1991, 55(3):335.Microbiol. Rev.M Manafi, W Kneifel and S Bascombin bacterial diagnostics.Fluorogenic and chromogenic substrates usedhttp://mmbr.asm.org/content/55/3/335Updated information and services can be found at: These include:CONTENT ALERTSmore cite this article), Receive: RSS Feeds, eTOCs, free email alerts (when new articleshttp://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtml Information about commercial reprint orders: http://journals.asm.org/site/subscriptions/ To subscribe to to another ASM Journal go to: on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from V o l . 5 5 , N o . 3 M I C R O B I O L O G I C A L R E V I E W S , S e p t . 1 9 9 1 , p . 3 3 5 - 3 4 80 1 4 6 - 0 7 4 9 / 9 1 / 0 3 0 3 3 5 - 1 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yF l u o r o g e n i c a n d C h r o m o g e n i c S u b s t r a t e s Us e d i nB a c t e r i a l D i a g n o s t i c sM O HA M M E D M A N A F I , l *W O L F G A N G KN E I F E L , 2 A N D S HO S HA N A B A S C O M B 3Hy g i e n e I n s t i t u t e , Un i v e r s i t y o f V i e n n a , A - 1 0 9 5 V i e n n a , 1 a n d D e p a r t m e n t o f D a i r y R e s e a r c h a n d B a c t e r i o l o g y ,A g r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y , A - 1 1 8 0 V i e n n a , 2 A u s t r i a , a n d M i c r o S c a n D i v i s i o n , B a x t e r D i a g n o s t i c s I n c . ,W e s t S a c r a m e n t o , C a l i f o r n i a 9 5 6 9 1 3I N TR O D UC TI O N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5D E TE C TI O N O F E N ZYM A TI C A C TI V I TI E S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5G e n e r a l C o n s i d e r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5D E TE C TI O N O F A C TI V I TYO F I N D I V I D UA L E N ZYM E S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6G l y c o s i d a s e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6P - D - G l u c u r o n i d a s e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 3 6, 1 - D - G a l a c t o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 3 76 - P h o s p h o - o - D - g a l a c t o s i d e 6 - p h o s p h o g a l a c t o h y d r o l a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 7S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f G UD a n d n - G A L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8a - D - G a l a c t o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8P - D - G l u c o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8a - A m y l a s e a n d a - g l u c o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8N e u r a m i n i d a s e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8E s t e r a s e s a n d L i p a s e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8D N a s e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9P h o s p h a t a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9P e p t i d a s e s a n d P r o t e a s e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9P y r o g l u t a m y l a m i n o p e p t i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9L - A l a n i n e a m i n o p e p t i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 0O t h e r a r y l p e p t i d a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 0C o a g u l a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 0US E O F F L UO R O G E N I C D YE S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 0P r o t e i n - S p e c i f i c D y e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1N u c l e o t i d e - S p e c i f i c D y e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1A P P L I C A TI O N O F E N ZYM E TE S TS TO S P E C I F I C TA XA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1D i f f e r e n t i a t i o n o f M e m b e r s o f t h e F a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1I d e n t i f i c a t i o n o f L e g i o n e l l a S p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1I d e n t i f i c a t i o n o f N e i s s e r i a S p e c i e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2E n zy m e Te s t s i n M y c o b a c t e r i a l Ta x o n o m y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2E n zy m e Te s t s i n F u n g a l Ta x o n o m y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2I d e n t i f i c a t i o n o f C a n d i d a S p e c i e s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2R A P I D I TYO F TE S TP E R F O R M A N C E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2C O N C L US I O N S A N D F UTUR E P E R S P E C TI V E S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3R E F E R E N C E S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3I N TR O D UC TI O NN e wt e c h n i q u e s h a v e b e e n d e v e l o p e d r e c e n t l y f o r d e t e c -t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f b a c t e r i a . Th e y a r e b a s e d o n t h eu t i l i za t i o n o f c h r o m o g e n i c a n d f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e s f o rd e t e c t i o n o f a c t i v i t i e s o f s p e c i f i c e n zy m e s . Th e s e s e n s i t i v em e t h o d s h a v e l e d t o i m p r o v e d a c c u r a c y a n d f a s t e r d e t e c t i o na n d m a y b e p e r f o r m e d b y u s i n g t h e p r i m a r y i s o l a t i o n m e d i a ,t h u s b y p a s s i n g t h e n e e d f o r t i m e - c o n s u m i n g i s o l a t i o n p r o c e -d u r e s p r i o r t o i d e n t i f i c a t i o n .F u r t h e r m o r e , j u d i c i o u s c h o i c e o f t h e s y n t h e t i c s u b s t r a t e sp e r m i t s s e v e r a l r e a c t i o n s t o b e e x a m i n e d s i m u l t a n e o u s l y .Th i s s u b j e c t h a s b e e n r e v i e we d p r e v i o u s l y ( 1 5 , 1 6 , 2 3 7 ) . Th i sr e v i e wd e a l s p r i m a r i l y wi t h r e c e n t p u b l i c a t i o n s , wi t h p a r t i c -*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .u l a r e m p h a s i s o n m e t h o d s f o r s p e c i f i c d e t e c t i o n o f E s c h e -r i c h i a c o l i .D E TE C TI O N O F E N ZYM A TI C A C TI V I TI E SG e n e r a l C o n s i d e r a t i o n sTh r e e g r o u p s o f f l u o r o g e n i c a n d / o r c h r o m o g e n i c r e a c t i o n sh a v e b e e n u s e d .( i ) Th e f i r s t i s h y d r o l y s i s o f s y n t h e t i c s u b s t r a t e s b y b a c t e -r i a l e n zy m e s , c a u s i n g c o n s i d e r a b l e i n c r e a s e i n t h e f l u o r e s -c e n c e a n d / o r a b s o r p t i o n o f t h e b a c t e r i u m - s u b s t r a t e m i x t u r e( 1 6 ) . F l u o r o g e n i c s y n t h e t i c e n zy m e s u b s t r a t e sc o n t a i n i n gc o u m a r i n d e r i v a t i v e s o f 4 - m e t h y l u m b e l l i f e r o n e ( 4 - M U) o r7 - a m i n o - 4 - m e t h y l c o u m a r i n ( 7 - A M C ) a r e t h e m o s tc o m m o n l yu s e d s u b s t r a t e s . Th i s p o p u l a r i t y c o u l d b e a s c r i b e d t o a v a i l -a b i l i t y o f a wi d e r a n g e o f s u b s t r a t e s wi t h d i f f e r e n t m e t a b o l i cm o i e t i e s , n o n c a r c i n o g e n i c i t y , e a s e o f v i s u a l d e t e c t i o n o f t h e3 3 5 on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from 3 3 6 M A N A F I E TA L .p r o d u c t s o f e n zy m e a c t i v i t y wi t h UV l i g h t s o u r c e s , a n da v a i l a b i l i t y o f s u i t a b l e f l u o r o m e t e r s f o r m e a s u r e m e n t o ff l u o r e s c e n c e i n b o t h t u b e a n d m u l t i we l l p a n e l s . D y e r ( 5 4 )wa s t h e f i r s t t o s u g g e s t t h e u s e o f f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e s f o rt h e d e t e c t i o n o f b a c t e r i a l e n zy m e s . D a h l e n a n d L i n d e ( 4 1 )d e s c r i b e d a n a g a r p l a t e , a n d M a d d o c k s a n d G r e e n a n ( 1 4 2 )d e s c r i b e d a 1 0 - m i n s p o t t e s t i n wh i c h 4 - M U d e r i v a t i v e s we r eu s e d . F u j i wa r a a n d Ts u r u ( 7 1 ) we r e t h e f i r s t t o u s e 7 - A M Cd e r i v a t i v e s f o r m e a s u r e m e n t o f b a c t e r i a l p e p t i d a s e s . B a s -c o m b ( 1 6 ) d e s c r i b e d i n d e t a i l t h e s y n t h e t i c m o i e t i e s o f b o t hf l u o r o g e n i c a n d c h r o m o g e n i c e n zy m e s u b s t r a t e s a n d t h ea p p l i c a t i o n o f t h e s e s u b s t r a t e s t o s t u d y o f b a c t e r i a l e n zy m e s .Th e d e r i v a t i v e s o f t h e f o l l o wi n g s u b s t r a t e s h a v e s i n c e b e e nu s e d m o s t f r e q u e n t l y : e s t e r s o f o - n i t r o p h e n o l ( O N P ) ( 1 3 5 ) o rp - n i t r o p h e n o l ( P N P ) ( 3 1 ) ( r e l e a s e o f t h e n i t r o p h e n o l r e s u l t si n a n i n c r e a s e i nA 4 , 5a n d a p p e a r a n c e o f a y e l l o w c o l o r ) ;e s t e r s o f i n d o x y l ( 3 1 ) o r 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l ( 2 4 4 )( t h e r e l e a s e d i n d o x y l c a u s e s a b l u e c o l o r i n c o l o n i e s o rs u s p e n s i o n s o f o r g a n i s m s p o s i t i v e f o r h y d r o l y zi n g s u c he s t e r s [ 3 1 , 1 3 7 , 2 4 4 ] ) ; e s t e r s o f 4 - M U ( 1 5 1 ) ( t h e r e l e a s e d4 - M U s h o ws a n i n c r e a s e i n f l u o r e s c e n c e [ e x c i t a t i o n wa v e -l e n g t h , 3 6 5 n m ; e m i s s i o n wa v e l e n g t h , 4 4 0 n m ] [ 7 9 ] , a n d b l u ef l u o r e s c e n c e c a n b e o b s e r v e d v i s u a l l y wh e n p l a t e s o r t u b e sa r e i r r a d i a t e d wi t h l o n g - wa v e l e n g t h UV l i g h t , i . e . , a W o o d sl a m p [ 1 4 2 ] ) ( Th e B a x t e r D i a g n o s t i c s I n c . M i c r o S c a n [ 1 8 ]R a p i d G r a m - N e g a t i v e a n d G r a m - P o s i t i v e I d e n t i f i c a t i o n P a n -e l s d e s c r i b e d i n 1 9 8 7 [ 1 1 8 ] u t i l i ze 4 - M U d e r i v a t i v e s o f m o n o -a n d d i s a c c h a r i d e s a n d p h o s p h a t e s ) ; a r y l p e p t i d e d e r i v a t i v e so f p - n i t r o a n i l i n e ( p - N A ) ( 3 2 ) ( r e l e a s e o f p - N A r e s u l t s i n a ni n c r e a s e i nA 4 0a n d a p p e a r a n c e o f a y e l l o wc o l o r [ 2 0 , 3 5 , 3 8 ,6 1 , 7 1 ] ; a s u b s t a n t i a l i n c r e a s e i n s e n s i t i v i t y c a n b e a c h i e v e db y r e a c t i n g t h e p - N A wi t h a d i a zo d y e [ 1 6 ] , y i e l d i n g b l u e t od a r k p u r p l e c o l o r s [ 2 2 , 1 0 9 ] ) ; a n d a r y l p e p t i d e d e r i v a t i v e s o f7 - A M C ( 7 1 , 7 9 ) ( r e l e a s e o f 7 - A M C r e s u l t s i n a n i n c r e a s e i nf l u o r e s c e n c e t h a t i s d e t e c t a b l e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y [ e x c i -t a t i o n wa v e l e n g t h , 3 7 0 n m ; e m i s s i o n wa v e l e n g t h , 4 4 0 n m ][ 7 1 ] o r b y v i s u a l o b s e r v a t i o n o f i n c r e a s e d b l u e f l u o r e s c e n c eu n d e r UV l i g h t [ 8 1 ] ) .