Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) -

lokalizacija molekularnih spektroskopskih informacij

s fluorescenčnim mikroskopom

Janez Štrancar

Laboratorij za biofiziko, IJS / CO NAMASTE

Zakaj je ta slika

netipčna za

navadno

mikroskopijo,

zakaj za

fluorescenčno

mikroskopijo?

Od mikroskopije do fluorescenčne mikroskopije

• Kontrast!

microscopy

fluorescence microscopy

Pojav fluorescence

3

Eksitacija in relaksacija

elektronskih stanj

Absorbcijski in emisijski spekter

Konfokalna fluorescenčna mikroskopija

• Optično rezinjenje!

– Eksitiramo eno optično

ravnino in

– Zajemamo svetlobe iz

ene optične ravnine!

fluorescence microscopy

fluorescent confocal microscopy

microscopy confocal microscopy

fluorescence microscopy microspectroscopy

Fluorescenčna mikrospektroskopija

lokalizacija prifiziol. pogojih

3D

kontroliranoozadje

spektralnoobčutljivadetekcija

Fluorescence microspectroscopy (FMS)

Iztok Urbančič FMS 7

EM

Liquid crystal

tunable filter

fluorescenca

konfokalna

mikroskopija

spektroskopija

Shema FMS

Elementi FMS

• primeren za opazovanje bioloških vzorcev v tekočini

• objektivi 10x, 40x, 100x (oljni in vodni imerzijski)

• motorizirana mizica (ravnina XY)

• motoriziran revolver objektivov (Z)

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Iztok Urbančič FMS 8

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Elementi FMS

• nazivna moč 300 W

• 4,5 W izsevane svetlobe, 500 mW v vidnem delu

• zvezen spekter od UV do NIR

• nadomešča nabor več laserjev

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Iztok Urbančič FMS 9

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Elementi FMS

Fluorescenčna enota

BD Carv II

nabor

• širokoprepustnih vzbujevalnih in izsevnih filtrov

• in dvobarvnih zrcal

Iztok Urbančič FMS 10

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Fluorescenčna enota

BD Carv II

Elementi FMS

Konfokalna enota

BD Carv II

Iztok Urbančič FMS 11

V primerjavi z laserskim skeniranjem:

• manj „bledenja fluorescence“

• neodvisnost pri izbiri fluorescenčnih barvil

Elementi FMS

TK nastavljivi filter

VariSpec

• spektralno območje 400–720 nm

• spektralna širina prepustnosti 10 nm

• korak 1 nm

• odzivni čas 50 ms

Iztok Urbančič FMS 12

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Fluorescenčna enota

BD Carv II

Konfokalna enota

BD Carv II

TK nastavljivi filter

VariSpec

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Fluorescenčna enota

BD Carv II

Konfokalna enota

BD Carv II

Elementi FMS

EMCCD kamera

QImaging Rolera Mgi+• ločljivost 512x512, velikost elementov 16 µm

• kvantni izkoristek > 90%

• hitrost snemanja 30 s–1

• temni tok < 0.2 e– (pix s)–1 @–25°C

• elektronsko pomnoževanje signala (do 1000x)

Iztok Urbančič FMS 13

Elementi FMS

Iztok Urbančič FMS 14

TK nastavljivi filter

VariSpec

Obrnjeni mikroskop

Nikon TE2000-E

Obločna svetilka (Xe)

Lambda LS

Fluorescenčna enota

BD Carv II

Konfokalna enota

BD Carv II

EMCCD kamera

QImaging Rolera Mgi+• IR vlakenski laser 1064 nm

• izhodna moč 5 W

• več kot 1000 sočasnih pasti

• preklapljanje med pastmi 100 kHz

• natančnost lege pasti < 1 nm

Optična pinceta

Aresis Tweez 200si

fluorescenčne nanokroglice (50 nm)

10 µm

Zajem in kodiranje krajevno lociranih spektralnih lastnosti

Kam so šli vsi fotoni?

FMSIztok Urbančič

elementprepustnost

[1]jakost

[W]fotonskitok [s–1]

300 W Xe obločnica 4,5 10+0 1,5 1019

svetlobni vodnik 0,1 4,5 10–1 1,5 1018

vzbujevalni filtri 0,2 9,0 10–2 3,0 1017

konfokalni disk 0,08 7,2 10–3 2,4 1016

objektiv (vstopna odprtina) 0,08 5,7 10–4 1,9 1015

fluorofori (absorpcija, emisija) (5 10–4) 2,9 10–7 9,7 1011

/ 3D slikovni element („voxel“) 6 10–7 1,7 10–14 5,7 104 [(pix s)–1]

objektiv (NA, n) 0,3 5,2 10–15 1,7 104::

izsevni filtri 0,7 3,6 10–15 1,2 104

TK filter 0,02 8,0 10–17 2,4 102

kamera (γ ⇒ ADCe) (0,02) 4,8 101 [ADCe (pix s)–1]

Ciljano porazdeljevanje označevalcev

• Od lastnosti označevalcev je odvisno, kje se le ti porazdeljujejo!

10 µmA B

D E

C

F

Preverjamo stabilnost vezave označevalcev

• Akumulirane titan oksidne nanocevke v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu, sprane s

PBS

• Vezan in prost Alexa označevalec imata vrha emisijskega spektra razmaknjena za 8 nm

emmision-maximum-coding FMS image emmision spectra of the two

states of the same probe

Identificiramo delce manjše od resolucije mikroskopije

• Akumulirani polistirenski nanodelci v MCF7 celicah (rak dojke) po 1 dnevu

• Kolokalizacija z doma-sintetiziranim membranskim označevalcem , ki ima vrh

emisijskega spektra zamaknjen za 40 nm glede na vrh spektra označevalca na

nanodelcih

500 550 600

Inte

nzi

teta

flu

ore

sce

nce

(a.

u.)

Valovna dolžina (nm)

Nanodelci

Membranska proba

slika, ki kodira vrh

emisijskega spektra

slika, ki kodira

intenziteto

Emisijski spekter

obeh označevalcev

membranski

označevalec

Opazujemo časovno odvisne pojave, kot je zlivanje membran

• Zaradi zlivanja membrane liposomov s plazemsko membrano, s okoli

fluorescenčnih označevalcev spreminja koncentracija holesterola, ki vpliva na

strukturiranost membrane, ta pa se odraža na vrhu emisijskega spektra

5 µm

5 min 10 min 15 min

Razglednica za spomin

Detekcija lokalnega

molekularnega okolja

Detekcija nanodelcev preko

spektralnega kontrasta

Barvno kodiranje

spektralnih lastnosti

Koncept FMS

Projektna skupina

Laboratorij za biofiziko @ F5.IJS, FFA.UNI-LJ, CO NAMASTE

Tilen KokličSlavko Pečar

Zoran Arsov

Iztok Urbančič

Marjeta Šentjurc

Janez Mravljak

Stane Pajk

Ivan Kvasić

Darija Jurašin

Alma Mehle

Ajasja LjubetičMaja Garvas

Daniele Biglino

Jana Mlakar

Janez Štrancar

http://lbf.ijs.si

Jure Zdovc

http://www.conamaste.si