

asa rastline

Naraščajoče koncentracije elementa

Naraščajoče koncentracije elementa

SLIKA 7. Rast rastline glede na koncentracije elementov v tleh.

Tabela 8. Raztopina mikroelementov

Mikroelementi Molek. masa Založna razt. (mm) Založna razt. (g l–1)KCl 74.55 25 1.864H3BO3 61.83 12.5 0.773MnSO4

. H2O 169.01 1 0.169ZnSO4

. 7H2O 287.54 1 0.288CuSO4

. 5H2O 249.68 0.25 0.062Na2MoO4 241.95 0.25 0.06


46

Rezultati

Rastline stehtajte in izmerite njihovo višino. Zabeležite si tudi pojav simptomov pomanjkanja (kloroze, nekroze).

Vprašanja

1. Ali ste opazili kakšne razlike med simptomi pomanjkanja nutrientov med koruzo in sončnico? Zakaj?

Tretma Višina (cm) Masa (g) Simptomi100% P75% P50% P25% P0% P

Tabela 9. Sestava raztopin z različnimi koncentracijami fosforja.

Založna raztopina Volumen založne raztopine, ki jo dodamo 800 ml H2O (ml)100% 75% 50% 25% 0%

100 ml 0,5M Ca(NO3)2 4 4 4 4 4100 ml 0,5 M KNO3 4 4 4 4 4100 ml 0,5 M MgSO4 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6100 ml 0,5 M KH2PO4 0,8 0,6 0,4 0,2 040 ml FeNaEDTA 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8Mikroelementi 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8100 ml 0,5 M KCl 0 0,2 0,4 0,6 0,8

Tabela 10. Sestava raztopin z različnimi koncentracijami fosforja.


47

MikorizaTermin »mikoriza« je prvi uporabil Frank (1885) za opis mutualistične povezave med koreninami in glivnim micelijem. Mikorizo tvorijo predstavniki vseh glavnih taksonomskih skupin gliv: Glomeromycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina in Deuteromycotina. Navadno najdemo pri posameznih rastlinah le en tip mikorize, pri nekaterih rastlinah pa lahko najdemo tudi več tipov mikorize (pri rodovih Salix, Populus, Alnus in Eucalyptus).

Arbuskularna mikorizaZnačilnost arbuskularne mikorize so drevesaste strukture (arbuskuli) v celicah gostitelja, ki služijo izmenjavi snovi. Ob tvorbi arbuskula pride do invaginacije v gostiteljsko celico in do tvorbe novega kompartmenta apoplasta, preko katerega poteka vsa izmenjava snovi. Arbuskuli so funkcionalni do 15 dni.

Poleg arbuskulov lahko v koreninah najdemo še druge glivne strukture. Vezikli so lipidna telesa v

intercelularjih gostitelja, ki v glavnem služijo kot zaloga, lahko pa opravljajo tudi razmnoževalno funkcijo. Nespolne spore nastanejo z diferenciacijo vegetativnih hif gostitelja. Pri nekaterih vrstah (npr. Glomus intraradices) se spore dodatno zdebelijo in ločijo od preostalega dela hife v korenini, večinoma pa spore nastajajo v substratu izven korenine.

Glive, ki tvorijo arbuskularno mikorizo pripadaja redu Glomales. Predstavniki so obligatni simbionti in jih ni mogoče gojiti v aseptični kulturi. Za njihovo vzgojo je ponavadi uporablja rastline dojilje.

Arbuskularna mikoriza izboljša preskrbljenost rastline z različnimi nutrienti, predvsem s fosforjem. Mikoriza je tako favorizirana v razmerah, ko je rastlini dostopnega fosforja v naravi malo. Ob povišanju koncentracije zaradi gnojenja (NPK) lahko rastlini dostopni fosfor povsem zadosti potrebam rastline in simbioza ni več potrebna.

▌Vaja: Barvanje struktur arbuskularno mikoriznih glivOpazovanje arbuskularno mikoriznih glivnih struktur pod svetlobnim mikroskopom nam omogoča selektivno barvanje hitina, ki je sestavina celične stene simbiontske glive. Barvila so različnih tipov, najpogosteje se uporablja tripan modro, lahko pa uporabljamo tudi kisli fuksin, sudan in celo navadno tinto (črnilo). Pri barvanju moramo biti pozorni na strukturo koreninskega sistema in čas presvetlitve in barvanja temu primerno optimizirati.

Material

10% raztopina KOH, 5% raztopina tripan modrega

(0.5 g tripan blue, 500 ml glicerola, 450 ml dH2O, 50 ml HCl), epruvete, til, sušilnik, objektna in krovna stekelca, mikroskop

Koreninski sistem rastline operemo pod tekočo in destilirano vodo, ga narežemo na ~1 cm fragmente in položimo v 16 cm široke epruvete. Fragmente prelijemo z 10% KOH, epruveto prekrijemo s tilom, ki ga zatesnimo z elastiko. V sušilniku vzorce 30 min segrevamo pri 90°C, nato iz epruvet odlijemo KOH in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. V epruvete nato dolijemo barvilo in jih segrevamo v sušilniku 3 min pri 90°C. Nato barvilo odlijemo (uporabimo


48

ga lahko večkrat!) in koreninice 3-krat speremo pod tekočo vodo. Vzorce lahko v vodi hranimo v hladilniku.

Več 1-cm dolgih fragmentov korenin položimo vzporedno na objektno steklo in jih pokrijemo. Pod mikroskopom lahko dele gliv vidimo kot modro obarvane strukture.

Skice glivnih struktur

90°C 30 min

10% KOH

Preparat s fragmenti

90°C 3 min

5% črnilo v 5% ocetni kislini

10% KOH metil modro

preparat z obarvanimi koreninskimi fragmenti

90°C 30 min

90°C 3-5 min

SLIKA 8. Shematični prikaz barvanja in obarvanih glivnih struktur v koreninah.

Documents

Fiziologija rastlin za pedagoge