( i i ) Th e s e c o n d g r o u p o f r e a c t i o n s i s t h e c h a n g e i n f l u o -r e s c e n c e o r a b s o r b a n c e o f a p Hi n d i c a t o r i n a m i x t u r e o fb a c t e r i a a n d s u b s t r a t e , wh i c h i s c a u s e d b y s p e c i f i c e n zy -m a t i c a c t i v i t y , e . g . , a n i n c r e a s e i n p H r e s u l t i n g f r o m u r e a s ea c t i v i t y ( 7 9 ) . A n u m b e r o f f l u o r e s c e n t p Hi n d i c a t o r s wi t hd i f f e r e n t p Ho p t i m a a r e a v a i l a b l e ( 5 0 , 8 2 , 2 2 4 ) . D y e r ( 5 4 )s u g g e s t e d t h e u s e o f 4 - M U a s a n i n d i c a t o r f o r t h e d e t e c t i o no f a n i n c r e a s e i n p Ha n d q u i n i n e f o r t h e d e t e c t i o n o f ad e c r e a s e . G o d s e y e t a l . ( 7 9 ) u s e d 4 - M U f o r t h e d e t e c t i o n o fu r e a s e a c t i v i t y . Ts i e n ( 2 2 4 ) d e s c r i b e s t h e u s e o f f l u o r e s c e n tp Hi n d i c a t o r s f o r i n t r a c e l l u l a r s t u d i e s o f e u c a r y o t i c c e l l s .Th e M i c r o S c a n R a p i d I d e n t i f i c a t i o n s y s t e m ( 1 1 8 ) u s e s f l u o -r e s c e n t p Hi n d i c a t o r s f o r t h e d e t e c t i o n o f u r e a s e a c t i v i t y ,d e c a r b o x y l a t i o n o f l y s i n e a n d o r n i t h i n e , a n d a c i d f o r m a t i o nf r o m s o m e m o n o - o r d i s a c c h a r i d e s . S i m i l a r t e s t s a r e a l s oa v a i l a b l e i n t h e S e n s i t i t r e I d e n t i f i c a t i o n s y s t e m ( R a d i o m e t e rA m e r i c a I n c . ) .( i i i ) Th e t h i r d g r o u p o f r e a c t i o n s i s t h e c h a n g e i n i n t e n s i t yo f f l u o r e s c e n c e a s a r e s u l t o f a d s o r b a n c e o f f l u o r e s c e n t d y eo n t o s o m e c o m p o n e n t o f t h e b a c t e r i a l c e l l , e . g . , a c r i d i n eo r a n g e ( A O ) b i n d i n g t o D N A ( 1 7 4 ) a n d 8 - a n i l i n o - 1 - n a p h t h a -l e n e s u l f o n i c a c i d ( A N S ) b i n d i n g t o p r o t e i n s ( 1 8 5 ) . I m p o r t a n te x t e n s i o n s o f t h i s a p p r o a c h a r e t h e u s e o f e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( 1 3 3 ) , d i r e c t e p i f l u o r e s c e n t f i l t e r t e c h n i q u e( D E F T) ( 1 7 3 ) , a n d f l o wc y t o m e t r y ( F C M ) ( 1 5 2 ) f o r c o u n t i n ga n d c h a r a c t e r i za t i o n o f c e l l p o p u l a t i o n s . Th e s e t e c h n i q u e sc a n b e a p p l i e d d i r e c t l y t o m i c r o b i a l c e l l s p r e s e n t i n t h es p e c i m e n wi t h o u t p r e i n c u b a t i o n o r c e l l m u l t i p l i c a t i o n . F i x -a t i o n o f t h e b a c t e r i a l c e l l s i s f r e q u e n t l y r e q u i r e d t o f a c i l i t a t ep e n e t r a t i o n o f t h e d y e . I n t h e s e t e c h n i q u e s , c e l l p o p u l a t i o n sa r e s t a i n e d wi t h n u c l e i c a c i d o r o t h e r s p e c i f i c r e a g e n t s . I nD E F T, b a c t e r i a l c e l l s a r e p r e f e r e n t i a l l y c o n c e n t r a t e d b yf i l t r a t i o n . I n F C M , c e l l s a r e c o u n t e d o n t h e b a s i s o f p a r t i c l es i ze a n d v o l u m e a n d t h e f l u o r e s c e n c e a t s p e c i f i c e x c i t a t i o na n d e m i s s i o n wa v e l e n g t h s .D E TE C TI O N O F A C TI V I TYO F I N D I V I D UA L E N ZYM E SG l y c o s i d a s e sP - D - G l u c u r o n i d a s e ., - D - G l u c u r o n i d a s e ( G UD ) ( E C3 . 2 . 1 . 3 1 ) i s a n e n zy m e t h a t c a t a l y ze s t h e h y d r o l y s i s o f3 - D - g l u c o p y r a n o s i d u r o n i c ( G L R ) d e r i v a t i v e s i n t o t h e i r c o r -r e s p o n d i n g a g l y c o n s a n d D - g l u c u r o n i c a c i d . Th e e n zy m e i sb e l i e v e d t o b e i n v o l v e d i n d e c o m p o s i t i o n o f t h e i n t e r c e l l u l a rs u b s t a n c e s o f t h e h o s t ' s c o n n e c t i v e t i s s u e ( 4 1 ) . Th e p r e v a -l e n c e o f t h i s e n zy m e a n d i t s u t i l i t y i n d e t e c t i o n o f E . c o l iwe r e r e v i e we d p r e v i o u s l y ( 1 6 , 9 2 ) . G UD - p o s i t i v e r e a c t i o n sa r e o b s e r v e d i n 9 4 t o 9 6 % o f E . c o l i i s o l a t e s t e s t e d ( 4 1 , 5 8 ,6 6 , 7 4 , 9 1 , 1 1 5 , 1 2 0 , 1 4 8 , 2 2 8 , 2 3 9 ) . I n c o n t r a s t , G UD a c t i v i t yi s l e s s c o m m o n i n S h i g e l l a ( 4 4 t o 5 8 %) , S a l m o n e l l a ( 2 0 t o2 9 %) , a n d Ye r s i n i a s t r a i n s a n d i n f l a v o b a c t e r i a ( 7 9 , 9 1 , 1 3 4 ,1 6 9 , 1 7 7 , 1 9 1 , 2 2 3 ) . Th e t e s t m a y b e u s e f u l i n i d e n t i f i c a t i o n o fc e r t a i n S a l m o n e l l a s p e c i e s ( 1 3 4 ) .A m o n g t h e g r a m - p o s i t i v e g r o u p , t h e t e s t wa s s h o wn t o b eu s e f u l i n c h a r a c t e r i za t i o n o f g r o u p B a n d D s t r e p t o c o c c i( 1 9 3 ) . O n l y s o m e S t a p h y l o c o c c u s ( 1 5 4 ) a n d C l o s t r i d i u m( 2 0 1 ) s t r a i n s e x h i b i t e d p o s i t i v e G UD r e a c t i o n s .D a h l e n a n d L i n d e ( 4 1 ) u s e d a p l a t e m e t h o d t o d e m o n s t r a t eG UD a c t i v i t y i n B a c t e r o i d e s a n d C o r y n e b a c t e r i u m s p p .Th e y a l s o s h o we d t h a t t h e m a j o r a c t i v i t i e s o f a s i n g l e E . c o l is t r a i n a n d a n a n a e r o b i c C o r y n e b a c t e r i u m s t r a i n we r e r e c o v -e r e d i n t h e i n t r a c e l l u l a r f r a c t i o n .G UD a c t i v i t y c a n b e m e a s u r e d b y u s i n g d i f f e r e n t c h r o -m o g e n i c a n d f l u o r o g e n i c s u b s t a n c e s . R e l e a s e o f p h e n o l -p h t h a l e i n f r o m ap h e n o l p h t h a l e i n - m o n o - p - D - g l u c u r o n i d ec o m p l e x ( P HE G L R ) ( 3 0 ) , o f P N P f r o m p - n i t r o p h e n o l - 3 - D -g l u c u r o n i d e ( P N P G L R ) ( 1 , 9 1 , 1 2 0 , 1 2 1 , 1 2 2 , 1 2 3 , 2 3 8 ) , a n do f i n d i g o f r o m 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - i - D - g l u c u r o n i d e( X- G L R ) ( 4 9 , 6 8 , 1 1 1 , 1 3 7 , 2 3 6 ) h a s b e e n u s e d f o r t h e s p e c i f i cd e t e c t i o n o f E . c o l i . Th e m o s t c o m m o n l y u s e d s u b s t r a t e i s4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l - p - D - g l u c u r o n i d e( M UG L R ) ( 6 , 9 , 3 0 ,4 1 , 4 6 , 5 8 , 7 8 , 8 9 , 9 3 , 9 9 , 1 0 3 , 1 0 6 , 1 2 2 , 1 4 3 , 1 4 9 % 1 5 0 , 1 5 5 ,1 5 9 , 1 6 6 , 1 7 2 , 1 7 9 , 1 9 2 , 2 0 4 , 2 1 3 ) . Th i s c o m p o u n d i s h y d r o -l y ze d b y G UD , y i e l d i n g 4 - M U, wh i c h s h o ws b l u e f l u o r e s -c e n c e wh e n i r r a d i a t e d wi t h l o n g - wa v e UV l i g h t ( e x c i t a t i o nwa v e l e n g t h , 3 6 5 n m ) . P r i m a r y i s o l a t i o n m e d i a m a y b e u s e df o r i n d i c a t i o n o f t h e p r e s e n c e o f E . c o l i o r f o r i s o l a t i o n o f E .c o l i c o l o n i e s . I n t h e f i r s t i n s t a n c e , a c h a n g e i n a b s o r p t i o n o rf l u o r e s c e n c e o f t h e e n t i r e m e d i u m i s a s u f f i c i e n t i n d i c a t o r . I nt h e s e c o n d c a s e , i t i s i m p o r t a n t t o m a i n t a i n l o c a l i za t i o n o ft h e r e a c t i o n p r o d u c t i n o r a r o u n d t h e b a c t e r i a l c o l o n y .S u b s t r a t e s wh i c h g i v e i n s o l u b l e c o l o r e d o r f l u o r e s c e n t h y -d r o l y s i s p r o d u c t s a r e p r e f e r a b l e t o t h o s e g i v i n g s o l u b l ef l u o r o p h o r e s o r c h r o m o p h o r e s .C h r o m o g e n i c a n d f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e s h a v e d i f f e r e n ta d v a n t a g e s i n t e s t i n g p r o c e d u r e s f o r E . c o l i . P N P G L R i ss u i t a b l e f o r l i q u i d m e d i au s e d f o r e s t i m a t i o n o f t u m b e r so f E .c o l i , e . g . , wh e n a p p l y i n g a m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r t e c h n i q u e( 1 2 3 ) , b u t l e s s s u i t a b l e f o r s o l i d m e d i a b e c a u s e o f t h ee x t e n s i v e d i f f u s i o n o f t h e y e l l o w c o l o r ( 4 9 , 1 2 1 , 1 3 7 , 1 4 3 ) .Ho we v e r , He n r i c h s e n ( 9 4 ) s h o we d t h a t P N P G L R , i n c o r p o -r a t e d i n a g a r m e d i u m , c o u l d b e u s e d f o r p r e s u m p t i v e i d e n -t i f i c a t i o n o f E . c o l i f r o m u r i n e s a m p l e s . W h e n X- G L R i sM I C R O B I O L . R E V . on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from E N ZYM E S UB S TR A TE S A N D B A C TE R I A L D I A G N O S TI C S 3 3 7TA B L E 1 . C o n c e n t r a t i o n s o f M UG L R p r o p o s e d f o ri n c o r p o r a t i o n i n t o p r i m a r y i s o l a t i o n m e d i aM e d i u mM UG L R c o n c nR e f e r e n c e( >g / m l )B r i l l i a n t g r e e n b i l eL a c t o s e b r o t h 5 0 7 8E . c o l i b r o t h 5 0 1 9 1L a u r y l s u l f a t e b r o t h 5 0 1 4 81 0 0 6 6M a c C o n k e y a g a r 1 5 0 2 2 3V i o l e t r e d b i l e a g a r 2 0 0 6 6u s e d , c o l o n i e s wi t h e n zy m a t i c a c t i v i t y s h o w a p u r p l e c o l o rwi t h o u t d i f f u s i o n ( 4 9 , 1 3 7 , 2 3 6 ) ; i t i s t h e r e f o r e m o s t s u i t a b l ef o r i n c o r p o r a t i o n i n s o l i d m e d i u m .M UG L R c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t o e i t h e r l i q u i d o r s o l i dm e d i a . Th e m i n i m u m c o n c e n t r a t i o n s u f f i c i e n t f o r d i s t i n c ti n d i c a t i o n wa s 5 0 , u g / m l ( Ta b l e 1 ) . Ho we v e r , t h e c o n c e n t r a -t i o n n e c e s s a r y f o r a c c e p t a b l e d e t e c t i o n o f E . c o l i d e p e n d s o nt h e o t h e r c o n s t i t u e n t s o f t h e m e d i a . B e c a u s e t h e f l u o r e s -c e n c e o f4 - M U i s p H d e p e n d e n t ( 8 2 ) , t h e p H o f g r o wt h m e d i ac o n t a i n i n g M UG L R s h o u l d b e n e u t r a l o r s l i g h t l y a l k a l i n e( 6 9 , 8 2 ) ; o t h e r wi s e , a l k a l i n e s o l u t i o n m u s t b e a d d e d t o r e v e a lt h e f l u o r e s c e n c e ( 6 9 , 1 4 2 ) .B e s i d e s i t s s p e c i f i c i t y a n d a p p l i c a b i l i t y , M UG L R h a sf u r t h e r a d v a n t a g e s . I t c a n b e s t e r i l i ze d t o g e t h e r wi t h o t h e rm e d i u m i n g r e d i e n t s wi t h o u t l o s s o f a c t i v i t y a t c o n c e n t r a -t i o n s o f 5 0 ( 1 8 9 ) , 1 0 0 ( 6 6 ) , a n d 2 0 0 ( 1 5 4 ) p u g / m l ; f u r t h e r m o r e ,n o i n h i b i t o r y e f f e c t o n E . c o l i g r o wt h h a s h i t h e r t o b e e no b s e r v e d ( 1 5 4 ) . S e v e r a l M UG L R t e s t i n g p r o c e d u r e s we r ep r o p o s e d f o r i d e n t i f i c a t i o n a n d e n u m e r a t i o n o f E . c o l i . Th e s ei n c l u d e m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r ( 9 , 6 6 , 1 2 3 , 1 2 4 , 1 4 3 , 2 0 6 ) ,m e m b r a n e f i l t r a t i o n ( 6 4 , 1 4 3 ) , p r e s e n c e - a b s e n c e t e s t ( 1 3 6 ,1 4 3 ) , a g a r p l a t e ( 4 1 , 4 4 , 1 4 3 , 1 5 0 ) , m i c r o t i t r a t i o n p l a t e ( 6 6 ) ,p a p e r s t r i p ( 7 2 , 9 0 , 9 6 ) , o r c u p u l e o n a p l a s t i c s t r i p ( 7 2 )t e c h n i q u e s . S o m e P s e u d o m o n a s s t r a i n s p r o d u c e a p i g m e n tt h a t e x h i b i t s d u l l g r e e n i s h f l u o r e s c e n c e u n d e r l o n g - wa v e UVl i g h t . Th i s m a y m i m i c t h e e x c i t a t i o n a n d e m i s s i o n s p e c t r a o f4 - M U d u r i n g m e a s u r e m e n t o f f l u o r e s c e n c e , b u t t h e f l u o r e s -c e n c e s i g n a l i s u s u a l l y t o o s m a l l f o r v i s u a l d e t e c t i o n . V i s u a ld e t e c t i o n o f t h e f l u o r e s c e n c e r e a c t i o n i n t h e M UG L R m e d i ai s i m p r o v e d b y u s i n g e i t h e r a d a r k r o o m o r a d a r k b o x s u c ha s a C A M A G UV c a b i n e t t o e x c l u d e m o s t o f t h e i n c i d e n tl i g h t . S e v e r a l a u t h o r s h a v e r e p o r t e d t h e a p p l i c a t i o n o f s p e -c i f i c G UD m e d i a f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f E . c o l i f r o md i f f e r e n t s o u r c e s ( Ta b l e 2 ) .F o r s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f E . c o l i i n p r i m a r y i s o l a t i o nm e d i a , a e r o b i c i n c u b a t i o n a n d i n c o r p o r a t i o n o f s u b s t a n c e sTA B L E 2 . A p p l i c a t i o n o f G UD m e d i a f o r i d e n t i f i c a t i o n a n de n u m e r a t i o n o f E . c o l iS y n t h e t i c R e f e r e n c e s f o r s a m p l e s o u r c e :m o i e t y o f C l i n i c a l o r v e t e r i n a r yW a t e ro rs u b s t r a t e s p e c i m e n f o o dI n d o x y l a 4 9 6 8 , 1 8 6 , 2 3 6p - N i t r o p h e n o l 9 1 , 1 2 0 , 1 2 1 1 2 2 , 1 2 3 , 1 4 84 - M U 3 6 , 5 1 , 7 9 , 9 3 , 1 0 8 , 4 , 6 , 9 , 1 1 , 3 0 , 6 6 ,1 6 6 , 2 2 0 , 2 2 3 7 8 , 8 9 , 9 0 , 1 0 3 ,1 0 6 , 1 2 2 , 1 4 9 , 1 5 0 ,1 5 4 , 1 7 6 , 1 8 8 , 2 3 9aR e f e r s t o i n d o x y l o r t o 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l e .wh i c h i n h i b i t t h e g r o wt h o f g r a m - p o s i t i v e s t r a i n s a r e u s e d t os u p p r e s s G UD a c t i v i t i e s o f o t h e r b a c t e r i a . A d d i t i o n a l l y ,i n c u b a t i o n a t 4 4 C a n d d e t e c t i o n o f g a s f o r m a t i o n h e l p i ne x c l u s i v e d e t e c t i o n o f E . c o l i . Th i s t e s t i s u s e d i n c r e a s i n g l yf o r d e t e c t i o n o f E . c o l i i n s p e c i m e n s f r o m e n v i r o n m e n t a l a n df o o d s o u r c e s , a s E . c o l i i s a n i m p o r t a n t i n d i c a t o r o f f e c a lc o n t a m i n a t i o n i n s a m p l e s f r o m f o o d - p r o c e s s i n g a n d wa t e rp u r i f i c a t i o n p l a n t s . G UD a c t i v i t y i s f o u n d i n t h e m a j o r i t y o fE . c o l i i s o l a t e s . Ho we v e r , C h a n g e t a l . ( 3 6 ) s t u d i e d t h ep r o p o r t i o n o f G UD - n e g a t i v e E . c o l i i s o l a t e s i n h u m a n f e c a ls a m p l e s a n d f o u n d t h a t a n a v e r a g e o f 1 5 % o f E . c o l i i s o l a t e swe r e G UD n e g a t i v e i n l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e b r o t h wi t hM UG L R . S o m e E . c o l i s t r a i n s we r e t e m p e r a t u r e d e p e n d e n tf o r G UD p r o d u c t i o n ( v e r y we a k l y p o s i t i v e a t 3 7 C , b u ts t r o n g l y p o s i t i v e a t 4 4 C ) . Th o m p s o n e t a l . ( 2 2 0 ) , i n v e s t i g a t -i n g t h e M UG L Ra c t i v i t y o f 1 , 4 8 3 i s o l a t e s , s h o we d v e r y g o o dc o r r e l a t i o n b e t we e n v e r o c y t o t o x i n p r o d u c t i o n a n d a n e g a -t i v e M UG L R r e s p o n s e . A 2 0 - m i n t e s t wa s d e v e l o p e d t h a ta l l o ws r e l i a b l e p r e d i c t i o n o f v e r o c y t o t o x i n p r o d u c t i o n b ys t r a i n s b e l o n g i n g t o E . c o l i s e r o t y p e 0 1 5 7 : H7 . Th e u s e o fg r o wt h - d e p e n d e n t t e s t s ( i n c l u d i n g G UD ) t o i d e n t i f y c y s -t e i n e - r e q u i r i n g s t r a i n s o f E . c o l i a n d o t h e r m e m b e r s o f t h ef a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e m a y l e a d t o e r r o r s d u e t o f a l s e -n e g a t i v e r e s u l t s . Th i s s o u r c e o f e r r o r c a n b e r e m e d i e d b yu s i n g a c y s t e i n e - s u p p l e m e n t e d i n o c u l u m ( 1 4 0 ) .P - D - G a l a c t o s i d a s e . P - D - G a l a c t o s i d a s e( P - G A L ) ( E C3 . 2 . 1 . 2 3 ) , t r i v i a l l y c a l l e d l a c t a s e , c a t a l y ze s t h e b r e a k d o wno f l a c t o s e i n t o g a l a c t o s e a n d g l u c o s e a n d h a s t h e r e f o r eb e e n u s e d m o s t l y f o r e n u m e r a t i n g t h e c o l i f o r m g r o u pwi t h i n t h e f a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e . Th e a c t i v i t y o f p - G A Lwa s d e t e r m i n e d b y u s i n g t h e f o l l o wi n g c h r o m o g e n i c s u b -s t r a t e s : o - n i t r o p h e n y l - , - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( O N P G ) ( 5 5 - 5 7 ,1 3 4 , 1 3 5 , 2 1 9 , 2 3 4 ) ,p - n i t r o p h e n y l - p - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e( P N P G A L ) ( 3 1 ) , o r 6 - b r o m o - 2 - n a p h t h y l - , - D - g a l a c t o p y r a n o -s i d e ( B N G A L ) ( 3 1 ) , a n d t h e f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e 4 - m e t h y l -u m b e l l i f e r y l - , - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( M UG A L ) ( 2 3 , 3 3 , 7 9 , 8 5 ,1 4 2 ) .Th e t e n d e n c y o f c h r o m o g e n i c n i t r o p h e n o l i c s u b s t a n c e s t od i f f u s e t h r o u g h s o l i d m e d i a wa s o b s e r v e d wi t h b o t h O N P Ga n d P N P G A L . Th e r e f o r e , a g a r s c o n t a i n i n g t h e s e s u b s t r a t e sc a n n o t b e u s e d ( 1 3 7 , 1 4 3 ) . To c i r c u m v e n t t h i s p r o b l e m ,5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e( X- G A L )i s p r e f e r r e d f o r t h e r a p i d d e t e c t i o n o f c o l i f o r m s ( 1 4 3 , 1 8 4 ) .Us i n g M UG A L a n d f o l l o wi n g t h e m e m b r a n e f i l t r a t i o n t e c h -n i q u e , B e r g a n d F i k s d a l ( 2 3 ) d e t e c t e d a s f e wa s 1 C F Uo f f e c a lc o l i f o r m s p e r 1 0 0 m l o f wa t e r i n 6 h . I n c o r p o r a t i o n o fM UG A L i n t o E . c o l i a g a r a n d l a u r y l s u l f a t e b r o t h e n a b l e s t h ed i r e c t c o u n t i n g o f c o l i f o r m s b y a p p l y i n g a m e m b r a n e f i l t r a t i o no r p r e s e n c e - a b s e n c e t e s t ( 1 4 5 ) . Th e t e s t f o r t h e p r e s e n c e o ft h i s e n zy m e wa s f o u n d u s e f u l i n d i f f e r e n t i a t i n g a m o n ga e r o b i ca c t i n o m y c e t e s ( 6 7 ) . A n i n d i r e c t m e t h o d f o r e s t i m a t i n gf e c a lc o l i f o r m c o n c e n t r a t i o n , b y u s i n g O N P G h y d r o l y s i s ,wa sd e s c r i b e d b y W a r r e n e t a l . ( 2 3 4 ) . A l i n e a r c o r r e l a t i o n wa ss h o wn b e t we e n t h e m o s t p r o b a b l e n u m b e r a n d t h e t i m er e q u i r e d t o o b t a i n h a l f - m a x i m u m A 4 2 0 b y b a c t e r i a c o n c e n -t r a t e d f r o m wa t e r s p e c i m e n s b y f i l t r a t i o n . Ko u m u r a e t a l .( 1 2 7 ) d e s c r i b e d a s i m i l a r a p p r o a c h f o r t h e d e t e c t i o n o f s m a l ln u m b e r s o f m i c r o o r g a n i s m s i n a v a r i e t y o f s p e c i m e n s b y u s i n g4 - M U d e r i v a t i v e s o f p - G A L a n d p h o s p h a t e .6 - P h o s p h o - 1 3 - D - g a l a c t o s i d e6 - p h o s p h o g a l a c t o h y d r o l a s e .6 -P h o s p h o - p - D - g a l a c t o s i d e6 - p h o s p h o g a l a c t o h y d r o l a s e ( P -P G A L ) ( E C 3 . 2 . 1 . 8 5 ) a n d p - G A L i n a n u m b e r o f l a c t i cs t r e p t o c o c c i we r e e x a m i n e d b y u s i n g t h ec h r o m o g e n i cs u b -s t r a t e s O N P - P - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e - 6 - p h o s p h a t ea n d O N P -P - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( 1 5 6 ) . Th ee n zy m e p - G A L c o u l d b ed e t e c t e d i n o n l y o n e o r g a n i s m , S t r e p t o c o c c u sl a c t i s 7 9 6 2 ;V O L . 5 5 , 1 9 9 1 on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from 3 3 8 M A N A F I E TA L .o t h e r l a c t i c s t r e p t o c o c c i e x a m i n e d s h o we d d i f f e r e n t a m o u n t so f, B - P G A L a c t i v i t y b u t n o p - G A La c t i v i t y .V o g e n s e n e t a l . ( 2 3 0 ) u s e d X- G A L f o r a d i r e c t d i f f e r e n t i -a t i o n o n a g a r b e t we e n L e u c o n o s t o c c r e m o r i s a n d L a c t o c o c -c u s l a c t i s . Un d e r t h e s e c o n d i t i o n s , L . c r e m o r i s i s a b l e t os p l i t X- G a l , a p p e a r i n g a s b l u e c o l o n i e s , b u t L . l a c t i s s u b s p .d i a c e t y l a c t i s , L . l a c t i s , a n d L . l a c t i s s u b s p . c r e m o r i s d o n o th y d r o l y ze X- G a l .S i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f G UD a n d"- G A L . I n t h e q u a l i t yc o n t r o l o f wa t e r a n d f o o d , i t i s h i g h l y i m p o r t a n t t o e x a m i n eb o t h c o l i f o r m s a n d E . c o l i . V i a b l e c o u n t s o f t h e s e b a c t e r i aa r e wi d e l y u s e d a s i n d i c a t o r s o f b a c t e r i o l o g i c a l q u a l i t y a swe l l a s f o r d e t e c t i o n o f f e c a l p o l l u t i o n . N o v e l m e t h o d s h a v eb e e n i n t r o d u c e d t h a t a r e b a s e d o n t h e d e t e c t i o n o f s p e c i f i ce n zy m e a c t i v i t y ( G UD a n d p - G A L )b y u s i n g f l u o r o g e n i ca n d / o r c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e s . Th o m p s o n a n d B o r c zy k( 2 1 9 ) d e s c r i b e d a s i n g l e - t u b e m e d i u m e n a b l i n g t h e d e t e c t i o no f m o t i l i t y , o f a c t i v i t i e s o f p - G A La n d p h e n y l a l a n i n e - d e s a -m i n a s e , a n d o f p r o d u c t i o n o f i n d o l e , wh i c h i s u s e f u l f o rs c r e e n i n g f o r m e m b e r s o f t h e f a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e i ne n t e r i c o r o t h e r c l i n i c a l s p e c i m e n s .A c o n s i d e r a b l e n u m b e r o f s t u d i e s h a v e u s e d a c o m b i n a -t i o n o f n i t r o p h e n o l d e r i v a t i v e s , f o r d e t e c t i o n o fp - G UD ,a n d4 - M U o r i n d o x y l d e r i v a t i v e s , f o r d e t e c t i o n o f G L R a c t i v i -t i e s ; p - G A Li s i n d i c a t i v e o f t o t a l c o l i f o r m s , a n d G UD i si n d i c a t i v e o f E . c o l i , i n d i c a t i n g f e c a l c o n t a m i n a t i o n ( 3 9 ,5 5 - 5 7 , 6 9 , 1 3 6 , 1 8 9 ) . S u c h m e d i a a r e u s e d i n c o m b i n a t i o nwi t h m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r , p r e s e n c e - a b s e n c e , a n d o t h e rd e t e c t i o n m e t h o d s . B e c a u s e a s m a l l p e r c e n t a g e o f E . c o l is t r a i n s m a y n o t s h o w G UD a c t i v i t y , a n d b e c a u s e s o m e f o o ds a m p l e s , e . g . , o y s t e r s , m a y s h o we n d o g e n o u s G UD a c t i v i t y ,o t h e r m e t h o d s f o r s p e c i f i c d e t e c t i o n o f E . c o l i we r e s o u g h t .Th e s e i n c l u d e s e r o l o g i c a l d e t e c t i o n o fp - G A L ,G UD , a n dg l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e e n zy m e s i n c e l l l y s a t e s b y u s i n ga n t i b o d i e s s p e c i f i c t o t h e s e e n zy m e s i s o l a t e d f r o m E . c o l i .Th e p r e s e n c e o f t h e s e e n zy m e s i n t h e c e l l l y s a t e s c a n b ed e t e c t e d b y c o a g u l a t i o n t e s t s wi t h p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s t ot h e E . c o l i e n zy m e s . A l t e r n a t i v e l y , a n t i b o d i e s s p e c i f i c t o t h eE . c o l i p - G A La n d G UD e n zy m e s we r e a t t a c h e d t o we l l s o fm i c r o t i t r a t i o n p l a t e s a n d u s e d t o c a p t u r e t h e c e l l l y s a t ee n zy m e s , wh o s e a c t i v i t y wa s d e t e c t e d b y u s i n g 4 - M U o rO N P d e r i v a t i v e s ( 1 1 5 ) .a - D - G a l a c t o s i d a s e . a - D - G a l a c t o s i d a s e ( a - D - G A L ) ( E C3 . 2 . 1 . 2 2 ) i s u s e f u l f o r d i f f e r e n t i a t i o n o f s t r e p t o c o c c i a n de n t e r o c o c c i ( 1 3 8 ) . 4 - M U- a - D - g a l a c t o s i d e i s h y d r o l y ze d b yS t r e p t o c o c c u s b o v i s a n d E n t e r o c o c c u s f a e c i u m a n d i t s b i o -t y p e s . A s t r e p t o c o c c a l s e l e c t i v e m e d i u m c o n t a i n i n g a f l u o -r o g e n i c a - D - G A L s u b s t r a t e a n d c o l o r i m e t r i c s t a r c h t e s t wa sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 3 8 ) . Th r e e p h e n o t y p i c g r o u p s a r ei d e n t i f i a b l e o n t h e b a s i s o f s t a r c h h y d r o l y s i s a n d f l u o r e s -c e n c e : ( i ) S . b o v i s p o s i t i v e f o r b o t h t e s t s ; ( i i ) E . f a e c i u mp o s i t i v e o n l y f o r a - D - G A L ; ( i i i ) E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s , E n -t e r o c o c c u s a v i u m , S t r e p t o c o c c u s e q u i n u s , S t r e p t o c o c c u sm i t i s , a n d S t r e p t o c o c c u s s a l i v a r i u s n e g a t i v e f o r b o t h t e s t s .P - D - G l u c o s i d a s e .Th e u s e o fP - D - g l u c o s i d a s e ( p - D - G L U)( E C 3 . 2 . 1 . 2 1 ) f o r b a c t e r i a l d i f f e r e n t i a t i o n h a s b e e n s u m m a -r i ze d p r e v i o u s l y ( 1 6 ) . I t s u s e f u l n e s s i n d i f f e r e n t i a t i o n o fs t r e p t o c o c c i h a s b e e n r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d ( 1 1 6 , 1 6 5 ) .4 - M U- P - D - g l u c o s i d ei n c o n j u n c t i o n wi t h P N P - a - D - g a l a c t o -p y r a n o s i d e a n d i n t h e p r e s e n c e o f 2 . 5 % s o d i u m d e o x y c h o -l a t e we r e u s e d t o i d e n t i f y S . b o v i s a n d r e l a t e d b a c t e r i a . Th i sc o m b i n a t i o n t e s t , i n c o n j u n c t i o n wi t h a r a p i d a s s a y f o rL - p y r r o l i d o n y l - a m i n o p e p t i d a s e( s e e b e l o w) , c o u l d d i s t i n -g u i s h S . b o v i s , S . e q u i n u s , E n t e r o c o c c u s s p p . , S t r e p t o c o c -c u s p n e u m o n i a e a n d t h e v i r i d a n s g r o u p s t r e p t o c o c c i i n 3 0m i n .A f l u o r o g e n i c a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o fP - D - G L Uwa sd e v e l o p e d a s p a r t o f a s i m p l i f i e d c o n v e n t i o n a l m e t h o d t od i s t i n g u i s h S t a p h y l o c o c c u s wa r n e r i a n d S t a p h y l o c o c c u sh o m i n i s i s o l a t e d f r o m b o v i n e b o d y s i t e s . Th e a s s a y i s b a s e do n t h e f a c t t h a t s t r a i n s o f S . wa r n e r i p r o d u c eP - D - G L U,wh i l e s t r a i n s o f S . h o m i n i s d o n o t ( 2 4 2 ) .a - A m y l a s e a n d a - g l u c o s i d a s e . S t a r c h h y d r o l y s i s a n d p r o -d u c t i o n o f a c i d f r o m s t a r c h h a v e l o n g b e e n u s e d f o r d i f f e r -e n t i a t i o n o f e n t e r o b a c t e r i a a n d s t r e p t o c o c c i . Ho we v e r , o n l ya f e w s y n t h e t i c s u b s t r a t e s a r e a v a i l a b l e f o r m e a s u r e m e n t o ft h e a c t i v i t y o f a - a m y l a s e . A m i x t u r e o f P N P d e r i v a t i v e s o fp e n t a - , h e x a - o r h e p t a - m a l t o s e wa s u s e d b y Tr e p e t a a n dE d b e r g ( 2 2 2 ) f o r d e t e c t i o n o f b a c t e r i a l a - a m y l a s e ( E C3 . 2 . 1 . 1 ) . A n e w c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e f o r t h e a s s a y a n dd e t e c t i o n o f a - a m y l a s e wa s r e p o r t e d b y B i e l y e t a l . ( 2 4 ) . Th es u b s t r a t e wa s p r e p a r e d b y c o u p l i n g p a r t i a l l y h y d r o l y ze ds t a r c h wi t h a d y e ( o s t a zi n b r i l l i a n t r e d H- 3 B ) . I t i s p r e c i p i -t a b l e f r o m b u f f e r e d s o l u t i o n s wi t h e t h a n o l a n d i s e q u a l l ys u i t a b l e f o r t h e a s s a y o f a - a m y l a s e i s o e n zy m e s i n g e l s .A s s a y s f o r a - g l u c o s i d a s e ( a - G L U) ( E C 3 . 2 . 1 . 2 0 ) a n da - m a l t o s i d a s e , i n t h e p r e s e n c e o f Tr i t o n X- 1 0 0 , c a n b e u s e dt o d i s t i n g u i s h B a c i l l u s a n t h r a c i s f r o m B a c i l l u s c e r e u s , B a -c i l l u s m y c o i d e s , a n d B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ( 1 9 9 ) .N e u r a m i n i d a s e . A c e t y l a t e d a m i n o s u g a r s a r e i m p o r t a n tc o n s t i t u e n t s o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y s a c c h a r i d e s a n d g l y -c o p r o t e i n s . S i a l i d a s e s ( a c e t y l n e u r a m i n y l - h y d r o l a s e s ) c l e a v ea n a - k e t o s i d i c l i n k a g e b e t we e n s i a l i c a c i d a n d t h e g l y c o s y lr e s i d u e s o f g l y c o p r o t e i n s , g l y c o l i p i d s , o r c o l o m i n i c a c i d s .A n u m b e r o f s u b s t r a t e s a r e n o w a v a i l a b l e f o r d e t e c t i o no f g l y c o s i d a s e s s p e c i f i c t o a c e t y l a m i n o s u g a r s . Th e y i n -c l u d e O N P a n d 4 - M U d e r i v a t i v e s o fP - D - g a l a c t o s a m i n e( , 1 -G a l N A c ) ,P - D - g l u c o s a m i n e( P - G l u N A c ) ,2 - D - N - a c e t y l n e u r -a m i n i c a c i d ( a - N e u N A c ) , a n dP - D - N ' , N ' - d i a c e t y l c h i t o b i o s e .A c t i v i t i e s o f e n zy m e s h y d r o l y zi n g t h e s e s u b s t r a t e s we r es o m e t i m e s c o n s i d e r e d t o b e r e l a t e d t o p a t h o g e n i c i t y , e . g . ,n e u r a m i n i d a s e ( 1 8 7 ) , b r e a k d o wn o f c h i t i n a c e o u s m a t e r i a l( 1 6 1 ) . O N P - , B - G l u N A c wa s u s e d f o r d i f f e r e n t i a t i n g b e t we e nB . m y c o i d e s a n d B . a n t h r a c i s ( 1 9 9 ) . S i a l i d a s e ( E C 3 . 2 . 1 . 1 8 )a c t i v i t i e s we r e d e t e r m i n e d b y u s i n g 4 - M U- a - N e u N A c a n d af l u o r o g e n i c a s s a y ( 1 8 3 ) ; a q u a l i t a t i v e f i l t e r p a p e r a s s a y wa sa p p l i e d t o A c t i n o m y c e s s t r a i n s , wi t h 7 9 % o f t h e s t r a i n ss h o wi n g a c t i v i t y ( 1 5 7 ) . A l l 1 6 s t r a i n s o f A c t i n o m y c e s v i s c o -s u s s h o we d a c t i v i t y . Th e t e s t s a r e m o s t u s e f u l f o r c h a r a c t e r -i za t i o n o f V i b r i o , S e r r a t i a , a n d F l a v o b a c t e r i u m s p e c i e s .Two o f t h e s e t e s t s a r e i n c l u d e d i n M i c r o S c a n R a p i d I d e n t i -f i c a t i o n p a n e l s ( 1 8 ) .Ka h a n e e t a l . ( 1 1 3 ) d e s c r i b e d t h e a c t i v i t i e s o f a - a n dp - g l u c o s i d a s e s ,a - G A L ,p - G A L ,a - a n dp - m a n n o s i d a s e s ,f u c o s i d a s e , N - a c e t y l n e u r a m i n i d a s e , a n d , B - N - a c e t y l g l u c o s -a m i n i d a s e o f m y c o p l a s m a s a t a c i d i c p H b y f l u o r o m e t r y wi t ht h e a p p r o p r i a t e 4 - M U s u b s t r a t e . B y t h i s m e t h o d , i t s e e m st h a t e a c h s p e c i e s h a s a u n i q u e e n zy m e p r o f i l e o f i t s o wn .Ho we v e r , t h e y c o n c l u d e d t h a t t h e e n zy m e t e s t s u s e d d i d n o tp r o v i d e d i f f e r e n t i a t i o n b e t we e n p a t h o g e n i c a n d n o n p a t h o -g e n i c m y c o p l a s m a s . W h i l e y e t a l . ( 2 4 1 ) u s e d 4 - M U d e r i v a -t i v e s o f a n u m b e r o f s u g a r s a n d a c e t y l a m i n o s u g a r s f o rc h a r a c t e r i za t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f S t r e p t o c o c c u s m i l l e r ig r o u p i s o l a t e s .E s t e r a s e s a n d L i p a s e sE s t e r a s e s a r e f o u n d i n a l l l i v i n g o r g a n i s m s , a n d t h e u s e o ft h e d i a c e t a t e e s t e r o f f l u o r e s c e i n f o r t h e d e t e c t i o n o f v i a b i l i t yh a s b e e n s u m m a r i ze d b y B a s c o m b ( 1 6 ) . Ts i e n ( 2 2 4 ) d i s -c u s s e d t h e f a c t o r s d e t e r m i n i n g t h e i n t r a c e l l u l a r f l u o r e s c e n c eo f f l u o r e s c e i n . E s t e r a s e s h y d r o l y ze m o l e c u l e s wi t h s h o r t e r -M I C R O B I O L . R E V . on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from E N ZYM E S UB S TR A TE S A N D B A C TE R I A L D I A G N O S TI C S 3 3 9c h a i n o r g a n i c a c i d s , wh e r e a s l i p a s e s a r e c a p a b l e o f a c t i n g o nd e r i v a t i v e s o f l o n g e r - c h a i n a c i d s . F o r d e t e c t i n g t h e s e e n -zy m e s , G u i l b a u l t a n d Kr a m e r ( 8 7 ) d e s c r i b e d f l u o r e s c e n c et e s t s i n wh i c h t h e y u s e d f l u o r e s c e i n d e r i v a t i v e s . Us e o fb u t y r y l , h e x a n o y l , h e p t a n o y l , n o n a n o y l , p a l m i t o y l , a n do l e y l e s t e r s o f 4 - M U h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d ( 5 3 , 1 1 0 , 1 9 8 ,2 1 5 ) . G u i l b a u l t e t a l . ( 8 8 ) c o m p a r e d t h e s u i t a b i l i t y o f 1 2d i f f e r e n t c o m p o u n d s a s s u b s t r a t e s f o r d e t e c t i n g v a r i o u sl i p a s e s . P a n c h o l y a n d L y n d ( 1 6 4 ) d e s c r i b e d a m e t h o d f o rd e t e c t i o n o f e s t e r a s e - s y n t h e s i zi n g m i c r o b i a l c o l o n i e s wi t h i nm i x e d - c u l t u r e p l a t e s b y u s i n g i n d u c e d h y d r o l y s i s o f b u t y r y l -4 - M U. A p l a t e a s s a y wa s f u r t h e r d e s i g n e d t o d e t e c t b a c t e r i a ll i p a s e s i n a m e d i u m c o n t a i n i n g t r i o l e y l g l y c e r o l a n d t h ef l u o r e s c e n t d y e r h o d a m i n e B . S u b s t r a t e h y d r o l y s i s c a u s e st h e f o r m a t i o n o f o r a n g e f l u o r e s c e n t h a l o s a r o u n d b a c t e r i a lc o l o n i e s v i s i b l e u p o n UV i r r a d i a t i o n ( 1 2 6 ) .B u t y r a t e e s t e r a s e h a s b e e n f o u n d i n c u l t u r e s o f B r a n -h a m e l l a c a t a r r h a l i s , a n o c c a s i o n a l c a u s e o f h u m a n r e s p i r a -t o r y i n f e c t i o n s . Th i s p r o p e r t y i s a b s e n t f r o m m o s t o t h e rm e m b e r s o f t h e f a m i l y N e i s s e r i a c e a e . Th e b u t y r a t e e s t e r a s ec a n b e d e t e c t e d wi t h f l u o r o g e n i c 4 - M U- b u t y r a t e ( 1 7 0 , 2 2 7 ) .A l l B r a n h a m e l l a s t r a i n s t e s t e d g a v e a p o s i t i v e f l u o r e s c e n c er e a c t i o n wi t h i n 5 m i n , wh e r e a s N e i s s e r i a s p p . r e m a i n e dn e g a t i v e . A t e s t i n v o l v i n g a p a p e r s t r i p i m p r e g n a t e d wi t hi n d o x y l b u t y r a t e wa s s u g g e s t e d b y D e a l l e r e t a l . ( 4 8 ) f o rd i s t i n g u i s h i n g B . c a t a r r h a l i s f r o m o t h e r o x i d a s e - p o s i t i v e ,g r a m - n e g a t i v e c o c c i . A g u i r r e e t a l . ( 2 ) d e m o n s t r a t e d t h eu s e f u l n e s s o f a f l u o r o g e n i c t e s t f o r t h e d e t e c t i o n o f C 8e s t e r a s e d i r e c t l y o n c o l o n i e s g r o wn o n M a c C o n k e y o r s a l -m o n e l l a - s h i g e l l a a g a r s . Th e t e s t wa s u s e f u l f o r d e t e c t i o n o fS a l m o n e l l a c o l o n i e s .D N a s e sUs e o f s y n t h e t i c s u b s t r a t e s f o r d e t e c t i o n o f D N a s e a c t i v i t yi s h a m p e r e d b y t h e l a c k o f s u i t a b l e s y n t h e t i c s u b s t r a t e s . Th et h r e e c o m p o u n d s t h a t a r e a v a i l a b l e a r e m o r e s u i t a b l e f o rd e t e c t i o n o f d i n u c l e o t i d a s e s o r e x o n u c l e o t i d a s e s t h a n e n d o -n u c l e o t i d a s e s . Te s t s c o m m o n l y u s e d f o r D N a s e a c t i v i t yb a s e d o n h y d r o l y s i s o f n a t u r a l D N A we r e p r e v i o u s l y s u m -m a r i ze d ( 1 6 ) . D N A - c o n t a i n i n g a g a r a n d d e t e c t i o n o f h y d r o l -y s i s o f D N A b y f l o o d i n g t h e i n c u b a t e d p l a t e wi t h 1 N HC Iwa s d e s c r i b e d f i r s t ( 1 1 2 ) . M o d i f i c a t i o n s o f t h i s , i n v o l v i n gt o l i d i n e b l u e ( 2 0 3 ) a n d m e t h y l g r e e n ( 2 1 0 ) , h a v e a d v a n t a g e sb e c a u s e t h e y d o n o t r e q u i r e t h e a d d i t i o n o f r e a g e n t s a f t e r t h ep l a t e s a r e i n c u b a t e d . L a c h i c a a n d D e i b e l ( 1 3 2 ) u s e d a n a g a rm e d i u m c o n t a i n i n g a c r i d i n e o r a n g e . W h e n c u l t u r e s we r eo v e r l a i d wi t h a n A O D N A - a g a r m i x t u r e , i n c u b a t e d f o r 1 t o 3h , a n d o b s e r v e d u n d e r UV l i g h t , c l e a r h a l o s d e v e l o p e da r o u n d D N a s e - p o s i t i v e c o l o n i e s . O t h e r D N A - b i n d i n g f l u o -r o g e n i c d y e s i n c l u d e 4 , 6 - d i a m i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e ( D A P I )( e x c i t a t i o n wa v e l e n g t h , 3 6 5 n m ; e m i s s i o n wa v e l e n g t h , 3 9 0n m ) , e t h i d i u m b r o m i d e ( e x c i t a t i o n wa v e l e n g t h , 3 5 2 n m ;e m i s s i o n wa v e l e n g t h , 6 0 0 n m ) , a n d t h e Ho e c h s t d y e 3 3 2 5 8( e x c i t a t i o n wa v e l e n g t h , 3 5 2 n m ; e m i s s i o n wa v e l e n g t h , 4 4 8n m ) . C o m m o n t o t h e s e c o m p o u n d s i s t h e i r we a k f l u o r e s -c e n c e a t n e u t r a l p Hb u t s t r o n g f l u o r e s c e n c e wh e n b o u n d t oD N A . S u c h d y e s a r e u s e d t o d e t e c t D N A f r a c t i o n s o n g e le l e c t r o p h o r e s i s a n d o t h e r s e p a r a t i v e m e t h o d s ; t h i s s u g g e s t st h a t f l u o r e s c e n c e i s p r e s e n t e v e n wh e n t h e D N A p o l y m e rh a s b e e n c a t a b o l i ze d t o f o r m o l i g o n u c l e o t i d e s .W o l f e t a l . ( 2 4 4 ) d e s c r i b e d a r a p i d t e s t i n g p r o c e d u r e wi t ha s y n t h e t i c m o l e c u l e o f 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - t h y m i -d i n e - 3 - p h o s p h a t e . Th y m i d i n e - 5 - m o n o p h o s p h a t e - P N P e s t e ra m m o n i u m s a l t wa s a l s o u s e d b y O n i s h i e t a l . ( 1 6 2 ) . Hy d r o l -y s i s o f t h e p h o s p h a t e e s t e r o f 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l e i su s e d t o i n d i c a t e D N a s e a c t i v i t y . I n c l u s i o n o f t h i s t e s t i n an u m b e r o f m u l t i t e s t k i t s h a s b e e n r e v i e we d ( 1 6 ) .P h o s p h a t a s e sTh e u s e o f b a c t e r i a l p h o s p h a t a s e s f o r d i f f e r e n t i a t i o n o fb a c t e r i a l t a x a h a s b e e n r e v i e we d ( 1 6 ) . B o t h a c i d a n d a l k a l i n ep h o s p h a t a s e s ( o p t i m a l p Hs o f 4 t o 6 a n d 8 . 5 t o 9 . 5 , r e s p e c -t i v e l y ) h a v e b e e n d e t e c t e d . Th e u s e f u l n e s s o f t h e p h o s -p h a t a s e t e s t i n d i s t i n g u i s h i n g p a t h o g e n i c f r o m n o n p a t h o -g e n i c s t r a i n s h a s b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 8 , 1 2 , 2 7 , 6 5 , 9 8 ,1 1 4 , 1 1 7 , 1 6 8 , 1 8 2 , 2 1 1 , 2 4 3 , 2 4 5 ) .S y n t h e t i c s u b s t r a t e s u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o f p h o s p h a t a s ea c t i v i t y i n c l u d e d e r i v a t i v e s o f p h e n o l p h t h a l e i n ( 1 2 , 2 7 ) ,p h e n o l ( 3 2 ) , a - o r 3 - n a p h t h o l , 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o x y l( 2 3 2 , 2 4 5 ) , P N P ( 1 3 , 1 7 ) , a n d 4 - M U ( 7 9 , 8 3 ) . Hu s c h t s c h a e ta l . ( 1 0 5 ) d e s c r i b e d a n i n s i t u c o u n t i n g o f c e l l s b a s e d o nf l u o r o g e n i c a s s a y o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e . P h o s p h a t a s e a c -t i v i t i e s o f b o t h g r a m - n e g a t i v e a n d g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a a r ed e t e c t e d u s i n g 4 - M U d e r i v a t i v e s i n t h e M i c r o S c a n R a p i dI d e n t i f i c a t i o n s y s t e m s ( 1 8 ) .P e p t i d a s e s a n d P r o t e a s e sTh e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e e n zy m e s t o b a c t e r i a l c h a r a c t e r -i za t i o n wa s r e v i e we d ( 1 6 ) . I n e a r l i e r s t u d i e s , d e r i v a t i v e s o fa - o r , - n a p h t h y l a m i d e s we r e u s e d a n d e n zy m a t i c a c t i v i t ywa s d e t e c t e d f l u o r o m e t r i c a l l y o r b y r e a c t i o n wi t h d i a zo n i u md y e s ( 1 6 ) . A s s a y s wi t h d e r i v a t i v e s o f p - N A ( 3 4 , 3 5 , 7 1 , 1 0 9 )o r 7 - A M C ( 7 1 , 7 9 ) a r e m o r e s e n s i t i v e a n d e a s i e r t o p e r f o r m .Two s p e c i f i c a m i n o p e p t i d a s e s h a v e b e e n m u c h u s e d , o n e f o rs p e c i f i c d e t e c t i o n a n d t h e o t h e r f o r d i f f e r e n t i a t i o n b e t we e ng r a m - n e g a t i v e a n d g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a .P y r o g l u t a m y l a m i n o p e p t i d a s e . P y r o g l u t a m y l a m i n o p e p t i d -a s e ( P YR a s e ) ( E C 3 . 4 . 1 1 . 8 ) a c t i v i t y wa s f o u n d i n B a c i l l u ss u b t i l i s ( 2 1 7 ) . I n 1 9 8 1 , G o d s e y e t a l . ( 8 0 ) d e s c r i b e d f o r t h ef i r s t t i m e t h e h y d r o l y s i s o f L - p y r r o l i d o n y l - , - n a p h t h y l a m i d e( P YR ) a s a n a i d f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f g r o u p A s t r e p t o c o c c ia n d e n t e r o c o c c i . S i n c e t h e n , s e v e r a l a u t h o r s ( 2 6 , 4 3 , 5 9 , 6 3 ,1 1 6 , 1 6 0 , 2 4 0 ) h a v e u s e d P YR f o r t h e d e t e c t i o n o f P YR a s ea c t i v i t y , m a i n l y f o r d i f f e r e n t i a t i n g b e t we e n t h e s e g r o u p s o fg r a m - p o s i t i v e c o c c i . B o s l e y e t a l . ( 2 6 ) f o u n d t h a t a l l o f t h eE n t e r o c o c c u s f a e c a l i s s t r a i n s , 9 0 %o f t h e E . f a e c i u m s t r a i n s ,a n d 9 6 % o f t h e S t r e p t o c o c c u s b o v i s b i o t y p e I s t r a i n s e x a m -i n e d i n t h e i r s t u d y , we r e c o r r e c t l y i d e n t i f i e d b y a 4 - hm e t h o d .S u b s t r a t e s u s e d f o r d e t e c t i o n o f P YR a s e a c t i v i t y i n c l u d eP YR ( 2 1 7 ) , L - p y r o g l u t a m y l - p - n i t r o a n i l i d e ( 7 1 ) , a n d L - p y r o -g l u t a m y l - 7 - a m i d o - 4 - m e t h y l c o u m a r i n ( 7 1 ) .R a p i d m e t h o d s f o r d e t e c t i o n o f P YR a s e b y u s i n g i m p r e g -n a t e d p a p e r s t r i p s we r e d e s c r i b e d b y W e l l s t o o d ( 2 4 0 ) a n dKa u f h o l d e t a l . ( 1 1 6 ) , wi t h t h e r e s u l t s b e i n g a v a i l a b l e wi t h i na f e w m i n u t e s . I n a n o t h e r s t u d y , t h e S t r e p - A - F l u o r p a p e rs t r i p t e s t ( B i o S p e c , D u b l i n , C a l i f . ) , i m p r e g n a t e d wi t h af l u o r o m e t r i c s u b s t r a t e , wa s a p p l i e d t o d e t e c t i o n o f g r o u p As t r e p t o c o c c i ( 2 3 5 ) . M o n i t o r i n g o f t h i s b a c t e r i a l g r o u p o n a g a rm e d i u m c o n t a i n i n g P YR h a s p r o v e d t o b e u s e f u l ( 1 0 1 ) .A n o t h e r m e t h o d f o r i d e n t i f i c a t i o n o f S . b o v i s a n d o t h e rr e l a t e d b a c t e r i a , d e v e l o p e d b y P a n o s i a n a n d E d b e r g ( 1 6 5 ) ,c o m b i n i n g t e s t s f o r a - D - G A L , 1 - D - G L U, a n d P YR a s e , e n -a b l e d t h e d i s t i n c t i o n b e t we e n S . b o v i s , S . e q u i n u s , E n t e r o -c o c c u s s p p . , S . p n e u m o n i a e , a n d t h e v i r i d a n s g r o u p o fs t r e p t o c o c c i i n a c u l t u r e m e d i u m wi t h i n 3 0 m i n . S e l e c t i v ea n d d i f f e r e n t i a l f l u o r o g e n i c m e d i a f o r t h e i s o l a t i o n o f f e c a ls t r e p t o c o c c i we r e a l s o d e s c r i b e d b y L i t t e l a n d Ha r t m a n( 1 3 8 ) . I n a n o t h e r s t u d y ( 1 1 6 ) , t wo p a p e r s t r i p t e s t s d e t e c t i n gV O L . 5 5 , 1 9 9 1 on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from 3 4 0 M A N A F I E TA L .P YR a s e a n d P - D - G L U a c t i v i t i e s , we r e u s e d f o r r a p i d i d e n -t i f i c a t i o n o f S . p y o g e n e s a n d e n t e r o c o c c i f r o m h u m a ns o u r c e s wi t h i n a f e w m i n u t e s .I t i s i m p o r t a n t t o r e m e m b e r t h a t t e s t s f o r o n e o r t woe n zy m e s m a y n o t b e s u f f i c i e n t f o r u n a m b i g u o u s i d e n t i f i c a -t i o n o f a s p e c i f i c p a t h o g e n wh e n a p p l i e d d i r e c t l y t o c l i n i c a lo r e n v i r o n m e n t a l s p e c i m e n s . F a c k l a m ( 6 2 ) s u g g e s t e d t h a tt h e n o n s p e c i f i c i t y o f t e s t s b a s e d o n d e t e c t i o n o f P YR a s ea c t i v i t y s e e m s t o l i m i t t h e u s e f u l n e s s o f s u c h t e s t s i nd e t e c t i o n o f g r o u p A s t r e p t o c o c c i i n m i x e d c u l t u r e s .L - A l a n i n e a m i n o p e p t i d a s e . L - A l a n i n e a m i n o p e p t i d a s e a r y l -a m i d a s e h a s b e e n s u g g e s t e d f o r d i f f e r e n t i a t i n g b e t we e ng r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , b e i n g m o r e p r e v -a l e n t i n t h e l a t t e r g r o u p ( 3 4 , 3 5 ) . Th i s d i s t i n c t i o n r e f l e c t s aq u a n t i t a t i v e r a t h e r t h a n a d e f i n i t e q u a l i t a t i v e d i f f e r e n c e ( 1 6 ) .Ki t s u s i n g p - N A - L - a l a n i n e a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e( M e r c k , D a r m s t a d t , G e r m a n y ; A u s t i n B i o l o g i c a l L a b . , A u s -t i n , Te x . ) .A p p l i c a t i o n o f t h e B a c t i d e n t a m i n o p e p t i d a s e t e s t ( M e r c k )h a s b e e n d e s c r i b e d b y C o s t i n e t a l . ( 3 8 ) a n d O t t e a n d To l l e( 1 6 3 ) . R e c e n t l y , a c o m p a r i s o n wa s m a d e o f u s e f u l n e s s o fs e v e r a l t e s t s f o r d i s t i n g u i s h i n g g r a m - p o s i t i v e f r o m g r a m -n e g a t i v e b a c t e r i a ( 1 4 4 ) . Tr a d i t i o n a l G r a m s t a i n i n g , l y s i s b yKO H, a n d u s e o f v a r i o u s c h r o m o g e n i c a n d f l u o r o g e n i cs u b s t r a t e s f o r d e t e c t i o n o f L - a l a n i n e a r y l a m i d a s e we r e e x -a m i n e d . Te s t s we r e d o n e b y u s i n g p a p e r s t r i p s i m p r e g n a t e dwi t h t h e s u b s t r a t e s , o r t h e s u b s t r a t e s we r e i n c o r p o r a t e d i n t os o l i d a n d l i q u i d m e d i a . I t wa s f o u n d t h a t t h e f l u o r o g e n i cs u b s t r a t e L - a l a n i n e - 7 - A M C s h o we d t h e h i g h e s t s e n s i t i v i t y .O t h e r a r y l p e p t i d a s e s . C h a r a c t e r i za t i o n o f r h o d o c o c c i a n da c t i n o m y c e t e s b y u s i n g f i l t e r p a p e r s s p o t t e d wi t h s u b s t r a t es o l u t i o n s wa s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 8 1 ) . A l l 1 0 5 s t r a i n st e s t e d s h o we d a c t i v i t y t o wa r d d e r i v a t i v e s o f L - a l a n i n e ,L - l y s i n e , a n d L - m e t h i o n i n e , L - s e r i n e , L - t y r o s i n e , S - b e n zy l - L -c y s t e i n e a n d L - A l a - P h e - a l a n i n e . Th e r h o d o c o c c i c o u l d b eb r o a d l y d i v i d e d i n t o t wo g r o u p s o n t h e b a s i s o f a c t i v i t y wi t hd e r i v a t i v e s o f x - L - g l u t a m i c a n d - y - L - g l u t a m i c a c i d s a n d c a r -b o b e n zy l - o x y - L - A r g - a r g i n i n e . E n d o p e p t i d a s e s u b s t r a t e s a p -p e a r e d t o h a v e b e t t e r d i f f e r e n t i a t i n g v a l u e s t h a n t h o s e f o ra m i n o p e p t i d a s e s . B a s c o m b ( 1 6 ) s u g g e s t e d t h a t wh e n a c r u d ee x t r a c t o f a b a c t e r i a l s t r a i n i s s h o wn t o h a v e a r y l a m i d a s ea c t i v i t i e s t o wa r d a v a r i e t y o f a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s , i t i s n o tp o s s i b l e t o d e c i d e , a p r i o r i , wh e t h e r t h e s e a c t i v i t i e s a r e d u et o t h e p r e s e n c e o f a s i n g l e e n zy m e wi t h b r o a d b u t v a r y i n gs p e c i f i c i t i e s t o t h e v a r i o u s d e r i v a t i v e s o r t o t h e p r e s e n c e o f an u m b e r o f e n zy m e s wi t h n a r r o w s p e c i f i c i t y t o wa r d s t h ei n d i v i d u a l d e r i v a t i v e s . Th e f i n d i n g ( 5 ) t h a t a p a r t i a l l y p u r i f i e dp r e p a r a t i o n o f t h e Ta m m - Ho r s f a l l g l y c o p r o t e i n s h o we d a c -t i v i t y t o wa r d a n u m b e r o f p - N A d e r i v a t i v e s f a v o r s t h ep r e s e n c e o f a s i n g l e e n zy m e s h o wi n g b r o a d a n d v a r y i n gs p e c i f i c i t i e s .Th e a c t i v i t y o f p r o t e a s e s s u c h a s c h y m o t r y p s i n ( E C3 . 4 . 2 1 . 1 ) a n d t r y p s i n ( E C 3 . 4 . 2 1 . 4 ) o f b a c t e r i a wa s e x a m i n e db y G r a y e t a l . ( 8 6 ) wi t h 4 - M U e s t e r s o f a m i n o a c i d d e r i v a -t i v e s t e s t i n g t h e c a r b o x y - t e r m i n a l s p e c i f i c i t y o f t h e e n zy m e s .S i m i l a r s t u d i e s we r e c a r r i e d o u t b y Ku r o m i zu e t a l . ( 1 3 0 ) .D e t e c t i o n o f t r y p s i n a c t i v i t y i n c o l o n i e s o f B a c t e r o i d e sg i n g i v a l i s b y u s i n g c a r b o b e n zo x y - L - a r g i n i n e - 7 - A M C wa sd e s c r i b e d b y S l o t s ( 2 0 9 ) .A n i m p r o v e d f l u o r o g e n i c a s s a y f o r t h e r a p i d d e t e c t i o n o fV i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s wa s d e v e l o p e d ( 1 5 3 ) : i t s t r y p s i n l i k ea c t i v i t y wa s m e a s u r e d wi t h t h e f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e b e n -zo y l - L - a r g i n i n e - 7 - A M C .C o r r e l a t i o n b e t we e n p e p t i d a s e / p r o t e a s e a c t i v i t i e s o n s y n -t h e t i c s u b s t r a t e s a n d n a t u r a l s u b s t a n c e s h a s n o t b e e n c o n -c l u s i v e ( 1 6 ) . R e c e n t l y , Ho m e r e t a l . ( 1 0 0 ) , s t u d y i n g t h e u s eo f e n zy m a t i c t e s t s f o r d i f f e r e n t i a t i o n b e t we e n S t r e p t o c o c c u ss p e c i e s , s h o we d a g o o d c o r r e l a t i o n b e t we e n a c t i v i t y t o wa r ds y n t h e t i c 7 - A M C e n d o p e p t i d a s e s u b s t r a t e s a n d h y d r o l y s i s o fn a t u r a l s u b s t a n c e s . S t r e p t o c o c c u s o r a l i s a n d S t r e p t o c o c c u ss a n g u i s s h o we d t h e h i g h e s t , m o s t v a r i e d p r o t e o l y t i c a c t i v i t y .C o a g u l a s eTh e a b i l i t y t o p r o d u c e c o a g u l a s e i s t h e m o s t wi d e l y u s e dc r i t e r i o n f o r i d e n t i f i c a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . I t c a nb e p e r f o r m e d a s e i t h e r a t u b e o r s l i d e c o a g u l a t i o n t e s t . Th em e t h o d i s b a s e d o n t h e a b i l i t y o f b o t h f r e e a n d b o u n dc o a g u l a s e t o c l o t p l a s m a . S t a p h y l o c o a g u l a s e r e a c t s wi t hp r o t h r o m b i n t o f o r m t h e c o m p l e x s t a p h y l o t h r o m b i n , wh i c hc o n v e r t s f i b r i n o g e n i n t o i n s o l u b l e f i b r i n , l e a d i n g t o c l o t t i n go f b l o o d . E n g e l s e t a l . ( 6 0 ) s h o we d t h a t , i n t h e p r e s e n c e o fp r o t h r o m b i n , h y d r o l y s i s o f C h r o m o zy mTH ( N - t o s y l - g l y c y l -1 - p r o l y l - L - a r g i n y l - p - n i t r o a n i l i d e h y d r o c h l o r i d e ) c a n b e u s e da s a m e a s u r e f o r c o a g u l a s e a c t i v i t y b y t h e d e t e c t i o n o f t h er e l e a s e d p - N A . F o r d i r e c t a s s a y o f S . a u r e u s , B u l a n d a e t a l .( 2 9 ) e v a l u a t e d t h e c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e D - P h e - P r o - A r g - j -n a p h t h y l a m i d e HC I f o r t h e d e t e c t i o n o f s t a p h y l o c o a g u l a s e .R e l e a s e o f j - n a p h t h y l a m i n e wa s d e m o n s t r a t e d b y a d d i t i o no f a d i a zo d y e .US E O F F L UO R O G E N I C D YE STh e i n c r e a s e i n t h e f l u o r e s c e n c e o f d y e s wh e n a d s o r b e d t om a c r o m o l e c u l e s h a s b e e n u s e d f o r d e t e c t i o n , e n u m e r a t i o n ,a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f b a c t e r i a . F l u o r o g e n i c d y e s h a v e b e e ni n c o r p o r a t e d i n g r o wt h m e d i a t o e n a b l e t h e d i f f e r e n t i a t i o nb e t we e n g r a m - n e g a t i v e a n d g r a m - p o s i t i v e c o l o n i e s . S u c hd y e s h a v e a l s o b e e n u s e d i n c o m b i n a t i o n wi t h m a g n i f i c a t i o na n d c o u n t i n g t e c h n i q u e s f o r e x t e n s i o n o f k n o wl e d g e t o t h el e v e l o f i n d i v i d u a l c e l l s . Th e t wo i m p o r t a n t f i e l d s i n wh i c hf l u o r o g e n i c d y e s a r e u s e d a r e F C M a n d D E F T.I n D E F T, d e s c r i b e d b y P e t t i p h e r a n d c o wo r k e r s ( 1 4 1 ,1 7 3 - 1 7 5 ) , s a m p l e s a r e f i r s t t r e a t e d t o d i s p e r s e c e l l a n d o t h e ra g g r e g a t e s a n d t o i n c r e a s e e f f i c i e n c y o f f i l t r a t i o n . Th e m i c r o -b i a l c o n t e n t o f t h e s a m p l e i s c o n c e n t r a t e d b y f i l t r a t i o n o n t op o l y c a r b o n a t e m e m b r a n e s a n d a p p l i c a t i o n o f v a c u u m . Th ec o n c e n t r a t e d s a m p l e i s t h e n s t a i n e d wi t h f l u o r o g e n i c n u c l e i ca c i d d y e s . E p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y c o m b i n e d wi t h v a r -i o u s d e g r e e s o f i m a g e a n a l y s i s i s u s e d t o e n u m e r a t e t h en u m b e r o f f l u o r e s c e n t p a r t i c l e s . A c o m b i n a t i o n o f e p i f l u o -r e s c e n c e m i c r o s c o p y a n d s t a i n i n g wi t h at e t r a zo l i u m s a l t wa su s e d b y Zi m m e r m a n e t a l . ( 2 4 7 ) f o r s i m u l t a n e o u s d e t e r m i -n a t i o n o f t h e t o t a l n u m b e r o f b a c t e r i a a n d t h e n u m b e rs h o wi n g r e s p i r a t o r y a c t i v i t y .I n F C M , p a r t i c l e s a r e m e a s u r e d wh i l e p a s s i n g t h r o u g h ah i g h l y f o c u s e d l i g h t b e a m . Th e u s e o f f l u o r o g e n i c r e a g e n t se n a b l e s m e a s u r e m e n t o f s p e c i f i c c e l l c o n s t i t u e n t s s u c h a sp r o t e i n s , D N A , R N A , s u r f a c e a n t i g e n s , a n d s p e c i f i c n u c l e -o t i d e s e q u e n c e s . Th e a b i l i t y o f F C M t o p e r f o r m s i m u l t a -n e o u s m e a s u r e m e n t s o f a n u m b e r o f c e l l c o n s t i t u e n t s , a swe l l a s t o d e t e r m i n e p a r t i c l e s i ze , m a k e s t h e s y s t e m a ne x c i t i n g a n d i n t e r e s t i n g m i c r o b i o l o g i c a l t o o l f o r c h a r a c t e r i -za t i o n o f c e l l p o p u l a t i o n s ( 7 0 , 1 5 2 , 2 0 5 ) .Un f o r t u n a t e l y , t h e s m a l l s i ze o f b a c t e r i a l c e l l s r e q u i r e se x p e n s i v e e q u i p m e n t ; t h u s , a p p l i c a t i o n o f t h e t e c h n i q u e t ob a c t e r i a l s t u d i e s h a s n o t p r o g r e s s e d a s m u c h a s i n o t h e rb i o l o g i c a l f i e l d s ( 7 0 ) . Us e o f f l u o r o g e n i c s u b s t r a t e s f o r d e -t e c t i o n o f e n zy m a t i c a c t i v i t y o f i n d i v i d u a l b a c t e r i a l c e l l s h a sb e e n v e r y l i m i t e d ( 4 0 , 7 0 ) .M I C R O B I O L . R E V . on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from E N ZYM E S UB S TR A TE S A N D B A C TE R I A L D I A G N O S TI C S 3 4 1P r o t e i n - S p e c i f i c D y e sA m e d i u m c o n t a i n i n g t h e f l u o r o g e n i c c o m p o u n d A N S f o rs i m u l t a n e o u s l y e n u m e r a t i n g g r a m - n e g a t i v e a n d g r a m - p o s i -t i v e b a c t e r i a a n d f o r d i f f e r e n t i a t i n g b e t we e n v a r i o u s s p e c i e swa s r e p o r t e d b y R a m s e y e t a l . ( 1 8 5 ) a s we l l a s b y Kwe e e t a l .( 1 3 1 ) . Th e m e c h a n i s m o f s t a i n i n g i s t h o u g h t t o b e t h a t o fa d s o r p t i o n o f A N S t o b a c t e r i a l c e l l wa l l p r o t e i n s i n g r o wi n gc u l t u r e s ( 1 6 7 ) . A i t h a l e t a l . ( 3 ) s t u d i e d t h e e f f e c t s o f t e m p e r -a t u r e a n d r e s p i r a t o r y i n h i b i t o r s o n t h e a f f i n i t y o f e l e c t r o nt r a n s p o r t p a r t i c l e s o f M y c o b a c t e r i u m p h l e i t o A N S . Th ee f f e c t o f t h e t e m p e r a t u r e o f c e l l s o n t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n -s i t y o f t wo g r a m - n e g a t i v e a n d t wo g r a m - p o s i t i v e c u l t u r e sd u r i n g m e a s u r e m e n t wa s d e s c r i b e d b y M a n t s a l a ( 1 4 6 ) . Ad e c r e a s e i n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y wa s o b s e r v e d wh e n t h et e m p e r a t u r e wa s e l e v a t e d f r o m 4 t o 4 0 C . A s t r o n g i n c r e a s ei n i n t e n s i t y wa s o b s e r v e d wi t h c e l l s o f P s e u d o m o n a s f l u o -r e s c e n s a n d E . c o l i , b u t o n l y a s l i g h t i n c r e a s e wa s o b s e r v e dwi t h c e l l s o f S t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s o r B . s u b t i l i s . A N Sa t h i g h c o n c e n t r a t i o n i s c a p a b l e o f i n h i b i t i n g t h e g r o wt h o fm o s t g r a m - p o s i t i v e b u t n o t g r a m - n e g a t i v e m i c r o o r g a n i s m s .A c c o r d i n g t o R a m s e y e t a l . ( 1 8 5 ) , t h e l i g h t e m i t t e d b yc o l o n i e s o f t h e g r a m - n e g a t i v e s t r a i n s i s m u c h m o r e i n t e n s et h a n t h a t e m i t t e d b y g r a m - p o s i t i v e o n e s . F u r t h e r m o r e , t h ei n t e n s i t y o f l i g h t e m i s s i o n o f v a r i o u s b a c t e r i a d i f f e r e d wi t ht h e wa v e l e n g t h s .N e i s s e r i a m e n i n g i t i d i s c a n b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m N e i s -s e r i a g o n o r r h o e a e b y u s i n g A N S . N . g o n o r r h o e a e i s e x -t r e m e l y s e n s i t i v e t o A N S ; g r o wt h i s i n h i b i t e d i n A N S -c o n t a i n i n g m e d i a ( 2 1 8 ) . C h a r a c t e r i s t i c s o f f l u o r e s c e n tr e a g e n t s f o r t h e v i s u a l i za t i o n o f e u c a r y o t i c c e l l c o n s t i t u e n t swe r e d e s c r i b e d b y W a g g o n e r e t a l . ( 2 3 3 ) .N u c l e o t i d e - S p e c i f i c D y e sD y e s t h a t a r e we a k l y f l u o r e s c e n t a t n e u t r a l p Hb u ts t r o n g l y f l u o r e s c e n t wh e n a d s o r b e d o n t o D N A , s u c h a se t h i d i u m b r o m i d e , h a v e b e e n u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o fa q u a t i c m i c r o f l o r a ( r e v i e we d i n r e f e r e n c e 1 6 ) . D i r e c t c o u n t -i n g o f a q u a t i c b a c t e r i a c o n c e n t r a t e d o n m e m b r a n e f i l t e r ss t a i n e d wi t h f l u o r o c h r o m e s b y u s i n g f l u o r e s c e n c e ( 1 3 3 ) a n de p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ( 9 5 , 2 4 6 ) h a s b e e n d e s c r i b e d . Am e t h o d f o r e n u m e r a t i o n o f b a c t e r i a i n m i l k , b a s e d o n a d -s o r p t i o n o f A O , h a s b e e n d e v e l o p e d ( 1 7 4 , 1 7 5 ) . B a c t e r i a lc e l l s s t a i n e d wi t h A O m a y s h o w o r a n g e - r e d o r g r e e n f l u o -r e s c e n c e . O r a n g e - r e d f l u o r e s c e n c e h a s b e e n a t t r i b u t e d t ov i a b l e c e l l s , a b u n d a n c e o f R N A , o r h e a t - d e n a t u r e d D N A .G r e e n f l u o r e s c e n c e h a s b e e n a t t r i b u t e d t o n o n v i a b l e c e l l sa n d D N A ( 1 0 4 ) . Th e i m p o r t a n c e o f a c i d p H i n d i f f e r e n t i a t i n gb e t we e n h u m a n c e l l s ( g r e e n ) a n d b a c t e r i a ( o r a n g e ) h a s b e e nd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 2 9 ) . C r e a m c o l o r a t i o n i n d i c a t e s t h ep r e s e n c e o f b o t h r e d a n dg r e e n f l u o r e s c e n c e ( 9 5 ) . Th e s p e c i a la p p l i c a t i o n o f A O s t a i n i n g c o m b i n e d wi t h m i c r o s c o p y , f o rd i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f t h e v i a b l e c o u n t , h a s b e e n d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 1 2 5 , 1 2 8 , 1 9 4 , 1 9 5 , 1 9 7 ) . D E F T- t y p e m e t h o d sh a v e b e e n d e v e l o p e d f o r f o o d s ( 1 9 6 ) , i n b r e we r i e s ( 4 7 ) , a n di n wi n e r i e s ( 3 7 ) . A m r d t - J o v i n a n d J o v i n ( 1 0 ) d e s c r i b e d a n dd i s c u s s e d t h e f a c t o r s a f f e c t i n g f l u o r e s c e n t s t a i n i n g o f D N Am o l e c u l e s o f l i v i n g e u c a r y o t i c c e l l s . F C M t e c h n i q u e s i n v o l v -i n g n u c l e i c a c i d - s p e c i f i c d y e s s u c h a s A O , e t h i d i u m b r o m i d e( 1 7 8 , 2 1 6 ) , D A P I , Ho e c h s t 3 3 2 5 8 ( 1 3 9 ) , m i t h r a m y c i n ( 2 1 6 ) ,a n d p r o p i d i u m i o d i d e ( 5 2 , 2 0 0 , 2 2 5 , 2 3 1 ) h a v e b e e n u s e d f o rr a p i d c o u n t i n g o f b a c t e r i a i n p u r e c u l t u r e s ( 1 7 8 , 2 1 6 ) a n d i nc l i n i c a l ( 2 2 5 ) , e n v i r o n m e n t a l ( 2 2 5 ) , f o o d ( 5 2 ) , a n d i n d u s t r i a ls p e c i m e n s . D A P I a n d Ho e c h s t 3 3 2 5 8 d y e s b i n d p r e f e r e n -t i a l l y t o a d e n i n e - t h i a m i n e ( A * T) b a s e p a i r s , wh e r e a s c h r o -m o m y c i n A 3 a n d m i t h r a m y c i n a r e s p e c i f i c t o g u a n i n e - c y -t o s i n e ( G * C ) b a s e p a i r s ( 1 0 , 1 3 9 , 2 0 2 , 2 0 5 , 2 2 6 ) . Ac o m b i n a t i o n o f s u c h d y e s h a s b e e n u s e d t o d i s t i n g u i s hb e t we e n p o p u l a t i o n s o f b a c t e r i a m a r k e d l y d i f f e r e n t i n G +Cc o n t e n t s u c h a s E . c o l i , P . a e r u g i n o s a , a n d S . a u r e u s ( 2 0 5 ) .Ho we v e r , p o p u l a t i o n s o f E . c o l i a n d Kl e b s i e l l a p n e u m o n i a ec o u l d n o t b e s e p a r a t e d ( 2 0 2 ) . Th e m e t h o d h a s a l s o b e e ns h o wn t o p r o v i d e am e a n s o f r a p i d d e t e r m i n a t i o n o f t h e G+Cc o n t e n t o f D N A i n p u r e c u l t u r e s ( 2 0 2 ) .F C M t e c h n i q u e s i n c o n j u n c t i o n wi t h p r o t e i n - s p e c i f i c d y e ss u c h a s f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( 1 0 7 ) , f l u o r e s c e n c e - l a -b e l e d a n t i b o d i e s ( 5 2 , 1 0 7 , 2 3 1 ) , a n d n u c l e o t i d e s e q u e n c e s ( 7 ) ,h a v e b e e n u s e d f o r d e t e c t i o n a n d e n u m e r a t i o n o f c e r t a i nb a c t e r i a l t a x a . Th e s e i n c l u d e E . c o l i ( 2 1 6 ) , L . p n e u m o n i a e( 1 0 7 ) , o t h e r L e g i o n e l l a s p p . ( 2 2 5 ) , N i t r o s o m o n a s s p p . ( 2 3 1 )a n d S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s ( 2 0 0 ) . A s f e wa s 5 x 1 0 3 a n d 5x 1 0 4 C F Uo f S . p y o g e n e s p e r m l we r e e n u m e r a t e d i n b u f f e ra n d s a l i v a , r e s p e c t i v e l y . Ty n d a l l e t a l . ( 2 2 5 ) , u s i n g f l u o r e s -c e i n i o d o t h i o c y a n a t e - l a b e l e d s p e c i f i c a n t i b o d i e s a n d p r o p i d -i u m i o d i d e , c o u l d d e t e c t L e g i o n e l l a s p p . i n s a m p l e s f r o mwa t e r - c o o l i n g t o we r s .A P P L I C A TI O N O F E N ZYM E TE S TS TOS P E C I F I C TA XATh e u s e o f e n zy m e t e s t k i t s a n d a p p l i c a t i o n o f b a t t e r i e s o fe n zy m e t e s t s f o r c h a r a c t e r i za t i o n o f i n d i v i d u a l g e n e r a h a v eb e e n s u m m a r i ze d b y B a s c o m b ( 1 6 ) .D i f f e r e n t i a t i o n o f M e m b e r s o f t h e F a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a eF u r t h e r e n zy m a t i c t e s t s we r e d e s c r i b e d f o r t h e e x a m i n a -t i o n o f d i f f e r e n t g e n e r a o f t h e f a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e ( 2 8 ,7 3 - 7 5 ) . R a m b a c h ( 1 8 4 ) d e s c r i b e d a n e wa g a r m e d i u m f o r t h ed i f f e r e n t i a t i o n o f S a l m o n e l l a s p p . Th e m e d i u m c o n t a i n sp r o p y l e n e g l y c o l a n d n e u t r a l r e d a s t h e p Hi n d i c a t o r f o rd e t e c t i o n o f S a l m o n e l l a c o l o n i e s , wh i c h a p p e a r b r i g h t r e d .Th e m e d i u m a l s o c o n t a i n s X- G a l f o r t h e d e t e c t i o n o f E . c o l ia n d o t h e r P - G A L - p o s i t i v e c o l o n i e s , wh i c h a p p e a r b l u e .C o l o n i e s o f P r o t e u s m i r a b i l i s a n d M o r g a n e l l a m o r g a n j ia p p e a r c o l o r l e s s .Th e e v a l u a t i o n o f a r a p i d c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e m e t h o d ,t h e M UC A P t e s t ( B i o l i f e I t a l i a n a S . R . L . , M i l a n , I t a l y )i n t e n d e d f o r t h e s c r e e n i n g o f S a l m o n e l l a s p p . , h a s b e e nr e p o r t e d ( 2 , 1 8 1 ) . Th i s t e s t i s b a s e d o n t h e d e t e c t i o n o f C 8e s t e r a s e e n zy m e b y u s i n g a f l u o r o g e n i c 4 - M U- c o n t a i n i n gs u b s t r a t e .C h r o m o g e n i c s u b s t r a t e s f o r p e p t i d a s e s we r e u s e d f o r t h ed e t e c t i o n o f S h i g e l l a s e r o v a r s a n d b i o v a r s . C h r o m o zy m P L( 7 7 ) a n d C h r o m o zy m U ( 1 4 7 ) a l l o we d t h e d i f f e r e n t i a t i o n o fS h i g e l l a s t r a i n s . P r o t e u s a n d P r o v i d e n c i a s t r a i n s i n c l i n i c a ls p e c i m e n s we r e d e t e c t e d b y u s i n g p - n i t r o - D L - p h e n y l a l a n i n e( P N P A ) . B a s c o m b a n d S p e n c e r ( 1 7 ) d e s c r i b e d t h e u s e o fP N P Af o r d e t e c t i o n o f t h e t r i b e P r o t e a e . A2 5 - m i n t e s t , u s i n gc o n t i n u o u s - f l o w e q u i p m e n t c a p a b l e o f p e r f o r m i n g 2 0 t e s t sp e r h , s h o we d t h a t o n l y t h e m e m b e r s o f t h e t r i b e P r o t e a eg a v e p o s i t i v e r e s u l t s . A 2 - h t e s t ( 1 6 ) a n d m a c r o - a n d m i -c r o t e s t s ( 7 6 ) h a v e b e e n d e s c r i b e d .I d e n t i f i c a t i o n o f L e g i o n e l l a S p e c i e sB e r d a l e t a l . ( 2 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t s y n t h e t i c c h r o m o g e n i cp e p t i d e s u b s t r a t e s c a n b e u s e d t o d e t e c t e x t r a c e l l u l a r p r o -t e o l y t i c e n zy m e s f r o m L e g i o n e l l a s p p . L . p n e u m o p h i l a wa sd i f f e r e n t i a t e d f r o m o t h e r L e g i o n e l l a s p e c i e s o n t h e b a s i s o ft h e q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e s i n h y d r o l y s i s o fV O L . 5 5 , 1 9 9 1 on June 10, 2013 by MERCK KGAAhttp://mmbr.asm.org/Downloaded from 3 4 2 M A N A F I E TA L .f o u r o l i g o p e p t i d e d e r i v a t i v e s o f p - N A . A n o t h e r s t u d y p r e -s e n t e d b y B e r d a l e t a l . ( 2 0 ) s h o we d t h a t p r o l i n e - s p e c i f i ce n d o p e p t i d a s e a c t i v i t y wa s p r e s e n t i n L e g i o n e l l a a n d F l a v o -b a c t e r i u m c u l t u r e s . Th e s e r e a c t i o n s c a n b e s h o wn b y u s i n gp e p t i d e d e r i v a t i v e s o f p - N A . Ho we v e r , a 1 0 0 - f o l d c o n c e n -t r a t i o n s t e p wa s n e e d e d t o a c h i e v e a d e t e c t a b l e a m o u n t o fp r o t e a s e a c t i v i t y . D i a zo t i za t i o n o f p - N A i m p r o v e d t h e s e n -s i t i v i t y o f t h e a s s a y ( 2 2 ) . Th e v a l u e o f s e v e r a l b i o c h e m i c a lt e s t s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f L . p n e u m o p h i l a wa s c o m p a r e db y V e s e y e t a l . ( 2 2 9 ) , wh o s h o we d t h a t 2 3 o f 4 2 a t t r i b u t e swe r e u s e f u l . A l k a l i n e p h o s p h a t a s e s , c a t a l a s e , p e r o x i d a s e ,l i p a s e , a n d p r o t e o l y t i c a c t i v i t i e s , a s d e t e c t e d b y a n u m b e r o fn a t u r a l s u b s t r a t e s , we r e o f p a r t i c u l a r v a l u e . S i m i l a r r e s u l t swe r e o b t a i n e d b y M u l l e r ( 1 5 8 ) , u s i n g a c o m m e r c i a l l y a v a i l -a b l e A P I ZYM s y s t e m .I d e n t i f i c a t i o n o f N e i s s e r i a S p e c i e sA n u m b e r o f e n zy m e t e s t s h a v e b e e n f o u n d u s e f u l ( 4 5 ,2 1 4 , 2 4 6 ) . B e h a l a n d C o x ( 1 9 ) s t u d i e d t h e p e p t i d a s e a c t i v i t yo f N e i s s e r i a c a t a r r h a l i s a n d r e p o r t e d t h a t a n i n t r a c e l l u l a re n zy m e s h o we d h i g h e r a f f i n i t y t o wa r d P - n a p h t h y l a m i d e - A l at h a n t o wa r d A l a - A l a p e p t i d e . D ' A m a t o e t a l . ( 4 5 ) s e l e c t e d 1 0e n zy m e t e s t s . Th e t e s t s m o s t f r e q u e n t l y u s e d a r e y - L -g l u t a m y l a r y l p e p t i d a s e a n d L - h y d r o x y p r o l i n e a r y l p e p t i d a s e( 6 1 , 2 3 7 ) . Th e f i r s t t e s t i s s p e c i f i c f o r i d e n t i f i c a t i o n o f N .m e n i n g i t i d i s ( 4 5 , 9 7 , 1 9 0 ) ; t h e s e c o n d i s s p e c i f i c f o r N .g o n o r r h o e a e ( 4 5 , 9 7 , 1 0 2 ) . Th e 1 3 - G A L t e s t i s s p e c i f i c t o N .l a c t a m i c a . Th e p r o d u c t i o n o f h y d r o x y p r o l y l a m i n o p e p t i d a s eb y N . c i n e r e a , b u t n o t b y B . c a t a r r h a l i s , i s o f p o s s i b l ed i f f e r e n t i a l v a l u e ( 9 7 ) . I s o n e t a l . ( 1 0 9 ) s t u d i e d t h e s p e c i f i ca c t i v i t i e s o f - y - L - g l u t a m y l - a n d L - h y d r o x y l p r o l y l - a r y l a m i -d a s e s o f N . g o n o r r h o e a e a n d t wo p o p u l a t i o n s o f N . m e n i n -g i t i d i s , o n e c o n s i s t i n g o f s t r a i n s i s o l a t e d f r o m s y s t e m i ci n f e c t i o n a n d t h e o t h e r c o n s i s t i n g o f s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h et h r o a t s o f m a l e p a t i e n t s a t t e n d i n g a s e x u a l l y t r a n s m i t t e dd i s e a s e c l i n i c . Th e p h a r y n g e a l m e n i n g o c o c c i s h o we d al o we rs p e c i f i c a c t i v i t y o f - y - L - g l u t a m y l - a r y l a m i d a s e a n d h i g h e r s p e -c i f i c a c t i v i t y o f L - h y d r o x y p r o l y l - a r y l a m i d a s e , s u g g e s t i n g t h eo c c u r r e n c e o f g e n e t i c i n t e r c h a n g e b e t we e n t h e t wo s p e c i e s .E n zy m e Te s t s i n M y c o b a c t e r i a l Ta x o n o m yTh e u s e o f u m b e l l i f e r o n e d e r i v a t i v e s i n t h e s t u d y o fm y c o b a c t e r i a wa s d e s c r i b e d b y G r a n g e ( 8 3 ) , G r a n g e a n dC l a r k ( 8 4 ) , a n d S l o s a r e k ( 2 0 8 ) . Th e y s h o we d t h a t 4 - M Us u b s t r a t e s p r o v i d e a v e r y s e n s i t i v e m e t h o d f o r d e t e c t i n gm y c o b a c t e r i a l g r o u p - s p e c i f i c h y d r o l a s e s , s u c h a s g l u c o s i -d a s e s , h e x o s a m i n i d a s e s , a c y l e s t e r a s e s , l i p a s e s , p h o s -p h a t a s e s , a n d a r y l s u l f a t a s e s . I t wa s f u r t h e r s h o wn t h a ts u b s t a n c e s c o n t a i n i n g 4 - M U we r e p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o re x a m i n i n g t h e g l y c o s i d a s e a c t i v i t y o f s l o wl y g r o wi n g m y c o -b a c t e r i a ( 8 5 ) . M y c o b a c t e r i u m n o n c h r o m o g e n i c u m , M . s zu l -g a i , a n d M . m a r i n u m c o u l d b e d i f f e r e n t i a t e d b y t h e i r a - L -f u c o s i d a s e a c t i v i t y ( 8 5 ) .E n zy m e Te s t s i n F u n g a l Ta x o n o m yS l i f k i n a n d C u m b i e ( 2 0 7 ) d e s c r i b e d t h e u s e o f C o n g o r e d a sa f l u o r o c h r o m e f o r t h e r a p i d d e t e c t i o n o f f u n g i . Th e s t a i nm a y b e p r e p a r e d wi t h p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e a s a c o u n -t e r s t a i n o r wi t h f o r m a l i n o r g l u t a r a l d e h y d e ( 2 0 7 ) . B o b e y a n dE d e r e r ( 2 5 ) d e m o n s t r a t e d t h a t d i f f e r e n t e n zy m e s o f y e a s t sc a n b e m o n i t o r e d u s i n g 4 - M Us u b s t r a t e s , f o l l o wi n g t h e s a m ep r i n c i p l e a s d e s c r i b e d f o r b a c t e r i a . I n p a r t i c u l a r , d e t e c t i o n o fp h o s p h a t a s e , , B - D - G L U, a n d p y r o p h o s p h a t e - d i e s t e r a s e c a nc o n t r i b u t e t o d i f f e r e n t i a t i o n .I d e n t i f i c a t i o n o f C a n d i d a S p e c i e sC a n d i d a a l b i c a n s i s t h e m o s t f r e q u e n t l y i s o l a t e d y e a s tp a t h o g e n . I t wa s d i f f e r e n t i a t e d f r o m C a n d i d ap a r a p s i l o s i s b yu s i n g p - n i t r o p h e n y l - N - a c e t y l - 3 - D - g a l a c t o s a m i n i d ef o r d e t e c -t i o n o fN - a c e t y l - p - D - g a l a c t o s a m i n i d a s e( E C 3 . 2 . 1 . 3 0 ) ( 1 1 9 ) .P e r r y a n d M i l l e r ( 1 7 1 ) a n d D a l t o n e t a l . ( 4 2 ) f o u n d t h a t4 - M U- N - a c e t y l - , B - D - g a l a c t o s a m i n i d e c o u l d b e u s e d f o r r a p i dd e t e c t i o n o f C . a l b i c a n s ; 9 9 . 7 % o f t h e C . a l b i c a n s a n d o n l y7 % o f C a n d i d a t r o p i c a l i s s t r a i n s t e s t e d s h o we d a p o s i t i v er e a c t i o n . S m i t k a a n d J a c k s o n ( 2 1 2 ) d e v e l o p e d a f l u o r o g e n i ct e s t f o r d i f f e r e n t i a t i n g t h e C . p a r a p s i l o s i s g r o u p f r o m o t h e rC a n d i d a s p e c i e s . Th e y u s e d 4 - M U- 1 3 - D - G L U t o a s s a y t h e1 - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l ywi t h i n 3 0 m i n .A l l C . p a r a p s i l o s i s s t r a i n s we r e p o s i t i v e . I n c o n t r a s t , p r e -l i m i n a r y r e s u l t s o b t a i n e d wi t h a s u b s t r a t e b u f f e r s y s t e m o fl o w p H h a d s u p p o r t e d t h e f i n d i n g s o f B o b e y a n d E d e r e r ( 2 5 )t h a t , u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , 1 - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y wa sn o t s i g n i f i c a n t i n C . p a r a p s i l o s i s . Hy d r o l y s i s o f g l y c o s i d e sc a n b e a f f e c t e d b y e n zy m e s p e c i f i c i t y a n d b y r e a c t i o nc o n d i t i o n s . Th e r e s u l t s o f P o l a c h e k e t a l . ( 1 8 0 ) i l l u s t r a t e t h a ta r e l i a b l e d i f f e r e n t i a t i o n o f C . a l b i c a n s c a n n o t b e p e r f o r m e do n l y o n t h e b a s i s o f 1 3 - D - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y .R A P I D I TYO F TE S TP E R F O R M A N C EM a n y t e s t s f o r s p e c i f i c d e t e c t i o n o f p a t h o g e n s o r i n d i c a t o ro r g a n i s m s a r e d e s c r i b e d a s r a p i d . W h e n c o n s i d e r i n g t h ed u r a t i o n o f a t e s t , i t i s i m p o r t a n t t o t a k e i n t o c o n s i d e r a t i o nt h e s i ze o f i n o c u l u m r e q u i r e d a n d t h e e f f e c t o f t h e r e c e n th i s t o r y o f t h e c u l t u r e o n t e s t r e s u l t s . Th u s , a t e s t t h a tr e q u i r e s g r o wt h f r o m a n u m b e r o f c o l o n i e s o r a t u r b i d i t ye q u i v a l e n t t o a M c F a r l a n d s t a n d a r d o f 2 1 o f t e n r e q u i r e s ap u r e c u l t u r e ; t h i s a d d s a n o v e r n i g h t i n c u b a t i o n p e r i o d t o t h ed u r a t i o n o f t h e t e s t . Th e r e f o r e , t h e s o - c a l l e d 1 5 - m i n t e s t i nr e a l i t y m a y r e q u i r e 2 4 h . Th e r e c e n t h i s t o r y o f t h e c u l t u r e i sa l s o i m p o r t a n t . M e d i a u s e d f o r p r i m a r y i s o l a t i o n m a y i n h i b i tt h e s y n t h e s i s o f e n zy m e s o f i n t e r e s t . Te s t s f o r p r e f o r m e de n zy m e s m a y g i v e d i f f e r e n t r e s u l t s d e p e n d i n g o n t h e m e d i u mo n wh i c h t h e c u l t u r e wa s g r o wn p r i o r t o t h e t e s t . F o re x a m p l e , I r i t a n i a n d I n za n a ( 1 0 8 ) d e s c r i b e a r a p i d ( 3 0 - t o6 0 - m i n ) t u b e a s s a y f o r d e t e c t i o n o f E . c o l i b a s e d o n d e t e c t i o no f t h e G UD a n d 1 3 - G A L e n zy m e s a n d i n d o l e . Ho we v e r , t h et e s t c o u l d b e p e r f o r m e d o n l y wi t h b a c t e r i a t a k e n f r o m b l o o da g a r . M o s t i s o l a t e s o f E . c o l i g r o wn o n M a c C o n k e y a g a rwe r e n o t i d e n t i f i e d c o r r e c t l y wi t h i n 6 0 m i nb y t h e t u b e a s s a y .Th o s e e n zy m e t e s t s t h a t r e l y o n s u b j e c t i v e o b s e r v a t i o n f o rd e t e r m i n a t i o n o f r e s u l t s m a y b e e i t h e r g r o wt h - d e p e n d e n tt e s t s o r s p o t t e s t s . I n t h e f i r s t t y p e , s y n t h e t i c s u b s t r a t e s a r ei n c o r p o r a t e d i n t o l i q u i d o r s o l i d g r o wt h m e d i u m ; d e t e r m i n a -t i o n o f r e s u